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Die Erfindung betrifft ein Konjugat, das einen
monoklonalen Antikörper und eine Markierung enthält, ein
Verfahren zur Herstellung des Konjugats und die Verwendung
des Konjugats in einem Verfahren zur Zerstörung
unerwünschter Zellen in einer Zellpopulation.
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Die zielgerichtete und selektive Eliminierung
bestimmter Zelltypen aus gemischen Zellpopulationen verursacht
sowohl in der experimentellen Forschung als auch in der
klinischen Praxis Probleme. Zu diesem Zweck wurde die
Anwendung von an Trägerstoffe gebundenen, d.h. an
Immunoglobuline gebundenen zytotoxischen Substanzen
versucht, siehe z.B. Keith, A. et al. Cancer Imm.
Immunother. (1981) 12, 39 - 41. Dies bildet den
theoretischen Hintergrund der sogenannten "Targeting"
Therapie, in deren Verlauf monoklonale Antikörper mit
stark zytotoxischen Substanzen wie der Alphakette von
Ricin konjugiert werden. Die Selektivität der Methode
hängt ausschließlich von der Spezifität des
Trägermoleküls ab. Seit dies für immer mehr Antikörper
nachgewiesen wurde, die früher als spezifisch für einen
einzigen Zelltyp galten, und seit man feststellte, daß die
durch die Antikörper gebundene Determinante auch auf
anderen Strukturen vorhanden sein kann, wird die
Spezifität eher quantitativ als qualitativ angesehen. Um die
Wirkung unerwunschter Bindungen zu beseitigen, kann die
Kombination lokal wirksamer physikalischer Wirkungen
eine Lösung bieten. Dies unterstreicht die Bedeutung
normalerweise harmloser Moleküle, die erst durch
physikalischen Einfluß, z.B. durch Bestrahlung mit
Licht, toxisch werden.
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Die Fototheraphie ist ein Gebiet mit zunehmender
Bedeutung
in der Medizin. Unter den Anwendungen, wo
Lichtquellen auf spezifische Ziele gerichtet werden, gilt
den Verfahren mit Einsatz von Laserstrahlen besondere
Aufmerksamkeit. Neben der größeren Energiedichte tragen
die einzigartigen physikalischen Eigenschaften
(Kohärenz, Polarisation) des Laserstrahls erheblich zur
angestrebten biologischen Wirkung bei.
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Im Verlauf der Untersuchung der biologischen Wirkungen
eines Niedrigenergie-He-Ne-Lasers auf in vitro
Zellkulturen konnten wir eine eindeutige energieabhängige
Reaktion nachweisen. Bei einem bestimmten Niveau der
Strahlungsenergie kommt es zur biologische Aktivierung,
während bei einem höheren Schwellenwert eine
Zellspaltung beobachtet werden kann. Dieses Phänomen wird in
Kisérketes Orvostudom ny (1984) 36, 96 und Studia
Biophys. (1985) 105, 144 beschrieben. Diese Methode
wird als "Immunotargeting" bezeichnet.
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Durch Einsatz verschiedener fotosensibilisierender
Moleküle können die Energieschwellenwerte von
biologischer Aktivierung und Zellspaltung beeinflußt werden.
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Aus dem Stand der Technik ist bekannt, daß
Porphyrinderivate im Wellenlängenbereich des sichtbaren Lichts
gut aktiviert werden können; deshalb werden sie weit
verbreitet als Fotosensibilisatoren eingesetzt (siehe
z.B. Br. J. Cancer (1979) 39, 398; Photochem.
Photobiophys. (1988) 10, 53 - 59 und Cancer Res. (1981) 41,
401).
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GB-A-2,063,469 offenbart ein Konjugat zur Verwendung in
der Aufspürung und Quantifizierung von Antikörpern und
Antigenen in Körperflüssigkeiten, das eine
immunologisch aktive Verbindung umfaßt, an der eine Markierung
in Form eines Metallporphyrins hängt, das eine
Chemilumineszenz-Reaktion katalysieren kann. Offenbar
enthalten
die als Markierung verwendeten Verbindungen
koordinierte Metallatome.
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Die Erfindung gründet sich auf die Beobachtung, daß der
Zellzerfall bereits bei einem Energieniveau einsetzt,
wo nicht sensibilisierte Zellen nicht zerstört würden,
wenn man die Oberfläche verschiedener Zellen mit
fotosensibilisierenden Substanzen in Kontakt bringt,
darunter die an sich nicht toxischen und durch unseren He-
Ne-Laser direkt nicht aktivierbaren
Hematoporphyrinderivate (HPD-Moleküle), und dann mit Laser bestrahlt.
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Um dieses Ziel zu erreichen, werden Porphyrinderivate,
vorzugsweise Hematoporphyrinhydrochlorid kovalent mit
monoklonalen Antikörpern gepaart, die sich selektiv an
Strukturen der Zelloberfläche binden können.
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Die Konjugation erfolgt durch Bebrüten des monoklonalen
Antikörperproteins mit dem Porphyrinderivat,
vorzugsweise mit Hematoporphyrinhydrochlorid in wäßriger
Lösung.
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Die Bestrahlung dieser Hematoporphyrinderivate mit
sichtbarem Licht führt zu einem wellenlängenabhängigen
Induktionsprozeß freier Radikale, wodurch die
biologischen Strukturen geschädigt werden. Da das
Absorptionsmaximum von Hematoporphyrin etwa 405 nm beträgt, wird
eine große Menge freier Radikale erzeugt, und ihre
schädigende Wirkung auf lebende Zellen kann nach der
Bestrahlung bei dieser Wellenlänge nicht kontrolliert
werden. Im Gegensatz dazu ist die Wirkung im
Wellenlängenbereich um 630 nm erheblich verringert, da die
Lichtenergie anstatt durch das Hematoporphyrinmolekül
durch die biologische Struktur selbst absorbiert wird
und durch Elektronentransferprozesse eine sehr viel
begrenztere Wirkung ausgelöst wird, die sich besser
regulieren laßt. Die Rolle der fotosensibilisierenden
Moleküle in diesem Prozeß ist es, den
Elektronentransfer auszulösen.
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Der Einsatz von He-Ne-Laser mit ausgestrahltem Licht
von 632,8 nm gestattet für relativ kurze Zeit einen
Fluß an konzentrierter Fotoenergie, der ausreicht,
regulierte Elektronentransferprozesse auszulösen,
jedoch nicht direkt zur Bildung freier Radikale führt.
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In einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren für
die Herstellung von fotosensibilisierenden Konjugaten
zur Verfügung gestellt, bei dem man beispielsweise
Anti-PNAr-I, Anti-PNAr-II, Anti-PNAr-III, Anti-WGA,
Anti-T3, Anti-AFP, Anti-HCG und Anti-H Antikörper in
einem wäßrigen Medium mit bestimmten Porphyrinderivaten
bebrütet.
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Die vorstehend aufgeführten zielspezifischen
monoklonalen Antikörper haben folgende Eigenschaften:
Anti-PNAr-I
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Ein monoklonaler Antikörper (IgG1), der mit dem
Erdnußagglutininantigen (peanut agglutinin antigen =
PNA) bindenden Rezeptor reagiert, welcher durch
Lectinaffinitätschromatographie aus den Epithelzellen
der Magenschleimhaut isoliert wird. Er reagiert sowohl
mit dem Golgi-Apparat der Zellen in der normalen
Magenschleimhaut als auch mit der Oberfläche und
zytoplasmischen Strukturen von Magenkrebszellen.
Letztere binden den monoklonalen Antikörper auf
spezifische Weise auch in ihren Metastasen.
Anti-PNAr-II
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Ein monoklonaler Antikörper (IgG1) gegen den PNA
bindenden Rezeptor, der durch
Lectinaffinitätschromatographie
aus der Körpermembran von Milchfett isoliert
wird. Dieser Antikörper reagiert mit der Lamina basalis
des Drüsenausführungsganges aus der normalen Brust
sowie mit der Oberfläche und zytoplasmischen Strukturen
von Brustkrebszellen sowohl im primären Tumor als auch
in Metastasen.
Anti-PNAr-III
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Ein monoklonaler Antikörper (IgG) gegen den
PNA-Rezeptor, der durch Lectinaffinitätschromatographie aus dem
Schleim einer Eierstockzyste isoliert wurde. Der
Antikörper reagiert gut mit verschiedenen Typen von
Eierstockkrebs sowohl im Primärtumor als auch in
Metastasen.
Anti-WGA
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Ein monoklonaler Antikörper, der mit
Weizenkeimagglutininantigen (wheat germ agglutinin antigen = WGA)
reagiert. Nach der Inkubation mit WGA können Zellen,
die auf ihrer Oberfläche WGA-bindende Rezeptoren
aufweisen, dadurch sensibilisiert werden.
Anti-T3
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Antikörper, die mit T-Lymphzyten reagieren. Sie können
bei Knochenmarktransplantationen zur Entfernung von T-
Zellen verwendet werden.
Anti-H-Antigen
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Ein monoklonaler Antikörper, der mit dem
Oberflächenantigen des das Y-Chromosom tragenden Bullenspermas für
künstliche Insemination reagiert.
Anti-AFP
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Ein monoklonaler Antikörper, der mit Alphafoetoprotein
erzeugenden Tumoren reagiert.
Anti-hCG
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Ein monoklonaler Antikörper, der mit menschliches
Choriogonadotropin erzeugenden Tumoren reagiert.
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Fig. 1 der Zeichnungen zeigt das Testergebnis mit einem
erfindungsgemäß erhaltenen Konjugat.
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Fig. 2 zeigt die Ergebnisse von Beispiel 1, das mit
Anti-OVA- und Anti-WGA-Zellen durchgeführt wurde.
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Fig. 1 zeigt die Testergebnisse mit einem Konjugat, das
durch das obenstehend beschriebene Verfahren
hergestellt wurde. Der Anti-PNAr-I monoklonale Antikörper,
der gegen den das Erdnußagglutinin-Antigen bindenden
Rezeptor, der auf der Oberfläche normaler Zellen der
Magenschleimhaut sowie auf den neoplastisch
transformierten Formen vorhanden war, eingesetzt wurde, wurde
mit Hematoporphyrin konjugiert und anschließend
gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete monoklonale
Antikörperhematoporphyrin-Konjugat kann für unbestimmte
Zeit gelagert werden, wenn man es trocknet. Das
Konjugat wird vor der Verwendung in sterilem destilliertem
Wasser aufgelöst; die spezifische Antikörperaktivität
und die Fotosensibilisatorbindung werden danach
ermittelt.
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Das so hergestellte Konjugat ist für die Zwecke des
"Fotoimmunotargeting" mit Laser geeignet.
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In einem in vitro Verfahren wird eine Zellmischung 1
bis 1,5 Stunden inkubiert, anschließend mit dem
Kulturmedium gewaschen und dann mit einem He-Ne-Laser bei 14
J/cm² Strahlungsenergie mit einer Wellenlänge
bestrahlt, die praktischerweise über 600 nm und
vorzugsweise bei 632 nm liegt.
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Auf der Grundlage unserer Experimente betrug die
optimale Konzentration des Konjugats 5 ug/ml
Hematoporphyrin.
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In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung daher die
Verwendung des Konjugats in einem Verfahren zur
Entfernung unerwünschter Zellpopulationen aus Zellmischungen
und -geweben zur Verfügung.
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Es kommt häufig vor, daß die Trennung bestimmter
Zellpopulationen (z.B. spezifische monoklonale Antikörper
erzeugende Hybridome) sich als sehr schwierig erweist;
außerdem ist selbst bei vollständiger Trennung der
Ertrag an reinen Zellen ziemlich niedrig.
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Erfindungsgemäß kann dieses Problem dadurch gelöst
werden, daß man die Mischung aus den erwünschten und
kontaminierenden Zellen mit dem Konjugat bestimmter
Porphyrinderivate, die mit dem kontaminierenden
zell(en)spezifischen monoklonalen Antikörper gepaart
wurden, in Kontakt bringt und die Mischung mit Laser
bestrahlt.
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Durch die Erfindung kann der Anteil der erwünschten
Zellen merklich gesteigert werden.
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Die durch die Erfindung zu Verfügung gestellten
Möglichkeiten können vorzugsweise für die Herstellung
monoklonaler Antikörper genutzt werden, die spezifisch
für Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht sind. In
diesen Fällen wird das Antigen zur Immunisierung
üblicherweise mit einigen Proteinen mit hohem
Molekulargewicht wie Thyreoglobulinen, Rinderserumalbumin,
"keyhole limpit"-Haemocyanin etc. gepaart. Nach der
Zellfusion entstehen deshalb mehrere Hybridome, die
einen Antikörper erzeugen, der mit der
Antigendeterminante des Trägerproteins reagiert. Die Eliminierung
solcher Antikörper verbessert die Chancen der Züchtung
und Isolierung von Klonen erheblich.
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Wie bereits erwähnt, ist das erfindungsgemäße Konjugat
nicht nur auf ein Verfahren zur Erzeugung von
Hybridomzellen anwendbar, sondern durch Auswahl geeigneter
monoklonaler Antikörper auch in einem Verfahren zur
Entfernung von T-Zellen bei
Knochenmarkstransplantationen sowie einem Verfahren zur Verrringerung der Y-
Chromosomenkonzentration in Bullensperma, das für die
künstliche Insemination verwendet wird, geeignet.
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Erfindungsgemäß wird das Konjugat in einem
"Immunotargeting"-Verfahren verwendet, bei dem lebendes
Gewebe, das einen unerwünschten Zelltyp bzw. unerwünschte
Zelltypen enthält, mit dem Konjugat behandelt wird, das
monoklonale, mit Porphyrinderivaten konjugierte
Derivate enthält, und anschließend mit Laserstrahlen einer
Wellenlänge bestrahlt, die über der liegt, die das
Porphyrinderivat aktiviert. Vorzugsweise wird ein He-
Ne-Laserstrahl mit einer Wellenlänge von mehr als 600
nm, vorzugsweise 630 nm verwendet.
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Bei diesem Verfahren ist die selektive Zerstörung
verschiedener Zellen, ohne daß ihre Umgebung
beeinträchtigt wird, von größter Wichtigkeit. Diese Hypothese
wird durch folgende durch Experimente gewonnene
Erkenntnisse gestützt.
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Menschliche Magenkrebszellen und Mäusehybridomzellen
wurden durch subkutane Injektion dorsal in nackte Mäuse
(haarlose Mäuse ohne Thymusdrüse) verpflanzt. Sobald
die Tumorgröße 0,5 cm erreicht hatte, wurde das
Konjugat, das 5 - 10 mg/kg Körpergewicht Hematoporphyrin
entsprach, verabreicht. Als Konjugate verwendete man
Anti-PNAr-I monoklonales Antikörperkonjugat für die
Mäuse, die menschliche Tumorzellen trugen, und WGA-
Hematoporphyrinkomplex für die Mäuse, denen Anti-WGA-
Hybridome eingepflanzt worden waren. Nach 24 Stunden
wurden die Tumoren, die auf dem Rücken der Mäuse
wuchsen, mit einer Energie von 14 J/cm² durch die Haut
bestrahlt.
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Bei beiden Modellen beeinflußte Hematoporphyrin allein
das Tumorwachstum nicht. Auch die Laserbestrahlung
allein veränderte die Tumorproliferation nicht. Doch
bei der Anwendung beider Stimulantien wurde der Tumor
innerhalb eines Tages zerstört. Nach der Behandlung
verschwand der Tumor vollständig und ließ nur Kallus
zurück. Der Prozeß wurde auch durch eine histologische
Nachuntersuchung überwacht.
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Die Ergebnisse weisen darauf hin, daß das Konjugat auch
in in vitro "Fototargeting"-Verfahren angewendet werden
kann. Seine Rolle erstreckt sich nicht nur auf die
menschliche Gesundheitspflege, sondern auch auf die
Veterinärmedizin, z.B. wenn man Tiere sterilisieren
will.
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Folgende Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
Beispiel 1
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Man stellt eine Mischung von Hybridom-Zellen her. 1 x
10 Anti-WGA-Zellen werden im Verhältnis 1 : 1 mit Anti-
OVA-Hybridomzellen vermischt. Ersterer Zellstamm, der
ein monoklonales Immungammaglobulin erzeugt, das
spezifisch
mit Weizenkeimagglutininlectin (WGA) reagiert,
wurde 1984 in unserem Labor erzeugt, während der zweite
1978 durch Bötcher et al. entwickelt wurde. Ein HP-
Anti-OVA-Konjugat, das 5 ug/ml HP entsprach, wurde dem
RPMI-1640 Medium zugesetzt und die Mischung eine Stunde
in einem CO&sub2;-Inkubator bebrütet. Dann wurden die Zellen
zentrifugiert und dreimal in konjugatfreiem RPMI-1640
Medium gewaschen. Die Zellmischung wurde mit einer
Energie von 14 J/cm² durch einen He-Ne Laser bestrahlt.
Durch ein früher von uns entwickeltes Verfahren, bei
dem die Menge des Kulturmediums auf den Durchmesser des
Laserstrahls verringert wird, konnte eine gleichmäßige
Bestrahlung erreicht werden. Vor und nach der
Bestrahlung wurde die Erzeugung spezifischer Antikörper durch
ELISA festgestellt; daraus konnte der Anteil der
Zellpopulation, die ein individuelles Immunoglobulin
erzeugt, ermittelt werden. Fig. 2 zeigt die Ergebnisse.
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Wie aus Fig. 2 ersichtlich ist, blieb die durch die
Anti-OVA-Zellen erzeugte Antikörpermenge nach wie vor
in der Zellmischung, obwohl ihre Zahl sehr gering war.
Die meßbare Antikörperproduktion, die erst nach einer
Woche nachweisbar war, entsprach 10 Duplikationen für
Hybridomzellen, was 10 - 100 überlebenden Zellen für
einen Zellzahl von 2 x 10&sup5; entspricht.
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Auf der Grundlage vorstehender Ergebnisse führt bereits
eine einzige Bestrahlung zu einem Wirksamkeitsgrad, der
wesentlich höher als bei bereits bekannten
Zelltrennungsverfahren wie dem Zellsortierer ist.
Beispiel 2
Herstellung des Konjugats
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20,0 mg Hematoporphyrindihydrochlorid wurden durch 0,8
ml N,N-dimethylformamid in 1,25 ml destilliertem Wasser
aufgelöst. Dieses wurde mit 20,0 mg in 0,6 ml Wasser
aufgelöstem
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDCL) vermischt. Nach 30 Minuten gab
man 15,0 mg in 5,0 ml destilliertem Wasser aufgelöstes
Antikörperprotein dazu und bebrütete die Mischung 5
Stunden bei Raumtemperatur, während der pH ständig
zwischen 6 und 7 gehalten wurde. Anschließend gab man 50
ul Monoethanolamin zu und ließ die Lösung über Nacht
bei Raumtemperatur stehen. Nach diesem Schritt wurde
die Lösung 4 Tage gegen 0,0001 M Phosphatpuffer, wobei
der Puffer dreimal täglich gewechselt wurde, und
schließlich über Nacht gegen PBS dialysiert. (Dabei
wurde der pH konstant auf 7,4 gehalten). Die dabei
entstandene Lösung wurde durch Sephadex(R) G 25
gefiltert. Nach der Ermittlung des Gesamtproteingehaltes
kann die Hematoporphyrinbindung fotometrisch bei 390 nm
Wellenlänge durch eine Eichkurve ermittelt werden. Die
Aktivität des spezifischen Antikörpers kann durch
Immunserologie (z.B. durch ELISA) ermittelt werden.