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TW202444895A - 間葉型幹細胞增殖促進劑、間葉型幹細胞用培養皿、間葉型幹細胞及培養上清液 - Google Patents

間葉型幹細胞增殖促進劑、間葉型幹細胞用培養皿、間葉型幹細胞及培養上清液 Download PDF

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TW202444895A
TW202444895A TW113110807A TW113110807A TW202444895A TW 202444895 A TW202444895 A TW 202444895A TW 113110807 A TW113110807 A TW 113110807A TW 113110807 A TW113110807 A TW 113110807A TW 202444895 A TW202444895 A TW 202444895A
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TW
Taiwan
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mesenchymal stem
culture
stem cells
cells
lysophosphatidic acid
Prior art date
Application number
TW113110807A
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English (en)
Inventor
石川格靖
阿部正通
岡本大樹
Original Assignee
日商樂敦製藥股份有限公司
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Publication date
Application filed by 日商樂敦製藥股份有限公司 filed Critical 日商樂敦製藥股份有限公司
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

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Abstract

本發明係以提供一種間葉型幹細胞之增殖性優良的培養用之培養皿為目的。 本發明為一種間葉型幹細胞增殖促進劑，其係含有16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽。本發明之間葉型幹細胞增殖促進劑較佳進一步含有18：1溶血磷脂酸、18：1溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽。本發明又包含一種間葉型幹細胞用培養皿，其係含有16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽。

Description

間葉型幹細胞增殖促進劑、間葉型幹細胞用培養皿、間葉型幹細胞及培養上清液
本發明係有關於一種間葉型幹細胞增殖促進劑、間葉型幹細胞用培養皿、間葉型幹細胞及培養上清液。
再生醫療係使用細胞或組織，而輔助並使功能不全之組織或臟器再生的醫療療法。由於此再生醫療可為對既有治療法不易因應之疾病的新穎治療法，其實用化為迫切之課題。其中，利用生物體來源幹細胞之再生醫療備受矚目而廣受研究。上述生物體來源幹細胞當中，就ES細胞、iPS細胞，係主要持續研究其作為組織再生技術。另一方面，間葉型幹細胞等成體幹細胞，除有組織損傷時修補細胞之作用以外，亦可望有抗發炎作用、免疫抑制作用等各種作用效果，而作為實現性更高的細胞療法備受矚目。
間葉型幹細胞係由Friedenstein(1982)首次分離自骨髓之具有分化多能的前驅細胞(參照非專利文獻1)。此間葉型幹細胞已知存在於骨髓、臍帶、脂肪等的各種組織，間葉型幹細胞移植係作為針對各種難治性疾病的新型治療方法備受期待(參照專利文獻1～2)。且，已有人報導間葉型幹細胞具有免疫抑制作用，或於腫瘤具累積性，且有人從事將間葉型幹細胞利用於移植後之排斥防止的研究(非專利文獻2；Stem Cell Res Ther. 2021; 12: 192.)、或利用於傳遞癌症治療藥的研究等(非專利文獻3；Cancer Res (2013) 73 (1): 364-372)。近來，已知存在與脂肪組織、胎盤、臍帶、卵膜等間質細胞同等機能的細胞，且有將間葉型幹細胞稱為間質細胞(Mesenchymal Stromal Cell)。
為培養間葉型幹細胞，已有人開發出各種培養皿(例如參照專利文獻3及4)，惟期望開發出可使更適於疾病治療的間葉型幹細胞，在保持未分化性下大量且有效地增殖的培養皿。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本特開2012-157263號公報 [專利文獻2]日本特表2012-508733號公報 [專利文獻3]美國專利公開2010/0015710號 [專利文獻4]日本特開2010-094062號公報 [非專利文獻]
[非專利文獻1]Pittenger F. M. et al., Science 284, pp.143-147, 1999 [非專利文獻2]Stem Cell Res Ther.,12, pp.192-,2021 [非專利文獻3]Cancer Res,73(1), pp.364-372,2013
[發明所欲解決之課題]
本發明係於上述情況下，以提供一種可使間葉型幹細胞，在保持未分化性下有效地增殖，亦即，以提供一種間葉型幹細胞之增殖促進效果優良的劑及間葉型幹細胞用之培養皿為目的。 [解決課題之手段]
為解決上述課題而致力研究的結果，本案發明人等發現添加有特定的溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid；LPA)之培養皿係間葉型幹細胞(mesenchymal stem (stromal) cell；MSC)的增殖性優良，而完成本發明。根據本發明，可在保持間葉型幹細胞的未分化性下促進增殖。亦即，本發明之要旨如下。
[1]一種間葉型幹細胞增殖促進劑，其係含有16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽。 [2]如[1]之間葉型幹細胞增殖促進劑，其進一步含有18：1溶血磷脂酸、18：1溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽。 [3]如[2]之間葉型幹細胞增殖促進劑，其中16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽的含量(μg/mL)相對於18：1溶血磷脂酸、18：1溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽的含量(μg/mL)的比例為0.1～10。 [4]如[1]之間葉型幹細胞增殖促進劑，其中間葉型幹細胞係源自於脂肪組織。 [5]一種間葉型幹細胞培養用添加劑，其係含有16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或其鹽。 [6]一種間葉型幹細胞用培養皿，其係含有16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽。 [7]如[6]之間葉型幹細胞用培養皿，其進一步含有18：1溶血磷脂酸、18：1溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽。 [8]如[7]之間葉型幹細胞用培養皿，其中16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽的含量(μg/mL)相對於18：1溶血磷脂酸、18：1溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽的含量(μg/mL)的比例為0.1～10。 [9]如[6]～[8]之間葉型幹細胞用培養皿，其係用於促進間葉型幹細胞之增殖。 [10]一種間葉型幹細胞，其係透過使用如[1]～[4]中任一項之間葉型幹細胞增殖促進劑、如[5]之間葉型幹細胞培養用添加劑或如[6]～[9]中任一項之間葉型幹細胞用培養皿進行培養而得。 [11]一種含有16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽的培養上清液，其係將間葉型幹細胞，以如[6]～[9]中任一項之間葉型幹細胞用培養皿進行培養而得。 [12]一種間葉型幹細胞之培養方法，其係包含在含有16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽的培養皿中培養間葉型幹細胞之步驟。 [13]如[12]之培養方法，其中上述培養為浮游・攪拌培養。 [14]一種16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽的使用，其係用於促進間葉型幹細胞之增殖。 [15]一種16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽，以及18：1溶血磷脂酸、18：1溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽的使用，其係用於促進間葉型幹細胞之增殖。 [16]一種16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽的使用，其係用於製造間葉型幹細胞增殖促進劑。 [17]一種16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽，以及18：1溶血磷脂酸、18：1溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽的使用，其係用於製造間葉型幹細胞增殖促進劑。 [18]一種促進間葉型幹細胞增殖之方法，其特徵為使用含有16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽的培養皿。 [19]一種促進間葉型幹細胞增殖之方法，其特徵為使用含有16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽，以及18：1溶血磷脂酸、18：1溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽的培養皿。 [20]一種促進間葉型幹細胞增殖之方法，其特徵為使用16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽。 [21]一種促進間葉型幹細胞增殖之方法，其特徵為使用16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽，以及18：1溶血磷脂酸、18：1溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽。 [發明之效果]
根據本發明之間葉型幹細胞增殖促進劑、間葉型幹細胞用培養皿，可使間葉型幹細胞，在保持未分化性下有效地增殖。且，以本發明之間葉型幹細胞用培養皿培養間葉型幹細胞而得之培養上清液由於富含胞外體或HGF等的各種體液性因子，而能夠適用於疾病治療等。
[實施發明之形態]
以下就本發明之間葉型幹細胞增殖促進劑、間葉型幹細胞用培養皿、間葉型幹細胞之培養方法、間葉型幹細胞及培養上清液詳細加以說明。
[間葉型幹細胞增殖促進劑] 本發明之間葉型幹細胞增殖促進劑係以含有特定的溶血磷脂酸、溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽為特徵。如使用本發明之間葉型幹細胞增殖促進劑，可使間葉型幹細胞在保持未分化性下有效地增殖。本發明之間葉型幹細胞增殖促進劑，除上述溶血磷脂酸、溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽外，在不損及本發明之效果的範圍，亦可含有其他成分。以下就本發明之間葉型幹細胞增殖促進劑詳細加以說明。
本發明中就間葉型幹細胞，「保持未分化性」之狀態係指維持向間葉型幹細胞所具有之骨細胞、軟骨細胞及脂肪細胞的分化能之狀態。
本發明中間葉型幹細胞係指具有分化成屬間葉系的一種以上之細胞(骨細胞、心肌細胞、軟骨細胞、腱細胞、脂肪細胞等)的能力，且可在維持該能力下增殖之細胞。本發明中所用之「間葉型幹細胞」之用語係指與間質細胞相同的細胞，未特別區分兩者。且，亦有時僅表記為間葉型細胞。含間葉型幹細胞之組織可舉出例如脂肪組織、臍帶、骨髓、臍帶血、子宮內膜、胎盤、羊膜、絨毛膜、蛻膜、真皮、骨骼肌、骨膜、牙囊、牙周膜、牙髓、牙胚等。本發明中的間葉型幹細胞可舉出源自於脂肪組織、臍帶、骨髓、臍帶血、子宮內膜、胎盤、羊膜、絨毛膜、蛻膜、真皮、骨骼肌、骨膜、牙囊、牙周膜、牙髓、牙胚等者，其中，較佳為源自於脂肪組織之間葉型幹細胞、源自於臍帶之間葉型幹細胞、源自於骨髓之間葉型幹細胞、源自於牙髓之間葉型幹細胞，更佳為源自於脂肪組織之間葉型幹細胞、源自於臍帶之間葉型幹細胞、源自於牙髓之間葉型幹細胞，再更佳為源自於脂肪組織之間葉型幹細胞。
本發明中脂肪組織係指含有包含脂肪細胞及微小血管細胞等的間質細胞之組織，係例如以外科式切除或抽吸哺乳動物的皮下脂肪而得的組織。
本發明中臍帶係指連結胎兒與胎盤的白色管狀組織，係由臍帶靜脈、臍帶動脈、膠狀組織(華通氏膠；Wharton’s Jelly)、臍帶基質本身等所構成，富含間葉型幹細胞。
本發明中骨髓係指充滿骨骼內腔的柔軟組織，係造血器官。骨髓中存在骨髓液，存在於其中的細胞係稱骨髓細胞。骨髓細胞除紅血球、粒細胞、巨核細胞、淋巴球、脂肪細胞等外，亦包含間葉型幹細胞、造血幹細胞、血管內皮前驅細胞等。骨髓細胞可採取自例如人類腸骨、長管骨或其他骨骼。
本發明中牙髓係指可見於牙齒核心之富含血管與神經的結締組織，意指牙胚中的齒乳突成長而成者。其係充滿牙齒內部之牙髓腔的軟組織。
本發明中的間葉型幹細胞的物種較佳為哺乳動物。哺乳動物可舉出人、馬、牛、羊、豬、狗、貓、兔、小鼠、大鼠、猴。其中，較佳為人、馬、牛、貓。
間葉型幹細胞可為由例如PromoCell公司、Lonza公司、Biological Industries公司、Veritas公司、R&D Systems公司及Corning公司等所提供的細胞，亦可為藉由本業者熟知之方法所調製的細胞。且，間葉型幹細胞可為分離自提供者之組織的初代細胞或已建立細胞株之細胞。
本發明中，溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid；LPA)為具有未取代之磷酸基的溶血磷脂質，存在烷基鏈長-雙鍵數(碳數-不飽和度)的組合不同的複數種類。上述碳數-不飽和度的組合(碳數：不飽和度)可舉出16：0、16：1、18：0、18：1、18：2、18：3、20：0、20：1、20：2、20：3、20：4、20：5、22：0、22：1、22：2、22：3、22：4、22：5、22：6等，此等當中，基於促進間葉型幹細胞之增殖之效果優良之觀點，較佳為16：0、16：1、18：0、18：1、18：2、18：3，更佳為16：0、18：1，再更佳為16：0。且，本發明之間葉型幹細胞增殖促進劑亦可含有烷基鏈長-雙鍵數(碳數-不飽和度)的組合不同的多種溶血磷脂酸。且，本發明之間葉型幹細胞增殖促進劑所含有的溶血磷脂酸可為溶血磷脂酸之衍生物。溶血磷脂酸之衍生物可舉出例如溶血磷脂醯膽鹼、溶血磷脂醯絲胺酸、溶血磷脂醯乙醇胺、溶血磷脂醯肌醇、溶血磷脂醯甘油等。本發明之間葉型幹細胞增殖促進劑所含有的溶血磷脂酸可為鹽等的任意形態。溶血磷脂酸為鹽之形態時，該鹽可舉出一鈉鹽、二鈉鹽、一鉀鹽、二鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽等。
就本發明之間葉型幹細胞增殖促進劑，由更顯著發揮本發明之效果而言，較佳含有16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽，除16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽外，亦更佳進一步含有18：1溶血磷脂酸、18：1溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽。
本發明之間葉型幹細胞增殖促進劑所含有之各溶血磷脂酸的濃度，以施用於細胞時的濃度計，為0.0025μg/mL以上1mg/mL以下，可為0.01μg/mL以上1mg/mL以下，較佳為0.1μg/mL以上100μg/mL以下，更佳為1μg/mL以上50μg/mL以下，再更佳為1.5μg/mL以上25μg/mL以下，特佳為2μg/mL以上20μg/mL以下，又更佳為2μg/mL以上10μg/mL以下，最佳為2.5μg/mL以上5μg/mL以下。
本發明之間葉型幹細胞增殖促進劑亦可混合含有多種溶血磷脂酸，此時之所有溶血磷脂酸的總濃度，以施用於細胞時的濃度計，為0.05μg/mL以上1.25mg/mL以下，較佳為0.1μg/mL以上100μg/mL以下，更佳為0.3μg/mL以上50μg/mL以下，再更佳為1μg/mL以上40μg/mL以下，特佳為2μg/mL以上30μg/mL以下，又更佳為5μg/mL以上20μg/mL以下。且，多種溶血磷脂酸的混合比率不特別限定，含有16：0溶血磷脂酸與18：1溶血磷脂酸此2種時，基於促進間葉型幹細胞之增殖之效果優良之觀點，16：0溶血磷脂酸及/或其鹽的含量(μg/mL)相對於18：1溶血磷脂酸及/或其鹽的含量(μg/mL)的比例為0.001～1000，較佳為0.01～100，更佳為0.1～10，再更佳為0.1～5，特佳為0.3～3，又更佳為0.5～1.5。
本發明之間葉型幹細胞增殖促進劑的形態不特別限定，可為上述溶血磷脂酸本身或上述溶血磷脂酸與其他成分組合而成的組成物。且，上述組成物的形態不特別限定。上述組成物可為例如用於間葉型幹細胞的培養之液體培養皿或液體培養皿的調製時等所摻混之間葉型幹細胞培養用添加劑。
本發明之間葉型幹細胞增殖促進劑之較佳實施形態為以上述濃度及/或比率含有上述溶血磷脂酸的液體培養皿。
本發明之間葉型幹細胞增殖促進劑之實施形態為液體培養皿時，本發明之間葉型幹細胞增殖促進劑係使向來週知之動物細胞培養用基礎培養皿，以上述濃度及/或比率含有上述溶血磷脂酸者。
本發明中的動物細胞培養用基礎培養皿係指含有培養動物細胞所需的碳源、氮源及無機鹽等地培養皿。此處所稱動物細胞，係指哺乳類細胞，尤為人類細胞。本發明中的動物細胞培養用基礎培養皿亦可包含生物來源原料，而考量將培養所得之細胞或其培養上清液使用於動物(含人類)之疾病的治療的可能性，基於感染性風險觀點，較佳為盡量不含生物來源原料的培養皿。
上述動物細胞培養用基礎培養皿可使用本業者熟知之動物細胞培養用培養皿。具體而言，可舉出如伊格爾培養皿之最低限度必需培養皿(MEM)、達爾伯克氏改良伊格爾培養皿(DMEM)、最低限度必需培養皿α(MEM-α)、間葉系細胞基礎培養皿(MSCBM)、Ham’s F-12及F-10培養皿、DMEM/F12培養皿、Williams培養皿E、RPMI-1640培養皿、MCDB培養皿、199培養皿、Fisher培養皿、Iscove改良達爾伯克氏培養皿(IMDM)、McCoy改良培養皿等，以及此等之混合培養皿等。
且，上述動物細胞培養用基礎培養皿可使用調整成間葉型幹細胞用之週知培養皿，可舉出例如間葉型幹細胞增殖培養皿2(Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2(Ready-to-use)PromoCell公司製)、間葉型幹細胞增殖培養皿XF(Mesenchymal Stem Cell Growth Medium XF (Ready-to-use)、PromoCell公司製)、MSCGM BulletKittm、MSCGMtm Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKittm(Lonza公司製)、人類間葉型幹細胞用無異種培養皿(MSC NutriStem(註冊商標)XF、Biological Industries公司製)、MesenCult-ACF Plus(Veritas公司製)、StemXVivotm Serum-Free Human MSC Expansion Media (R&D Systems公司、Corning公司製)、脂肪來源幹細胞用無血清培養皿(KBM ADSC-4、KOHJIN BIO公司製)、間葉型幹細胞用無血清培養皿(R：STEM Medium for hMSC High Growth、Rohto公司製)等。
本發明之間葉型幹細胞增殖促進劑之實施形態為液體培養皿時，本發明之間葉型幹細胞增殖促進劑，除上述動物細胞培養用基礎培養皿、上述溶血磷脂酸以外，亦可視需求進一步含有麩胺酸等胺基酸類、葡萄糖等醣類、氯化鈉或硫酸鎂等金屬鹽類、硒等微量金屬類、脂質類(上述溶血磷脂酸及其鹽除外)、泛酸等維生素類、白蛋白、胰島素、轉鐵蛋白、胰島素、生長因子(如表皮生長因子、鹼性纖維母細胞生長因子)、生長因子、細胞介素等蛋白質、多糖、低分子量化合物、抗生素、抗氧化劑、丙酮酸鹽、緩衝劑、無機鹽類等物質。
本發明之間葉型幹細胞增殖促進劑之實施形態為液體培養皿時，本發明之間葉型幹細胞增殖促進劑除上述動物細胞培養用基礎培養皿、上述溶血磷脂酸以外，亦可視需求含有血清。上述血清只要是不會抑制間葉型幹細胞的增殖者則不特別限定，為源自動物之血清，較佳為源自哺乳動物之血清(例如胎牛血清、人類血清等)，更佳為人類血清。本發明之間葉型幹細胞增殖促進劑中之上述血清的濃度只要是本業者所熟知的濃度範圍內即可。以醫療目的使用培養後的間葉型幹細胞時，其他動物來源成分可能成為血液媒介病原菌的感染源或異種抗原，因此本發明之間葉型幹細胞增殖促進劑係以不含血清為佳。不含血清時，亦可使用血清的替代添加物(例如Knockout Serum Replacement(KSR)(Invitrogen)、Chemically-defined Lipid concentrated(Gibco)等)。
本發明之間葉型幹細胞增殖促進劑之實施形態為液體培養皿時，滲透壓比較佳為0.9～1.1。pH較佳為6.0～9.0，更佳為6.5～8.5。且，上述液體培養皿為無菌，內毒素量較佳為2.5EU/mL以下。
本發明之間葉型幹細胞增殖促進劑可將上述成分藉由常用方法混合而製造。又，本發明之間葉型幹細胞增殖促進劑係以濃縮狀態提供，亦可為使用時稀釋之形態。
如上述說明可理解，本發明中「一種16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽的使用，其係用於促進間葉型幹細胞之增殖」、「一種16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽，以及18：1溶血磷脂酸、18：1溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽的使用，其係用於促進間葉型幹細胞之增殖」、「一種16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽的使用，其係用於製造間葉型幹細胞增殖促進劑」、「一種16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽，以及18：1溶血磷脂酸、18：1溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽的使用，其係用於製造間葉型幹細胞增殖促進劑」亦包含於其範圍。
如上述說明可理解，本發明中，「一種促進間葉型幹細胞增殖之方法，其特徵為使用含有16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽的培養皿」、「一種促進間葉型幹細胞增殖之方法，其特徵為使用16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽，以及18：1溶血磷脂酸、18：1溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽的培養皿」、「一種促進間葉型幹細胞增殖之方法，其特徵為使用16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽」、「一種促進間葉型幹細胞增殖之方法，其特徵為使用16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽，以及18：1溶血磷脂酸、18：1溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽」亦包含於其範圍。
[間葉型幹細胞用培養皿] 本發明為含有動物細胞培養用基礎培養皿與特定的溶血磷脂酸、溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽的間葉型幹細胞用培養皿。本發明之間葉型幹細胞用培養皿，由於促進間葉型幹細胞之增殖之效果優良，而能夠適用於作為用於促進幹細胞增殖。此外，本發明之間葉型幹細胞用培養皿係相當於上述本發明之間葉型幹細胞增殖促進劑之一實施形態(為液體培養皿時)。
上述溶血磷脂酸，存在烷基鏈長-雙鍵數(碳數-不飽和度)的組合不同的複數種類，具體而言，上述碳數-不飽和度的組合(碳數：不飽和度)可舉出16：0、16：1、18：0、18：1、18：2、18：3、20：0、20：1、20：2、20：3、20：4、20：5、22：0、22：1、22：2、22：3、22：4、22：5、22：6等。此等當中，基於促進間葉型幹細胞之增殖之效果優良之觀點，較佳為16：0、16：1、18：0、18：1、18：2、18：3，更佳為16：0、18：1，再更佳為16：0。且，本發明之間葉型幹細胞用培養皿亦可含有烷基鏈長-雙鍵數(碳數-不飽和度)的組合不同的多種溶血磷脂酸。且，本發明之間葉型幹細胞用培養皿所含有的溶血磷脂酸可為溶血磷脂酸之衍生物或鹽等的任意形態。就上述衍生物及鹽之具體例，可應用[間葉型幹細胞增殖促進劑]一項中的記載。
本發明之間葉型幹細胞用培養皿較佳含有16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽，除16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或其鹽外，更佳進一步含有18：1溶血磷脂酸、18：1溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽。
本發明之間葉型幹細胞用培養皿所含有的各溶血磷脂酸的濃度為0.0025μg/mL以上1mg/mL以下，可為0.01μg/mL以上1mg/mL以下，較佳為0.1μg/mL以上100μg/mL以下，更佳為1μg/mL以上50μg/mL以下，再更佳為1.5μg/mL以上25μg/mL以下，特佳為2μg/mL以上20μg/mL以下，又更佳為2μg/mL以上10μg/mL以下，最佳為2.5μg/mL以上5μg/mL以下。
本發明之間葉型幹細胞用培養皿亦可混合含有多種溶血磷脂酸，此時之所有溶血磷脂酸的總濃度較佳為0.1μg/mL以上100μg/mL以下，更佳為0.3μg/mL以上50μg/mL以下，再更佳為1μg/mL以上40μg/mL以下，特佳為2μg/mL以上30μg/mL以下，又更佳為5μg/mL以上20μg/mL以下。且，多種溶血磷脂酸的混合比率不特別限定，含有16：0溶血磷脂酸與18：1溶血磷脂酸此2種時，基於促進間葉型幹細胞之增殖之效果優良之觀點，16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽的含量(μg/mL)相對於18：1溶血磷脂酸、18：1溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽的含量(μg/mL)的比例為0.001～1000，較佳為0.01～100，更佳為0.1～10，再更佳為0.1～5，特佳為0.3～3，又更佳為0.5～1.5。
本發明之間葉型幹細胞用培養皿由於係相當於上述本發明之間葉型幹細胞增殖促進劑之一實施形態(為液體培養皿時)，就上述動物細胞培養用基礎培養皿、其他成分、特性等，可直接適用間葉型幹細胞增殖促進劑一項之液體培養皿之說明中的記載。
本發明之間葉型幹細胞用培養皿亦包含對上述液體培養皿添加凝膠化材料而形成凝膠狀者。上述凝膠化材料，只要是可使培養皿呈凝膠狀且可使用於細胞的培養者即可，可舉出例如瓊脂、瓊脂糖、海藻酸、膠原蛋白、明膠、纖維素等。此等凝膠化材料的添加濃度，只要可使培養皿呈凝膠狀即可，本業者可視需求適宜設定。只要在細胞的培養或保存條件下為凝膠狀即可，較佳為在例如-80℃～100℃之溫度範圍內的任意溫度下為凝膠狀。
[間葉型幹細胞培養用添加劑] 本發明亦包含一種間葉型幹細胞培養用添加劑，其係含有16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽。本發明之間葉型幹細胞培養用添加劑，透過含有上述特定的溶血磷脂酸、溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽，若添加於培養間葉型幹細胞時的培養皿等，由於可發揮促進間葉型幹細胞之增殖的優良效果，而能夠適用於作為間葉型幹細胞培養用及/或間葉型幹細胞增殖促進用。此外，本發明之間葉型幹細胞培養用添加劑係相當於上述本發明之間葉型幹細胞增殖促進劑之一實施形態。從而，針對本發明之間葉型幹細胞培養用添加劑的詳細說明可應用本發明之間葉型幹細胞增殖促進劑一項之記載。
[間葉型幹細胞之培養方法] 本發明亦包含一種間葉型幹細胞之培養方法，其係包含在含有特定的溶血磷脂酸、溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽的培養皿中培養間葉型幹細胞之步驟。根據本發明之培養方法，可使間葉型幹細胞，在保持未分化性下有效地增殖。
上述溶血磷脂酸，存在烷基鏈長-雙鍵數(碳數-不飽和度)的組合不同的複數種類，具體而言，上述碳數-不飽和度的組合(碳數：不飽和度)可舉出16：0、16：1、18：0、18：1、18：2、18：3、20：0、20：1、20：2、20：3、20：4、20：5、22：0、22：1、22：2、22：3、22：4、22：5、22：6等。此等當中，基於促進間葉型幹細胞之增殖之效果優良之觀點，較佳為16：0、16：1、18：0、18：1、18：2、18：3，更佳為16：0、18：1，再更佳為16：0。且，上述培養皿亦可含有烷基鏈長-雙鍵數(碳數-不飽和度)的組合不同的多種溶血磷脂酸。且，上述培養皿所含有的溶血磷脂酸可為溶血磷脂酸之衍生物或該等鹽等的任意形態。就上述衍生物及鹽之具體例，可應用[間葉型幹細胞增殖促進劑]一項中的記載。
本發明之培養方法中含有特定的溶血磷脂酸、溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽的培養皿由於係相當於上述本發明之間葉型幹細胞增殖促進劑之一實施形態(為液體培養皿時)，就上述培養皿的細節，可直接應用間葉型幹細胞增殖促進劑一項之液體培養皿之說明的記載。且，針對間葉型幹細胞之說明亦可直接應用間葉型幹細胞增殖促進劑一項之記載。
本發明之培養方法只要是包含在含有特定的溶血磷脂酸、溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽的培養皿中培養間葉型幹細胞之步驟的方法則不特別限定，除此之外可採用與往常同樣的方法。通常培養溫度為30℃～40℃，較佳為30～37℃。培養時的CO 2濃度為2%～10%，較佳為2%～7%，更佳為5%。培養時的O 2濃度為0%～100%，較佳為0.5%～22%，更佳為5～21%。且，培養中亦可視需求進行間葉型幹細胞之繼代或培養皿更換，其時間點及方法，只要適合各間葉型幹細胞亦不特別限定，可一邊觀察間葉型幹細胞之形態，一邊與往常同樣地進行。繼代數較佳為0～8，更佳為1～6。培養時間較佳為3日～50日，更佳為3日～40日，再更佳為3日～30日。播種密度可配合培養目的等適宜決定，能以低密度播種並長時間培養，或以高密度播種並採短時間培養，通常較佳為2500cells/cm 2～10000cells/cm 2，更佳為5000cells/cm 2～7500cells/cm 2。
就本發明之間葉型幹細胞之培養方法，可藉由使間葉型幹細胞貼附於細胞培養用之燒瓶、培養皿、培養盤等培養器的一般平面貼附培養來培養，或藉由使間葉型幹細胞貼附於微珠、微載體等，並使其微珠、微載體等浮游於培養皿中而進行培養之浮游培養(懸浮培養)、浮游・攪拌培養來培養，或使其貼附於微纖維等纖維狀支架來培養，或者使用球體培養。
本發明之間葉型幹細胞的培養所使用之培養器，只要是可培養間葉型幹細胞者則不特別限定，可舉出例如燒瓶、組織培養用燒瓶、培養皿、皮氏培養皿、組織用培養皿、多培養皿、微量盤、微孔板、多片式盤、多孔板、顯微玻片、室載玻片、盤皿、管、托盤、培養袋、滾筒等。
[間葉型幹細胞] 本發明亦包含一種間葉型幹細胞，其係透過使用上述本發明之間葉型幹細胞增殖促進劑、間葉型幹細胞培養用添加劑或本發明之間葉型幹細胞用培養皿進行培養而得。本發明之間葉型幹細胞，藉由在含有特定的溶血磷脂酸、溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽的培養皿中培養而成，不僅可促進增殖、存活率高且狀態良好，與習知間葉型幹細胞相比，可釋放出更多的胞外體或HGF等的各種體液性因子，而能夠適用於各種疾病的治療。
本發明之間葉型幹細胞係藉由將習知間葉型幹細胞，使用上述本發明之間葉型幹細胞增殖促進劑或本發明之間葉型幹細胞用培養皿進行培養而得。通常培養溫度為30℃～40℃，較佳為30～37℃。培養時的CO 2濃度為2%～10%，較佳為2%～7%，更佳為5%。培養時的O 2濃度為0%～100%，較佳為0.5%～22%，更佳為5%～21%。且，培養中可視需求進行間葉型幹細胞之繼代或培養皿更換，其時間點及方法，只要適合各間葉型幹細胞亦不特別限定，可一邊觀察間葉型幹細胞之形態，一邊與往常同樣地進行。繼代數較佳為0～8，更佳為1～6。培養時間較佳為3日～50日，更佳為3日～40日，再更佳為3日～30日。播種密度通常較佳為2500cells/cm 2～10000cells/cm 2，更佳為5000cells/cm 2～7500cells/cm 2。
本發明之間葉型幹細胞，藉由提高播種密度、細胞密度，可使釋放至培養上清液中的胞外體量或HGF等的各種體液性因子量增加。此種播種密度較佳為5000cells/cm 2～40000cells/cm 2，更佳為7500cells/cm 2～30000cells/cm 2，再更佳為15000cells/cm 2～20000cells/cm 2。且，藉由降低播種密度並長時間培養，亦可提高培養上清液中之胞外體或HGF等的各種體液性因子濃度。
本發明之間葉型幹細胞為CD73、CD90及CD105陽性，保持未分化性。且，本發明之間葉型幹細胞，與習知間葉型幹細胞相比，會釋放出更多的CD9、CD63陽性之胞外體。而且，本發明之間葉型幹細胞與習知間葉型幹細胞相比，會釋放出更多的肝細胞生長因子(Hepatocyte Growth Factor；HGF)、類胰島素生長因子(Insulin-like Growth Factors；IGF相關因子)、血小板來源生長因子(Platelet-Derived Growth Factor；PDGF、血管內皮細胞生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor；VEGF)等的各種體液性因子。
可使用本發明之間葉型幹細胞作為醫藥品的疾病可舉出例如軟骨退化、類風濕性關節炎、乾癬性關節炎、脊椎關節炎、變形性關節炎、痛風、牛皮癬、多發性硬化症、肌萎縮側索硬化症、阿茲海默症、帕金森氏症、充血性心臟衰竭、中風、主動脈瓣狹窄疾病、腎衰竭、狼瘡、胰臟炎、過敏、纖維化、貧血、動脈粥狀硬化、再狹窄、化療法/放射相關併發症、I型糖尿病、II型糖尿病、自體免疫性肝炎、C型肝炎、原發性膽汁性肝硬化、原發性硬化性膽管炎、暴發性肝炎、乳糜瀉、非特異性結腸炎、過敏性結膜炎、糖尿病視網膜病變、乾燥綜合症候群、葡萄膜炎、過敏性鼻炎、氣喘、石棉肺、矽肺、慢性阻塞性肺病、慢性肉芽腫性發炎、囊性纖維化、結節性多發性動脈炎、腎絲球腎炎、脈管炎、皮膚炎、HIV相關惡病質、腦型瘧疾、僵直性脊椎炎、麻風病、肺纖維化、食道癌、胃食道逆流、巴雷斯特食道症、胃癌、十二指腸癌、小腸癌、闌尾癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肛門癌、胰臟癌、肝癌、膽囊癌、脾癌、腎癌、膀胱癌、攝護腺癌、睪丸癌、子宮癌、卵巢癌、乳癌、肺癌、甲狀腺癌、纖維肌痛等。
將本發明之間葉型幹細胞作為醫藥品使用時的投予方法不特別限制，較佳微血管內投予(較佳為靜脈內投予)、腹腔內投予、腸管內投予、皮下投予等，其中更佳為血管內投予。
將本發明之間葉型幹細胞作為醫藥品使用時的投予量，可隨疾病的種類或其症狀的輕重程度、劑型、投予對象的體重等而異；對人類投予時，間葉型幹細胞可每日以1X10 5個～1X10 9個的範圍投予。對小鼠等小動物投予時，可每日以1X10 4個～1X10 9個的範圍投予，更佳為1X10 5個～1X10 9個的範圍。此外，將本發明之間葉型幹細胞作為醫藥品使用時的投予可於1日中分成1～多次來進行。且，上述投予可為單次投予或持續地進行。持續進行時，可例如以3日1次以上之頻率持續投予2次以上。
將本發明之間葉型幹細胞作為醫藥品使用時之投予對象的哺乳動物不特別限制，較佳為人、猴、小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠、牛、豬、馬、兔、綿羊、山羊、貓、狗等，其中更佳為人。且，將本發明之間葉型幹細胞作為醫藥品使用時，與作為投予對象之哺乳動物的種類一致，基於獲得對疾病之更穩定且優良的預防及/或治療效果之觀點而言係較佳。
[培養上清液] 本發明亦包含一種含有16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽的培養上清液，其係將間葉型幹細胞，以上述本發明之間葉型幹細胞用培養皿進行培養而得。本發明之培養上清液與以習知培養皿培養間葉型幹細胞而得之培養上清液相比，含有更多的CD9、CD63陽性之胞外體。甚而，亦含有更多的肝細胞生長因子(Hepatocyte Growth Factor；HGF)、類胰島素生長因子(Insulin-like Growth Factors；IGF相關因子)、血小板來源生長因子(Platelet-Derived Growth Factor)；PDGF、血管內皮細胞生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor；VEGF)等的各種體液性因子。因此，本發明之培養上清液可適用於各種疾病的治療。且，亦可適用於化妝品、食品。
(培養上清液的調製) 可將根據以下方法而得之間葉型幹細胞之培養上清液調成本發明中的培養上清液。且，亦可將由該上清液中藉由透析・超過濾等手段去除多餘成分者、將該上清液以管柱等進行分提而得之區分、使用針對特定分子之抗體等所選出之區分、藉由離心操作所取得之區分等作為本發明中的培養上清液。
取得培養上清液時所使用之培養皿為上述本發明之間葉型幹細胞用培養皿。培養上清液之取得方法只要是適於各間葉型幹細胞之培養的方法則不特別限定，通常培養溫度為30℃～40℃，較佳為30℃～37℃。培養時的CO 2濃度為2%～10%，較佳為2%～7%，更佳為5%。培養時的O 2濃度為0%～100%，較佳為0.5%～22%，更佳為5%～21%。且，培養中亦可視需求進行間葉型幹細胞之繼代或培養皿更換，其時間點及方法，只要適合各間葉型幹細胞亦不特別限定，可一邊觀察間葉型幹細胞之形態，一邊與往常同樣地進行。間葉型幹細胞之繼代數較佳為0～8，更佳為1～6。培養時間較佳為3日～50日，更佳為3日～40日，再更佳為3日～30日。播種密度通常較佳為2500cells/cm 2～10000cells/cm 2，更佳為5000cells/cm 2～7500cells/cm 2。
取得培養上清液之際，可藉由提高間葉型幹細胞之播種密度、細胞密度，而提高培養上清液中之胞外體或HGF等的各種體液性因子濃度。此種播種密度較佳為5000cells/cm 2～40000cells/cm 2，更佳為7500cells/cm 2～30000cells/cm 2，再更佳為15000cells/cm 2～20000cells/cm 2。且，藉由降低間葉型幹細胞之播種密度並長時間培養，亦可提高培養上清液中之胞外體或HGF等的各種體液性因子濃度。
取得培養上清液後，亦可將細胞進行繼代，持續在本發明之間葉型幹細胞用培養皿中的培養多次，而多次取得培養上清液。
用於取得本發明之培養上清液的培養可為使其附著於細胞培養用之燒瓶、培養皿、培養盤等而進行之平面貼附培養，亦可為使其貼附於微載體、微珠等的浮游・攪拌培養。
本發明之培養上清液，於提供時，較佳經無菌處理而呈無菌，內毒素量較佳為2.5EU/mL以下。
本發明之培養上清液可對與可使用本發明之間葉型幹細胞作為醫藥品之疾病同樣的疾病使用。且，對於作為投予對象之物種亦同。本發明之培養上清液亦可使用於準醫藥品、化妝品、食品。本發明之培養上清液作為醫藥品使用時，就其投予方法，較佳為血管內投予(較佳為靜脈內投予)、腹腔內投予、腸管內投予、皮下投予等，其中更佳為血管內投予。
將本發明之培養上清液作為醫藥品使用時的投予量，可隨疾病的種類或其症狀的輕重程度、劑型、投予對象的體重等而異。此外，將本發明之培養上清液作為醫藥品使用時的投予可於1日中分成1～多次來進行。且，上述投予可為單次投予或持續地進行。持續進行時，可例如以3日1次以上之頻率持續投予2次以上。 [實施例]
以下舉出實施例及試驗例詳細說明本發明，惟本發明不受此等實施例等所限定。
[實施例1：平面貼附培養/含LPA之培養皿之間葉型幹細胞增殖促進效果的探討-1] 將源自人類脂肪之間葉型幹細胞(AD-MSC、Promo Cell製)及源自人類臍帶之間葉型幹細胞(UC-MSC、Promo Cell製)以5,000cells/cm 2播種於貼壁細胞用T25燒瓶(Corning製)，分別以R：STEM Medium for hMSC High Growth培養皿(樂敦製藥股份有限公司製、無血清培養皿、以下記載為RS培養皿、RS或RSTEM)或RS培養皿中添加有18：1 LPA及/或16：0 LPA之培養皿進行培養。添加18：1 LPA單質、16：0 LPA單質時，係以最終濃度成為5.0μg/mL的方式添加，添加18：1 LPA與16：0 LPA此兩者時，則以最終濃度分別成為2.5μg/mL的方式添加。以各培養皿於37℃、5%CO 2條件下培養3日後，用胰蛋白酶剝離細胞，量測各燒瓶中的細胞數。將僅以未添加18：1 LPA、16：0 LPA任一者之RS培養皿培養者作為控制組(RS)，將控制組中的回收細胞數定為100%，算出各培養皿條件下之回收細胞數的相對值(%)。將結果示於圖1及2。圖1表示16：0 LPA的添加效果(AD-MSC、UC-MSC)、圖2表示添加18：1 LPA與16：0 LPA之任一者及兩者的效果(AD-MSC)。
若以添加16：0 LPA之培養皿培養，AD-MSC、UC-MSC皆可顯著促進增殖(圖1)。且，就添加18：1 LPA與16：0 LPA此兩者之培養皿，與分別單獨添加18：1 LPA或16：0 LPA之培養皿相比，對AD-MSC可獲得相乘性增殖促進效果(圖2)。
[實施例2：平面貼附培養/含LPA之培養皿之間葉型幹細胞增殖促進效果的探討-2] 將源自人類臍帶之間葉型幹細胞(UC-MSC、Promo Cell製)以5,000cells/cm 2播種於貼壁細胞用T25燒瓶(Corning公司)，以添加有18：1 LPA及/或16：0 LPA之基礎培養皿(MEM、bFGF、白蛋白、胰島素、轉鐵蛋白、3%FBS)進行培養。添加18：1 LPA單質、16：0 LPA單質時，係以最終濃度成為2.5μg/mL的方式添加，添加18：1 LPA與16：0 LPA此兩者時，則以最終濃度分別成為2.5μg/mL的方式添加。以各培養皿於37℃、5%CO 2條件下培養3日後，用胰蛋白酶剝離細胞，量測各燒瓶中的細胞數。將僅以未添加18：1 LPA、16：0 LPA任一者之RS培養皿培養者作為控制組，將控制組中的回收細胞數定為100%，算出各培養皿條件下之回收細胞數的相對值(%)。將結果示於圖3。
如圖3所示，對於UC-MSC，單獨添加18：1 LPA之培養皿及單獨添加16：0 LPA之培養皿，與基礎培養皿相比均顯示較優良的增殖促進效果。再者，添加18：1 LPA與16：0 LPA此兩者之培養皿，與控制組相比，可獲得更顯著的增殖促進效果。此外，雖未示出數據，而對於AD-MSC，亦與實施例1之情形同樣可確認添加18：1 LPA及/或16：0 LPA所產生的增殖促進效果。
[實施例3：平面貼附培養/16：0LPA與18：1LPA的濃度比的探討] 將源自人類臍帶之間葉型幹細胞(UC-MSC、Promo Cell製)以5,000cells/cm 2播種於貼壁細胞用T25燒瓶(Corning公司)，將18：1 LPA及16：0 LPA，以總添加量為5.0μg/ml固定於R：STEM Medium for hMSC High Growth培養皿(樂敦製藥製、無血清培養皿、下稱RS培養皿)或RS培養皿，使用以各種濃度比添加之培養皿進行培養。此外，以LPA之各培養皿於37℃、5%CO 2條件下培養3日後，用胰蛋白酶剝離細胞，量測各燒瓶中的細胞數。將僅以未添加18：1 LPA、16：0 LPA任一者之RS培養皿培養者作為控制組，將控制組中的回收細胞數定為100%，算出各培養皿條件下之回收細胞數的相對值(%)。將結果示於圖4。
如圖4所示，對於UC-MSC，在16：0 LPA與18：1 LPA的比為10：90～75：25下，可獲得更顯著的增殖促進效果。此外，而對於AD-MSC，亦與實施例3之情形同樣可確認添加各種濃度之18：1 LPA及16：0 LPA所產生的增殖促進效果。
[實施例4：平面貼附培養/LPA的濃度的探討] 將源自人類臍帶之間葉型幹細胞(UC-MSC、Promo Cell製)以5,000cells/cm 2播種於貼壁細胞用T25燒瓶(Corning公司)，用分別對R：STEM Medium for hMSC High Growth培養皿(樂敦製藥製、無血清培養皿、以下RS培養皿)或RS培養皿以各種濃度各等量添加18：1 LPA及16：0 LPA之培養皿進行培養。以各培養皿於37℃、5%CO 2條件下培養3日後，用胰蛋白酶剝離細胞，量測各燒瓶中的細胞數。將僅以未添加18：1 LPA、16：0 LPA任一者之RS培養皿培養者作為控制組，將控制組中的回收細胞數定為100%，算出各培養皿條件下之回收細胞數的相對值(%)。將結果示於圖5。
如圖5所示，18：1 LPA、16：0 LPA的總濃度為0.3125μg/mL以上時，顯示優良的增殖促進效果，尤為5μg/mL～20μg/mL可獲得顯著的增殖促進效果。
[實施例5：浮游培養] 將源自人類脂肪之間葉型幹細胞(AD-MSC、Promo Cell製)以7,500cells/cm 2播種於單次使用生物反應器(Able製)內的Corning(註冊商標)低濃度 Synthemax(註冊商標)II微載體(Corning公司)，以對RS培養皿或RS培養皿各添加2.5μg/mL的18：1 LPA及16：0 LPA之培養皿進行浮游培養。於37℃、5%CO 2條件下培養3日後，用胰蛋白酶剝離細胞，量測各燒瓶中的細胞數。將僅以未添加18：1 LPA、16：0 LPA任一者之RS培養皿培養者作為控制組(RS)，將控制組中的回收細胞數定為100%，算出各培養皿條件下之回收細胞數的相對值(%)。將結果示於圖6。
如圖6所示，添加18：1 LPA與16：0 LPA此兩者之培養皿，與控制組相比，對於AD-MSC可獲得更顯著的增殖促進效果。以浮游培養所得之此效果，比起平面貼附培養之情形(實施例1)更為顯著。
[實施例6：源自脂肪之間葉型幹細胞的胞外體產生評估] 將源自人類脂肪之間葉型幹細胞(AD-MSC、Promo Cell製)以5,000cells/cm 2播種於貼壁細胞用T25燒瓶(Corning製)，分別以RS培養皿(RSTEM)，以及對RS培養皿各添加2.5μg/mL的18：1 LPA及16：0 LPA之培養皿(添加LPA)進行培養。以各培養皿於37℃、5%CO 2條件下培養4日後，回收培養上清液，使用CD9、CD63ELISA套組(COSMO BIO股份有限公司製)定量胞外體量。將結果示於圖7。
如圖7所示，添加18：1 LPA及16：0 LPA之培養皿，與上述血清培養皿、RS培養皿(RSTEM)相比，培養AD-MSC而得之培養上清液中的胞外體的量為約4倍，可知藉由添加18：1 LPA及16：0 LPA，可顯著促進胞外體自AD-MSC的產生。
[實施例7：源自脂肪之間葉型幹細胞之體液性因子產生評估] 將源自人類脂肪之間葉型幹細胞(AD-MSC、Promo Cell製)以5,000cells/cm 2播種於貼壁細胞用T25燒瓶(Corning製)，分別以RS培養皿及對RS培養皿各添加2.5μg/mL的18：1 LPA及16：0 LPA之培養皿進行培養。以各培養皿於37℃、5%CO 2條件下培養4日後，回收培養上清液，以RayBio Label-Based Antibody Array解析培養上清液中的各體液性因子。
上述解析之結果，與RS培養皿相比，添加LPA(16：0與18：1的混合物)之RS培養皿，肝細胞生長因子(Hepatocyte Growth Factor；HGF)為5倍以上、類胰島素生長因子(Insulin-like Growth Factors；IGF相關因子)為2倍以上、血小板來源生長因子(Platelet-Derived Growth Factor；PDGF)為3倍以上、血管內皮細胞生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor；VEGF)為2倍以上。
[實施例8：間葉型幹細胞之貼附性的評估] 將源自人類脂肪之間葉型幹細胞(AD-MSC、Promo Cell製)以5,000cells/cm 2播種於可自市場取得之貼壁細胞用燒瓶，使用RS培養皿或對RS培養皿分別以2.5μg/mL添加18：1 LPA及16：0 LPA之培養皿(RS+LPA)於37℃、5%CO 2條件下培養3日。培養3日後，用胰蛋白酶剝離細胞，量測各燒瓶中的細胞數。將結果示於圖8。此外，使用之燒瓶的細節如下： ・Corning CellBind/Corning(註冊商標)CellBIND表面 對培養容器的聚苯乙烯表面導入含氧官能基，而使表面電荷帶負電。 ・Nunc/Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks 培養表面施有獨特的表面處理。 ・Falcon/Falcon(註冊商標)細胞培養燒瓶 培養表面施有真空氣體電漿處理。 ・Sumitomo Bakelite/附濾心封蓋之貼壁細胞培養燒瓶(綠色封蓋)培養表面施有物理親水處理。
如圖8所示，使用RS培養皿中添加有18：1 LPA及16：0 LPA之培養皿培養時，任一燒瓶中，相較於RS皆顯示良好的貼附所產生之培養性能。
[實施例9：間葉型幹細胞之增殖促進效果及培養不均度的評估] 使用3種源自人類脂肪之間葉型幹細胞(AD-MSC、Promo Cell製)的不同批次，分別以5,000cells/cm 2播種，並使用對RS培養皿或RS培養皿分別以2.5μg/mL添加18：1 LPA及16：0 LPA之培養皿(RS+LPA)於37℃、5%CO 2條件下共計培養9日。量測9日的細胞之分裂次數，示於圖9。且，比較分裂次數之批次間的不均度(變異係數)，將結果示於圖10。
如圖9所示，使用RS+LPA進行培養時，與以RS培養時相比，9日之細胞之分裂次數為約2倍，顯示良好的培養性能。且，就分裂次數之細胞批次間的不均度，使用RS+LPA培養者，與以RS培養時相比亦為不均度較小之結果。其示意使用添加LPA之培養皿培養時，間葉型幹細胞之貼附性能的改善有助於提升增殖性及減低批次(提供者)間的差異。
[實施例10：間葉型幹細胞之過繼代培養] 將源自人類脂肪之間葉型幹細胞(AD-MSC、Promo Cell製)以5,000cells/cm 2播種於貼壁細胞用燒瓶，以對RS培養皿或RS培養皿分別以2.5μg/mL添加18：1 LPA及16：0 LPA之培養皿(RS+LPA)於37℃、5%CO 2條件下每隔3～4日實施重複繼代之過繼代培養試驗。將結果示於圖11。
如圖11所示，如使用RS+LPA，可在維持AD-MSC之增殖速度的狀態下進行培養至繼代數13(P13)。
[實施例11：血管新生試驗] 將源自人類脂肪之間葉型幹細胞(AD-MSC、Promo Cell製)，於貼壁細胞用燒瓶(Corning製)中以5,000cells/cm 2播種於各培養皿(負控制組、正控制組、RSTEM、RSTEM+LPA(16：0 LPA與18：1 LPA各2.5ug/mL))，分別於37℃、5%CO 2條件下培養3日。其後，移除各培養皿並用胰蛋白酶剝離細胞後，播種於新的同種之各培養皿，以相同條件培養3日。其後，用胰蛋白酶剝離細胞，對2%FBS-HuMedia以120,000cells/cm 2播種，進而於37℃、5%CO 2條件下培養3日並回收上清液。此外，負控制組係使用2%FBS-HuMedia。且，正控制組則使用2%FBS-HuMedia中添加有hEGF(最終濃度10ng/mL)及hFGF-b(最終濃度5ng/mL)之培養皿。
對黑色96井孔孔盤於冰上各添加40ul/well的Matrigel基底膜基質(Corning製)，於37℃、5%CO 2下培養1小時以上。對經Matrigel塗覆之96well孔盤，以7,500cells/well播種分散於上述所調製之各上清液的人類臍帶靜脈內皮細胞(HUVEC)。於37℃、5%CO 2條件下培養5小時。培養後，將HUVEC進行鈣黃綠素染色。進而，以ImageJ算出HUVEC之染色面積占視野全體的比例(%)，來評估HUVEC的增殖率(各上清液的血管新生能力)。分別將染色時的照片與染色面積的比較示於圖12、表1。
如圖12及表1所示，於採RSTEM+LPA之培養上清液中，血管新生面積更大，顯著確認優良的血管新生能力。且，將各上清液進行蛋白質體分析的結果，採RSTEM+LPA之培養上清液與採RSTEM之培養上清液相比，檢測出大量已知與血管新生有關的因子(未記載數據)。
[實施例12：源自臍帶之間葉型幹細胞之增殖促進效果的評估] 使用1種源自人類臍帶之間葉型幹細胞(UC-MSC、LIFELINE公司製)之批次，分別以4000cells/cm 2播種，以RS培養皿(RSTEM)，以及各添加2.5μg/mL之18：1 LPA及16：0 LPA之培養皿(含LPA之培養皿)於37℃、5%CO 2條件下共計培養10日。量測10日的細胞之分裂次數(PDL)，示於圖13。
如圖13所示，使用含LPA之培養皿進行培養時，與以RS培養時相比，10日之細胞之分裂次數增加，顯示良好的培養性能。其示意使用添加LPA之培養皿培養時，使用源自臍帶之間葉型幹細胞時亦有助於改善增殖能力。
[實施例13：細胞表面抗原標記的評估] 將以實施例12之條件培養10日之UC-MSC冷凍保存後使用設定成37℃的恆溫槽使其熔解。熔解後的細胞懸浮液中分取3.4×10 ^6cells，以培養皿予以懸浮。離心分離後，去除上清液，以1.7mL的1%BSA・PBS予以再懸浮。將細胞懸浮液100μL與各抗體試劑以旋渦混合器攪拌後，於遮光・冰冷卻下使其反應30分鐘。反應後，用1%BSA・PBS洗淨2次，去除上清液後，添加1%BSA・PBS500μL使細胞懸浮液濃度呈均勻。將細胞懸浮液通過細胞濾網添加於管中，於7-AAD與遮光・室溫下使其反應10分鐘，藉由流式細胞儀測定各細胞表面標記。將結果示於表2。
如表2所示，可確認使用含LPA之培養皿所培養之UC‐MSC滿足國際細胞治療協會(International Society for Cellular Therapy：ISCT)所示之間葉型幹細胞之定義。
[實施例14：源自牙髓之間葉型幹細胞之增殖促進效果的評估] 使用源自人類牙髓之間葉型幹細胞(Lonza公司製)，以3000cells/cm 2播種，以RS培養皿(RSTEM)，以及各添加2.5μg/mL之18：1 LPA及16：0 LPA之培養皿(含LPA之培養皿)於37℃、5%CO 2條件下共計培養10日。將量測4日之細胞之分裂次數(PDL)的結果示於圖14。
如圖14所示，使用含LPA之培養皿進行培養時，與以既有培養皿培養時相比，4日的細胞之分裂次數增加，顯示良好的培養性能。而且，含LPA之培養皿，於7日後、10日後採取時，與採既有培養皿之培養相比顯示更良好的分裂次數。由此等結果示意，添加LPA之培養皿，對源自牙髓之間葉型幹細胞使用時亦有助於改善增殖能力。 [產業上可利用性]
根據本發明之間葉型幹細胞增殖促進劑、間葉型幹細胞用培養皿，可使間葉型幹細胞，在保持未分化性下有效地增殖。且，以本發明之間葉型幹細胞用培養皿培養間葉型幹細胞而得之培養上清液由於富含胞外體或HGF等的各種體液性因子，而能夠適用於疾病治療等。
[圖1]為表示平面貼附培養中含LPA之培養皿對間葉型幹細胞之增殖促進效果的圖。AD：源自脂肪之間葉型幹細胞、UC：源自臍帶之間葉型幹細胞 [圖2]為表示平面貼附培養中含LPA之培養皿對源自脂肪之間葉型幹細胞之增殖促進效果的圖。 [圖3]為表示平面貼附培養中含LPA之培養皿對源自臍帶之間葉型幹細胞之增殖促進效果的圖。 [圖4]為表示間葉型幹細胞之含LPA之培養皿之培養中16：0LPA與18：1LPA的濃度比的探討結果的圖。 [圖5]為表示間葉型幹細胞之含LPA之培養皿之培養中LPA濃度的探討結果的圖。 [圖6]為表示浮游・攪拌培養中含LPA之培養皿對源自脂肪之間葉型幹細胞之增殖促進效果的圖。 [圖7]為表示間葉型幹細胞之平面貼附培養中含LPA之培養皿之胞外體產生促進效果的圖。 [圖8]為表示以含LPA之培養皿培養之間葉型幹細胞之對各種培養燒瓶之貼附性評估的結果的圖。 [圖9]為表示源自脂肪之間葉型幹細胞的平面貼附培養中，探討添加於培養皿之LPA對細胞之分裂次數所提供之效果之結果的圖。 [圖10]為表示源自脂肪之間葉型幹細胞的平面貼附培養中，探討添加於培養皿之LPA對細胞之分裂次數的細胞批次間不均度所提供之效果之結果的圖。 [圖11]為表示計數源自脂肪之間葉型幹細胞以含LPA之培養皿之平面貼附培養之過繼代培養中的細胞分裂次數之結果的圖。 [圖12]為表示使用HUVEC之血管新生試驗之結果之照片的圖。 [圖13]為表示含LPA之培養皿對源自臍帶之間葉型幹細胞之分裂次數所提供之效果的圖。 [圖14]為表示含LPA之培養皿對源自牙髓之間葉型幹細胞之分裂次數所提供之效果的圖。

Claims (11)

  1. 一種間葉型幹細胞增殖促進劑，其係含有16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽。
  2. 如請求項1之間葉型幹細胞增殖促進劑，其進一步含有18：1溶血磷脂酸、18：1溶血磷脂酸之衍生物及/或其鹽。
  3. 如請求項2之間葉型幹細胞增殖促進劑，其中16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽的含量(μg/mL)相對於18：1溶血磷脂酸、18：1溶血磷脂酸之衍生物及/或其鹽的含量(μg/mL)的比例為0.1～10。
  4. 如請求項1之間葉型幹細胞增殖促進劑，其中間葉型幹細胞係源自於脂肪組織。
  5. 一種間葉型幹細胞培養用添加劑，其係含有16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽。
  6. 一種間葉型幹細胞用培養皿，其係含有16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽。
  7. 如請求項6之間葉型幹細胞用培養皿，其進一步含有18：1溶血磷脂酸、18：1溶血磷脂酸之衍生物及/或其鹽。
  8. 如請求項7之間葉型幹細胞用培養皿，其中16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽的含量(μg/mL)相對於18：1溶血磷脂酸、18：1溶血磷脂酸之衍生物及/或其鹽的含量(μg/mL)的比例為0.1～10。
  9. 如請求項6之間葉型幹細胞用培養皿，其係用於促進間葉型幹細胞之增殖。
  10. 一種間葉型幹細胞，其係透過使用如請求項1～4中任一項之間葉型幹細胞增殖促進劑、如請求項5之間葉型幹細胞培養用添加劑或如請求項6～9中任一項之間葉型幹細胞用培養皿進行培養而得。
  11. 一種含有16：0溶血磷脂酸、16：0溶血磷脂酸之衍生物及/或該等之鹽的培養上清液，其係將間葉型幹細胞，以如請求項6～9中任一項之間葉型幹細胞用培養皿進行培養而得。
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