DE2939269C2

DE2939269C2 - Verfahren zur optischen Trennung von DL-2-Amino-4-hydroxy(methyl)phosphinoylbuttersäure

Info

Publication number: DE2939269C2
Application number: DE2939269A
Authority: DE
Inventors: Hitoshi Chiba Goi; Shinji Miyado; Tomizo Yamada Yujiro Niwa; Takashi Yokohama Kanagawa Shomura; Akira Tokyo Suzuki
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1978-10-02
Filing date: 1979-09-28
Publication date: 1982-07-08
Also published as: GB2031896A; JPS6247520B2; GB2031896B; FR2438054B1; FR2438054A1; JPS5547630A; DE2939269A1

Description

O O

!I Il

CHj-P-CH₂-CH₂-CH-C-OH

I
OH

HNR

DL-2-Amino-4-hydroxy(methyI)phosphinoylbuttersäure (im folgenden als DL-MPGA bezeichnet) sowie die Salze derselben mit anorganischen oder organischen Basen sind nicht nur als Bakterizide für landwirtschaftliche Zwecke und Gartenbauzwecke (vgl. japanische Patent-Vorveröffentlichungen Nr. 14 644/74, 14 641/74 und 26 430/74) geeignet, sondern auch als Herbizide, insbesondere für mehrjährige Unkräuter und verschiedene Straucharten (vgl. japanische Patent-Vorveröffentlichung Nr. 1 39 727/77).

Kürzliche Untersuchungen über die herbizide Wirkung der genannten Verbindungen haben gezeigt, daß die Wirkung von L-MPGA etwa zweimal so hoch ist wie die des Racemates, d. h. von DL-MPGA; d. h. also, daß die herbizide Wirkung der Verbindungen im wesentlichen dem L-MPGA und nicht dem D-MPGA zuzuordnen ist.

Es ist bereits vorgeschlagen worden, L-MPGA aus einem bekannten antimikrobiellen Mittel, nämlich der Substanz SF-1293 herzustellen. Bei der Substanz SF-1293 handelt es sich um L-MPGA-ananyl-alanin. Diese Substanz wird einem sauren Abbau (vgl. japanische Patent-Vorveröffentlichung Nr. 85 538/73) oder einem enzymatisch^ Abbau (vgl. japanische Patent-Vorveröffentlichung Nr. 31 890/74) unterworfen. Bezüglich der Substanz SF-1293 und der Herstellung derselben wird auf die japanische Patent-Vorveröffentlichung Nr. 22 688/73 und die Literaturstelle Helvetica Chimica Acta, 55, Fase 1, 224 bis 239 (1972) verwiesen. Es ist weiterhin bekannt, mit Hilfe chemischer synthetischer Verfahren MPGA in Form des Racemates, d. h. der DL-Mischung herzustellen (vgl. japanische Patent-Vorveröffentlichungen Nr. 91 019/73 und Nr. 1 39 727/77).

darstellen, in welcher R eine nicht-substituierte oder halogen-substituierte Acylgruppe darstellt.

Die Acylgruppe des N-Acyl-DL-MPGA, welches als Substrat für die mikrobiellen Acylasen wirkt, kann, wie sich gezeigt hat, bei dem erfindungsgemäßen Verfahren aus jeder beliebigen Acylgruppe bestehen, vorausgesetzt, daß sie sich durch die Einwirkung der Acylasen hydrolysieren läßt, so daß L-MPGA entsteht. Üblicherweise kann daher die Acylgruppe sowohl eine Alkanoylals auch eine Aroylgruppe sein. Von diesen sind insbesondere geeignet Alkanoylgruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen wie die Formyl-, Acetyl-, Propionyl-, Butyryl- und Pentanoylgruppe sowie die Benzoylgruppe. Die Acylgruppe kann halogen-substituiert sein, vorausgesetzt, daß der Halogensubstiluent bzw. die Halogensubstituenten die gewünschte enzymatische Umsetzung nicht beeinflussen bzw. nicht behindern.

Die Mikroorganismen, die die Fähigkeit besitzen, mikrobielle Acylasen zu erzeugen, die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendbar sind, sind folgende:

Bakterien:

Pseudomonas maltophilia BN-233, isoliert aus einer Bodenprobe, die auf der Halbinsel Chita, Aichi Prefecture, Japan, genommen werden ist; hinterlegt bei ATCC unter der Nummer 31 559.

Actinomycetes:

Streptomyces violascens SF-2072 und Streptomyces diastatochromogenes SF-2073, isoliert aus einer Bodenprobe, die in Shiga Prefecture, Japan, genommen worden ist; hinterlegt bei ATCC unter den Nummern 31 560 bzw. 31 561.

Fungi;

Aspergillus sp. KS-IOl und Aspergillus sp. KS-102, beide isoliert aus einer Bodenprobe, die in Yokohama Japan, entnommen worden ist, beide hinterlegt bei ATCC unter den Nummern 20 575 bzw. 20 568.

Die vorstehend erwähnten Stämme weisen folgende mikrobiologische Kenndaten auf:

Pseudomonas maltophilia BN-233
(a) morphologische Eigenschaften

Die auf Bouillon-Agar gezüchteten Zellen sind stäbchenförmig und haben eine Größe von 0,5 bis 0,7 um χ 1,0 bis 2,0 μπί; sie sind mit Hilfe einer polaren Geißei beweglich. Bildung von Sporen sowie von Poiymorphismus wurden nicht beobachtet. Gram-negativ.

(b) Züchtungseigenschaften auf verschiedenen
Kulturmedien

1) Bouillon-Agar:

Die Zellen wachsen mit gelblich-brauner Farbe. Die Bildung eines diffusionsfähigen Pigmentes, schrumpliges Wachstum, gummiartiges Wachstum sowie Kriechen wurden beobachtet

2) Bouillon-Brühe:

Das gesamte Kulturmedium wurde trübe. Keine Hautbildung.

3) Bouillon-Gelatine-Ansatz:
Das Medium wird verflüssigt.

4) Milch:

Das Medium wird verflüssigt, wobei der pH-Wert in den alkalischen Bereich übergeht.

(c) Physiologische Eigenschaften

1) Reduktion von Nitrat: negativ

2) Denitrifizierung: negativ

3) Methyl-rot-Test: negativ

4) Voges-Proskauer-Test: negativ

5) Erzeugung von Indol: negativ

6) Erzeugung von Schwefelwasserstoff: Bleiacetat-Papier wird schwarz gefärbt; Schwärzung von TSI-Medium tritt dagegen nicht auf.

7) Hydrolyse von Stärke: negativ

8) Verwendung von Zitronensäure: positiv

9) Verwendung von Stickstoffquellen: der Stamm kann Ammoniumsalz verwenden, jedoch nicht Nitrat als einzige Stickstoffquelle.

10) Erzeugung eines wasserlöslichen Pigmentes auf King-Α und King-B-Medien: nicht feststellbar.

11) Wachstumsfaktoren: Methionin ist erforderlich.

12) Ansammlung von Poly-/?-hydroxybutyrat in den Zellen: negativ

13) Oxydase-Test: negativ

14) Wachstumstemperatur: der Stamm wächst bei 15 bis 37° C, jedoch nicht bei 5° C und nicht bei 42° C.

15) Anaerobe Bedingungen: der Stamm kann dann nicht wachsen.

16) O.F.-Test: O-Typ

17) Verwendung von Kohlenstoffquellen: der Stamm kann Glukose, Maltose, Cellobiose und Lactose als alleinige Kohlenstoffquelle für das Wachstum verwenden, jedoch nicht Glycerin und Glutarsäure.

Die Identifizierung des Stammes BN-233 mit den vorstehend angegebenen mikrobiologischen Eigenschaften wurde mit Hilfe von Berge/s Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe (1974) durchgeführt, wobei sich folgendes ergab:

(1) Der Stamm BN-233 gehört offensichtlich zur Gattung Pseudomonas, und zwar im Hinblick auf die Tatsache, daß es sich um gram-negative Stäbchen handelt, die mittels einer polaren Geißel beweglich sind, keine Sporen produzieren und strikt aerob sind.

(2) Die Zuordnung des Stammes BN-233 zur Gattung Pseudomonas maltophilia erfolgt im Hinblick auf

2n die Tatsache, daß er Methionin benötigt, dem Oxydase-Test gegenüber negativ ist und bei der Verflüssigung von Gelatine ein positives Ergebnis liefert sowie insbesondere im Hinblick auf die Palette der benutzten Kohlenstoffquellen. '

Der Stamm BN-233 wurde daher als Fseudomonas maltophilia BN-233 bezeichnet und bei der amtlichen japanischen Hinterlegungsstelle »Fermentation Research Institute, Agercy of Industrial Science and Technology«, (nage, Chiba-city, Japan unter der Hinterlegungsnummer FERM-P 4487 sowie bei der American Type Culture Collection, Washington, D.C., USA unter der Hinterlegungsnummer ATCC 31 559 hinterlegt.

Streptomyces violascens SF-2072
(a) Morphologische Eigenschaften

Die Bildung von Luft-Mycel ist im allgemeinen auf verschiedenen Züchtungsmedien schlecht, jedoch gut auf Böden aus anorganischen Salzen-Stärke-Agar, wobei es zu einer reichlichen Bildung von Sporen kommt. Die Luft-Mycelien bilden monopodiale Verzweigungen, wobei quirlständige Verzweigungen nicht beobachtet wurden. Die Spitzen des Luftmycels sind spiralig (hauptsächlich kompakt-spiralig). Sklerotium wurde nicht beobachtet.

Bei der elektronen-mikroskopischen Beobachtung zeigt; sich, daß die Oberflächenstruktur der Sporen dornig ist. Die Sporen selbst haben hauptsächlich eine zylindrische Form bei einer Größe von 0,6 bis 0,7 μηι χ 1,1 bis 1,3 μηι. Im allgemeinen bilden sie eine Kette aus 10 oder mehr Sporen.

(b) Kultureigenschaften auf verschiedenen
Kulturmedien

Die Kultureigenschaften des Stammes SF-2072 sind in der folgenden Tabelle 1 angegeben. Die Angabe von Farbzahlen in () basiert auf dem Standardwerk »Color Harmony Manual«, erstellt von der Container Corporation of America. Die Bebrütungstemperatur betrug 28°C und die Begutachtung erfolgte nach einer Bebrütung von 14 bis 21 Tagen.

Tabelle I

Kulturmedium

Wachstum;

Farbe der Rückseite

Luftmycel

Lösliches
Pigment

Saccharose-Nitratagar

Glucose-Asparaginagar
Glycerin-Asparaginagar

Anorganische
Salze-Stärkeagar

Hafermehlagar
Hefe-Malzagar
Tyrosinagar

Nähragar

schwaches Wachstum,
farblos

gewöhnliches Wachstum, hellgelblich-braun

gewöhnliches Wachstum, graugelb bis hellgelblich-braun

gutes Wachstum,
hellgrau-gelb

gewöhnliches Wachstum,

creme

gewöhnliches oder gutes

Wachstum, schwach braun

gewöhnliches oder gutes

Wachstum,

braun oder dunkelbraun

gewöhnliches Wachstum, dunkelbraun

sehr schwach.	keins
baumwollartig,
blaßlila (llca)
keins	keins
keins	keins
reichlich,	keins
baumwollartig,
blaßlila (llca)
sehr schwach,	keins
baumwollartig, weiß
keins oder sehr	keins
schwach, weiß
sehr schwach,	schwach braun
baumwollartig,
weiß bis blaßlila
keins	braun

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(c) Physiologische Eigenschaften

1) Wachstumstemperaturbereich:

Der Stamm SF-2072 wächst in einem Tempeiaturbereich von 15 bis 38°C auf anorganischen Salzen-Stärkeagar. Die optimale Wachstumstemperatur liegt zwischen 25 und 30° C.

2) Verflüssigung von Gelatine:
positiv (bei 20°C, 21 Tage Bebrütung)

3) Hydrolyse von Stärke:

pi iitiv(bei28°C)

4) Gerinnung von Magermilch:
negativ (bei 28° C)

5) Peptonisierung von Magermilch:

negativ (bei 28° C)

6) Bildung eines melanin-ähnlichen Pigmentes:
positiv

(d) Verwendung von Kohlenstoffquellen (bei Bebrütung

auf Pridha.;>GottIieb's-Agar bei 28°C)

1) verwendet werden: D-Glucose, D-Fructose, D-Xylose, L-Inosit, L-Arabinose, Saccharose, Raffinose.

2) nicht verwendet werden: D-Mannit, Rhamnose.

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Im Hinblick auf die vorstehend aufgeführten mikrobiologischen Eigenschaften kann der Stamm SF-2072 der Gattung Strpetomyces zugerechnet werden. Er bildet ein Luftmycel, dessen Spitzen eine spiralige Form aufweisen. Die Sporenoberfläche hat eine dornige Struktur, Das Luftmycel nimmt eine blaßlila Farbe an und gehört zu den »Violett-Reihen« nach der Definition von H.D. Tresner und F.). Bacus in Appl. Microbiol. II, 335 bis 338 (1963). Die Rückseite des Wachstums färbt sich schwach gelblich-braun ohne andere ausgeprägte fo Farben. Ein m°lanin-ähnliches Pigment wird gebildet; die Produktion anderer löslicher Pigmente konnte nicht beobachtet werden.

Vergleicht man die angegebenen mikrobiologischen Eigenschaften des Stammes SF-2072 mit denen von Streptomyces violascens gemäß ISP (International Streptomyces Project), beschrieben in International Journal of Systematic Bacteriology, 18, 380 bis 382 (1968), so zeigt sich, daß die ersteren mit den letzteren selbst in den geringsten Einzelheiten übereinstimmen, so daß der Stamm SF-2072 als Streptomyces violascens SF-2072 bezeichnet wurde.

Dieser Stamm, Streptomyces violascens SF-2072, wurde beim japanischen Fermentation Research Institute unter der Hinterlegungs-Nr. FERM-P-4617 sowie außerdem bei der American Type Culture Collection in den USA unter der Hinterlegungs-Nr. ATCC 31560 hinterlegt.

Streptomyces diastatochromogenes SF-2073
(a) Morphologische Eigenschaften

Die Bildung von Luftmycel durch den Stamm auf anorganischen Salzen-Stärkeagar, Hafermehlagar oder Tyrosinagar ist gut bei reichlicher Erzeugung von Sporen. Die Luftmycelien bilden monopodiale Verzweigungen ohne quirhtändige Verzweigungen. Die Spitzen des Luftmycels sind spiralig (hauptsächlich kompaktspiralig). Sklerotium wurde nicht beobachtet.

Die elektronen-mikroskopische Untersuchung der Sporen zeigte, daß sie eine glatte Überfläche aufweisen und eine elliptische oder kurze zylindrische Form bei einerGröQe von0,8bis 1,1 μπι χ 1,0 bis 1,3 μΐη besitzen Gewöhnlich bilden sie eine Kette aus 10 oder mehr Sporen.

(b) Kultureigenschaftf η auf
verschiedenen Kulturmedien

Die Kultureigenschaften des Stammes SF-2073 sind in der folgenden Tabelle 2 zusammengestellt. Die Bebrütungstemperatur betrug 28⁰C und die Beobachtungen wurden nach 14 bis 21 täEricrer eemachr.

Tabelle 2

Kulturmedium	Wachstum;	L u Cl my cci	Lösliches
	l'arhe iler Rückseite		Pigment
Saccharose-Nitratagar	gewöhnliches oder gutes	schwach grau	schwach
	Wachstum.	(2dc-2fe)	graugelb
	gelblich-braun mit Graustich
Glucose-Asparaginagar	gewöhnliches Wachstum,	keins oder	keins
	schwach hraun	sehr, schwach, weil!
Gh /erm- Asparaginagar	gewöhnliches Wachstum.	schwach.	keins
	schwach grau	grauweiß (2clc)
Anorganische	gutes Wachstum.	reichlich.	keins
Sal/e-Stärkeagar	era u hraun	briiunlichgrau (lge-4ig)
Hafe-mehlagar	gutes Wachstum.	reichlich.	keins
	graubraun	braiinlichgrau (.Ige)
U..I"., V.J..I ,..,..r	*.,.... ;;t-.~ι...u..- \i.\...u^t ,**		ι.-:_
• ««.ι·. . · ■ ti ι r ii ».·· ■	scIns ach braun	weiU bis grauweiß
Tyrnsinagar	gutes Wachstum.	reichlich.	dunkelbraun
	dunkelbraun bis schwär/	hriiunlichgraii (3gc)
Nährauar	gewöhnliches Wachstum.	keins	schwach braun
	schwach braun

(c) Physiologische Eigenschaften

1) Wachstumstemper.iturbereich:

Der Stamm SF-2U73 wächst in einem Temperaturbereich von 15 bis 38 C auf anorganischen Salzen-Stärkeagar. Die optimale Wachstumstemperatur liegt zwischen 25 und 30' C.

2) Verflüssigung von Gelatine:
positiv (bei 20X. 21 Tage Bebrütung)

3) Hydrolyse von Stärke:
positiv (bei 28'C)

■i) Gerinnung \on Magermilch:
negativ (bei 28' C)

5) Peptonisierung von Magermilch:
Dositis (bei 28" C)

r) Bildung eines melanin-ähnlichen Pigmentes:

DOSItIV

(d) \usnt:^-/'.jng von Kohlenstoffquellen (bebrütet auf
Pndham-Gottliebs-Agar bei 28' C)

Der Summ nutzt gut D-Glucose. D-Fructose. D-Xylose. D-Mannit. L-Arabinose. L-Inosit. Saccharose. Raffinose und Rham".ose für sein Wachstum.

Im Hinblick auf die vorstehend aufgeführten mikrobiologischen Eigenschaften kann der Stamm SF-2073 der Gattung Streptomyces zugeordnet werden. Die Luftmy- :eiien sind spiralig an der Spitze und die Oberflächenstruktur der Scorer ist elan. O'c Farbe des Luftrn.vcels ;si bräunlich-grau und die Rückseite des Wachstums -:mm· eine schwach-brau-e bis grau-braune Farbe ohne •vettere bestimmte Farben an. E¹ kommt zur Bildung e:nes rr.eianin-ähniichen Pigmentes, während andere iösnche Pigmente nur geringfügig oder gar nicht erzeug! werden.

Ein Vergleich der mikrobiologischen Eigenschaften des Stammes SF-2073 mn denen von Streptomyces diastatochromogenes nach ISP. erläutert in International Journal of Systematic Bacteriology. 22. 290 bis 29* (1972). zeigte eine enge Übereinstimmung zwischen beiden. Der Stamm SF-2073 stimmt in seinen mikrobiologischen Eigenschaften mit Streptomyces diastatochromog', .;s weiter übereiii als mit allen anderen bekannten Stämmen, die unter die Gattung Streptomyces fallen; geringe Unterschiede bestehen bei dem Stamm SF-2073 hinsichtlich der FäVbung der Rückseite des Wachstums auf anorganische!; Salzen-Stärkeagar oder Hafermehlagar. welche grau-braun ist. und hinsichtlich der Spitzen der Luftmycelien. die im wesentlichen spiralig geformt sind: bei dem entsprechenden ISP-Stamm ist die Farbe der Rückseite des Wachstums schwach gelb bis grau-gelb und die Spitzen des Luftmycels sind nicht nur spiralig, sondern auch wellig und gerade geformt.

Im Hinblick auf cie weitgehende Übereinstimmung in den fundamentalen Eigenschaften des Stammes SF-2073 mit dem entsprechenden ISP-Stamm wurde der Stamm SF-2073 trotz der bestehenden geringfügigen Unterschiede der Art Streptomyces diastatochromogenes zugeordnet und als Streptomyces diastatochromogenes SF-2073 bezeichnet.

Dieser Stamm wurde bei dem japanischen Fermentation Research Institute unter der Hinterlegungs-Nr. FERM-P- 4618 und außerdem bei der American Type Culture Collection in den ISA unter der ATCC-Nr. 3156! hinterlegt.

Aspergillussp. KS-IOl

Bei der Bebrütung des Stammes auf Kartoffelstärke-Glucoseagar bei 28⁼C in 10 Tagen bilden sich Kolonien mit einem Durchmesser von 65 mm. Das gebildete weiße Mycel war baumwollartig und wies zahlreiche schwarz-braune Sporen auf. Eine entsprechende Bebrü tung des Stammes auf Czapeks-Agar ergab Kolonien mit einem Durchmesser von 70 mm. die ein samt-ähnliches Wachstum mit einer großen Zahl schwarz-brauner Sporen zeigten. Auf Maizextraktagar hatten die gebildeten Kolonien einen Durchmesser von 90 mm: die Myceiien derselben waren in kurz-flockiger Form mit einer großen Anzahl schwarz-brauner Sporen.

Bei der mikroskopischen Betrachtung zeigte sich, daß die reifen Konidienköpfe eine kugelförmige Gestalt mit einem Durchmesser νηη 40 bis 60 um aufwiesen und

dich! mit schwarz-braunen Sporen bzw. Konidien besetzt waren. Die Konidienträger sind glatt und besitzen an der Spitze kugelförmige Bläschen mit einem Durchmesser von 10 bis 15 μίτι. Die Sterigmata verlaufen in zwei Reihen und die Konidien haben die Form von Kügelchen mit einem Durchmesser von 3 bis 4 μπι, die mit zahlreichen kleinen warzenförmigen Erhebungen besetzt sind.

Dt-I Stamm wächst gut in einem Temperaturbereich von 15 bis 37"C; er wächst nicht bei 42°C.

Aufgrund der vorstehend aufgeführten mikrobiologischen Eigenschaften wurde geschlossen, daß dieser Stamm zu der Gattung Aspergillus. u. a. zu der Galtung Aspergillus niger gehört; er wurde als Aspergillus sp. KS-IOI bezeichnet.

Dieser Stamm wurde bei dem japanischen Fermentation Research Institute unter der Nummer FERM-P-4614 sowie bei der American Type Culture Collection in den I ISA unter der Hinterlegiings-Nr. ATCC 20 567 hinterlegt.

Aspergillus sp. KS-102

Bei der Bebrütung des Stammes auf Kartoffelstärke-Glucoseagar in einer Petri-Schale bei 28⁰C während 10 Tagen bildeten sich Kolonien mit einem Durchmesser von 13 mm. die ein samt-ähnliches Aussehen zeigten. Der Rand der Kolonien war weiß und die Mitte derselben war leicht hochgewölbt und zeigte eine gelblicli-grüne Farbe. Eine entsprechende Bebrütung des Stammes auf Czapeks-Agar ergab Kolonien mit einem Durchmesser von 50 mm, die einen tief grün gefärbten Wuchs mit samt-ähnlichem Aussehen, in welchem sich sporadisch kleine schwarze Klüivpchen von etwa I mm Durchmesser befanden, zeigten. Auf Malzextraktagar hatten die gebildeten Kolonien einen Durchmesser von 90 mm und zeigten ein samt-ähnliches Aussehen des Wuchses mit einer großen Anzahl tief grün gefärbter Spo^-en.

Bei der mikroskopischen Betrachtung zeigte sich, daß die Konidienkörper keulenförmig oder säulenförmig ausgebildet sind; die Bläschen haben in einem frühen Wachstumssiadium eine elliptische Gestalt. Im Reifezustand sind die Konidienköpfe kugelförmig und haben einen Durchmesser von 40 bis 60 μτη; die Bläschen sind ebenfalls kugelförmig oder subglobular bei einem Durchmesser von 15 bis 20 μπι. Die Konidienträger sind glatt, die Sterigmata sind in einzelnen Reihen angeordnet und die Konidien sind kugelförmig oder subglobular bei einem Durchmesser von 4 bis 6 μΐη, die Oberfläche der Sporen ist glatt.

Der Stamm wächst gut bei einer Temperatur im Bereich von 15 bis 40" C

Im Hinblick auf die vorstehend aufgeführten mikrobiologischen Eigenschaften wurde geschlossen, daß der Stamm zur Gattung Aspergillus sowie u. a. zur Art Aspergillus flavus-Oryzae gehört. Er wurde als Aspergillus sp. KS-102 bezeichnet.

Dieser Stamm wurde bei dem japanischen Fermentation Research Institute unter der Hinterlegungs-Nr. FERM-P 4615 und außerdem bei der American Type Culture Collection in USA unter der Hinterlegungs-Nr. ATCC 20 568 hinterlegt

Alle vorstehend erwähnten Stämme besitzen Eigenschaften, die sich ändern können, wie dies auch von anderen Stämmen bei einer großen Vielzahl von Mikroorganismen bekannt ist. Die Stämme können infolgedessen Varianten oder Mutanten bilden, wenn sie mit verschiedenen Mutagenen wie Ultraviolettstrahlen,

Röntgenstrahlen, hoch frequenz-elektromagnetische η Wellen, radioaktiven Strahlen oder Chemikalien behandelt werden. Alle vorstehend aufgeführten Stämme einschließlich aller natürlichen oder künstlichen Varianten oder Mutanten derselben können für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendet werden, vorausgesetzt, daß sie die Fähigkeit besitzen, die gewünschte Acylasezu bilden.

Die Züchtung eines Acylase erzeugenden Stammes, dessen Acylase als optisch spezifisches, hydrolytisches Enzym für das Verfahren gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden soll, kann in üblicher bekannter Weise durchgeführt werden. So liißt sich der Acylase produzierende Stamm in einem Kulturmedium züchten, welches die üblicherweise für Fermentierungspro/.esse. die der Züchtung von Mikroorganismen dienen, benutzten Nährstoffqtiellen enthält. Beispielsweise können folgende Nahrstoffquellen bei der Züchtung verwendet werden: Glucose. Saccharose. Stärke. Glyzerin. Maizsirup. Melasse und pflanzliche Üie als Kohlenstoffquellen; Sojabohnenmehl. Weizenkeime, Fleischextrakt, Pepton. Maisweichwasser, getrocknete Hefe, Ammoniumnitrat und Natriumnitrat als Stickstoffquellen. Erforderlichenfalls können auch anorganische Salze wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid. Calciumcarbonat und Phosphate, sowie andere Zusätze, die das Wachstum des Stammes fördern, eingesetzt werden. Insbesondere durch Verwendung der letzteren läßt sich die Erzeugung der gewünschten Acylase beschleunigen.

Die Züchtung kann in üblicher Weise sowohl in flüssigen als auch in festen Kulturen durchgeführt weiden, wobei eine Kultur unter submersen Bedingungen bei der Züchtung in größerem Maßstab bevorzugt wird. Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur zwischen 2S und 37'C. vorzugsweise bei einer Temperatur um etwa 28°C durchgeführt. Die Züchtungsdauer hängt von den Züchtungsbedingungen ab, insbesondere von der zur Züchtung verwendeten Apparatur, der Zusammensetzung des Kulturmediums, der Temperatur usw. Vorzugsweise wird die Züchtung so lange fortgesetzt, bis die Aktivität der erzeugte' Acylase ein Maximum erreicht. In den meisten Fällen macht sich die Acylase-Aktivität einen Tag nach Beginn der Züchtung bemerkbar, erreicht nach zwei bis drei Tagen ihr Maximum und verringert sich dann allmählich bis zum Verschwinden. Infolgedessen erscheint eine Dauer von 2 bis 4 Tagen für die Züchtung besonders günstig.

Die so erhaltene Kultur oder das »Enzymmaterial«, das aus einer solchen Kultur durch gewisse Nachbehandlungsschritte erhalten worden ist. enthält eine Acylase. die als optisch spezifisches, hydrolytisches Enzym wirkt und für das optische Trennungsverfahren gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden kann. Mit dem Ausdruck »Enzymmaterial«, welcher im vorliegenden Zusammenhang verwendet wird, wird jedes beliebige Material verstanden, welches durch Nachbehandlung der Kulturen der vorstehend erwähnten Stämme gewonnen worden ist, die die Kultur in eine für die Zwecke der Erfindung vorteilhaftere Form umwandeln. Durch die Umwandlung wird insbesondere der Wirkungsgrad des Enzyms bei der Acyl-Eliminierung bei der Herstellung von L-MPGA und N-Acyl-D-MPGA erhöht Beispiele für »Enzymmaterialien« der genannten Art sind Zellen, die aus der Kultur gewonnen worder, sind, und zwar sowohl in. gewaschener als auch in ungewaschener, in getrockneter oder nicht getrockneter Form, zerkleinerte Zellen, deren Extrakte, die

(1

reich an der gewünschten Acylase sind und durch Extraktion der mittels Ultraschall oder mechanisch aufgebrochenen Zellen sowie anschließende Reinigung gewonnen wurden, immobilisierte Acylaseptäparate, die aus den Zellen gewonnen wurden, zerkleinerte Zellen oder deren Extrakte.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die ontisch aufzutrennende, als Ausgangsmaterial eingesetzte D₁L-MPGA in Form ihres N-Acylderivates eingesetzt. Die enzymalische Deacylierungsreaktion durch optisch spezifische Hydrolyse von N-Acyl-I.-MPGA unter der Wirkung einer mikrowellen Acylase wird in einem wäßrigen Medium durchgeführt. Die Reaktionsbedingungen werden so ausgewählt, dal.i die Eigenschaften der Acylase optimal ausgenutzt werden. Wird die Acylase in Form von intakten, aus der Kultur abgetrennten /eilen verwendet, so ist die enzymatische Aktivität derselben bei einem pH-Wert von 6 bis 8,5 zufriedenstellend.hoch. Bei einem pH-Wert unter t> oder über 4 verringert sie sich oder verschwindet ganz, wobei keine nennenswerten Unterschiede in den enzymatischen Eigenschaften unter den Acylasen, die von verschiedenen Arten von Mikroorganismen erzeugt wurden, festgestellt werden konnten. Die Reaktionstemperatur kann im Bereich von 20 bis 45°C für alle in Frage kommenden Acylasen liegen, der bevorzugte Bereich liegt zwischen 28 und 35"C. Ober 50'C verlieren die Acylasen. wie festgestellt werden konnte, ihre Wirkung.

Die Reaktionsbedingungen sollten daher vorzugsweise so ausgewählt werden, daß der pH-Wert zwischen 6.5 und 8,5 liegt und daß eine Temperatur zwischen 25 und 40'C eingehalten wird. Fs wurde gefunden, daß die für das erfindungsgemäße Verfahren /u verwendende mikrobielle Acylase kaum eine oder nur eine sehr geringe Wirkung gegenüber anderen Substraten als N-Acyl-L-MPGA besitzt, beispielsweise gegenüber N-Acylderivaten von bekannten üblichen L-Aminosäuren.

In Fällen, in denen die mikrobielle Acylase in Form von gewaschenen Zellen verwendet wird, dispergiert man die Zellen vorzugsweise in einer Lösung des Substrates, so daß die Reaktion in der Dispersion ablaufen kann. Besonders günstig ist es. wenn die Umsetzung unter Schütteln oder Rühren durchgeführt wird. Andererseits ist es auch möglich, die Reaktion so durchzuführen, daß man eine Kolonne mit der Kultur oder einem Enzymmaterial, welches aus der Kultur gewonnen worden ist, füllt und kontinuierlich die Substratlösung durch die Kolonne leitet, so daß die Deacylierung sukzessive erfolgen kann. Die Reaktionsdauer hängt von der Konzentration des Substrates, dem Ausmaß der Deacylierungsaktivität, der Reaktionstem peratur und anderen Faktoren ab; sie liegt im allgemeinen im Bereich von 2 bis 40 Stunden. Die Beendigung der Reaktion kann bestimmt werden, indem man die Zeit feststellt, in welcher die Bildung der gewünschten L-MPGA ein Maximum erreicht. Die Substratkonzentration wird hauptsächlich in bezug auf das Ausmaß der Deacylierungsaktivität bestimmt und liegt gewöhnlich im Bereich von 0,1 bis 10%. Gegebenenfalls kann ein beliebiges Antiseptikum zugesetzt werden, um eine mögliche Verunreinigung der Reaktionsmischung mit anderen Mikroorganismen während der Umsetzung zu verhindern.

Die Abtrenimn" von L-MPGA und N-AcI-D-MPGA aus dem ReaJctionsgemisch und die Isolierung und Abtrennung jeder der beiden Verbindungen kann in an sich bekannter Weise erfolgen. So kann man die Zellen oder die Derivate d Tselben, die eingesetzt worden sind, aus dem gewonnenen Reaktionsgemisch abfiltrieren oder mittels Zentrifugalkraft odvr mit anderen Trenni operationen entfernen. Das Filtrat bzw. die flüssige Fraktion, die auf diese Weise gewonnen wird, kann durch eine Kolonne geleitet werden, die mit einem stark sauren lonenaustauscherharz beladen ist. Die L-MPGA wird an der Kolonne adsorbiert, während die nicht

in umgesetzte N-Acyl-D-MPGA die Kolonne passiert, ohne an derselben adsorbiert zu werden. Anschließend kann, die Kolonne mit Wasser entwickelt werden, um die 1.-MPCiA zu eluieren. 1.-MPCiA reagiert positiv auf N'iiihydrin. Das Hluat kann gegebenenfalls gereinigt . werden, indem man es mit Aktivkohle oder einem lonenausMuscherharz behandelt. Das gereinigte F.luai kann eingeengt oder zur Kristallisation gebracht oder der Gefriertrocknung unterworfen werden, so daß man reine L-MPGA in Form von Kristallen oder in Form

„•η eines weißen Pulvers erhält.

Die abgetrennte. N-Acyl-D-MPGA enthaltende Fraktion kann leicht in an sich bekannter Weise racemisiert werden, so daß man eine weitere Menge der als AusgangsmuUiritil /u verwendenden N-Acyl-D.l.

;-, MPCJA erhält. So kann man beispielsweise die N-Acyl-D-MPGA enthaltende Fraktion in wäßrigem Natriumhydroxid lösen und die Racemisierung der entstandenen Lösung durch Zugabe eines großen Überschusses an Essigsäureanhydrid oder unter Durch-

■,<■ leiten von Ketengas durch die Lösung vornehmen. Die Racemisierung von N-Acyl-D-MPGA kann auch er reicht werden, indem man N-Acyl-D-MPGA in Eisessig gibt und eine äquimolekulare oder etwas geringere als äquimolekulare Menge an Essigsäureanhydrid unter

i~> Erwärmen zusetzt Die mehrfache Wiederholung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur optischen Auftrennung in Kombination mit der anschließenden Racemisierung in der beschriebenen Weise führt zu einer vollständigen Umwandlung von D-MPGA in L-MPGA.

-.<< Der Endpunkt der enzymatischen Deacylierungsreaktion kann bestimmt werden, indem man die Menge an gebildeter L-MPGA nach folgender Methode rr..ßt:

Die Menge an gebildeter L-MPGA kann quantitativ mit Hilfe der Spektrophotometrie unter Verwendung

4-, von Ninhydrin als Reagenz bestimmt werden. Zunächst wird eine Standard-Kalibrierungskurve hergestellt, mit welcher das Absorptionsvermögen der zu prüfenden Proben verglichen wird (vgl. E.W. Yemm und E. C. Cocking. Analyst. 80. 209 f 1955).

'" Reagentien

Lösung A: 4 m Essigsäurepufferlösung (pH 5,0);
Lösung B: Mischung aus 5 ml 0,01 m Kaliumcyanid-Iö-

sung und 245 ml Methylcellosolve:
,5 Lösung C: Lösung aus 25 g Ninhydrin in 50 ml

Methylcellosolve;
Lösung D: Mischung aus 250 ml der Lösung B und

50 ml der Lösung C:
Lösung E: 60%ige Äthanollösung.

Meßvorgang

1.0 ml der zu prüfenden Probelösung wird in ein Reagenzglas gegeben, in welches dann noch 0,5 ml der Lösung A und IJ? ml der Lösung D gefüllt werden. Die entstandene Mischung wird 15 Minuten auf einem siegender. Wasserbad gehalten und dann 5 Minuten in kaltem Wasser abgekühlt Anschließend werden 3,0 ml der Lösung E zu der Mischung gegeben. Man rührt gut

durch und mißt das Absorptionsvermögen bei 570 n.n in einem Speklrophotometer.

Die Standardkurve des Absorptionsvermögens von L-MPGA zeigt eine lineare Beziehung in den Konzentralionen von 1 bis 50 μg/ml. so daß der Vergleich der gemessenen Werte mit der Standardkurve den Gehalt an L-MPGA in der Probelösung angibt.

Die im folgenden aufgeführten Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Be i s pi el 1

Fine Schlinge soll einer Schrägbodenkultur von Pseudomonas maltophilia BN-233(ATCC 31 559) wurde in 200 ml eines sterilisierten Kulturmediums eingeimpft, welches 0.5% Glucose. 0.3% Fleischextrakt. 0.5¹Vn , Pepton. 0.2% Natriumglutamat. 0.001% Kobaltchloricl und 0.001% Ferrosulfat enthielt. Das geimpfte Medium wurde unter Schütteln bei 28X 42 Stunden bebrütet. Die Kuiiu'biüne wuiuc aiiMciiiieueitu in 20 Minuten bei 8000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, um die ; Zellen abzutrennen, die anschließend mit 50 ml physiologischer Salzlösung gewaschen wurden. Man erhielt auf diese Weise 5 g (Naßgewicht) gewaschene Zellen.

l.bg dieser gewaschenen Zellen wurden in 50 ml einer 0.05m Phosphat-Pufferlösung (pH 5) suspendiert. Zu der Suspension wurden anschließend 240 mg N-Acetyl-DL-MPGA gegeben. Die Mischung wurde unter Schütteln 18 Stunden bei 28C in einem 200-ml-Erlenmeyer-Kolber gehalten, damit die Umsetzung ablaufen konnte. Anschließend wurde das Reaktonsgemisch zentrifugiert. Man erhielt die Zellen als feste Masse und eine darüberstehende Flüssigkeit. Die feste Masse wurde zweimal mit je 5 ml Wasser gewaschen. Die Waschwässer wurden mit der überstehenden Flüssigkeit vereinigt. Die vereinigten Flüssigkeiten wurden durch eine Kolonne (1.6 cm im Durchmesser und 12 cm hoch) geleitet, die ein lonenaustauscherharz (CHiCOO) enthielt. Durch die Kolonne wurde eine große Menge Wasser zum Waschen und dann 0.3n Essigsäure zum Entwickeln geleitet. DieEIuatfraktionen (Gesamtvolumen 90 ml), die gegenüber Ninhydrin positiv reagierten, wurden zusammen aufgefangen, unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt und der Gefriertrocknung unterworfen. Auf diese Weise erhielt man 84 mg L-MPGA als weißes Pulver. Reinher 85%: («)>■" 21,7" (c=\. In HCI): Ausbeute 68%.

Beispiel 2

Eine Schlinge voll einer Schrägbodenkultur von Streptomyces violascens SF-2072 (ATCC 31 560) wurde in 200 ml eines sterilisierten Kulturmediums eingeimpft, welches 1% lösliche Stärke. 0.2% Hefeextrakt und 0.2% Pepton enthielt. Der pH-Wert vor dem Sterilisieren lag bei 7,0. Das geimpfte Medium wurde unter Schütteln bei 28° C 72 Stunden bebrütet. Die entstandene Kultur wurde über einem Papierfilter abgesaugt, und die auf dem Papier zurückbleibenden Zellen wurden mit 50 ml physiologischer Salzlösung gewaschen. Man erhielt auf diese Weise 6,5 g (Naßgewicht) der gewaschenen Zellen.

3 g der gewaschenen Zellen wurden sorgfältig in 200 ml einer 0,05m Phosphat-Pufferlösung (pH 7_T0) suspendiert Die Suspension wurde anschließend mit 400 mg N-Acetyl-DL-MPGA versetzt: die entstandene Mischung wurde bei 30⁼ C 16 Stunden geschüttelt, damit die Umsetzung ablaufen konnte. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch wieder über ein Papierfilter der genannten Art filtriert, und die auf dem Papierfilter zurückbleibende feste Masse wurde mit 20 ml Wasser gewaschen. Das Filtrat und die Waschwässer wurden vereinigt und durch eine Kolonne (1,2 cm im Durchmesser und 15 cm hoch) geleitet, in der sich ein lonenaustauscherharz (H*) befand, /um umwickeln wurde Wasser durch die Kolonne geleitet. Die Eliiatfraktionen (Gesamtvolumen 160 ml), dts gegenüber Ninhydrin positiv reagierten, wurden zusammen aufgefangen und unter vermindertem Druck i.ur Trockne eingeengt und anschließend der Gefriertrocknung unterworfen. Man erhielt auf diese Weise 158 ml L-MPGA als weißes Pulver. Reinheit 92%: (<\) 23° ic = 1. In HCI); Ausbeute 88.6%.

Beispiel 3

Die F.luatfraktionen. die durch die in Beispiel 2 benutzte Kolonne hindurchgegangen und zusammen aufgefangen worden waren und deren Gesamtvolumen 25GtiM betrug, winden mit in Nairiumhydroxidiösung neutralisiert und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Zu dem getrockneten Konzentrat wurden 2 ml Essigsäure und 0,11 ml Essigsäureanhydrid gegeben, worauf die Mischung bei 100⁰C 18 Standen zum Rückfluß erhitzt wurde. Das entstandene Gemisch wurde wiederum unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, und der feste Rückstand wurde der enzymatischen Deacylierung in derselben Weise wie in Beispiel 2 beschrieben unterworfen. Man erhielt auf diese Weise 55 mg L-MPGA als weißes Pulver.(λ) 22"

Beispiel 4

Die folgenden Stämme wurden zur Züchtung benutzt, um die gewünschten mikrobiellen Acylasen in derselben -, Weise r.i erzeugen, wie das in den vorausgegangenen Beispielen erläutert worden ist.

A: Pseudomobas maltophilia BN-233(ATCC 31 559) B: Streptomyces vii'ascens SF-2072 (ATCC 31 560)

.. C: Streptomyces diastatochromogenes SF-2073 (ATCC 31 561)

D: Aspergillus sp. KSlOl (ATCC 20 567) E: Aspergillus sp. KS-102 (ATCC 20 568)

100 mg (Naßgewicht) der jeweils bei der Züchtung der vorstehend genannten Stämme gewonnenen gewaschenen Zellen wurden in 1 ml einer 0.05 m Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) suspendiert. Die Suspension wurde jeweils mit 5 mg eines der in der folgende"¹

,.ι Tabelle aufgeführten Substrate- versetzt, und die Mischung wurde in einer Schüttelvorrichtung bei 28° C 6 Stunden behandelt, damit die Umsetzung zuende ablaufen konnte. Das Reaktionsgemisch wurde nachbehandelt wie in den voraufgegangenen Beispielen beschrieben. Die prozentuale Erzeugung von L-MPGA wurde spektrophotometrisch in den Filtraten gemessen, wobei Ninhydrin als Reagenz benutzt wurde. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 zusammengestellt.

Tabelle 3

Prozentuale Erzeugung von L-MPGA

., Substrat ABCDE

N-Acetyl-L-MPGA

55.0 73.2 65.4 52.0 45.S

Fortsetzuna

Substrat

N-Propionyl- 52,2 70,5 55,0 38,0 46,2

L-MPGA '

N-Butyryl- 38,8 46,4 46,4 37,5 35.0

L-MPGA

N-Benzoyl- 24,3 36,1 26,1 24,0 22,4

L-MPGA

N-p-Ch!orben- 21.6 33,8 24,5 - 18,6

zoyl-L-MPGA

Einzelheiten der Herstellung der gewaschenen Zellen

Stamm A:

entsprechend der Methode von Beispiel 1

Stämme B und C:

entsprechend der Methode von Beispiel 2

Stämme D und E:

Schüttelkultur auf einem sterilisierten Kulturmedium, welches 1% Pepton, 0,2% Hefeextrakt. 2% Glucose und 0,001 % Kobaltchlorid (pH 7,0 vor dem Steri'isieren) enthält, bei 28° C über 68 Stunden. Die entstandene Kultur wurde filtriert; die abfiltrierten Zellen wurden gewaschen.

Beispiel5

3 g der gewaschenen Zellen von Streptomyces violascens SF-2072 (ATCC 31 560), die gemäß Beispiel 2 erhalten worden sind, wurden in 100 ml einer 0,05 m Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) suspendiert Die entstandene Suspension wurde zur Zerkleinerung der Zellen in einer französischen Druckzelle bei einem Druck von 105 kg/cm² behandelt und dann bei 1500 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Die nach dem Zentrifugieren überstehende Flüssigkeit wurde als Acylase fur den folgenden Versuch benutzt

20 ml der Acylase wurden mit 120 mg N-Acetyl-DL-MPGA vermischt Die Mischung wurde 16 Stunden bei 30°C gehalten, damit die Umsetzung ablaufen konnte. Danach wurde das Reaktionsgemisch durch eine Kolonne (1,2 cm im Durchmesser und 10 cm hoch) geleitet, die ein Ionenaustauscherharz (H⁺) enthielt Anschließend wurde eine ausreichende Menge Wasser als Entwicklungsmittel durch die Kolonne geleitet Die gegenüber Ninhydrin positiv reagierenden Fraktionen, deren Gesamtvolumen 24 ml betrug, wurden aufgefangen und mit 100 mg Aktivkohle unter Rühren bei Raumtemperatur 30 Minuten behandelt und dann filtriert. Die abfiltrierte Kohle wurde zweimal mit je 5 ml Wasser gewaschen. Das Filtrat wurde mit den Waschwässern vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der verbleibende Rückstand wurde der Gefriertrocknung unterworfen. Man erhielt auf diese Weise 48 mg L-MPGA als weißes Pulver. Reinheit 91%; («)'-' 213° (c-\. In HCI); Ausbeute 88,7%.

Beispiel 6

50 ml der gemäß Beispiel 5 gewonnenen Acylase wurden durch Zugabe von In HCl auf einen pH-Wert von 5,5 eingestellt Anschließend wurde die Acylase mit 20 ml Ionenaustauscherharz (OH-Typ), welches mit Wasser aufgequollen worden war, versetzt Die Mischung wurde bei 5° C drei Stunden gerührt, so daß die Acylase vollständig an dem Ionenaustauscherharz

ίο adsorbiert wurde. Danach wurde die Miicnung 20 Minuten bei 3000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert wodurch das Ionenaustauscherharz in gelförmigem Zustand abgeschieden wurde. Das Gel wurde zweimal mit je 50 ml 0,05 m Phosphat-Pufferlösung (pH

7,0) gewaschea Eine Lösung von 50 mg N-Acetyl-DL-MPGA in 50 ml einer 0,05m Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) wurde zu 10 ml des wie beschrieben gewonnenen Gels gegeben, und die Mischung wurde auf einem magnetischen Rührer 16 Stunden bei 30° C gerührt

χ damit die Reaktion zuende ablaufen konnte. Danach wurde das Reaktionsgemisch 20 Minuten bei 3000 Umdrehungen pro Minute zentrifugien, um das Gel abzuscheiden, welches mit 5 ml derselben Pufferlösung gewaschen wurde. Die nach dem Zentrifugieren in der Zentrifuge überstehende Flüssigkeit wurde mit den Waschwässern vereinigt

Dieselbe Umsetzung wie vorstehend beschrieben, wurde wiederholt indem man 50 ml einer 0,1% N-Acetyl-DL-MPGA-Phosphat-Pufferlösung zu dem gewaschenen Ionenaustauscherharz Gel gab. Die prozentuale Erzeugung von L-MPGA wurde mittels eines Spektrophotometers in der überstehenden Flüssigkeit unter Verwendung von Ninhydrin als Reagenz gemessen.

Die Umsetzung wurde dreimal, jeweils mit demselben lonenaustauscherharz-Acylase-Gel durchgeführt; die prozentuale Bildung von L-MPGA bei diesen Versuchen war wie folgt:

I.Versuch = 86,1% 2. Versuch = 85,0% !Versuch -81,2%

Zusammenfassung

L-2-Amino-4-hydroxy(methyl)phosphinoylbuttersäure (L-MPGA), die als Bakterizid und Herbizid verwendbar ist, kann durch optische Trennung des Racemates, d. h. DL-MPGA, mit Hilfe einer mikrobiel len Acylase gewonnen werden. Das Verfahren bestehl in der Überführung von DL-MPGA in das N-Acylderi vat derselben, Umsetzung der N-Acyl-DL-MPGA ir wäßrigem Medium mit einer mikrobiellen Acylase, di< eine optisch spezifische, hydrolytische Aktivität besitzt so daß selektiv die Acylgruppe aus dem N-Acy I-L

MPGA entfernt wird und ein Gemisch aus L-MPGA und N-Acyl-D-MPGA entsteht, sowie der Isolierung von L-MPGA aus der Mischung. Die Acylase ihrerseiti wird durch Züchtung eines Mikrobenstammes erzeugt der zur Gattung Pseudomonas, Streptomyces odei Aspergillus gehört, und zwar mit Hilfe von Pseudomo nas maltophilia BN-233 (ATCC 3t 559), Streptomyce: violascens SF 2072 (ATCC 31 560), Streptomycei diastatochromogenes SF 2073 (ATCC 31 561), Aspergil lus jp. KS-IOI (ATCC 20 567) oder Aspergillus sp

M KS-102(ATCC20 568).

230 227/»

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur optischen Trennung von DL-2-Amino-4-hydroxy(niethyI)phosphinoyIbuuersäure, dadurch gekennzeichnet, daß man DL-2-Amino-4-hydroxy(methyl)phosphinoylbutter-

säure in das N-Acylderivat überführt, letzteres im wäßrigen Medium mit einer mikrobiellen Acylase, welche eine spezifische optische hydrolytische Aktivität aufweist und durch Züchtung der Mikrobenstämme Pseudomonas maltophilia BN-233 (ATCC 31 559), Streptomyces violascens SF 2072 (ATCC 31 560), Streptomyces diastatochromogenes SF 2073 (ATCC 31 561), Aspergillus sp. KS-101 (ATCC 20 567) oder Aspergillus sp. KS-102 (ATCC 20 568) erhalten worden ist, umsetzt, so daß selektiv die Acylgruppe aus der N-AcyI-L-2-amino-4-hydroxy(methyl)phosphinoylbuttersäure eliminiert wird und ein Gemisch aus L-2-Amino-4-hydroxy(methyl)-phosphinoylbuttersäure und N'-Acyi-D-2-amino-4-hydroxy(methyl)phosphinoylbuttersäure anfällt, aus dem die L-2-Amino-4-hydroxy(methyl)phosphinoylbuttersäure abgetrennt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die mikrobielle Acylase in Form einer Kultur, die durch Züchtung eines der angegebenen Mikrobenstämme erhalten worden ist, oder in Form eines durch Nachbehandlung einer solchen Kultur gewonnenen Enzymmaterials verwendet wird.

Die jetzt durchgeführten Untersuchungen betreffen die optische Trennung von DL-MPGA, welches mit Hilfe eines chemischen Syntheseverfahrens hergestellt worden ist Dabei hat sich gezeigt, daß N-Acyl-DL-MPGA durch eine spezifische Deacylierung von N-Acyl-L-MPGA mit bestimmten Acylasen mikrobiellen Ursprungs getrennt werden kann, so daß das L-MPGA von dem N-Acyl-D-MPGA isoliert werden kann.

Die vorliegende Erfindung basiert auf der Feststellung, daß bestimmte mikrobielle Acylasen als optisch spezifische hydrolytische Enzyme wirken, die die Fähigkeit besitzen, selektiv die Acylgruppe aus N-acy-Iiertem L-MPGA zu eliminieren, ohne dabei das N-Acyl-D-MPGA anzugreifen. Derartige mikrobielle Acylasen werden bei der Züchtung von Bakterienstämmen der Gattung Pseudomonas oder von A ctinomyceten der Gattung Streptomyces oder von Pilzen der Gattung Aspergillus erzeugt

Gegenstand der Erfindung ist das in den Patentansprüchen beanspruchte und gekennzeichnete Verfahren zur optischen Trennung von DL-2-Amino~4-hydroxy(methyl)phosphinoylbuttersäure.

Die als Ausgangsverbindung benutzte N-Acyl-DL-2-amino-4-hydroxy(methyl)phosphinoylbuttersäure läßt sich durch die allgemeine Formel