DE2223340C3 - Verfahren zur Stabilisierung von Glucose-Isomerase in Bakterienzellen - Google Patents

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Stabilisierung der Glucose-Isomerase-Aktivität, die in Bakterienzellen enthalten ist, durch Behandlung der Bakterienzellen mit Glutaraldehyd. Das entstehende stabilisierte Enzym kann zur Umwandlung von Glucose in Fructose verwendet werden und dann erneut für weitere Umwandlungen verwendet werden, wobei nach jeder Verwendung eine minimale Verringerung der Enzymaktivität eintritt.

Es ist bekannt, daß ein Glucose-Isomerase-Enzym verwendet werden kann, um die Umwandlung von Glucose (Dextrose) in Fructose (Lävulose), die eine höhere Süßkraft besitzt als das Ausgangsmaterial, zu katalysieren. Es ist auch bekannt, daß Glucose-Isomerase erzeugt wird durch Fermentation von Organismen, wie Pseudomonas hydrophila. Streptomyces flavovireus, Streptomyces echinatur, Streptomyces achromogenus, Streptomyces albus, Streptomyces olivaceus und ähnlichen in geeigneten Nährmedien. Die Glucose Isomerase wird innerhalb der Bakterienzellen gebildet, die während ihrer Produktion wachsen. Die Zellen können von der Fermentationsbrühe abfiltriert und direkt als Quelle für die Glucose-Isomerase verwendet werden. Wahlweise können die Zellen durch Filtration gewonnen und dann nach bekannten Verfahren zerstört werden. Die entstehenden aufgebrochenen Zellen und der freigesetzte Inhalt können ebenfalls als Quelle zur Glucose-Isomerase verwendet werden. Ferner können die Zellen aufgestoßen und die Zelltrümmer durch Zentrifugieren entfernt werden. Die überstehende Flüssigkeit kann direkt als Quelle für Glucose-Isomerase verwendet werden, oder das Enzym kann von dieser Flüssigkeit nach bekannten Verfahren als Pulver gewonnen werden.

Die nach all diesen bekannten Verfahren gebildete Glucose-Isomerase war für kommerzielle Zwecke nicht geeignet wegen der hohen Anwendungskosten des Enzyms. Die Kosten für die Enzymproiiuktion waren hoch wegen der aufwendigen Nährmedien, die notwendig waren, und der verhältnismäßig geringen Enzymausbeute verglichen mit der Produktion anderer Enzyme. Es ist daher notwendig, das Glucose-Isomerase nach der Verwendung zurückgewonnen und erneut für andere Umwandlungen von Glucose in Fructose verwendet werden kann.

Die Glucose-Isomerase kann besonders leicht zurückgewonnen und erneut verwendet werden, wenn sie noch in den ursprünglichen Bakterienzellen enthalten ist Die Bakterienzellen können leicht von dem zuckerhaltigen Reaktionsmedium abgetrennt werden. Nach den bekannten Verfahren war jedoch eine lohnende Wiederverwendung der Bakterienzellen nicht möglich, da die Zellen ungefähr 50% ihrer Glucose-Isomerase-Aktivität während jeder Verwendung verloren.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Stabilisierung von Glucose-Isomerase in Bakterienzellen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Bakterienzellen, die Glucose-Isomerase-Aktivität enthalten, mit Glutaraldehyd behandelt

Die Bakterienzellen, die Glucose-Isomerase-Aktivität enthalten und für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind, können nach bekannten Verfahren gebildet werden. Die bevorzugten enzymhaltigen Zellen werden erzeugt durch Züchtung unter submersen aeroben Bedingungen einer Kultur von Streptomyces olivaceus NRRL 3583 oder dessen Mutanten in einem Medium enthaltend geeignete Nährstoffe. Die entstehenden Bakterienzellen werden von der Fermentationsbrühe abfiltriert oder abzentrifugiert.

Die so gewonnenen Bakterionzellen werden dann in einem wäßrigen Medium suspendiert und mit Glutaraldehyd vermischt Der Glutaraldehyd wird in einer Menge von ungefähr 0,1 bis ungefähr 50 Gewichtsprozent, bezogen auf das Trockengewicht der Zellen, verwendet. Vorzugsweise wird der Glutaraldehyd in einer Menge von ungefähr 10 bis ungefähr 50 Gewichtsprozent bezogen auf das Trockengewicht der Zellen, verwendet. Die Bakterienzellen besitzen anfangs einen pH-Wert von ungefähr 8,5. Wenn die Bakterienzellen mit dem Glutaraldehyd behandelt werden, sinkt der pH-Wert unter Umständen auf ungefähr 6,5. Wenn der Anfangs-pH-Wert oberhalb von 8,5 liegt oder wenn der pH-Wert während der Behandlung auf weniger als 6,5 sinkt sollten geeignete Puffersubstanzen zugesetzt werden, um den pH-Wert der Bakterienzellen im Bereich von ungefähr 6,5 bis ungefähr 8,5 zu halten.

Die Bakterienzellen sollten ungefähr eine halbe bis ungefähr 2 Stunden mit dem Glutaraldehyd behandelt werden. Die bevorzugte Behandlungsdauer beträgt ungefähr 1 bis ungefähr t '/2 Stunden.

Die Behandlungstemperatur ist nicht in engen Grenzen kritisch und kann günstigerweise von ungefähr 15 bis ungefähr 6O⁰C betragen. Die Glucose-Isomerase-Aktivität der Ausgangsbakterienzellen und des mit Glutaraldehyd behandelten Materials wurden nach folgendem Verfahren bestimmt.

Es wurde eine 62,5%ige (GewVVol.) wäßrige Lösung von Glucose hergestellt, indem man unter Rühren langsam 625 g wasserfreie Glucose zu 300 ml heißem destilliertem Wasser zugab. Die Lösung wurd« auf Zimmertemperatur abgekühlt, und hierzu wurden 125 ml Im wäßrige Lösung von Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan vom pH-Wert 8,5, 125 ml Im wäßrige Lösung von Magnesiumsulfat und 50 ml 0,025m wäßrige Lösung von Kobaltchlorid zugesetzt. Das entstehende Gemisch wurde dann mit destilliertem Wasser auf 1 1 verdünnt.

10 ml der oben angegebenen Glucoselösung wurden in einen 25-ml-Meßkolben gegeben. Es wurde eine ausreichende Menge des zu untersuchenden Enzyms

zugegeben, um zu einer Reduktion der spezifischen Rotation von ungefähr 23 bis ungefähr 7,5° zu kommen, wie später beschrieben wird. Der Kolbeninhalt wurde dann mit destilliertem Wasser auf 25 ml verdünnt, und das entstehende Gemisch wurde 2 h bei 60⁰C stehengelassen. Die Reaktion wurde dann durch Zusatz von 1 ml einer 03m wäßrigen Lösung von Perchlorsäure abgebrochen. Das Gemisch wurde dann mit 15 000UpM 20 min zentrifugiert, und die optische Drehung (in Grad) der überstehenden Flüssigkeit wurde durch bekannte Verfahren bestimmt Es wurde eine Blindprobe auf die gleiche Weise, aber ohne das Enzym, gemacht Die optische Drehung der Blindprobe wurde ebenfalls bestimmt Die spezifische Rotation [«] f der Probe bzw. der Bliridprobe betrug 2« odsr den doppelten Wert der beobachteten optischen Drehung. Die prozentuale Umwandlung von Glucose in Fructose wurde durch die folgende Formel berechnet:

Prozentuale _ [«] BJmdprobe - [»robe

Umwandlung

[n] Blmdprohc + 92

100

Die Enzymaktivität in Glucose- Isomerase-Einheiten (GIE) der untersuchten Enzymprobe wurde nach der folgenden Formel berechnet:

[ig gebildete Fructose

mg oder ml verwendetes Enzym

00461

wobei die /ig gebildete Fructose durch Multiplikation des oben berechneten Wertes für die prozentuale Glucose-Umwandhing mit dem Faktor 6,25 · 10⁶ berechnet wurden. Eine Glucose-Isomerase-Einheit ist die Menge an Enzym, die 1 μ Mol Glucose pro Minute unter den Versuchsbedingungen in Fructose umwandelt

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert

Beispiel 1

Eine Kultur von Streptomyces olivaceus NRRL 35P3 wurde unter Rühren in ein Fermentationsgefäß gegeben, das 101 eines wäßrigen Gemisches mit 0,7% Xylose, 0,3% raffinierte Maisstärke, 1,0% Peptone, 0,5% Fleischextrakt 0,25% Hefeextrakt 0,50% Natriumchlorid und 0,05% Magnesiumsulfat und einen pH-Wert von 7,0 enthielt. Alle oben angegebenen Prozentwerte beziehen sich auf GewiVol. Es wurde mit 400 UpM gerührt und Luft mit einer Geschwindigkeit von 3 Volumina Luft pro Volumen des Mediums in 1 Minute durchgeleitet Die Fermentation wurde 24 h bei 32° C fortgesetzt Die Gärbrühe wurde mit 40 000UpM zentrifugiert um die Bakterienzellen abzutrennen. Ein Anteil der Bakterienzellcai wurde gefroren und lyophilisiert

3 g der gefriergetrockneten ganzen Zellen wurden in 50 ml wäßrigem Tris-(hydroxymethyl)-aminoniethan bei einem pH-Wert von 8,5 suspendiert und die Suspension unter Rühren mit 0,1 g einer wäßrigen Lösung von 25 Gewichtsprozent Glutaraldehyd (0,83 Gewichtsprozent Glutaraldehyd, bezogen auf das Trockengewicht der Zellen) unter Rühren bei Raumtemperatur {ungefähr 2O⁰C) 1'/2 Stunden behandelt Die behandelten Zellen, die eine Aktivität von 145GIE/g hatten, wurden abfiltriert und zu einer wäßrigen Lösung von 62,5 Gewichtsprozent Glucose, enthaltend 0,001 Gewichtsprozent Kobaltchlorid und 0,01 Gewichtsprozent Magnesiumchlorid, zugegeben. Das entstehende Gemisch wurde 2 Stunden bei 70⁰C umgesetzt, wobei ungefähr 4,5% Glucose in Fructose umgewandelt wurden. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren von dem Reaktionsmedium entfernt und das Fructose-Dextroöe-Gemisch dekantiert

Die Zellen wurden untersucht und es zeigte sich, daß sie die gleiche Glucose-Isomerase-Aktivität besaßen wie vor ihrer Anwendung. Die Zellen wurden dann erneut verwendet, um eine frische Glucoselösung unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben zu behandeln, und sie wurden wieder zurückgewonnen und untersucht Dieses Verfahren wurde insgesamt 12mal wiederholt Danach besaßen die Zellen noch 56% ihrer ursprünglichen Glucose-Isomerase-Aktivität Die Zellen, die nicht mit Glutaraldehyd behandelt worden waren, verloren nahezu ihre gesamte Glucose-Isomerase-Aktivität nach 2maliger Anwendung.

Beispiel 2

Eine Fermentationsbrühe, enthaltend Streptomyces olivaceus NRRL 3583 Bakterienzellen, wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellt. Ein Anteil dieser Fermentationsbrühe wurde zentrifugiert, und 3 g der nassen Bakterienzellen wurden isoliert. Diese Zellen wurden dann in 50 ml Wasser suspendiei t und mit 0,1 g einer wäßrigen Lösung von 25 Gewichtsprozent Glutaraldehyd mit einem pH-Wert von 6,5 bis 8,5 bei Raumtemperatur 1 Stunde behandelt. Die behandelten Zellen, die eine Aktivität von 265 GI E/g besaßen, wurden abfiltriert und wie in Beispiel 1 verwendet, um Glucose in Fructose umzuwandeln. Die Zellen wurden insgesamt 12mal zurückgewonnen und für frische Glucose verwendet Die Zellen besaßen danach noch 60,7% ihrer ursprünglichen Glucose-Isomerase-Aktivität

Beispiel 3

Eine Fermentationsbrühe, enthaltend Streptomyces olivaceus NRRL 3583 Bakterienzellen, wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellt. Eine aliquote Menge der gesamten Fermentationsbrühe, enthaltend

3 g ganze Zellen, wurde mit 0,2 g einer wäßrigen Lösung von 25 Gewichtsprozent Glutaraldehyd (1,67 Gewichtsprozent Glutaraldehyd, bezogen auf das Trockengewicht der Zellen) unter Rühren bei Raumtemperatur bei einem pH-Wert von 6,5 bis 8,5 1 Stunde lang vermischt. Die behandelten Zellen, die eine Aktivität von 271 GIE/g besaßen, wurden abfiltriert und auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise verwendet um Glucose in Fructose umzuwandeln. Die Zellen wurden zurückgewonnen und insgesamt 12mal für frische Glucose verwendet Danach besaßen die Zellen noch 61,6% ihrer ursprünglichen Glucose-Isomerase-Aktivität.

Beispiel 4

Eine Fermentationsbrühe, enthaltend Streptomyces olivaceus NRRL 3583 Bakterienzellen, wurde auf die in Beispiel 1 angegebene Weise hergestellt. Ein aliquoter Anteil der gesamten Fermentationsbrühe, enthaltend

4 g ganze Zellen, wurde mit 0,4 g einer wäßrigen Lösung von 25 Gewichtsprozent Glutaraldehyd (2,5 Gewichtsprozent Glutaraldehyd, bezogen auf das Trockengewicht der Zellen) 1 Stunde unter Rühren bei Raumtemperatur vermischt Der pH-Wert wurde nicht eingestellt. Zu Beginn der Reaktion besaß das Zellgemisch einen pH-Wert von 8,4. Am Ende der Reaktion betrug der pH-Wert 6,8. Die behandelten Zellen, die eine Aktivität von 387 GIE/g besaßen, wurden abfiltriert und zur Umwandlung von Glucose in Fructose auf die in

Beispiel 1 beschriebene Weise verwendet Die Zellen wurden zurückgewonnen und insgesamt 15mal für frische Glucose verwendet Die Zellen besaßen danach noch 100% der ursprünglichen Glu.x>se-Isomerase-Aktivität

Beispiel 5

Eine Fermentationsbrühe, enthaltend Streptomyces oliyaceus NRRL 3583 Bakterienzellen, wurde auf die in Beispffl 1 beschriebene Weise hergestellt wobei ein Fermentationsgefäß von 378,51 verwendet wurde. Die Fermentationsbriihe besaß eine Gesamtaktivität von 1350 000 GIE and enthielt 3,18 kg Bakterienzellen, bezogen auf das Trockengewicht (425GIE/g). Der pH-Wert der Fermentationsbrühe wurde durch Zugabe *5 von Natriumhydroxid auf 8,2 eingestellt 3,18 kg einer wäßrigen Lösung von 50 Gewichtsprozent Glutaraldehyd, die auf eine Konzentration von 0,5 bis 0,6% (GewiVoL) verdünnt war, wurde zu der Fermentationsbrühe innerhalb von 30 bis 40 Minuten unter Rühren zugegeben (50 Gewichtsprozent Glutaraldehyd, bezogen auf das Trockengewicht der Zellen). Das entstehende Gemisch wurde dann bei Raumtemperatur I¹/2 Stunden unter leichtem Rühren umgesetzt. 0,5% (Gew./VoL) Diatomeenerde wurden als Filterhilfe zugesetzt und die Fermentationsbrühe über einen Rotationsvakuumfilter filtriert Der Filterkuchen wurde mit Wasser gewaschen, um Reste der Fermentationsbrühe zu entfernen. Die Bakterienzellen besaßen eine Gesamtaktivität von 1 215 000 GIE oder 90% der ursprünglichen Aktivität

Eine Glucoselösung wurde hergestellt durch Vermischen von 102 kg Glucose in 2081 Wasser (49,2% Glucose Gew/Vol.). Zu dieser Lösung wurde Kobaltchlorid in einer Menge von 0,001% (GewyVoL) und Magnesiumchlorid in einer Menge von 0,01% (Gew./ Vol.) zugegeben. Ein Anteil der wie oben hergestellten mit Glutaraldehyd behandelten Bakterienzellen mit einer Gesamtaktivität von 407 250 GIE wurde ebenfalls zu der Glucoselösung zugegeben. Das entstehende Gemisch wurde 24 Stunden bei 6O⁰C gerührt wobei der pH-Wert durch Zugabe von Natriumhydroxid auf 7,7 bis 7_:9 gehalten wurde. Die Bakterienzellen wurden von dem Reaktionsgemisch abfiltriert, das 40,2% Fructose enthielt Die gesammelten Bakterienzellen wurden erneut für eine frische Glucoselösung auf die oben beschriebene Weise verwendet. Dieses Verfahren wurde wiederholt bis die Bakterienzellen insgesamt 9mal verwendet worden waren. Bei dem 9. Ansatz ergab die GIucose-Isomerase-Aktivität in den Bakterienzellen 38,8% Fructose, was noch eine Wirksamkeit von 96,5%, bezogen auf die ursprüngliche Wirksamkeit bedeutet ROhrgeschwindigkeit von 400 UpM bei einem pH-Wert von 7,0 und 30⁰C wachsen, wobei ein Volumen Luft pro Volumen des Fennentators in der Minute durchgeleitet wurde. Die Menge von jeweils ungefähr 101 wurde in 2 Teile geteilt Die eine Hälfte wurde filtriert und getrocknet Die andere Hälfte wurde mit 7 Gewichtsprozent Glutaraldehyd (bezogen auf das Trockengewicht der Zellen) bei einem pH-Wert von 8,2 ungefähr 1 Stunde vermischt. Sie wurde dann filtriert und getrocknet Jeder Anteil der Zellen wurde auf die GIucose-Isomerase-Aktivität untersucht Anteile von jedem Ansatz der Zellen wurden dann mit Anteilen von 30 Gewichtsprozent wäßriger Dextrose-Lösung vermischt und 22 Stunden bei einem pH-Wert von 7,2 auf 6O⁰C erhitzt Die Zellen wurden jeweils in einer solchen Menge verwendet daß man die gleiche anfängliche GIucose-Isomerase-Aktivität erhielt (ungefähr 4GIE pro g Dextrose). Die Zellen wurden dann abfiltriert und mit einem frischen Ansatz Dextrose-Lösung vermischt Das entstehende Gemisch wurde dann erneut 22 Stunden bei einem pH-Wert von 7,2 auf 6O⁰C erhitzt. Die Zellen wurden wieder abfiltriert Proben der Zellen wurden nach der 1. und nach der 2. Anwendung zur Umwandlung von Dextrose in Fructose entnommen, und es wurde die GIucose-Isomerase-Aktivität dieser Proben gemessen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben. Dabei bezeichnet der Ausdruck »behandelt« die erfindungsgemäß mit Glutaraldehyd behandelten Zellen. Die »prozentuale Aktivität« gibt den Prozentsatz an GIucose-Isomerase-Aktivität an, die nach der 2. Anwendung noch vorhanden ist, bezogen auf die GIucose-Isomerase-Aktivität nach der 1. Anwendung.

Stamm

Prozentuale Aktivität

behandelt nicht behandelt

Streptomyces venezuelae 35,0 13,1

ATCC 21 113

Streptomyces olivochromogenes 67,0 12,5

ATCC 21 114

Streptomyces phaeochromo- 58,0 13,1

genes NRRL 23 559

Streptomyces ochromogenes 27,4 20,6

NRRL 2120

Streptomyces flavovirens 273 14,3

NRRL 2685

Beispiel 6

Es wurden Kulturen von Streptomyces venezuelae ATCC 21 113. Streptomyces olivochromogenes ATCC 114, Streptomyces phaeochromogenes NRRL 3559, Streptomyces ochromogenes NRRL 2120 und Streptomyces flavovirens NRRL 2685 in dem in Beispiel 1 beschriebenen Medium gezüchtet. Man ließ die Zellen bis 43 Stunden in einem 10-1-Fermentator mit einer Aus diesen Werten geht hervor, daß die Behandlung mit Glutaraldehyd bei allen Zellen zu einer Stabilisierung der GIucose-Isomerase-Aktivität führt.

Ein bekanntes in Polyacrylamidgel eingebautes Ghicoseisomerase-Enzympräparat (Applied Microbiology.Bd.21,1971,S.588bis593)erwies sich bereits nach einmaliger Anwendung als inaktiv. Im Gegensatz hierzu besitzen erfindungsgemäß stabilisierte Bakterienzellen nach 12maliger Anwendung etwa 60% ihrer Aktivität (s. Beispiele 1 bis 3) bzw. nach 15maliger Anwendung noch

100% ihrer Aktivität (s. Beispiel 4).

Claims (4)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Stabilisierung von Glucose-Isomerase in Bakterienzellen, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterienzellen, die Glucose-Isomerase-Aktivität enthalten, mit Glutaraldehyd behandelt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Glutaraldehyd in einer Menge ι ο von ungefähr 0,1 bis ungefähr 50 Gewichtsprozent, vorzugsweise ungefähr 10 bis ungefähr 50 Gewichtsprozent, bezogen auf das Trockengewicht der Zellen, verwendet

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß nan die Behandlung mit Glutaraldehyd bei einem pH-Wert von ungefähr 6,5 bis ungefähr 8,5 durchführt

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterienzellen verwendet, die durch Streptomyces olivaceus gebildet worden sind.