CN1309180A - 用于来自脂肪组织的基质细胞的多中胚层谱系分化潜能和其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及可用于将来自脂肪组织的基质细胞分化成支持造血的基质细胞和骨胳和平滑肌类型的肌细胞的方法和组合物。这些方法制备的细胞可用于提供完全分化的有功能的细胞的来源,用于组织工程产品的研究、移植和开发以治疗人体疾病和创伤组织损伤修复。
Description
本发明涉及脂肪组织的基质细胞分化成支持造血的基质细胞和骨胳和平滑肌类型的肌细胞的方法和组合物。
人体发育的新生儿期的特征在于存在具有沿多重分化路径发育的潜能的“干”细胞。这些细胞的终末分化是由协调器官发生和组织结构的细胞因子和激素指令决定的。已将鼠胚胎干细胞分离并在体内外进行了深入研究。研究者在体外使用外源刺激物，诱导ES细胞沿多重谱系路径分化。这些包括神经元、B谱系淋巴和脂肪细胞(Dani等人(1997)J.Cell Sci.110:1279；Remoncourt等人(1998)Mech.Dev.79:185；O’Shea KS(1999)Anat.Rec.257:32)。该ES细胞已通过同源重组技术在体内操作产生基因特异无效或“敲除”的小鼠(Johnson RS(1989)Science 245:1234)。一旦分离出缺少特异基因的ES细胞克隆，它们就被移植到受精的鼠受精卵中。该分离的ES细胞的子代可以协调的方式发育成任意和所有鼠组织。
干细胞必需满足以下条件：(1)克隆的干细胞群体自我更新的能力；(2)克隆的干细胞群体在体外产生一新的、终末分化的细胞类型的能力；和(3)克隆的干细胞群体当移植到耗尽其拥有的天然细胞的动物时替换缺乏的终末分化细胞群体的能力。
多重干细胞存在于成熟有机体中。“干细胞”的最有特征的例子是从骨髓和外周血分离的造血祖代。通过Trentin、Till和McCulloch的初期研究(McCulloch等人(1996)Proc.Can.Cancer Conf.6:356-366；Curry等人(1967)J.Exp.Med.125:703-720)检查经致死辐照的小鼠。在没有处理的情况下，由于这些动物不能重新补足它们的循环血细胞因此它们死了；但是，从移植同源供体动物体的骨髓将解救该宿主动物。这些供体细胞使得重新组成所有这些循环血细胞。已进行大量漂亮的研究以证实供给有限未分化的造血干细胞就能够在宿主中再生8个或更多的分化血细胞谱系中的每一个。该项工作提供了骨髓移植的基础，而骨髓移植是用于人体癌症和新陈代谢先天性障碍的可广泛接受的治疗形式。因此，在整个生命过程中造血干细胞保留在正常人体骨髓中；它们不限于新生期。
最近由单个供体细胞形成完整的生物体的研究结果与该假说一致。多利羊实验显示，从羊的乳腺分离得到的细胞可以发育成成熟绵羊(Pennisi & Williams(1997)Science 275:1415-1416)。在相似的鼠研究中，从卵巢的黄体获得的细胞能够发育成成熟小鼠(Pennisi(1998)Science 281:495)。这些研究暗示具有分化成任意和所有细胞类型的能力的干细胞连续存在于成熟生物体中。因此，“胚胎”干细胞可以在整个生命过程中保留着。
使用胚胎源的细胞系的体外试验证实，可能存在中胚层干细胞。在70年代后期Taylor和同事的工作证明，例如C3H10T1/2或3T3细胞的鼠胚胎成纤维细胞，在暴露到1-10μM的5’-氮杂胞苷中后沿多重中胚层谱系路径分化(Constantinides等人(1977)Nature 267:364；Jones & Taylor(1980)Cell20:85)。在2-4周内，分离的克隆呈现出与脂肪细胞、肌细胞、软骨细胞或成骨细胞分化一致的形态。生化数据对每种这些谱系的鉴别提供了补充支持。该发现提供了鉴别骨骼肌分化的主调节转录因子myoD的基础(Lassar(1986)Cell47:649)。
成年骨髓微环境是这些假定中胚层干细胞的潜在来源。从成年骨髓分离的细胞是指各种名称，包括基质细胞、基质干细胞、间质干细胞(MSC)、间质成纤维细胞、网状内皮细胞和Westen-Bainton细胞(Gimble等人(1996)Bone 19:421-428)。体外研究表明这些细胞可能沿多重中胚层或间质谱系路径分化。这些包括，但不限于，脂肪细胞(Gimble等人(1990)Eur.J.Imunol 20:379-386；Pittenger等人(1999)Science 284:143-147；Nuttall等人(1998)JBMR 13:371-382；Park等人(1999)Bone 24:649-564)、软骨细胞(形成软骨的细胞)(Dennis等人(1999)JBMR 14:700-709)、支持造血的细胞(Gimble等人(1990)Eur.J.Immunol.20:379-386)、肌细胞(骨骼肌)(Phinney(1999)J.Cell.Biochem.72:570-585)、肌细胞(平滑肌)(Remy-Martin等人(1999)Exp.Hematol.27:1782-1795)和成骨细胞(形成骨骼的细胞)(Beresford(1989)Clin Orthop Res 240:270-280；Owen(1988)J.Cell.Sci.10:63-76；Dorheim等人(1993)J.Cell.Physiol.154:317-328；Haynesworth等人(1992)Bone 13:81-88, Kuznetsov等人(1997)JBMR 12:1335-1347)。骨髓被推荐作为骨胳、软骨、肌肉、脂肪组织和其它间质衍生器官再生的基质干细胞源。使用这些细胞的主要限制是骨髓活体解剖过程带来的困难性和危险性以及现存的收获过程相伴的记忆B细胞和造血干细胞损失。
使用骨髓多潜能干细胞的另一能生长发育的选择是脂肪组织。脂肪基质细胞提供了能够沿多重间质谱系分化的容易使用且丰富的基质细胞源。需要方法和组合物用于连续且定量地将脂肪衍生的基质细胞分化成包括例如造血基质细胞和骨骼和平滑肌肌细胞的各种细胞类型。
本发明提供了脂肪细胞分化的组合物和方法。一般来说，本发明提供了连续地且定量诱导来自皮下的、乳房的、生殖腺的或网膜的脂肪组织的基质细胞成以下全分化和功能性中胚层细胞谱系：支持造血的基质细胞、骨骼肌肌细胞和平滑肌肌细胞(肌成纤维细胞)的方法和组合物。
这些组合物包括用作扁平基质细胞的促细胞分裂剂和分化诱导剂并产生所需细胞类型的各种化学组分。这些促细胞分裂剂和诱导剂包括，但不限于，白介素、Flt-3配体、干细胞因子、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞-单核细胞集落刺激因子、红细胞生成素、血小板生成素、骨保护蛋白(osteoprotegerin)配体、地塞米松、氢化可的松、 1,25-二羟基VD3、2-巯基乙醇、谷氨酰胺、5’-氮杂胞苷、两性霉素、转化生长因子β和成纤维细胞生长因子。
本发明提供了测定这些组合物指导来自脂肪的基质细胞分化和发挥功能的能力的方法，用于转导携带调节基因的病毒载体到基质细胞中、转染携带调节基因的质粒载体到基质细胞中、跟踪和检测这些基因所编码的功能蛋白质、以及开发生物机械载体用于将这些细胞重新导入到活生物体中的方法。
本发明还提供了用于与广谱疾病状态有关的化合物和蛋白质的药物发现的方法和组合物，这些疾病状态包括，但不限于，再生障碍性贫血、肌肉营养障碍、放射中毒、神经病肌肉退化、泌尿生殖器畸形和胃肠畸形。
图1是来自人脂肪的基质细胞中LPS可诱导的细胞因子mRNA的聚合酶链反应检测。将人体脂肪衍生的基质细胞在6孔板中培养在DMEM/F 10(1∶1 v∶v)、10％胎牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml和7.5mM HEPES pH7.2中直到铺满并静止。然后将这些细胞在含100ng/ml脂多糖(LPS)的DMEM/F 10(1∶1v∶v)、2％胎牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml和7.5mM HEPES pH7.2中培养。立即(时间″0″)或4小时之后(时间″4″)收获细胞用于使用苯酚/氯仿/酸过程进行总RNA的提取和分离(Chomczynski & Sacchi(1987)AnalyticalBiochem 162:156-159)。利用以下对指示人体mRNA具有特异性的引物组，通过聚合酶链反应将总RNA的等分试样逆转录和扩增；肌动蛋白引物用作样品之间等量上样的阳性对照：肌动蛋白 正向5’AGTAACAGCCCACGGTGTTC3′
反向5’AGCCTCCGAAAGGAAATTGT3′白介素6(IL-6)正向5’GTAGCCGCCCCACACAGACAGCC3′
反向5’GCCATCTTTGGAAGGTTCAGG3′白介素8(IL-8)正向5’TCTGCAGCTCTGTGTGAAGGT3′
反向5’TGAATTCTCAGCCCTCTTCAA3′粒细胞集落刺激因子(G-CSF)
正向5’AGCTTCCTGCTCAAGTGCTTAGAG3′
反向5’TTCTTCCATCTGCTGCCAGATGGT3′巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)
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反向5’AAGGGGATGACAAGCAGAAAGTCC3′Flt3配体 正向5’TGGAGCCCAACAACCTATCTC3′
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正向5’AACAACCTCATGAACCAGATCAGGAGC3′
反向5’ATCCTTACCCGAGGTGTCAGGGCCGTAGG3′
所得PCR产品在2％琼脂糖胶上电泳，用溴化乙锭染色并照相。
表1：以抗体和PCR检测为基础鉴定脂肪衍生的基质细胞表面标记。所列的在人体脂肪衍生的基质细胞中所分析的细胞表面蛋白和基因以免疫组织化学染色、流式细胞术和/或通过聚合酶链反应为基础。标记分为表达(标为“阳性”)和未表达(标为“阴性”)。
表2：脂肪衍生的基质细胞组成型或在内毒素(LPS)诱导之后表达的细胞因子。在用100ng/ml脂多糖诱导之后从人体脂肪衍生的基质细胞分离的总RNA中分析所列细胞因子。使用所列的寡核苷酸引物检测该表中所列的细胞因子。所有细胞因子以组成型方式或诱导方式表达。
表3：LPS诱导来自脂肪的基质细胞所分泌的细胞因子的定量ELISA(pg/ml)。所列的细胞因子利用经100ng/ml LPS诱导0-24小时的人体脂肪衍生基质细胞的条件培养基来评价。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测所有细胞因子并以pg/ml条件培养基来表示。通过单向方差分析，″*″所示的那些细胞因子证明相对0小时时间点，在24小时诱导过程中有显著增加。
本发明提供了将来自脂肪组织的基质细胞分化和培养成(a)支持造血的基质细胞、(b)骨骼肌肌细胞和(c)平滑肌肌细胞(肌成纤维细胞)的方法和组合物。
脂肪组织是骨髓之外作为多潜能基质干细胞来源潜在的选择。脂肪组织易于利用并富含在许多个体中。肥胖为美国流行的群体的症状，其中超过50％的成年人超过以身高为基础推荐的BMI。在门诊病人的基础上通过抽脂肪来收获脂肪细胞。这是对大多数病人可接受的具有美容效果的相对无损伤的手术。已充分证实脂肪细胞是可补给的细胞群体。甚至在通过抽脂肪和其它过程的手术除去之后，在一段时间后在个体中看到再现脂肪细胞也是很常见的。这暗示脂肪组织含有能够自我更新的基质干细胞。病理学证据暗示脂肪的基质细胞能够沿多重中胚层谱系分化。最常见的软组织瘤-脂肉瘤是由脂肪细胞样细胞发展的。混合起源的软组织瘤较常见。这些可以包括脂肪组织、肌肉(平滑肌或骨骼肌)、软骨和/或骨骼。正如骨髓中的形成骨骼的细胞可以分化成脂肪细胞或脂细胞，这些髓外的脂肪细胞也能够形成骨骼。在具有已知为阵发性骨增生异常的罕见情况的病人中，皮下脂肪细胞不明原因地形成骨胳(Kaplan(1996)Arch.Dermatol.132:815-818)。
成人髓外来自脂肪组织的基质细胞代表了可以对病人危险极小地常规收获的基质干细胞源。它们可以在体外扩展，沿单一的中胚层谱系路径分化，遗传改造，并作为自体或异源移植再引入个体中。本发明提供了分离、鉴定成人髓外脂肪组织基质细胞和沿中胚层谱系分化的方法和组合物的例子并描述了治疗许多人体症状和疾病的用途。
本发明方法生产的细胞用于提供完全分化的功能性细胞源，以研究、移植和开发用于治疗人体疾病和外伤修补的组织工程产品。因此，一方面，本发明提供了将来自脂肪组织的基质细胞分化成3个功能不同的中胚层细胞谱系之一：支持造血的细胞、肌细胞(骨骼肌)和肌细胞(平滑肌肌成纤维细胞)的方法，该方法包括：在一组合物中培养所述细胞，该组合物包括(a)能够与可诱导基质表达造血生长因子的因子或直接添加的外源生长因子支持基质细胞和造血细胞共培养生长；(b)能够支持基质细胞生长并分化成功能性和增殖的骨骼肌细胞；(c)能够支持基质细胞生长和分化成功能性和增殖的平滑肌肌细胞或肌成纤维细胞的培养基。
另一方面，本发明提供了将来自脂肪组织的基质细胞分化成三种不同中胚层衍生谱系中每一种的组合物。这些组合物包括：
(a)来自脂肪组织的基质细胞，能够支持该基质细胞生长的培养基和能够诱导基质细胞表达造血生长因子的生长因子和试剂或者外源造血生长因子或非肽因子本身；
(b)来自脂肪组织的基质细胞，能够支持基质细胞生长的培养基，和足够将所述基质细胞分化成骨骼肌肌细胞的量的5’氮杂胞苷和/或两性霉素或其它试剂；
(c)来自脂肪组织的基质细胞，能够支持基质细胞生长的培养基，和足够诱导所述基质细胞分化成平滑肌肌细胞或肌成纤维细胞的量的转化生长因子β或其它肽生长因子。
这些方法包括培养对来自脂肪组织的基质细胞，在用于每个谱系的由以下物质组成的培养基中以约1000-25000个细胞/cm2的密度铺板后进行培养：
(a)支持造血的基质细胞-葡萄糖、诱导造血的细胞因子，包括但不限于，白介素-1,3,6,7,11,12、干细胞因子、flt-3配体、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞-单核细胞集落刺激因子、血小板生成素、红细胞生成素、骨保护蛋白配体、1,25二羟基VD3和2-巯基乙醇。这些培养基还可以含有氢化可的松、地塞米松和骨保护蛋白配体。将细胞保持在33℃(对骨髓细胞)或37℃(对B-谱系淋巴样细胞)的温度。
(b)骨骼肌肌细胞-葡萄糖，5’-氮杂胞苷或两性毒素，有限的接触时间，胎牛血清的浓度为0％-20％。该培养基还可以含有，但不限于，抗生素(例如青霉素或链霉素)、谷氨酰胺、丙酮酸钠和2-巯基乙醇。
(c)平滑肌肌细胞/肌成纤维细胞-葡萄糖和10％胎牛血清，有胶原、明胶、层粘连蛋白、纤连蛋白或其它底物或三维基质。
“脂肪基质细胞”是指起源于脂肪组织的基质细胞。“脂肪”的意思是任意脂肪组织。该脂肪组织可以为褐色或白色脂肪组织，来自皮下、网膜、内脏、乳房、生殖腺或其它脂肪组织位置。优选地，该脂肪为皮下白色脂肪组织。这些细胞可以包括原代细胞培养物或无限增殖化细胞株系。该脂肪组织可以来自具有脂肪组织的任意有机体。优选地，该脂肪组织来自哺乳动物，最优选该脂肪组织来自人体。脂肪组织的方便来源是来自脂肪抽吸手术，但是，脂肪组织的来源和分离脂肪组织的方法并不是本发明的关键。如果希望基质细胞自体移植到被试者中，那么从该被试者分离脂肪组织。
“支持造血的基质细胞”是指能够支持造血祖代细胞，还称作造血干细胞的增殖和成熟的基质细胞，从骨髓、脾、外周血或脐血获得，可以是CD34+或者CD34-。将支持造血的基质细胞与造血祖代细胞共培养将使得产生粘着和非粘着种群的造血细胞，包括但不限于骨髓细胞(巨噬细胞、嗜中性白细胞、破骨细胞)、红色的(红细胞)、淋巴细胞(B-淋巴、T-淋巴)和血小板(巨核细胞)，以及嗜酸性细胞、嗜碱细胞、肥大细胞和其它循环血细胞类型。造血细胞的生长和分化将通过包括评价特征血细胞谱系特异蛋白(例如B谱系淋巴细胞为CD45、T谱系淋巴细胞为T细胞受体、巨噬细胞为Mac-I/LFA11、破骨细胞为耐酒石酸盐的酸性磷酸酶)的表面表达的测定来检测，但不限于此。造血干细胞的增殖将在体外通过共培养衍生的造血细胞在平铺到新鲜的支持造血的基质细胞层上可以连续扩展到多重血细胞谱系、在体内共培养衍生的造血细胞能重新入住骨髓并营救经致命辐照而缺乏其自身血细胞的动物宿主的事实来评价。
“肌细胞(骨骼)”是指能够表达骨骼肌的特征生化标记(包括但不限于转录因子myoD和肌细胞生成素、骨骼肌动蛋白、肌球蛋白轻链激酶和肌球蛋白重链激酶)、骨骼肌的特征形态标记(包括但不限于多核复合体和肌节)，并且能够显示自动或对例如乙酰胆碱的外生因素作出反应的收缩功能的细胞。
“肌细胞(平滑肌、肌成纤维细胞)”是指能够表达平滑肌的特征生化标记(包括但不限于α-平滑肌肌动蛋白、纤连蛋白和β-1整联蛋白)、平滑肌的特征形态标记(包括但不限于应力纤维形成在培养物中)，和能够呈现特征平滑肌功能(包括但不限于在体外在胶原网格上产生拉伸张力)的细胞。
“造血生长因子”是指细胞因子、激素和其它蛋白试剂。这些可以在共培养系统中直接衍生自基质细胞或者可以调查者决定的浓度添加到共培养物中并获得由重组物和天然源得到的富集或精制蛋白。这些将包括但不限于以下细胞因子和激素：用于B谱系淋巴细胞的白介素7；用于造血谱系的干细胞因子；用于巨噬细胞和破骨细胞的M-CSF；用于破骨细胞的骨保护蛋白配体；用于红细胞的红细胞生成素；用于血小板和巨核细胞的血小板生成素；用于血小板、巨核细胞和B谱系淋巴细胞的白介素6。最佳浓度和处理时间可以由从业人员通过使用分化每种血细胞谱系的已知试验来测定。
“非肽生长因子”是指类固醇、视黄醇类和可诱导血细胞谱系分化的其它化合物或试剂。通常认为可以改变浓度。而且，通常认为将这些化合物或试剂以足够刺激分化的量添加。但是，一般以以下浓度使用这些物质：约1nM-约100nM的1,25二羟基VD3，约1nM-约100nM的地塞米松，约1nM-约100nM的氢化可的松，约1nM-约100nM的视黄酸，约1nM-约100nM的9-顺视黄酸，或以从业人员决定和优化的浓度。
足够诱导分化的5’氮杂胞苷和/或两性霉素的量是指5’氮杂胞苷和两性毒素的浓度，当将其用在能够支持基质细胞(例如NIH-3T3、C3H、10T1/2、来自人体脂肪组织的基质细胞等)生长的培养基中时，在约1-6周内将诱导所述基质细胞分化成骨骼肌成肌细胞和肌细胞。5’氮杂胞苷的典型使用浓度范围为约1∶M-约30∶M。两性毒素的典型使用浓度范围为约10ng/ml-约100ng/ml。最佳浓度和暴露时间可以由从业人员通过使用分化骨骼肌成肌细胞的已知试验来测定。这些试验包括，但不限于，评价与骨骼肌相关的形态或生化特征的那些试验(例如形成多核肌管、蛋白质或RNA水平上肌球蛋白重链的表达和myoD的表达)。
“足够诱导分化的转化生长因子β或其它肽生长因子的量”是指转化生长因子β或其它肽的浓度，当将它们用于能够支持基质细胞(例如NIH-3T3、C3H10T1/2、来自人体脂肪组织的基质细胞等)生长的培养基中时，它们将在1天-6周内诱导所述基质细胞分化成平滑肌肌细胞或肌成纤维细胞。转化生长因子β的浓度范围为约20ng/ml-约40ng/ml。成纤维细胞生长因子的典型使用浓度范围为约20ng/ml-约40ng/ml。暴露的最佳浓度和时间长度可以由从业人员通过使用分化平滑肌成肌细胞的已知试验测定。这些试验包括，但不限于，评价与平滑肌有关的形态或生化特性的那些试验(例如，平滑肌肌动蛋白和纤连蛋白的表达，当有凝血酶或溶血磷脂酸的情况下放在胶原网格中时产生收缩力)。
可以使用在组织培养中能够支持基质细胞的任意培养基。支持成纤维细胞生长的培养基配方包括，但不限于，Dulbecco’s Modified Eagle培养基(DMEM)、α改性的极限必需培养基(αMEM)和Roswell Park Memorial Institute Media1640(RPMI Media 1640)等。典型地，为了支持基质细胞和造血细胞生长，向上述培养基中添加0-20％的胎牛血清(FBS)。但是，如果鉴定出了FCS中基质细胞和造血细胞生长必需的生长因子、细胞因子和激素并在生长培养基中以适当浓度提供时，可以使用已知成分培养基。
用于本发明的方法的培养基可以含有一种或多种感兴趣的化合物，包括但不限于，抗生素，用于造血的促有丝分裂的化合物；干细胞，造血干细胞的分化诱导因子，和/或基质细胞的促有丝分裂因子或分化因子。用于本发明的抗生素的例子包括但不限于青霉素和链霉素。青霉素典型地以约10U/ml-约200U/ml使用。链霉素典型地以约10μg/ml-约200μg/ml使用。造血促有丝分裂因子包括但不限于干细胞因子和白介素3；造血分化诱导因子包括但不限于1,25二羟基VD3、白介素7和骨保护蛋白配体；基质细胞促细胞分裂原包括但不限于转化生长因子β；基质细胞分化因子包括但不限于地塞米松、氢化可的松、转化生长因子β等。
“来自脂肪组织的基质细胞，一种能够支持基质细胞生长的培养基和能够诱导基质细胞表达造血生长因子的生长因子和试剂，或者外源造血生长因子或非肽因子本身”是指组合物中的肽和化学物类生长因子，它们提高造血干细胞在体外和体内的增殖和成熟。这些包括，但不限于，白介素1、白介素3、白介素6、白介素7、白介素11、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干细胞因子、flt3配体、血小板生成素、红细胞生成素、骨保护蛋白配体、地塞米松、氢化可的松和1,25二羟基维生素D3。这些因子的浓度和暴露的时间长度由研究者测定和优化。白介素、M-CSF、GM-CSF、Flt3配体和干细胞因子以约5pg/ml-约1ng/ml使用。血小板生成素典型地以约5pg/ml-约1ng/ml使用。红细胞生成素以约5U/ml-约1000U/ml使用。骨保护蛋白配体以约5pg/ml-约1ng/ml使用。地塞米松、氢化可的松和1,25二羟基VD3的使用浓度为约1nM-约100nM。最佳浓度和处理时间通过监测特异循环血细胞谱系在造血干细胞和来自脂肪组织的基质细胞的共培养物中的产生来确定。通常认为将这些因子以足够刺激分化的量添加。这些试验和指标包括，但不限于，评价细胞形态或生化特征的那些，例如通过流式细胞术、免疫组织化学和/或免疫荧光法对特异血细胞谱系独有的细胞表面蛋白的表达进行检测，对特异mRNA在细胞群体中的表达进行检测，或者通过共培养系统体内评估造血干细胞的产生进行检测。
“来自脂肪组织的基质细胞，一种能够支持基质细胞生长的培养基和足够诱导所述基质细胞分化成骨骼肌肌细胞的量的氮杂胞苷和两性毒素或其它试剂”是指用于体外促进骨骼肌特异基因标记表达和骨骼肌功能的诱导分化的试剂。该培养基包括胎牛血清、抗生素、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、2-巯基乙醇和5’氮杂胞苷或两性毒素。胎牛血清可以0.5％-20％的浓度使用。抗生素典型地使用，但不限于，青霉素或链霉素。青霉素典型地以约10U/ml-约200U/ml的浓度使用。链霉素典型地以约10μg/ml-约200μg/ml的浓度使用。L-谷氨酰胺和丙酮酸钠典型地以0.5mM-约2mM使用。2-巯基乙醇典型地以约10μM-约100μM使用。5’氮杂胞苷典型地以约1μM-约30μM使用。两性毒素典型地以约10ng/ml-约100ng/ml使用。这些因子的浓度和接触的时间长度将由研究者测定和优化。最佳浓度和处理时间将通过监测骨骼肌特征性的形态和生化标记确定。这些包括，但不限于，培养中多核肌管的产生和肌特异基因和蛋白的表达，例如肌转录因子(myoD，肌细胞生成素)、肌球蛋白轻链激酶、肌球蛋白重链激酶和骨骼肌肌动蛋白。
“来自脂肪组织的基质细胞，一种能够支持基质细胞生长的培养基和足够诱导所述基质细胞分化成平滑肌肌细胞或肌成纤维细胞的量的转化生长因子β或其它肽生长因子”是指用于体外促进与平滑肌相关的基因标记和蛋白质的表达和平滑肌功能的诱导分化的条件。这些因子的浓度和暴露的时间长度将由研究者测定并优化。最佳浓度和处理时间将通过监测平滑肌细胞的形态和生化标记特征来确定。这些包括，但不限于，当细胞放在胶原Ⅰ型网格时这些细胞产生的拉伸张力以及平滑肌特异基因和蛋白质如平滑肌肌动蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白的表达。
优选地，该来自脂肪组织的基质细胞分离自待引入最终分化细胞的被试者的脂肪组织。但是，该基质细胞还可以分离自与被试者相同或不同种的任意有机体。带有脂肪组织的任意有机体可以是一潜在候选者。优选地，该有机体为哺乳动物，更优选该有机体为人体。
该来自脂肪组织的基质细胞可以使用质粒、病毒或备选载体用感兴趣的核酸稳定或瞬时转染或转导。感兴趣的核酸包括，但不限于，编码基因产品的那些；这些基因产品：(1)可增强造血细胞谱系的生长、分化、成熟和增殖；例子包括诱导破骨细胞发育的骨保扩蛋白配体，诱导B谱系淋巴细胞发育的白介素7，诱导红细胞发育的红细胞生成素，以及诱导血小板发育的血小板生成素；(2)可增强骨骼肌分化；例子包括myoD和肌细胞生成素、刺激肌管形成和骨骼肌特异基因表达的转录因子；(3)可增强平滑肌细胞的生长、分化和成熟；例子包括诱导平滑肌增殖和胞外基质产生的转化生长因子β。
造血干细胞和来自脂肪组织的基质细胞在体外共培养生产的血细胞可以单独加入或与基质组分一起加入贫血和血细胞生产有限的被试者中。它们可以包括，但不限于，接受高计量化学治疗的患者、接受骨髓移植的患者、遭受再生障碍性贫血的患者、遭受镰状细胞性贫血的患者和其它血质不调者。
可通过输入干细胞治疗的其它病症包括，但不限于，正常血细胞生产和成熟缺乏或机能障碍所致的疾病(即再生障碍性贫血和低增殖性干细胞紊乱)；造血器官中增生性、恶性疾病(例如白血病和淋巴瘤)；非造血源的广谱恶性实体瘤；自体免疫病和遗传疾病。这些紊乱包括，但不限于正常血细胞产生和成熟缺乏或机能障碍所致的疾病，包括低增殖性干细胞紊乱，由于药物、辐射或感染、自发引起的再生障碍性贫血、各类血细胞减少症、粒细胞缺失症、血小板减少症、红细胞再生不良、Blackfan-Diamond综合征；造血器官恶性肿瘤，包括急性成淋巴细胞(淋巴细胞)白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急恶性骨髓硬化、多发性骨髓瘤、真性红细胞增多、特发性骨髓外化生、Waldenstrom巨球蛋白血症、Hodgkin淋巴瘤、非Hodgkin淋巴瘤；患恶性、实体肿瘤的患者中的免疫抑制，这些肿瘤包括恶性黑素瘤、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、小细胞肺癌、成视网膜细胞瘤、睾丸癌、恶性胶质瘤、横纹肌肉瘤、成神经细胞瘤、Ewing肉瘤、淋巴瘤；自体免疫疾病，包括类风湿性关节炎、Ⅰ型糖尿病、慢性肝炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮；遗传(先天)病症，包括贫血症、家族性再生障碍、Fanconi综合征、Bloom综合症、纯红细胞再生不良(PRCA)、先天性角化不良、Blackfan-Diamond综合症、先天性红细胞生成障碍综合症Ⅰ-Ⅳ,Chwachmann-Diamond综合症、二氢叶酸还原酶缺乏症，甲酰胺基转移酶(formanino transferase)缺失症、Lesch-Nyhan综合症、先天性球形红细胞症、先天性椭圆形红细胞症、先天性裂口红细胞症、先天性Rh因子缺乏疾病、阵发性夜间血红蛋白尿，G6PD(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)变异体1,2,3，丙酮酸激酶缺失症、先天性红细胞生成素敏感性缺失症、镰状细胞疾病和特征、地中海贫血α,β,γ,met-血红蛋白血症、先天免疫紊乱、严重联合免疫缺陷疾病(SCID)、单纯淋巴细胞综合症、离子载体反应性联合免疫缺陷、带有髓盖异常的联合性免疫缺陷、核苷磷酸化酶缺乏症、粒细胞肌动蛋白缺乏症，婴儿粒细胞缺乏症、Gaucher病、腺苷脱氨酶缺乏症、Kostmann综合症，网状发育不良，先天白血球机能障碍综合症；和其它的，如骨硬化病、骨髓硬化病、获得性溶血性贫血、获得性免疫缺陷、造成原发和继发免疫缺陷的传染性病症，细菌传染病(例如布鲁氏菌病、李斯特菌病、肺结核、麻风病)，寄生虫感染病(例如疟疾、利什曼病)，真菌感染，由于老化而使淋巴样细胞组比例失常和削减的免疫功能的病症，噬吞细胞病症，Kostmann粒细胞缺乏症，慢性肉芽肿疾病，Chediak-Higachi综合症，嗜中性白细胞肌动蛋白缺乏症，嗜中性白细胞膜GP-180缺乏症，新陈代谢贮藏疾病，粘多糖沉积症，粘脂沉积症，涉及免疫机理的各种病症，Wiskott-Aldrich综合症，α1-抗胰蛋白酶缺乏症等。
通过在体外操作该来自脂肪组织的基质细胞生产的骨骼肌细胞可以单独或与组合物基质一起加入以修补继新陈代谢疾病产生的肌肉缺陷(肌营养不良、肌炎)、创伤和废用性萎缩。这些组合物包括，但不限于，胶原基质、聚乳酸聚合物、聚乙醇酸聚合物、藻酸盐或其它固体载体。
通过在体外操作该来自脂肪组织的基质细胞生产的平滑肌细胞可以单独或与组合物基质一起加入以修补平滑肌缺陷。这些缺陷可以包括，但不限于，由于在新生儿遗传性畸形或在老年个体中的外伤和肿瘤侵入继发产生的尿道膀胱壁异常，由于新生儿中遗传性畸形、老年个体中外伤或肿瘤侵入继发产生的胃肠道异常、生殖道(阴道)异常，或者用于变性手术中组织重建手术，或用于移植目的的功能性大静脉发育。复合基质可以包括，但不限于，胶原基质如猪肠粘膜下层、聚乳酸聚合物、聚乙醇酸聚合物、藻酸盐或其它固体载体。
本发明的另一目的是提供可增强或抑制来自脂肪组织的基质细胞分化成支持造血的基质细胞、骨骼肌肌细胞或平滑肌肌细胞的化合物的鉴定和研究的方法。增强以下细胞分化的化合物：(a)支持造血的基质细胞，该化合物的价值在于可以治疗特征为循环血细胞的产量降低的血恶液质且高剂量的化学治疗之后可以促进患者康复；(b)骨骼肌肌细胞，该化合物的价值在于可以治疗继遗传缺陷或外伤引起的肌骨骼疾病；或者(c)平滑肌肌细胞，该化合物的价值在于可以治疗平滑肌缺陷，包括膀胱(膀胱壁)、胃肠道(结肠、小肠)和生殖系统(阴道)缺陷。相反地，抑制以下细胞分化的化合物：(a)支持造血的基质细胞，该化合物的价值在于可以治疗特征为循环血细胞的产量过高如真性红细胞增多的血恶液质；(b)骨骼肌，该化合物的价值在于可以治疗骨骼肌源的软组织肿瘤，如横纹肌肉瘤；和(c)平滑肌，该化合物的价值在于可以治疗平滑肌源的软组织肿瘤，如平滑肌肉瘤。
可以检测任何化合物影响来自脂肪组织的基质细胞分化成支持造血的基质细胞、骨骼肌肌细胞或者平滑肌肌细胞的能力。可与待测试的化合物相容的适宜载体对本领域技术人员为已知并可以在当前版的Reminggton药物科学中找到，将其内容加入本文作为参考。
参照以下的实施例将更清楚地理解本发明的特征和优点，但并不构成对本发明的限制。
实施例1
体外来自脂肪组织的基质细胞中
细胞表面粘着分子和造血细胞因子的表达
根据1999年1月29日申请的序列号为09/240029的“人体前脂肪细胞分化成脂肪细胞的方法和组合物”中所述的方法从人体皮下脂肪组织分离基质细胞。将这些细胞以30000个细胞/cm2的密度平铺在分室玻片、6号组织培养皿或T25cm2烧瓶中。将细胞在补充有10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和7.5mMHEPES pH7.2的DMEM/Ham’s F-10中连续培养8天。这些基质细胞表达的表面蛋白通过基于免疫组织化学和/或流式细胞术的免疫学技术测定。就免疫组织化学分析而言，使用95％乙醇/5％冰醋酸固定分室玻片并与检测人细胞表面蛋白的鼠单克隆抗体一起温育。在与酶偶联的抗鼠二抗一起温育之后，通过组织化学反应检测蛋白表达。或者，通过胰蛋白酶/EDTA消化收获几瓶细胞并将其与检测特异人体表面蛋白的荧光偶联的鼠单克隆抗体一起温育。通过流式细胞术检测细胞的荧光强度。将这些试验的结果汇总于表1中。这些研究证实脂肪衍生的基质细胞表达与骨髓基质细胞的造血支持功能有关并且必要的细胞表面蛋白(Miyake等人(1990)J Exp Med 171:477-488；Miyake等人(1991)J Exp Med 173:599-607；Miyake等人(1991)J Cell Biol 114:557-565,1991；Jacobsen等人(1992)J ExpMed 176:927-935；Kincade等人(1993)Curr Top Microbiol Immunol 184:215-222Hayashi等人(2000)Leuk Lymphoma 38:265-270)。其中这些包括VCAM1、CD44、整联蛋白β1、整联蛋白α4,5(VLA-4,VLA-5)和CD9等。
用脂多糖(LPS)或内毒素(一种能够诱导骨髓基质细胞中的造血细胞因子的炎症试剂(Gimble等人(1989)Blood 74:303-311))诱导后测定脂肪衍生的基质细胞的细胞因子表达分布图。在补充有2％胎牛血清、100μg/ml链霉素、100U/ml青霉素和7.5mM HEPES pH7.2的DMEM培养基中将铺满并静止的细胞暴露在100ng/ml LPS中培养0-24小时。收获每次培养的条件培养基并贮藏在-80℃，同时通过Chomczynski和Sacchi法收获总RNA(参见Anal.Biochem.(1987)162:156-159)。表2中所示细胞因子的mRNA是使用表下面所列的寡核苷酸引物组通过聚合酶链反应测定的。在图1中证明了一典型组的反应。以酶链免疫试验为基础，以下细胞因子证实了LPS可显著诱导免疫反应蛋白表达：巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞/单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素6、7和8(IL-6、7、8)。脂肪衍生的基质细胞表达的细胞因子的分布图与能够支持骨髓、淋巴和破骨细胞在体外增殖和分化的骨髓衍生的基质细胞的分布图一致(Pietrangeli等人(1988)Eur.J.Immunol.18:863-872；Gimble等人(1989)Blood 74:303-311；Gimble等人(1992)J.Cell Biochem 50:73-82；Kelly等人(1998)Endocrinol.139:2092-2101)。
实施例2
在体外用来自脂肪组织的基质细胞层建立髓细胞生成共培养物
根据1999年1月29日申请的序列号为09/240029的“人体前脂肪细胞分化成脂肪细胞的方法和组合物”中所述的方法从人体皮下脂肪组织分离基质细胞。将这些细胞以500-20000个细胞/cm2的密度平铺。在将造血祖代细胞引入共培养系统之前将基质细胞在培养物中培养1-3天。自以下人体组织之一分离造血祖代细胞：骨髓、脐静脉/胎盘血、外周血、脾。或者使用鼠组织。在无菌条件下通过使用DMEM/10％FCS冲洗6-10周龄小鼠的骨髓腔收获鼠骨髓细胞。在无菌条件下通过物理的经过细金属筛收获鼠脾细胞。使用3种方法中的一种耗尽混合造血细胞群体的基质组分。作为第一种选择，根据已建立的技术使用抗-CD34抗原通过磁免疫珠提纯将来自血液样品的造血干细胞群体富集。作为第二种选择，通过将骨髓或其它血液样品通过一无菌G-10交联葡聚糖凝胶或尼龙羊毛柱；洗脱造血祖代细胞的同时保留基质细胞来富集造血细胞。作为第三种选择，通过以表面蛋白特征为基础的流式细胞分选术富集造血细胞。将这些造血细胞冲洗一次并用0.3％醋酸溶解红细胞以及台盼蓝染色之后使用血细胞计数器计下有核细胞的数量。以优选10-100个有核造血细胞/个平铺的基质细胞，更优选20-30个有核造血细胞/个平铺的基质细胞，最优选25-30个有核造血细胞/个平铺的基质细胞的比例，将造血细胞引入液体共培养物中。在补充有10-100nM氢化可的松或10％马血清、10-200U/ml青霉素、10-200μg/ml链霉素的由DMEM(高葡萄糖)、10％胎牛血清组成的培养基中在33℃下在5％CO2中培养细胞。每3-4天替换共培养物中一半的培养基、培养基中非粘着细胞的数量是通过血细胞计数器计数和/或流式细胞术测定的。使用主要造血细胞谱系的常规抗体标记证明非粘着细胞的表面抗原特征。这些包括，但不限于，Mac-1、Thy-1、Ig重链、Ter-81(血细胞标记)。在高达10周的时间内测定非粘着细胞群体的数量和特征。研究结束时，通过流式细胞术或免疫组织化学术测定粘着细胞层的细胞组成。作为另一种尝试，在半固体培养物中进行造血研究。如上所述制备细包，但是在另外存在2.1％甲基纤维素的情况下平铺造血祖代细胞。7-14天之后使用组织学、形态学和免疫学的标准评价形成的集落，以评估粒细胞、红细胞、巨噬细胞和单核细胞的存在情况。
实施例3
来自脂肪组织的基质细胞/造血祖代细胞
共培养物在体外保持造血祖代细胞增殖的能力
在实施例1所述的液体培养条件下建立来自脂肪组织的基质细胞/造血祖代细胞共培养物，并将其用于评价该系统在体外保持造血祖代细胞增殖的能力。使用来自人脂肪组织的基质细胞和鼠造血祖代建立共培养物。经过培养的细胞用表达可跟踪的蛋白质标记如绿色荧光蛋白质或β-半乳糖苷酶的病毒载体转导。或者，根据其来源，通过独特抗原或基因标记的表达，例如对于基质细胞为人体蛋白质的表达，对于鼠造血细胞为转基因或雄性特异标记的表达来鉴定共培养细胞。通过用胰蛋白酶/EDTA的有限培养收获建立的共培养物，并将其输入经致死辐照的有免疫缺陷的小鼠中。随时间跟踪动物。在9-14天后，处死小鼠。检查其脾的造血细胞岛或脾集落形成单元(CFU-S)的出现。或者，将小鼠保持14天或更长并通过血液学和流式细胞术试验测定其循环血细胞数。通过流式细胞术或传统病理/组织学方法用抗体试剂或固定细胞的特异DNA标记检查基质细胞和供体造血细胞的特异标记的存在。共培养细胞在受体中定殖CFU-S和/或14天后供体血细胞在宿主中保持增殖和成熟的能力是来自脂肪组织的基质细胞在体外连续扩展一些造血祖代的证据。
实施例4
在体外用来自脂肪组织的基质细胞层建立淋巴细胞生成共培养物
根据1999年1月29日申请的序列号为09/240029的“人体前脂肪细胞分化成脂肪细胞的方法和组合物”中所述的方法从人体皮下脂肪组织分离基质细胞。将这些细胞以500-20000个细胞/cm2的密度平铺。在将造血祖代细胞引入共培养系统之前将基质细胞在培养物中定殖1-3天。从以下人体组织之一分离造血祖代细胞：骨髓、脐静脉/胎盘血、外周血、脾。或者使用鼠组织。在无菌条件下通过使用RPMI/10％FCS冲洗6-10周龄小鼠的骨髓腔收获鼠骨髓。在无菌条件下通过物理的经过细金属筛收获鼠脾细胞。使用3种方法中的一种耗尽混合造血细胞群体中的基质组分。作为第一种选择，根据已建立技术使用抗-CD34抗原通过磁免疫珠提纯将来自血液样品的造血干细胞群体富集。作为第二种选择，通过将骨髓或其它血液样品通过一无菌G-10交联葡聚糖凝胶或尼龙羊毛柱；洗脱造血祖代细胞的同时保留基质细胞来富集造血细胞。作为第三种选择，通过流式细胞分选术富集造血细胞。将这些造血细胞冲洗一次并用0.3％醋酸溶解红细胞以及台盼蓝染色之后使用血细胞计数器计下有核细胞的数量。以优选10-100个有核造血细胞/1个平铺的基质细胞，更优选20-30个有核造血细胞/1个平铺的基质细胞，最优选25-30个有核造血细胞/1个平铺的基质细胞的比例，将造血细胞引入液体共培养物中。在37℃下5％CO2中，在由RPMI1640、经过预筛选的10％胎牛血清、10-200U/ml青霉素、10-200μg/ml链霉素、0.5-2mM L-谷氨酰胺、10-100μM 2-巯基乙醇组成的培养基中培养细胞。每3-4天替换共培养物中一半的培养基、培养基中非粘着细胞的数量通过血细胞计数器计数和/或流式细胞术测定。使用主要造血细胞谱系的常规抗体标记证明非粘着细胞的表面抗原特征。这些包括，但不限于，Mac-1、Thy-1、Ig重链、Ter-81(血细胞标记)。在高达10周的时间内测定非粘着细胞群体的数量和特征。研究结束时，通过流式细胞术或免疫组织化学术测定粘着细胞层的细胞组成。作为另一种尝试，在半固体培养物中进行造血研究。如上所述制备细胞，但是在另外存在2.1％甲基纤维素的情况下平铺造血祖代细胞。7-14天之后使用组织学、形态学和免疫学的标准评价形成的集落，以分析B谱系淋巴细胞以及粒细胞、红细胞、巨噬细胞和单核细胞的存在情况。或者，以从业人员测定的可提高B谱系淋巴细胞的增殖和成熟的浓度添加白介素7，如上所述建立共培养物和/或半固体培养物。将上面概括的技术用于评价该生长因子对来自脂肪组织的基质细胞的造血支持功能的影响。
实施例5
在体外用来自脂肪组织的基质细胞层建立破骨细胞细胞生成共培养物
根据1999年1月29日申请的序列号为09/240029的“人体前脂肪细胞分化成脂肪细胞的方法和组合物”中所述的方法从人体皮下脂肪组织分离基质细胞。将这些细胞以500-20000个细胞/cm2的密度平铺在24孔板中。在37℃下5％CO2中，在由DMEM(高葡萄糖)、经过预筛选的10％胎牛血清、100-2000U/ml青霉素、10-200μg/ml链霉素、0.5-2mM L-谷氨酰胺、0.5-2mM丙酮酸钠、10-100μM 2-巯基乙醇组成的培养基中培养细胞。在基质培养物建立3天之后，用10-100nM1,25二羟基VD3和/或骨保护蛋白配体以从业人员测定的浓度补充该培养基。在将造血祖代细胞引入共培养系统之前在该培养物中将基质细胞培养6天。
从以下人体组织之一分离造血祖代细胞：骨髓、脐静脉/胎盘血、外周血、脾。或者使用鼠组织。在无菌条件下通过使用DMEM(高葡萄糖)/10％FCS冲洗6-10周龄小鼠的骨髓腔收获鼠骨髓。在无菌条件下通过物理的经过细金属筛收获鼠脾细胞。使用3种方法中的一种耗尽混合造血细胞群体中的基质组分。作为第一种选择，根据已建立的技术使用抗-CD34抗原通过磁免疫珠提纯将来自血液样品的造血干细胞群体富集。作为第二种选择，通过将骨髓或其它血液样品通过一无菌G-10交联葡聚糖凝胶或尼龙羊毛柱；洗脱造血祖代细胞的同时保留基质细胞来富集造血细胞。作为第三种选择，通过以表面蛋白特征为基础的流式细胞分选术富集造血细胞。将这些造血细胞冲洗一次并用0.3％醋酸溶解红细胞以及台盼蓝染色之后使用血细胞计数器计下有核细胞的数量。以优选10-100个有核造血细胞/1个平铺的基质细胞，更优选20-30个有核造血细胞/1个平铺的基质细胞，最优选25-30个有核造血细胞/1个平铺的基质细胞的比例，将造血细胞引入液体共培养物中。每3-4天替换共培养物中一半的培养基。在加入造血细胞之后，有1,25二羟基VD3或骨保护蛋白配体的情况下连续保持共培养物。
在共培养6-9天后，用0.5ml含3.7％(vol∶vol)甲醛的磷酸盐缓冲液将共培养物固定5分钟，用丙酮∶乙醇(50∶50,vol/vol)干燥30秒钟，并用10mM酒石酸钠、40mM醋酸钠(pH5.0)、0.1mg/ml磷酸萘酯AS-MS(Sigma N-5000)和0.6mg/ml固红紫LB盐(Sigma F-3381)染色10分钟。染色的培养物在蒸馏水中经冲洗并贮藏在50％甘油/PBS中。在光学显微镜下依据细胞质的红色着色评价每孔中耐酒石酸盐的酸性磷酸酶阳性细胞的数量。计下TRAP+细胞数并将每孔中具有1-2个核的细胞与具有≥3个核的多核细胞区分开。该试验证实来自脂肪组织的基质细胞支持破骨细胞生成前体在体外分化和增殖的能力。该培养过程能够扩展和促进破骨细胞分化，在特征在于脆骨、其中病人不能产生天然破骨细胞的罕见临床状况下，该方法具有潜在的用途。该体外法提供了一种离体扩展个体拥有的破骨细胞祖代并促进其分化的方式。可以将该细胞群体再注入受影响的个体中，具有潜在短期或长期好处。该方法的无损伤性能和仅仅依赖自体细胞的潜能说明该过程可以重复用于治疗个体患者。
实施例6
来自脂肪组织的基质细胞支持的离体造血作为
骨髓移植和血液学受损患者的治疗形式的用途
实施例1-4概括的共培养模式具有用于使接受高剂量化疗、高剂量辐射处理或损及血细胞生产和骨髓功能的任意其它治疗形式的患者中的骨髓功能易于恢复的潜能。在任何选择性步骤之前，个体可以捐赠自身脂肪组织和血细胞用于以后自体移植。在损及免疫的步骤之前，可以建立和扩展该个体自身的血细胞和基质的共培养物。进行任意损及免疫的步骤后，根据标准输血术可以将患者自身的血细胞/基质细胞共培养物再输入该患者内。可以在缺少或存在外源造血细胞因子(或者将其添加到共培养物或者直接给患者)的情况下进行该步骤。这一步可以增加血细胞在患者中生产的速度，减少对细胞因子治疗的需要，以及降低化疗或其它免疫损伤操作的整个费用和危险性。利用该过程的离体性能，可以利用基质细胞提高特异血细胞谱系的产量。例如，瞬时表达白介素7的基质细胞，将促进B谱系淋巴细胞的快速扩展，同时表达红细胞生成素的基质细胞将有利于红细胞的扩展。
如上所述，最初设计该方案是为了处理医院诱导的血细胞恶液质。但是，自体基质/造血共培养物的离体大规模的生产对于手术过程中和手术之后需要输血的选择性和非选择性手术过程具有潜在价值。目前，需要输血的大多数患者接受其它人捐赠的血液制品。这具有将来被认出的传染病从供血者传播给受血者的危险性。利用离体生产血细胞的能力，个体可以不再受骨髓腔体积限制的量扩展其造血细胞群体。使用具有循环系统的细胞工厂组织培养方案，可以实现通过来自脂肪组织的基质细胞/造血细胞共培养物连续生产血细胞。该方案的优点是：避免了血液从供血者输到受血者时固有的危险性；其中这些包括例如HIV、肝炎、巨细胞病毒、Jacob/Creukzfeld疾病等传染病的传播。
实施例7
来自脂肪组织的基质细胞分化成骨骼肌成肌细胞
根据1999年1月29日申请的序列号为09/240029的“人体前脂肪细胞分化成脂肪细胞的方法和组合物”中所述的方法从人体皮下脂肪组织分离基质细胞。将这些细胞以500-20000个细胞/cm2的密度平铺在24孔板中。在37℃下5％CO2中，由DMEM(高葡萄糖)、经过预筛选的10％胎牛血清、10-200U/ml青霉素、10-200μg/ml链霉素、0.5-2mM L-谷氨酰胺、0.5-2mM丙酮酸钠、10-100μM 2-巯基乙醇组成的培养基中培养细胞。将细胞暴露到1-30μM 5’氮杂胞苷或10-100ng/ml的两性毒素中1-6天以确保整个S相的细胞连续暴露到这些试剂中。这段时间之后，在没有氮杂胞苷或两性毒素补充物的培养基中保持培养物。培养物或者以确立的细胞密度继续培养，或者通过有限稀释法亚克隆，以选择能够表达骨骼肌成肌细胞的特征标记的细胞克隆。以形态标准，特别是培养时形成多核肌管的能力；生化标准，特别是肌球蛋白重和轻链激酶、骨骼肌肌动蛋白和肌球蛋白的表达和肌细胞生成转录因子myoD和/或肌细胞生成素的表达为基础选择这些细胞。
实施例8
由来自脂肪组织的基质细胞分化的骨骼肌成肌细胞的应用
为了组织工程目的，可以将实施例6中发育的细胞骨骼肌成肌细胞用于治疗肌营养障碍、肌萎缩和继治疗癌或外伤的手术过程之后发生的骨骼肌物理损失。可以将由脂肪组织离体生成成肌细胞增殖群体用于补充和修补受折磨的个体中的骨骼肌块。成肌细胞可以在包括聚乳酸、聚乙醇酸、胶原或形成肌带的其它物质的可生物降解的基质中培养。然后可以将这些移植到受折磨位置并通过缝合固定到现存肌、腱或骨骼上。或者，可以通过病毒转导、质粒转染或表达新型基因的其它方式基因工程加工离体扩展的成肌细胞。可以将这些细胞直接注入这些新型基因产品现在将表达的现存肌肉位置。该方案直接应用到患者继重要骨骼肌基因突变之后患的肌营养障碍。同样，该工程化基质细胞可以将该肌肉转变成所缺乏的循环蛋白的生产位置。例如，表达脂蛋白脂酶的脂肪组织所衍生的基质细胞可以用于治疗其天然脂蛋白脂酶基因发生突变并处于严重心血管疾病的增加的危险性的许多患者。
实施例9
由来自脂肪组织的基质细胞离体分化和扩展平滑肌成肌细胞
根据1999年1月29日申请的序列号为09/240029的“人体前脂肪细胞分化成脂肪细胞的方法和组合物”中所述的方法从人体皮下脂肪组织分离基质细胞。将这些细胞以500-20000个细胞/cm2的密度平铺在24孔板中。在37℃下，5％CO2中，在由DMEM(高葡萄糖)、经过预筛选的10％胎牛血清、10-200U/ml青霉素、10-200μg/ml链霉素、0.5-2mM L-谷氨酰胺、0.5-2mM丙酮酸钠组成的培养基中培养细胞。用转化生长因子β和/或成纤维细胞生长因子以从业人员测定的浓度但不超过40ng/ml补充培养物。以单层培养细胞，或在包括Ⅰ型胶原或其它可生物降解的物质(藻酸盐、合成聚合物或其它)的三维网格中培养细胞。以用于平滑肌成肌细胞分化的形态、生化和功能标准表征细胞；这些标准包括，但不限于，平滑肌肌动蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白和其它胞外基质蛋白的表达，由压强转导器测定产生拉伸张力的能力和沿三维网格中拉力线组织的能力。
实施例10
由来自脂肪组织的基质细胞离体分化的平滑肌成肌细胞的应用
可以将实施例8中所述的平滑肌成肌细胞用于治疗平滑肌功能受损的情况，例如每年有超过1000个新生儿遭受膀胱壁畸形。这些病症的严重程度可以变化，但是它可以毁灭性的，并且达到可接受的修复和发挥正常功能的方案需要昂贵的手术操作。在许多情况下，膀胱太小或者膀胱壁未完全成型，需要移植假体物作为膀胱壁替换物。经过调查的方法包括使用猪肠粘膜下层作为膀胱壁的替换物。一个要点是手术移植的膀胱壁是否能实现与伸展和收缩有关的适当的物理和机械特征。这些大部分是通过功能平滑肌细胞介导的。目前的方法是没有离体预植入任意平滑肌细胞的情况下植入SIS物。外科医生依靠从包括网膜脂肪组织的邻近组织募集成纤维细胞和肌成纤维细胞。利用能够分化成平滑肌成肌细胞的来自脂肪组织的基质细胞的可获得性，能够将这些细胞与SIS材料离体预培养。在手术修补膀胱壁之前引入这些细胞预计可以促进和提高达到适宜的膀胱紧张度。该方案对所有依赖平滑肌细胞的弹性软组织器官有广泛的应用。这些器官包括，但不限于，小肠、大肠、阴道、尿道和静脉血管。该来自脂肪组织的基质细胞对任意这些器官的缺陷的手术修补都有潜在的应用。
本说明书中提及的所有出版物都代表了本发明涉及领域中的技术人员的水平。本文相同程度地参考引入公开出版物，好象每个单独的出版物被特异和独特地指出加入本文作为参考。
尽管为了清楚和理解起见通过举例详细描述了前述发明，但是显而易见，在附加权利要求书的范围内可以进行某些变化和改进。
表1：以抗体和PCR测定为基础鉴定脂肪衍生的基质细胞的表面标记
| 正标记 | 负标记 |
| CD9-Tetraspan蛋白 | CD11a |
| CD29-整联蛋白β1 | CD11b |
| CD34 | CD11c |
| CD44-透明质酸受体 | CD14 |
| CD49d,e-整联蛋白α4,5 | CD31 |
| CD54-ICAM1 | CD45 |
| CD55-衰变加速因子 | CD50-ICAM3 |
| CD56-NCAM | HLA DR(Ⅱ类) |
| CD59-补体抑制剂蛋白 | |
| CD105-Endoglin | |
| CD106-VCAM1 | |
| CD146-Muc 18 | |
| CD166-ALCAM | |
| α平滑肌肌动蛋白 | |
| 胶原Ⅰ | |
| 胶原Ⅲ | |
| 碱性磷酸酶 | |
| Ⅰ类HLA |
表2：由脂肪衍生的基质细胞组成地表达或者内毒素(LPS)诱导后表达的细胞因子
| M-CSF-巨噬细胞集落刺激因子 |
| G-CSF-粒细胞集落刺激因子 |
| GM-CSF-粒细胞/单核细胞集落刺激因子 |
| LIF-白血病抑制因子 |
| SCF-干细胞因子(c-kit配体) |
| BMP 2,4-骨形态发生蛋白2,4 |
| IL-6,7,8,11-白介素6,7,8,11 |
| Flt-3配体 |
所列细胞因子mRNA是使用以下寡核苷酸引物组通过聚合酶链反应测定的：M-CSF 正向5′TTGGGAGTGGACACCTGCAGTCT3′
反向5′CCTTGGTGAAGCAGCTCTTCAGCC3′G-CSF 正向5′AGCTTCCTGCTCAAGTGCTTAGAG3′
反向5′TTCTTCCATCTGCTGCCAGATGGT3′GM-CSF 正向5′GTCTCCTGAACCTGAGTAGAGACA3′
反向5′AAGGGGATGACAAGCAGAAAGTCC3′LIF 正向5′AACAACCTCATGAACCAGATCAGGAGC3′
反向5′ATCCTTACCCGAGGTGTCAGGGCCGTAGG3′SCF 正向5′CTCCTATTTAATCCTCTCGTC3′
反向5′TACTACCARTCTCGCTTATCCA3′BMP-2 正向5′GGAAGAACTACCAGAAACGAG3′
反向5′AGATGATCAGCCAGAGGAAAA3′BMP-4 正向5′ACCTGAGACGGGGAAGAAAA3′
反向5′TTAAAGAGGAAACGAAAAGCA3′IL-6 正向5′GTAGCCGCCCCACACAGACAGCC3′
反向5′GCCATCTTTGGAAGGTTCAGG3′IL-7 正向5′ATGTTCCATGTTTCTTTTAGGTATATCT3′
反向5′TGCATTTCTCAAATGCCCTAATCCG3′IL-8 正向5′TCTGCAGCTCTGTGTGAAGGT3′
反向5′TGAATTCTCAGCCCTCTTCAA3′IL-1I 正向5′ATGAACTGTGTTTGCCGCCTG3′
反向5′GAGCTGTAGAGCTCCCAGTGC3′Flt3配体 正向5′TGGAGCCCAACAACCTATCTC3′
反向5′GGGCTGAAAGOCACATTTGGT3′
表3：脂肪衍生的基质细胞LPS诱导后分泌的细胞因子的定量ELISA(pg/ml)
| 时间LPS | 0小时 | 1小时 | 2小时 | 4小时 | 8小时 | 24小时 |
| GM-CSF* | 1±1 | 1±0 | 3±1 | 7±2 | 17±3 | 76*±28 |
| M-CSF* | 4±3 | 76±14 | 161±29 | 304±62 | 512±98 | 977*±285 |
| IL-6* | 1±1 | 287±73 | 674±51 | 2649±495 | 6083±956 | 9204±2676 |
| IL-7* | 0.4±0.2 | 0.4±0.2 | 0.3±0.3 | 0.3±0.3 | 0.9±0.2 | 3.4*±0.7 |
| IL-8* | 0±0 | 88±42 | 225±82 | 1343±224 | 4924±1046 | 9710*±2438 |
| IL-11 | 2±2 | 2±1 | 13±6 | 14±6 | 16±6 | 19±8 |
| IL-12 | N.D. | N.D. | N.D. | N.D. | N.D. | N.D. |
(表3中的数值为来自n=5-7个基质细胞供体的平均数±平均数标准误差。使用在暴露到100ng脂多糖/ml培养基指定时间之后未经稀释、经1∶25或1∶125稀释的条件培养基进行ELISA。IL-7ELISA在0.16-10pg/ml之间呈线性，星号表示在24小时和0小时时间点之间以单向ANOVA分析时*p＜0.01。缩写：N.D.:未检出。)
Claims (79)
1．一种可用于将来自脂肪组织的基质细胞分化成可沿骨髓谱系路径或B-谱系淋巴路径增殖和分化的支持造血的基质细胞的培养基，所述培养基包括：具有或添加有足够刺激分化的量的以下组分的化学成份确定的培养基：(ⅰ)0％-20％胎牛血清，(ⅱ)抗生素，(ⅲ)白介素，(ⅳ)干细胞因子，(ⅴ)flt-3配体，(ⅵ)巨噬细胞集落刺激因子，(ⅶ)粒细胞-单核细胞集落刺激因子，(ⅷ)红细胞生成素，(ⅸ)血小板生成素，(ⅹ)骨保护蛋白配体，(ⅹⅰ)地塞米松，(ⅹⅱ)氢化可的松，(ⅹⅲ)1,25二羟基维生素D3和(ⅹⅳ)2-巯基乙醇。
2．权利要求1的培养基，其中所述化学成份确定的培养基选自由DMEM、αMEM和RPMI培养基1640组成的组。
3．权利要求1的培养基，其中所述抗生素为青霉素。
4．权利要求1的培养基，其中所述抗生素为链霉素。
5．权利要求3的培养基，其中所述青霉素以约10U/ml-约200U/ml的量存在。
6．权利要求4的培养基，其中所述链霉素以约10μg/ml-约200μg/ml的量存在。
7．权利要求1的培养基，其中所述白介素选自由白介素-1、白介素-3、白介素-6、白介素-7、白介素-11和白介素-12组成的组。
8．权利要求7的培养基，其中白介素的量为约5pg/ml-约1ng/ml。
9．权利要求1的培养基，其中所述flt-3配体以约5pg/ml-约1ng/ml的量存在。
10．权利要求1的培养基，其中所述干细胞因子以约5pg/ml-约1ng/ml的量存在。
11．权利要求1的培养基，其中所述粒细胞-单核细胞集落刺激因子以约5pg/ml-约1ng/ml的量存在。
12．权利要求1的培养基，其中所述巨噬细胞集落刺激因子以约5pg/ml-约1ng/ml的量存在。
13．权利要求1的培养基，其中所述红细胞生成素以约5U/ml-约1000U/ml的量存在。
14．权利要求1的培养基，其中所述血小板生成素以约5pg/ml-约1ng/ml的量存在。
15．权利要求1的培养基，其中所述骨保护蛋白配体以约5pg/ml-约1ng/ml的量存在。
16．权利要求1的培养基，其中所述地塞米松以约1nM-约100nM的量存在。
17．权利要求1的培养基，其中所述氢化可的松以约1nM-约100nM的量存在。
18．权利要求1的培养基，其中所述1,25二羟基维生素D3以约1nM-约100nM的量存在。
19．权利要求1的培养基，其中所述2-巯基乙醇以约10μM-约100μM的量存在。
20．权利要求1的培养基，其中所述培养基在约33℃的温度下培养骨髓细胞。
21．权利要求1的培养基，其中所述培养基在约37℃的温度下培养B-谱系淋巴细胞。
22．一种可用于将来自脂肪组织的基质细胞分化成骨骼肌肌细胞的培养基，所述培养基包括：具有或补充有足够刺激分化的量的以下组分的化学成份确定的培养基：(ⅰ)0.5％-20％胎牛血清，(ⅱ)抗生素，(ⅲ)谷氨酰胺，(ⅳ)丙酮酸钠，(ⅴ)2-巯基乙醇和(ⅵ)5’氮杂胞苷或两性毒素。
23．权利要求22的培养基，其中所述化学成份确定的培养基选自由DMEM、αMFM和RPMI培养基1640组成的组。
24．权利要求22的培养基，其中所述抗生素为青霉素。
25．权利要求22的培养基，其中所述抗生素为链霉素。
26．权利要求24的培养基，其中所述青霉素以约10U/ml-约200U/ml的量存在。
27．权利要求25的培养基，其中所述链霉素以约10μg/ml-约200μg/ml的量存在。
28．权利要求22的培养基，其中所述丙酮酸钠以约0.5mM-约2mM的量存在。
29．权利要求22的培养基，其中所述2-巯基乙醇以约10μM-约100μM的量存在。
30．权利要求22的培养基，其中所述5’氮杂胞苷以足够诱导所述基质细胞分化成骨骼肌肌细胞的量存在。
31．权利要求30的培养基，其中所述5’氮杂胞苷以约1μM-约30μM的量存在。
32．权利要求22的培养基，其中所述两性毒素以足够诱导所述基质细胞分化成骨骼肌肌细胞的量存在。
33．权利要求32的培养基，其中所述两性毒素以约10ng/ml-约100ng/ml的量存在。
34．一种可用于将来自脂肪组织的基质细胞分化成平滑肌成肌细胞的培养基，所述培养基包括：具有或补充有足够刺激分化的量的以下组分的化学成份确定的培养基：(ⅰ)0％-10％胎牛血清，(ⅱ)抗生素，(ⅲ)谷氨酰胺(ⅳ)丙酮酸钠(ⅴ)转化生长因子β或成纤维细胞生长因子和(ⅵ)由可生物降解的物质组成的三维基质。
35．权利要求34的培养基，其中所述化学成份确定的培养基选自由DMEM、αMEM和RPMI培养基1640组成的组。
36．权利要求34的培养基，其中所述抗生素为青霉素。
37．权利要求34的培养基，其中所述抗生素为链霉素。
38．权利要求36的培养基，其中所述青霉素以约10U/ml-约200U/ml的量存在。
39．权利要求37的培养基，其中所述链霉素以约10μg/ml-约200μg/ml的量存在。
40．权利要求34的培养基，其中所述丙酮酸钠以约0.5mM-约2mM的量存在。
41．权利要求34的培养基，其中所述转化生长因子β以约20ng/ml-约40ng/ml的量存在。
42．权利要求34的培养基，其中所述成纤维细胞生长因子以约20ng/ml-约40ng/ml的量存在。
43．权利要求34的培养基，其中所述可生物降解的物质选自包括胶原Ⅰ型、藻酸盐或其它合成类聚合物的组。
44．一种可用于将来自脂肪组织的基质细胞分化成可沿骨髓谱系路径或B-谱系淋巴路径增殖和分化的支持造血的基质细胞的方法，包括：
a)以大约30000个细胞/cm2的密度将述基质细胞平铺在分室玻片中；
b)将细胞在含Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)或Ham’s F-10的培养基中培养约8天；
c)用以下组分补充所述培养基：
(ⅰ)1％-20％胎牛血清
(ⅱ)抗生素
(ⅲ)白介素(ⅳ)干细胞因子(ⅴ)flt-3配体(ⅵ)巨噬细胞集落刺激因子(ⅶ)粒细胞-单核细胞集落刺激因子(ⅷ)红细胞生成素(ⅸ)血小板生成素(ⅹ)骨保护蛋白配体(ⅹⅰ)地塞米松(ⅹⅱ)氢化可的松(ⅹⅲ)1,25二羟基维生素D3和(ⅹⅲⅰ)2-巯基乙醇；和
d)使用包括但不限于免疫组织化学、流式细胞术、免疫荧光法的各种技术检测细胞群体中与骨髓谱系或B-淋巴谱系的细胞一致的细胞表面蛋白的表达和mRNA表达。
45．权利要求44的培养基，其中所述抗生素为青霉素。
46．权利要求44的培养基，其中所述抗生素为链霉素。
47．权利要求45的培养基，其中所述青霉素以约10U/ml-约200U/ml的量存在。
48．权利要求46的培养基，其中所述链霉素以约10μg/ml-约200μg/ml的量存在。
49．权利要求44的培养基，其中所述白介素选自由白介素-1、白介素-3、白介素-6、白介素-7、白介素-11和白介素-12组成的组。
50．权利要求49的培养基，其中白介素以约5pg/ml-约1ng/ml的量存在。
51．权利要求44的培养基，其中所述flt-3配体以约5pg/ml-约1ng/ml的量存在。
52．权利要求44的培养基，其中所述干细胞因子以约5pg/ml-约1ng/ml的量存在。
53．权利要求44的培养基，其中所述粒细胞-单核细胞集落刺激因子以约5pg/ml-约1ng/ml的量存在。
54．权利要求44的培养基，其中所述巨噬细胞集落刺激因子以约5pg/ml-约1ng/ml的量存在。
55．权利要求44的培养基，其中所述红细胞生成素以约5U/ml-约1000U/ml的量存在。
56．权利要求44的培养基，其中所述血小板生成素以约5pg/ml-约1ng/ml的量存在。
57．权利要求44的培养基，其中所述骨保护蛋白配体以约5pg/ml-约1ng/ml的量存在。
58．权利要求44的培养基，其中所述地塞米松以约1nM-约100nM的量存在。
59．权利要求44的培养基，其中所述氢化可的松以约1nM-约100nM的量存在。
60．权利要求44的培养基，其中所述1,25二羟基维生素D3以约1nM-约10nM的量存在。
61．权利要求1的培养基，其中所述2-巯基乙醇以约10μM-约100μM的量存在。
62．一种可用于将来自脂肪组织的基质细胞分化成骨骼肌肌细胞的方法，包括：
a)以约500-约20000个细胞/cm2的密度将所述基质细胞平铺在分室玻片中；
b)将细胞在含Dulbecco’s Modified Fagle’s Medium(DMEM)或Ham’s F-10的培养基中培养约8天；
c)用以下组分补充所述培养基：
(ⅰ)1％-10％胎牛血清
(ⅱ)抗生素
(ⅲ)谷氨酰胺(ⅳ)丙酮酸钠(ⅴ)2-巯基乙醇；
d)将细胞暴露到氮杂胞苷或两性毒素中1-6天；
e)检查所述细胞的骨骼肌成肌细胞特征性生化表型或标记。
63．权利要求62的方法，其中所述抗生素为青霉素。
64．权利要求62的方法，其中所述抗生素为链霉素。
65．权利要求63的方法，其中所述青霉素以约10U/ml-约200U/ml的量存在。
66．权利要求64的方法，其中所述链霉素以约10μg/ml-约200μg/ml的量存在。
67．权利要求62的方法，其中所述丙酮酸钠以约0.5mM-约2mM的量存在。
68．权利要求62的方法，其中所述2-巯基乙醇以约10μM-约100μM的量存在。
69．权利要求62的培养基，其中所述5’氮杂胞苷以约1μM-约30μM的量存在。
70．权利要求62的培养基，其中所述两性毒素以约10ng/ml-约100ng/ml的量存在。
71．一种可用于将来自脂肪组织的基质细胞分化成平滑肌成肌细胞的方法，包括：
a)以约500-约20000个细胞/cm2的密度将所述基质细胞平铺在分室玻片中；
b)将细胞在含Dulbecco’s Modified Fagle’s Medium(DMEM)或Ham’s F-10的培养基中维持；
c)用以下组分补充所述培养基：
(ⅰ)1％-10％胎牛血清
(ⅱ)抗生素
(ⅲ)谷氨酰胺(ⅳ)丙酮酸钠(ⅴ)转化生长因子β和/或成纤维细胞生长因子；
d)将细胞以单层维持或维持在含胶原Ⅰ型、或藻酸盐或其它可生物降解的物质的三维网格中；以及
e)以生化或功能性标准鉴定细胞以确定平滑肌分化。
72．权利要求71的方法，其中所述抗生素为青霉素。
73．权利要求71的方法，其中所述抗生素为链霉素。
74．权利要求72的方法，其中所述青霉素以约10U/ml-约200U/ml的量存在。
75．权利要求73的方法，其中所述链霉素以约10μg/ml-约200μg/ml的量存在。
76．权利要求71的方法，其中所述丙酮酸钠以约0.5mM-约2mM的量存在。
77．权利要求71的方法，其中所述转化生长因子β以约20ng/ml-约40ng/ml的量存在。
78．权利要求71的方法，其中所述成纤维细胞生长因子以约20ng/ml-约40ng/ml的量存在。
79．通过权利要求44的方法制备的造血细胞。
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