DE2232645C3

DE2232645C3 - Verfahren zur Durchführung einer enzymkatalysierten Umwandlung eines Substrats

Info

Publication number: DE2232645C3
Application number: DE2232645A
Authority: DE
Inventors: Chin Kee Lee; Margaret Esther Long
Original assignee: RJ Reynolds Tobacco Co
Current assignee: RJ Reynolds Tobacco Co
Priority date: 1971-07-09
Filing date: 1972-07-03
Publication date: 1979-03-29
Also published as: ES404521A1; FR2145486A1; CA1030087B; DK136073B; DE2232645A1; FI49319B; US3821086A; AU4420672A; IT988061B; CH554941A; FI49319C; AT314452B; CA978118A; JPS578716B2; DE2232645B2; FR2145486B1; NL158846B; JPS5344682A; SE409469B; NO140233B

Description

Die Verwendung von Enzymen aus mikrobiellen Zellen zur spezifischen chemischen Umwandlung von Substraten ist bekannt Bei der Durchführung solcher Umwandlungen werden zellfreie Zubereitungen üblicherweise in absatzweise geführten Prozessen verwendet Die Enzyme werden gewöhnlich aus der Zelle durch mechanische Maßnahmen oder durch Autolyse freigesetzt Dieses Vorgehen ist wenig wirtschaftlich und technisch problematisch.

Es ist auch Bekannt, daß unlösliche Materialien, wie Zellen, aus Flüssigkeiten durch Verwendung von Polyelektrolyten, natürlichen Gummis oder Alaun wirksam entfernt werden können. So unterstützt bei Fermentation, die extracellular Enzyme verwenden, gewöhnlicherweise die Verwendung von Polyelektrolyten die Entfernung der unerwünschten Zellen und es wird die Klarheit des Enzym enthaltenden Filtrats verbessert. Einige mechanistische Aspekte hinsichtlich der Flockulierung von Bakterien mit Polyelektrolyten werden von P. L. Busch und W. Stumm in Enviromental Science und Technology 2.49 — 53 (Januar 1968) und von L. L Gasner und D. I. C. Waηg in Biotechnology and Bioengineering 12, 872 — 887 (1970) gegeben.

Aus der DE-AS 12 27 855 ist ein Verfahren zur Herstellung von Enzymkörpern für die Durchführung enzymatischer Reaktionen bekannt, bei dem man ein Enzym in trockener, emulgierter oder gelöster Form einer Lösung eines semipermeablen Materials, wie Polyamid, Polyvinylacetat, Zellulosenitrat, Zelluloseacetat, Äthylzellulose, Kautschukchlorid oder Lipoide, einverleibt und anschließend die entstandene Lösung, Emulsion oder Suspension unter Trocknung formt. Mittels solcher Enzymkörper können dann Spaltungen, z. B. die Spaltung von Saccharose, durch Invertase, vorgenommen werden.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein einfaches und wirksames Verfahren zur enzymkatalysierten Umwandlung eines Substrates aufzuzeigen, bei dem man das Substrat mit einem Aggregat in Berührung bringt, das ganze mikrobielle Zellen, welche mit aktiven Mengen des Enzyms vergesellschaftet sind, enthält. Eine Abtrennung des Enzyms von dem Mikroorganismus ist nicht mehr erforderlieh. Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt in der im Patentanspruch 1 angegebenen Weise. Die ganzen mikrobiellen Zellen, die durch Verwendung von geeigneten Flockulierungsmitteln zu Aggregaten gebildet worden sind, können direkt in einer weiten Vielzahl von enzymatischen Prozessen verwendet werden. Ein Bett aus flockulierten mikrobiellen Zellen ist dazu imstande, einem wiederholten Durchlauf von Substratlösungen durch das Bett zu widerstehen,

ίο wobei über ausgedehnte Zeiträume zufriedenstellende Fließgeschwindigkeiten und Enzymaktivitäten beibehalten werden.

Zur Förderung der gewünschten Zellaggregation ist eine Vielzahl von Flockulierungsmitteln geeignet Beispiele für solche Mittel sind anionische Polyelektrolyte, wie Carboxylsubstituierte Polyacrylamide, Polystyrolsulfonate und Polycarbonsäuren, kationische PoIyelektrolyte, wie Polyamine, Polyäthylenamk· .md kationische Polyacrylimide und Polysäuren. Zur Bewirkung der gewünschten Aggregation können auch Kombinationen von zwei oder mehreren Flockulierungsmitteln verwendet werden. Die Auswahl des geeigneten Flockulierungsmittels im Einzelfall kann leicht erfolgen, indem man verschiedene Mittel zu kleinen Proben der zeilenthaltenden Brühe gibt und die Textur und das Aussehen der gebildeten Zellaggregate vergleicht. Die Verwendung von Filterhilfen und polymeren Adsorbentien zusammen mit dem Flockulierungsmitteln kann in manchen Fällen von Vorteil sein. So sind z. B. polymere Adsorbentien, wie Acrylsäureester, und Filterhilfsmittel, wie Diatomeenerde und Asbest wirksam, wenn sie zu der Brühe zu der Zeit der Flockulierung zugesetzt werden. Die Mengen des Adsorptionsmittels oder des Filterhilfsmittels, die verwendet werden, können, bezogen auf das Gewicht der nassen Zellen in der Brühe, bis zu 100 Gew.°/o ausmachen.

Die Zugabe des Flockulierungsmittels zu der zeilenthaltenden Brühe wird am geeignetsten in Form einer Lösung oder Suspension durchgeführt. Es kann auch notwendig sein, den pH-Wert der Flockuüerungsmittellösung und/oder der Brühe vor dem Vermischen einzustellen. Dies hängt von dem verwendeten Mikroorganismus, der Stabilität des interessierenden Enzyms und dem pH-Bereich, >n welchem das Flockulierungsmittel am wirksamsten ist, ab. Die Flockulierung wird vorzugsweise bei Umgebungstemperaturen durchgeführt Die erforderliche Menge des Flockulierungsmittels ist im allgemeinen 1 bis 50 Gew.%, bezogen auf das Gewicht der nassen Zellen, die in der Brühe enthalten sind.

Die Durchbewegung der das Flockulierungsmittel enthaltenden Fermentationsbrühe muß heftig genug sein, um ein relativ vollständiges Aussetzen der Zellen an das Flockulierungsmittel zu bewirken. Eine überschüssige Durchbewegung sollte aber vermieden werden, da hierdurch eine Verringerung der Größe der Aggregate erfolgen kann, die sich bereits gebildet haben, wodurch der Zweck der Zugabe des Flockulierungsmittels zunichte gemacht wird. Die sorgfältige Kontrolle der Durchbewegung ergibt Zellaggregate, die sieh in den Fermentator agglomerieren, und sie erleichtert die praktisch vollständige Gewinnung der verfügbaren Zellen durch Standard-Techniken, bei' spielsweise durch Dekantierung, Filtration oder Zentrifugation.

Die flockulierten Zellen können ohne eine weitere Behandlung in dem in Betracht gezogenen enzymatischen Verfahren verwendet werden. Jedoch ist die

einsetzbare Lebensdauer eines solchen Zellmaterials beim Betrieb in einer kontinuierlichen Kolonne aufgrund der Packung und Absetzung des Materials erheblich vermindert, das die Fließgeschwindigkeiten nachteilig beeinflußt Es wird daher bevorzugt, die geernteten flockuiierten Zellen Gefriertemperaturen auszusetzen oder die flockuiierten Zellen vor der Verwendung in einem enzymatischen Prozeß zu trocknen. Solche Behandlungen dienen nicht nur dazu, die Fließgeschwindigkeiten der Substratlösung zu verstärken, sondern auch dazu, die Handhabungs- und Lagerungseigenschaften der flockuiierten Zellen zu verbessern. Die bei der Behandlung des geernteten Zellmaterials erforderlichen Gefriertemperaturen sind nicht besonders kritisch, wobei Temperaturen von 0⁰C und darunter zufriedenstellend sind. Die Gefrierzeiten hängen naturgemäß von den verwendeten Temperaturen und von der Masse der Zellaggregate ab, die eingefroren werden solL

Die Konsistenz der geernteten flockuiierten Zellen ist derart, daß das Material in verschiedene Gestalten extrudiert werden kann, die für die Verwendung in enzymatischen Prozessen geeignet sind. Die extrudierten Zellaggregate können in Verbindung mit inerten Trägermaterialien bei der Herstellung von gepackten Kolonnen für den kontinuierlichen Betrieb verwendet werden oder das Extrudat kann vor dem Gebrauch gefroren oder getrocknet werden.

Die Trocknung der flockuiierten Zellen ist besonders nützlich, da hierdurch ein Mahlen des getrockneten Materials und die Auswahl der Teilchengröße durch Sieben der gemahi.nen Zellen ermöglicht wird. Die Kontrolle der Teilchengröße gewährleistet ihrerseits ein gleichförmiges Bett, wenn das Material in Kolonnen zum kontinuierlichen Strom von 5Hibstratlösungen durch das gepackte Bett hindurch abgepackt wird. Das Trocknen der flockuiierten Zellen gestattet auch die Lagerung des getrockneten Materials bei Raumtemperaturen über ausgedehnte Zeiträume. Die Trocknung kann in jeder beliebigen Weise durchgeführt werden, beispielsweise in einem Zwangsumluftofen, in einer Vakuumkammer, in einem Trommeltrockner und dergleichen, vorausgesetzt, daß die Trocknungstemperaturen und die verwendeten Trocknungszeiten keine nennenswerte Denaturierung des gewünschten Enzyms mit sich bringen. Die Trocknungszeiten variieren, doch wird es bevorzugt, daß das Trocknungsverfahren weitergeführt wird, bis das Material genügend spröde ist, um ein Mahlen zu gestatten.

Die flockuiierten Zellen können für eine weite Vielzahl von enzymkatalysierten Umwandlungen verwendet werden. Beispiele hierfür sind Isomerisierungen, die Oxidation, die Dehydrierung, die Hydrolyse und die Reduktion. Das Material ist sowohl für absatzweise geführte oder kontinuierliche Vorgänge geeignet, obgleich Umwandlungen, die die Freisetzung eines Gases umfassen, bei kontinuierlichen Kolonnenprozessen weniger anzustreben sind. Die Menge des erforderlichen Zellmaterials für einen gegebenen Prozeß hängt von einer Anzahl von Faktoren mit Einschluß der spezifischen Enzymaktivität des Materials und der Verfügbarkeit gegenüber dem Substrat sowie der Geschwindigkeit und dem Grad der gewünschten Umwandlung ab. Bei kontinuierlichen Kolonnenvorgängen beeinflussen auch die Dimensionen der Kolonne und die gewünschten Fließgeschwindigkeiten die Menge des erforderlichen Zellmateriäls.

Das Substrat, vorzugsweise in Form einer Lösung

oder Emulsion, wird mit dem flockulierten Zellmaterial über einen Zeitraum in Berührung gebracht, der ausreicht, um die gewünschte Umwandlung zu bewirken. Die Betriebsparameter, wie die Temperatur, der pH-Wert und die Substratkonzentration, werden von der Stabilität und den Bedingungen für eine optimale Aktivität des Enzyms, das für die Umwandlung verantwortlich ist, bestimmt Das Produkt der Umwandlung wird nach bekannten Maßnahmen gewonnen. Gewünschtenfalls kann es einer weiteren Behandlung unterworfen werden.

Die Erfindung kann am besten unter Hinweis auf spezifische Organismen und knzyme illustriert werden. Ein ausgewählter Stamm von Arthrobacter, z. B. ein solcher der Hinterlegungsnummern NRRL B—3724, NRiIL B-3725, NRRL B-3726, NRRL B-3727 oder NRRL B—3728, wird in einem sterilen Medium kultiviert, das Quellen für Kohlenhydrat, Stickstoff und anorganische Salze enthält Die Fermentation wird bei 30⁰C gemäß dem Verfahren der deutschen Patentanmeldung P 20 55 515.1 durchgeführt Man läßt die Fermentation fortschreiten, bis eine maximale Isomeraseaktivität erreicht wird, bestimmt nach den Standardanalyseverfahren. Zu diesem Zeitpunkt machen die in der Brühe auspendierten nassen Zellen gewöhnlich etwa 4 Gew.% der Gesamtbrühe aus. Zu der Brühe wird Polyvinylimidazolin in Form einer 2% igen wäßrigen Lösung gegeben, deren pH-Wert zuvor auf 5.0 eingestellt worden ist Die Menge des zugegebenen Flockulierungsmittels beträgt ungefähr 0,25 Gew.%, bezogen auf die Gesav.tbrühe. Die Zugabe erfolgt unter mäßigem Durchbewegen der Brühe. Die Bildung der Gesamtzellaggregate ist gewöhnlich innerhalb 10 bis 15 Minuten vollständig. Die Durchbewegung wird sodann gestoppt und die flockulierte Zellmasse setzt sich am Boden des Fermentators ab. Die Zellen werden geerntet indem der größte Teil der klaren Brühe abdekantiert wird und die nassen flockuiierten Zellen einer Vakuumfiltration unterworfen werden.

Die geernteten gesamten Zellagi,r=gate werden eingefroren und etwa 8 Stunden bei —5°C gehalten, bevor eine gepackte Kolonne hergestellt wird, wobei das Material in der getauten Form verwendet wird. Bei der Herstellung der gepackten Kolonnen werden die Aggregate in Wasser aufgeschlämmt und einer mechanischen Aufbrechung unterworfen, um eine gleichförmigere Teilchengröße zu erhalten. Für diesen Zweck ist beispielsweise ein Waring-Mischer geeignet, vorausgesetzt, daß die Mischzeit auf sehr kurze Zeiträume beschränkt ist. Die Aufschlämmung wird in eine Kolonne gegossen, die zum Teil mit Wasser gefüllt ist. und es erfolgt die Sedimentierung der Zellen. Durch die geprckte Kolonne wird eine Glucoselösung mit Konzentrationen von bis zu 50Gew.°/o, die genügend Mg+ + enthält, um eine maximale Isomerisierung zu erhalten, und die auf einen pH-Wert von etwa 6 bis 10 eingestellt ist, geleitet. Die Kolonne wird vorzugsweise auf etwa 50 bis 75"C erhitzt, um die Geschwindigkeit der Umwandlung von Glucose zu Fructose zu erhöhen und um das Wachstum von verunreinigenden Organismen ZU !nhibieren_: Die Fließgeschwindigkeit des ausströmenden Stroms wird so kontrolliert, daß Umwandlungen von Glucose zu Fructose von 40 bis 45% erhalten werden. Der durch das Verfahren der Erfindung erhältliche Ümwandlungsgrad der Glucose zu Fructose erreicht bis zu 50%, Gewünschtenfalls können zwei oder mehrere gepackte Kolonnen in Reihe betrieben werden, wobei die gepackten Zellen aus den

Kolonnen wiedergewonnen werden können, um nachfolgend bei Glucoseisomerisierungen wiederverwendet zu werden. Die Isomeraseaktivität wird beibehalten, sogar wenn das Zellmaterial wiedergewonnen und vor dem Gebrauch gekühlt, gefroren oder getrocknet wird.

Die Isomerisierung von Glucose zu Fructose kann auch durch verschiedene Arten von Streptomyces durchgeführt werden, die flockuliert worden sind. Arten, die für diesen Zweck geeignet sind, sind z. B. S. albus, S. chinatur, S. achromogenes, S. phaeochromogenes, S. flavovirens und S. olivaceus. Die Flockulierung der Gesamtzellen, die durch Kultivierung von verschiedenen Arten von Streptomyces erhalten werden, wird in einer Weise vorgenommen, die der entsprechenden, im Zusammenhang mit Arthrobacter beschriebenen Weise analog ist. Auch die Isomerisierung erfolgt in ähnlicher Weise.

Beispiel 1

(A) Herstellung des Aggregats

Eine Art von Arthrobacter, z. B. NRRL B-3728, wird in ein sterilisiertes Züchtungsmedium gegeben, das 2% Dextrose, 0,3% Fieischprotein, 0,i % Hefeextrakt, 0,6% (NH₄J₂HPO₄, 0,2% KH₂PO₄ und 0,01% IvIgSO₄-7H₂O enthält. Der pH-Wert des Mediums ist 6,9. Die Fermentation wird unter Durchbewegung bei 28° C über 60 Stunden fortschreiten gelassen. Am Ende dieses Zeitraums hat die Brühe einen pH-Wert von ungefähr 5,5. Zu dieser Brühe wird eine 2%-ige (Gewicht je Volumen) Lösung eines Polyelektroiyten, z. B. Polyvinylimidazolin, gegeben, bis zu einer End-Polyelektrolyt-Konzentration von 0,25% (Gewicht je Volumen). Der pH-Wert der Polyelektrolytlösung wird zunächst auf etwa 5,0 eingestellt und die Fermentationsbrühe wird langsam während der Zugabe des Polyelektroiyten durchbewegt. Gewünschtenfalls kann ein Filterhilfsmittel, wie Kieselgur, zu der Brühe in einer Konzentration von etwa 0,5% (Gewicht je Volumen) kurz vor der Zugabe der Polyelektrolytlösung zugesetzt werden. Die mäßige Durchbewegung der Brühe, die den Polyelektroiyten (und gegebenenfalls das Filterhilfsmittel) enthält, wird weitergeführt, bis stabile Zellaggregate gebildet werden (ungefähr 10 Minuten). Sodann wird die Durchbewegung gestoppt und die Zellüggregate werden langsam agglomerieren gelassen, wodurch sich der größte Teil der klären Brühe von dem Zellmaterial abscheidet. Das Zellmaterial wird sodann durch Vakuumfiltralion oder durch andere geeignete Maßnahmen gesammelt. Die geernteten Zellaggregate werden vor dem Gebrauch entweder bei —5°C gefioren oder bei 55° C getrocknet Die Isomeraseaktivität der geernteten Aggregate, bestimmt nach den Standardanalyseverfahren, ist der enzymatischen Aktivität der Zellen vergleichbar, die aus der Fermentationsbrühe vor der Behandlung mit dem Flockulierungsmitte! und dem Filterhilfsmittel isoliert worden sind. Darüber hinaus zeigt eine Analyse der abgetrennten Fermentationsbrühe keine Isomeraseaktivität, was auf eine vollkommene Gewinnung der Isomerase durch die Flockulierungstechnik hinweist

(B) Erfindungsgemäßes Verfahren

Die gefrorenen flockulierten Zellen werden in Wasser oder einem Glucosesirup eingetaucht Die Zellenmasse wird auftauen gelassen und durch mechanische Maßnahmen oder durch Rühren leicht verkleinert, wodurch Teilchen mit ungefähr gleichförmiger Größe erhalten Werden. Diese Aufschlämmung wird sodann ungefähr 30 Minuten Vakuumbtdingungen ausgesetzt, um okkludierle Gase aus den Zellteilchen zu entfernen. Eine Mantelkolonne mit einem Durchmesser von 2,5 cm wird zum Teil mit Wasser oder Glucosesiiup gefüllt und die entgaste Aufschlämmung wird sodann in die Kolonne gegossen. Die gepackte Kolonne wird auf 60°C erhitzt. Eine 2 m— Lösung von Glucose mit einem pH-Wert von 8,0, die 0,004 m MgCI₂-OH₂O enthält, wird durch die Kolonne geschickt Durch dieses Verfahren sind Umwandlungen bis zu 50% erhältlich.

Beispiel 2

("A^ Herstellung des Aggregats
Die Flockulierung wird durch die kombinierte Verwendung eines kationischen und eines anionischen Flockulierungsmittels erhalten. 5 Teile einer frischen Arthrobacter-Kultur (pH 5,6) werden mit 1 Teil einer 1 %-igen (Gewicht je Volumen) Lösung von Polyvinylimidazolin behandelt Die day Flockulierungsmittel enthaltende Brühe wird langsam gerührt, bis sich große Zellagijregate bilden. Ein Teil einer 1%-igen (Gewicht je Volumen) anionischen Floc)'· 'ierungsmittel-Lösung (Copolymer aas Methacrylsäure -ine¹ Äthylacrylat ⁷⁰Z30) wird sodann zugesetzt und das Rühren wird weitergeführt bis die großen Aggregate zu feinen Teilchen aufbrechen. Die flockulierten Zellen werden wie im Beispiel 1 A agglomerieren gelassen. Die geklärte Brühe wird abgetrennt und die flockulierten Zellen werden durch eine einfache Vakuumfiltration gewonnen. Der pH-Wert von beiden Flockulierungslösungen wird mit Alkali eingestellt bevor diese zu der Brühe gegeben werden. Die kationische Lösung wird auf einen pH-Wert von 5 eingestellt Die anionische Lösung wird auf einen pH-Wert von 7 eingestellt Der End-pH-Wert der flockulierten Kultur beträgt etwa 5,6%.

Der filtrierte Zellkuchen wird durch eine geeignete Düse extrudiert, bevor das Extrudat in einem Zwangsumluftofen etwa 24 Stunden bei ungefähr 55° C getrocknet wird Das getrocknete Zellenmaterial wird in einer Mühle granuliert und zu einer Teibhengröße

40' von 0,84 bis 0,42 mm gesiebt

(B) Erfindungsgemäßes Verfahren

Die granulierten getrockneten Zellen werden in eine Kolonne gepackt und die Glucose-Isomerisierung wird in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 B durchgeführt.

Beispiel 3

Aspergillus niger wird in einem Nährmedium kultiviert das Glucose, Fructose, MgSO₄ · 7H₂O.

KH₂PO₄, (NH₄J₂HPO₄, Harnstoff und Maisquellflüssigkeit enthält Am Ende der Fermentationsperiode wird zu dem Medium ein kationischer Polyelektrolyt in einer Menge gegeben, die 0,3Gew.%, bezogen auf das Volumen der Brühe, äquivalent ist. Es wird eine genügende Durchbewegung vorgenommen, um eine Aggregation der Zellen zu bilden. Oie flockulierten Zellen werden geerntet und in eine Mantelkolonne mit geeigneter Größe eingepackt Die gepackte Kolonne wird auf 40°C erhitzt Durch die Kolonne wird eine 5%-ige Lösu .g von Invertzucker geleitet, wodurch ein ausströmendes Produkt erhalten v/ird, das Gluconsäure und Fructose enthält

Beispiel 4

Streptomyces olivaceus, Stamm NRRL B—3583, wird in einem Nähriiicdiurn kultiviert, das 0,7% Xylose, 0,3% Dextrose, 0,5% Rindfleischextrakt, 0,25% Hefeextrakt, 1,0% Pepton, 0,5% NaCl, 0,05% MgSO₄-7H₂O und

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0,024% CoCI₂-6H₂O enthält. Die Fermentation wird bei 28°C 24 Stunden ablaufen gelassen. Eine 2%'ige (Gewicht je Volumen) Lösung eines kationischen Polyelektrolyten wird zu der Fermentationsbrühe in Mengen gegeben, die 0,05% (Gewicht je Volumen) des trockenen Flockulierungsmittels äquivalent sind. Die Brühe wird kurz durchbewegt, um eine Aggregation der Zellen zu fördern. Die Drehbewegung wird sodann gestoppt und die Sedimentation der flockulierten Zellen wird gestattet. Die Zellaggregate werden entsprechend wie in Beispiel 1 geerntet. Die flockulierten Zellen werden 24 Stunden bei 60°C getrocknet, bevor die getrocknete Zellmasse einer mäßigen mechanischen Zerkleinerungswirkung unterworfen wird, um die Teilchen auf Größen zu zerkleinern, die für einen Kolonnenbetrieb geeignet sind. Das zerkleinerte Zellenmaterial wird in eine Mantelkolonne gegossen, die zum Teil mit einer 1,0 m Glucose-Lösung gefüllt ist. Die gepackte Kolonne wird auf 70°C erhitzt. Eine 1,0 m Glucose-Lösung, die 0,04 m MgCI₂-BH₂O enthält, und die auf einen pH-Wert von 8 eingestellt ist, wird durch die Kolonne geleitet, wodurch eine Umwandlung von Glucose zu Fructose erzielt wird.

Beispiel 5

Saccharomyces cerevisiae wird in einem Nährmedium kultiviert, das Molassen enthält. Nach einer Fermentationsperiode wird eine Polyelektrolytlösung zu der Brühe unter genügender Rührung gegeben, um eine Aggregation der Zellen zu bewirken. Die flockulierte Zellmasse wird geerntet und bei einem kontinuierlichen Kolonnenbetrieb verwendet, wobei die Kolonnentemperatur 6O⁰C beträgt. Eine 0,5 m Lösung von Sucrose mit einem pH-Wert von 5,0 wird durch die Kolonne geleitet. Die Sucrose wird zu Invertzucker umgewandelt

Beispiel 6

Aspergillus oryzae wird in einem Nährmedium kultiviert, das Weizenkleie im Gemisch mit weiteren Kohlehydraten, Mineralstoffen und Puffersubstanzen enthält. Die Fermentation wird 48 Stunden bei 30⁰C stattfinden gelassen. Am Ende dieses Zeitraums wird zu der Brühe eine Lösung eines Polyelektrolyten gegeben. Die resultierende Aggregation der flockulierten Zellen wird durch eine mäßige Durchbewegung unterstützt Die flockulierten Zellen werden durch Dekantierung und Filtration gewonnen. Die flockulierten Zellen werden sodann in eine Mantelkolonne gebracht und auf 50⁰C erhitzt. Durch die Kolonne wird eine neutrale 0,2 m Lösung von Acetyl-DL-methionin geleitet, die 5 χ 10-⁴ m Co + -.· enthält Man erhält ein ausströmendes Produkt das L-Methionin enthält

Beispiel 7

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Aspergillus niger, NRRL346, wird in 101 eines Mediums kultiviert das 0,5% Pepton, 03% Hefeextrakt 03% Malzextrakt und 3,0% Laktose enthält Die Mycelien werden durch Filtration gewonnen, mit Wasser gewaschen und in 81 einer 0,1 molaren Natriumbicarbonat-Lösung (pH 8,0) erneut suspendiert Diese Suspension wird mit 160 ml einer 1,5%-igen kationischen Flockulierungsmittel-Lösung (die vorher auf einen pH-Wert von 8 eingestellt wurde) und anschließend mit 400 ml einer 1,5%-igen Lösung eines anionischen Flockungsmittels aus einem ⁷⁰Zx Copolymeren aus Methacrylsäure und Äthylacrylat versetzt Die ausgefällten Zellen werden dann durch Vakuumfiltration gesammelt, bei 55°C über Nacht getrocknet und dann gesiebt. Ein Anteil von 8,6 g der getrockneten Ausflockung mit einer Teilchengröße von etwa 1,19 bis 0,84 mm wird in eine Glaskölohne von 2,54 cm Durchmesser eingegeben. Eine saure Molke-Lösung mit einem pH von 4,5, die 6,5 Gew.% an Feststoffen (hauptsächlich Lactose) enthält, wird kontinuierlich durch die gefüllte Kolonne mit einer Fließgeschwindigkeit von 550 ml pro Tag und bei einer Temperatur von 6Ö°C hindurchgeführt; es wird ein Eluat erhalten, das Lactosehydrolyseprodukte enthält. Der Grad der Lactosehydrolyse liegt bei etwa 35%.

Beispiel 8

Lactobacillus thermophillus wird in 7 I eines Mediums kultiviert, das 2,0% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,25% Gelatine, 0,5% Dextrose, 2,0% Lactose, 0,5% Sucrose, 0,4% Natriumchlorid, 0,15% Natriumacetat und 0,05% Ascorbinsäure enthält. Nach 25snindiger Bebrütung bei 45°C wird die Brühe auf einen pH-Wert von 5,5 eingestellt und 30 Minuten lang mit 150 ml Toluol gerührt Die Zellen werden dann durch Zugabe von 200 ml einer 1,5%-igen Lösung eines kationischen Flockulierungsmittels zu der Brühe ausgeflockt. Die ausgeflockten Zellen werden durch Filtration gewonnen und bei 50°C über Nacht getrocknet. Ein Anteil von 4 g des getrockneten Materials wird in eine Säule mit einem Durehmp.sser von 2,54 cm eingegeben und 5 Oew.%-ige Lactoselüsung, die 0,02 molaren Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,0) enthält, kontinuierlich durch die gefüllte Säule hindurchgegeben. Mit einer Fließgeschwindigkeit von 420 ml pro Tag und einer Säulentemperatur von 55°C werden etwa 50% der Lactose zu Glucose und Galactose hydrolysiert.

Beispiel 9

Kluyveromyces fragilis wird in 151 eines Mediums kultiviert, das 4% Lactose, 0,4% Diammoniumhydrogenphosphate, 1,0% Pepton und 0,5% Hefeextrakt enthält Die Kultur wird mit 75 ml Toluol 30 Minuten lang behandelt Dann wird das Ausfällen durch Zugabe von 1100 ml einer 1,5%-igen Lösung (pH 5,8) eines kationischen Flockulierungsmittels und anschließende Zugabe von 450OmI einer 1,5%-igen Lösung eines anionischen Flockungsmittels aus einem ⁷⁰I-M Copolymer aus Methacrylsäure und Äthylacrylat zu der Kulturbrühe bewirkt Die erhaltene Ausflockung wird durch Filtration gewonnen und bei 55° C über Nacht getrocknet Ein Anteil von 10 g der getrockneten Zellen wird in eine Säule von 234 cm Durchmesser gegeben die eine süße Molkelösung mit einem pH-Wert vo^H 63. die 7,0 Gew.% Feststoffe enthält kontinuierlich durch die gefüllte Säule hindurchgegeben, während die Säule bei einer Temperatur von 2° C gehalten wird. Mit einer '.Fließgeschwindigkeit von 550 ml pro Tag werden etwa 65% der in der Molkelösung vorhandenen Lactose zu Glucose und Galactose hydrolysiert

Beispiel 10

Torulopsis sphaerica, NRRLl 178, wird in einem Medium kultiviert das 1,5% Maisquellflüssigkeit 0,4% Diammoniumhydrogenphosphat, 0.1 % Ammoniumdihydrogenphosphat 0,025% Magnesiumsulfatheptahydrat 0,1% Hefeextrakt und 3% Lactose enthält Die Fermentierungszeit ist 25 Stunden bei einer Temperatur von 28° C Ein Anteil von 500 ml der Fennentationsbrühe wird auf einen pH-Wert von 7,0 durch Zugabe von Natriumhydroxid eingestellt und dann mit 25 ml Toluol

15 Minuten lang gerührt.

Ein Anteil von 100 ml der mit Toluol behandelten Brühe wird dann nacheinander mit 2Örnl einer 1,5%-igen Lösung aines kationischen Flockungsmittels (pH 4,0) und 20 ml einer l,5%i-igen Lösung (pH 4,5) eines anionischen Flockungsmittels aus einem ¹⁰Im Copolymer aus Methacrylsäure und Äthylacrylat behändi'i Die Ausfällung der Torulopsis sphaerica-Zellen tritt unmittelbar auf; sie können durch Filtration gewönnen werden. Die ausgefällten Zellen werden dann direkt zur Hydrolyse der Lactose in 100 ml einer 5%-igen wäßrigen Lactoselösung, die 0,05 Mol Phosphat von einem pH^Wert von 7,0 enthält, verwendet. Nachdem die Lactoselösung, die die ausgefällter! Zellen enthält, 2 Stunden lang bei 37°G gerührt wurde, sind etwa 95% der Lactose zu einem Gemisch, das Glucose und Galactose enthält, hydrolysiert worden.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Durchführung einer enzymkatalysierten Umwandlung eines Substrats, bei dem man das Substrat mit einem Aggregat in Berührung bringt, das ganze mikrobielle Zellen, welche mit aktiven Mengen des Enzyms vergesellschaftet sind, enthält, dadurch gekennzeichnet, daß das Aggregat unter Verwendung eines anionischen oder kationischen Polyelektrolyt-Flockulierungsmittels gebildet worden ist

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Aggregat aus ganzen mikrobiellen Zellen, einem Flockulierungsmittel und einem Filterhilfsmittel besteht

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Aggregat vor der enzymkatalysierten Umwandlung trocknet

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet daß man das Aggregat vor der enzymkatalysierten Umwandlung einfriert