CN119454758A - 一种间充质干细胞及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种间充质干细胞及其应用。本发明公开的MLPH⁺LPXN⁺MSCs可作为临床治疗GVHD同时促进造血干细胞移植后再生重建的细胞药物，可优先应用于移植物造血功能不良和GVHD等排异的临床治疗，为临床疾病的针对性治疗，选择合适的MSCs产品提供理论依据。MLPH⁺和LPXN⁺作为不同培养阶段MSCs产品的生物标志物，用于不同适应症疾病的治疗，为MSCs细胞药物制备的质控标准、标准化生产提供参考，在精准医疗方面具有重要的转化应用前景。

Description

一种间充质干细胞及其应用

技术领域

本公开涉及生物医药领域，特别地，本公开涉及一种间充质干细胞及其应用。

背景技术

间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）是一种具有高度分化潜能和自我更新能力的细胞。它具有低免疫原性、相对易于获取、增殖能力强等特性，目前被应用于治疗多种血液系统疾病、神经系统疾病、心血管疾病、自身免疫系统疾病等方面。基于其免疫调节和组织再生修复能力，使其在医疗和保健领域具有广泛的应用前景，可以带来巨大的健康收益。作为高级的健康保健方式，从根源上提高生活质量。

但是在临床使用时，往往对间充质干细胞例如脐带来源的间充质干细胞（UC-MSCs）的数量要求很高，这就需要对分离出的MSCs进行体外连续传代培养和大量的规模化扩增。然而体外扩增后的MSCs其功能特性会发生改变，如复制性衰老、分化潜能降低等，并且MSCs及其传代培养后的细胞为一群具有高度异质性的细胞群体，其功能上存在很大的差异，这会直接导致临床输注后的治疗效果差异较大。因此，如何制备临床治疗效果明确的MSCs药物是目前MSCs产品的技术瓶颈和亟待解决的问题。

发明内容

解决的技术问题：

针对现有技术中存在的问题：（1）缺少临床治疗效果明确的MSCs药物；（2）MSCs进行体外连续传代培养和大量的规模化扩增后，其功能特性会发生改变；（3）缺少具备造血支持等功能的MSCs群体，本公开的一个方面，是提供了一种新的间充质干细胞亚群及其在多方面新的应用。

具体地，本发明人对体外扩增和培养后不同代次的UC-MSCs进行单细胞转录组测序，将不同代次的UC-MSCs异质性群体分为不同的亚群，对同时具有免疫抑制和造血支持作用的UC-MSCs亚群进行解析并筛选出可用于富集该亚群的两个有效分子标记物MLPH⁺和LPXN⁺。用流式细胞分选的方法获得MLPH⁺LPXN⁺双阳性MSCs并在体外制备MLPH⁺LPXN⁺MSCs细胞系。采用续贯输注的治疗方法发现，MLPH⁺LPXN⁺MSCs可用于治疗GVHD，而MLPH和LPXN表达阴性的MSCs则对GVHD的治疗无效。体内和体外功能实验检测结果显示，MLPH⁺LPXN⁺MSCs体外显著支持造血细胞增殖，体内显著促进造血干/祖细胞的植入和造血重建。通过以上创造性的发明，解决了上述现有技术中存在的问题。

技术方案：

间充质干细胞在制备具有造血支持功能的产品中的用途，所述间充质干细胞携带的标志分子为MLPH⁺和LPXN⁺。

基于本公开中的研究，本公开的另一个方面，是提供了间充质干细胞在制备促进CD34⁺造血干/祖细胞和/或CD133⁺造血干/祖细胞的扩增的产品中的用途，所述间充质干细胞携带的标志分子为MLPH⁺和LPXN⁺。

在本公开的一些实施方式中，上述间充质干细胞可以在体外或体内环境下促进CD34⁺造血干/祖细胞和/或CD133⁺造血干/祖细胞的扩增。

基于本公开中的研究，本公开的另一个方面，是提供了间充质干细胞在制备促进人造血干细胞在体内的造血重建的产品中的用途，所述间充质干细胞携带的标志分子为MLPH⁺和LPXN⁺。

基于本公开中的研究，本公开的另一个方面，是提供了间充质干细胞在制备促进人造血干细胞向巨核细胞方向分化的产品中的用途，所述间充质干细胞携带的标志分子为MLPH⁺和LPXN⁺。

在本公开的一些实施方式中，上述间充质干细胞可以在体外或体内环境下促进人造血干细胞向巨核细胞方向分化。

基于本公开中的研究，本公开的另一个方面，是提供了间充质干细胞在制备具有免疫抑制功能的产品中的用途，所述间充质干细胞携带的标志分子为MLPH⁺和LPXN⁺。

基于本公开中的研究，本公开的另一个方面，是提供了间充质干细胞在制备治疗或辅助治疗移植物抗宿主病的产品中的用途，所述间充质干细胞携带的标志分子为MLPH⁺和LPXN⁺。

在本公开的一些实施方式中，上述移植物抗宿主病可以为急性移植物抗宿主病（aGVHD）或慢性移植物抗宿主病（cGVHD）。

基于本公开中的研究，本公开的另一个方面，是提供了间充质干细胞在制备治疗或辅助治疗移植物造血功能不良（Poor graft function，PGF）的产品中的用途，所述间充质干细胞携带的标志分子为MLPH⁺和LPXN⁺。

在本公开的一些实施方式中，上述间充质干细胞可以来自于，包括但不限于，脐带血、羊水、胎盘、骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝或胰腺。可以是经由上述来源中分离得到，也可以是利用现有技术中已知的方法由ES细胞或iPS细胞经诱导分化获得。可以是自体细胞，也可以是同种异体细胞（例如，商品化的同种异体间充质干细胞）。

优选地，在本公开的一些实施方式中，上述间充质干细胞为人脐带血来源的间充质干细胞。

本公开的另一个方面，是提供了一种药物组合物，所述药物组合物中包括携带的标志分子为MLPH⁺和LPXN⁺的间充质干细胞，以及药学上可接受的载体（carrier）。

在本公开的一些实施方式中，所述间充质干细胞为人脐带血来源的间充质干细胞。

在本公开的一些实施方式中，上述药物组合物中还可以包括CD34⁺的细胞和/或辅助成分。

在本公开的一些实施方式中，上述辅助成分为选自细胞因子、营养支持物质、抗氧化剂、免疫调节剂、抗凝剂或抗炎药物中的一种或几种。

在本公开的一些实施方式中，上述间充质干细胞可以为经传代培养后的子代细胞。在本公开的另一些实施方式中，上述子代细胞可以为第一代细胞、第二代细胞、第三代细胞、第四代细胞、第五代细胞、第六代细胞、第七代细胞、第八代细胞、第九代细胞、第十代细胞、第十一代细胞或第十二代细胞。优选地，在本公开的另一些实施方式中，上述子代细胞可以为第六代细胞至第九代细胞。

本公开的另一个方面，是提供了上述药物组合物的应用，所述应用为选自：

（1）制备具有造血支持功能的产品；或

（2）制备促进CD34⁺造血干/祖细胞和/或CD133⁺造血干/祖细胞的扩增的产品；或

（3）制备促进人造血干细胞在体内的造血重建的产品；或

（4）制备促进人造血干细胞向巨核细胞方向分化的产品；或

（5）制备具有免疫抑制功能的产品；或

（6）制备治疗或辅助治疗移植物抗宿主病的产品；或

（7）制备治疗或辅助治疗移植物造血功能不良的产品。

本公开的另一个方面，是提供了一种制备以下产品的方法：

（1）具有造血支持功能的产品；或

（2）促进CD34⁺造血干/祖细胞和/或CD133⁺造血干细胞的扩增的产品；或

（3）促进人造血干细胞在体内的造血重建的产品；或

（4）促进人造血干细胞向巨核细胞方向分化的产品；或

（5）具有免疫抑制功能的产品；或

（6）治疗或辅助治疗移植物抗宿主病的产品；或

（7）治疗或辅助治疗移植物造血功能不良的产品，所述方法中包括获得携带的标志分子为MLPH⁺和LPXN⁺的间充质干细胞的步骤。

在本公开的一些实施方式中，所述间充质干细胞为人脐带血来源的间充质干细胞。

本公开的另一个方面，是提供了一种治疗或辅助治疗移植物抗宿主病的方法，所述方法为向患者施用有效剂量的上述产品或上述药物组合物。

本公开的另一个方面，是提供了一种治疗或辅助治疗移植物造血功能不良的方法，所述方法为向患者施用有效剂量的上述产品或上述药物组合物。

有益效果：

本发明公开的MLPH⁺LPXN⁺MSCs可作为临床治疗GVHD同时促进造血干细胞移植后再生重建的细胞药物，可优先应用于移植物造血功能不良和GVHD等排异的临床治疗，为临床疾病的针对性治疗，选择合适的MSCs产品提供理论依据。MLPH⁺和LPXN⁺作为不同培养阶段MSCs产品的生物标志物，用于不同适应症疾病的治疗，为MSCs细胞药物制备的质控标准、标准化生产提供参考，在精准医疗方面具有重要的转化应用前景。

附图说明

图1为本公开实施例中对培养不同阶段的UC-MSCs亚群进行比较分析，对UC-MSCs亚群的造血支持（左图）功能和免疫抑制（右图）能力进行打分的结果图；

图2为本公开实施例中对培养不同代次的M+L+UC-MSCs亚群的基因表达量进行分析的结果图；

图3为本公开实施例中MLPH⁺LPXN⁺MSCs，MLPH^-LPXN^-MSCs，Mix MSCs与CB CD34⁺细胞共培养7天及单独培养CB CD34⁺细胞7天的CB CD34⁺细胞的流式检测结果图，其中，左图为CD34⁺的造血干/祖细胞的结果图，右图为CD133⁺的造血干细胞的结果图；

图4为本公开实施例中MLPH⁺LPXN⁺MSCs，MLPH^-LPXN^-MSCs，Mix MSCs与CB CD34⁺细胞共移植及单独移植CB CD34⁺细胞，移植后8周和12周，NOG小鼠外周血人的细胞植入的流式检测结果图；

图5为本公开实施例中MLPH⁺LPXN⁺ MSCs，MLPH^-LPXN^- MSCs与CB CD34⁺细胞共培养后，CB CD34⁺细胞分化为巨核细胞的百分比结果图；

图6为本公开实施例中MLPH⁺LPXN⁺ MSCs，MLPH^-LPXN^- MSCs与T细胞共培养及单独T细胞培养5天，T细胞的增殖情况结果图；

图7为本公开实施例中aGVHD的小鼠输注MLPH⁺LPXN⁺MSCs，MLPH^-LPXN^- MSCs和MixMSCs后，小鼠的生存曲线图。

具体实施方式

本发明公开了一种间充质干细胞及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。术语“一个（一种）”（“a”、“an”和“the”）包括复数指示物。术语“多个（多种）”是指两个（种）或更多个（种）。术语“如”、“例如”等旨在指示例性实施方案，而不意图限制本公开的范围。

在本公开中，当提供值范围时，应理解为除非上下文另外明确指出，否则所述范围中包括端点且在所述范围的上限与下限之间的各个中间值和在所述规定范围内的任何其它指定值或中间值以及指定值之间的较小范围内的任一值均被涵盖。

在本公开中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。

在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。分子生物学常见术语的定义可参见Lewin’s GENES, TwelfthEdition, Jocelyn E. Krebs, Elliott S. Goldstein, Stephen T. Kilpatrick, 出版社：Jones & Bartlett Learning。生物化学常见术语的定义可参见Lehninger Principlesof Biochemistry, Eighth Edition, David L. Nelson, Michael M. Cox, 出版社：W.H. Freeman。细胞生物学常见术语的定义可参见Molecular Biology of the Cell, SixthEdition, Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, David Morgan, MartinRaff, Keith Roberts, Peter Walter, 出版社：Garland Science。遗传学常见术语的定义可参见Genetics: Analysis of Genes and Genomes, Eighth Edition, Daniel L.Hartl, Maryellen Ruvolo, 出版社：Jones & Bartlett Learning。

除非另外规定，否则本文中的实验技术采用免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规技术，其可参见于如以下的标准书籍：《分子克隆实验指南（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）》;《细胞生物学实验室手册（Cell Biology: A Laboratory Handbook）》等。

1、术语：

本公开中的术语“标志分子”与“细胞标志分子”、“标志物”、“生物标志物”、“biomarker”具有相同的含义，其在本公开中可以替换使用，是指该分子的存在可以用于鉴定特定细胞或细胞类型，这些分子可以是蛋白质、糖类、脂质等生物大分子，也可以是其他具有特定生物学功能的分子。在本公开的一些实施方式中，所述标志分子为蛋白质。进一步地，在本公开的另一些实施方式中，也可以根据表达本公开所述标志分子的基因的表达差异来识别、鉴定或分选所对应的细胞群体或细胞类型。此外，可以利用现有技术中的方法分选获得携带有特定标志分子的细胞群体，例如，在本公开的一些实施方式中，可以使用流式细胞分选法（FACS）、免疫磁珠分选法（MACS）对所述细胞进行分选。

本公开中的术语“造血支持”（support human hematopoiesis）是指通过药物、输血、生长因子或其他医疗手段，帮助患者恢复或维持正常的造血功能。这通常涉及到促进骨髓中造血干细胞的增殖、分化和释放，以及改善造血微环境等。造血支持在多种临床情况下都非常重要，包括但不限于，造血干细胞移植、骨髓抑制、失血或贫血。

本公开中的术语“免疫抑制”（immune depression）是指造成免疫应答暂时或永久功能障碍的状态。具体地，是指使用免疫抑制剂药物促进对如外来蛋白等外来抗原、器官移植、骨髓和组织移植的免疫耐受性，从而有意降低对宿主免疫系统的激活或功效。现有免疫抑制剂药物的例子包括，环磷酰胺、甲氨蝶呤、CD4抗体、环孢霉素，等。降低对宿主免疫系统的激活或功效一般可以体现为对免疫细胞增殖的抑制，例如，在本公开的一些实施方式中，显著抑制了CD3⁺T细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、CD4⁺CD25⁺T细胞和CD3⁺CD25⁺T细胞的增殖。

本公开中的术语“移植物抗宿主病”（graft versus host disease，GVHD）是一种特异的免疫现象，主要发生在骨髓移植（或其他免疫活性细胞移植）后。它是由于移植物组织中的免疫活性细胞（主要是T淋巴细胞）与免疫受抑制的、组织不相容性抗原受者的组织之间发生反应所引起的。移植骨髓中的免疫活性细胞识别了受体的不同组织相容性抗原而增生分化，当这些免疫活性细胞在受体内增生到一定程度后，会把受体的某些组织或器官作为靶目标进行免疫攻击，从而产生损害。GVHD的临床表现类似于多系统的自身免疫性疾病，如Sjögren综合征、系统性红斑狼疮、硬皮病等。它可累及多个器官和系统，包括，皮肤、消化系统、肝脏、眼部，等。GVHD可分为急性和慢性两种类型，急性GVHD多发生在移植后100天以内，但也可发展为慢性损害。慢性GVHD多在100天以后出现，但也可在100天以前出现。在临床上，急性移植物抗宿主病发生率约为35%～64%，慢性移植物抗宿主病发生率约为30％～70％。

本公开中的术语“移植物造血功能不良”（Poor graft function，PGF）是同种异体干细胞移植（alloSCT）的严重并发症，其定义是在100%供体嵌合的情况下存在多系细胞减少症。同种免疫的诱导剂或增强剂，如巨细胞病毒再激活和移植物抗宿主病与PGF的发展有关。PGF的病理生理学可以被定义为与干细胞的数量或生产力相关的功能障碍，骨髓微环境成分（如间充质基质细胞和内皮细胞）的缺陷，或同种异体干细胞移植后造血的免疫抑制。

2、药物组合物：

基于本公开的研究，可以提供一种药物组合物，所述药物组合物中包括携带的标志分子为MLPH⁺和LPXN⁺的间充质干细胞，以及药学上可接受的载体。

在上述药物组合物中，所述间充质干细胞是一种多能干细胞，间充质干细胞最初在骨髓中发现，随后科学家发现它们广泛存在于人体的多种组织中，如脂肪、胎盘、脐带血等。它们属于非终末分化细胞，既有间质细胞，又有内皮细胞及上皮细胞的特征。间充质干细胞具有强大的增殖能力和多向分化潜能、免疫调节功能，并易于分离、培养、扩增和纯化。

在本公开的一些实施方式中，所述间充质干细胞可以来自于，包括但不限于，脐带血、羊水、胎盘、骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝或胰腺。可以是经由上述来源中分离得到，也可以是利用现有技术中已知的方法由ES细胞或iPS细胞经诱导分化获得。可以是自体细胞，也可以是同种异体细胞（例如，商品化的同种异体间充质干细胞）。

在本公开的一些实施方式中，可以利用现有技术中已知的方法培养所述间充质干细胞。例如，采用含有或不含有10%胎牛血清（FBS）的α-MEM或DMEM培养基，在温度（37℃）、湿度（95%）和二氧化碳浓度（5%）的条件下进行培养。不同来源的间充质干细胞在培养条件上可能有所差异。当MSCs在培养瓶中生长至一定密度时，需要进行传代培养。传代时，使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶等消化酶将细胞从瓶壁上消化下来，然后按照适当的比例进行传代。在本公开的一些实施方式中，发明人对不同培养代次的MSCs进行了研究，发现在临床输注治疗中使用的培养P6、P9代的MSCs中表达最高。因此，所述药物组合物中的间充质干细胞优选为经传代培养后的子代细胞，更优选为，第六代细胞至第九代细胞。上述细胞的代次是由原代细胞开始计算。一般地，可以利用现有技术中已知的方法计算并确定细胞的代次，例如，记录细胞群体倍增数（PDL）法，利用公式：PDL = X + 3.322(logY–logI)计算，其中，X为传代前代次，I为细胞接种前细胞数，Y为培养后细胞总数，通过此公式，可以计算出细胞在传代后的代次。再例如，利用常规培养中观察细胞密度进行估算，在常规培养条件下，如果采用1:2的传代比例，则每次传代代次加1，如果采用1:3的传代比例，则每次传代代次加1.5。在本公开的另一些实施方式中，为了更准确地达到所述药物组合物的效果，可以通过检测间充质干细胞携带的标志分子MLPH⁺和LPXN⁺的表达水平来分选该细胞群体。

在本公开的一些实施方式中，上述药物组合物为一种细胞制剂，其中还包括现有技术中已知的药学上可接受的载体（carrier）。该载体为不影响所述间充质干细胞的作用发挥，且对患者的身体状态无影响的物质。例如，在本公开的一些实施方式中，上述载体可以为生理盐水。

此外，为了实现更好的效果，上述药物组合物中除包括作为有效成分的携带的标志分子为MLPH⁺和LPXN⁺的间充质干细胞以外，在本公开的另一些实施方式中，还可以包括其他辅助分子。这些辅助分子可以为，包括但不限于，细胞因子（为了促进干细胞的增殖、分化和迁移，提高干细胞的存活率，并增强其在体内的治疗效果等，例如，表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、胰岛素样生长因子（IGF）、血小板源性生长因子（PDGF），等）、营养支持物质（为了确保其在贮存或培养过程中的正常生长和分化，例如，葡萄糖、氨基酸、维生素、无机盐，等）、抗氧化剂（为了清除自由基，减少氧化应激对干细胞的损伤，从而提高干细胞的存活率和治疗效果，例如，维生素C、维生素E、谷胱甘肽，等）、免疫调节剂、抗凝剂、抗炎药物，等，及其组合。除此以外，还可以包括其他已知的添加剂，例如，pH调节剂、稳定剂、防腐剂，等。

此外，在本公开的一些实施方式中，也可以将CD34⁺的细胞作为药物组合物的一部分，以增强治疗效果。

本公开中所述药物组合物的施用对象为人或其他哺乳动物。施用的方式可以为静脉注射、局部皮下注射、动脉注射、鼻内滴注、吸入，等。施用的次数可以为一次或多次。可根据施用对象的情况（例如，年龄、体重、健康状况、饮食、病情严重程度）调节用量，一般的，所述药物组合物中间充质干细胞的施用量为10⁵~10⁶个/次。

3、实施例：

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：具有显著造血支持和免疫抑制功能的UC-MSCs亚群的标记物筛选和富集

（1）将人脐带用PBS清洗2遍，剪成2-3厘米的小段，纵行剖开脐带，去除1条脐静脉和2条脐动脉，剥离华通胶。

（2）将华通胶剪碎后放入15厘米的培养皿中，加入5ml临床应用级别的间充质干细胞无血清培养基，待细胞长至80%-90%融合时，用干细胞温和消化酶消化，传代，传代培养至P6代使用。

（3）将P6代UC-MSCs的旧培养基吸至50ml离心管中，加入10ml PBS清洗1遍。

（4）加入5ml干细胞温和消化酶，消化3分钟，加入旧的UC-MSCs培养基，终止消化。

（5）将培养皿中的液体，吸至50ml离心管中，加入10ml PBS清洗1遍。

（6）离心，1200rpm，4℃，5分钟，弃上清，得到P6代UC-MSCs。

（7）用1ml间充质干细胞无血清培养基（含1%添加剂1）重悬细胞，过膜后吹匀，计数。

（8）根据计数结果将细胞用培养基重悬，密度为2x10⁶个/ml，按照1:100的比例，加入MLPH-FITC和LPXN-APC两种抗体，4℃，标记2h，每隔20min混匀一次。同时做全阴管和FMO管。

（9）FMO管加入2ml培养基洗抗体，全阳管加入20ml培养基洗抗体，离心，1200rpm，5分钟，4℃，弃上清，用培养基重悬，将细胞密度调整为5x10⁶个/ml，加入DAPI，上机（流式细胞仪）分选MLPH⁺LPXN⁺的细胞，MLPH^-LPXN^-的细胞，DAPI-的细胞（即Mix组）于低DNA结合的EP管中。

（10）将EP管中的细胞吹匀，接种到10cm的培养皿中，加入10ml间充质干细胞无血清培养基（含1%添加剂1），放入37℃，5%CO₂培养箱中进行培养和传代。

（11）对不同培养代次的hUC-MSCs进行单细胞转录组测序。单细胞转录组测序的原始数据去接头，过滤分布不均衡的碱基，去除含N过多的读数，运行Cell Ranger count命令，完成细胞和基因的定量，输出基因表达矩阵。运行结束后输出样本的基因表达数字矩阵，细胞注释文件和基因注释文件。单样本seurat数据质控筛选，加载Seurat包，去除低频基因，去除低频基因，去除包含基因过少的细胞。多样本整合去批次聚类，UMAP可视化。

（12）对UC-MSCs的各个亚群进行分析，筛选出同时具有显著造血支持和免疫抑制功能的亚群，命名为M+L+亚群（如图1所示）。对M+L+亚群的基因进行分析发现M+L+亚群显著高表达MLPH⁺和LPXN⁺两个蛋白，尤其在临床输注治疗中使用的培养P6至P9代的UC-MSCs中表达量最高（如图2所示）。

实施例2：MLPH⁺LPXN⁺MSCs细胞具有显著的造血支持的功能

（1）采用实施例1得到的流式分选的MLPH⁺LPXN⁺、MLPH^-LPXN^-的UC-MSCs并进行体外传代培养，获得MLPH⁺LPXN⁺MSCs和MLPH^-LPXN^-MSCs细胞系，未分选的细胞为Mix MSCs系。

（2）分别消化P6-P9代的MLPH⁺LPXN⁺ MSCs、MLPH^-LPXN^- MSCs、Mix MSCs，将MSCs的旧培养基吸至50ml离心管中，加入10ml PBS清洗后吸弃，加入5ml干细胞温和消化酶，室温消化3分钟，加入MSCs的旧培养基终止消化，离心，1200rpm，4℃，5分钟，弃上清，加入2ml间充质干细胞无血清培养基（含1%添加剂1），吹匀，进行细胞计数。

（3）将MLPH⁺LPXN⁺ MSCs，MLPH^-LPXN^- MSCs，Mix MSCs重悬为3x10⁴个/ml，往24孔板的每孔中加入1ml细胞悬液。

（4）放入37℃，5% CO₂培养箱培养过夜。

（5）吸弃MSCs的培养基，加入CB CD34⁺细胞扩增培养基，1ml/孔：SFEMII + 100ng/ml SCF + 10ng/ml TPO + 10ng/ml Flt3-L + 1% PS + 1% L-Glu。

（6）每孔分选1x10⁴个Lin^-CD34⁺的CB CD34⁺的细胞，放入37℃，5% CO₂培养箱培养7天。

（7）培养第7天，收集每孔的悬浮细胞：先轻轻晃动培养基并轻轻吸净，再向每孔中加入1ml PBE，轻轻晃动清洗并吸净，重复3次。

（8）细胞离心，1500rpm，4℃，5分钟，弃上清，1ml PBE重悬，每孔取100ul，加入DAPI，用流式分析仪进行细胞计数。

（9）每孔剩余900μl细胞，离心，1500rpm，4℃，5分钟，弃上清。

（10）标抗体，4℃，30分钟。

（11）加入2ml PBE洗去未结合的抗体，离心，1500rpm，4℃，5分钟，弃上清。

（12）100ul PBE重悬细胞，加入DAPI，流式分析仪检测，检测的配色方案如下表1：

表1

抗原	通道	体积
			hCD34	FITC	1μl
hCD90	Percp_Cy5.5	1μl
			hCD133	APC	1μl
hCD201	PE	1μl
			hCD45RA	APC-Cy7	1μl
hCD45	PE-Cy7	1μl

结果：结果显示，与MLPH^-LPXN^-MSCs细胞共培养相比，MLPH⁺LPXN⁺MSCs可以显著促进CD34⁺的造血干/祖细胞的扩增（如图3的左图所示）以及CD133⁺的造血干细胞的扩增（如图3的右图所示）。

实施例3：MLPH⁺LPXN⁺MSCs细胞显著促进人造血干细胞的体内造血重建

（1）取8周雌性NOG小鼠，1.5Gy照射，照射后6小时进行移植。

（2）使用美天旎的CD34 MicroBeads Kit富集新鲜脐血CB CD34⁺的细胞后计数。

（3）消化P3-P6代的实施例1中得到的MLPH⁺LPXN⁺ MSCs，MLPH^-LPXN^- MSCs，MixMSCs：将MSCs的旧培养基吸至50ml离心管中，加入10ml PBS清洗后吸弃，加入5ml干细胞温和消化酶，室温消化3分钟，加入MSCs的旧培养基终止消化，离心，1200rpm，4℃，5分钟，弃上清，加入2ml间充质干细胞无血清培养基（含1%添加剂1），吹匀，进行细胞计数。

（4）移植，每只鼠移植不同marker的UC-MSCs 2x10⁵个联合CB CD34⁺ 5x10⁴个，单独移植CB CD34⁺细胞组只移植CB CD34+细胞5x10⁴个。

（5）移植后8周和12周，每只小鼠采血20μl，加入2ml裂解红细胞液体室温裂红10分钟，离心，1500rpm，4℃，5分钟，弃上清，加入2ml PBE洗去ACS，离心，1500rpm，4℃，5分钟，弃上清。

（6）标抗体，4℃，30分钟。

（7）加入2ml PBE洗去未结合的抗体，离心，1500rpm，4℃，5分钟，弃上清。

（8）100ul PBE重悬细胞，加入DAPI，流式分析仪检测，检测的配色方案如下表2：

表2

抗原	通道	体积
			mCD45	Percp-Cy5.5	0.5μl
hCD45	APC-Cy7	1μl
			hCD19	PE	1μl
hCD235a	PE	1μl
			hCD33	APC	1μl
hCD3	FITC	1μl
			hCD61	PE-Cy7	1μl

结果：结果显示，与MLPH^-LPXN^-MSCs组相比，MLPH⁺LPXN⁺MSCs共移植组中人CD45⁺细胞的百分比显著增加（如图4所示），MLPH⁺LPXN⁺MSCs细胞输注显著促进了脐血来源的CD34⁺造血干细胞的体内造血重建。

实施例4：MLPH⁺LPXN⁺MSCs细胞显著促进人造血干细胞向巨核细胞方向分化

（1）消化P2-P6代的实施例1中得到的MLPH⁺LPXN⁺MSCs，MLPH^-LPXN^- MSCs，将MSCs的旧培养基吸至50ml离心管中，加入10ml PBS清洗后吸弃，加入5ml干细胞温和消化酶，室温消化3分钟，加入MSCs的旧培养基终止消化，离心，1200rpm，4℃，5分钟，弃上清，加入2ml间充质干细胞无血清培养基（含1%添加剂1），吹匀，进行细胞计数。

（2）将MLPH⁺LPXN⁺MSCs，MLPH^-LPXN^-MSCs重悬为3x10⁴个/ml，往24孔板的每孔中加入1ml细胞悬液。

（3）放入37℃，5% CO₂培养箱培养过夜。

（4）吸弃MSCs的培养基，加入巨核细胞分化培养基，1ml/孔：SFEMII + 25ng/mlSCF + 10ng/ml TPO + 10ng/ml Flt3-L + 1% PS + 1% L-Glu + 2.5ng/ml IL3 + 2.5ng/ml IL6。

（5）每孔分选1x10⁴个Lin^-CD34⁺的CB CD34⁺的细胞，放入37℃，5% CO₂培养箱培养14天，每周半量换液。

（6）培养第14天，收集每孔的悬浮细胞：先轻轻晃动培养基并轻轻吸净，再向每孔中加入1ml PBE，轻轻晃动清洗并吸净，重复3次。

（7）细胞离心，1500rpm，4℃，5分钟，弃上清。

（8）标抗体，4℃，30分钟。

（9）加入2ml PBE洗去未结合的抗体，离心，1500rpm，4℃，5分钟，弃上清。

（10）100ul PBE重悬细胞，加入DAPI，流式分析仪检测，检测的配色方案如下表3：

表3

抗原	通道	体积
			hCD45	APC-Cy7	1μl
hCD14	PE-Cy7	1μl
			hCD15	FITC	1μl
hCD235a	PE	1μl
			hCD56	Percp-cy5.5	1μl
hCD41a	APC	1μl

结果：结果显示，与MLPH^-LPXN^- MSCs相比，MLPH⁺LPXN⁺MSCs与脐血来源的CD34⁺细胞共培养后，显著促进了CD34⁺造血干/祖细胞细胞分化为巨核细胞的百分比（如图5所示）。

实施例5：MLPH⁺LPXN⁺MSCs细胞具有显著的免疫抑制作用

（1）消化实施例1中得到的MLPH⁺LPXN⁺ MSCs，MLPH^-LPXN^- MSCs，将MSCs的旧培养基吸至50ml离心管中，加入10ml PBS清洗后吸弃，加入5ml干细胞温和消化酶，室温消化3分钟，加入MSCs的旧培养基终止消化，离心，1200rpm，4℃，5分钟，弃上清，加入2ml间充质干细胞无血清培养基（含1%添加剂1），吹匀，进行细胞计数。

（2）将MLPH⁺LPXN⁺ MSCs，MLPH^-LPXN^- MSCs重悬为1x10⁶个/ml，往48孔板的每孔中加入100ul细胞悬液（含1x10⁵个UC-MSCs细胞），再加入900μl间充质干细胞无血清培养基（含1%添加剂1），阳性对照组只加入1ml间充质干细胞无血清培养基（含1%添加剂1）。

（3）放入37℃，5% CO₂培养箱培养过夜。

（4）使用美天旎的CD3 MicroBeads，human-lyophilized，按照官网的操作步骤富集PB中的T细胞。

（5）将富集后的T细胞悬液，离心，1500rpm，4℃，5分钟，弃上清，加入500μl PBS混匀制成单细胞悬液，放冰上备用。

（6）RPMI 1640完全培养基的配制：RPMI 1640基础培养基+10% FBS+1% Glutamax+1% 青霉素-链霉素（Penicillin-Streptomycin，PS）溶液，后续操作步骤均在避光下进行。

（7）CFSE工作液配制：每份中CFSE 1μl +500μl PBS，充分吹打混匀。

（8）将重悬后的单细胞悬液（500μl PBS重悬的单细胞悬液）分别加入一份CFSE工作液（每份中CFSE 1μl +500μl PBS），充分吹打混匀，室温静置10分钟。

（9）分别快速加入1ml预冷的50% FBS并吹打混匀以终止染色，冰上静置2分钟，离心，300g，4℃，10分钟，弃上清。

（10）分别加入2ml 1640完全培养基吹打混匀，离心，300 g，4℃，10分钟，弃上清。

（11）重复步骤10。

（12）加入1640完全培养基重悬细胞沉淀，使其浓度调整为1×10⁶个/ml。

（13）吸弃48孔板中的间充质干细胞无血清培养基（含1%添加剂1），加入400μl1640完全培养基，再加入100μl CFSE标记的T细胞悬液（含1x10⁵个T细胞），即每孔的培养基为500μl，加入CD3/28抗体，使得CD3/28抗体的终浓度为10μl/ml。

（14）37℃，5% CO₂培养箱培养5天。

（15）培养第5天，收集每孔的悬浮细胞：先轻轻晃动培养基并轻轻吸净，再向每孔中加入1ml PBE，轻轻晃动清洗并吸净，重复3次。

（16）细胞离心，1500rpm，4℃，5分钟，弃上清。

（17）标抗体，4℃，30分钟。

（18）加入2ml PBE洗去未结合的抗体，离心，1500rpm，4℃，5分钟，弃上清。

（19）100μl PBE重悬细胞，加入DAPI，流式分析仪检测，检测的配色方案如下表4：

表4

抗原	通道	体积
			CD4	APC	0.5ul
CD8	PE-Cy7	0.5ul
			CD25	APC-Cy7	0.5ul
CD69	PE	0.5ul

结果：结果显示，与MLPH^-LPXN^-MSCs相比，MLPH⁺LPXN⁺MSCs显著抑制了CD3⁺T细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、CD4⁺CD25⁺T细胞和CD3⁺CD25⁺T细胞的增殖（如图6所示）。

实施例6：MLPH⁺LPXN⁺MSCs细胞输注治疗GVHD

（1）半相合aGVHD模型构建前，day-1天，移植3种不同marker的UC-MSCs：消化P6代的实施例1中得到的MLPH⁺LPXN⁺ MSCs，MLPH^-LPXN^- MSCs，Mix MSCs，将MSCs的旧培养基吸至50ml离心管中，加入10ml PBS清洗后吸弃，加入5ml干细胞温和消化酶，室温消化3分钟，加入MSCs的旧培养基终止消化，离心，1200rpm，4℃，5分钟，弃上清，加入2ml间充质干细胞无血清培养基（含1%添加剂1），吹匀，进行细胞计数。MLPH⁺LPXN⁺ MSCs组，MLPH^-LPXN^- MSCs组，Mix MSCs组，分别移植2x10⁵个相应marker的UC-MSCs。

（2）取8周雌性CB6F1小鼠，8Gy照射（4Gy+4Gy）。

（3）照射后4小时后，每只CB6F1小鼠移植5x10⁶个雌性B6小鼠BM细胞联合9x10⁷个雌性C57小鼠脾脏细胞。

（4）半相合aGVHD模型构建后，day3天，移植3种不同marker的UC-MSCs：消化P6代实施例1中得到的MLPH⁺LPXN⁺ MSCs，MLPH^-LPXN^- MSCs，Mix MSCs，将MSCs的旧培养基吸至50ml离心管中，加入10ml PBS清洗后吸弃，加入5ml干细胞温和消化酶，室温消化3分钟，加入MSCs的旧培养基终止消化，离心，1200rpm，4℃，5分钟，弃上清，加入2ml间充质干细胞无血清培养基（含1%添加剂1），吹匀，进行细胞计数。MLPH⁺LPXN⁺ MSCs组，MLPH^-LPXN^- MSCs组，Mix MSCs组，分别移植2x10⁵个相应marker的UC-MSCs。

（5）半相合aGVHD模型构建后，day12天，移植3种不同marker的UC-MSCs：消化P6代实施例1中得到的MLPH⁺LPXN⁺ MSCs，MLPH^-LPXN^- MSCs，Mix MSCs，将MSCs的旧培养基吸至50ml离心管中，加入10ml PBS清洗后吸弃，加入5ml干细胞温和消化酶，室温消化3分钟，加入MSCs的旧培养基终止消化，离心，1200rpm，4℃，5分钟，弃上清，加入2ml间充质干细胞无血清培养基（含1%添加剂1），吹匀，进行细胞计数。MLPH⁺LPXN⁺ MSCs组，MLPH^-LPXN^- MSCs组，Mix MSCs组，分别移植2x10⁵个相应marker的UC-MSCs。

（6）半相合aGVHD模型构建后，每天观察各组小鼠的存活情况，并进行记录。

结果：结果显示，与输注MLPH^-LPXN^- MSCs的GVHD小鼠相比，输注MLPH⁺LPXN⁺ MSCs的小鼠GVHD症状明显减轻，生存明显延长（如图7所示），MLPH⁺LPXN⁺MSCs具有治疗GVHD的作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (13)

1.间充质干细胞在制备具有造血支持功能的产品中的用途，其特征在于，所述间充质干细胞携带的标志分子为MLPH⁺和LPXN⁺。

2.间充质干细胞在制备促进CD34⁺造血干/祖细胞和/或CD133⁺造血干/祖细胞的扩增的产品中的用途，其特征在于，所述间充质干细胞携带的标志分子为MLPH⁺和LPXN⁺。

3.间充质干细胞在制备促进人造血干/祖细胞在体内的造血重建的产品中的用途，其特征在于，所述间充质干细胞携带的标志分子为MLPH⁺和LPXN⁺。

4.间充质干细胞在制备促进人造血干细胞向巨核细胞方向分化的产品中的用途，其特征在于，所述间充质干细胞携带的标志分子为MLPH⁺和LPXN⁺。

5.间充质干细胞在制备具有免疫抑制功能的产品中的用途，其特征在于，所述间充质干细胞携带的标志分子为MLPH⁺和LPXN⁺。

6.间充质干细胞在制备治疗或辅助治疗移植物抗宿主病的产品中的用途，其特征在于，所述间充质干细胞携带的标志分子为MLPH⁺和LPXN⁺。

7.间充质干细胞在制备治疗或辅助治疗移植物造血功能不良的产品中的用途，其特征在于，所述间充质干细胞携带的标志分子为MLPH⁺和LPXN⁺。

8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中包括携带的标志分子为MLPH⁺和LPXN⁺的间充质干细胞，以及药学上可接受的载体。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中还包括CD34⁺的细胞和/或辅助成分。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述辅助成分为选自细胞因子、营养支持物质、抗氧化剂、免疫调节剂、抗凝剂或抗炎药物中的一种或几种。

11.根据权利要求8~10任意一项所述的药物组合物，其特征在于，所述间充质干细胞为经传代培养后的子代细胞。

12.如权利要求8~11任意一项所述的药物组合物的应用，其特征在于，所述应用为选自：

（1）制备具有造血支持功能的产品；或

（2）制备促进CD34⁺造血干/祖细胞和/或CD133⁺造血干/祖细胞的扩增的产品；或

（3）制备促进人造血干细胞在体内的造血重建的产品；或

（4）制备促进人造血干细胞向巨核细胞方向分化的产品；或

（5）制备具有免疫抑制功能的产品；或

（6）制备治疗或辅助治疗移植物抗宿主病的产品；或

（7）制备治疗或辅助治疗移植物造血功能不良的产品。

13.一种制备以下产品的方法：（1）具有造血支持功能的产品；或（2）促进CD34⁺造血干/祖细胞和/或CD133⁺造血干/祖细胞的扩增的产品；或（3）促进人造血干细胞在体内的造血重建的产品；或（4）促进人造血干细胞向巨核细胞方向分化的产品；或（5）具有免疫抑制功能的产品；或（6）治疗或辅助治疗移植物抗宿主病的产品；或（7）治疗或辅助治疗移植物造血功能不良的产品，其特征在于，所述方法中包括获得携带的标志分子为MLPH⁺和LPXN⁺的间充质干细胞的步骤。