DD209578A5

DD209578A5 - Verfahren zur herstellung von immunoenzymatischen konjugaten

Info

Publication number: DD209578A5
Application number: DD83248852A
Authority: DD
Inventors: Franz Jansen; Pierre Gros
Original assignee: Sanofi Sa
Priority date: 1982-03-17
Filing date: 1983-03-16
Publication date: 1984-05-16
Also published as: EP0089880A1; PT76394A; PT76394B; CS173783A2; NZ203586A; NO830935L; EP0089880B1; DE3372175D1; IE830531L; KR840003815A; DK121683A; FR2523445B1; ES8405071A1; CS268656B2; FR2523445A1; NO166618C; ES520692A0; IE54624B1; MA19742A1; DK121683D0

Abstract

VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON NEUEN KONJUGATEN DURCH KOVALENTE BINDUNG ZWISCHEN EINEM ENZYM UND EINEM ANTIKOERPER. DIE VORLIEGENDE ERFINDG. BETRIFFT EIN VERFAHRENZ. HERSTELLG. V. IMMUNOENZYMAT. KONJUGATEN, DAURCH GEKENNZEICHNET, DASS SIE AUS EINER CHEMISCHEN KUPPLUNG DURCH KOVALENTE BINDUNG ZWISCHEN EINEM ANTIKOERPER ODER DEM FRAGMENT EINES ANTIKOERPERS, DIE IHRE FAEHIGKEIT ZUR WIEDERERKENNUNG DES GEWAEHLTEN ANTIGENS BEHALTEN HABEN, UND EINEM ENZYM, DAS BEFAEHIGT IST, AMMONIUM-IONEN AUSGEHEND VON IM ORGANISMUS HOEHERER TIERE TOLERIERTEN NATUERLICHEN SUBSTRATEN FREIZUSETZEN, RESULTIEREN.

Description

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Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen Konjugaten, bei denen ein Enzym und ein Antikörper durch kovalente Bindung zusammengefügt sind.

Die gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltenen Produkte sind daher !Conjugate, die durch kovalente Bindung eines spezifischen Enzyms mit einem Antikörper oder dem Fragment eines Antikörpers hergestellt wurden, wobei der Antikörper oder dessen Fragment gegen ein Antigen gerichtet sind, das die Zielzellen tragen.

Im Zusammenhang mit dem vorliegenden Patent werden derartige Verbindungen als "immuno-enzymatische !Conjugate" bezeichnet·

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die immunoenzymatischen !Conjugate sind künstliche, gemischte Moleküle, in denen ein Enzym durch kovalente Bindung mit einem Antikörper verbunden ist, der gegen ein von den Zielzellen getragenes Antigen gerichtet ist·

Die verwendeten Enzyme sind bekannte Verbindungen» Der verwendete Antikörper wird entweder polyklonalen Charakter aufweisen, wenn er aus einer konventionellen, beim Tier durchgeführten Immunisierung resultiert, oder monoklonalen Charakter haben, wenn er durch Klonierung von Hybridzellen hergestellt wird, die mittels Fusion zwischen Lymphozyten und Myelom-Zellen- erhalten wurden. Dieser Antikörper wird entweder in Form ganzer Immunoglobulin-Moleküle verwendet werden können, die die Fähigkeit zur Wiedererkennung des gewählten Antigens besitzen, oder in Form aller Fragmente dieser Immunoglobulin-Moleküle, die die Fähigkeit zur Wiedererkennung des gewählten Antigens behalten

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haben und insbesondere die unter der Bezeichnung ^ JFAB und Fab¹ bekannten Fragmente.

Die chemische Kupplung zwischen dem Antikörper (oder dem !Fragment des Antikörpers) und dem Enzym kann nach zahlreichen Methoden erfolgen, und zwar unter dem Vorbehalt, daß die gewählte Methode

- die jeweiligen biologischen Aktivitäten der zwei Konjugatkomponenten Antikörper und Enzym unverändert bewahrt;

- eine zufriedenstellende Reproduzierbarkeit des Verfahrens und eine gute Ausbeute bei der Kupplung gewährleistet;

- es gestattet, den Wert des Verhältnisses Enzym/Antikörper im erhaltenen Konjugat zu steuern bzw. zu beherrschen;

-zu einem stabilen Produkt führt, das in Wasser löslich ist.

Unter den Methoden, die diesen Bedingungen entsprechen, ist es erforderlich, diejenigen zu bevorzugen, die eine oder mehrere Thiol-Funktionen für die Ausbildung der Bindung zwischen den zwei Proteinen zur Umsetzung bringen. Es ist dabei gleichgültig, ob diese Thiol-Funktionen zu dem einen oder anderen Kupplungs-Protein gehören, oder ob sie in das eine oder andere dieser Proteine, das kein natürliches Thiol besitzt, künstlich eingeführt werden.

Wenn demnach eine oder mehrere Thiol-Gruppen künstlich in eines der Proteine eingeführt werden sollen, so kann dies durch Umsetzung des Proteins mit S-Acetylmercaptobernsteinsäureanhydrid erfolgen, das fähig ist, die Amin-Funktionen des Proteins zu acylieren. Anschließend kann man die Thiol-Funktionen durch Entfernung der Acetyl-Schutzgruppe xraittels Hydroxylamin freisetzen, wie es in Archives of Biochemistry and Biophysics JJQ, 41-49 (1967) beschrieben wurde. Eine sich anschließende Dialyse gestattet es, den Überschuß an den Reaktionspartnern sowie die Reaktionsprodukte mit geringer Molekularmasse zu entfernen. Andere in der Literatur beschrie-

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-3- ί 8·8.1983

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bene Methoden können auch bei der [Einführung der Thiol-Funktionen in eines der Kupplungs-Proteine angewendet werden.

!

! '

In den früheren französischen Patentanmeldungen, die insbesondere die Nummern 78 27 838, 79 24 655, 81 07 596 und 81 21 836 tragen, wurde bereits die Herstellung von anticancerogenen Produkten, sog. Konj^gaten, beschrieben, die durch Kupplung, durch kovalente Bindung der Rincin-A-Kette mit einem Antikörper oder dem Fragment eines Antikörpers, die gegen ein von den zu zerstörenden Zielzellen getragenes Antigen gerichtet sind, erhalten werden. Die Produkte dieses Typs sind in der vorliegenden Anmeldung mit dem Gattungsnamen Immunotoxine bezeichnet.

In der französischen Patentanmeldung 81 21 836 wurde außerdem die Eigenschaft von Ammonium-Ionen (in Form irgendeines ihrer Salze und insbesondere des Chlorids) zur Steigerung der cytotoxischen Wirksamkeit dieser Immunotoxine beschrieben*

Es ist jedoch relativ schwierig, eine dauerhafte ausreichende Konzentration an Ammonium-Ionen in den biologischen Flüssigkeiten des Kranken aufrechtzuerhalten*

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von neuen immunoenzymatisehen Konjugaten, welche die mit der Anwendung von Ammonium-Ionen verbundenen Nachteile in beträchtlicher Weise reduzieren, aber alle durch diese Ionen erzielten Vorteile der cytotoxischen Wirkungssteigerung und der Beschleunigung der Wirkungskinetik bei den Immunotoxinen erhalten bleiben*

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Ammoniumionen in der unmittelbaren Umgebung der Zielζeil en zu produzieren

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durch eine enzymatische Reaktion, ausgehend von einem nichttoxischen, natürlich vorhandenen oder kUnatlich in die Umwelt dieser Zellen eingebrachten Substrat»

Erfindungsgemäß werden immunoenzymatische Konjjugate in der Weise hergestellt, daß man eine chemische Kupplung durch kovalente Bindung zwischen einem Antikörper oder dem Fragment eines Antikörpers, die ihre Fähigkeit zur Wiedererkennung des gewählten Antigene behalten haben, und einem Enzym, das befähigt ist, Ammonium-Ionen ausgehend von im Organismus höherer Tiere tolerierten natürlichen Substraten freizusetzen, durchführt»

Erfindungsgemäß wird insbesondere dasjenige der zwei Proteine, das allein eine oder mehrere Thiol-Funktionen besitzt, mit dem anderen Protein zur Reaktion gebracht, in das zuvor eine oder mehrere Funktionen eingeführt werden, die geeignet sind, mit den Thiol-Funktionen zu reagieren, wobei die Umsetzung im wäßrigen Medium bei einem pH-Wert zwischen 5 und 9 und bei einer Temperatur durchgeführt wird, die 30 ⁰C nicht übersteigt, um eine stabile und definierte kovalente Bindung zu liefern» Diese kovalente Bindung wird insbesondere entweder eine DisulfId-Bindung oder eine Thiolether-Bindung sein. Man bezeichnet im folgenden dajenige der zwei Proteine,-das eine oder mehrere Thiol-Funktionen trägt, mit P- und das andere Kupplungs-Protein mit Pg»

1» Fall: Disulfid-Bindung

Die Herstellung des Konjugats kann durch das folgende Schema dargestellt werden:

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-3b- 8·8·1983

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in dem

-S-S-X eine aktivierte, gemischte Diaulfidgruppe bezeichnet, worin X der Aktivator-Rest ist» ·

Das durch, ein aktiviertes Schwefelatom substituierte Protein P₂ wird ausgehend von demselben Protein P₂ durch Substitution mittels eines Reaktionspartners, der selbst ein aktiviertes

Schwefelatom trägt, gemäß dem folgenden Schema erhalten:

P₂ + Y-R-S-S-X —> P₂-R-S- S-X₁

in dem

P₂ das zu substituiertende Protein bezeichnet,

Y eine Punktion darstellt, die die kovalente Bindung des Reaktionspartners an das Protein ermöglicht,

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2488 52 O _r4_

R eine Gruppe bezeichnet, die gleichzeitig die Substituenten

Y und -S-S-Z tragen kann und X den Aktivator-Rest darstellt.

Die funktioneile Gruppe Y ist befähigt, sich in kovalenter Form mit irgendeiner Funktion zu verbinden, die von den Seitenketten in den wesentlichen Aminosäuren des zu substituierenden Proteins getragen wird. Unter diesen sind insbesondere die endständigen Amin-Funktionen der I<ysyl-Radikale in dem Protein zu nennen

In diesem Fall wird Y insbesondere darstellen:

- eine Carboxylgruppe, die sich in Anwesenheit eines Kupplungsmittels wie eines Carbodiimide, und insbesondere eines in Wasser löslichen Derivats davon, wie 1-Ethyl-3-(3-Diethylaminopropyl)~carbodiimid, mit den Amin-Funktionen des Proteins verbinden kann,

- ein Carboxylsäurechlorid, das geeignet ist, direkt mit den Amin-Funktionen zu reagieren, um diese zu acylieren,

- einen sogenannten "aktiven" Ester, wie einen ortho- oder para-, Hitro- oder Dinitrophenylester oder auch einen Ester des H-Hydroxysuccinimids, die direkt mit den Amin-Funktionen reagieren, um diese zu acylieren,

- ein inneres Anhydrid einer Carboxyl-disäure, wie beispielsweise Bernsteinsäureanhydrid, das spontan mit den Amin-Funktionen reagiert, um Amid-Bindungen auszubilden,

NH

- eine Imidoestergruppe - C ,in der

R₁. eine Alkylgruppe ist, die mit den Amin-Gruppen des Proteins nach dem folgenden Schema reagiert:

Prot -MH₉+ ^XC-R_O * Prot-MH-C-R₀+R.OH

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24 88 5 2 O .₅.

Daa Radikal -S-S-X bezeichnet ein aktiviertes, gemischtes Disulfid, das befähigt ist, mit einem freien Ihiol-Rest zu reagieren» In dem gemischten Disulfid kann X insbesondere eine gegebenenfalls durch ein oder mehrere Alkyl-, Halogen- oder Carboxylradikale substituierte 2-Pyridyl- oder 4-Pyridyl-Gruppe bedeuten. X kann auch eine Phenylgruppe bezeichnen, die vorzugsweise durch eine oder mehrere Mtro- oder Carboxylgruppen substituiert ist. X kann schließlich auch eine Alkoxycarbonylgruppe wie die Methoxycarbonylgruppe darstellen·

Das Radikal R bezeichnet ein ganzes Radikal, das fähig ist, gleichzeitig die Substituenten Y und S-S-X zu tragen. Es sollte in der Weise ausgewählt werden, daß es keine !Funktionen aufweist, die geeignet sind, im Verlauf der späteren Umsetzungen mit den verwendeten Reaktionspartnern und den synthetisierten Produkten unerwünschte Webenreaktionen einzugehen. Die Gruppe R kann insbesondere eine -(GHp) -Gruppe mit η zwischen 1 und 10 sein oder auch eine Gruppe:

R₃-

OH

R₃-OH-

in der R. Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen bedeutet und R~ einen Substituenten darstellt, der gegenüber den später verwendeten Reaktionspartnern inert ist, wie eine Oarbamat-Gruppe -HH-C-OR,-

It 0

in der R₁- eine gerade oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen und insbesondere die tert-Butyl-Gruppe bezeichnet.

Die Reaktion der Verbindung Y-R-S-S-X mit dem Protein P₂ wird in homogener wäßriger Phase, meistens in Wasser oder einer Pufferlösung durchgeführt. Wenn es die Löslichkeit der Reaktionspartner erfordert, ist es möglich, dem Reaktionsmedium bis zu 20 % (Vol.) eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels, wie Alkohol und insbesondere tert.-Butanol hinzuzufügen.

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24 88 5 2 O _₆_

Die Reaktion γ/ird bei Umgebungstemperatur während einer Dauer von einigen bis zu 24 Stunden durchgeführt· Daraufhin wird eine Dialyse vorgenommen, die es gestattet, die !Produkte mit geringer Molekularmasse und insbesondere den Überschuß der Reaktionspartner zu entfernen. Dieses Verfahren ermöglicht es, zwischen 1 und 15 Substitutionsgruppen pro Mol übliches Protein einzuführen· Unter Verwendung derartiger Verbindungen wird die Kupplung mit dem Protein P₁ in Anwesenheit einer wäßrigen Lösung der zwei Proteine bei einer 30 ⁰C nicht übersteigenden Temperatur und einer variablen Reaktionsdauer von einigen Stunden bis zu einem Tag durchgeführt· Anschließend wird die erhaltene wäßrige Lösung dialysiert, um die Produkte mit geringer Molekulannasse zu entfernen, danach kann das Konjugat nach verschiedenen bekannten Methoden gereinigt werden.

2. Fall: Thioether-Bindun^

Die Herstellung des Konjugats beruht darauf, daß P₁-SH mit dem Protein P₂ zur Reaktion gebracht wird, in das zuvor ein IiJaIeimid-Radikal eingeführt wurde.

Die Reaktion wird in diesem Pail durch das folgende Schema dargestellt: 0

SH + (ρΓ) - BH-CO-Z -

-HH-CO-Z-H

in dem

Z eine aliphatisch^ oder aromatische Zwischenstruktur mit 1 bis 1.0 Kohlenstoffatomen darstellt.

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Das durch Maleimid substituierte Protein P₂ wird ausgehend ι :: von dem Protein Pp selbst durch Substitution der Amin-Punktiönen de3 Proteins mittels eines Reaktionspartners erhalten, der seibat Träger der Maleimid-Gruppe i3t, gemäß dem Schema:

HH_n + Y,-Z-II

In T -L λ—U—Xi

P₂-NH-CO-Z-N

ο ο :

in dem Y₁ darstellt:*

- entweder eine Carboxylgruppe; die Reaktion wird in diesem ffall nach Aktivierung der Carboxyl-Punktion in Anwesenheit: eines Kupplungsmittels wie Carbodiimid und insbesondere eines in Wasser löslichen Derivats davon, wie 1-Ethyl-3-(3-diethylamino-propyl)-carbodiimid,

- oder einen sogenannten "aktiven" Ester, wie einen ortho- oder para-, Nitro- oder Dinitrophenylester oder auch einen Este*· des N-Hydroxysuccinimids, die direkt mit den Amin-Funktionen reagieren, um diese zu acylieren.

Die Herstellung derartiger Reaktionspartner ist insbesondere beschrieben in Helvetica Chimica Acta £8, 531-541 (1975)· Andere Verbindungen der gleichen Klasse sind kommerziell verfügbar. 0

Die Reaktion der Verbindung Y_n'

mit dem Protein P„ wird in homogener wäßriger Phase, meistens in Wasser oder einer Pufferlösung durchgeführt. Wenn es die Löslichkeit der Reaktionspartner erfordert, ist es möglich, dem Reaktionsmedium bis zu 20 % (Vol.) eines mit'Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels, wie Alkohol und insbesondere tert.-Butanol hinzuzufügen.

62 186 -Π

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-8-

Die iieaktion wird bei Umgebungstemperatur während einer Dauer von einigen bis zu 24 Stunden durchgeführt· Daraufhin wird eine Dialyse vorgenommen, die es gestattet, die Produkte mit geringer Molekularmasse und insbesondere den Überschuß der Reaktionspartner zu entfernen. Dieses Verfahren ermöglicht es, zwischen'1 und 15 Substitutionsgruppen pro Mol übliches Protein einzuführen.

Unter Verwendung derartiger Verbindungen wird die Kupplung mit dem Protein P₁ in Anwesenheit einer wäßrigen Lösung der zwei Proteine bei einer 30 ⁰C nicht übersteigenden Temperatur und einer variablen Reakt ions dauer von einigen Stunden bis zu einem Tag durchgeführt. Anschließend v/ird die erhaltene wäßrige Lösung dialysiert, um die Produkte mit geringer Molekularmasse au entfernen, danach kann das Konjugat nach verschiedenen bekannten Methoden gemnigt werden.

Solche inmunoenzymatischen Konjugate können mit irgendeinem Enzym hergestellt werden. Jedoch sind im Hinblick auf ihre therapeutische Verwendung, die weiter unten ausgeführt wird, diejenigen Enzyme zu bevorzugen, die befähigt sind, Ammonium-Ionen ausgehend von im Organismus höherer Tiere tolerierten natürlichen Substraten freizusetzen.

Gemäß der Internationalen Klassifikation, wie sie beispielsweise in "Comprehensive Biochemistry" Band 13, 3· Ausgabe (1973)t M. Plorkin und E.H. Stortz Editors (Elsevier) dargestellt wurde, finden sich die in der Therapie anwendbaren Enzyme hauptsächlich im Rahmen der vorliegenden Erfindung wieder:

- in der Gruppe 1 (Oxydoreduktasen) und insbesondere in der Untergruppe 1-4, die die Aminosäure-dehydrogenasen und die Arainoxydasen enthält,

- in der Gruppe 3 (Hydrolasen) und insbesondere in der Untergruppe 3-5, die die Enzyme zur Hydrolyse von Amiden, Amidinen

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und anderen O-N-Bindungen (unter Ausschluß der Peptid-Bindungen) enthält,

- in der Gruppe 4 (Lyasen) und insbesondere in den Untergruppen 4-2 und 4-3, die die Enzyme zur Katalyse von Abbau-Reaktionen unter Bildung von ungesättigten Verbindungen enthalten.

Nachstehend ist eine Liste der für die Herstellung der erfindungsgemäßen immunoenzymatischen !Conjugate bevorzugten Enzyme aufgestellt. In jedem Pail wurde hierbei die gleiche Kodierung verwendet, wie sie zur Bezeichnung dieser Enzyme in der Internationalen Nomenklatur herangezogen worden ist.

1-4-1-1 1-4-1-3 1-4-1-5 1-4-3-2 3-5-1-1 3-5-1-2 3-5-1-4 3-5-1-5 3-5-3-6 3*5-4-4 3-5-4-6 3-5-^21 4-2-1-13 4-2-1-16 4-3-1-1 4-3-1-3 4-3-1-5

Alanin-Dehydrogena3 e Glutamat-Dehydrogenase NAD (P)⁺ L-Amino s äuren-Dehydrogenas e L-Aminosäuren-Oxydase Asparaginase Glutaminase Amidase Urease Arginin-Desiminase :Adenosin-Desaminase Adenosin-monophosphat-Desaminase Greatinin-Desaminase L-3 erin-De shydrat as e L-Theonin-Deshydratase Aspartat-Amonia-Lyase (oder Aspartase) Histidin-Ammonia-Lyase (oder Histidase) Phenylalanin-Ammonia-Lyase

Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Anwendung solcher immuno enzymatischen !Conjugate in der Human-Therapie.

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248852 O -ίο.

In den früheren französischen Patentanmeldungen,'die insbesondere die Nummern 78 27 838, 79 24 655, 81 07 596 und 81 21 836 tragen, wurde "bereits die Herstellung von anticancerogenen Produkten, sog. Konjugaten beschrieben, die durch Kupplung, durch kovalente Bindung der Ricin-A-Kette mit einem Antikörper oder dem Fragment eines Antikörpers, die gegen ein von den zu-zerstörenden Zielzellen getragenes Antigen gerichtet sind, erhalten werden. Die Produkte dieses Typs sind in der vorliegenden Anmeldung mit dem Gattungsnamen Immunotoxine bezeichnet.

In der französischen Patentanmeldung 81 21 836 wurde außerdem die Eigenschaft von Ammonium-Ionen (in !Form irgendeines ihrer Salze und insbesondere des Chlorids) zur Steigerung der cytotoxischen Wirksamkeit dieser Immunotoxine beschrieben.

Die Eigenschaft der Ammoniumsalze, die selektive cytotoxische Aktivität von Immunotoxinen zu steigern, bietet zahlreiche Vorteile bei zwei Situtations-Typen:

a) Jedesmal, wenn ein Immunotoxin als selektives cytotoxisches Mittel in vitro verwendet wird, um die Zielzellen zu zerstören

Im Fall der therapeutischen Anwendung trifft diese Situation insbesondere dann zu, wenn das Immunotoxin als cytotoxisches Mittel, zur Behandlung des Knochenmarks von Leukämie-Patienten verwendet wird, bei denen das so behandelte Knochenmark später transplantiert werden soll, wie das in der unter der Hummer 81 21 826 in Frankreich hinterlegten Patentanmeldung der vorliegenden Anmelderin beschrieben wurde.

b) Wenn das Immunotoxin in vivo als therapeutisches Mittel

beim Menschen angewendet wird,

ist es bei der Verabreichung an den Kranken jedesmal möglich, vorher, gleichzeitig oder später als das Immunotoxin ein

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Ammoniumsais zu geben, das die Steigerung der Wirksamkeit des Imtnunotoxins sichert, wie das in der oben genannten Patentanmeldung beschrieben wurde·

Jedoch kennt in diesem letzten Fall die Anwendung von Immunotoxin in vivo zusammen mit dem Gebrauch eines Ammoniumsalzes, ebenfalls in vivo, um den Steigerungseffekt zu erreichen, einige Einschränkungen, die mit der Eigen-Toxozität der Ammonium«Ionen verbunden sind und wegen dieser Tatsache ist es relativ schwierig, eine dauerhafte, ausreichende Konzentration an Ammonium-Ionen in den biologischen Flüssigkeiten des Kranken aufrechtzuerhalten.

Die durch die Anmelderin fortgeführten Arbeiten haben es ermöglicht, diese mit der Anwendung von Ammonium-Ionen verbundenen Nachteile in beträchtlicher Weise zu reduzieren, wobei alle der durch diese Ionen erzielten Vorteile der cytotoxisehen Wirkungssteigerung, und der Beschleunigung der Wirkungskinetik bei den Immunotoxinen erhalten bleiben. Diese Arbeiten haben im Ergebnis gezeigt, daß der durch die Zugabe eines Ammoniumsalses in entsprechender Konzentration zu den Immunotoxinen erhaltene Effekt der Steigerung und Beschleunigung auch erreicht werden könnte, wenn die Ammonium»Ionen in der unmittelbaren Umgebung der Zielzellen produziert worden wären, und zwar durch eine enzymatische Reaktion, ausgehend von einem nichttoxischen, natürlich vorhandenen oder künstlich in die Umwelt dieser Zellen eingebrachten Substrat.

Außerdem haben diese Arbeiten gezeigt, daß dieses Resultat in bemerkenswert wirksamer Art und Weise erhalten wird, wenn das Enzym, das die Reaktion katalysiert und Ammonium-Ionen produziert, mit einem Antikörper (oder dem Fragment eines Antikörpers) gekuppelt wird, der die Fähigkeit zum Wiedererkennen eines an der Oberfläche der Zielzellen vorhandenen Antigens besitzt·

Diese Verfahrensweise bringt mehrere Vorteile von großer Be-

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88 5 2 Ο-"-

deutung mit sich, insbesondere die folgenden:

a) Das verwendete Enzym ist in diesem Fall an der Membran der Zielzellen konzentriert, wegen der Affinität des Antikörpers (oder Fragment des Antikörpers) zu dem an dieser Membran vorhandenen Antigen. Aus dieser Tatsache heraua wird die Freisetzung von Mi, -Ionen als Produkt

der enzymatischen Reaktion nur in der unmittelbaren Umgebung der Membran der Zielzellen stattfinden, was die mit der allgemeinen Toxizität der Ammonium-Ionen verbundenen Risiken vermindert, wobei auch die Zwishenreaktion dieser · Ionen mit der unveränderten Zielzelle, die für den Eintritt der Wirkungssteigerung erforderlich ist, erleichtert wird.

b) Die enzymatische Reaktion, die die KEL -Ionen kontinuierlich und auch langer produziert, als das Substrat vorhanden ist, und dieses Substrat, das als nicht-toxisches ausgewählt wird, gewährleisten zusammen in dem Verfahren eine sehr große Anpassungsfähigkeit bei der Anwendung des Me-'chanismus der Wirkungss t eig erung.

Das bedeutet

- wenn das Substrat endogen ist und eine ausreichende Konzentration auf weist, kann die Verabreichung des wirkungsstei-

gernden iramunoenzymatischen Konjugats vor, gleichzeitig oder nach der Verabreichung des Iminunotoxins erfolgen, gemäß der optimalen Umstände, die für jeden Patienten festzulegen sind.

- wenn außerdem das Enzym in der Weise ausgewählt wird, daß sein Substrat nicht im Blut und den extrazellulären Flüssigkeiten in ausreichend erhöhter Konzentration existiert und daher dieses Substrat auch dem Kranken verabfolgt

werden muß, zeigt sich hier die maximale Anpassungsfähigkeit der Anwendung de3 Medikaments, weil man frei und unabhängig

24 88 5 2 O ^ ..„.,„

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den Zeitpunkt der Verabreichung, deren Dauer und die Dosis jeder der drei verabreichten Verbindungen regeln kann, nämlich des Immunotoxins, des immunoenzymatischen Konjugats und des Substrats, entsprechend der für die Behandlung jedes Patienten optimalen Bedingungen.

c) Unter den oben angegebenen Bedingungen wird man mindestens zwei unbedingt notwendige wirksame Substanzen gegen die Zielzellen richten, um das gesuchte Ergebnis zu erreichen:

- einerseits die Ricin-A-Kette, die den wirksamen, cytotoxischen Bestandteil verkörpert und in dem Konjugat, genannt Immunotoxin, enthalten ist»

- andererseits das Enzym, das einen wesentlichen Bestandteil des gesamten, die Wirkung steigernden Systems ausmacht und in dem immunoenzymatischen Konjugat enthalten ist.

Diese wirksamen Substanzen sind in allen Fällen, hinsichtlich ihrer Steuerung und ihrer selektiven Bindung an die Zielzellen, mit Antikörpern (oder Fragmenten von Antikörpern) gekuppelt, die die an der Oberfläche der Zielzellen vorhandenen Antigene wiedererkennen. Wenn man einen Antikörper auswählt, der streng spezifisch ein Antigen einer zu zerstörenden Zeil-Population wiedererkennt, so kann man in diesem Fall den gleichen Antikörper für die Kupplung an die verschiedenen wirksamen Bestandteile verwenden. Jedoch hat man im allgemeinen daran Interesse, verschiedene Antikörper auszuwählen, die verschiedene, aber von den Zielzellen gemeinsam getragene Antigene wiedererkennen. Selbst wenn jedes dieser Antigene nicht streng spezifisch der Zielzellen ist, so wird die Wahrscheinlichkeit, daß alle beiden gewählten Antigene zusammen an den Nicht-Zielζeilen vorhanden sind, sehr gering sein, und man sieht daher den Einsatz eines extrem starken Mittels vor, um den spezifischen cytotoxischen Charakter der Immunotoxine noch zu erhöhen.

£k 8 8 5 2 O -H- 8.8.1983

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Ausführungsbeispiel

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung ohne deren Bereich einzuschränken*

Beispiel 1

Immunoenzymatisches Konjugat, erhalten durch Reaktion zwischen einem Anti-Dinitrophenyl-Antikörper, substituiert durch eine aktivierte Disulfid-Gruppe und einer Urease pflanzlichen Ursprungs.

a) Anti-Dinitrophenyl-Antikörper (anti-DNP)

Dieser Antikörper ist ein monoklonaler Antikörper, der ausgehend von Ascites-Flüssigkeit von Mäusen des Stammes Balb/C, bei denen das Hybridom F« transplantiert wurde, nach konventionellen Techniken gereinigt wurde.

Dieses Hybridom selbst wurde durch Fusion zwischen Milzzellen der Maus vom Stamm Balb/C, die mittels Rinder-^-Globulin, auf dem zuvor 20 Radikale DHP pro Mol fixiert wurden, immunisiert waren, und Zellen vom Stamm Myelom Murin NS 1 erhalten und nach klssischen Techniken durch Klonierung isoliert. Der erhaltene Antikörper ist ein Immunoglobulin der Klasse G und

Q Λ

des Isotyps 2b, dessen Affinitätskonstante 1,8 . 10 M beträgt (gemessen für den Liganden £ -DNP-Lysin)»

b) aktivierter anti-DNP-Antikörper

Dieses Produkt wurde ausgehend von dem oben genannten Antikörper nach einer analogen Technik erhalten, wie sie in den früheren Anmeldtuigen Nr, 78 27 838 und Zusatz 79 24 655, Ir. 81 07 596 und Nr. 81 21 836 beschrieben wurde. Man hat in diesem Fall 20 mg anti-DNP-Antikörper mit 1,2-Aktivatorgruppen pro Mol erhalten«

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c) Urease ;

Das verwendete Enzym ist eine Urease der Herkunft SIGMA (Typ[VII, Referenz U 0376), die 170 Einheiten pro Milligramm titriert.j Eine Einheit ist die Enzym-Menge, die die Freisetzung von 1 Mikromol KH/** pro Minute bei 20 ⁰C und pH 7,0 gewährleistet, ausgehend von Harnstoff. "" \

Dieses Enzym besitzt natür-1icherweise 27 Thiolgruppen pro Molekül bei einem Molekulargewicht von 480.000. Diese Thiolgruppen, titrierbar nach der Methode von ELJMAlW, sind nicht alle für J die enzymatische Aktivität erforderlich. Daher können einige von ihnen dazu dienen, die Kupplung mit dem aktivierten Antikörper zu vollziehen. ;

d) Kupplung des Antikörpers mit dem Enzym

5 mg Urease werden in 0,625 ml einer Lösung des aktivierten Antikörpers (Gehalt 7,2 mg/ml) in 0,125 M Phosphatρuffer, pH 7,0 gelöst, was 4,5 mg aktiviertem Antikörper entspricht, wonach die Inkubation bei 25 ⁰G innerhalb von 14 Stunden durchgeführt .wird.

Man chromatographyert die Reaktionsmischung über eine Gel-Kolonne Sepharose GB (Pharmacia), eingestellt in PBS-Puffer (Phosphat 10 raM, Natriumchlorid 140 mM, pH 7,4). Die Elution wird vorgenommen durch Messung der optischen Dichte bei 280rm und durch Messung der Urease-Aktivität gemäß der Technik von SUMMER (Methods in Enzymology vol. II, S. 378, S.B. Colowick und IT. 0. Kaplan Ed., Academic Press., 1955).

Man vereinigt die Fraktionen, die die stärksten Urease-Aktivitäten aufweisen und erhält auf diese V/eise 8 ml Konjugat-Lösung zu 6,5 Einheiten pro ml. Wenn eine aliquote Fraktion dieser Lösung über eine Kolonne mit Rinder-Serum-Albumin absorbiert wird, das durch sechs DHP-Radikale pro Mol substituiert und über eine zuvor durch Cyanogenbromid aktivierte

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Sepharose 4 B-Kolonne unlöslich gemacht wurde, stellt man fest, daß die Urease~Aktivitat vollständig in der Kolonne absorbiert bleibt. Dies zeigt gleichseitig, daß der in dem Konjugat vorhandene Antikörper seine Fähigkeit zur tViedererkennung des Haptens DUP behalten hat und daß die Urease ganz an diesen Antikörper gekuppelt wird.

Beispiel 2

Wirkungssteigerun^ des. Iinmunotoxins anti T65

Das wie vorstehend beschrieben erhaltene Konjugat wurde auf seine biologischen Eigenschaften hin und genauer, auf seine Fähigkeit zur V/irkungssteigerung des Immunotoxins anti T 65 hin, in einem angepaßten zellularen Modell untersucht.

Dieses Modell wird durch Zellen des lymphoblastoiden Human-Stammes GEM gebildet, der natürlicherweise das Antigen T 65 trägt. Dieses Antigen, gegen das das verwendete Immunotoxin gerichtet ist, bildet das erste Ziel~Antigen des Modells. Man kann außerdem die Zellen mit Hilfe des Haptens Trinitrophenyl :(THP) nach der in der früheren Anmeldung Kr. 78 27 838 be-, achriebenen Technik markieren. Dieses Hapten wird sehr gut durch den Antikörper anti-DlIP erkannt, der in dem untersuchten immunoenzymatischen Konjugat enthalten ist und es bildet demnach das zweite Ziel-Antigen des Modells· IDs wurde gezeigt, daß die Markierung der Zellen durch das Hapten TlIP die Lebensfähigkeit der Zellen nicht verändert und die Fixierung des Immunotoxins anti T 65 an diesen Zellen nicht stört·

Die grundlegende Eigenschaft der Immunotoxine ist die ' ; ; Inhibierung dor Proteinsynthese der Ziolzellen, Der augewandte Test besteht in der Messung &^Θ:Γ V/irkung der untersuch ten Substanzen über die Inko cancerösen Zellen in Kultur»

ten Substanzen über die Inkorporation von G-Lencin in die

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wie sie in Journal of Biological Chemistry, 1974, 249,, (11), 3557-3562 unter Verwendung des Tracers C-Lencin für die Bestimmung des Prozentsatzes der Protein-Synthese beschrieben wurde. Die Bestimmung der inkorporierten Radioaktivität wird hier an ganzen, durch Filtration isolierten Zellen durchgeführt.

Ausgehend von diesen Bestimmungen kann man die Kurven Wirkung/ Dosis darstellen, auf der Abszisse werden die molare Konzentration an Α-Kette der untersuchten Substanzen und auf der Ordinate die Inkorporation von ^C-Lencin ausgedrückt im Prozentsatz der Inkorporation von Vergleichsζeilen, in Abwesenheit aller Substanzen, die die Protein-Synthese beeinflussen, aufgetragen.

Man kann daher für jede untersuchte Substanz die Konzentration bestimmen, die 50 % der Inkorporation von ⁴C-Lencin inhibiert, die "concentration inhibitrice 50" (GI 50).

Die verschiedenen Versuche dieses Experiments wurden wie folgt durchgeführt. Die entsprechenden experimentellen Resultate sind in Figur 1 dargestellt.

a) CEM-Zellen werden 18 Stunden lang bei 37 ⁰G in Anwesenheit von bekannten Konzentrationen an Ricin oder der isolierten Α-Kette inkubiert (3ie dienen als Vergleichssubstanz), und anschließend werden diese Zellen der Stufe der Inkorporation des radioaktiven Tracers unterworfen. Die erhaltene CI 50 beträgt entsprechend 4 . 10"¹²H und 4,5 . 1O~⁸ Mol für Ricin und die Kette A. Es wurde außerdem gezeigt, daß diese Werte nicht zu unterscheiden sind von den Zellen, die man aus durch das Hapten TiIP markierte CEM-Zellen erhält (Kurve 1, Ricin an CEM und Kurve 2 Ricin-A-Kette an CEM).

b) Durch TIiP markierte CGM-Zellen werden 18 Stunden lang bei

37 ⁰C in Anwesenheit eines Immunotoxins mit anti-DNP-Spezifität inkubiert, das wie in der qben genannten Anmeldung Kr. 78 27 838 und dem Zusatz 79 24 655 beschrieben, erhalten

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und anschließend der Inkorporation des radioaktiven Tracers unterworfen wurde. Die Kurvenform der erhaltenen Cytotoxizität und der Wert der GI 50 (1,5 · 10"^ M) zeigen, daß die Zellen für die cytotoxische Wirkung des Immunotoxins anti-DNP normal sensibel sind, was folglich beweist, daß die Markierung dieser Zellen durch THP korrekt durchgeführt wurde (Kurve 3)·

c) Durch TNP markierte CEM-Zellen werden zuerst 1 Stunde lang bei 4 C in Anwesenheit nichtkonjugierter Urease in einem Verhältnis von 4 U/ml inkubiert, anschließend gewaschen, dann 18 Stunden lang bei 37 ⁰G in Anwesenheit des Immunotoxins anti T 65 und 5 inM Harnstoff inkubiert und schließlich der Inkorporation des radioaktiven Tracers unterwarfen. Die erhaltene GI 50 beträgt 5 · 10"⁹ M. Dieser Wert ist mit demjenigen identisch, den man unter Anwendung der gleichen Bedingungen von nicht mit TUP markierten Zellen, in Abwesenheit der Urease-Behandlung und in Abwesenheit von Harnstoff im Inkubationsmedium nach Waschen der Urease, erhält.

Dieser Versuch zeigt, daß die Inkubation in Anwesenheit von nicht-konjugierter Urease keine Bindung der Urease an die Zellen nach sich zieht und somit auch keine Wirkungssteigerung bei dem Immunotixin anti T 65 (Kurve 4)*

d) Durch TIiP markierte CEM-Zellen werden zuerst 1 Stunde lang bei 4 ⁰C in Anwesenheit des wie vorstehend beschriebenen irnmunoenzymatischen Konjugats, in einer Konzentration von 6,5 U/ml angewendet, inkubiert. Es wurde außerdem bestätigt, daß dieses Konjugat, unter diesen Bedingungen angewendet, keine eigene Cytotoxizität für die verwendeten Zellen besitzt. Diese Zellen werden anschließend gewaschen, um alles Konjugat zu entfernen, das nicht fixiert wurde, dann werden sie 18 Stunden lang bei 37 ⁰G in Anwesenheit von Immunotoxin anti T und 5 ml Harnstoff inkubiert. Schließlich werden sie der Inkorporation des radioaktiven Tracers unterworfen. Die er-

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24 88 5 2 O --ig.

halteine CI 50 beträgt 3,5 . 1(T¹³ M (Kurve 5)..

Dieses Ergebnis zeigt, daß die Wirkungssteigerung des immünoenzyraatischen Konjugats ungefähr 14 000~fach die cytotoxische Aktivität des Immunotoxins auf die Zielzellen erhöht. Dieser Versuch demonstriert, daß der Effekt der Wirkungssteigerung die Fixierung des immunoenzymatischen Konjugats an das Antigen, entsprechend seiner immunologischen Spezifität, mit einbezieht. Diese Fixierung widersteht dem Waschen der Zellen und beläßt an deren Oberfläche die aktive enzymatische Urease, die ausgehend von dem in dem Medium der Inkubation mit dem Immuno-

toxin enthaltenen Harnstoff HH.⁺~Ionen produziert, was wiederum

den bekannten Effekt der Wirkungssteigerung der M, -Ionen nach sich zieht. Dieser erhaltene Effekt der Wirkungssteigerung ist völlig analog mit demjenigen, der wie vorstehend gezeigt, durch Zusatz von 10 mM Ammoniumchlorid zum Inkubations-Medium erreicht wurde.

Wie im Fall einer künstlichen Zugabe von Ammoniumchlorid wird dieser 3teigerungseffekt weder mit Ricin, noch mit der Ricin-A-Kette, noch mit einem nicht-spezifischen Iramunotoxin der untersuchten Zellen erhalten.

Unter den Bedingungen dieses Beispiels beträgt die cytotoxische Aktivität des Immunotoxins anti T 65 in Anwesenheit des verwendeten immunoenzymatischen Konjugats ungefähr 130 000 mal, derjenigen der Ricin-A-Kette und sie übersteigt sogar in ihrer Wirksamkeit diejenige des Ricins um einen Faktor von ungefähr 11 mal.

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Beispiel 3

ι ..

Immunoenzymatisches Kon.iugat, erhalten durch Reaktion zwischen einem anti-Dinitrophenyl-Antikörper, der durch eine Maleimid-Gruppe substituiert ist, und einer Urease pflanzlichen Ursprungs

a) anti-Dinitrophenyl-Antikörper (anti DIJP)

Dieser Antikörper ist ein raonoklonaler Antikörper, der ausgehend von Ascites-Flüssigkeit von Musen des Stammes BaIb/C, beijdenen das Hybridom Pq transplantiert wurde, nach konven^ tioneilen Techniken gereinigt wurde·

Dieses Hybridom selbst wurde durch I'usion zwischen Milzzellen der Maus vom Stamm Balb/C, die mittels Rinder-^f-Globulin, auf dem zuvor 20 Radikale DHP pro Mol fixiert wurden, immunisiert waren, und Zellen vom Stamm Myelom Murin US1 erhalten und nach klassischen Techniken durch Klonierung isoliert· Der erhaltene Antikörper ist ein Immunoglobulin der Klasse G und des Isotyps 2 b, dessen Affinitätskonstante 1,8 . 10M~' beträgt (gemessen für den Liganden £-DIiP-Lysin).

b) aktivierter anti-DMP-Antikörper

Zu 2,5 ml Lösung des anti-DEP-Antikörpers (Gehalt 9,7 mg/ml) in Phosphatpuffer 125 mM, pH 7 werden 10 aiI Dimethylformamid gegeben, die 0,4 mg m-IIaleimido-benzoesäure-N-hydroxysuccinimid-Ester enthalten. Die Mischung wird 1/2 Stunde lang bei 25 ⁰C inkubiert. Die Lösung wird dann über eine Kolonne Sephadex G 25 von 10 ml gegeben, die mit Phosphatpuffer 125 mM auf pH eingestellt wurde. Die Blution wird vorgenommen durch Messung der optischen Dichte bei 280nm· Man sammelt 2,5 ml vom Ausflußvolumen der Kolonne. Die Messung des Substitutionsgrades wird an einem Aliquot durch Reaktion mit einem Überschuß von I4c-Cystein durchgeführt.

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Han erhält auf diese Weise eine Lösung zu 8 mg Antikörper \ pro ml, mit einem Substitutionsgrad von 3,5 Maleimid-Gruppen pro Mol Antikörper.

c) Urease ;

Das verwendete Enzym ist eine Urease der Herkunft SIGMA (Typ VII, Referenz U 0376), die 170 Einheiten pro Milligramm titriert. Eine Einheit ist die Enzym-Menge, die die Preiset sung von 1 Mikroraol I¹E-I₄+ _pro Minute bei 20 ⁰C und pH 7,0 gewährleistet, ausgehend von Harnstoff.

Dieses Enzym besitzt natürlicherweise 27 Thiolgruppen pro Molekül bei einem Molekulargewicht von 480 000. Diese Thiolgruppen, titrierbar nach der Methode von ELLMANlI, sind nicht alle für die enzymatische Aktivität erforderlich. Daher können einige von ihnen dazu dienen, die Kupplung mit dem aktivierten Antikörper zu vollziehen.

d) Kupplung des Antikörpers mit dem Enzym

Unmittelbar nach der Entsalzung an G 25 werden 2,4 ml der Lösung des aktivierten Antikörpers zu 2,0 ml Harnstofflösung (Gehalt 24 mg/ml) in Phosphatpuffer 125 mM, pH 7,0 gemischt. Man inkubiert die Mischung 1 Stunde lang bei 25 ⁰G und gibt sie nach Zentrifugierung über eine Kolonne von 450 ml Sephadex-GeI G 200, eingestellt in PBS-Puffer. Die Elution wird vorgenommen durch Messung der optischen Dichte bei 280 nm und durch Messung der Urease-Aktivitat gemäß der Technik von SUMMER« Man vereinigt die li'raktionen, die die därksten Urease-Aktivitäfcen auf v/eisen und erhält auf diese Weise 14 ml Konjugat-Lösung zu 102 Einheiten pro ml. Wenn eine aliquote ]?raktion dieser Lösung über eine Kolonne mit Protein-A-Sepharose-Gel chromatographiert wird, stellt man fest, daß 30 % der Urease-Aktivitat nicht von der Kolonne zurückgehalten wurden·. Der Rest der Urease-Aktivität wird

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in der gleichen Zeit wie der Antikörper durch den Puffer mit pH 3,5 eluiert. Ein Kontrollversuch zeigt, daß die nicht mit dem Antikörper gekuppelte Urease durch die Kolonne nicht vollständig fixiert wird. Dies demonstriert, daß 70 % der Urease-Aktivität der vereinigten Fraktionen wirklich zu dem Antikörper-Urease-Konjugat gehören. Bei den nachfolgend beschriebenen Versuchen wurde die Lös undicht von der freien, verunreinigenden Urease befreit, die ohne Einfluß auf die verwendeten Bedingungen ist, wie das nachfolgend beschrieben wird. : :

Beispiel 4

Steigerung der Wirkung von Iinmunotoxin anti T 65 durch das immunoenzymatisehe Korg ugat von Beispiel 3

Das erfindungsgemäße Konjugat, erhalten wie vorstehend angegeben (Beispiel 3) wurde hinsichtlich seiner biologischen Eigenschaften, und genauer, seiner Fähigkeit zur Wirkungssteigerung des Immunotoxins anti T 65 in einem angepaßten zellularen Modell untersucht.

Dieses Modell wird durch Zellen des lymphoblastoiden Human-Stammes GEM gebildet, der natürlicherweise das Antigen T 65 trägt. Dieses Antigen, gegen das das verwendete Imraunotoxin gerichtet ist, bildet das erste Ziel-Antigen des Modells. Man kann außerdem die Zellen mit Hilfe des Haptens Trinitrophenyl (THP)nach der in der früheren Anmeldung Nr. 78 27 838 beschriebenen Technik markieren. Dieses Hapten wird 3ehr gut durch den Antikörper anti-DHP erkannt, der in dem untersuchten immunoenzymatischen Konjugat enthalten ist und es bildet demnach das zweite Ziel-Antigen des Modells. Es wurde gezeigt, daß die Markierung der Zellen durch das Hapten TKP die Lebensfähigkeit der Zellen nicht verändert und die Fixierung des Immunotoxins anti T 65 an diesen Zellen nicht stört.

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Die grundlegende Eigenschaft der Immunotoxine ist die Inhi*- , bierung der Pro t einsynt lies e der Zielzellen. Der angewandte Test besteht in der Messung der Wirkung der untersuchten Substanzen über die Inkorporation von C-Lencin in die caneerösen Zellen in Kultur

Diase Messung wird nach einer angepaßten Technik durchgeführt, wie sie in Journal of Biological Chemistry, 1974, 249 (11),

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3557-62 unter Verwendung des Tracers C-Lencin für die Bestimmung des Prozentsatzes der Protein-Synthese beschrieben v/urde. Die Bestimmung der inkorporierten Radioaktivität wird hier an ganzen, durch Filtration isolierten Zellen durchgeführt.

Ausgehend von diesen Bestimmungen kann man die Kurven Wirkung/Dosis darstellen, auf der Abszisse werden die molare Konzentration an Α-Kette der untersuchten Substanzen und auf der Ordinate die Inkorporation von ^C-Lencin, ausgedrückt im Prozentsatz der Inkorporation von Vergleichszellen, in Abwesenheit aller Substanzen, die die Protein-Synthese beeinflussen, aufgetragen.

Man kann daher für jede untersuchte Substanz die Konzentration bestimmen, die 50 % der Inkorporation von ^C-Lencin inhibiert, die "concentration inhibitrice 50" (CI 50).

Die verschiedenen Versuche dieses Experiments wurden wie folgt durchgeführt. Die entsprechenden experimentellen Resultate sind in Figur 2 dargestellt.

a) Die zu Beispiel 2a) durchgeführten Vergleichsversuche wurden nicht wiederholt, wie sie auch für das vorliegende Beispiel als gültig betrachtet werden können.

b) Durch Tl]P markierte CBM-Zeil en wurden 18 Stunden lang bei 37 °C in Anwesenheit eines Immunotoxins mit anti-65-£ tat inkubiert, das wie in unserer vorstehenden Anmeldung

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!ir· 81 21 836 beschrieben, erhalten und anschließend der Inkorporation des radioaktiven Tracers unterworfen wurde· Die Kurvenfonn der Cyctotoxizität ist mit derjenigen identisch, die man mit jäen gleichen, nicht mit TlP markierten Zellen unter den gleichen Inkubationsbedingungen erhält, was folglich beweist, daß die Markierung dieser Zellen durch THP korrekt durchgeführt wurde (Kurve 6),

c) Durch TlP markierte CEM-Zellen werden zuerst 1 Stunde lang bei 4 ⁰G in Anwesenheit nicht-konjugierter Urease in einem Verhältnis von 1 U/ml inkubiert, anschließend gewaschen und 18 Stunden lang bei 37 ⁰G in Anwesenheit des Immunotoxins anti T 65 in einer Konzentration von nur 10 -⁷LJ und 5 mM Harnstoff inkubiert und schließlich der Inkorporation des radioaktiven Tracers unterworfen·

Der in diesem Versuch erhaltene Wert der Inkorporation von C-Lencin (65 %) ist nicht von demjenigen zu unterscheiden, der durch die gleiche Konzentration an Immunotoxin anti T 65 in Versuch b) erhalten wurde· Dieses Resultat zeigt, daß die Inkubation in Anwesenheit nicht-konjugierter Urease keine Bindung der Urease an die Zellen nach 3ich zieht und angesichts dieser Tatsache auch keinen Effekt der Wirkungssteigerung bei dem Imraunotoxin anti T 65·

d) Durch THP markierte CEM-Zellen werden zuerst 1 Stunde lang bei 4 ⁰C in Anwesenheit des wie vorstehend beschriebenen immunoenzymatischen Konjugats, in einer Konzentration von 1,02 U/ml angewendet, inkubiert. Es wurde außerdem bestätigt, daß dieses Konjugat, unter diesen Bedingungen angewendet, keine eigene Cyctotoxizität für die verwendeten Zellen besitzt. Diese Zellen werden anschließend gewaschen, um alles Konjugat zu entfernen, das nicht fixiert wurde, dann werden sie 18 Stunden lang bei 37 ⁰C in Anwesenheit von Immunotoxin anti T 65 und 5 mM Harnstoff inkubiert.

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Schließlich v/erden sie der Inkorporation des radioaktiven

— 1 Tracers unterworfen. Die erhaltene GI 50 beträgt 2,4 · 10; M (Kurve 7)· Dieser Wert ist völlig mit demjenigen vergleichbar, der unter Verwendung des Konjugats von Beispiel 1 erhalten wurde und stellt einen bemerkenswerten Effekt der Wirkungssteigerung dar, der im Hinblick auf das Immunotoxin durch das iminunoenzymatische Konjugat hervorgerufen wurde·

Dieser Versuch demonstriert, daß der Effekt der Wirkungssteigerung die Fixierung des ämmunoenzymatisehen Konjugats an das Antigen, entsprechend seiner immunologischen Spezifität, mit einbezieht· Diese Fixierung widersteht dam Waschen der Zellen und beläßt an deren Oberfläche die aktive enzymatische Urease, die ausgehend von dem in dem Medium der Inkubation mit dem Immunotoxin enthaltenen Harnstoff ΗΗ_Δ ⁺-Ιοηβη produziert, was wiederum den bekannten Effekt der Wirkungssteigerung der Mi. -Ionen nach sich zieht.

Dieser erhaltene Effekt der Wirkungssteigerung ist völlig analog mit demjenigen, der demonstriert wird, wenn die Inkubation in Anwesenheit von 10 mM Ammoniumchlorid, dem Inkubationsmedium hinzugefügt, anstelle des Systems immunoenzymatisch.es Konjugat/Substrat, stattfindet.

Im Falle der Zugabe von Ammoniumchlorid ist die erhaltene GI 50 effektiv 3,8 · 10""¹^ M, wie das die entsprechende Kurve der Figur 2 zeigt (Kurve 8).

Die obigen Beispiele zeigen, daß die erfindungsgemäßen Produkte in der Human-Therapeutik verwendet werden können·

Die erfindungsgemäßen neuen Medikamente werden in der Weise hergestellt, daß sie auf dem Y/ege der Injektion, vorzugsweise auf intravenösem Weg angewendet werden können· Sie können zur Behandlung von cancerösen oder nicht-cancerösen Erkrankungen verwendet werden, die die Antikörper sensibel

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sind, die zur Herstellung der Iminunotoxine eingesetzt v/erden. Sie werden in Dosierungen und unter Bedingungen angewendet, die in jedem Pail unter Berücksichtigung von Ursache und Natur der zu behandelnden Erkrankung festzulegen sind·

Claims

88 5 2 O ^Ji 8.8.1983

AP A 61 K/248 852/0 62 186/11

Erfindungsanspruch

1. Verfahren zur Herateilung von immunoenzymatischen Konju-r gaten, gekennzeichnet dadurch» daß man eine chemische Kupplung durch kovalente Bindung zwischen einem Antikörper oder dem Fragment eines Antikörpers, die ihre Fähigkeit zur Wiedererkennung des gewählten Antigens behalten haben, und einem Enzym, das befähigt ist, Ammonium-Ionen ausgehend von im Organismus höherer Tiere tolerierten natürlichen Substraten freizusetzen, durchfuhrt*
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die genannte kovalente Bindung eine Disulfid-Bindung ist*

3· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die genannte kovalente Bindung eine Thioether-Bindung ist«

4· Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß man die Reaktion eines Proteins, das eine Thiol-Funktion, nämlich P«SH, enthält, mit einem anderen Protein P₂ durchführt, in das mindestens eine Funktion eingeführt wird, die eine Disulfidbrücke und ein mit dem Thiol reagierendes Radikal, nämlich P₂-S-S-X, aufweist, wobei die Reaktion im wäßrigen Medium bei einem pH-Wert zwischen 5 und 9 und einer Temperatur unterhalb von ungefähr 30 ⁰C stattfindet.
5. Verfahren zur Herstellung von Konjugaten nach Punkt 3» gekennzeichnet dadurch, daß man ein Protein mit einer Thiolgruppe, nämlich P-jSH, mit einem anderen Protein P₂ umsetzt, in das eine Maleimid-Funktion, nämlich

P₂ - MH - CO - Z -

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eingeführt wird, in der Z eine Zwischenstruktur darstellt, wobei die Reaktion im wäßrigen Medium und bei einer Temperatur unterhalb von ungefähr 30 ⁰G durchgeführt wird.

Hierzu 2 „Seifen Zeichnungen