Hintergrund der Erfindung
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Respiratory Syncytial Virus (RSV) ist eine Hauptursache für
Erkrankungen der unteren Atemwege im Säuglings- und frühen
Kindesalter (McIntosh and Chanock, 1985, in Virology, Fields, B.
(Hg.), Raven, NY, S. 1285-1304). In allen geographischen
Gebieten ist es die Hauptursache für Bronchiolitis und
Lungenentzündung bei Säuglingen und Kleinkindern. Das Virus führt während
der Kindheit immer wieder zu Infektionen, aber eine durch
Reinfektion hervorgerufene Erkrankung ist im Allgemeinen schwächer
als jene im Zusammenhang mit der Erstinfektion und verursacht
nur selten größere Probleme.
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Das RS-Virus ist ein umhülltes RNA-Virus der Familie
Paramyxoviridae und des Genus Pneumovirus. Die beiden wichtigsten
Hüllenproteine sind das G-Protein, das für das Anlagern des
Virus an die Wirtszellenmembran verantwortlich ist, und das
Fusionsprotein (F-Protein), das für die Fusion des Virus mit
Zellmembranen verantwortlich ist. Die Virus-Zellen-Fusion ist
ein notwendiger Schritt für die Infektion. Fusionsprotein ist
auch für die Zellen-Zellen-Fusion notwendig, die ein anderer Weg
ist, um die Infektion von einer infizierten Zelle auf eine nicht
infizierte Zelle zu übertragen.
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Antikörper gegen das Fusionsprotein oder gegen das G-Protein
können das Virus neutralisieren. Nur Antikörper gegen das
Fusionsprotein blockieren jedoch die Verbreitung des Virus zwischen
Zellen, d. h. sie haben Antifusions-Aktivität. Daher schützen
Antikörper gegen das Fusionsprotein vor dem zirkulierenden Virus
und inhibieren die Verbreitung einer bestehenden Infektion unter
den Zellen. Es ist gefunden worden, dass Antikörper gegen das
Fusionsprotein (sowohl polyklonale Antiseren gegen gereinigtes
Fusionsprotein als auch monoklonale Antikörper, die sowohl
neutralisierende als auch Antifusions-Aktivität beinhalten) in
Tiermodellen gegen Infektion schützen (Walsh et al., 1984,
Infect. Immun. 43: 756-758).
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Ein praktisches Mittel zum Schutz von Säuglingen und
Kleinkindern gegen Erkrankungen der oberen und unteren Atemwege wäre
eine Schutzimpfung gegen RS-Virus. Die Impfung von werdenden
Müttern (aktive Immunisierung) würde Kleinkinder durch passiven
Immunitätstransfer entweder durch die Plazenta oder durch die
Muttermilch schützen. Es sind mehrere Ansätze zu einem
RS-Virusimpfstoff möglich, wobei sich einige jedoch in der
Vergangenheit als nicht erfolgreich erwiesen haben.
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Es ist die Impfung mit Vakzinen mit abgetöteten RS-Viren
versucht und als unwirksam befunden worden (Kim et al., 1969,
Am. J. Epid. 89: 422). Die Kinder waren nicht nur nicht
geschützt, sondern in einigen Fällen führten Folgeinfektionen mit
RS-Virus sogar zu atypischen und schwereren Erkrankungen als bei
den nicht immunisierten Kontrollgruppen. Dieses Phänomen ist
nicht auf das RS-Virus beschränkt und ist auch bei Impfstoffen
mit abgetötetem Paramyxovirus, wie Masern, beobachtet worden. Es
ist darauf hingewiesen worden, dass die Ursache für das Versagen
des früheren Impfstoffs mit inaktiviertem RS-Virus in der
Inaktivierung der biologisch funktionellen Epitope auf einem oder
beiden viralen Hüllen-Glycoproteinen liegt. Das heißt, die
Neutralisations- und Fusionsepitope am abgetöteten Virus des
Vakzins waren "denaturiert". Infolgedessen erhielt die geimpfte
Testperson keine biologisch funktionierenden Neutralisations-
und Fusionsepitope. Als daher die geimpfte Testperson mit einem
lebenden Virus in Berührung kam, brachte die resultierende
Antikörperantwort keine schützende Immunität. Statt dessen kam es zu
einer Antikörper-mediierten Entzündungs-Antwort, die oft zu
einer schwereren Erkrankung führte (Choppin and Scheid, 1980,
Rev. Inf. Dis. 2: 40-61).
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Der zweite Ansatz für einen RS-Virusimpfstoff bestand darin,
lebende Viren abzuschwächen. Es hat sich gezeigt, dass
temperaturempfindliche Mutanten (Wright et al., 1982, Infect. Immun.
37: 397-400) und Passage-abgeschwächtes Virus (Belshe et al.,
1982, J. Inf. Dis. 145: 311-319) nur schwach infektiös und bei
der Verhütung einer Erkrankung nicht wirksam sind, wenn sie als
Immunogene in RS-Virusvakzinen verwendet werden. In diesen
Fällen kam es jedoch nicht zu einer atypischen Erkrankung in Folge
der Impfung.
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Auf Grund unseres derzeitigen Wissens über die Struktur des
RS-Virus und die Immunantwort auf eine Infektion ist klar, dass
eine brauchbare Impfung gegen dieses Virus bei der Induzierung
der Bildung von Antikörpern gegen das Fusionsprotein und/oder
das G-Protein wirksam sein muss. Von besonderer Bedeutung für
die schützende Immunität ist die Bildung von Antikörpern, die
die Fusion inhibieren und daher die Verbreitung des Virus unter
den Zellen in den Atemwegen unterbinden können. Außerdem ist es
hilfreich, eine Zellen-mediierte Immunantwort hervorzurufen,
einschließlich der Stimulation von cytotoxischen T-Zellen
(CTLs), die gegen mit dem RS-Virus infizierte Zellen nützlich
sind. Die verschiedenen Vakzinformulierungen der vorliegenden
Erfindung sind darauf ausgerichtet, diese beiden Ziele zu
erreichen.
Zusammenfassung der Erfindung
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Diese Erfindung bezieht sich auf die Entdeckung bestimmter
Hilfsstoffe, die in der Lage sind, die Immunantwort gegen
Hüllenproteine des Respiratory Syncytial Virus zu verstärken,
insbesondere gegen RSV-Glycoprotein F und RSV-Glycoprotein G.
Insbesondere wird hier gezeigt, dass der Hilfsstoff QS-21 oder
alternativ dazu 3D-Monophosphoryllipid A plus Alaun die Fähigkeit
von gegen RSV-Glycoprotein F und/oder G gebildeten Antikörpern,
das Virus zu neutralisieren, signifikant erhöht und über die
Zellen-mediierte Antwort gegen das Virus einen immunologischen
Schutz bietet. Außerdem ist gezeigt worden, dass diese
Hilfsstoffe in von Viren infizierten Zellen die Syncytiabildung
verhindern. Auf Grund dieser Erkenntnisse können
Vakzinformulierungen hergestellt werden, die Hüllenprotein(e) von RSV und ein
Adjuvans, ausgewählt aus QS-21, 3D-MPL und Kombinationen,
umfassen. Die Formulierung kann gegebenenfalls Alaun enthalten. Die
Zugabe von Alaun kann die Immunantwort gegen das (die)
RSV-Antigen(e) noch verstärken, wenn es mit diesen Adjuvantien
verabreicht wird. Das Vorhandensein dieser Adjuvantien bringt erhöhte
Immunogenizität gegen das Antigen durch Erweiterung der
Immunantwort, insbesondere Komplement-mediierte Plaquereduktions-
Neutralisation im Vergleich zu Alaun. Außerdem ermöglicht das
Vorhandensein eines Adjuvans die Herstellung eines Vakzins mit
einer reduzierten Menge Antigen(en).
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Fig. 1 zeigt die Ergebnisse der Zellen-mediierten
Cytotoxizität der Versuche von Beispiel 5, das hier besprochen wird.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf
Vakzinformulierungen und therapeutische Verwendungen dafür zur Verhinderung
einer RSV-Infektion. Die erfindungsgemäße Vakzinformulierung
umfasst (a) ein Respiratory Syncytial Virus- (RSV-)Protein,
ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (i) RSV-Glycoprotein G,
(ii) RSV-Glycoprotein F, (iii) einem chimären Polypeptid, das
mindestens ein immunogenes Fragment von sowohl RSV-Glycoprotein
F als auch G umfasst, und (iv) Kombinationen davon, und (b) ein
Adjuvans, von dem gezeigt worden ist, dass es die Immunantwort
auf das RSV-Protein verstärkt. Das Adjuvans ist ausgewählt aus
QS-21, 3-deacyliertem Monophosphoryllipid A und Kombinationen
davon, und gegebenenfalls Alaun. Die Gegenwart von Alaun im
Vakzin wirkt synergistisch mit 3D-MPL, um eine
Neutralisationsantwort auf RSV hervorzurufen.
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In einer Ausführungsform der Erfindung ist QS-21 mit RSV-
Hüllenprotein G und/oder F formuliert. QS-21 ist ein Saponin,
das von einem rohen Extrakt von Quillaja saponaria gereinigt
wird, und ist von Kensil and Marciani, U. S. Patent 5,057,540,
beschrieben worden. Antikörper, die gegen Formulierungen
gebildet werden, die QS-21 und RSV-Protein F oder RSV-Protein G und F
enthalten, können RS-Virus neutralisieren. Die Immunogenizität
von RSV-F- und G-Proteinen wird durch die Verwendung von QS-21
als Adjuvans im Vergleich zu Formulierungen, die kein Adjuvans
oder andere bekannte Adjuvantien enthalten, wie Alaun, wenn es
alleine als Adjuvans verwendet wird, stark erhöht.
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Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist der, dass
die Adjuvantien in einem Vakzin mit RSV-G-Protein oder F-Protein
verwendet werden können, um eine Immunantwort auszulösen, wie
eine Antikörperantwort, die sowohl Untergruppe A als auch
Untergruppe B des RSV-Virus neutralisiert. Dies ist eine signifikante
Entdeckung, da gefunden worden ist, dass andere Adjuvantien,
insbesondere Alaun, mit G-Protein nur jene Untergruppe
neutralisieren, aus der das Protein gereinigt worden ist.
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In einer weiteren Ausführungsform kann 3D-MPL in Kombination
mit Alaun verwendet werden, um eine Vakzinformulierung
herzustellen, die die Stimulierung von Komplement-abhängigen
neutralisierenden Antikörpern gegen RSV verstärken kann. Die Immunogenizität
von Komponenten von RSV-Untereinheiten wird mit diesem
Adjuvans im Vergleich zu Formulierungen, die kein Adjuvans oder
Alaun als das einzige Adjuvans enthalten, stark erhöht.
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Proteine und Polypeptide, die mit einem neutralisierenden
und/oder Fusionsepitop(en) des Fusionsproteins und/oder
G-Proteins des RS-Virus in Zusammenhang stehen, sind als Immunogene in
einem Untereinheits-Vakzin nützlich, um gegen Erkrankungen der
unteren Atemwege und andere Krankheitssymptome einer
RS-Virusinfektion zu schützen, und können in den erfindungsgemäßen
Vakzinen formuliert werden. Untereinheits-Vakzine umfassen das
relevante immunogene Material, das notwendig ist, um einen Wirt zu
immunisieren, und die Adjuvantien, die hier als potente
Immunmodulatoren bezeichnet sind. Vakzine, die aus gentechnisch
veränderten Immunogenen, chemisch synthetisierten Immunogenen und/
oder Immunogenen hergestellt sind, die authentisches, im
Wesentlichen reines RS-Virus-Fusionsprotein oder Fragmente davon
allein oder in Kombination mit ähnlich hergestellten RS-Virus-G-
Proteinen oder Fragmenten davon umfassen, und die in der Lage
sind, eine schützende Immunantwort hervorzurufen, sind von
besonderem Vorteil, weil kein Risiko einer Infektion der Empfänger
besteht. Chimäre Polypeptide, die mindestens ein immunogenes
Fragment von den beiden RSV-Glycoproteinen F und G umfassen,
können in erfindungsgemäßen Vakzinformulierungen ebenfalls
verwendet werden. Solche chimäre RSV-Polypeptide sind von Wathen,
U. S. Patent 5,194,595, beschrieben worden.
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Das RS-Virus-Fusionsprotein und/oder G-Protein und
Polypeptide können aus Rekombinanten gereinigt werden, die die
neutralisierenden und/oder Fusionsepitope exprimieren. Solche
Rekombinanten schließen jegliche bakterielle Transformanten,
Hefetransformanten, kultivierte Insektenzellen, die mit
rekombinanten Baculoviren infiziert sind, oder kultivierte
Säugetierzellen, wie sie auf dem Fachgebiet bekannt sind, ein, wie zum
Beispiel Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters, die die Epitope
des RS-Virus-Fusionsproteins exprimieren. Das rekombinante
Protein oder Polypeptide können multiple Kopien des Epitops, an dem
Interesse besteht, umfassen.
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Das Protein oder Polypeptid, das mit dem
RS-Virus-Fusionsprotein und/oder G-Protein in Zusammenhang steht, kann chemisch
synthetisiert werden. Alternativ dazu können das Protein oder
Polypeptid, das mit dem RS-Virus-Fusionsprotein in Zusammenhang
steht, oder das Protein, das mit G in Zusammenhang steht, in im
Wesentlichen reiner Form aus dem RS-Virus oder Kulturen von
Zellen isoliert werden, die mit RS-Virus infiziert sind, und mit
den neuen Adjuvantien als Impfstoff gegen RSV formuliert werden.
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Unabhängig vom Verfahren zur Herstellung wird das RS-Virus-
Fusionsprotein oder G-Protein, verwandtes Protein oder
Polypeptid in eine geeignete Konzentration gebracht und kann mit einem
Adjuvans formuliert werden, ausgewählt aus QS-21 oder 3D-MPL
plus Alaun. 3-Deacyliertes MPL (3D-MPL) kann mit TDM und Squalen
koformuliert und in erfindungsgemäßen Vakzinformulierungen
verwendet werden. 3D-MPL kann gemäß den im britischen Patent Nr.
2220211 (Ribi Immunochem.) beschriebenen Verfahren erhalten
werden.
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Die Menge Protein in jeder Vakzindosis wird als eine Menge
gewählt, die eine immunprotektive Antwort ohne signifikante
negative Nebenwirkungen auslöst. Eine solche Menge ist je nach dem
verwendeten Immunogen verschieden. Im Allgemeinen wird jede
Dosis etwa 0,1 bis etwa 100 ug Protein umfassen, wobei etwa 5 bis
etwa 50 ug bevorzugt werden und etwa 5 bis etwa 25 ug/Dosis
alternativ bevorzugt werden. Die Menge Adjuvans wird eine Menge
sein, die eine immunmodulierende Antwort ohne signifikante
negative Nebenwirkungen auslöst. Eine optionale Menge für ein
bestimmtes Vakzin kann durch Standardstudien festgestellt werden,
die die Beobachtung der Antikörpertiter eines Vakzins und ihre
Fähigkeiten, Virus zu neutralisieren, beinhalten. Die Menge
Adjuvans wird etwa 1 bis etwa 100 ug/Dosis betragen, wobei etwa 5
bis etwa 50 ug/Dosis bevorzugt werden und etwa 20 bis etwa 50
ug/Dosis alternativ bevorzugt werden.
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Die Immunpotenz von Vakzinen, die RS-Virus-Fusions- oder G-
Protein oder immunologische Fragmente davon und genetische oder
physikalische Mischungen davon enthalten, kann durch Beobachtung
der Immunantwort von Versuchstieren nach der Immunisierung mit
dem gereinigten Protein, synthetischen Peptid oder rekombinanten
Protein bestimmt werden. Versuchstiere können Mäuse, Ratten,
Hasen, Primaten und schließlich menschliche Testpersonen
beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Verfahren zur Einführung
des Immunogens können intradermale, intramuskuläre,
intraperitoneale, intravenöse, subcutane, intranasale oder jegliche
andere Standardwege der Immunisierung einschließen. Die
Immunantwort der Testsubjekte kann durch mehrere Ansätze analysiert
werden: (a) die Reaktivität des resultierenden Immunserums auf
authentische RS-Virus-Antigene, wie sie durch bekannte Techniken
getestet wird, z. B. Festphasen-Enzymimmunoassay (ELISA),
Immunblots, Radioimmunpräzipitationen etc., (b) die Fähigkeit des
Immunserums, die RS-Virus-Infektivität in vitro zu
neutralisieren, (c) die Fähigkeit des Immunserums, die Virusfusion in vitro
zu inhibieren, die Fähigkeit immunisierter Tiere,
Antigen-abhängige cytotoxische T-Lymphozyten- (CTL-)Aktivität zu entwickeln,
und (e) der Schutz vor einer RS-Virusinfektion.
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Es können zahlreiche Verfahren verwendet werden, um die hier
beschriebenen Vakzinformulierungen für prophylaktische Zwecke an
Menschen zu verabreichen. Diese beinhalten, sind jedoch nicht
beschränkt auf intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale,
intravenöse, subcutane und intranasale Routen. Die
sekretorischen IgA-Antikörper, die vom Mucosa-assoziierten Lymphoidgewebe
produziert werden, können beim Schutz gegen eine
RS-Virusinfektion eine Hauptrolle spielen, indem sie die anfängliche
Wechselwirkung der Pathogene mit der Mucosaoberfläche verhindern, oder
indem sie die wichtigen Epitope der Pathogene neutralisieren,
die an der Infektion oder Verbreitung der Krankheit beteiligt
sind. Die Stimulierung der Mucosa-Immunantworten einschließlich
der Produktion von sekretorischen IgA-Antikörpern kann beim
Verleihen von Schutz gegen Infektionen der unteren und oberen
Atemwege von großer Wichtigkeit sein.
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Die Polypeptide und Proteine können im Allgemeinen in
Konzentrationen im Bereich von etwa 0,1 ug bis etwa 100 ug pro
Dosis formuliert sein.
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Physiologisch annehmbare Medien können als Träger verwendet
werden. Diese schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf
steriles Wasser, Kochsalzlösung, Phosphat-gepufferte
Kochsalzlösung u. ä. Andere geeignete Adjuvantien können den
erfindungsgemäßen, neuartigen Vakzinformulierungen zugesetzt werden und
schließen Mineralgele, z. B. Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat
etc. ein. Das Immunogen kann zur Verwendung in einer Vakzinformulierung
auch in Liposome eingebunden oder an Polysaccharide
und/oder andere Polymere konjugiert sein.
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Die Polypeptide und Proteine, die in erfindungsgemäße
Vakzinformulierungen eingebunden sein können, können mit einem
löslichen makromolekularen Träger verbunden sein. Vorzugsweise
haben der Träger und die Polypeptide und Proteine nach dem
Verbinden mehr als 5000 Dalton, und mehr bevorzugt hat der Träger mehr
als 5 Kilodalton. Vorzugsweise ist der Träger eine
Polyaminosäure, entweder natürlich oder synthetisch, die bei Tieren
einschließlich Menschen immunogen ist. Die Art der Verbindung ist
herkömmlich. Viele Verbindungstechniken sind im U. S. Patent Nr.
4,629,783 geoffenbart. Viele Vernetzungsmittel sind im 1986-87
Handbook and General Catalog, Pierce Chemical Company (Rockford,
Illinois), S. 311-340, geoffenbart.
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Es werden rekombinante Viren hergestellt, die mit RS-Virus-
Fusionsprotein und/oder G-Protein verwandte Epitope exprimieren.
Diese Viren können verwendet werden; um inaktivierte
rekombinante Virus-Vakzine herzustellen, um gegen Infektionen der unteren
Atemwege und andere Krankheitssymptome des RS-Virus zu schützen.
Inaktivierte Vakzine sind "tot" in dem Sinn, dass ihre
Infektivität zerstört worden ist, üblicherweise durch chemische
Behandlung (z. B. Formaldehyd). Idealerweise wird die
Infektivität des Virus zerstört, ohne die Proteine zu schädigen, die mit
der Immunogenizität des Virus in Zusammenhang stehen. Um
inaktivierte Vakzine herzustellen, müssen große Mengen des
rekombinanten Virus, das das RS-Virus-Fusionsprotein und/oder G-Protein
exprimiert, verwandte Proteine oder Polypeptide in einer Kultur
gezüchtet werden, um die erforderliche Menge relevanter Antigene
zur Verfügung zu stellen. Eine Mischung von inaktivierten Viren,
die verschiedene Epitope exprimieren, kann für die Formulierung
"multivalenter" Vakzine verwendet werden. In bestimmten Fällen
können diese "multivalenten" inaktivierten Vakzine auf Grund
potentieller Schwierigkeiten mit der gegenseitigen Störung von
Lebendviren, die gemeinsam verabreicht werden, den
Lebendvakzinformulierungen vorgezogen werden. In jedem Fall kann das
inaktivierte rekombinante Virus oder die Mischung von Viren mit dem
erfindungsgemäßen Adjuvans formuliert werden, um die
immunologische Antwort auf die Antigene zu verstärken.
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Die erfindungsgemäßen Vakzine können an ein Individuum
verabreicht werden, um eine Infektion oder Krankheitssymptome, die
mit RSV in Zusammenhang gebracht werden, zu verhindern. Eine
solche Verabreichung kann durch eine Einzeldosis oder durch
mehrere Dosen erfolgen, um bei dem Individuum eine primäre
Immunantwort auszulösen. Typischerweise wird eine Mehrfachimpfung für
Menschen 3 Mal im Abstand von im Wesentlichen 2 Monaten gegeben.
Auffrischungsdosen können gegeben werden, um eine existierende
Immunantwort aus einer früheren Impfung oder einer natürlichen
Infektion zu stimulieren.
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Die folgenden Beispiele werden gegeben, um die vorliegende
Erfindung darzustellen, und sollen nicht als den Umfang der
vorliegenden Erfindung einschränkend interpretiert werden.
Beispiele
Beispiel 1: RSV-Proteinpräparat
A. Immunaffinität-Fusionsprotein-1 (PFP-1)
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PFP-1 wird nach dem Verfahren von Walsh et al., J. Gen.
Virol. 66: 409-415 (1985) mit den folgenden Modifikationen
hergestellt. Das Immunaffinität-eluierte Material wird über eine
DEAE-Säule geleitet, und der Durchfluss wird gesammelt, gegen
PBS/0,1% Triton X-100 dialysiert und durch ein 0,2 um Filter
steril filtriert.
B. Ionenaustausch-Fusionsprotein-2 (IF)
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IF wird hergestellt, indem ein geklärtes, RSV-infiziertes
Zelllysat über eine DEAE-Säule geleitet wird. Der Durchfluss
wird gesammelt und über eine Hydroxyapatit- (HA-)Säule geleitet.
Nach dem HA-Eluieren wird das eluierte F-Protein gegen PBS/0,1%
Triton® X-100 dialysiert und durch ein 0,2 um Filter steril
filtriert.
C. Immunaffinität-G-Protein (G)
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G-Protein wird nach dem Verfahren von Walsh et al., J. Gen.
Virol. 66: 761-767 (1984) mit den folgenden Modifikationen
hergestellt. Nach dem Eluieren wird das G-Protein über eine
Immunaffinitätssäule geleitet, die für das RSV-F-Protein spezifisch
ist. Der Durchfluss wird gesammelt, gegen PBS/0,1% Triton® X-100
dialysiert und durch ein 0,2 um Filter steril filtriert.
D. F/G-Protein-Chimär
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F/G-Protein-Chimär ist nach dem U. S. Patent Nr. 5,194,595
hergestellt und wird von der Upjohn Corporation zur Verfügung
gestellt.
Beispiel 2: Enzymimmunoassay (EIA)
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Der Antikörpertiter in Serumproben wird unter Verwendung
eines Enzymimmunoassays (EIA) bestimmt, der wie folgt
durchgeführt wird:
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RS-Virus-Fusionsprotein wird in Carbonat-Bicarbonat-Puffer,
pH 9,6, auf 200 ng/ml verdünnt. 100 ul des verdünnten Antigens
werden jeder Vertiefung der Reihen B bis 6 einer NUNCTM
Testplatte mit 96 Vertiefungen mit flachem Boden zugesetzt. In den
Reihen A und H werden jeder Vertiefung nur 100 ul
Carbonat-Bicarbonat-Puffer alleine zugesetzt. Die Platte wird zugedeckt, 2
Stunden lang bei 37ºC unter Schütteln inkubiert und über Nacht bei
4ºC gelagert, um das Antigen zu immobilisieren.
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Die Überstände werden von der NUNCTM Testplatte entfernt, und
die Platte wird mit 0,1% Tween/PBS, pH 7,4, gewaschen und
trocken getupft.
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3 Antikörperproben werden auf jeder Platte einem Assay
unterzogen. Jede Probe wird zuerst zu einer Primärverdünnung in
0,2% Tween, 0,01 M EDTA/PBS, pH 7,5 (0,2% TWN), verdünnt. Die
Primärverdünnungen werden wie folgt in einer FALCONTM Platte mit
96 Vertiefungen mit U-förmigem Boden weiter seriell verdünnt:
(a) Die Primärverdünnungen der Proben werden zu 200
ul/Vertiefung in Reihe 2 geimpft. Probe 1 wird dreifach geimpft, z. B. in
Vertiefungen A2, B2 und C2; Probe 2 doppelt, z. B. in
Vertiefungen D2, E2; Probe 3 dreifach, z. B. in Vertiefungen F2, G2 und
H&sub2;.
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(b) 100 ul von 0,2% TWN wurden in jede Vertiefung der Reihen 3
bis 12 geimpft.
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(c) Serielle Verdünnungen wurden hergestellt, indem 100 ul
sequenziell von einer Vertiefung in Reihe 2 zur korrespondierenden
Vertiefung in Reihe 3 (z. B. B2 zu B3; C2 zu C3), einer
Vertiefung in Reihe 3 zur korrespondierenden Vertiefung in Reihe 4
transferiert wurden, bis Reihe 12 erreicht wurde.
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(d) In Reihe 1 wurden zu jeder Vertiefung als Kontrolle 100 ul
0,2% TWN zugesetzt.
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100 ul der Primärverdünnungen werden von jeder Vertiefung
der FALCONTM Platte zur korrespondierenden Vertiefung in der
NUNC Platte transferiert, z. B. A2 (FALCONTM) zu A2 (NUNCTM). Die
NUNC Testplatte wird zugedeckt und 1 Stunde lang bei 37ºC unter
Schütteln inkubiert. Die Überstände werden von der Testplatte
entfernt, und die Platte wird mit 0,1% Tween/PBS gewaschen und
trocken getupft.
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Ziegen-anti-Maus-IgG-alkalische Phosphatase-Konjugat (TAGOTM)
wird mit 0,3% Tween/PBS, pH 7,0 (0,3% TWN), zu einer
Arbeitsverdünnung verdünnt, z. B. 1 : 1500. Das verdünnte Konjugat (100 ul)
wird zu jeder Vertiefung in den Reihen 2 bis 12 zugesetzt. In
Reihe 1 werden 100 ul 0,3% TWN zu jeder Vertiefung als Kontrolle
zugesetzt. Die Platte wird zugedeckt und 1 Stunde lang bei 37ºC
unter Schütteln inkubiert. Die Inokula werden dann entfernt, und
die Platte wird mit 0,1% Tween/PBS, pH 7,4, gewaschen und
trocken getupft.
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Jeder Vertiefung werden 100 ul Substratlösung, 1 mg/ml in
Diethanolaminpuffer, pH 9,8 (SIGMA-104TM), zugesetzt. Die
Enzymreaktion wird bei Zimmertemperatur 1 Stunde lang geschehen
gelassen. Die Reaktion wird durch die Zugabe von 100 ul 3 N NaOH zu
jeder Vertiefung beendet. Das Ausmaß der Enzymreaktion wird
durch Ablesen der optischen Dichte von 410 nm bestimmt.
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Die Reihen A und H dienen als negative Kontrollen, da kein
Antigen vorhanden ist; Reihe 1 dient auch als negative
Kontrolle, da keine Antikörper vorhanden sind.
Beispiel 3: Virusneutralisations-Assay (Plaquereduktions-
Neutralisationstest, PRNT)
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Testserumproben, die seriell verdünnt sind, und das positive
Kontrollserum werden bei 56ºC 30 Minuten lang hitzeinaktiviert.
Alle Seren werden dann mit einem gleichen Volumen verdünnt, das
etwa 30 plaquebildende Einheiten (PFU) von RS-Virus enthält, und
bei 37ºC 1 Stunde lang mit (C' plus PRNT) oder ohne (PRNT)
Zugabe von 5% Hasenkomplement inkubiert. Ein Pool von menschlichen
Erwachsenenseren, die vorher durch Enzymimmunoassay,
Neutralisations- und Antifusionsassay charakterisiert worden sind, wird
für die positive Kontrolle verwendet. Seren, die vorher
charakterisiert worden sind und von denen bekannt war, dass sie
nichtimmun sind, werden als negative Kontrolle verwendet.
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Jede inkubierte Serum-Virus-Mischung wird in separaten
Vertiefungen von Platten mit 96 Vertiefungen auf HEp-2-Zellen (ATCC
Nr. CCL23) geimpft, und die Virusabsorption wird 2 Stunden lang
bei 37ºC erfolgen gelassen. Die Inokula werden entfernt. Die
Zellen-Monoschichten werden gewaschen, mit modifiziertem Eagle's
Medium plus 5% bovinem Fetalserum und 1% SEPHADEX® überschichtet
und bei 37ºC 3 Tage lang inkubiert. Das Überschichtungsmedium
wird entfernt, und die Zellen werden mit Phosphat-gepufferter
Kochsalzlösung (PBS) gewaschen.
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200 ul gekühlte PBS-Methanol-Lösung (1 : 5) werden jeder
Vertiefung zugesetzt, und die Zellen werden 30 Minuten lang bei
Zimmertemperatur fixiert. Das PBS-Methanol-Fixativ wird
entfernt, und 200 ul 5% CARNATION® Instantmilch in PBS, pH 6,8,
(BLOTTO) werden jeder Vertiefung zugesetzt. Die Platte wird 30
Minuten lang bei 37ºC inkubiert.
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BLOTTO wird entfernt. 50 ul monoklonale Antikörper gegen RS-
Virus (vorher titriert und mit BLOTTO zu einer
Arbeitskonzentration verdünnt) werden pro Vertiefung zugesetzt, und die Platte
wird bei 37ºC 1 Stunde lang inkubiert. Die Antikörper werden
entfernt, und die fixierten Zellen werden 2 Mal jeweils 30
Minuten lang mit BLOTTO gewaschen.
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50 ul/Vertiefung Merrettichperoxidase-konjugiertes
Ziegenanti-Maus-IgG (verdünnt 1 : 250 in BLOTTO) werden zugesetzt, und
die Platte wird 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Die Ziegen-
Antikörper werden entfernt, und die fixierten Zellen werden
wieder 2 Mal jeweils 30 Minuten lang mit BLOTTO gewaschen.
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50 ul/Vertiefung einer Peroxidasesubstratlösung (0,05% 4-
Chlor-1-naphthol, 0,09% H&sub2;O&sub2; in PBS, pH 6,8) werden zugesetzt,
und während 15 bis 30 Minuten bei Zimmertemperatur wird Farbe
entwickeln gelassen. Die Substratlösung wird entfernt, und die
Vertiefungen werden mit Wasser gewaschen und an der Luft
getrocknet. Die Anzahl der Plaques in jeder Vertiefung wird
festgestellt.
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Die Neutralisationsfähigkeit einer Testserumprobe wird als
jene Verdünnung ausgedrückt, die zu einer 60% Reduktion der
Plaquebildung im Vergleich zu einem nicht-immunen Kontrollserum
führt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 bis 4 tabellarisch
zusammengefasst.
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Die Daten in den Tabellen 1, 2, 3 und 4, die die Ergebnisse
des EIA und des Plaquereduktions-Neutralisationstests
darstellen, zeigen die Verbesserung der biologischen Immunantwort mit
der Verwendung dieser neuen Adjuvantien im Vergleich zu Alaun
alleine. Die Vakzinformulierungen von RS-Virus-Fusionsprotein,
G-Protein, Mischungen davon und F/G-chimärem Protein mit den
neuen Adjuvantien (mit oder ohne zusätzliches Alaun) waren im
Vergleich zu den Formulierungen, die nur Alaun enthielten,
signifikant verstärkt.
Immunogenizität von RSV-F- und G-Proteinen mit verschiedenen Adjuvantien¹ Serologische Titer pro Assay² und Zeit
Fortsetzung der Tabelle
Immunogenizität von RSV-F- und G-Proteinen mit verschiedenen Adjuvantien¹ Serologische Titer pro Assay² und Zeit
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1) Seronegative Schweizer Webster-Mäuse wurden mit F- und G-
Proteinen in verschiedenen Adjuvantien in Woche 0 und Woche 3
immunisiert (100 ul). Den Mäusen wurde für die Serologie in den
Wochen 0, 3 und 6 Blut abgenommen.
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2) Serologische Assays: EIA-F (F-Protein-spezifischer
Enzymimmunoassay), EIA-Ga (Ga-Protein-spezifischer Enzymimmunoassay),
PRNT (Plaquereduktions-Neutralisationstest) gegen einen
Untergruppe A-Stamm von RSV (d. h. A2) und einen Untergruppe B-Stamm
von RSV (d. h. 18537). C'-PRNT
(Plaquereduktions-Neutralisationstest mit 5% Komplement) wurden auch gegen die RSV-Stämme A2 und
18537 durchgeführt. EIA-Assays wurden an einzelnen Seren
durchgeführt, und die geometrischen mittleren Titer (GMT) wurden
berechnet und sind berichtet. PRNT- und C'-PRNT-Assays wurden an
gepoolten Seren durchgeführt (ein Pool pro Gruppe, n-5).
-
3) Immunogene: IF - Ionenaustausch-gereinigtes RSV-F-Protein;
G - Affinitäts-gereinigtes RSV-G-Protein; PFP-1 -
Affinitätsgereinigtes RSV-F-Protein; F/G-chimär - F/G-chimäres Protein,
gereinigt aus mit Baculovirus infizierter Sf9-Kultur.
-
4) Immunogene wurden mit den folgenden Adjuvantien verabreicht:
Alaun - 1 ug/ml Aluminiumhydroxid, QS-21-200 ug/ml QS-21, 3D-
MPL - 250 ug/ml 3D-MPL, 3D-MPL + Alaun - eine Kombination von
250 u1/ml 3D-MPL plus 1 ug/ml Aluminiumhydroxid.
-
5) nd - nicht durchgeführt
Auswirkung verschiedener Adjuvantien auf die Immunogenizität von F und G in Balb/c-Mäusen¹ Serologische Titer pro Assay² und Zeit
-
1) Seronegative Balb/C-Mäuse wurden in Wochen 0 und 4 mit
0,5 ug-Dosen der verschiedenen Immunogene immunisiert (100 ul).
Den Mäusen wurde für die Serologie in den Wochen 0, 4 und 8 Blut
abgenommen.
-
2) Serologische Assays: EIA-F (F-Protein-spezifischer
Enzymimmunoassay), EIA-GA (GA-Protein-spezifischer Enzymimmunoassay),
PRNT (Plaquereduktions-Neutralisationstest) gegen einen
Untergruppe A-Stamm von RSV (d. h. A2) und einen Untergruppe B-Stamm
von RSV (d. h. 18537). Alle Assays wurden an gepoolten Seren
durchgeführt (1 Pool/Gruppe, n-5). Außerdem wurden die Pools von
Woche 8 mit Komplement-verstärktem PRNT durch die Zugabe von 5%
Hasenkomplement getestet.
-
3) Alaun: Aluminiumhydroxid, 1 mg/ml.
-
4) 3D-MPL: 3D-Monophospholipid A, 250 ug/ml (25 ug/Dosis).
-
5) OS21: 200 ug/ul (20 ug/Dosis).
-
6) Alaun + 3D-MPL: Mischung von 1 mg/ml Aluminiumhydroxid und
250 ug/ml 3D-MPL.
Tabelle 3
Dosis-Antwort der Immunogenizität von IF mit verschiedenen Adjuvantien bei Schweizer Webster-Mäusen¹ Serologische Titer pro Assay² und Zeit
-
1) Seronegative Schweizer Webster-Mäuse wurden mit
Ionenaustausch-gereinigtem RSV-F-Protein (IF) oder PBS in verschiedenen
Adjuvantien in Woche 0 und Woche 3 immunisiert (100 ul). Den
Mäusen wurde für die Serologie in den Wochen 0, 3 und 6 Blut
abgenommen.
-
2) Serologische Assays: EIA-F (F-Protein-spezifischer
Enzymimmunoassay), EIA-Ga (Ga-Protein-spezifischer
Enzymimmunoassay), PRNT (Plaquereduktions-Neutralisationstest)
gegen einen Untergruppe A-Stamm von RSV (d. h. A2) und einen
Untergruppe B-Stamm von RSV (d. h. 18537). C'-PRNT
(Plaquereduktions-Neutralisationstest mit 5% Komplement) wurden auch gegen
die RSV-Stämme A2 und 18537 durchgeführt. EIA-Assays wurden an
einzelnen Seren durchgeführt, und die geometrischen mittleren
Titer (GMT) wurden berechnet und sind berichtet. PRNT- und C'-
PRNT-Assays wurden an gepoolten Seren durchgeführt (ein Pool pro
Gruppe, n-5).
-
3) Ionenaustausch-gereinigtes F-Protein (IF) wurde mit den
folgenden Adjuvantien verabreicht: Alaun = 1 ug/ml
Aluminiumhydroxid, QS-21 = 200 ug/ml QS-21, 3D-MPL = 250 ug/ml 3D-MPL, 3D-MPL
+ Alaun = eine Mischung von 250 ug/ml 3D-MPL plus 1 mg/ml
Aluminiumhydroxid.
-
4) nd - nicht durchgeführt
Tabelle 4
Immunogenizität von RSV-F- und G-Proteinen mit Aluminiumhydroxid oder OS-21 bei Schweizer Webster-Mäusen¹ Serologische Titer pro Assay² und Zeit
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1) Seronegative Mäuse wurden mit 1 ug Protein mit entweder Alaun
(AL(OH)&sub3;, 1 mg/ml) oder QS-21 (250 ug/ml) als Adjuvans in den
Wochen 0 und 3 immunisiert (100 ul, i. m.). Den Mäusen wurde für
die Serologie in den Wochen 0, 3 und 6 Blut abgenommen.
-
2) Serologische Assays: EIA-F (F-Protein-spezifischer
Enzymimmunoassay), PRNT (Plaquereduktions-Neutralisationstest) für einen
Untergruppe A-Stamm von RSV (d. h. A2) und einen Untergruppe B-
Stamm von RSV (d. h. 18537) mit der Zugabe von 5%
Hasenkomplement. EIA-Assays wurden an einzelnen Seren durchgeführt, und die
geometrischen mittleren Titer (GMT) wurden berechnet und sind
berichtet (Anzahl der Mäuse/Gruppe = 5).
-
3) Ionenaustausch-gereinigtes F-Protein (Triton X-100 Lyse)
kombiniert mit einer gleichen Menge Affinitäts-gereinigtes
G-Protein (Triton X-100/Desoxycholat Lyse).
-
4) Ionenaustausch-gereinigtes F-Protein.
Beispiel 4: Virus und Zelllinien
-
Die Stämme A2 und 18537 von RSV werden verwendet, und
Virusvorräte werden nach Standardverfahren entweder in Vero-Zellen
[American Type Culture Collection (ATCC) Nr. CCL 81] oder HEp-2-
Zellen (ATTC Nr. CCL 23) gezüchtet, über Sorbit-Dichtegradienten
gereinigt und bis zur Verwendung bei -70ºC gelagert. Eine BCH4-
Zelllinie, die ständig mit dem langen Stamm von RSV infiziert
ist, und die nicht infizierte BALB/c-Zelllinie (für beide
Zelllinien siehe Fernie et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1981,
167: 83-86) sind ein Geschenk von Dr. Bruce F. Fernie. Die
letzteren Zelllinien werden in Dulbecco's modifiziertem Eagle's
Medium (DMEM, Gibco BRL, Gaithersburg, MD) mit 10% (V/V)
hitzeinaktiviertem FBS (Hyclone Laboratories Inc., Logan, UT) gehalten.
Beispiel 5: Bestimmung der Anti-F-Protein-Antikörper-Unterklasse
-
Der Titer von Anti-F-Protein-Antikörper-Unterklasse von
Mäusen, vorbehandelt mit 5 ug F-Protein gemischt mit QS-21, ALOH
oder natürlicher Infektion, wird mittels ELISA bestimmt. Kurz
gesagt werden Platten mit 96 Vertiefungen mit 20 ng F-Protein
oder 5 ug RSV A2 wie folgt vorbereitet. Gereinigtes F-Protein
(200 ng/ml) oder RSV A2 (50 ug/ml) in Carbonat-Bicarbonat-Puffer
(pH 9,6) werden während 2 Stunden bei 37ºC auf Platten mit 96
Vertiefungen (Nung, Roskilde, Dänemark) geschichtet und über
Nacht bei 4ºC gelagert. Danach werden die Platten 5 Mal mit
PBS/0,05% Tween® 20 (Sigma) gewaschen, gefolgt von 2
zusätzlichen Spülungen nur mit PBS alleine. Serielle dreifache
Verdünnungen des Serums, hergestellt in PBS/0,3% Tween® 20/0,01 M
EDTA-Puffer (pH 7,0) werden dann den Vertiefungen zugesetzt und
1 Stunde lang bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach 5 Mal Waschen
mit PBS/0,1% Tweene 20 werden 100 ul biotinyliertes Ziegen-anti-
Maus-IgG (1 : 4000, Kirkegaard and Perry Laboratories), IgGl
(1 : 3000, Zymed) oder IgG2a (1 : 5000, Zymed) zugesetzt, und die
Platten werden 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur inkubiert.
Nach einer weiteren Serie von Waschungen werden den Vertiefungen
100 ul Streptavidin, konjugiert an Merrettichperoxidase (1 : 10
000 Verdünnung in PBS/0,3% Tween® 20, Zymed) zugesetzt und bei
Zimmertemperatur weitere 30 Minuten lang inkubiert.
Peroxidasesubstrat (2,2'-Azino-di-[3-ethyl-benzthiazolinsulfonat (6)],
Kirkegaard and Perry Laboratories) wurde den Vertiefungen nach
dem Waschen zugesetzt und bei Zimmertemperatur 20 Minuten lang
inkubiert, wonach die Reaktion mit 100 ul 1%
Natriumdodecylsulfat (Pierce, Rockford, IL) beendet wird. Endpunkttiter werden
bei 410 nM bestimmt.
-
Virusneutralisationsassay (PRNT) wird wie in Beispiel 3
durchgeführt.
-
Die erhöhten Komplement-unterstützten,
Serumneutralisierenden Antikörpertiter, die durch F/QS-21 hervorgerufen wurden,
korrelierten mit der Induzierung von Anti-F-Protein-Antikörpern
der IgG2a-Unterklasse (Tabelle 5). 3 Wochen nach der
Primärimmunisierung gab es eine QS-21-dosisabhängige Steigerung sowohl der
proteinspezifischen IgG2a- als auch der IgG1-Antikörper. Im
Vergleich dazu ruft eine einzelne Injektion von F-Protein gemischt
in Kochsalzlösung allein oder F/ALOH primär proteinspezifische
Antikörper der IgOl-Unterklasse hervor (Tabelle 5). Die Daten
weisen darauf hin, dass F/QS-21 humorale Immunantworten auslöst,
die jenen ähnlich sind, die von einer experimentellen Infektion
erzeugt werden und sowohl aus Komplement-fixierenden IgG2a- als
auch IgGl-Antikörpern bestehen.
Beispiel 6: Bestimmung der kreuzneutralisierenden
Antikörpertiter und RSV-Infektivität
-
Das Titrieren von serumneutralisierendem Antikörper wird
doppelt auf HEp-2-Zellen-Monoschichten in Gewebekulturplatten
mit 96 Vertiefungen durchgeführt, wie in Beispiel 3 beschrieben.
-
In diesem Beispiel wird beobachtet, wie in der Tabelle unten
dargestellt ist, dass ein Adjuvans das RSV-Protein in die Lage
versetzen kann, eine Komplement-abhängige IgG-Antikörperantwort
hervorzurufen, die Viren sowohl der Untergruppe A als auch der
Untergruppe B neutralisiert (diese Untergruppen werden in der
Tabelle unten als A2 bzw. 18537 bezeichnet). Diese
kreuzneutralisierende Immunantwort des RS-Virus vom heterologen Subtyp ist
früher unter Verwendung von gereinigtem G-Protein alleine nicht
erreicht worden. Ein Impfstoff, der mit Adjuvans QS-21 und RS-
Virus-G-Protein formuliert ist, erzeugt eine wünschenswerte
heterotypische neutralisierende Antikörperantwort, die wesentlich
größer ist als jene, die durch Alaun alleine oder eine
natürliche Infektion ausgelöst wird.
Tabelle 6: Heterotypische neutralisierende Antikörperantwort, ausgelöst durch RSV-G-Protein mit Adjuvans QS-21¹
-
¹Seronegative BALB/c-Mäuse werden in Wochen 0 und 3 mit RSV-G-
Protein in den oben angegebenen Dosen immunisiert (0,1 ml,
i. m.). Die Tiere werden in der 6. Woche 6 log&sub1;&sub0; PFU des RSV-
Stamms A2 ausgesetzt (0,1 ml, i. n.), und 4 Tage nach dem
Aussetzen wird ihnen für die Serologie Blut abgenommen.
-
²PRNT = Plaquereduktions-Neutralisations-Test durchgeführt gegen
einen Untergruppe A- (A2-) und einen Untergruppe B- (18537-)
Stamm von RSV. Assays werden an gepoolten Seren (n = 5) in
Gegenwart von 5% Hasenkomplement durchgeführt.
-
³Immunogen: RSV-G-Protein wird aus Vero-Zelllysaten, die mit dem
RSV-Stamm A2 infiziert sind, Immunaffinität-gereinigt. Dieses
gereinigte Protein wird unter Verwendung von
Immunaffinitätschromatographie weiter verarbeitet, um das Niveau des
verbleibenden F-Proteins noch weiter zu reduzieren. Durch diese
Immunogene werden keine nachweisbaren F-Protein-spezifischen
Antikörper hervorgerufen (wie mittels EIA gemessen wurde).
-
&sup4;Adjuvantien: QS-21 (200 ug/ml) oder Aluminiumhydroxid (Alaun,
1 mg/ml) werden 24 Stunden vor der Verwendung mit RSV-G-Protein
oder PBS gemischt.
Beispiel 7: Vergleich von QS-21 und ALOH bezüglich der
Fähigkeit, lokal F-Protein-abhängige Killerzellenaktivität
hervorzurufen
-
Die Fähigkeit von QS-21, lokal F-Protein-abhängige
Killerzellenaktivität hervorzurufen, wird ebenfalls untersucht und mit
der Zellen-mediierten Cytotoxizität verglichen, die durch die
Immunisierung mit F/ALOH oder eine experimentelle Infektion
ausgelöst wird.
-
Isolierung pulmonaler Mononuklearzellen (PMC): Die PMC werden
aus den Lungen nach Kollagenase-Verdau isoliert (siehe Hancock
et al., Vaccine, 12: 267-274, 1994 und Anderson et al., J. Gen.
Virol., 71: 1561-1570, 1990). Kurz gesagt werden die
herausgeschnittenen Lungen in kaltes DMEM gegeben und von peripherem
Blut reingespült. Die Lungen werden dann in frischem DMEM
zerkleinert, in eine 50 ml Zentrifugalröhre gegeben und bei 37ºC in
Gegenwart von Kollagenase (Kollagenase Typ IV, Sigma Chemical
Co., St. Louis, MO) bei einer Endkonzentration von 2 mg/ml 10 mM
HEPES-Puffer und 1% (V/V) hitzeinaktiviertem FBS rotiert. Nach
90 Minuten Inkubation werden die Fragmente durch ein
Gewebekulturfilter (Sigma) von 100 mesh aus rostfreiem Stahl gegeben. Die
resultierende Suspension wird pelletiert (400 g), in Metrizamid
(16%, W/V, Accurate Chemical & Scientific Corp., Westbury, NY)
resuspendiert, mit RPMI 1640 (Gibco BRL) überlagert, das 10%
hitzeinaktiviertes FBS enthält, und 20 Minuten lang bei 5ºC zentrifugiert
(150 g). Die PMC-Schichten werden dann gesammelt, von
Gradient reingewaschen und ex vivo auf ihre cytolytische
Fähigkeit getestet.
-
Bestimmung der prozentuellen Cytotoxizität: Die
Antigen-abhängige zelluläre Cytotoxizität wird in einem 4 Std. &sup5;¹Cr (Amersham
Corp., Arlington Heights, IL) Freisetzungsassay bestimmt. Kurz
gesagt werden 50 ul (5000 Zellen) syngeneische &sup5;¹Cr-markierte
Kontrolle oder RSV-infizierte (BCH4) Targetzelllinien dreifach
in Mikrovertiefungen mit V-förmigem Boden (Costar, Cambridge,
MA) mit 100 ul mononuklearen Milz- oder Lungenzellen (seriell 2-
fach verdünnt in RPMI 1640, das 10% hitzeinaktiviertes FBS, V/V,
enthält) inkubiert (37ºC, 5% CO&sub2;). Das Endvolumen beträgt 150 ul
pro Vertiefung. Nach der Inkubation werden die Überstände
gesammelt (Skatron Harvester, Skatron Inc., Sterling, VA), die
Freisetzung von &sup5;¹Cr in einem ClinGamma-Zähler (Pharmacia LKB)
gemessen und mit der spontanen Freisetzung (Targets nur mit Medium,
20-25%, inkubiert) und der Gesamtfreisetzung (Targets in
Kulturmedium mit 1,0% Triton® K-100, V/V, in PBS inkubiert)
verglichen. Die prozentuelle spezifische Freisetzung wird berechnet:
100 · [(mittl. cpm Versuch) - (mittl. cpm Spontanfreisetzung)]/
[(mittl. cpm Gesamtfreisetzung) - (mittl. cpm
Spontanfreisetzung)].
-
Studien der Antikörper-Blockade: Gereinigte monoklonale
Antikörper, gerichtet gegen die Antigene des Major
Histocompatibility Complex (MHC) H&sub2;Kd(Klon SF1-1.1, IgG 2a), H-2Dd (Klon AF4-
62.4, IgG 2b) und H-2Kb (Klon AF6-88,5, IgG 2a), werden von
PharMingen, San Diego, CA, erworben. Ein monoklonaler Antikörper
(E37-10, IgG 2b), der gegen Diphtherietoxoid-Antigen gerichtet
ist, dient als Unterklassenkontrolle. Der gegen
CD8-Oberflächenmoleküle von Mäusen (53-6.72, ATCC Nr. TIB 105) gerichtete
monoklonale Antikörper wird aus Hybridomkultur-Überständen über
einer rekombinanten Protein G-Säule (Pharmacia) gereinigt.
Gereinigtes Ratten-IgG wird von Calbiochem (San Diego, CA)
erworben. Um die Zellen-mediierte Cytolyse zu unterbinden, werden zu
50 ul Effektorzellen vor der Zugabe von 50 ul Targetzellen 50 ul
Antikörper zugesetzt. Das Endverhältnis von Effektor zu Target
betrug 60 : 1.
-
Balb/c-Mäuse werden in Woche 0 und 3 mit 5 ug F-Protein,
gemischt mit entweder 20 ug QS-21 () oder 100 ug ALOH (D)
geimpft und mit Mäusen verglichen, die durch experimentelle
Infektion immunisiert wurden ( ). Zwei Wochen nach der zweiten
Immunisierung werden die Mäuse dem Virus ausgesetzt. 4 Tage danach
sind die PMC von BALB/c-Mäusen, die mit F/QS-21 geimpft wurden,
in der Lage, RSV-infizierte Targets (durchgehende Linien in der
Zeichnung) in Antigen-abhängiger Weise abzutöten (siehe Fig.
1A). Es ist am bemerkenswertesten, dass diese cytotoxische
Aktivität genauso wirksam ist wie jede der PMC von Mäusen, die
vorher mit RSV infiziert wurden, und fast 3 Mal größer ist als
die Aktivität, die in den PMC von Mäusen induziert wurde, die
mit F/ALOH geimpft wurden. Syngeneische Kontroll-Targets
(strichlierte Linien), die nicht mit RSV infiziert sind, werden
nicht abgetötet (Fig. 1A). Die Aktivität ist lokal, da die
Milzzellen von den selben Mäusen nicht cytolytisch sind.
-
Die Ergebnisse wiesen weiters darauf hin, dass die lokale
Killerzellenaktivität, die durch die Impfung mit F/QS-21
ausgelöst wurde, durch T-Zellen des CD8-Phänotyps mediiert wird. Die
Cytolyse war inhibiert, wenn der Assaymischung steigende Dosen
von monoklonalem Antikörper gegen Zellen, die
CD8-0berflächendeterminanten aufweisen (ausgefülltes Symbol), zugesetzt wurden
(Fig. 1B). Ebenso blockieren steigende Konzentrationen von anti-
H&sub2;Dd und H&sub2;Kd monoklonalen Antikörpern (ausgefülltes Symbol) die
Cytolyse (Fig. 1C). Kontrollimmunglobulin (offene Symbole) sind
nicht inhibierend (Fig. 1 B und C).