CZ116799A3 - Adjuvantní prostředek a vakcina - Google Patents

Description

Adjuvantní prostředek a vakcina

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nových vakcinačních prostředků, způsobů pro jejich přípravu a jejich použití v lékařství. Konkrétně se předkládaný vynález týká vakcin obsahujících kamenec, antigen, imunologicky aktivní frakci z kůry Quillaja saponaria molina jako je QS21 a sterol.

Dosavadní stav techniky

Imunologicky aktivní saponinové frakce mající adjuvantní aktivitu získané z kůry jihoamerického stromu Quillaja saponaria molina jsou známé v oboru. Například, QS21, též znám jako QA21, HPLC přečištěná frakce ze stromu Quillaja saponaria molina a způsob pro jeho výrobu je popsán (jako QA21) v US patentu č. 5057540. Quillaja saponin byl také popsán jako adjuvans v Scott et al., Int. Archs. Allergy Appl. Immun. 1985, 77: 409. Nicméně, použití QS21 jako adjuvans je spojeno s několika nevýhodami. Například, při injekci QS21 jako volné molekuly savcům byla pozorována nekrosa, t.j. lokalizovaná smrt tkáně, v místě podání injekce.

WO 96/33739 popisu vakcinu obsahující antigen, imunologicky aktivní frakci z kůry Quillaja saponaria molina, jako je QS21, a sterol.

Nyní bylo překvapivě zjištěno, že obsažení kamence do yakciny obsahující MPL, QS21 a SUV zvyšuje jak protilátkovou, tak buněčnou odpověď a že vakciny obsahující MPL, QS21, SUV a kamenec jsou netoxické s dobrým profilem reaktivity a že mají zvýšenou adjuvantní aktivitu. Kromě toho se zdá, že kombinovaná adjuvans

• · · ·

upřednostňují TH1 odpověď.

Podstata vynálezu

V prvním aspektu vynález obsahuje adjuvans pro vakcinu obsahující kamenec, imunologicky aktivní saponinovou frakci a sterol. Termínem kamenec je míněn hydroxid hlinitý nebo fosforečnan hlinitý.

Výhodně obsahuje adjuvantní prostředek podle předkládaného vynálezu imunologicky aktivní saponinovou frakci ve významně přečištěné formě. Výhodně obsahuje prostředek podle předkládaného vynálezu QS21 ve významně přečištěné formě, to znamená, že QS21 má alespoň 90% čistotu, lépe alespoň 95% čistotu a nejlépe alespoň 98% čistotu.

Další imunologicky aktivní saponinové frakce použitelné v prostředcích podle předkládaného vynálezu jsou QA17/QS17. Prostředky podle předkládaného vynálezu obsahující QS21 a cholesterol vykazují nižší vyvolanou reaktivitu ve srovnání s prostředky bez cholesterolu, zatímco adjuvantní účinek je zachován. Kromě toho je známo, že QS21 je degradován za alkalických podmínek, je-li pH je 7 nebo vyšší. Další výhodou prostředků podle předkládaného vynálezu je to, že stabilita QS21 k alkalické hydrolýze je zvýšena u prostředků obsahujících cholesterol.

Výhodné steroly zahrnují β-sitosterol, stigmasterol, ergosterol, ergokalciferol a cholesterol. Tyto steroly jsou dobře známé v oboru, například cholesterol je popsán v Merck Index, 11. vydání, str. 341, jako přirozený sterol z tuku živočichů.

Nejvýhodnějším sterolem je cholesterol.

·· · • · • · · · · · · · ·· • · · · · · · • · · · · · ··· · · · · • ······· · · · ··· ··· ······ ·· • · · ····· · · · · 'i ·<

Výhodné prostředky podle předkládaného vynálezu jsou prostředky tvořící liposomovou strukturu, to znamená malé jednolamelámí vesikuly (SUV) . Prostředky, ve kterých sterol/imunologicky aktivní saponinová frakce tvoří ISCOM strukturu, také tvoří aspekt předkládaného vynálezu.

Poměr QS21:sterol bude obvykle 1:100 až 1:1 hmotností. Výhodně je použit nadbytek sterolu, a poměr QS21:sterol je nejméně 1:1 hmot.:hmot. V obvyklých vakcinách pro podání lidem budou QS21 a sterol v množství od přibližně 1 /xg do přibližně 100 ^g, výhodně od 10 μ$ do přibližně 50 μ$ na dávku QS21.

Liposomy výhodně obsahují neutrální lipid, například fosfatidylcholin, který je výhodně nekrystalický při pokojové teplotě, například žloutkový fosfatidylcholin, dioleoylfosfatidylcholin nebo dilaurylfosfatidylcholin. Liposomy mohou také obsahovat lipid s nábojem, který zvyšuje stabilitu struktury liposomu-QS21 pro liposomy složené z nasycených lipidů.

V těchto případech je množství lipidu s nábojem obvykle 1-20% hmot.:hmot., lépe 5 - 10 %. Poměr sterolu k fosfolipidu je 1 50% (mol/mol), lépe 20 - 25 %.

Zejména výhodné podle předkládaného vynálezu jsou prostředky obsahující MPL (3-deacylovaný mono-fosforyl-lipid A, též známý jako 3D-MPL). 3D-MPL je známý z GB 2220211 (Ribi) jako směs 3 typů De-O-acylováného monofosforyl lipidu A s 4, 5 nebo 6 acylovaným řetězcem a je vyráběn Ribi Immunochem., Montana.

Výhodná forma je popsána v Mezinárodní patentové přihlášce 94/21292.

Vhodné prostředky podle předkládaného vynálezu jsou ty, ve kterých jsou liposomy nejprve připraveny bez MPL, a MPL je potom přidán/ výhodně ve formě 100 nm částic. MPL tak není obsažen v • · 4 4 · 4

444 4 4«

4 <

4 4 4 membráně vesikul (prostředky známé jako MPL out). Prostředky, ve kterých je MPL obsažen v membráně vesikul (známé jako MPL in) také tvoří aspekt předkládaného vynálezu. Antigen může být obsažen v membráně vesikul nebo může být obsažen mimo membránu vesikul. Výhodně jsou rozpustné antigeny mimo membránu a hydrofobní nebo lipidované antigeny jsou buď v membráně, nebo mimo membránu.

Ve výhodném aspektu předkládaného vynálezu jsou liposomy/SUV nejprve přidány do QS21 a potom je tato směs smí sena s kamencem, což vede k navázání významné části QS21 na kamenec (interakcí s liposomy). Takové prostředky, při injekčním podání, povedou k pomalejšímu uvolňování QS21 do těla, díky účinku kamence, než pokud je QS21 volný nebo nefixovaný na liposomy. Prostředky obsahující MPL, QS21, SUV a kamenec jsou zejména výhodné, protože j sou netoxické a vysoce imunogenní.

Výhodně budou vakcinační prostředky podle předkládaného vynálezu obsahovat antigen nebo antigenní prostředek, který je schopen vyvolat imunitní odpověď proti lidskému nebo zvířecímu patogenu. V první aspektu proto vynález obsahuje vakcinační prostředek obsahující kamenec, antigen, imunologicky aktivní saponinovou frakci a sterol.

V prostředcích podle předkládaného vynálezu mohou být použity antigeny nebo antigenní sloučeniny známé v oboru, včetně polysacharidových antigenů, antigenů nebo antigenních sloučenin získaných z HIV-1 (jako je gpl20 a gpl60), jakéhokoliv kočičího viru imunodeficience, lidských nebo zvířecích herpes virů, jako je gD nebo jeho deriváty nebo z bezprostředních časných proteinů jako je ICP27 z HSV1 nebo HSV2, cytomegaloviru (zejména lidského) (jako je gB nebo jeho deriváty), viru varicella zoster (jako je gpl, II nebo III) nebo z virů hepatitidy jako je virus hepatitidy : ' r • · ·· • · · · • · · ·

B, například, povrchový antigen viru hepatitidy B nebo jeho deriváty, viru hepatitidy A, viru hepatitidy C nebo viru hepatitidy E, nebo z jiných virových patogenů jako respiračně syncyciální virus (například F nebp G proteiny HSRV nebo jejich imunogenní fragmenty popsané v U.S. patentu 5149650 nebo chimérické polypeptidy obsahující imunogenní fragmenty z F a G proteinů HSRV, například FG glykoprotein popsaný v U.S. patentu 5194595), antigeny odvozené od kmenů meningitidy jako je meningitis A, B a C, Streptococcus pneumoniae, lidského papiloma viru, Haemophilus influenzae B (Hib), viru Epstei-Barrové (EBV) nebo od bakteriálních patogenů jako je Salmonella, Neisseria, Borrelia (například OspA nebo OspB nebo jeho deriváty), nebo Chalmydia nebo Bordetella, například P.69, PT a FHA, nebo antigeny odvozené od parasitů jako je plasmodium nebo toxoplasma.

Glykoprotein D (gD) HSV nebo jeho derivát je výhodným antigenem pro vakcinu. Je umístěn na virové membráně a také je prokazován v cytoplasmě infikovaných buněk (Eisenberg, R.J. et al., J. of Virol. 1980, 35: 428 - 435). Skládá se z 393 aminokyselin včetně signálního peptidu a má molekulovou hmotnost přibližně 60 kDa. Ze všech glykoproteinů obalu HSV je pravděpodobně nejlépe charakterizován (Cohen et al., Virology 60: 157 - 166). Je známo, že in vivo má centrální úlohu při navázání viru na buněčné membrány. Kromě toho, bylo zjištěno, že glykoprotein D je schopen vyvolat tvorbu neutralizačních protilátek in vivo a chránit zvířata před letální infekcí. Zkrácená forma gD molekuly je zkrácena o C-koncový kotvící region a může být produkována savčími buňkami jako solubilní protein, který je vylučován do supernatantu buněčné kultury. Takové solubilní formy gD jsou výhodné. Produkce zkrácených forem gD je popsána v EP 0139417. Výhodně je gD odvozen od HSV-2. Jedním provedením vynálezu je zkrácený HSV-2 glykoprotein D o 308 aminokyselinách, který obsahuje aminokyseliny 1 až 306 • · · ·· ···· ·· ·· přirozueného glykoproteinu s adicí asparaginu a glutaminu na C-konec zkráceného proteinu, který byl zbaven membránového kotvícího regionu. Tato forma proteinu obsahuje signální peptid, který je odštěpen proto, aby byla umožněna sekrece zralého solubilního proteinu o 283 aminokyselinách z hostitelské buňky.

V jiném aspektu vynálezu je výhodným antigenem pro vakcinu povrchový antigen viru hepatitidy B.

Jak je zde použit, zahrnuje výraz povrchový antigen viru hepatitidy B nebo HBsAg jakýkoliv HBsAg antigen nebo jeho fragment vykazující antigenní vlastnosti povrchového antigenu HBS. Mělo by být jasné, že kromě sekvence 226 aminokyselin HBsAg (viz Tiollais et al., Naturě, 317: 489 (1985) a odkazy zde uvedené) může HBsAg jak je zde popsán obsahovat celou nebo část pre-S sekvence jak je popsána ve výše uvedených odkazech a v EP-A-0278940. Konkrétně může HBsAg obsahovat polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci obsahující zbytky 12 - 52, po kterých následují zbytky 133 - 145, po kterých následují zbytky 175 - 400 L-proteinu HBsAg podle otevřeného čtecího rámce viru hepatitidy B serotypu ad (tento polypeptid je označen jako L*; viz EP 0414374). HBsAg podle předkládaného vynálezu může také zahrnovat pre-Sl-preS2-S polypeptid popsaný v EP 0198474 (Endotronics) nebo jeho blízké analogy, například jak jsou popsány v EP 0304578 (McCormic a Jones). HBsAg jak je zde použit může také zahrnovat mutanty, například escape mutant popsaný ve WO 91/14703 nebo Evropské patentové přihlášce č. 0511855A1, zejména HBsAg, který má aminokyselinovou substituci v pozici 145 z glyčinu na arginin.

Obyčejně je HBsAg ve formě částic. Částice mohou obsahovat například S protein samostatně, nebo se může jednat o složené částice, například (L·*, S), kde L* je definován výše a S označuje

4444

44 • 4 4 4 4 • 4 I ► 4 1

4 4 44

444

4

S-protein HBsAg. Uvedená částice je výhodně ve formě, ve které je exprivována v kvasinkách.

Příprava S-proteinu povrchového antigenu viru hepatitidy B je v literatuře dobře známá. Viz například Harford et al., (1983) v

Devolop. Biol. Standard 54, str. 125, Gregg et al., (1987), v

Biotechnology 5, str. 479, EP 0226846, EP 0299108 a odkazy zde uvedené.

V jiném provedení je antigenem pro vakcinu RSV antigen, jmenovitě F/G antigen. U.S. patent 5194595 (Upjohn) popisuje chimérické glykoproteiny obsahující imunogenní segmenty F a G glykoproteinů RSV a naznačuje, že takové proteiny mohou být exprivovány v mnoha systémech včetně bakteriálních, kvasinkových, savčích (např. CHO buňkách) a hmyzích buňkách (pomocí například bakuloviru).

Wathen et al., (J. Gen. Virol. 1989, 70: 2625 - 2635) popisuje určitý RSV FG chimérický glykoprotein exprivovaný pomocí bakulovirového vektoru skládající se z aminokyselin 1 - 489 F proteinu, které jsou navázány na aminokyseliny 97 - 279 G proteinu.

Prostředky podle předkládaného vynálezu mohou také obsahovat protinádorový antigen a mohou být použity pro imunoterapii tumorů.

Příprava vakcin je obecně popsána v New Trends and Devolopments in Vaccines, vydané Voliér et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978. Obalení v liposomech je popsáno například v Fullerton, U.S. patent 4235877. Konjugace proteinů na makromolekuly je popsána, například, v Likhite, U.S. patent 4372945 a Armor et al., U.S. patent 4474757.

· • •00

0 0 0· 0

Obsah proteinu je v každé dávce vakciny vybrán jako množství proteinu, které indukuje imunoprotektivní odpověď bez významných nežádoucích vedlejších účinků v obvyklých vakcinách. Takový obsah se bude lišit podle toho, jaký je použit jednotlivý imunogen a podle toho, jak je presentován. Obecně se očekává, že každá dávka bude obsahovat 1 - 1000 gg proteinu, výhodně 2 - 100 gg, nejlépe 4 - 40 gg. Optimální množství pro určitou vakcinu může být zjištěno standartními studiemi obsahujícími pozorování imunitní odpovědi subjektů. Po počáteční vakcinaci mohou subjekty dostat jednu nebo několik dosycovacích imunizací s vhodným časovým odstupem.

Prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být použity jak pro profylaktické, tak pro terapeutické účely.

Podle dalšího aspektu vynález proto obsahuje použití vakcinačního prostředku podle předkládaného vynálezu pro léčbu lidských pacientů. Vynález obsahuje způsob léčby, který obsahuje podání účinného množství vakciny podle předkládaného vynálezu pacientovi. Konkrétně, vynález obsahuje způsob pro léčbu virových, bakteriálních a parazitárních infekcí nebo nádorů, který obsahuje podání účinného množství vakciny podle předkládaného vynálezu pacientovi.

Následující příklady a data dokreslují předkládaný vynález.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Příprava vakciny obsahující kamenec, SUV .MPL a QS21

1.1. Způsob přípravy SUV

Směs lipidu (jako je fosfatidylcholin buď z vaječného žloutku, • ·

• · · • · ··· • · · * • · · · • ·· ··· nebo syntetický) a cholesterolu v organickém rozpouštědlu se suší ve vakuu (nebo alternativně proudem inertního plynu). Potom se přidá vodný roztok (jako je fosfátem pufrovaný salinický roztok) a nádoba se třepe do té doby, kdy je veškerý lipid v suspenzi. Tato suspenze se potom mikrofluidizuje do té doby, než je velikost liposomů redukována na 100 nm a potom se sterilně filtruje přes 0,2 μτη filtr. Protlačování nebo sonikace může nahradit tento krok. Obvykle je poměr cholesterol:

:fosfatidylcholin 1:4 (hmot./hmot.) a vodný roztok je přidán v takovém množství, aby se získala konečná koncentrace cholesterolu 5 až 50 mg/ml.

1.2. Antigen (1 - 500 ^g, výhodně 10 - 100 ^g) se přidá ke kamenci (například hydroxidu hlinitému nebo fosforečnanu hlinitému) (100 - 500 μg) ve vodě. Objem vody se vybere tak, že objem konečného prostředku je 500 μΐ. Po inkubaci trvající 15 - 30 minut se přidá 50 ^g MPL ve formě MPL s malou velikostí částic (WO 94/21292). MPL se nechá adsorbovat na kamenec po dobu 15-30 minut při pokojové teplotě. 10-krát koncentrovaný fosfátem pufrovaný salinický roztok (1,5 M chlorid sodný, 0,5 M fosforečnan sodný, pH 7,5) se přidá v takovém objemu, aby byl konečný přípravek isotonický. Tento přípravek se inkubuje při pokojové teplotě po dobu 15-30 minut.

Potom se přidá QS21 (50 μg) do SUV (obsahující mezi 50 a 250 μg cholesterolu) Směs se přidá ke směsi kamenec/antigen/MPL/pufr uvedené výše. Pokud je to žádoucí, přidá se bakteriostatické činidlo jako je například thiomersal (50 μg) .

}

Příklad 2 . ;

Tabulka 1 ukazuje vazbu QS21 na kamenec za^: přítomnosti a za absence·-liposomů obsahujících 25% (hmot. /hmot'.)^:: -

ΦΦ φ „ _ φφφ ΦΦ· φ « φ φ φ φ φ φ φ φ ··· · · · · φ ······· · Φ···ΦΦ·· φφφ φφφ Φ·

ΦΦ φ · · φ ·· ·· · · dioleoylfosfatidylcholinu a za použití 5-násobného nadbytku cholesterolu vzhledem k QS21.

Prostředek	SUV	vazba QS21 (Mg)
500 pg kamence + 50 pg QS21	0	< 10
500 pg kamence + 50 pg QS21	250 pg chol + 1 mg DOPC	> 10

Pro zvýšení vazby QS21 na kamenec může být sníženo množství liposomů. Tímto se sníží poměr cholesterol:QS21, nicméně bylo zjištěno, že QS21 je netoxický pro poměry cholesterol:QS21 1:1 a vyšší. Tabulka 2 ukazuje, ža pokud se sníží množství kamence (z 500 pg na 100 pg), tak se významně sníží množství navázaného QS21 a také se sníží množství navázaného MPL. Při přidání menšího množství liposomů, za uchování poměru cholesterol:QS21 1:1 nebo vyššího, se na kamenec může navázat vyšší množství QS21 a MPL.

Prostředek Chol/QS21 vazba QS21 vazba MPL (Mg) (Mg)

500 pg kamence + + 50 pg MPL	50	Mg QS21	+	5/1	42	>48
100 pg kamence +	50	Mg QS21	+	5/1	17	>40
+ 50 pg MPL
100 pg kamence +	50	Mg QS2i	+	2/1	30	>45
+ 50 pg MPL
100 pg kamence +	50	Mg QS21	+	1/1	40	>45

+ 50 pg MPL

99

9 9

9 9

9

·· β • · · • ♦ · · • 9 9999

9 9

9

9 9

9 9

9

9

9 9

Příklad. 3

Adjuvantní účinek kombinace antigenu (gD2t z Herpes simplex viru-2 - exprivovaný v CHO buňkách a obsahující 283 aminokyselin zralého N-konce zralého glykoproteinu) s MPL a QS21 v kombinaci s liposomy se testuje s a bez kamence. Přípravky se testují na kočkodanech zelených.

Kočkodani zelení se imunizují dvakrát (den 0, 28) 20 pg gD2t plus 50 μg QS21 s nebo bez liposomů (250 pg cholesterolu plus 1 mg DOPC) a s nebo bez 500 pg kamence. Imunitní odpověď se analyzuje v den 42.

Výsledky jsou uvedeny na obr. 1 až 4.

Protilátková odpověď se měří jako IgG proti gD proteinu. Obrázek 1 ukazuje, že kombinace MPL + QS21 + SUV + kamenec indukuje vyšší titry protilátek než kombinace bez kamence. Obr. 2 ukazuje, že prostředek podle předkládaného vynálezu indukuje nejvyšší antigen-specifickou proliferaci.

Data ukazují, že obsažení hydroxidu hlinitého ve vakcinách obsahujících MPL a QS21 a SUV zvyšuje jak protilátkovou, tak buněčnou odpověď. Toto je neočekávané zjištění, protože je všeobecně přijímáno, že hliník jako adjuvans upřednostňuje Th2 typ odpovědi, zatímco zde presentované výsledky ukazují, že odpověď obsahuje významnou Thl složku, která není potlačena přidáním kamence.

Prostředek obsahující MPL a QS21 a SUV a kamenec je netoxický a vysoce imunogenní.

0 · · • 0 0 0

0 0 0

• · · « 0 0 «·0

0 0000 « · * 0 0 ·0 • «·

0 0 0 0

Příklad 4; Produkce RSV FG proteinů v CHO buňkách

Plasmid pEE14-FG obsahující chimérický konstrukt obsahující fúsi mezi aminokyselinovými sekvencemi F (1 - 525) a G (69 - 298) se získal spoluprácí s A. Bollen (ULB/CRI, Belgie). Tento FG fúsní protein obsahuje celkem 755 aminokyselin. Začíná v N-koncové signální sekvenci F a postrádá C-koncovou transmembránovou doménu (525 - 574) - kotvící doménu - F glykoproteinu. Dále obsahuje po extracelulárním regionu G glykoproteinu, bez amino-koncového regionu, signální/kotvící doménu G proteinu, který je typickým glykoproteinem třídy II.

pEE14-FG expresní plasmid se generuje insercí FG kódující sekvence z pNIV2857 (A. bollen, ULB/CRI, Belgie) jako Asp7181 (tupý konec) 5' - HindlII (tupý konec) 3' restrikční fragment (2188 bp) do Smál místa pEE14 (Celltech) . Kozáková sekvence od FG start ATG kodonu byla generována do pNIV 2 857 konstruktu následujícím způsobem:

pEE14-----ccc gtacc ATG GAG-----x----CAG TAG aagct ggg---pEE14 (Smál) Metl

Asp7181 (Klenow)

Gln(298)Stop

HindlII (Klenow)

5'F(l-525)

G(69-298)3'

F sekvence v pEE14-FG je z kmenu SS2 RSV a byla laskavě poskytnuta Dr. Pringlem jako cDNA konstrukt ve Vaccinia vektoru (Baybutt and Pringle, J. Gen. Virol. 1987, 2789 - 2796) . G sekvence je z kmenu A2 RSV a byla vyrobena z rekombinantního G viru vakcinie, který byl získán od Dr. G. Wertze (Alabama, USA) .

Transfekce CHO K1 a stabilní exprese FG proteinu

CHO K1 buňky odvozené od MCB 024M (Celltech) se transfektují

²⁰ Μ9 pEE14-FG plasmidová DNA s dvojnásobkem CsCl, která byla přečištěna pomocí Ca-fosfát-glycerolového transfekčního postupu. Buněčné klony se selektují podle postupu GS (glutaminsyntetasového) expresního systému (Crocett et al., BioTechn., 1990, svazek 8, 662) a amplifikují se za přítomnosti 25 gmol methioninsulfoximinu (MSX) v G MEM mediu, které neobsahuje glutamin a je doplněno 10% dialyzovaným FBS (fetálním hovězím sérem) . Po transfekci se 39 MSX resistentních klonů vyšetřuje ve 24-jamkových plotnách a jejich supernatanty se testují na sekrecí FG fúsního proteinu. Pomocí specifického sandwichového ELISA testu (t.j. králičí polyklonální anti-FG sérum/antigen/mAB19) se zjistilo, že všechny transfektanty jsou pozitivní na expresi F antigenů. Monoklonální protilátka rozpoznává konformační F1 epitop aje neutralizační.

Tři nej lepší klony produkující FG (č. 7, 13 a 37) se po jedné buňce subklonují v testu limitního ředění za použití 0,07 buněk na jamku v 96-jamkové plotně. Získá se celkem 59 pozitivních subklonů a 16 klonů nejlépe produkujících FG se dále charakterizuje pomocí Western blotu a ELISA. Znovu se 8 klonů nejlépe produkujících FG dále amplifikuje a jejich exprese FG se hodnotí za přítomnosti a za absence butyratu sodného (2 mM) nebo DMSO (1 nebo 2%) . Amplifikuje se šest subklonů, které se uloží do zkumavek a uskladní se při -80 °C v kapalném N₂ . Nakonec se vyberou tři nej lepší FG-subklony. Těmito subklony jsou CHOK1 FG č. 7.18, 13.1 a 37.2.

Western blot analýzy (za neredukčních podmínek) s monoklonální mAB19 ukázaly hlavní proužek FG o asi 135 kDa. Přečištěný FG protein z rekombinantních bakulovirus-FG infikovaných buněk (Upjohn) se jevil jako hlavní proužek při +/- 100 kDa a další proužek při +/- 70 kDa za podobných podmínek testu.

• · ··· ·

Přidání butyratu sodného do kultivačního media CHO-FG buněk zvýšilo hladinu exprese FG 3- až 12-krát, podle subklonu a použitých kultivačních podmínek. Jmenovitě, subklon CHO-FG 13.1 exprivoval 8 - 10-krát více FG-proteinu za přítomnosti butyratu (WB/ELISA).

Hladina exprese byla určena ELISA (mAB19 nebo MoAb AK13) za použití přečištěnéhgo FG bakulo proteinu jako standardu, stejně jako pomocí Western blot analýzy využívající sériové ředění.

Podle ELISA testu a kultivačních podmínek je exprese CHO-FG 13.1 5 - 12 gg FG/ml po ošetření butyratem. Při akumulačních podmínkách a výměně media (3 až 5 dnů) se získá 16 - 28 gg secernovaného FG proteinu/ml.

CHOK1 FG 13.1 buněčná linie byla adaptována na růst v suspenzi a v podmínkách bez séra (S/SF) za použití speciálního kultivačního media. Buněčná linie CHO FG 13.1 S/SF kultivovaná v mediu bez butyratu exprivovala podobná množství proteinu jako původní adherentní buněčná linie kultivovaná v mediu bez butyratu. Přidání butyratu do CHO FG 13.1 S/SF media mělo malý vliv na produkci FG (1,5 - 2-násobné zvýšení).

Hodnocení dlouhodobé exprese a předběžná genetická charakterizace ukázaly, že CHO FG 13.1 a S/SF adaptovaná 13.1 buněčné linie jsou stabilní, že obsahují intaktní FG expresní kazety, které vyvolávají tvorbu jediného mRNA proužku o délce přibližně 3000 nukleotidů (Southern a Northern analýzy). CHO FG 13.1 S/SF byla dále použita pro výrobu FG antigenu.

Použití kamence/MPL/QS21/SUV pro zvýšení imunitní odpovědi u kočkodanů zelených proti FG proteinu z RSV (respiračně syncyciálního viru)

FG protein (fúsní protein obsahující F- a G-proteiny z RSV) byl exprivován v CHO buňkách a byl přečištěn. 20 gg přečištěného proteinu se adsorbovalo na kamenec (500 /xg) , ke kterému se přidal monofosforyl lipid A (MPL: 50 ^g). Po inkubaci po dobu 30 minut při pokojové teplotě se přidá fosfátem pufrovaný salinický roztok. Potom se přidá buď SUV samostatně, nebo směs SUV a QS21 (50 μg QS21, SUV obsahující 250 ^g cholesterolu a 1 mg DOPC). Kočkodanům zeleným se podají tři injekce tohoto prostředku nebo FG na kamenci samostatně nebo FG ve směsi s MPL, SUV a QS21 za absence kamence.

Obr. 5 dále ukazuje titry neutralizující RSV a FG-ELISA titry získané pro každý prostředek. Je jasné, že skupina kamenec/MPL/QS 21/SUV indukuje nejvyšší titry.

Příklad 5: Srovnání prostředků vakciny proti hepatitidě B obsahujících SL* antigen s QS21/SUV s prostředky obsahujícími kamenec

Úvod

SL* se vyrobí postupem podle Evropské patentové přihlášky č. 414374 .

Studie imunogenicity se provede na Balb/c myších pro srovnání odpovědi protilátkových odpovědí indukovaných prostředky obsahujícími QS21-SUV za přítomnosti nebo za absence Al(OH)₃. Dávka MPL je 5 ^g, QS21 5 μg, SUV obsahuje 25 μg cholesterolu a 100 μg DOPC.

Protokol pokusu je popsán v části materiál a metody. Stručně, myši se imunizují intramuskulárně v oblasti tlapky dvakrát v intervalu 4 týdny SL* vakcinou obsahující buď vehikulum, • · ·

• · · · · 9>

• · imunostimulans nebo jejich kombinaci. Analyzuje se anti-HBs protilátková odpověď (IgG a isotypy).

Ve pokusu se použijí následující skupiny:

1.	SL*	(2	MG)
2 .	SL*	(2
3 .	SL*	(2	M9)
4 .	SL*	(2	Mg)

Al(OH)_a (50 /xg)

A1(OH)₃ (50 /xg)/MPL/QS21 A1(OH)₃ (50 Mg)/QS21-SUV MPL/QS21-SUV

Výsledky

Protilátkové odpovědi se měří ELISA jak je popsáno v části materiál a metody. Analyzují se dva časové body: 2 8 dní po první injekci (28 post I) a 14 dní po dosycovací injekci (14 post II) .

Post I a post II anti-HBs odpovědi zjištěné z odebraného séra j sou uvedeny na obr. 6.

Tato data ukazují, že v primární odpovědi jsou indukovány všemy prostředky obsahujícími QS21-SUV srovnatelné titry, zatímco při použití Al(OH)₃ samotného jsou pozorovány slabší odpovědi.

V sekundární odpovědi byla nej slabší protilátková odpověď také indukována vakcinou obsahující A1(OH)₃. Nicméně, všechny prostředky obsahující QS21-SUV nevyvolávaly stejnou odpověď.

Dva prostředky obsahující Al(OH)₃ QS21-SUV (+/-) MPL indukovaly nej silnější protilátkovou odpověď (2x vyšší než MPL/QS21-SUV).

Ačkoliv nebyla provedena statistická analýza, výsledky získané z jednotlivých sér potvrzují toto pozorování.

·· ♦ • ·

Kombinace Al(OH)₃ a QS21-SUV (+/- MPL) také kvantitativně ovlivňovala imunitní odpověď, jak ukazuje isotypový profil protilátkové odpovědi (obr. 7).

Al(OH) indukuje zřetelně TH2 typ imunitní odpovědi (pouze 3% IgG2a), zatímco prostředek obsahující Al(OH)₃/QS21-SUV (+/- MPL) indukuje více než 46% IgG2a.

Závěr

Kombinace kamence s QS21-SUV (+/- MPL) indukuje vyšší titr protilátek než prostředek obsahující vehikulum nebo imunostimulans samostatně.

Materiál a metody

Imunizace skupin 5 samic Balb/c myší (6-8 týdnů) bylo imunizováno intramuskulárně v oblasti tlapky (m. gastrocnemicus) dvakrát v intervalu 4 týdnů 50 gl vakciny obsahující 2 gg SL* připraveného v A1(OH)₃ (50 gg ekvivalentu Al³*), Al(OH)₃/QS21-SUV,

Al(OH)₃/MPL/QS21-SUV, MPL/QS21-SUV. Byla použita dávka 5 gg imunostimulancia.

Zvířatům byla odebrána krev v den 28 (28 post I) a v den 42 (14 post II) pro určení titru protilátek ELISA.

Prostředky

Použijí se složky pro jednotlivé vsádky.

Příprava prostředku

SL* (2 gg) se adsorbuje nebo nikoliv po dobu 15 minut na 50 gg vodou ředěného Al(OH) .

Pokud je to nutné, přidá se na 15 minut do prostředku 5 gg MPL jako suspenze 100 nm částic (MPL out). Pokud je to nutné, přidá se desetkrát koncentrovaný pufr před přidáním 5 gg QS21 ve směsi s liposomy v hmotnostním poměru QS21:cholesterolu 1:5.

Thiomersal se přidá do prostředků 15 minut po přidání QS21/SUV.

Prostředky obsahující QS21-SUV se pufrují PBS pH 7,4 a ostatní se připraví v PBS pH 6,8.

Sérologie

Kvantitativní hodnocení anti-HBs protilátek se provede ELISA za použití HBs (Hep286) jako potahovacího antigenů. Antigen a roztoky protilátek se použití v objemu 50 gl na jamku. Antigen se ředí na konečnou koncentraci 1 gg/ml v PBS a adsorbuje se přes noc při 4 °C na jamky 96-jamkové mikrotitrační plotny (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dánsko). Plotny se potom inkubují po dobu 1 hodiny při 37 °C s PBS obsahujícím 1% hovězí sérový albumin a 0,1% Tween 20 (saturační pufr). Dvojnásobná ředění séra (s počátečním ředěním 1/100) v saturačním pufru se přidají do HBs-potažených ploten a inkubují se po dobu 1 hodiny 30 minut při 37 °C. Plotna se čtyřikrát promyjí PBS 0,1% Tween 20 a do každé jamky se přidá s biotinem konjugovaný anti-myší IgGl, IgG2a,

IgG2b nebo směs tří protilátek (Amersham, UK) ředěných 1/1000 v saturačním pufru a provede se inkubace po dobu 1,5 hodiny při 37 °C. Po promytí se přidá komplex streptavidin-biotynylovaná ·· ···· • · · • · · · · · • · · · · · · · » • ······· · • · · · · • · · · · · · · peroxidasa (Amersham, UK) v ředění 1/5000 v saturačním pufru na dobu dalších 30 minut při 37 °C. Plotny se promyjí způsobem uvedeným výše a inkubují se po dobu 20 minut s roztokem o-fenylendiamidu (Sigma) 0,04%, H₂0₂ 0,03% v 0,1% Tween 20, 0,05 citratového pufru pH 4,5. Reakce se ukončí 2N H SO a odečítá se

4 při 492/620 nm. ELISA titry se vypočítají pomocí SoftmaxPro (pomocí čtyřparametrové rovnice) a vyjádří se v EU/ml.

• 4 4444 44 44 • · · 444 4444 •444 44 444 · 4 4 4 • 4444444 4 44 444 444 •44 44 4 4« ·· · 44444 44 44 fatentove rr á. ar θ ZPz y

Claims (14)

1. Adjuvantní prostředek obsahující kamenec, QS21 a sterol vyznačující se tím, že kamenec je navázán na QS21.

2. Adjuvantní prostředek podle nároku lvyznačuj ící se tím, že saponin je spojen s liposomy nebo s Iscom obsahujícím fosfolipid a sterol.

3. Adjuvantní prostředek podle jakéhokoliv z nároků 1 nebo 2 vyznačuj ící se tím, že sterol je cholesterol.

4. Adjuvantní prostředek podle jakéhokoliv z nároků 1 až 3 vyznačující se tím, že poměr QS21:sterol je od 1:100 do 1:1.

5. Adjuvantní prostředek podle jakéhokoliv z nároků 1 až 5 vyznačující se tím, že dále obsahuje 3-de-0-acylovaný monofosforyl lipid A.

6. Vakcina obsahující adjuvans podle nároku 1 až 6 a antigen.

7. Vakcina podle nároku 6 obsahující antigen nebo antigenní sloučeninu získanou z jakéhokoliv z viru lidské imunodeficience, viru kočičí imunodeficience, viru varicella zoster, viru herpes simplex typ 1, viru herpes simplex typ 2, lidského cytomegaloviru, viru hepatitidy A, B, C nebo E, respiračně syncyciálního viru, lidského papiloma viru, viru chřipky, Hib, viru meningitidy, Salmonella, Neisseria, Borrelia, Chlamydia, Bordetella, Plasmodium nebo Toxoplasma, obsahující adjuvans podle nároků 1 až 6.

·· · • · ··· · • ·

99 ·· » · ··

8. Vakcina podle nároku 6, kde antigenem je nádorový antigen.

9. Vakcina podle nároku 6, kde antigen je vybrán ze skupiny zahrnující SL* odvozený od viru hepatitidy B, HSV gD^t nebo FG chimérického proteinu RSV.

10. Použití prostředku podle jakéhokoliv z nároků 1 až 5 pro výrobu vakciny pro profylaktickou léčbu virových, bakteriálních nebo parasitárních infekcí.

11. Použití prostředku podle jakéhokoliv z nároků 1 až 5 pro výrobu vakciny pro imunoterapeutickou léčbu virových, bakteriálních nebo parasitárních infekcí nebo nádorů.

12. Způsob pro léčbu savců infikovaných patogenem nebo vnímavých k infekci patogenem vyznačující se tím, že obsahuje podání bezpečného a účinného množství prostředku podle jakéhokoliv z nároků 1 až 4.

13. Způsob pro léčbu savců s nádorovým onemocněním vyznačující se tím, že obsahuje podání bezpečného a účinného množství prostředku podle jakéhokoliv z nároků 1 až 4

14. Způsob pro výrobu adjuvantního prostředku podle nároku 1 vyznačující se tím, že obsahuje smísení frakce QS21 a cholesterolu a navázání QS21 na kamenec.