DE2349464A1 - Verfahren zur herstellung laevulosehaltiger sirupe - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich ganz allgemein auf die enzyma*fcisehe Isoiaerisierung und inöbesondere auf Verbesserungen bei der technischen Durchführung der kontinuierlichen Isomerisierung.

Die enzymatisch^ Stärkehydrolyse zur Herstellung von Glucosesirup und Trockenglucösesirup wird technisch im allgemeinen durchgeführt, um Hydrolysate mit 3).ü.-Werten über 95$ zu erhalten, wobei insbesondere chargenweiwe verfahren wird.

Untersuchungen über die enzymatisch^ Isomerisierung von dextrose und Stärkehydrolysaten zur Herstellung von laevulosehaltigen Produkten, die in der Literatur beschrieben werden* verwenden bei der Isomerisierung ion allgemeinen die chargenweise Arbeitsweise . Eine chargenweise Isomerisierung kann beispielsweise in einem Reaktor unter Rühren bei einer Temperatur von etwa 7O⁰Cftyid einem pH Von etwa 6,2 während einer Isomerisierungszeit von etwa 40 bis 60 Stunden durchgeführt werden* Die Enzymmenga und die Konversiohstemperatur werden so gewählt, dass man in dem Endprodukt den gewünschten Laevulose-G-ehalt erhält. Das pH de&

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Sirups kann entweder kontinuierlich oder abschnittsweise durch Zugabe von basischen; Lafcerial, wie liatriumbiearbonat, während der Isomerisierung aufrechterhalten werden.

Die Wahl der optimalen Ai-'beits bedingungen für die chargenv\eise Isomerisierung ist nicht einfach. Eine AusgaiifTnruriable, die in gewissem Umfange festgelegt v/ei'den ktain, i~ l die besondere Enzym-Zubereitung, die verwendet wird. Isomerase—Enzyme haben ihre eigenen "besonderen Eigenschaften, und die \^rori verschiedenen Mikroorganismen produzierten Enzyme haben, nicht die gleichen optimalen i-3edingungen, für· ihre Einwirkung. So hat beispielsweise jede Enzym-Zubereitung ihr eigenes pH-Optimum, ein Temperatur-Optimum, einen optimalen Bedarf an Metallen, eine bestimmte Temperatur-Stabilität und eine bestimmte f. chaelis-Konstante neben anderen Eigenschaften, wie beispielsweise Dr.T.Sato in einer Arbeit "The Enzyme for the Isomerization of Glucose" berichtet, die in der japanischen Zeitschrift Deiapunto G-ijutsu Kenkyu 32, 81 - 88 (1965) veröffentlicht wurde.

Wenn die Enzym-Zubereitung von einem Mikroorganismus der Gattung Streptomyces erzeugt wird, ist die von. dem Enzym gebildete Laevu-1 oseinenge bei 7O⁰G grosser als bei 6O⁰C. Bei pH 6,2 gehen'jedoch einige Vorteile, die beim Durchführen der Isomerisierung bei höheren Temperaturen erzielt werden, verloren, weil das leicht saure pH die gebildete L-aevul ο semenge und die .Enzymstabilität reduziert.

Für eine wirksame chargenweise Isomerisierung ist ein kontinuierliches Mischen der Stärkehydrolysat- Lösung bzw. des Sirups erforderlich. Wenn als Quelle für die Enzymaktivität Zellen verwendet werden, so hat dies den Nachteil, dass durch das Mischen' Seherkräfte erzeugt werden, die sich auf die Mikrobenzellen übertragen, die das Enzym enthalten« Wenn die Zellen zerstört werden, tritt die Zellflüssigkeit einschliesslich der Enzyme in die Lösung über. Unter diesen Bedingungen scheint das Enzym gegen Inaktivierung empfindlicher au sein als Enzyme, die in intakten Zellen verbleiben«

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In der Literatur-irt die Wirkung der Temperatur auf die Isomerase behandelt worden. Beispielsweise haben zwei Pioniere uuf diesem Gebiet, K. Tsuniura und T. Sato von dem Japanese Food Research Institute eine Eolge von Veröffentlichungen unter dein Titel "Enzymatic Conversion of D-Glucose to D-Fructose" geschrieben. In den Teilen V und VI, welche in Agr. Biöl."Uhem. 29, 1123 1128 und 1129 - 1134 (1965) erschienen sind, beschreiben sie speziell die Wirkung der Temperatur auf eine Isomerase, die aus Aerobacter cloacae erhalten wurde. Sie fanden, dass dieses Enzym seine Hauptaktivität bei 80⁰U in Gegenwart von Magnesium und bei 90⁰C in Gegenwart von'Kobaltionen verlor. Ohne die Gegenwart von Ivie tall ionen, die stabilisierend wirken, verlor ihr Enzym, wenn es für 10 Minuten einer Temperatur von 70⁰O ausgesetzt wurde, einen wesentlichen Teil seiner Aktivität. Der Zusatz von stabilisierenden lietallionen erhöhte die Hitzeverträgliehkeit, aber bei etwa 8O⁰C konnte auch dann Enzym-Inaktivierung beobachtet werden.

Ein Artikel von Yoshimura, Danno und Natake von der Hy ο go-Uni ve rsität, Japan, der unter dem Titel "Studies on Glucose Isomerizing Activity of D-Xylose Grown Cells from Bacillus coagulans, Strain HN-68" in Agr.Biol.ühem. 30, (10). 1015 - 1023 (1966) erschienen ist, berichtet über die Wirkung der Temperatur auf das Isomerase-Enzym aus der von ihnen verwendeten Bikroorganismen-Quelle. Die grösste Aktivität nach zweistündiger Inkubation wurde bei 70⁰C beobachtet. Räch einer Inkubationszeit von 20 Stunden lag das Maximum der Aktivität bei Temperaturen im Bereich von 60⁰C bis 65°C. Oberhalb von 70⁰C wurde nach 2 Stunden das Enzym im wesentlichen inaktiviert $ und beim chargenweisen Arbeiten mit einer gegebenen Enzymmenge und Vergleich der dabei angewendeten Temperaturen trat "BnZyminaktiVierung im wesentlichen nach 20 Stunden oberhalb 65⁰C ein.

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Im Journal of ffood Science and Technology ( IIinon Shokuhin Kogei Gakkaishi) 14 (12), 539 - 540 (1967) haben N. Tsumura und" M. Ishikawa unter dem Titel " Continuous Isomerization of Glucose by a Column of Glucose Isomerase" ein Verfahren zum kontiinuierlichen Isoir;erisieren von Glucose beschrieben, wonach eine gereinigte Isomeräse-Enzymprobe, die sich von einem Streptomyces-Stamia ableitete, in einer Säule an einem DfiAE-SephadexBett fixiert wurde, um'das Enzym zu immobilisieren. Die Säule wurde mit warmem Wasser auf 6O⁰C erwärmt, das durch einen Mantel strömte. Dann wurde eine GlucoselÖsung durch die Säule gegeben. Es wurde eine mögliche Reduzierung der Enzymaktivität beobachtet,■obwohl die Autoren nicht sicher waren, ob die beobachtete Abnahme der Isomerisierung durch Enzyminaktivierung oder durch Auslaugen des !Enzyms aus der Säule verursacht wurde.

Kürzlich haben Dr. Takasaki und seine Mitarbeiter vom Japanese Fermentation Research Institute in einer Arbeit, die in dem Buch "Fermentation"Advances", herausgegeben -von D. Perlman, Academic Press, 1969, beginnend auf S..561 erschienen ist, eine kontinuierliche Säulen-Isomerisierung.beschrieben und die Hitzestabilität eines Isomerase-Enzyms, das sich von einem gewöhnlichen Streptomyces-Stamm ableitete, charakterisiert. Sie
rung

Sie beobachteten oberhalb 70⁰C nach 10 Minuten Enzyminaktivie-

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein neues verbessertes technisches Verfahren, xxe. auf kontinuierlichem Wege die enzymatisch^ Isomerisierung von Dextrose in- laevulose durchzuführen.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein technisch brauchbares Verfahren zur Isomerisierung von Starkehydrolysaten oder von Dextroselcsungen in laevuiosehaltige Produkte, das schaftlicher i3t als die bekannten Verfahren»

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W.;gen der Vielzahl von Bogriffen, die in der Literatur in Gebrauch sind, sollen hier einige Definitionen gebracht werden, im die vorliegende Erfindung zu vereinfachen und sie knapper zu halten.

Die Bezeichnung ¹¹D.S.-Wert" ist eine Abkürzung für "Dextrose-Äciuivalent" ( "dextrose equivalent" ). Diese Bezeichnungen werden wechselweise für den %-Gehalt an reduzierenden Zucker, berechnet als Dextrose bzw. D-Glucose und bezogen auf Trockensubstanz angewendet.

Die Bezeichnung "Stärkehydrolysat" wird im allgemeinen angewendet, Uiii einen Sirup oder ein Trocicenprodukt zu kennzeichnen, das durch Hydrolyse von Stärke erhalten worden ist. Ein derartiges Produkt kann durch Hydrolyse mit Säuren oder Enzymen hergestellt werden-oder durch eine kombinierte bäure-enzymatische Hydrolyse. Ein bevorzugter Typ eines Stärkehydrolysate für die Verwendung zur Isomerisierung im .Rahmen der vorliegenden Erfindun wird durch saure oder enzymatische Verdünnung von Stärke bis zu einem D.E.-Wert von 10% oder weniger und nachfolgende enzymatische Verzuckerung bis zu einem D.E.-Wert über 95% und vorzugsweise über 97,5% hergestellt.

Stärkehydrolysate mit mittlerem D.E.-Wert werden in der Literatur üblicherweise als "Glucose¹¹ bezeichnet, unabhängig davon, ob das Stärkehydrolysat in JOrm eines Sirups oder eines festen Produktes vorliegt. Die Bezeichnung "Dextrose" ist im allgemeinen reserviert für das gereinigte kristallisierte üionosaccharid, das ■ aus Stärkehydrolysaten mit hohem D.E.-Wert erhalten wird, aber auch für D-Glucose als Bestandteil von Stärkehydrolysaten. In den folgenden Ausführungen wird die Bezeichnung "Dextrose" verwendet, um dieses Lionosaccharid. in jeder Form, in Lösung oder in trockenem Zustand,, als Bestandteil eines Stärkehydrolysats in Sirup- oder in Trockenform oder in rainem kristallisiertem Zustand zu kennzeichnen. ■ ■ .

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Die Bezeichnungen "Fructose" und "Laevulose" werden in der Literatur iiii allgemeinen vv-echsölweise angewendet, um 'ein besonderes Isoiuereii der Dextrose zu kennzeichnen, das süsser als Dextrose ist. Dienes Isomere kommt geiueinsiüi mit Dextrose im Honig und iiii Invertzucker vor, es ist im Hinulick auf seinen süssen Geschmack w-^x'tvoll. In den folgenden Ausfiihiungen wird die Bezeichnung "L-iOvuloae" ge br:, rieht werden, um dieses toonosaccharid zu kennzeichnen.

Das Enzym, das Dextrose zu Laevulose isomerisiert, wird in der Literatur mit verschiedenen Namen bezeichnet. In der US-PS 2 950 228 wix-d es als Xylose-I^omerase bezeichnet, weil es Xylose zu Xylulose iüomerisiert. Diese Aktivität besitzt es zusätzlich zu der Eigenschaft, Dextrose zu Laevulose zu isomerisieren. bis wird in der Literatur auch als Dextrose-Isomerase und Glucose-Isomerase bezeichnet. In den folgenden Ausführungen wird die Bezeichnung "Xvlose-Isomorase" gebraucht.werden, weil die Forschung zu der Erkenntnis geführt hat, dass Xylose das natürliche Substrat der Isomerase ist.

Die Bezeichnung "Enzyin-Zubereitung" wird angewendet, um jede stoffliche Zusammensetzung zu kennzeichnen, welche die gewünschte Xylose-Isomerase-Enzymaktivität besitzt. Die- Bezeichnung wird beispielsweise angewendet für ganze lebende Zellen, getrocknete Zellen, Zellextrakte und gereinigte und konzentrierte Präparate, die sich von den Zellen ableiten. Enzym-Zubereitungen können in trockenem oder flüssigem Zustand vorliegen. Da sich die vorliegende Erfindung auf einen kontinuierlichen Prozess bezieht, wird die Enzym-Zubereitung lunker in immobilisierten! Zustand vorliegen» Die Enzym-Zubereitung kann beispielsweise in der Losung eines Stärkehydrolysats dispergiert sein aber in dieser Lösung zurückgehalten werden,= weil die gewünschten Endprodukte durch ein selektives Membranfilter unter Verwendung der Technik der Ultrafiltration Von der Lösung selektiv abgetrennt werden. Andererseits kann die Enzym-Zubereitung auch an eine unlösliohe Matrix gebunden sein. Die drei wichtig-

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8AD ORIGJNAL

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sten Methoden, um Enzyme an Matrizes zu binden, sind gewöhnliche !covalente chemische Bindungen, Adsorption und' Einschluss des Enzyms in ein netzartiges Gel mit Poren, die gross genug sind, um die Moleküle des Substrats und des Produktes frei passieren zu lassen, aber klein genug, um das Enzym zurückzuhalten.

Alle Teil— und Pro ζ ent angab en beziehen sich auf Gewicht, wenn nicht ausdrücklich etwas anderes gesagt ist.

Eine Isomerase-Einheit wird definiert als Iüenge Enzym-Aktivität, die erforderlich ist, um l.Mikromol Laevulose je Mnute unter den beschriebenen I;.;omerisierungsbedingungen, die in den folgenden Ausführungen näher erläutert werden, zu produzieren.

Mit der Bezeichnung "Streptomyces" wird eine Gattung von Mikroorganismen der Klasse Actinomycetales gekennzeichnet. Diese Mikroorganismen' sind an der Luft Myzele produzierende Actinomycetes. Die Gattung ist gut gekennzeichnet. Einige ihrer wichtigsten unterscheidenden Eigenschaften werden beispielsweise in dem Buch "The Actinomycetes" von Selman A. Y/aksman, - The iionald Press Company, Uew York 1967, Seite 135 ff. beschrieben.

Es wurde nunmehr ein technisch durchführbares kontinuierliches Verfahren zur Isomerisierung von Dextrose zu Laevulose gefunden, das einige bemerkenswerte Vorteile aufweist.

Allgemein gesprochen bezieht sich das erfindungsgemässe Verfahren, auf die Durchführung der Isomerisierung bei einer nahezu konstanten Anfängst erxip e rat ur von wenigstens 50⁰G, vioran sich eine Erhöhung der Arbeitstemperatur,die stufenweise oder in einem einzigen Schritt erfolgen kannj auf.einen Wert, der 5°G oder hoher oberhalb der Arbeitstemperatur in der Anfangsphase liegt, auf eine Temperatur nicht über 80 G anschliesst.

In einer bevorzugten Ausführungsform dar Erfindung wird ein Strom einer dextroSchaltigen Lösung während einer Anfangsphase der Isomerisierung der Wirkung einer iiamobilisj erten Enzym-Zu-

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bereitung bei einem pH von wenigstens 7,0 und vorzugsweise im Bereich von pH 7,5 bis 8,5 sowie bei einer Temperatur von we- . nigstens 5O⁰C , die aber wenigstens 10 G unterhalb der Temperatur liegt, bei der eine schnelle Inaktivierung des Enzyms eintritt, unterworfen. Für Enzym-Zubereitungen, die sich von Mikroorganismen der Gattung Streptomyces ableiten, ist die Temperatur, oberhalb der eine schnelle Inaktivierung der Enzym-Zubereitung eintritt, gewöhnlich etwa 7O⁰G, sodass die bevorzugte Arbeitstemperatur während der Anfangsphase der Isomerisierung bei etwa 60⁰G oder niedriger, d.h. vorzugsweise bei 50⁰G bis 60°C liegt. Bei Temperaturen von" 50⁰G bis 60⁰C tritt zwar eine gewisse -inaktivierung ein, aber der Inaktivierungsgrad ist relativ gering im Vergleich zu dem Inaktivierungsgrad bei 70 G. Wenn ein gev/isser Verlust an Enzymaktivität nach dem Arbeiten im Bereich von 50⁰G bis 60⁰G oder in der Nähe dieser Temperaturen beobachtet wird, erhöht man die Temperatur um wenigstens etwa 5⁰G, was entweder stufenweise um 2 bis 3 G oder weniger, wie es erforderlich ist, um die gewünschte Ketosemenge in dem Produkt aufrechtzuerhalten, oder alternativ durch Erhöhen der Temperatur um wenigstens 5°G in einem einzigen Schritt erfolgen kann* Vorzugsweise erfolgt das Erhöhen der Temperatur in der zweiten Phase des Verfahrens um wenigstens etwa 10°C, und vorzugsweise wird die Arbeitstemperatur stufenweise in kleinen Abschnitten erhöht.

Ziele und Vorteile der Erfindung sind unter anderem eine bessere Enzymstabilität, ein gewünschter Kohlenhydratgehalt des isomerisierten Erzeugnisses, verbesserte Wirksamkeit im Vergleich zur chargenweisen Konversion und Wirtschaftlichkeit.

Die Bestimmung der Isomerase-Aktivität macht es erforderlich, auf spektrophotometrischem Wege die aus einer Glucoselösung gebildete Ketose unter standardisierten Versuchsbedingungen zu ermitteln. Es wird in folgender Weise eine Vorratslösung hergestellt (Tab. 1). ·

- : - - ORIGINAL i^3?ECTED^:

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Tabelle 1 Vorratslösung zur Bestimmung ' "' ,

der Isomerase-Aktivität

Bestandteil Menge

0,1 mol. MgSO₄.7H₂O ImI

0,1 mol. GoGl₂.6H.p,0 . 1 ml

1,0 mol. Phosphatpuffer, pH 7,5 0,5 ml

Wasserfreie D-Glucöse 1,44 g

Destilliertes Wasser um ein Gesamtvo

lumen von 7,5 ml zu ergeben

Die Enzym-Zubereitung, die untersucht werden soll, wird zunächst mit Ultraschall behandelt oder in anderer geeigneter Weise, um das Enzym in eine für den Versuch geeignete Form zu bringen. Es wird dann auf einen Gehalt von 1 bis 6 Isomerase-Einheiten je ml verdünnt. ' . · , .

Durch Hinzufügen von 1 ml Enzym-Zubereitung zu 3 ml Vorratslösung wird eine enzymatisch^ Isomerisierung durchgeführt, und es wird 3Ö Minuten bei 60⁰G inkubiert. Bei Ablauf der Inkubationszeit wird eine 1 ml-Probe entnommen und mit 9 ml 0,5-n-Perchlorsäure inaktiviert. Die inaktivierte Probe wird dann auf ein Gesamtvolumen von 250 ml verdünnt. Zur Kontrolle wird eine Glucoselösung in gleicher Weise behandelt, in der anstelle von 1 ml Enzym-Zubereitung 1 ml Wasser zugesetzt wurde«

Dann wird die Ketose durch eine Gystein-Schwefelsäure-Methode bestimmt. Für die Durchführung der Bestimmung der Isomerase-Aktivität wird eine Isomerase-Einheit als die Menge Enzym-Aktivität definiert, die erforderlich· ist, um 1 Mikromol Laevulose ■ je Minute unter den beschriebenen Isomerisierüngs-Bedirigungen zu erzeugen.

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BEISPIRT, 1 - Kontinuierliche Isomei'isierurig unter Verwendung

eines fixiertes Bettes von luikrobenzellen; ■ Ein'stufige Temperature ins teilung

Um die Erfindung zu erlautern,wurde eine mit Hantel versehene Säule vervvendet. Der Mantel war mit einer Heisswasserq.uelle verbunden, um die Temperatur der Säule während der Isomerisierung zu kontrollieren.

Ein Stamm eines Mikroorganismus der Gattung Streptomyces, der als guter- Isomerase-Erzeuger erkannt war", wurde unter submersen aeroben Bedingungen in einem xylοsehaltigeη Medium kultiviert, um intrazellular Isomerase zu erzeugen.

Nach der Fermentation wurde Magnesiumhydroxid im Verhältnis von 2 Gew.-Teilen Magnesiumhydroxid je Gew.-Teil Zellmasse der Kulturbrühe zugesetzt. Die so erhaltene Anschlämmung wurde filtriert, und der Filterkuchen wurde in einem offenen Gefäss bei Raumtemperatur getrocknet. Die Aktivität der so erhaltenen trokkenen Enzym-Zubereitung betrug 330 Einheiten je-Gramm.

Die trockene Enzym-Zubereitung wurde in einer 50^-igen Dextroselösung (Gew./Vol.) dispergiert. Die Ansehlämiuung wurde dann in die mit Mantel versehene .Säule übergeführt,und heim Einführen in die Säule wurden gleichzeitig kleine Glaskugeln mit einem Durchmesser von etwa 3mni hinzugefügt. Die Glaskugeln dienten als Träger und ve !'hinder ten gleichzeitig ein Absetzen der Enzym-Zubereitung und Verstopfen der Säule. In dieser Weise wurden etwa 750 Einheiten des Enzyms in die Säule eingeführt.

Ein Dextrosesirup mit einer Konzentration von 5O?£ ( Gew./Vol) wurde durch Zugabe von Magnesiumhydroxid auf ein pH im Bereich von 7,0 bis 7,5 eingestellt. Der Sirup wurde mit Stickstoff beladen und dann in den oberen Teil der Säule unter Stickstoff-Atmosphäre eingeführt. ■

ÖAD ORIGINAL

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Das isomerisierte Produkt wurde in gleichen Mengen von 15ml in Versuchsgläsern gesammelt. Die Versuchsgläser enthielten jedes etwa 5ml einer 0,5-n-Perehlorsäure, um jede lösliche Isomerase, di.e mit der Lösung hätte austreten können, zu inaktivleren.

Während einer Anfangsphase wurde die Temperatur der Säule bei etwa 60⁰G gehalten. Die Durchflussmenge der Dextroselösung durch die Säule wurde im wesentlichen konstant gehalten, und der Ketqsegehalt des Ausflusses betrug 40 bis 50$, bezogen auf Trockensubstanz.

In dieser Weise wurde die Isomerisierung neun Tage lang durchgeführt, bevor ein wesentlicher Abfall hinsichtlich der Enzym-Aktivität in Erscheinung trat, was sich in einer Abnahme des im Ausfluss beobachteten Ketosewertes zeigte. Während der Anfangsphase des Versuchs hatte der durchschnittliche Ketosegehalt des Ausflusses bei 38,7$ gelegen.

Bei Beendigung dieser ersten Phase des Versuchs wurde die Temperatur der Säule in einer Stufe ( von dem Ausgangswert in Hohe von 60⁰C ) auf 70⁰G erhöht. Die Isomerisierung wurde dann fortgesetzt bei der erhöhten Temperatur während einer zusätzlichen Zeit von 24 Stunden. Der Ketosegehalt des ausfliessenden Produktes während der zweiten Phase des Versuchs betrug im Durchschnitt etwa 49$. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt worden (Tab.2).

Bei Wiederholung der Isomerisierung mit einer,Enzym-Zubereitung, die aus einem Gemisch von Diatomeenerde und Kikrobenzellen bestand, wurdannahezu die gleichen Resultate erhalten.

ORIGINAL IHSPBCTED 409816/08 36

Tabelle 2 Kontinuierliche Isomerisierung,

Einstufige Temperatureinstellung

Zeit, Temperatur, Durchlauf durch Auslauf des etwa 4-2$ Laevu-Tage G das Bett, lose i.Tr* enthaltenden

Vol. je Stunde Produktes

(lbs. Tr. je cu.ft.d.BettesJ erwartet bei 60⁰Q erhalten

1,27 951 951

1,27 951 951

1,27 951 951·

1,27 951 951

X,25 936 936

1,17 876 876

1,10 823 823

1,03 771 771

1,65 734 1235

1,65 681 1235

Kontinuierliche Isomerisierung unter Verwendung eines fixierten Bettes von Kikrobenzellen : Temperatureinsteilung in kleinen Stufen

Intrazellulare Isomerase wurde durch Wachsen einer Streptomyces-KuItür unter submersen aeroben Bedingungen in einem xyloeehalti— gen Nährmedium gewonnen*

Nach Beendigung der Fermentation wurde Diatomeenerde-Filterhilfsmittel der fermentierten Flüssigkeit im- Verhältnis von 2 Teilen Filterhilfsmittel zu 1 Teil Mikroorganismen-Zellen, bezogen auf das. trockene Gewicht der Zellen₅ zugesetzt. Das G-emisch aus Zellen undDiatomeaierde wurde durch Filtration abgetrennt^ gewaschen und getrocknet j um es als Enzym-Zubereitung zu verwenden.

1	60	2
• 2	. 60
3	60
4	60
5	60
6	60
7	60
8	60
9	70
10	70
BEISPIEL

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Diese Enzym-Zubereitung wurde in Dextroselösung suspendiert und in eine mit Mantel versehene Säule eingeführt. Der untere Auslass der Säule 'war an eine Vakuumquelle angeschlossen, um ein kompaktes .Bett zu ei-halten. Nach dem Fällen enthielt die Säule 2 2 lbs. (Trockensubstanz) Enzym-Zubereitung ( d.h. Gemisch aus Zellen und Filterhilfsmittel) je cu.ft. des Säulemrolumens.

Durch den Mantel der Säule wurde Wasser von 60⁰G gegeben. Es wurde eine Lösung mit einem Gehalt von 500g Trockensubstanz je Liter eines Stärkehydrolysats mit 95$ D.E. und 92$ Dextrose in der Trockensubstanz mit Magnesiumhydroxid auf pH 7,8 eingestellt und kontinuierlich in die Säule eingeführt, wobei zur Kontrolle der Ausflussmenge Druck angewendet wurde. Die Durchflussmenge wurde so eingestellt, dass im Ausfluss aus der Säule ein Gehalt von 42% Laevulose (bezogen auf Trockensubstanz) aufrechterhalten wurde.

Nach einer Versuchsdauer von 6 Tagen wurde das Ausflussvolurnen auf 6θ?ο> des Anfangswertes reduziert, um den Gehalt an 42$ Laevulose (in der Trockensubstanz) aufrechtzuerhalten. Danach vvurde die Temperatur periodisch erhöht, wie aus Tabelle 3 hervorgeht, damit die Ausflussmenge bei einem Gehalt von 42$ Laevulose nicht weniger als 66$ der anfänglichen Ausflussmenge betrug. Wie aus der Tabelle 3 zu ersöhen ist, war die Gesamtauaflussmenge, die in einer Zeit von 14 Tagen durch Erhöhen der Temperatur erhalten wurde,- um 41$ grosser als die Geaamtäusflussmenge, die erhalten word.en wäre, wenn die Temperatur auf 6O⁰G konstant gehalten worden wäre.

ORlGSNAL INSPECTED

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Tabelle 3

kontinuierliche Isomerisierung unter Verwendung eines fixiertem Bettes,
Temperaturerhöhung in kleinen Stufen

Zeit, Temperatur

Tage

	60	erwartet
1	60	787
2	60	787
3	60	787
4	60	787
5	60	622
6	62	516
7	62	418
8	62	343
9	64	286
10	64	233
11	66	187
12	68	158
13	70	127
14	106

Auslauf des etwa 42$ Laevulose i.Tr. enthaltenden Produktes(lbs.Tr. je cu.ft.Bett)

60⁰G

"bei

erhalten

787 787 787 787 622 516 590 516 516 509 509 473 674 622

insgesamt 6144

8695

"BEISPIEL 3 ' Ghargenweise Isomerisierung im Vergleich zur

kontinuierlichen Isomeivisierung mit immobiü-i— eierten Enz.y u ien im fixierten Bett

Es wurde· eine Fermentation mit einem Mikroorganismus der' Gattung Streptomyces in einem xylosehaltigen iiulturmedium durchgeführt, um Isomerase zu produkzieren. Durch Hinzufügen von Diatomeenerde zur ICuItürbrühe und Filtrieren wurden die Zellen-abgetrennt.

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Ein Teil des feuchten i'ilterkuchens wurde als Enzym-Zubereitung zur Durchführung einer chargenweisen Isomerisierung von einem-Lläisstärkehydrolysat mit einem D.E.-Wert von 95$ verwendet. Die Yerweilzeit in einem mit Rührwerk ausgerüsteten Reaktionsbehälter "betrug 50 Stunden bei pH 6,25.

Ein anderer Teil der.gleichen Enzym-Zubereitung wurde als Enzymquelle für ein fixiertes Bett verwendet, um eine kontinuierliche Isomerisierung durchzuführen. Die Yerweilzeit in der Säule betrug bei pH 8 1 bis 2 Stunden.

Die chargenweise Isomerisierung wurde bei 70^QC durchgeführt,, die kontinuierliche Isomerisierung in einer Anfangsphase, bis im wesentlichen eine Inaktivierung des Enzyms beobachtet wurde, bei 6O⁰G. Dann wurde die Säulentemperatur auf 70⁰G erhöht. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 zusammengestellt.

Tabelle 4 Ohargenweise und Säulen-Isomerisierung eines

Hydrolysats	mit einem D.	E.-Wert von 95$	Differenz
Ghargenweise, 50 Std. pH 6,25	Zugeführtes Material	Isomerisat	• 0,8
Asche, $ Tr.	1,0	1,8	0,03
Organischen Säuren, a/o	Tr. 0,05	0,08	196
Farbe	4	200	Differenz
Kontinuierlich, 1-2 Stunden, pH 8	Zugeführtes Material	Isomerisat	0,1 ■
Asche, '?£ Tx*.	0,5	0,6	0,01
Organische Säuren, 56	Tr. 0,03	0,04	7
Farbe	4	11

Die chargenweise Isomerisierung wurde bei pH 6,25 durchgeführt, weil bei pH-Werten über 7,0 während der langen fieaktionsdauer_P ■lie beim chargenv/eisen Arbeiten erforderlich ist,- die Zusammendes Endproduktes dazu neigte, unerwünscht zu ¥/erden.Es

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wurden Bedingungen für den Vergleich gewählt, von denen'angenom- · men werden kann, dass sie für jeden Prozesstyp das Optimum darstellten, und "der Vergleich spricht eindeutig für den kontinuierlichen Prozess. . ·

Hinsichtlich der Wirtschaftlichkeit hat sich gezeigt, dass der kontinuierliche Prozess wirksamer ist und eine wesentlich geringere Menge an Enzym-Aktivität je Einheit an gebildetem Laevulose-Orodukt erfordert.

BEISPIEL· 4 . . Stabilisierte Enzyme

Wenn die Isomerisierungstemperatur erhöht γ/ird., steigt die umgesetzte Menge an, aber gleichzeitig tritt Inaktivierung der Isomerase ein. Bei einer bestimmten Temperatur wird der G-rad der Inaktivierung die Zunahme an umgesetzter-Menge übersteigen, und "bei dieser Temperatur wird die an je Einheit gebildetem Produkt abnehmen. .

Es wurde eine neuartige Stabilisierungstechnik entwickelt, um der Isomerase eine verbesserte thermische Aktivität zu verleihen« Die Verwendung der stabilisierten Isomerase, verbunden mit dem temperaturprograjüiuierten Verfahren, gestattet die Herstellung von hochlaevulosehaltigen Sirupen ohne übermässigen Enzymverlust.

Um eine stabilisierte Isomerase zu erhalten, -wird aus den Zellen ein -Enzym von sehr höher Reinheit gewonnen» Sin läizym, das sich Ton Streptomyces ableitet_s wird bevorzugt₉ aber als Quelle für den verwendeten Mikroorganismus kann jeder Erzeuger einer ausreichenden Enzymmenge dienen* Bas Enzym Itaoa in Lösung gebracht und über ein Bett von vorzugsweise -basischem ffiagpiesiumeartoonat geleitet werden,, Das Enzym wird wirksam absorbiert, und das Produkt stellt eine sehr stabile,, aktive I'qtmi des -Enzyms dar.

Das Arbeiten bei höheren Temperaturen führt zu höheren Laevulosegehalten, weil die umgesetzte Menge ansteigt und der im Gleichgewicht befindliche Laevulosegehalt bei höheren Temperaturen ansteigt. In der folgenden Tabelle sind die bei einigen erhöhten Temperaturen im Gleichgewicht befindlichen Laevulosegehalte zusammengestellt worden ( Tab. 5).

Tabelle 5 Im Gleichgewicht befindlicher Laevulosegehalt

in Abhängigkeit von der Temperatur

Isomerisierungs- Laevulosegehalt, ^ο/> Tr., temperaturen, ' bezogen auf Ausgangsmenge _Cl· ; Dextrose -

60 51,2

70 52,6

80 54,0

Wenn eine Säule mit dem stabilisierten Enzym gefüllt und ein Strom einer Dextroselösung durch die Säule gegeben wurde, wurde eine gute Konversion beobachtet. Trotz verlängerter Versuchsdauer bei"60⁰G und darüber wurde eine lange Lebensdauer des Enzyms erreicht, während der Laevulosegehalt im Ausfluss wenigstens 50?£ des gesamten vorhandenen Zuckers, bezogen auf Trockensubstanz, betrug. Die Isomerisierung wurde bei pH 8 durchgeführt, und das Produkt hatte eine besonders gute Farbe, einen niedrigen Gehalt an organischen Säuren und einen niedrigen Gehalt an unerwünschten Kohlenhydraten. Das hohe Arbeits-pH fördert die Enzymstabilität trotz der hohen Arbeitstemperaturen, und die hohen Temperaturen gestatten eine sehr kurze Verweildauer in der Säule. Auf diese Weise lassen sich die erforderlichen Investitionen und Anlagekosten für den Prozess verringern.

Die Erfindung lässt sich auch erfolgreich mit Enzym-Zubereitungen anderer Art ausführen, obwohl im allgemeinen die 'Verwendung intakterZelien bevorzugt wird. In einer, anderen. Ausführungsform der Erfindung werden getrocknete Zellen in ein feines Pulver übergeführt, was mit Hilfe eines Waring-blender erfolgen kann. Es wird

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durch. Auflösen einer kleinen Menge des oberflächenaktiven Mittels Tween 80 in einer Ι,Ο-mol.-ü-lycinlösung eine Pufferlösung hergestellt. Die Pufferlösung wird durch Zugabe einer kleinen Menge Natriumhydroxid auf pH 8,0 eingestellt. Durch Hinzufügen von 200g der trockenen, fein gepulverten Zellen zu 1000ml Pufferlösung wird dann eine Aufschlämmung hergestellt. Die Aufschlämmung .wird filtriert. Es werden 793ml Filtrat mit einer Aktivität von 17»5 Einheiten je ml erhalten.

Ein Teil dieser Enzymlösung wird dann an einem porösen Glasträger mit grosser Oberfläche und reaktionsfähigen Silangruppen fixiert, wie es in der US-Patentschrift 3 556,945, die am 19.1.1971 erteilt wurde, beschrieben wird. Eine weitere Menge der Lösung wird an aktivierter granulierter Kohle absorbiert. Beide Enzym-Zubereitungen können dann für den erfindungsgemässen kontinuierlichen Isomerisierungs-Prozess verwendet werden, wobei die hierfür beschriebene Technik angewendet wird.

Einer*der wichtigsten Vorteile bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung ist in der Herabsetzung der Kosten je Einheit produzierter Laevulose zu sehen. Im Vergleich zu der chargenweisen Isomerisierung wird mit der gleichen Enzymmenge, wenn sie erf indungs geinäss verwendet wird, mehr Laevulose produziert als beim chargenweisen Arbeiten. Bis zu dreimal mehr an Produkt wird von einer gegebenen Menge Enzym-Zubereitung produziert, wenn nach dem erfindungsgemässen Verfahren gearbeitet wird, als optimal beim chargenweisen Arbeiten zu erhalten, ist.

Barüberhinaus sind viele andere wichtige Vorteile zu nennen. So sind bei Anwendung der Technik der kontinuierlichen Isomerisierung unter Verwendung einer immobilisierten Enzym-Zubereitung die Isomerisierungszeiten oder Verweilzeiten, worunter man die Zeit versteht, während der die zugeführte Lösung und die Enzym-Zubereitung miteinander in Berührung sind, wesentlich kurzer. Dies bedeutet, dass die Zucker, die zur Umsetzung gelangen, der

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erhöhten Temperatur eine kürzere Zeit ausgesetzt werden, so dass ein geringerer thermischer Abbau eintritt. Das Endprodukt enthält deshalb weniger Farbstoffbestandteile, so dass die Farbe des Produktes besser ist und Raffinationskosten geringer sind. Auch werden weniger organische Säuren gebildet, und die Zusammensetzung der Kohlenhydrate im Endprodukt ist wünschenswerter. Schliesslich sind im Hinblick auf die kürzere Reaktionszeit auch kleinere Anlagen für den Prozess.erforderlich.

Wie aus Beispiel 4 hervorgeht, betrifft ein anderes wichtiges Merkmal der Erfindung eine immobilisierte Xyloseisomerase-Zubereitung mit einer verbesserten zurückbehaltenen Isomeraseaktivität und einer verbesserten Fliessgeschwindigkeit im Yer-= gleich zu den bekannten Enzymzubereitungen. Ein anderes Merkaal der Erfindung betrifft eine neue und wirksame Methode zur Gewinnung einer zellenfreien Xyloseisomerase aus einer Gärungsbrühe. Ein weiteres Merkmal der Erfindung ist ein verbessertes l/erfahren zum kontinuierlichen Umwandeln einer Dextrose-enthaltenden Lösung in einen Laevulose-enthaltenden Sirup auf - enzymatischem Wege, und zwar durch Verwendung der immobilisierten Xyloseisomerase.

Das Konzept des Bindens von Enzymen an feste Träger ist Gegenstand von wachsendem Interesse geworden. Im allgemeinen können diese Bindemethoden wie folgt eingeteilt, iirerdens

1) Adsorption: Binden an einen festen Träger durch physikalische oder elektrostatische Kräfte wie im Falle von Aktivkohle oder Ton.

2) Ionisch: Anhaften an lonenaustauschermaterialien aus synthetischen Polymeren, Zellulose, Starkes, Dextran etc» -

5) Kovalente Bindungϊ Kupplung des Enzyms an einen Träger durch eine funktioneile Gruppe_P wie beispielsweise eine Biazogruppe s, Alkylgruppe₉ Peptidgr-uppe oder Silanylgruppe«

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4) Einschliessen: Immobilisieren durch Einbetten oder Einschluss in eine Gelstruktur eines hydrophilen polymeren Materials, wie beispielsweise eines Polymeren aus einem Acrylamid, oder durch die Zellwand eines Mikroorganismus.

5) Vernetzen: Insolubilisierung durch Vernetzen des Enzyms mit einem bifunktionellen Mittel und

6) Ausflocken: Behandeln der Mikrobenzellen, welche das Enzym enthalten, mit einem Ausflockungsmittel, wie beispielsweise einem anionischen Polyelektrolyten, einem kationischen Polyelektrolyten sowie mineralischen Hydrokolloiden, wie sie in der NL-PS 72/09532 beschrieben werden.

Die bekannten Methoden haben in'der Industrie keine weite Verbreitung gefunden. Beispielsweise sind Aktivkohle, Kaliumcarbonat etc. dafür bekannt, dass die Substanzen ein relativ hohes Bindevermögen für Enzyme, wie beispielsweise Xyloseisomerase₅ besitzen. Jedoch sind die erhaltenen immobilisierten Enzymzubereitungen relativ inaktiv bezüglich des Vermögens, Dextrose-enthaltende Lösungen in Laevulose-enthaltende Sirupe laazuwandeln. Dies bedeutet mit anderen Worten, dass viele der bekannten immobilisierten Enzyme eine relativ geringe effektive Isomeraseaktivität aufweisen.. Ferner sind diese immobilisierten Enzyme des Standes der Technik im allgemeinen instabil und besitzen in typischer Weise sehr kurze Halbwertszeiten.

Aus der US-PS 3 715 276 ist es bekannt, Kaliumcarbonat, Magnesiumcarbonat sowie einige Ionenaustauscherharze dazu zu verwenden, den pH-Wert während längerer enzymatischer Isomerisierungsreaktionen von Dextrose-enthaltenden Lösungen in Laevulose-enthaltenden Sirupe zu regulieren. Gemäss der genannten US-PS wird ein Xyloseisomerase-Enzym verwendet, das innerhalb der Zellen durch eine Wärmebehandlung gebunden ist. Das Enzym wird jedoch nicht an dem den pH-Wert regulierenden Mittel sorbiert, da es innerhalb der Zellen gebunden ist. Ferner

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tritt die pH-regulierende Wirkung von Kaliumcarbonat, Magnesiumcarbonat sowie von Ionenaustauscherharze*! nur dann zutage, wenn die Isomerisierung während einer relativ langen Zeitspanne durchgeführt wird, d.h. einer Verweilzeit von mehr als ungefähr 4 Stunden. Im Falle enzymatischer Isomerisierungen, bei deren Durchführung die Verweilzeit der Zuckerlösung ungefähr 4 Stunden übersteigt, erfolgt die Bildung von unerwünschten Verbindungen, wobei eine derartige Verbin« dung beispielsweise Psikose ist. Da in vielen Nahrungsmitteln, in denen Laevulose—enthaltende Sirupe eingesetzt werden, Psikosegehalte von mehr als 2 Gewichts-%, bezogen auf Trockenbasis, und öfter 1 -Gewichts-%, bezogen auf Trockenbas&s, nicht toleriert werden können, sind Verfahren mit längeren Verweilzeiten, wie sie in der US-PS 3 715 276 besehrieben werden, technisch nicht interessant.

Es wurde nunmehr gefunden, dass zellfreie, lösliche Xyloseisomerase-Enzymzubereitungen, falls sie mit basischem Magnesiumcarbonat kontaktiert werden, gebunden oder sorbiert werden, wodurch eine immobilisierte Enzymzubereitung zur Verfugung gestellt wird, die eine hohe effektive Isomeraseaktivität besitzt. Andere verwandte Materialien, wie beispielsweise Kaliumcarbonat, ergeben keine hochaktive und stabile Xyloseisomerase. Ferner wird eine intrazellulare Xyloseisomerase nicht an basischem Magnesiumcarbonat sorbiert.

Die erfindungsgemässe immobilisierte Xyloseisomerase-Zubereitung zeichnet sich durch einen sehr hohen Enzymwirkungsgrad aus, wobei die Zuckerkontaktzeit, die zur Erzeugung eines Laevulose-enthaltenden Sirups von wenigstens ungefähr 45 Gewichts-% Laevulose aus einer Dextrose-enthaltenden Lösung erforderlich-ist, im allgemeinen unterhalb ungefähr 2 Stunden liegt. Infolge der geringeren Kontaktzeit, die durch die verbesserte zurückbehaltene Enzymaktivität der erfindungs-

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gemässen Zubereitung erreicht wird, besitzen die erhaltenen Laevulose-enthaltenden Sirupe eine geringere Farbe, einen geringeren Gehalt an organischer Säure sowie einen niedrigeren Gehalt an Psikose, der im allgemeinen unterhalb ungefähr 1 Gewichts-%, bezogen auf Trockenbasis, liegt und sehr oft unterhalb ungefähr 0,3 Gewichts-% Psikose, bezogen auf Trockenbasis, beträgt. DieserVorteile sind im Hinblick auf die Investitionskosten sowie die Kommerzialisierung eines Verfahrens zur enzymätisehen Herstellung von Laevulose-enthaltenden Sirupen aus Dextrose-enthaltenden Lösungen sehr gravierend.

Die erfindungsgemässe stabilisierte Xyloseisomerase-Enzymzubereitung wird vorzugsweise in der Weise hergestellt, dass eine zellfreie Xyloseisomerase mit basischem Magnesiumcarbonat in Form von Einzelteilchen kontaktiert wird. Das in Form von Einzelteilchen vorliegende basische Magnesiumcarbonat kann entweder ein Pulver oder ein Granulat sein. Das Granulat wird im Hinblick auf die Fliesseigenschaften bevorzugt, die dann ins Gewicht fallen, wenn ein Tiefbettkonverter eingesetzt wird. Die stabilisierte Enzymzubereitung kann in zweckmässiger Weise nach üblichen Methoden gewonnen werden, beispielsweise durch Filtration oder dergleichen. Wahlweise kann das in Form von Einzelteilchen vorliegende basische Magnesiumcarbonat zuerst in einen Konverter eingebracht v/erden, der später zur Durchführung der enzymatischen Isomerisierungsreaktion eingesetzt wird, worauf anschliessend eine Lösung einer zellfreien Xyloseisomerase durch die Säule solange gepumpt werden kann, bis kein Enzym mehr von der Lösung durch das in Form von Einzelteilchen vorliegende basische Magnesiumcarbonat sorbiert wird. Anschliessend an die Herstellung der stabilisierten Enzymzubereitung ist der Konverter bereit für die Verwendung, indem einfach dem Konverter eine Dextrose-enthaltende Lösung zugeleitet wird.

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Es ist darauf hinzuweisen, dass das Xyloseisomerase-Enzym, das gemäss diesem Merkmal der Erfindung eingesetzt wird, hochrein oder roh sein kann. Das Enzym kann nach jeder üblichen Reinigungsmethode gereinigt werden, beispielsweise durch eine fraktionierte Ausfällung mit Natriumsulfat, Ammoniumsulfat oder einem anderen Mineralsalz, durch selektive Adsorption oder dergleichen, durch eine Differential-Wärmeinaktivierung von verunreinigenden Proteinen durch Einwirkenlassen steigender Temperaturen auf das Produkt bei verschiedenen pH-Werten, durch isoelektrische Ausfällung, durch Ausfällung unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels unter Einsatz von Alkoholen, durch eine DEAE-Zellulosechromatographie sowie durch eine "Sephadex"-Gelfiltration, durch eine elektrophoretisch« Trennung, eine Ultrazentrifugentrennung oder dergleichen.

Die eingesetzte Xyloseisomerase-Enzymzubereitung liegt in ihrer löslichen Form vor. Dies bedeutet mit anderen ¥orten₉ dass die Xyloseisomerase frei von Mikrobenzellen ist, wenn sie gebildet wird. Das Enzym kann aus dem Zellmaterial auf irgend eins übliche Weise freigesetzt werden. Das Enzym in dem Roluaaterial kann dann an dem basischen Magnesiumcarbonat sorbiert werden.. Die Xyloseisomerase wird dann an dem basischen Magnesiumcarbonat gebunden. Die immobilisierte Enzymzubereitung kann danach durch Filtration, Zentrifugieren oder dergleichen abgetrennt und mit einem Puffer gewaschen werden. Die filtrierte und gewaschene immobilisierte Enzymzubereitung kann in ihrer feuchten Form, wie sie vorliegt, verwendet werden, der Kuchen dann jedoch auch unter Anwendung üblicher Trocknungsmethoden, wie sie auf Enzymzubereitungen angewendet werden, getrocknet werden, beispielsweise durch eine Zellentrocknung, eine Drehtrommeltrocknung oder eine Sprühtrocknung, wobei jedoch auch ,auf ein Gefriertrocknen zurückgegriffen werden kann.■Sehr gute Ergebnisse werden gedoch erhalten, wenn das Enzym vor der Sorption gereinigt wird.

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Vor dem Immobilisieren wird die zellfreie Enzymlösung vorzugsweise auf einen pH-Wert von ungefähr 7,5 bis ungefähr 9_t5 und insbesondere von ungefähr 8 bis ungefähr 9 eingestellt. Die Immobilisierung kann bei Zimmertemperatur (beispielsweise im allgemeinen bei ungefähr 25°C) durchgeführt werden, um eine Inaktivierung des Enzyms, zu vermeiden. Es können jedoch auch höhere Temperaturen toleriert werden, falls die Enzymlösung mit einer Dextrose-enthaltenden Lösung während der Immobilisierung vermischt wird. Liegt der pH-Wert der Enzymlösung, die mit dem basischen Magnesiumcarbonat kontaktiert werden soll, unterhalb ungefähr 7, dann zeigt das basische Magnesiumcarbonat eine Neigung zur Zersetzung und ist für eine Verwendung nicht geeignet. Daher ist es zweckmässig, den ρΉ-Wert der Enzymlösung bei ungefähr 7,5 oder darüber zu halten.

Die Enzymlösung besitzt vorzugsweise eine Aktivität von wenigstens ungefähr 10 Einheiten/ml (U/ml) und kann eine Aktivität von bis zu 3000 U/ml aufweisen. Im allgemeinen besitzt die Enzymlösung eine Aktivität von ungefähr 50 U/ml Ms ungefähr 200 U/ml der Isomeraseenzymaktivitit.

Ss wurde gefunden_s dass das .basische Magnesiumcarbonat ein starkes Bindevermögen für das Xyloseisomerase-Enzym besitzt. In diesem Zusammenhang wurde gefunden, dass das basische Magnesiumcarbonat dazu In der Lage ist, eine bestimmte Menge des Enzyms zu binden, die eine Aktivität besitzt, falls diese vor der Sorption gemessen wird, welche mehr als 150 Einheiten pro Gramm (U/g) des gebundenen Enzyms äquivalent ist (d.h. des Komplexes aus Isomerase und basischem Magnesiumcarbonat). Im allgemeinen wurde beobachtet? dass die sortierte Enzymmenge eine Menge ist, die 250 Aktivitätseinheiten besitzt, falls sie vor der Sorption gemessen wird₉ und zwar programm des Komplexes. In der Praxis liegt die Zahl oft oberhalb 500 U/g des Komplexes. Leider wird nicht die ganze ursprüngliche enzymatisch« Aktivität nach der Komplexbildung beibehalten, wie aus dem weiter unten folgenden

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Beispiel 8 hervorgeht, obwohl das ganze proteinhaltige Enzym sorbiert wird. Unter den Begriffen "gebundene Isomerase" und "Bindevermögen¹¹, die erfindungsgemäss verwendet werden, sind Isomeraseinheiten zu verstehen,' und zwar gemessen in Lösung vor der Sorption, gebunden an 1 g des Komplexes, bezogen auf .Trockenbasis.

Im Hinblick auf die Erfahrung mit anderen Trägern wurde in überraschender Weise gefunden, dass die erfindungsgemässe immobilisierte Xyloseisomerase-Zubereitung eine extrem hohe "effektive Isomerase-Aktivität" besitzt, d.h. eine Isomeraseaktivität des immobilisierten Enzyms, welche tatsächlich enzymatisch die Umwandlung von Dextrose in Laevulose bedingt. Es gibt viele Materialien, welche Xyloseisomerase zu binden vermögen, beispielsweise Aktivkohle, Kalziumcarbonat, Zinkcarbonat und dergleichen. Wird jedoch das Enzym an diese Träger gebunden, dann werden die Wirksamkeit des Enzmys oder die effektive Aktivität merklich vermindert. Sehr oft besitzen immobilisierte Enzymkomplexe, die unter Verwendung dieser bekannten Träger hergestellt werden, eine Wirksamkeit von weniger als 50 % der Aktivität, die zu erwarten ist, und zwar bezogen auf die Isomerasemenge, die tatsächlich an dem Träger gebunden oder sorbiert ist. Die immobilisierte Xyloseisomerase-Zubereitung gemäss vorliegender Erfindung besitzt wenigstens ungefähr 70 % der Aktivität der ursprünglichen Isomeräse, die an den Träger gebunden ist, wobei die Aktivität sehr oft oberhalb 80 % liegt. Dies bedeutet mit anderen Worten, dass die immobilisierte Xyloseisomerase mehr als 70 % der Aktivität der Isomerasemenge zeigt, die tatsächlich an dem basischen Magnesiumcarbonat gebunden ist. .

Die immobilisierte Xyloseisomerase-Zubereitung gemäss vorliegen-· der Erfindung, zeichnet sich daher dadurch aus, dass sie eine effektive Isomeraseaktivität pro Gramm der immobilisierten Enzymzubereitung, bezogen auf Trockenbasis, von wenigstens 100 (d.h.

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100 U/g der wirksamen Isomeraseaktivität) und vorzugsweise von wenigstens ungefähr 175 U/g besitzt.

Ein anderes wesentliches Merkmal der erfindungsgemässen immobilisierten und stabilisierten Enzymzubereitung ist ihre lange Halbwertszeit. Die erfindungsgemässe Enzymzubereitung zeichnet sich dadurch aus, dass sie 45 % Laevulose zu erzeugen vermag, und zwar bei Fliessgeschwindigkeiten von mehr als 0,5 Bettvolumina/Stunde, wobei die Enzym-Halbwertszeit bei mehr als 15 Tagen liegt.

Das basische Magnesiumcarbonatmaterial, das zur Herstellung der erfindungsgemässen stabilisierten Enzymzubereitung eingesetzt wird, ist vorzugsweise eine körnige poröse Substanz mit jeder gewünschten Teilchengrösse. Das basische Magneslumcarbonat kann in der Weise hergestellt werden, dass zuerst eine Magnesiumcarbonat—Trihydrat-Aufschlämmung hergestellt wird, die Aufschlämmung auf einen Feststoffgehalt von wenigstens ungefähr 10 % entwässert wird und die erhaltene pastenartige Masse getrocknet wird. Das erhaltene Produkt besitzt eine feste, gegenüber einem Zerstossen widerstandsfähige Struktur und eine ausgeprägte Affinität für lösliche Enzyme, wie beispielsweise Xyloseisomerase.

Basisches Magnesiumcarbonat kann auch nach den in den US-PS 2 209 752, 2 209 753 und 2 209 754 beschriebenen Methoden hergestellt werden.

Einige bevorzugte basische Magnesiumcarbonat-Arten, die' zur Herstellung der erfindungsgemässen immobilisierten Enzymzubereitung geeignet sind, können auch im Handel erhalten werden. Einige dieser Produkte werden als 4 MgCOyMg(OH)₂*5H₂O (oder 5 MgO 4COp-SH₂O) mit einem Molekulargewicht von ungefähr 485,74, einer absoluten Dichte von ungefähr 2,16, einem Feuchtigkeitsgehalt (110⁰C) von ungefähr 0,5 bis ungefähr 2,3 %,

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einer Schüttdichte (lose) von 0,0560 bis 0,1280 g/ccm (3,5 bis 8,0 pounds/cubic foot) sowie einer solchen Maschengrösse definiert, dass wenigstens 99 % (feucht) durch ein 350 mesh-Sieb hindurchgehen, wobei ferner eine Summenformel von 3,2 MgCO₃-Mg(OH)₂-3,9H₂O aufgestellt worden ist.

Die. stabilisierte immobilisierte Xyloseisomerase-Enzymzubereitung gemäss vorliegender Erfindung kann zur Durchführung eines jeden Verfahrens zur enzymatischen Umwandlung von Dextrose-ent— haltenden Lösungen in Laevulose-enthaltende Sirupe eingesetzt werden, einschliesslich des beschriebenen temperaturprogrammierten Verfahrens. Die immobilisierte Enzymzubereitung ist besonders geeignet für eine kontinuierliche Umwandlung von Dextrose in Laevulose. Die stabilisierte und immobilisierte Enzymzubereitung gemäss vorliegender Erfindung lässt sich ferner zur Durchführung von kontinuierlichen enzymatischen Isomerisierungsverfahren einsetzen, die anders sind als das beschriebene temperaturprogrammierte Verfahren.

Die Vorteile der stabilisierten und immobilisierten Enzymzube- · reitung der Erfindung liegen insbesondere in dem hohen Ausmaß der Glukoseisomerase-Aktivität pro Gramm des Materials, so dass eine vergleichsweise geringe Kontaktzeit erforderlich ist, um Laevulose-enthaltende Sirupe herzustellen.

Gemäss einem bevorzugten Merkmal der Erfindung wird enzymatisch Dextrose in Laevulose umgewandelt, und zwar durch Bildung einer Reaktionslösung, die ungefähr 20 bis ungefähr 70 Gewichts-% Dextrose enthält und einen pH-Wert von ungefähr 7?5 bis ungefähr 9,5 aufweist und eine Temperatur von ungefähr 30 bis ungefähr 90⁰C besitzt. Diese Lösung wird über ein Bett aus dsr immobilisierten Xyloseisomerase mit einer effektiven Isomeraseaktivität von wenigstens ungefähr 100 U/g der Enzymzubereitung geschickt.

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Vorzugsweise enthält die Reaktionslösung ungefähr 40 bis ungefähr 60 Gewichts-% Dextrose, wobei der pH-Wert der Lösung zwischen ungefähr 8,2 und ungefähr 9,2 liegt. Eine Reaktionslösung, die ungefähr; 50 Gewichts-% Dextrose enthält und einen pH-Wert zwischen ungefähr 8,4 und ungefähr 8,6 aufweist, wird bevorzugt.

In typischer Weise besitzt die immobilisierte Xyloseisomerase-Zubereitung eine effektive Isomeraseaktivität von wenigstens ungefähr 175 U/g der immobilisierten Enzymzubereitung. Die Reaktionstemperatur liegt vorzugsweise zwischen ungefähr 50 und ungefähr 75⁰C, wobei eine Temperatur von ungefähr 60°C bevorzugt wird.

Das Xyloseisomerase-Enzym geht vorzugsweise auf einen Mikroorganismus zurück, der zu dem Genus Streptomyces gehört, wobei insbesondere ein Mikroorganismusstamm in Frage kommt, der aus der Mutantenstämmengruppe ausgewählt wird, die aus S. olivochromogenes, ATCC Nr. 21713, S. olivochromogenes, ATCC Nr. 21714 und S. olivochromogenes, ATCC Nr. 21715 besteht. Die Herstellung, der zuletzt erwähnten Stämme wird infefeesondere in der DT-PS . ;.„ ... (Patentanmeldung entsprechend der US-Anmeldung Serial No. 181 639, eingereicht am 17. September 1971) beschrieben.

Die Dextrose, die zur Herstellung der Reaktionslösung verwendet wird, kann Dextrose in kristalliner Form, in erneut aufgeschmolzener Form oder ein Stärkehydrolysat sein, das in der Weise hergestellt wird, dass entweder aufeinanderfolgend oder gleichzeitig enzymatisch eine stärkeenthaltende Losung verflüssigt und verzuckert wird. Als geeignete Reaktionslösungen kommen Stärkehydrolysate la. Frage, die mit einer Säure verdünnt oder verflüssigt worden sind und in einer anschliessenden Stufe.in eine Dextrose-enthaltende Lösung umgewandelt worden

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sind, und zwar enzymatisch durch eines oder mehrere Enzyme. Bevorzugte Stärkehydrolysate werden in der Weise hergestellt, dass eine Enzym-verflüssigte Stärke-enthaltende Lösung mit einer Kombination von zwei Enzymen, wie beispielsweise Glukoamylase- und 1,6-Glukosidaseenzym, umgewandelt wird.

Das Verfahren zur enzymatischen Umwandlung von Dextrose in Laevulose unter Einsatz der erfindungsgemässen immobilisierten Xyloseisomerase-Enzymfeubereitung eignet sich sehr gut für eine Durchführung in Säulenreaktoren zur kontinuierlichen enzymatischen Isomerisierung von Dextrose zu Laevulose, wobei das immobilisierte Enzym in die Säule gepackt wird. Die Säule kann gegebenenfalls weitere Materialien enthalten, um die Fliessgeschwindigkeit der Reaktionsflüssigkeit zu verbessern, wie beispielsweise Glaskugelchen, Filterhilfsstoffe und dergleichen. Ausgezeichnete Fliessgeschwindigkeiten werden jedoch durch die Verwendung eines körnigen basischen Magnesiumcarbonats mit Teilchengrössen von mehr als 40 mesh erzielt. Im allgemeinen schwankt die Teilchengrösse des bevorzugten körnigen basischen Magnesiumcarbonats zwischen ungefähr -12 und +20 mesh. Das basische Magnesiumcarbonat in körniger Form lässt sich in einfacher Weise dadurch erhalten, dass im Handel erhältliches pulverisiertes basisches Magnesiumcarbonat in einer geeigneten Vorrichtung kompaktiert und anschliessend vermählen wird.

Gemäss- einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird mehr als eine Säule verwendet, vorzugsweise werden wenigstens drei Säulen eingesetzt, welche die immobilisierte und stabilisierte Xyloseiaomerase enthalten und in Reihe geschaltet sind. Unter Anwendung einer derartigen Methode lässt sich eine wirksamere Ausnützung der immobilisierten Enzymzubereitung erzielen. Beispielsweise können höhere Fliessgeschwindigkeiten eingehalten werden. Wird die erste Säule in der Reihe inaktiviert, dann kann die Beschickungsflüssigkeit· ohne weiteres der zweiten Säule zugeführt werden, während die erste Säule durch eine Kon-

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taktierung mit frischem, löslichem Xyloseisomerase-Enzym regeneriert wird. Wird die zweite Säule inaktiviert, dann kann die Beschickungsflüssigkeit der dritten Säule zugeführt werden, und zwar zuerst und anschliessend durch die regenerierte erste Säule. Auf diese Weise kann das Verfahren kontinuierlich ohne Unterbrechen durchgeführt werden. Die immobilisierte Xyloseisomerase-Enzymzubereitung kann ferner in einem Druckblattfilter verwendet werden, das aus einem oder mehreren flachen Filterelementen (Blättern) besteht, die vertikal oder horizontal in einem zylindrischen Tank befestigt sind. Erwähnt sei beispielsweise ein Filter, wie es von der Industrial Filter Pump Manufacturing Company, Cicero, Illinois, hergestellt wird.

Da das basische Magnesiumcarbonat, welches das gebundene Xyloseisomerase-Enzym enthält, auf einem alkalischen pH gehalten werden muss, um eine Zersetzung während der enzymatischemIsomerisierungsreaktion zu verhindern, sollte die Beschickungsflüssigkeit, welche die Dextrose enthält, zuvor auf alkalische pH-Werte, wie sie vorstehend angegeben worden sind, eingestellt werden, d.h. auf einen pH-Wert von wenigstens ungefähr 7,5 und vorzugsweise auf einen pH-Wert von mehr als 8,2. Infolge der erhöhten Enzymkonzentration sowie der aufrechterhaltenen Aktivität des Komplexes aus Xyloseisomerase und basischem Magnesiumcarbonat vermindert sein Einsatz bei der Durchführung einer kontinuierlichen Umwandlung die Zeitspanne, die erforderlich ist, um einen Laevulose sirup mit 45 % Laevulose zu erzeugen, so dass eine pH-Wertänderung infolge einer Bildung von organischen Säuren in dem Konverter nicht festzustellen ist. Dies bedeutet mit anderen Worten, dass, falls die Verweilzeit oder die Kantaktzeit bei der Durchführung einer Säulenisomerisierung unterhalb 2 Stunden liegt und vorzugsweise weniger als 1 Stunde.beträgt und der pH-Wert der Ausgangsbeschickungsflüssigkeit grosser als 8,0 ist, die Bildung einer Säure während der enzymätischen Isomerisierung nicht festzustellen ist, so dass daher der pH-Wert des Beschickungssirups nicht durch ein alkalisches Material gesteuert werden muss, wie dies auch aus dem folgenden Beispiel hervorgeht. _409816/0836

BEISPIEL 5 Kontinuierliche enzymatisch^ Umwandlung von

Dextrose in Laevulose unter Verwendung von immobilisierter XyIοseisomerase

Ein körniges basisches Magnesiumcarbonat mit einer Teilehengrösse zwischen -12 und +20 mesh wird in einer Menge von 55,8 g in eine Säule gegeben, die ein Volumen von 73,3 ml aufweist. Ein im wesentlichen reines, lösliches und zellfreies Xyloseisomerase-Enzym, das auf S. olivochromogenes AiCC Nr. 21713 in einer 0,01m MgSOλ-Lösung zurückgeht und eine Aktivität von 50 U/ml besitzt, wird mit dem körnigen basischen Magnesiumcarbonat kontaktiert, um die Säule mit 5 Millionen Einheiten/ 0,03 m des Enzyms zu beladen. Das immobilisierte Xyloseisomerase-Enzym weist eine effektive Aktivität von mehr als 100 ü/g pro Gramm des immobilisierten Enzyms auf.

Eine wässrige Dextrose-Beschickungsflüssigkeit wird dann der Säule mit 27° Baume (50 %, d.s.) zugeführt. Die Beschickungsflüssigkeit enthält MgCl₂ (0,005m bezüglich MgCl₂). Der pH-Wert der Beschickung wird auf 8₉4 bis 8,8 mit 4n NaOH bei 58°C eingestellt.

Die Säule, welche die immobilisierte Enzymzubereitung enthält^ wird auf einer Temperatur von 58°C gehalten» Die Verweilzeit in der Säule beträgt weniger als 1 Stunde«, Das Ausgangsbettvolumen pro Stunde für die Herstellung von #5 % Laevulose, bezogen auf Trockenbasis (BVEL₄C Laevulose) beträgt ungefähr 1. -

Der abfliessende Sirup enthält ungefähr 45 Gewichts-% Laevulose, bezogen auf Trockenbasis, und weniger als ungefähr 0·,3 Gewichts-% Psikose, bezogen auf Trockenbasis» Nachfolgend ,wird eine Analyse des pH-Wertes des Beschickungssirups sowie des abfliessenden Sirups nach einer längeren kontinuierlichen Umwandlung angegeben:

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Betriebs- Beschickungs- Ablauf, stunden sirup, pH bei 25°C pH bei 25°C

261 8,60 8,60

Der vorstehend beschriebene Versuch wird wiederholt, mit der Ausnahme, dass die Xyloseisomerase an einen Aluminiumoxydträger gebunden wird. Die gleiche Dextrose-Beschickungsflüssigkeit, . die zuvor auf einen pH von 8,3 bis 8,4 mit 4n NaOH eingestellt worden ist, wird durch die Säule gepumpt, die auf einer Temperatur von 58°C gehalten wird, und zwar mit einer solchen Geschwindigkeit, dass 45 Gewichts-% Laevulose, bezogen auf Trockenbasis, in dem ablauf erhalten werden. Die Verweilzeit beträgt weniger als 1 Stunde. Nachfolgend wird eine Analyse des pH des Beschickungssirups sowie des ablaufenden Sirups anach einer längeren kontinuierlichen Umwandlung angegeben:

Betriebs stunden	Beschxckungs- simp, pH bei 250C	Ablauf, pH bei 250C
16	8,3	8,4
376	8,15	8,25
428	. 8,4	8,3

Bei dem Betrieb einer Säule, in welcher die Verweilzeit ungefähr 4 Stunden überschreiten kann, ist es besonders vorzuziehen, ein alkalisches Material, wie beispielsweise eine Natriumhydroxyd- oder Mg(OH)ρ-Lösung oder eine Kombination aus diesen beiden Lösungen in die Säule in verschiedenen Höhen einzuführen. Eine geeignete Methode zur Durchführung dieser Maßnahme besteht darin, Einlasse für die alkalischen Lösungen an einer oder mehreren Stellen längs der' Säule vorzusehen, so dass der pH-vVert der Reaktionslösung auf wenigstens ungefähr 7,5 gehalten wird.

Gemäss einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann der pH-Wert der enzymatisehen Isomerase-Reaktionslösung durch die

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Verwendung von einem oder mehreren Einlassen für die alkalische Lösung längs der Säule programmiert werden. Bei der Durchführung einer derartigen Methode kann der Anfangs-pH-Wert der Beschickungsflüssigkeit ungefähr 7,5 oder darüber betragen und vorzugsweise zwischen ungefähr 7,5 und ungefähr 8,2 liegen. Durch Einführen von alkalischen Materialien, wie beispielsweise Natriumhydroxyd oder Mg(OH) ρ oder Kombinationen aus diesen zwei Materialien in die Reaktionslösung über Einlasse längs der Säule kann der pH-Wert der Reaktionslösung in bequemer Weise bis auf einen Wert von bis zu ungefähr 9,5 gebracht werden. Vorzugsweise wird der pH-Wert um einen Wert von. wenigstens ungefähr 0,1 durch die Zufuhr von Vorratsflüssigkeit zu dem Ablauf erhöht, wobei jedoch günstigere Ergebnisse bezüglich der Stabilität des basischen Magnesiumträgers sowie der Qualität der Isomerase erzielt werden, wenn der pH-Wert um einen Wert von wenigstens ungefähr 0,2 gesteigert wird.

BEISPIEL 6 Kontinuierliche enzymatische Umwandlung von

Dextrose in Laevulose unter Verwendung von immobilisierter Xyloseisomerase

Eine von einem Glasmantel umgebene Säule mit einer Länge von 104 cm wird als Konverter verwendet. Der Durchmesser des Enzymbettes beträgt 26 mm. Wasser wird in den Konverter an dem tieferen Ende in einer Menge von ungefähr 2 Bettvolumina pro Stunde eingepumpt. Trockenes basisches Magnesiumcarbonat, das durch ein 16 mesh-Sieb gesiebt worden ist und auf einem 30 mesh-Sieb gesammelt worden ist, wird dann oben in die Konvertersäule eingefüllt. Die Teilchen des basischen Magnesiumcarbonats setzen Sich unten an dem Konverter ab, während das feine Material des basischen Magnesiumcarbonats aus dem Oberteil der Säule durch aufsteigendes Wasser ausgewaschen wird.

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Nachdem das Bett aus basischen Magnesiumcarbonat-Teilchen hergestellt worden ist, wird eine lösliche Xyloseisomerase—Enzymlösung, die auf einen Mikroorganismus des Genus Streptomyces zurückgeht (1 1 mit einer Enzymaktivität von 100 U/ml) durch das Bett bei Zimmertemperatur gepumpt. Bezogen auf den Unterschied der Enzymaktivität der Lösung vor sowie nach einem zweimaligen Durchlaufenlassen durch das Bett wird festgestellt, dass 79 000 Einheiten des Isomeraseenzyms in dem Bett aus basischem Magnesiumcarbonat gebunden sind, wobei ein Komplex aus Xyloseisomerase und basischem Magnesiumcarbonat gebildet wird, der eine effektive Aktivität von mehr als 175 U/g besitzt.

Eine enzymatische Isomerisierung einer Dextroselösung unter Bildung eines Laevulose-enthaltenderx Sirups wird in der Weise durchgeführt, dass durch die Säule eine Lösung geschickt wird, die 600 g pro Liter Dextrose enthält, und zwar bei einem Anfangs-pH von ungefähr 8,3 sowie einer Infangsfliessgeschwindigkeit von ungefähr 1,5 Bettvolumina pro Stunde (ungefähr 800 hlL pro Stunde). Aliquotproben werden periodisch für Analyseziirecke abgezogen. Während der ersten 6 Stunden des Betriebs enthält das ablaufende Produkt zwischen £-5,9 und 48,7 Gewichts-?^ Ketose. Die Fliessgeschwindigkeit zur Herstellung eines Ketoseproduktes in einer Menge von 45 Gewichts—?a, bezogen auf TrockenbasiSy "beträgt ungefähr 1 Bettvolumen pro Stunde oder darüber. Die Menge der gebildeten Psikose beträgt weniger als 1 Ge wichts—%, bezogen auf Trockenbasis.

Unter Berücksichtigung der bei der Durchführung des vorstehend geschilderten Experiments erhaltenen Ergebnisse ist ersichtlich, dass der Komplex aus Xyloseisomerase und basischem Magnesiumcarbonat sehr aktiv ist. Das Experiment zeigt ferner, dass das gebundene Enzym aktiv und sehr stabil ist. Da die Qualität eines Produktes aus einem kontinuierlich arbeitenden Konverter mit einer Produktionsgeschwindigkeit von 0,5 Bett-

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volumina pro Stunde (BVH) zufriedenstellend ist, kann die Produktionszeit dieses Konverters 22 Tage betragen, wobei die Halbwertszeit des Konverters zwischen-16 und 18 Tagen liegt. Bei einer durchschnittlichen Produktionsgeschwindigkeit von 1,3 BVH bei 45 % Laevulose während einer Zeitspanne von 17 Tagen beträgt das Gesamtprodukt, bezogen auf Trockenbasis, 171 849 g oder 0,46 Enzymeinheiten pro Gramm des Produktes.' Daraus geht deutlich der durch die Erfindung erzielbare technische Fortschritt hervor, der insbesondere auf Einsparungen an dem Enzym zurückzuführen ist, das zur Herstellung des gewünschten Laevuloseproduktes erforderlich ist.

BEISPIEL 7

Ein im Handel erhältliches basisches Magnesiumcarbonat—Pulver wird kompaktiert und auf eine Teilchengrösse zwischen ungefähr -40 und +30 mesh vermählen. 31 j 7 g dieses granulierten basischen Magne siumcarbonat—Trägers werden in eine mit Wasser gefüllte Säule gegeben, die von einem Mantel umgeben ist. Das Bett besitzt ein Volumen von 53 ml- Wasser wird durch die Säule an ihrem unteren Ende eingepumpt, so dass die gröberen Teilchen des körnigen basischen Magnesiumcarbonate sich unten in dem Konverter absetzen, während das feine Material aus dem Oberteil der Säule durch das aufsteigende Wasser ausgewaschen wird.

In einem anderen Behälter wird eine Lösung hergestellt, die 95 % D.E.-Stärkehydrolysat mit einem Feststoffgehalt von 50 %.sowielösliches Enzym enthält. Das Xyloseisomerase-Enzym geht auf Streptomyces zurück und besitzt eine Isomeraseaktivität von 50 U/ml. Die Lösung wird auf 189 ml eingestellt. Magnesiumchlorid (MgCl₂) wird der Lösung zur Einstellung eines Gehaltes von 0,005m bezüglich MgCl,-, zugesetzt. Der pH wird' unter Verwendung von 4n Natriumhydroxyd auf 8,4 eingestellt.

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Die Kombinationslösung (Stärkehydrolysat und lösliches -Enzym) wird in die Kolonne eingepumpt, welche das körnige basische Magnesiumcarbonat enthält und 2 1/2 mal durch die Säule Haufen gelassen, so dass der Träger mit 5 Millionen Einheiten pro 0,03 m (cubic foot) des Enzyms bei einer Temperatur von 60°C beladen wird. Nachdem die Lösung, die das lösliche Enzym und das Stärkehydrolysat enthält, durch die Säule laufen gelassen worden ist, ist die Säule anschliessend aktiviert und fertig für eine Verwendung zur kontinuierlichen Umwandlung einer Dextroselösung in einen Laevulose-enthaltenden Sirup. Der Komplex aus Xyloseisomerase und körnigem basischen Magnesiumcarbonat besitzt eine effektive Isomeraseaktivität von mehr als 175 U/g des Komplexes.

Ein Laevulose-enthaltender Sirup wird kontinuierlich in der Säule in der Weise hergestellt, dass eine Lösung, die ein Stärkehydrolysat mit einem Dextroseäquivalent von ungefähr 95 enthält und einen Feststoffgehalt von ungefähr 50 %, bezogen auf Trockenbasis, aufweist, eingepumpt wird. Das in die Säule eingepumpte Stärkehydrolysat wird zuerst mit MgCl₂ zur Einstellung eines MgCl^-Gehaltes von 0,005m behandelt, worauf der pH-Wert der Lösung auf 8,4 unter Verwendung von 4n NaOH eingestellt \cLrd. Die Isomerisierung wird kontinuierlich bei einer Temperatur von 60⁰C bei einem Laevulose-BVH^p-Wert ^von 1,6 durchgeführt.

Nach 69 Stunden vermag die immobilisierte Xyloseisomerase in der Säule immer noch Dextrose in Laevulose umzuwandeln, wobei ein Produkt erhalten wird, das einen Ketosegehalt von 40,1 %, bezogen auf Trockenbasis, und einen Psikosegehalt von 0,15 Gewichts-?^ bezogen auf Trockenbasis, aufweist, wobei ein eingestelltes Bettvolumen pro Stunde erzielt wird, das 1,8 äquivalent ist.

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Dieses Experiment zeigt deutlich die Stabilität sowie die Enzymwirkung der erfindungsgemässen immobilisierten XyIoseisomerase.

BEISPIEL 8 Vergleichsbeispiel ■ ,

Erdalkalicarbonate werden im Vergleich auf ihr Bindevermögen ("gebundene Isomerase) sowie die effektive Isomeraseaktivität ("beibehaltene Isomeraseaktivität") mit in Form van Einzelteilchen vorliegendem basischen Magnesiumcarbonat verglichen. In jedem Falle wird der getestete Träger mit einer gereinigten, zellfreien Xyloseisomerase-Lösung kontaktiert, die 2500 bis 2600 U/ml Glukoseisomerase-Aktivität enthält. Die Xyloseisomerase geht auf einen Mikroorganismus des Genus Streptomyces (Stamm S. olivochromogenes, ATCC Nr. 21713) zurück.

Jeder der Träger wird in einem 150 ml-Becher mit 30 ml einer Lösung aufgeschlämmt, die aus 0,01m MgSO,·7HpO besteht. Die Aufschlämmung wird auf einen pH von 8 bis 9 unter Verwendung von 0,1n KOH eingestellt. Die gereinigte Xyloseisomerase-Lösung wird dann einer jeden Trägeraufschlämmung zugesetzt, um eine Gesamtisomerase-Zugabe von ungefähr 2600 Einheiten Glukoseisomerase-Aktivität zu erzielen. Eine weitere Menge einer 0,01m MgSOA-Lösung wird einer jeden Aufschlämmung aus Träger und Enzym zugesetzt, um ein Gesamtvolumen von 50 ml einzustellen. Der pH-Wert der Lösung wird (falls erforderlich) auf 8 bis 9 eingestellt. Die Becher werden bedeckt und bei Zimmertemperatur >Shrend einer Zeitspanne von 30 Minuten gerührt, um eine maximale Sorption des Enzyms an die entsprechenden Träger zu bewirken. Die Aufschlämmungen werden filtriert, worauf die Träger mit dem sorbierten Enzym mit 100 ml der 0_r01 m MgSO^-Lösung gewaschen werden, pie Filtrate sowie die Waschlösungen werden vereinigt und auf ihre Isomeraseaktivi-e-'tät gegenüber der zugesetzten ursprünglichen Isomeraseaktivität unter Verwendung eines Technicon Auto-Analyzers untersucht.

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Das Bindevermögen oder die "gebundene Isomerase" der jeweiligen Träger wird unter Anwendung der folgenden Formel berechnet:

"Gebundene Isomerase" _ Alle vorliegend η Einheiten - Alle Ein-(BI), U/G, d.b, ⁼ heiten in dem Filtrat und in den Wasch-

lösungen

g Träger, d.b.

Die "effektive Isomeraseaktivitat!¹ (auch als "zurückbehaltend Isomeraseaktivität" bezeichnet) einer jeden Erdalkali-Carbonatträgerprobe wird unter Einhaltung der folgenden Methode bestimmt:

Eine wässrige Lösung, die 80 g Dextrose (d.b.) und 13>3 mg Mg(OH)₂ pro 100 ml enthält, wird hergestellt. Die Lösung wird während wenigstens 1 Stunde (vorzugsweise über Nacht) zur Gleichgewichtseinstellung gerührt. Der pH wird auf 8,5 bei Zimmertemperatur mit 3n KOH eingestellt. 193,9 g Substrat (ungefähr 150 ml) werden in einen Becher aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 1 1 zugesetzt, der mit einem Uhrglas mit einem Loch in der Mitte bedeckt ist, wobei das Uhrglas ein weiteres Loch in der Nähe seines Randes aufweist. Die Probe wird in ein Wasserbad mit einer Temperatur von 6O°C gestellt und während einer Zeitspanne von 15 Minuten gerührt, wobei ein pH-Wert von 8,0 unter Verwendung von 3n KOH aufrechterhalten wird. Das Substrat wird mit Stickstoff mit massiger Geschwindigkeit gespült, wobei ein Gasverteilungsrohr verwendet wird, das durch das Loch am Aussenumfang des Uhrglases eingeführt wird. Eine zuvor abgewogene Menge«eines Komplexes aus Syloseisomerase und basischem Magnesiumcarbonate der 1000 bis 3000 Einheiten an gebundener Isomerase enthält, wird unter Verwendung von 50 ml Wasser mit einer Temperatur •von 60⁰C zugesetzt, wobei das Wasser dazu verwendet wird, um das Material in den Becher aus rostfreiem Stahl zu überführen. Auf diese Weise erhält man eine Reaktionsmischung, die 60 g

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2343464'.

Dextrose und 10 mg Mg(OH)₂ pro 100 ml enthält und einen Isomerasegehalt von 8,3 bis 25,0 Einheiten pro Gramm Dextrose aufweist. Die Reaktionsmischung wird auf einen pH von 8,0 eingestellt und während einer Zeitspanne von 2 Stunden, die exakt nach der Enzymzugabe gemessen werden, digeriert. Das Material wird sofort durch Vakuum durch ein 10 cm Whatman 541-Papier filtriert, worauf der pH eines 500 ml-Anteils des Filtrats auf ungefähr 2,5 unter Verwendung von .1,On Perchlorsäure eingestellt wird. Der Trockensubstanzgehalt der inaktivierten Probe wird durch Brechungsindexmessung bestimmt. Die Laevulosekonzentration wird durch spektrophotometrische oder polarimetrische.Methoden ermittelt. Ms der Menge der erzeugten Laevulose wird die effektive Isomerase-Aktivität ("beibehaltene Isomeraseaktivität") unter Anwendung der folgenden Gleichung bestimmt:

Effektive Aktivität, _ V _{26 46} ^₁₂ U/g, ü.D. irager υ log 51,2-L

V = Reaktionsvolumen, ml

C = Träger, g₉ d.b« und

L = erzeugte Laevulose, % d.b.

Einzelheiten sowie die Ergebnisse der einzelnen Tests sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst%

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Tabelle	6	D	Lösungsmittel	Bindever	Effek	% der	)	48,9
				mögen O'ge-	tive	ursprüng	14,7
	Substrat		bundene Iso	Isome	lichen	-
	Konzentration		meraseakti	rase-	Aktivi	71,4
Träger	g, d.s.	MgSO4	vität" )	akti	tät
	100 ml	MgSO4	(Hg, d.b.)	vität
		MgSO4		(U/κ,d.b.:
		MgSO4	515	252
ZnCO3			368	54
CaCO3	60		38	75
BaCO3	60·	412	294
60
Basisches 60
MgCO3

1) Basisches Magnesiumcarbonat der Formel 4 MgCO₃^Mg(OH)₂*

Wie aus den vorstehenden Werten ersichtlich ist, ist das Bindevermögen (auch als "gebundene Isomerase" bezeichnet) der Erdalkalicarbonate schwer vorhersehbar. Das gleiche gilt für die effektive Isomeraseaktivität. Es ist besonders bemerkenswert, dass BaCO₃ ein extrem geringes Vermögen besitzt, Isomerase zu binden. Während ZnCO₃- und CaCO^-Komplexe mit Isomerase eine vernünftige "gebundene Isomeraseäktivität" zeigen, besitzen die Komplexe der beiden Verbindungen eine relativ niedrige "effektive Isomeraseaktivität" oder die Fähigkeit, Dextrose zu Laevulose zu isomerisieren, und zwar im Vergleich zu dem Komplex aus Xyloseisomerase und basischem Magnesiumcarbonat gemäss vorliegender Erfindung.

Ohne sich an eine Theorie binden zu wollen, kann man annehmen, dass die relativ niedrige "effektive Isomeraseaktivität" bei diesen Salzen (ZhCO₃ und CaCO₃) deshalb auftritt, da die Isomerase so fest gebunden wird, dass ihre Konformation verändert und/oder die Isomerase nicht dem Substrat zugänglich

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ist aufgrund der /rt, in welcher die Isomerase an das Salz gebunden ist. In jedem Falle ist es unerwartet, dass basisches Magnesiumcarbonat ein relativ hohes Bindevermögen zusätzlich zu einer hohen "effektiven Isomeraseaktivitatf'besitzt. Die Kombination dieser zwei Merkmale bietet eine Reihe von wichtigen Vorteilen im Hinblick auf die Stabilität sowie die längere Halbwertszeit des immobilisierten Enzyms sowie des grösseren Enzymwirkungsgrades. Die Enzymwirkungsgrade liegen normalerweise zwischen 0,30 und ungefähr 0,70. So zeigt beispielsweise eine Tiefbettsäule mit einer Enzymbeladung von 6 MM Einheiten/O,03 m (Ausmaß der Enzymaktivität in dem Bett (Einheiten/g) geteilt durch das Bettvolumen (kg/0,03 m )) sowie mit einem Enzymwirkungsgrad von 0,6 eine Anfangssäulen-Produktionsgeschwindigkeit von 3,6 BVH mit 45 % Ketose (BVH^₅), wobei BVH die Zuführungsgeschwindigkeit geteilt durch das Bettvolumen ist.

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Claims (1)

1. -. 42-

   P AT ERTMi SPRUCH S

   1. ifozyiuatiechcs'Isoi..urisierungs-V^rfahren zur Umwandlung von Dextrose in Laevulose, dadurch gekennzeichnet, dass eine'Dextrose enthaltende Lösung in einer Anfangsphase der Umsetzung bei einer Arbeitstemperatur von wenigstens 5O°C aber nicht über 70⁰C der Einwirkung einer Xylose-Isomerase-Enzyaizubefeitung unterworfen wird, woraufhin die Temperatur auf einen Wert erhöht wird, der wenigst
   während der Anfangsphase der Umsetzung.

   auf einen Wert erhöht wird, der wenigstens 5°G höher liegt als

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeic hn e t, dass die Temperatur während der Aufangjphase der Umsetzung im Bereich von 50⁰C bis 65°C liegt.

   3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur nach der Anfangsphase der Umsetzung. stufenweise erhöht wird.

   4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur nach der Anfangsphase der Umsetzung in einer einzigen Stufe erhöht wird.

   5. Verfahren nach Anspruch 2_S dadurch g e 's. e η η ζ e i c hn e t, dass die Arbeitstemperatur nach der Anfangsphase der Umsetzung 80 C nicht überschreitet,

   6. Kontinuiex-lich.es Verfahren zur Isomerisierung von. Dextrose in Laevulose mit einer Xylose-Isomerase-Enzjmzubereitung, dadurch g ekennz e i chn e t, dass ein Strom einer dextrosehaltigen Losung in einer Anfangsphase der Umsetzung mit einer immobilisierten Xylose-Isomerase-Snzymzubereitung für eine Anfangszeit bei einer Arbeitstsuperatur von wenigstens 5ö°G in Berührung gebracht wird, woraufhin die Umsetzung bei einer iiöixeren Temperatur als während der Anfangsphase, die aber 80^QG nicht überschreitet, fort-

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   setzt, um im Ausfluss eine gewünschte Ke tos einenge aufrechtzuerhalten.

   7.' Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzsichn e t, dass als Dextroselösung ein Stärkehydrolysat verwendet wird.

   8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gele ennz a lehnet, dass das Stärkehydrolysat einen D.E.-Wert von wenigstens 95 aufweist.

   9. Verfahren nach Anspruch 6., dadurch gekennzeichnet, dass die Bextroselösung durch Auflösen von kristallisierter Dextrose in einem wässrigen Medium erhalten wird.

   10. Verfahren nach. Anspruch 6, dadurch g e k e η ri ζ e i c hnet , dass der Lösungsstrom bei einem pH von wenigstens 7 mit der Enzymzubereitung in Berührung, gebracht wird.

   11. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Arbeitstemperatur während der Anfangsphase der Umsetzung im Bereich von 50⁰G bis 65°C liegt.

   12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennz eic line t, dass das pH iai Bereich von etwa 7,5 bis 8,5 aufrechterhalten wird. ■

   13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass sich die.EnzyMZUbc-reitung von einem Organismus der Gattung Streptomyces ableitet.

   14. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch g ek e η η ζ e i c hn. e t, dass die Umsetzung in der zweiten Phase durch Erhöhen der Temperatur in kleinen Stufen erfolgt.

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   15. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung in der zweiten Phase durch Erhöhen auf eine Temperatur., die wenigstens 5 O höher als die Arbeitstemperatur während der Anfangsphase ist, fortgesetzt wird.

   16. Kontinuierliches Verfahren zur Isomerisierung einer dextrosehaltigen Lösung mit einer Xylose-Isomerase-Enzymzubereitung, dadurch gekenn ze ichne t, dass ein Strom einer dextrosehaltigen Lösung in einem wässrigen Medium in einer Anfangsphase der Umsetzung mit einer immobilisierten Xylose-Isomerase-Enzymzubereitung, die sich, yon einem Mik-r ο Organismus der Gattung Streptomyces ableitet, bei einem pH von wenigstens 7>0 und bei einer Temperatur von wenigstens 50 G bis zu etwa 65 G in Berührung gebracht wird, woraufhin die Isomerisierung bei einem pH von wenigstens 7 und bei einer Temperatur fortgesetzt wird, die höher ist, als die während der Anfangsphase angewendete Temperatur aber 8O⁰O nicht überschreitet, um im Ausfluss eine gewünschte Ketosemenge aufrechtzuerhalten und ein laevulosehaltiges Produkt zu gewinnen.

   17· Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennz eichn e t, dass die Xylose-Iaomerase-Zubereitung aus intakten Zellen von Mikroorganismen besteht.

   18. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch g e k e η η ζ e i ahnet, dass die Isomerisierung bei einem pH im Bereich von etwa 7,5 bis etwa 8,5 durchgeführt wird.

   3,9. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass ein Maisstärkehydrolysat mit einem D.E.-Wert von wenigstens 95 als Dextroselösung-Ausgangsiaaterial verwendet wird.

   20. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennz eichn e t, dass die Isomerisierung durch Erhöhen der Temperatur -in kleinen Stufen fortgesetzt wird. " · -. '■

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   21. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Isomerisierung fortgestzt wird, indem die Teinpetur um wenigstens 5°G gegenüber der Arbeitstemperatur während

   der Anfangsphase erhöht wird. -

   22. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Isomerisierung fortgesetzt wird, indem die Tempetur uia wenigstens 10⁰G gegenüber der Arbeitstemperatur während der Anfangsphase erhöht wird.

   23. Enzymatisehes Isomerisat einer dextrosehaltigen Lösung, dadurch gekennzeichnet, dass es einen durch· enzymatische Isomerisierung erhaltenen Laevulosegehalt von wenigstens 50 Gew.-56, · be'zogen auf Trockenbasis, aufweist.

   24-. Isomerisat nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass es aus einem Maisstärkehydrolysat μit einem D.S.Wert von wenigstens 95 erhalten, wird.

   25. Erzeugnis nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass es einen von der Isomerisierung verursachten Aschegehalt unter 1,0)», bezogen auf Trockenbasis, und einen Psicosegehalt nicht über 0,3^, bezogen auf Trock&nbasis aufweist.

   26. Stabilisierte Xylose-Isoiüerase-Enzymzubereitung, dadurch gekennzeichnet, dass das Xylone-Isomerase-Enzym an vorzugsweise basischem fcagnesiumcarbonat adsorbiert ist.

   27. Stabilisierte Xylose-Isomerase-ßnzymzubereituhg nach Anspruch 26, dadurch gekennzeicline t, ^: dass sich das Enzym von einem I.iirkoorganisxuus der Gattung Stroptomyces ableite

   28. Stabilisierte und immobilisierte Xylose-Isomerase-Enzym-

   zubereitung, dadurch gekennzeichne t , dass die Xylose-Isomerase an vorzugsweise basisches Maänoüiumcarbonat gebunden und die Zubereitung eine wirksame Isomerase--Aktivität von •wenigstens etv^a 100 -Einheiten je Gramm ÄnEyzizubereitung aufweist.

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   BAD OHiGiNAL

   29. Zubereitung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass .das vorzugsweise basische Llagnesiunicarbonat in Granulatform zur Anwendung kommt.

   30. Zubereitung nach Anspruch 2b¹, dadurch ge k e η η zeichnet, dass eich die lösliche Xylose-Isoinerase von einem IviikroOrganismus der G-attung Sti-eptoiayees ableitet.

   31. Zubereitung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass sich die lösliche Xylose-Isomerase von Mikroorganismen der Stämme 3. olivochromogenes ATCG Ko. 21713» S. olivochromogenes ATCG No. 21714 und S. olivochromogenes ATGO No. 21715 ableitet.

   32. Zubereitung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine wirksame Isomerase-Aktivität von wenigstens etwa 175 Einheiten je Gramm -Enzymzube reitung aufweist.

   33· Verfahren zur Herstellung einer stabilisierten und immobilisierten Xylose-Isomerase-Enzyiazubereitung, dadurch gekennzeichnet, dass ein vorzugsweise basisches Magne siumcarbonat mit einer Lösung in Berührung gebracht wird, die zellfreies, lösliches Isomerase-Enzym enthält.

   34. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekenn ze ichn e t, dass das pH der Lösung iia Bereich von etwa 7,5 bis etwa 9,5 liegt. .

   35- Verfahren nach Anspruch. 33, dadurch gekenn' ze ichn e t, dass das zellfreie, lösliche Xylose-Iaonie-rase-Enzym in im wesentlichen gereinigtem Zustand vorliegt;.

   36. Verfahren nach Anspruch 33> dadurch gekennz e ich-· net, dass sich die sellfreie, lösliche Xyl-se-Isoraerase von einem Mikroorganismus der Gattung Streptomyces ableitet. .

   409816/0836 BADORiGINAL

   37. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch g e'k e η η zeichnet, dass sich die zellfreie, löbliche Xylose-Isomerase von eine:u* Mikroorganismus der Stämme S. olivochromogenes ATGG ITo. 21713, S. olivochroiaogenes ATCC No. 21714 "und S. olivochroiaogen.es ATGG 21715 ableitet.

   38. Verfahren zum enzymatisch en Konvertieren von Dextrose in Laevulose, dadurch g e k enn ζ ei chn e t, dass eine Lösung mit einem Gehalt von etwa 20 Gew.-¹^ bis etwa 70 Gew.-Ja Dextrose bei einem pH im Bereich von etwa 7,5 bis etwa 9,5 und bei einer Temperatur Von etwa 3O⁰C biu etwa 9O⁰G durch ein Bett einer an vorzugsweise basisches Liagnesiuiucarbonät gebundenen Enzymzubereitung von Xylooe-Isoiaerase geleitet wird, die eine wirksame Isoinerase-Aktivität von wenigstens etwa 100 Einheiten je Gramm Enzymzubereitung aufweist.

   39· Verfahren nach Anspruch 38» dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionslösung etwa 40 Gew.-$ Ms etwa 60 Gew.-°fc Dextrose enthält und das pH der Lösung im Bereich von etwa 8,2 bis etwa 9,2 liegt.

   40. Verfahren nach Anspruch 38, dadurch g e k e η η zeichnet, dass das Bett in Lösung gebrachte Xylose-Isomerase enthält, die an ein vorzugsweise basisches Magnesiumcarbonat gebunden ist, und dass die wirksame Isomerase-Aktivität wenigstens 175 -Einheiten je Gramm JSnzymzubereitung beträgt.

   41. Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass sich Xylose-Isoiierase-Enzym von einem Mikroorganismus der Gattung Streptomyces ableitet.

   42. Verfahren nach Anspruch 38, dadurch g e- k e η η zeichnet, dass sich die lösliche XyIοse-Isomerase von einem Mikroorganismus der Stämme."S-- olivochroiuogenes ATGG üo· 217I3, S. olivochromogen.es ATGC Ho. 21714 und S. olivocJiromogenes No, 21715 ableitet.

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   -4 3· Verfahren nach Anspruch 38, dadurch g e k e η η ζ ei c h η e t, dass das Bett , das lösliche XyIöse-Isomerase an ein vorzugsweise basisches idagnesiuiacai^bonat gebunden, enthält, .in einer Säule angeordnet ist'.

   44'. Verfahren nach Anspruch 43» dadurch gekennzeichnet, dass die Säule einen Einlass aufweist, durch, welchen ein alkalisierendes Mittel zum Regulieren des pH-Wertes der Reaktionslösung in die Säule eingeführt v/erden kann. .

   45. Verfahren nach-Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, dass die Realctionslöcung durch mehr als eine Säule , die in Serie angeordnet sind, geführt wird.

   46. Verfahren nach Anspruch 38, dadurch g e k e η η -

   a ei chn e t, dass das vorzugsweise basische iJagnesiumcarbonat in Granulatform vorliegt.

   47. .Verfahren nach Anspruch 38, dadurch g e k e η η !zeichnet, dass als Reaktionslösung ein Stärkehydrolysat verwendet wird, dass durch aufeinander folgende oder gleichzeitige enzymatische Verflüssigung und Verzuckerung einer stärkehaltigen Lösung gewonnen wird.

   48. Verfahren zur enzymatischem Konversion von Dextrose in Laevulose, dadurch- gekennzeichnet, dass

   (1) in einer Anfangsphase der Umsetzung eine Dextrose-Lösung bei einer Arbeitstemperatur von wenigstens etwa 50⁰G aber nicht über 70⁰U der Einwirkung einer stabilisierten Xylose-Isciuerace-Snzyiuzubereitung, die an ein vorzugsweise basisches Lagnesiumcarbonat adsorbiert ist , ausgesetzt v/ird und

   (2) in einer anschliessenden Phase der Umsetzung die Tem-

   ' peratur auf einen Wert erhöht wird, der 'wenigstens 5⁰G höher als die Temperatur während dor Anfangsphase der Ulis e· t ζ ung lie β t,

   409 8 16/0836 ^{SAD or}'G'Nal

   23Λ9Α64

   4-9. Verf uhren nach Anspruch 48, dadurch g e k e, η η -

   zeichnet, dass, sich das Xv-l'oae-IöOL.ürace-jSnzyia von einem SUUS- der Gattung Streptomyoes ableitet.

   50. Verfuhren nach Anspruch 48, dadurch g e k e η η -

   ζ eich π-et, dass das stabilisierte iSnsyra in einer Säule angeordnet i.st.

   51. Verfahren zur Gre\,^;imiung von Xylose-Isouierase aus einer Perjaentationsflüeaigkeit, dadurch gekennzeichnet , UQas ^ina FerLientationßflüsijiglceit, die Xyloce-Isoiiierase enthält, .mit vorzugsweise basiachem Icasnesiuiacarbonat in Berührung gebracht wird , um Adsorption der Isomerase zu bewirken und dann die Xyiose^Isowrase in Iforia sines Komplexes aus Xylose-Isomerase-SnzyiB und basischen M^gneslumcarbonat zu gewinnen.

   52. . '.Verfahren nach Anspruch 51, dadurch g e k e η η -

   ζ e i chn e t, daes dös« Verzugsv/«ise basische liagnesiuiacarbonat a$r Pemientat^onoflüssigkeit mit d®n Seilen, die xyioseenthalten, zuge&ötsit wird, und dass in einer naehiolgan-Stufe die 2ylose-IsoB*era;3e in Gegenwart de© vörj&ugsweise

   ' vsaa den Zellen abgetrennt wird.

   ORIGINAL 03816/0836