CN101490246B - 自吸脂后脂肪吸取物分离及纯化造血干细胞 - Google Patents

Abstract

本发明是关于一种自脂肪组织分离造血干细胞的方法。该方法产生显著高量的CD34⁺、ALDH^br和/或ABCG2-表达细胞，其包含造血干细胞，允许不使用任何扩增或最少扩增地使用该细胞。

Description

自吸脂后脂肪吸取物分离及纯化造血干细胞

发明背景

造血干细胞(HSCs)为一种形成血液及免疫细胞的干细胞，并且最终负责生物生命期间生物中不断的血液更新。数十年来HSCs已成为研究焦点，并且现在口常地用于许多医疗应用，包含白血病、淋巴瘤、遗传型血液疾病的治疗、以及特别是深度化疗方案之后的HSC挽救。

HSCs是存在于成人生物组织中的全能干细胞的最佳特征化实例。在Trentin及同事的创新研究中(Trentin，1965，Cardiovasc，Res.Cent.Bull4：38-4；Till & McCulloch，1961，Rad.Res.14：213-222)经致死量照射的小鼠因为它们无法更新它们的循环血液细胞而死亡。然而，来自同源供体动物的骨髓细胞的移植拯救该宿主动物。该供体细胞负责再增殖所有循环血液细胞。近来，已显示负责再造接收骨髓移植体的人类中的造血作用的细胞位于表达CD34抗原(CD34⁺)的细胞的子集中(Berenson等，1991，血液77：1717-1722)。换言之，CD34⁺细胞包含造血干细胞。已寻求不依靠细胞表面免疫表型来辨识及分离富含造血干细胞的细胞群的其它方法。初期人类造血祖细胞已基于醛脱氢酶(ALDH)活性而分离(Storms等，1999，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.)96：9118-9123；Hess等，2004，血液(Blood)104：1648-1655)。此外，人类的植入与经灌注具ALDH活性(ALDH^br)及低侧向角(SSC^lo)的细胞数目高度相关(Fallon等，2003，Br.J.Haematol.122：99-108)。

丰富的研究已证实有限数目的未分化造血干细胞的捐赠能够再生宿主动物中的八个或更多不同血液细胞血源的每一个。此大型研究已为骨髓移植提供基础，其为一种已广泛接受的癌症及先天性代谢缺陷的治疗方式。于是，在人类一生中造血干细胞仍维持存在于正常的人类骨髓；它们不限于新生儿期。

目前存在三种用于骨髓移植目的的造血干细胞(HSCs)的主要来源：成人骨髓、成人外周血液、及婴儿出生后脐带血的单核细胞部份。分离用于移植目的的细胞典型地自成人的骨髓或外周血液分离。然而，不利地是，CD34⁺细胞在成人骨髓中非常稀少(～1-2％)，这需要得到显著量的骨髓以产生足够量的HSCs以植入成人。得到骨髓的步骤对骨髓提供者是冗长及不舒适的步骤，需要延长住院以使得骨髓恢复。典型上需要多重血球分离术从外周血液分离CD34⁺或ALDH^br细胞对捐赠者是较少不舒适的，然而，其需要使用细胞因子预先接种供体以使HSCs迁移至外周血液。尽管进行了该迁移，则外周血液中CD34⁺或ALDH^br细胞的数目，及接着HSCs的数目典型地仍为相当低的。

与骨髓或经迁移的外周血液相较，脐带血(UCB)稍微更富含CD34⁺细胞(Wang等，1997，血液(Blood)89：3919-3924)，但是脐带血中可提供的少量血液限制可恢复的可植入HSCs的绝对量，使得UCB的可用性较原先预期更低。理论上，我们可以通过汇集多个脐带血样品而提供足够数目的HSCs，然而，汇集在临床实践中是情势不佳的。于是，脐带血来源的CD34⁺细胞在它们在成人中的应用上受限，因为分离所得的低HSCs数目太少而不足以成功植入成熟的成人。已研究传代流程，以试验及增加细胞数目。典型地，然而HSC传代伴随着总是不理想的显著分化。

存在越来越多的证据显示造血祖细胞可不受限于骨髓微观环境。卡尔加里大学(University of Calgary)的研究人员已检查了神经元干细胞，其沿神经细胞谱系路径例常地分化。当这些细胞移植进入经致死量照射的宿主时，研究人员检测到供体细胞标记在新产生骨髓及淋巴细胞中的存在(Bjornson，1999，科学(Science)283：534-537)。贝勒医学院(Baylor Collegeof Medicine)的研究人员已使用从小鼠骨骼肌所分离的卫星细胞进行类似研究(Jackson等，1999，PNAS 96：14482-14486)。当这些肌肉-来源的细胞移植进入经致死量照射的宿主时，研究人员检测到肌肉基因标记在所有血液细胞血源中的存在。这些研究一起显示神经及肌肉组织包含能够造血分化的干细胞。此建议骨髓以外的部位能提供具有潜在应用于人类疾病治疗的可更新造血祖细胞来源(Quesenberry等，1999，神经外伤杂志(J.Neurotrauma)16：661-666：Scheffler等，1999，神经科学趋势(TrendsNeurosci)22：348-357；Svendsen & Smith，1999，神经科学趋势(TrendsNeurosci)22：357-364)。

近来，脂肪来源的基质血管成分(SVF)细胞已显示可成功地重构经致死量照射的小鼠中的主要造血细胞谱系(Cousin等，2003，生物化学和生物物理学研究通讯(Biochem Biophys.Res.Commun.)301：1016-1022及美国专利公布号2004/0067218)。自脂肪组织分离的间充质基质干细胞也已与自经移动的外周血液分离的CD34⁺细胞共同灌注，并且发现促进CD34⁺细胞的成功植入(Kim等，2005，生物化学和生物物理学研究通讯(BiochemBiophys.Res.Commun.)329(1)：25-31)。

美国专利公布号2001/0033834公开了一种已分化表达造血祖细胞的至少一个特征的分离的脂肪来源的基质细胞。还公开的是去分化为全功能多潜能干细胞的脂肪来源的基质细胞，其可接着分化为造血细胞谱系。

除上文所总结的研究外，存在需要丰富的造血干细胞来源的需求以用于医疗及其它应用。本发明解决并且满足这些需求。

发明概述

本发明包括自脂肪组织分离造血干细胞的方法，该方法包括下述步骤：得到脂肪组织；自该脂肪组织制备基质血管成分(SVF)；及分离在SVF中的非黏附细胞，其中该非黏附细胞包含造血干细胞。优选地，该脂肪组织为人类的。在一个实施方案中，该脂肪组织得自脂肪吸取物(lipoaspirate)。

在一个实施方案中，该造血干细胞选自由下列各项组成的组：ALDH^brSSC^lo细胞、CD34⁺细胞、CD34⁺SSC^lo细胞、CD34⁺CD45⁺细胞、CD34⁺CD38^-CD41^-细胞、CD34⁺CD45^-细胞、CD34⁺CD38^-CD41^-SSC^lo细胞、及ABCG2-表达细胞。在另一个实施方案中，该造血干细胞选自由下列各项组成的组：集落形成单位粒细胞巨噬细胞(CFU-GM)、爆发集落形成单位红细胞(BFU-E)及集落形成单位粒细胞红细胞巨噬细胞巨核细胞(CFU-GEMM)。

在另一实施方案中，分离造血干细胞的方法进一步包括从该非黏附细胞分离CD34^hi细胞。在另一实施方案中，该方法进一步包括从该非黏附细胞分离ALDH^br细胞。在一方面，该ALDH^br细胞为ALDH^brSSC^lo。

本发明还提供一种分离CD34⁺细胞的方法，该方法包括下列步骤：得到脂肪组织；自该脂肪组织制备基质血管成分(SVF)；分离在SVF中的非黏附细胞与该黏附细胞，及从该黏附细胞分离CD34⁺细胞，由此分离CD34⁺细胞。优选地，该脂肪组织为人类的。包含根据该方法所分离的CD34⁺细胞的组合物由本发明提供，其中该CD34⁺细胞以每约1毫升脂肪组织分离至少约1×10⁵CD34⁺细胞的比率分离。

在一个实施方案中，该脂肪组织由脂肪吸取物得到。在一个实施方案中，该SVF包含至少约40％CD34⁺细胞。在一个方面中，该CD34⁺细胞以每约100毫升脂肪组织分离至少约1×10⁷CD34⁺细胞的比率分离。

在另一实施方案中，该CD34⁺细胞选自由下列各项组成的组：CD34⁺SSC^lo细胞、CD34⁺CD45⁺细胞、CD34^hiCD38^-CD41^-细胞、CD34⁺CD38^-CD41^-SSC^lo、CD34^loCD45^-细胞、CD34^loCD45⁺细胞、CD34⁺ALDH^br细胞和CD34⁺ALDH^brSSC^lo细胞。

在一个实施方案中，分离CD34⁺细胞的方法进一步包括分离CD34^hi细胞或CD34^lo细胞。

本发明还提供一种为受试者供给造血干细胞的方法。该方法包括下列步骤：自供体受试者得到脂肪组织；自该脂肪组织制备基质血管成分(SVF)；分离在SVF中的非黏附细胞；分离造血干细胞与该非黏附细胞；及施用来自所述非黏附细胞的治疗有效量的细胞；及施用治疗有效量的造血干细胞到需要其的受体受试者。优选地，该供体受试者及受体受试者为人。在一个实施方案中，该供体受试者及该受体受试者为相同的人。在另一个实施方案中，该供体受试者及受体受试者不是相同的人。

在提供造血干细胞的方法的一个实施方案中，该造血干细胞为CD34⁺，并且以每约100毫升脂肪组织分离至少约1×10⁷CD34⁺细胞的比率分离。

在该方法的一个实施方案中，所述获得步骤包含脂肪吸取。在另一实施方案中，所述分离步骤包括分离ALDH^brSSC^lo细胞或CD34⁺CD38^-CD41^-SSC^lo细胞。

本发明提供包含至少约40％非黏附、基质血管成分(SVF)CD34⁺细胞的分离的细胞的组合物。在一个实施方案中，该分离的细胞包含至少约20％CD34⁺CD45^-细胞。在另一实施方案中，该基质血管成分得自人脂肪组织。在一个实施方案中，该CD34⁺细胞包含CD34⁺CD38^-CD41^-ALDH^br细胞。

在另一实施方案中，该CD34⁺细胞包含CD34⁺CD38^-CD41^-SSC^lo细胞。在另一实施方案中，该CD34⁺细胞包含集落形成单位粒细胞巨噬细胞(CFU-GM)、爆发集落形成单位红细胞(BFU-E)及集落形成单位粒细胞红细胞巨噬细胞巨核细胞(CFU-GEMM)。在另一实施方案中，该细胞是基因修饰的。

还提供包含至少约10％非黏附、基质血管成分(SVF)ALDH^br细胞的分离的细胞的组合物。在一个实施方案中，该组合物包含至少约15％非黏附SVF ALDH^br细胞。在一个实施方案中，该ALDH^br细胞为ALDH^brSSC^lo细胞。优选地，该SVF得自人类脂肪组织。

还提供包含本发明的一种组合物及药用载体的药物组合物。

附图简述

为举例说明本发明的目的，在附图中说明本发明的某些实施方案。然而，本发明并不限于在所述附图中描述的实施方案中的精确装置及仪器工具。

图1为分离自脂肪组织非黏附基质血管成分(SVF)的各种CD34⁺细胞亚群的一系列流式细胞散射光数据的图。在中央版的四个框起的亚群中的数字表示代表亚群的总细胞百分率。在两个左边及两个右边版，闸控(gated)型群以黑点绘制，并且非闸控型群以灰阶密度绘制。SSC-H＝侧向散射；FSC-H＝前向散射。

图2为分离自脂肪组织非黏附SVF的两种主要CD34⁺细胞群(低侧散射及高侧散射)的一系列关于CD38及CD41表达的流式细胞术数据的图。在右侧的两个图为CD34⁺细胞的低侧散射。

图3为分离自脂肪组织非黏附SVF的两种主要CD34⁺细胞群的一系列关于CD31、CD105及CD90表达的流式细胞术数据的图。在右侧的三个图为CD34⁺细胞的低侧散射。

图4为在(干细胞技术)培养第14天BFU-E集落的影像，该集落在培养20,000非黏附SVF细胞之后发现(100x放大率)。

图5为在培养20,000非黏附SVF细胞(100x放大率)之后第14天的两个BFU-E集落的影像。

图6为在培养20,000非黏附SVF细胞(100x放大率)之后第14天的CFU-GM集落的影像。

图7为在培养20,000非黏附SVF细胞(100x倍率)之后第14天的CFU-GEMM集落的影像。

图8，包括图8A及图8B，为一系列说明在非黏附SVF细胞中ABCG2表达的两个影像。图8A为非黏附SVF细胞的光散性质的图。在非黏附SVF细胞中ABCG2-表达细胞一般发现于离散区域(圈起部分)。图8B为非黏附SVF细胞的ABCG2表达数据的图。这些数据说明约16％非黏附SVF细胞是表达ABCG2的。

发明详述

本发明是部份基于这样的观察，即，在脂肪组织基质血管成分(SVF)中的非黏附细胞富含CD34⁺细胞、ALDH^br细胞、ALDH^brSSC^lo细胞及ABCG2-表达细胞、用于HSC鉴定的关键标记。此外，表明这些细胞包含全能造血祖细胞及谱系-决定型造血祖细胞。本发明由此提供从脂肪组织分离造血干细胞的方法。

定义

除非另外定义，本文所使用的所有技术及科学术语一般具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常了解的相同意义。一般言之，本文所使用的名词及关于细胞培养、分子遗传、有机化学、及核酸化学及杂交的实验室步骤为在该领域内所熟知及常用的步骤。

标准技术用于核酸及肽合成。该技术及步骤通常根据该领域中常规方法及各种一般参考文献(例如，Sambrook及Russell，2001，分子克隆，实验室方法(Molecular Cloning，A Laboratory Approach)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港，NY，及Ausubel等，2002，现代分子生物学方法(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley& Sons，纽约，NY)进行，其在此文件中通篇提供。

冠词“一(a)”及“一(an)”在本文中用以表示一个或超过一个(即至少一个)该冠词的语法对象。作为实例，“一个组件”表示一个组件或超过一个组件。

术语“约”由本领域普通技术人员所了解，并且基于使用其的上下文在一定程度内变化。

当用于本文时，“体外(in vitro)”及“离体(ex vivo)”交替使用以表示在活生物身体外的条件。于是，体外培养及离体培养都表示在活生物身体外培养。

“脂肪”表示任何脂肪组织。该脂肪组织可为棕色、黄色或白色脂肪组织。脂肪组织包含脂肪细胞及基质。脂肪组织可于动物身体全身发现。例如，在哺乳动物中，脂肪组织存在于网膜、骨髓、皮下间隙、脂肪垫(例如肩胛骨或髌骨后脂肪垫)中，并且围绕大多数器官。该脂肪组织可来自拥有脂肪组织的任何生物。人脂肪组织的方便及丰富来源得自吸脂外科手术的脂肪组织。然而，脂肪组织的来源或脂肪组织的分离方法对于本发明不是关键性的。

术语“脂肪组织-来源的细胞”是表示源自脂肪组织的细胞。得自脂肪组织的细胞可以是原代细胞培养、传代培养、或是无限增殖的细胞系。分离自脂肪组织的初始细胞群为异质细胞群，其包括但不限于，基质血管成分(SVF)细胞。

当用于本文时，术语“脂肪来源的基质细胞”、“脂肪组织-来源的基质细胞”、“脂肪组织-来源的成人基质(ADAS)细胞”、或“脂肪-来源的干细胞”(ASCs)可以交替使用，并且表示源自脂肪组织的基质细胞，其可以作为各种不同细胞形式例如但不限于，脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌肉及神经/神经胶质细胞谱系的干细胞样前体。ASCs为来源自脂肪组织的子群，其可使用在本领域中已知的标准培养步骤与脂肪组织的其它成分分离。此外，ASCs可基于在本领域已知的细胞表面标记从细胞混合物中分离。

当用于本文时，术语“脂肪来源的造血干细胞”表示存在于脂肪组织基质血管成分的非黏附细胞，其包含选自由下列各项所组成的组中的一个或多个HSC特征：CD34⁺、ALDH^br、SSC^lo、ABCG2表达及多能造血祖细胞能力。

当用于本文时，“非黏附细胞”表示在SVF细胞标准组织培养条件下不会黏附于组织培养瓶的细胞。经验丰富的技术人员熟悉用于SVF细胞的标准组织培养条件。

当用于本文时，“ALDH^br”表示在向细胞施用产生荧光产物的ALDH底物之后，表达高ALDH水平的细胞的亮细胞内荧光。检测ALDH^br细胞为本领域所熟知。此外，用于辨识ALDH-表达细胞的

试剂盒(干细胞技术(Stem Cell Technologies)，温哥华，BC，加拿大)可商购。还参看美国专利第5,876,956号。

术语“前体细胞”，“祖细胞”，及“干细胞”在本领域可交替使用，并且当用于本文时是表示多能或谱系-未定型祖细胞，其潜在地能够进行无限数目的有丝分裂以更新其本身或是产生后代细胞，其会分化为需要的细胞形式。与多能干细胞相反，谱系决定型祖细胞一般被认为是无法产生彼此表型不同的数目众多的细胞形式。而是祖细胞产生一个或可能两个谱系决定型细胞类型。

当用于本文时，术语“多能的”或“多能性”表示干细胞分化成超过一种细胞类型的能力。

当用于本文时，“生物相容的”表示当植入哺乳动物时其不会引起哺乳动物中不良反应的任何物质。当引入个体时，生物相容物质对该个体是无毒的或是没有伤害的，其也不会在哺乳动物中诱发该物质的免疫排斥。

当用于本文时，“自体移植的”表示生物物质得自与该物质稍后要再度引入的个体相同的个体。

当用于本文时，“同种异体的”表示生物物质得自与该物质要引入的个体为相同物种的遗传上不同的个体。

当用于本文时，“同源的”表示生物物质得自与该物质要引入的个体是遗传上相同的个体(例如同卵双生)。

当用于本文时，“减轻”疾病、缺陷、失调或病症表示减低疾病、缺陷、失调或病症的一个或多个症状的严重性。

当用于本文时，“治疗”表示减低病患所经历的疾病、缺陷、失调或不利病症、及其类似的症状的频率。

当用于本文时，“治疗有效量”是足以对施用组合物的个体提供有利效用的本发明组合物的量。例如，关于将细胞施用至个体，“治疗有效量”是足以对施用细胞的个体提供有利效用的细胞的量。

“治疗”性处理是为了治疗或缓和至少一种症状的目的对表现出至少一种病理症状的受试者实施的处理。

当用于本文时，术语“生长培养基”表示促进细胞增殖的培养基。生长培养基一般包含动物血清。在一些情形中，生长培养基可以不包含动物血清。

“分化培养基”在本文用于表示一种生长培养基，其包含一种添加剂或缺乏一种添加剂，以使得当在该培养基中培养时未完全分化的干细胞、HSC、CD34⁺细胞、脂肪来源的成人干细胞或是其它此种祖细胞发展为具一些或所有经分化的细胞的特征的细胞。

当用于本文时，“生长因子”表示一种刺激细胞的增生、分化及/或成熟的物质。用于本发明的生长因子的非限制实例包括红细胞生成素(EPO)、巨噬细胞集落刺激因子、血小板生成素(TPO)、生长激素(GH)、白介素1-α及1-β、白介素3(IL-3)、白介素4(IL-4)、白介素5(IL-5)、白介素6(IL-6)、白介素7(IL-7)、白介素9(IL-9)、白介素10(IL-10)、白介素11(IL-11)、白介素13(IL-13)、c-kit配体/干细胞因子(SCF)、胰岛素、胰岛素样生长因子，如IGF-2、表皮生长因子(EGF)、及成纤维细胞生长因子(FGF)，如FGF-1、FLT-3/FLK-2配体、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、及巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)。生长因子典型地以微微克/毫升-毫克/毫升水平之间的浓度使用。

细胞的“免疫表型”在本文用于表示关于细胞的表面蛋白质图谱的细胞表型。

“分离的细胞”表示已与在组织或哺乳动物中自然伴随该细胞的其它成分和/或细胞分离的细胞。

当用于本文时，“实质上纯化的细胞”为一种已与其以其自然存在状态通常相伴随的其它细胞类型纯化的细胞。

“扩增性”在本文用于表示细胞增殖的能力，例如以倍数扩增或是，在细胞群的情况下进行细胞群加倍的能力。当在促进细胞生长和/或分化的情况下将细胞置于生长培养基时，细胞在培养物中扩增，产生更多的细胞群。

“增殖”在本文用于表示类似形式，特别是细胞，的再生或倍增。即，增殖包含较大细胞数目的产生，并且可尤其是仅由计数细胞数目，测量进入细胞的³H-胸腺嘧啶的结合，及其类似方式而测量。细胞增殖的速率典型地可由细胞数目加倍所需的时间测量，细胞数目加倍所需的时间另外称为倍增时间(doubling time)。

当用于本文时，“细胞培养”表示一种方法，由此方法取自活的生物的细胞在经控制的条件下生长。

“原代细胞培养”表示一种直接取自生物并在第一次传代培养之前的细胞、组织或器官的培养。

当用于本文时，“传代培养”表示将细胞从一个生长容器至另一个生长容器的转移。

当用于本文时，“传代”表示一轮传代培养。因此，当细胞进行传代培养时，它们被称为已传代。有时称为特定细胞群，或是细胞系，或是由已传代次数表征。例如，已传代十次的经培养的细胞群可称为P10培养物。原代培养物，即，细胞从组织分离后的第一次培养物，称为P0。第一次传代培养之后，细胞被叙述为次代培养物(P1或传代1)。在第二次传代培养之后，细胞成为三代培养物(P2或传代2)，等等。本领域熟练的技术人员应该了解，在传代期间存在许多细胞群加倍；所以培养物的细胞群加倍数目大于传代数目。在传代之间的期间细胞的扩增(即，细胞群加倍的数目)依据许多因素而定，其包括，但不限于，接种密度、基底、培养基、及传代之间的时间。

当用于本文时，术语“非免疫原的”表示在体外于混合淋巴细胞反应(MLR)中或在体内不会诱发T细胞增生的细胞性质。

当用于本文时，“组织工程”表示离体产生用于组织置换或再造的组织的方法。组织工程为一种“再生医学”的实例，其包含通过与生物工程材料与技术一起并入细胞、基因或其它生物性结构单元而修复或置换组织和器官的方法。

当用于本文时，“内源的”表示在生物、细胞或系统中产生或是源自其内部的任何物质。

“外源的”表示引入生物、细胞或系统或是在其外部产生的任何物质。

当用于本文时，术语“表型特征”应解释为表示至少一个下列特征：形态外观、特定蛋白质的表达、染色模式，其包括，但不限于，细胞质染色模式、特定细胞相关酶催化活性、及能使用物质染色的能力。

“编码”表示在多核苷酸中的特定核苷酸序列，如基因、cDNA、或mRNA的固有性质，以用做在生物过程中合成其它聚合物及大分子的模板，其具有确定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或是确定的氨基酸序列及由此得到的生物性质。因此，基因编码一种蛋白质，只要对应于该基因的mRNA的转录及转译在细胞或其它生物系统中产生该蛋白质。编码链，其核苷酸序列与mRNA序列相同，并且通常提供在序列表中，及非编码链，其用做基因或cDNA转录的模板，都可称为编码该蛋白质或该基因或cDNA的其它产物。

除非另外指定，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括为彼此简并的形式及编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质的核苷酸序列及RNA可包括内含子。

“分离的核酸”表示已与在自然存在状态中在其侧翼的序列分离的核酸链段或片段，即，已从正常相邻于该片段的序列，即在其天然存在的基因组中邻近该片段的序列中移出的DNA片段。此术语也应用于已基本上从自然地伴随该核酸的其它成分，即，在细胞中自然地伴随该核酸的RNA或DNA或蛋白质中纯化的核酸。因此，该术语包括，例如，并入载体中、并入自主复制质粒或病毒中、或是并入原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA，或是其以不依赖于其它序列的独立的分子(即，作为cDNA或基因组或由PCR或限制酶消化所产生的cDNA片段)存在。其还包含作为编码额外多肽序列的杂合基因的一部分的重组DNA。

在本发明的内容中，对于常见核酸碱基使用下列简称，“A”表示腺嘌呤，“C”表示胞嘧啶，“G”表示鸟嘌呤，“T”表示胸腺嘧啶，及“U”表示尿嘧啶。

当用于此处时词组“在转录调控下”或“操纵性地连接”表示启动子处在相对于多核苷酸的正确位置及方向，以控制RNA聚合酶起始反应及多核苷酸的表达。

当用于本文时，术语“启动子/调控序列”表示表达操纵性连接至该启动子/调控序列的基因产物所需的核酸序列。在一些实例中，此序列可为核心启动子序列，并且在其它实例中，此序列还可以包含基因产物表达所需的增强子序列及其它调控元件。例如，该启动子/调控序列可以是以组织特异性方式表达基因产物的序列。

“组成型”启动子为一种核苷酸序列，当与编码或指定基因产物的多核苷酸操纵地连接时，其使得基因产物在大多数或所有细胞生理条件下在细胞中产生。

“可诱导的”启动子为一种核苷酸序列，当与编码或指定基因产物的多核苷酸操纵性地连接时，其使得基因产物基本上仅当细胞中存在对应于该启动子的诱导物时才在细胞中产生。

“组织特异性”启动子为一种核苷酸序列，当与编码或指定基因产物的多核苷酸操纵地连接时，其使得基因产物基本上仅当该细胞为一种与该启动子相对应的组织类型的细胞时才在细胞中产生。

“载体”为一种物质组合物，其包含分离的核酸，并且其可用于将经分离的核酸递送至细胞内部。数种载体在本领域中是已知的，其包含，但不限于，线型多核苷酸、与离子或两亲性化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。于是，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应该解释为包含促进核酸转移进入细胞的非质粒和非病毒化合物，诸如例如，聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括，但不限于，腺病毒载体、腺伴随病毒载体、反转录病毒载体等。

“表达载体”表示一种包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸含有与要表达的核苷酸序列操纵地连接的表达控制序列。表达载体包含用于表达的足够的顺式作用元件；用于表达的其它元件可由宿主细胞提供或是处在体外表达系统中。表达载体包括所有在本领域中已知的载体，例如黏端质粒、质粒(即，裸露的或包含在脂质体中)及结合该重组多核苷酸的病毒。

“重组多核苷酸”表示具有未自然连接在一起的序列的多核苷酸。扩增的或经组装的重组多核苷酸可以包含在合适的载体中，并且该载体可用于转化合适的宿主细胞。重组多核苷酸也可提供非编码功能(例如，启动子、复制起点、核醣体结合位点，等)。

当用于本文时，“血液疾病”表示这样的任何病症，慢性的或急性的，其中受试者缺乏或具有医学显著减少量的至少一种类型的成熟、功能性的血液细胞，其包含，但不限于，单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、T-细胞、B-细胞、NK-细胞、红细胞、巨核细胞及树突状细胞。所述病症可为慢性的或急性的。该病症的深层原因可以是已知的，如但不限于，化学诱发的或是基因诱发，或者该深层原因可以是未知的或是不确定的(即自发性的)。血液疾病包括伴随不足量的至少一种类型的成熟血液细胞或由之表征的过度增生性疾病及再生障碍性疾病。

“药用载体”表示与药物组合物的生物成分相容并且对接受者没有害处的任何载体、稀释剂或赋形剂。

发明叙述

在本发明中，已证实CD34⁺细胞、ALDH^br细胞及ABCG2-表达细胞以高量从脂肪组织中得到。还显示所得到的细胞包含多种HSCs的亚群特征。亚群的非限制实例包括ALDH^brSSC^lo细胞、CD34⁺SSC^lo细胞、CD34⁺ALDH^br细胞、CD34⁺CD38^-CD41^-细胞、CD34⁺CD38^-CD41^-ALDH^br细胞、CD34⁺CD38^-CD41^-SSC^lo细胞、CD34⁺CD45^-细胞、CD34⁺CD45⁺细胞、及CD34⁺ALDH^brSSC^lo细胞。进一步显示所得到的CD34⁺细胞包含多种多能造血祖细胞及谱系决定性造血祖细胞。因此，本发明提供以高产率从脂肪组织分离包含HSCs的CD34⁺细胞、ALDH^br细胞或ABCG2-表达细胞的群的方法。本发明进一步提供一种包含HSCs的CD34⁺细胞、ALDH^br细胞或ABCG2-表达细胞的组合物，其通过本发明方法分离以产生高度富含HSCs的群作为原代培养物。本发明进一步提供一种治疗需要HSCs的受试者的方法。有利地是，所以，本发明的方法及组合物减少或排除在用于治疗性处理之前将包含HSCs的分离的CD34⁺细胞、ALDH^br细胞、或ABCG2-表达细胞进行扩增的要求。

脂肪组织提供作为多潜能造血干细胞来源的骨髓或脐带血的有利的替代物。脂肪组织是容易可得的并且在许多个体中是丰富的。事实上，在美国肥胖是一种流行性比例的病症，在美国超过50％的成人超过基于他们的身高及体重所建议的身体质量指数(BMI)。脂肪组织可以基于门诊病人通过吸脂而获得。吸脂为获得美容效果的最少非侵入性方法，其为大多数患者接受。而且，充分记载脂肪细胞为一种可补给细胞群。事实上，通常可见到脂肪细胞在相同部位随时间在个体中的再现。所以，不期望脂肪组织移除的初始美容效果的人仍应易于遵从此步骤。

与包含骨髓、外周血液及脐带血的传统来源显著相反，已知脂肪组织为CD34⁺细胞、ALDH^br细胞及ABCG2-表达细胞的丰富来源。具体而言，本文显示从人类脂肪组织所得到的SVF细胞包含至少约5％及可能至少约10％的CD34⁺细胞(其包含HSCs)。进一步显示至少约40至约60％的非黏附SVF细胞为CD34⁺。显示至少约10至约20％非黏附SVF细胞为ALDH^br。还显示至少约10至约20％非黏附SCF细胞为ABCG2-表达细胞。该高比率允许产生显著高产率的包含HSCs的CD34⁺细胞、ALDH^br细胞或ABCG2-表达细胞，其可以从适度量的脂肪组织获得。例如，在本发明方法的一个实施方案中，至少约1×10⁷的CD34⁺细胞可以通过吸脂步骤从约100毫升(ml)的脂肪组织分离。相反，100毫升骨髓或脐带血典型地产生仅约1-2×10⁶CD34⁺细胞。

典型美容吸脂步骤产生约3至约4升脂肪吸取物，使用本发明方法，此脂肪组织量潜在地产生至少约3-4×10⁸的CD34⁺细胞，且不需延长的培养或扩增。在典型的HSC移植步骤中，需要将约2×10⁶CD34⁺细胞/千克体重灌注至接受者以达到快速植入。所以100kg的人需要约2×10⁸的CD34⁺细胞。因此，自单一脂肪吸取物的产率有力地足以治疗及植入平均尺寸的成人。结果，脂肪组织可以是目前所鉴定的最临床相关且最丰富的HSC来源。

本发明的组合物及方法具有无数有用的应用。本发明方法有效用于大量包含HSC的CD34⁺细胞、包含HSC的ALDH^br细胞，或包含HSC的ABCG2-表达细胞的制备，其是快速地并且不需扩增或多重传代以得到用于治疗应用的足够数目的HSCs。脂肪来源的造血干细胞的组合物可以用在减缓或治疗个体中血液疾病的医疗方法中。该组合物及方法也可用于研究目的，其包括，但不限于，鉴定影响HSCs的扩增或分化的化合物。

I.从脂肪组织分离HSCs

用于本发明的脂肪组织可使用熟练的技术人员已知的任何方法从任何哺乳动物获得。在本发明方法中用做脂肪组织来源的哺乳动物包括，但不限于，牛、绵羊、山羊、狗、马、猫、非人类灵长类及人类。优选地，脂肪组织是从灵长类分离，并且更优选地，从人类分离。优选地，脂肪组织为皮下白色脂肪组织。优选的脂肪组织来源为网膜脂肪。在人类中，脂肪典型地通过吸脂分离。如本发明的细胞要被移植进入人体受试者，优选地该脂肪组织应该从相同个体分离以提供用于自体移植，或是从基因相同的同胞(例如同卵双生)分离以提供用于同源移植。然而，备选地，施用的HSCs可以是同种异体的。

根据本发明一个实施方案，脂肪来源的HSCs通过分离SVF的CD34⁺、非黏附细胞而分离。在另一个实施方案中，HSCs通过分离SVF的ALDH^br、非黏附细胞而从脂肪组织分离。在一个方面中，包含脂肪来源的HSCs的ALDH^brSSC^lo非黏附SVF细胞被分离。在另一个实施方案中，脂肪来源的HSCs通过分离SVF的ABCG2-表达、非黏附细胞而分离。

熟练的技术人员已知的从脂肪组织制备SVF的任何方法可用于实施本发明。例如，此种方法叙述于美国专利第6,153,432号，其以其全文并入本文。典型地，处理该脂肪组织是用浓度介于0.01至0.5％之间，优选地0.04至0.3％之间，最优选为约0.2％的胶原酶，浓度介于0.01至0.5％之间，优选地0.04％，最优选为约0.2％的胰蛋白酶；和/或在0.5ng/ml至10ng/ml浓度的中性蛋白酶；和/或有效浓度的透明质酸酶或DNA酶；和在浓度为约0.01至2.0mM，优选地在约0.1至约1.0mM，最优选为0.53mM的乙二胺四乙酸(EDTA)；在介于25℃至50℃之间，优选地介于33℃至40℃之间，最优选为在37℃的温度处理10分钟-3小时的期间，优选地介于30分钟至1小时之间，最优选为45分钟。任选地，可将该细胞通过介于20微米至800微米之间，更优选为介于40至400微米之间，最优选为70微米的尼龙或粗棉布网过滤器。接着将该细胞直接在培养基中或是在Ficoll或Percoll或其它颗粒梯度进行差速离心。细胞将以介于100至3000Xg，更优选为200至1500Xg，最优选为500Xg的速度离心1分钟-1小时之间的期间，更优选为介于2至15分钟，最优选为5分钟，在4°至50℃之间，优选地介于20°至40℃之间，最优选为在约25℃的温度下进行。该细胞团块为SVF。接种该SVF细胞团块，以得到非黏附细胞。

SVF的非黏附细胞通过首先将SVF细胞在培养装置中在基质细胞培养基中培养一段时间再分离。“一段时间”可为适合体外细胞培养及允许黏附细胞黏附的任何时间。在一个实施方案中，该段时间为约12小时。在优选实施方案中，该段时间为24小时。该培养装置可为常用于体外培养细胞的任何培养装置。优选的培养装置为培养瓶，且更优选的培养装置为T-225培养瓶。接种密度可在约10,000细胞/cm²至约100,000细胞/cm²的范围内。在一个实施方案中，细胞以约50,000细胞/cm²及介于其间的任何整数接种在培养瓶中。然而，本发明不限于该接种密度。熟练的技术人员可以通过常规实验决定适当的接种密度。

包含HSCs的非黏附细胞在培养期间在任何时间从该培养装置收集。收集该非黏附细胞的非限制方法包含从该培养装置取出液体培养基。该培养基可在SVF细胞培养期间在任何时间更换；可每日收集包含非黏附SVF细胞(并因此含HSCs)的经移除的培养基，直到第一次传代胰蛋白酶消化作用。优选地，该基质细胞培养基每3至4天更换一次。

如果需要，以黏附成分存在的脂肪组织来源的基质细胞(ASCs)，也可从该培养装置收集。该ASCs可立即使用或是冷冻保存以稍后使用。脂肪组织来源的基质细胞可通过胰蛋白酶消化作用、EDTA处理、或是用于从该培养装置收集黏附细胞的任何其它步骤收集。脂肪组织来源的基质细胞可施用给接收HSCs的个体，例如，以提供造血支持细胞以帮助HSCs的植入。

HSCs可由熟练技术人员已知的任何方法进行表征。可利用HSCs的免疫表型做为HSCs的唯一识别码。即在目的细胞上的该唯一细胞表面标记可用以从来源于脂肪组织的混合细胞群分离特定细胞亚群。HSCs的表型标记是本领域普通技术人员所熟知的，并且大量地在文献中公布。其它表型标记持续被公开或是可被辨识且不需过度的实验。对HSCs特异的一些表型标记包括CD34、CD45、CD38^lo/-、CD41、及ABCG2。HSCs的其它特征为高醛脱氢酶(ALDH^br)活性及低侧向散射(SSC^lo)。HSCs及各种造血决定谱系的其它标记包括CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD13、CD14、CD15、CD19、CD20、CD32、CD51、CD52、CD53、CD56、CD57、CD60、CD61、CD62L、CD65、CD72、CD73、CD81、CD82、CD83、CD90、CD99、CD100、CD117、TCR、P-选择蛋白、HLA-DR，等。本领域的普通技术人员应该认识到，已知比色、荧光、免疫化学、聚合酶链式反应、化学或放射化学方法可容易地确认谱系特异性标记或酶活性的存在或不存在。

优选地，该脂肪来源的HSCs特征在于，CD34的细胞表面表达、高ALDH活性(ALDH^br)、光散射性质(例如SSC^lo)和/或ABCG2表达。自该SVF所分离的非黏附细胞包含至少约10％CD34⁺细胞、优选地至少约20％CD34⁺，及更优选为至少约40％CD34⁺细胞。从该SVF所分离的非黏附细胞包含至少约10％ALDH^br细胞，优选地至少约15％ALDH^br细胞及更优选为至少约20％ALDH^br细胞。从该SVF所分离的非黏附细胞包含至少约10％ABCG2-表达细胞，优选地至少约15％ABCG2-表达细胞并且更优选为至少约20％ABCG2-表达细胞。

本领域技术人员将进一步了解，特定于细胞表面标记的抗体可与物理支持物(即链霉抗生物素蛋白珠子)缀合，并且，所以，可用于结合并分离具有该特定细胞表面标记的HSCs。特异结合至HSC的抗体的实例包括，但不限于，抗-CD34⁺抗体。在结合后，经结合的HSCs可通过如使用磁珠粒(包括但不限于

(Dynal Biotech，Brown Deer，WI))的磁分离与其它细胞分离。进一步关于的使用，MACS分离试剂(MiltenyiBiotec，Auburn，CA)可用于从混合细胞群移出HSCs。备选地，免疫表型、光散射性质、和/或HCS的可检测的HSCs-特征酶产物的存在允许使用基于流式细胞技术的细胞分选仪进行分选。作为分离步骤或细胞分选的结果，得到富含HSCs的CD34⁺细胞、ALDH^br细胞和/或ABCG2-表达细胞的群。在一个实施方案中，HSCs群为一种纯化的细胞群，该分离的HSCs可立即用于治疗性应用，而不需进一步扩增，可使用在本领域中已知技术冷冻保存或是可使用本文所公开的方法或常规方法进行体外培养及扩增和，任选地，进行分化。

HSCs还可由进行集落形成测试法表征，以评估多潜能及谱系决定性造血祖细胞。可使用熟练技术人员已知的任何方法执行集落形成测试。优选地，从该SVF分离的在非黏附细胞中的HSCs包含集落形成单位粒细胞巨噬细胞(CFU-GM)、爆发集落形成单位红细胞(BFU-E)及集落形成单位粒细胞红细胞巨噬细胞巨核细胞(CFU-GEMM)。

有效用于培养ASCs的培养基在本文中称为“基质细胞培养基”。有效用于培养HSCs的培养基在本文中称为“造血干细胞培养基”。细胞培养中能够支持成纤维细胞的任何培养基可用做基质细胞培养基、造血干细胞培养基或是做为ASCs及HSCs共培养的培养基。典型地，基质细胞培养基或造血干细胞培养基包含碱性培养基、血清及抗生素/抗真菌素。基质细胞培养基的非限制实例是包含DMEM/F 12Ham’s、10％胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素(Pen-Strep)及0.25μg/ml两性霉素B的培养基。造血干细胞培养基的非限制实例是包含DMEM、10％胎牛血清(FBS)、4mM L-谷氨酰胺、50mg/ml青霉素及链霉素、及100ng/ml的Flt-3配体、干细胞因子及巨核细胞生长及发育因子(MGDF)中每一种的培养基。造血干细胞培养基的另一个实例为具有2％FBS的Iscove’s培养基。例如，该培养基在稀释用于CFU测定的细胞是有用的。然而，ASCs及HSCs可在补充至少一种生长因子、细胞因子或激素且无抗生素/抗真菌素的碱性培养基中培养。

有效用于根据本发明的方法分离和增殖HSCs的培养基在本领域中是已知的。这些培养基还有效用于ASCs的分离和增殖。有效用于本发明方法的碱性培养基的非限制实例包含Eagle极限必需培养基、ADC-1、LPM(不含牛血清白蛋白)、F10(HAM)、F12(HAM)、DCCM1、DCCM2、RPMI 1640、BGJ培养基(具有和不具有Fitton-Jackson改良)、Eagle基本培养基(BME-添加Earle’s盐基)、Dulbecco’s改良的Eagle培养基(DMEM-不含血清)、Yamane、IMEM-20、格拉斯哥改良的Eagle培养基(GMEM)、Leibovitz L-15培养基、McCoy’s 5A培养基、培养基M199(M199E-具有Earle’s盐基)、培养基M199(M199H-具有Hank’s盐基)、Eagle极限必需培养基(MEM-E-具有Earle’s盐基)、Eagle极限必需培养基(MEM-H-具有Hank’s盐基)及Eagle极限必需培养基(MEM-NAA具有非必需氨基酸)、尤其在数种其它培养基中，其包括培养基199、CMRL 1415、CMRL 1969、CMRL 1066、NCTC 135、MB 75261、MAB 8713、DM 145、William’G、Neuman&Tytell、Higuchi、MCDB 301、MCDB 202、MCDB 501、MCDB401、MCDB 411、MDBC 153。用于本发明的优选培养基为DMEM。这些及其它有用培养基特别可购自GIBCO，Grand Island，纽约，美国，及生物工业(Biological Industries)，Bet HaEmek，以色列。数种这些培养基总结在酶学方法(Methods in Enzymology)，第LVIII卷，“细胞培养(Cell Culture)”，第62-72页，由William B.Jakoby及Ira H.Pastan编辑，由学院出版社公司)Academic Press，Inc)出版。尤其是西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)，干细胞技术(Stemcell Technologies)，StemGenix，Mabio及Quality BiologicalInc提供用于造血干细胞增殖的专卖培养基。

有效用于本发明的血清，包括，但不限于，浓度至少1％至约30％，优选地至少约5％至15％，最优选为约10％的牛或其它物种的胎儿血清。鸡或其它物种的胚提取物可以约1％至30％，优选地至少约5％至15％，最优选为约10％的浓度存在。在一些人的治疗实施方案中，因为血清中偶发传染性污染物的可能传播的安全风险，不希望使用非人类血清。有经验的执业医生熟悉医疗应用的HSCs的医药适当的处理。

“生长因子、细胞因子、激素”指下列特定因子，其包括，但不限于，红细胞生成素(EPO)、巨噬细胞集落刺激因子、血小板生成素(TPO)、生长激素(GH)、白介素1-α及1-β、白介素3(IL-3)、白介素4(IL-4)、白介素5(IL-5)、白介素6(IL-6)、白介素7(IL-7)、白介素9(IL-9)、白介素10(IL-10)、白介素11(IL-11)、白介素13(IL-13)、c-kit配体/干细胞因子(SCF)、胰岛素、胰岛素样生长因子、如IGF-2、白血病抑制因子(LIF)、巨噬细胞抑制蛋白1α(MIP1α)、表皮生长因子(EGF)、及成纤维细胞生长因子(FGF)、如FGF-1、FLT-3/FLK-2配体、巨核细胞生长发育因子(MGDF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、及巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，其以介于微微克/ml至毫克/ml水平的浓度存在。有效用于HSCs扩增的因子包括，但不限于，IL-3、SCF、FLT-3/FLK-2配体、IL-6及GM-CSF。当在治疗应用中要将HSCs施用至人类时，在培养基中任何生长因子、细胞因子和/或激素优选是人类的。

应该进一步认识到，可以向该培养基中加入额外成分。此种成分可为抗生素、抗真菌药、白蛋白、氨基酸、及细胞培养工艺中已知的其它成分。此外，可添加成分以加强分化作用。可添加到培养基中的抗生素包括，但不限于，青霉素及链霉素。青霉素在培养基中的浓度为约10至约200单位/毫升。培养基中链霉素的浓度为约10至约200μg/ml。然而，本发明决不应解释为受限于用于培养基质细胞和/或HSCs的任何一种培养基。而是，可使用能够在组织培养中支持脂肪组织SVF细胞及HSCs的任何一种培养基。

依本文所叙述分离的脂肪来源的HSCs可根据常规步骤冷冻保存。优选地，在包含10％DMSO的基质细胞培养基中的约一百万至一千万个细胞冷冻保存在液态N₂的气相。经冷冻的细胞可于37℃浴由涡流解冻，再次悬浮于新鲜生长培养基，并且如上文所叙述扩增。

II.使用HSCs

由本发明方法所得到的脂肪来源的HSCs可以用在本领域中使用HSCs的已知的任何方法中。额外地，HSCs可用于目前待揭示的方法及组合物中。使用HSCs的一个方法是将它们施用至需要HSCs的受体受试者。

受体受试者可为任何哺乳动物，包括马、山羊、牛、狗、绵羊、猫、非人类灵长类、及人类。优选地，该受体受试者为人。用于得到移植用HSCs的脂肪组织来源可以是与进行治疗的受体受试者相同的(自体移植)或是可得自供体受试者。该供体受试者可与受体受试者是基因相同的(同源移植)或是可以是相同物种的非基因相同个体(同种异体移植)。

可由所公开的细胞灌注而治疗的疾病包括，但不限于，由正常血液细胞产生及成熟的功能障碍的失效导致的疾病(即，再生障碍性贫血及再生障碍性干细胞疾病)。HSCs的施用意欲补充或置换有缺陷的内源血液细胞产生及成熟。此种疾病一般为造血器官中的赘瘤、恶性疾病(例如白血病及淋巴瘤)；非造血器官起源的广谱恶性实体肿瘤；自体免疫病症；或是遗传疾病。此种疾病包括，但不限于，由正常血液细胞产生及成熟的功能障碍的失效导致的疾病、过度增生干细胞疾病，其包括再生障碍性贫血、各类血细胞减少症、粒细胞缺乏、血小板缺乏、红细胞发育不良、布-戴二氏贫血综合征(Blackfan-Diamond syndrome)，因为药物、辐射、或感染引起的、自发性的；造血恶性病，包括急性淋巴性(淋巴细胞性)白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、恶性脊髓髓硬化、多发性骨髓瘤、真性红细胞增多症、原因不明的骨髓化生、Waldenstrom氏巨球蛋白症、霍奇金(Hodgkin)氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤；患有包括恶性黑素瘤、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、小细胞肺癌、成视网膜细胞瘤、睪丸癌、成神经胶质细胞瘤、横纹肌肉瘤、成神经细胞瘤、Ewing氏肉瘤、淋巴瘤的恶性、实体肿瘤的患者的免疫抑制；自体免疫疾病，包括类风湿关节炎、I型糖尿病、慢性肝炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮；遗传(先天性)疾病，包括贫血、家族性再生障碍、范科尼综合征、二氢叶酸还原酶缺乏症、甲酰氨基转移酶缺乏症、莱希-尼亨综合征、先天性红细胞形成不良性综合征I-IV、Chwachmann-Diamond综合征、二氢叶酸还原酶缺乏症、甲酰氨基转移酶缺乏症、莱希-尼亨综合征、先天性球形红细胞症、先天性椭圆红细胞症、先天性裂口红细胞症、先天性Rh无效应性疾病、阵发性夜间血红蛋白尿症、G6PD(6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏症)变体1，2，3，丙酮酸激酶缺乏症、先天性红细胞生成素敏感症、缺乏症、镰刀形细胞贫血症及特征、地中海型贫血α、β、γ、正铁血红蛋白血症、先天性免疫失调、重度合并性免疫缺陷症(SCID)、bare淋巴细胞综合征、离子载体-反应联合免疫缺陷症、具有帽化异常(capping abnormality)的联合免疫缺陷症、核苷磷酸化酶缺乏症、粒细胞肌动蛋白缺乏症、婴儿型粒细胞缺乏症、戈谢病、腺苷脱胺脢缺乏症、Kostmann氏综合征、网状组织发育不全、先天性白细胞功能异常综合征；及其它如骨质疏松、骨髓硬化、后天性溶血性贫血、获得性免疫缺陷症、引起原发性或继发性免疫缺陷症的感染性疾病、细菌感染(例如布鲁氏菌症、利斯特氏菌症、结核病、麻疯病)、寄生性感染(例如疟疾、利什曼原虫症)、真菌感染、涉及淋巴样细胞组中不平均及因老化引起的受损免疫功能的疾病、吞噬细胞疾病、Kostmann氏粒细胞缺乏症、慢性肉芽肿病、Chediak-Higachi综合征、嗜中性粒细胞肌动蛋白缺乏症、嗜中性粒细胞膜GP-180缺乏症、代谢性储存疾病、粘多醣贮积症、粘脂质贮积症、涉及免疫机制的各种疾病、尤其是Wiskott-Aldrich综合征、α1-抗胰蛋白酶缺乏症。

细胞可以各种方式施用至受体受试者。优选的施用模式为肠胃外的、腹膜内的、静脉内的、皮内的、硬膜外、脊椎内、胸骨内的、关节内的、滑膜内的、鞘内的、动脉内的、心腔内的、肌肉内的、鼻内的、皮下的、眼眶内的、囊内的、局部的、透皮药贴、包括经由栓剂的经由直肠的、阴道的或尿道的施用、经皮肤、鼻内喷雾剂、外科手术植入、内科糊剂、输液泵、或经由导管。在一个实施方案中，该试剂及载体以缓释型配方施用，例如直接组织注射或推注(bolus)、植入物、微粒、微球粒、纳米粒子及纳米球粒。优选的施用方法为静脉内滴注。骨髓移植的方法为本领域中所熟知，并且叙述于如美国专利第4,678,470号，和美国专利第5,571,083号，其教导将细胞移植至身体内任何解剖部位的方法。

为将本发明的细胞移植至人类，所述细胞依本文所叙述分离。随后，分离的HSCs可以以移植所需的任何方式医学处理。任选地，使用本领域中已知的方法从HSCs去除细胞如T-细胞。此种方法包括，但不限于，逆流离心分离、大豆凝集素/E-花纹样体形成(soybean agglutinin/E-rosetteformation)、密度梯度离心及免疫消耗。作为癌症治疗的一部分的自体移植体中肿瘤细胞的清除方法也为本领域所已知。

优选地，要移植的细胞来自要移植所述细胞的受试者(自体移植)。在细胞不是来自该患者的情况下(同种异体移植)，典型地要决定在供体细胞及患者之间的血型或单元型相容性。本领域熟练的医生熟悉同种异体移植的相容性问题。

将介于约10⁵及约10¹³之间的CD34⁺、ALDH^br和/或ABCG2-表达细胞/100kg的人的细胞施用至人。在一些实施方案中，将介于约1.5×10⁶及约1.5×10¹²之间的细胞/100kg的人施用至人。在一些实施方案中，将介于约1×10⁸及约5×10¹¹之间的细胞/100kg的人施用至人。在一些实施方案中，将介于约1×10⁹及约2×10¹¹之间的细胞/100kg的人施用至人。在其它实施方案中，将介于约5×10⁸及约1×10¹⁰之间的细胞/100kg的人施用至人。这些细胞可由各种方法施用至人，所述方法包括但不限于输注及静脉内施用。

在一些实施方案中，提供单次细胞施用。在一些实施方案中，提供多次施用。在一些实施方案中，于3-7天连续期间提供多次施用。在一些实施方案中，于3-7天连续期间提供3-7次施用。在其它实施方案中，于5天连续期间提供5次施用。

在一些实施方案中，提供约10⁵-约10¹³个细胞/100kg的人的单次施用。

在一些实施方案中，提供约1.5×10⁸-约1.5×10¹²个细胞/100kg的人的单次施用。在一些实施方案中，提供约1×10⁸-约5×10¹¹个细胞/100kg的人的单次施用。在一些实施方案中，提供约1×10⁹-1×10¹⁰个细胞/100kg的人的单次施用。在一些实施方案中，提供1×10¹⁰个细胞/100kg的人的单次施用。

在一些实施方案中，提供约10⁵-约10¹³个细胞/100kg的人的多次施用。在一些实施方案中，提供约1.5×10⁸-约1.5×10¹²个细胞/100kg的人的多次施用。在一些实施方案中，于3-7天连续期间提供约1×10⁸-约5×10¹¹个细胞/100kg的人的多次施用。在一些实施方案中，于3-7天连续期间提供约4×10⁹个细胞/100kg的人的多次施用。在一些实施方案中，于3-7天连续期间提供约2×10¹¹个细胞/100kg的人的多次施用。在一些实施方案中，于5天连续期间提供约3.5×10⁹个细胞的5次施用。在一些实施方案中，于5天连续期间提供约4×10⁹个细胞的5次施用。在一些实施方案中，于5天连续期间提供约1.3×10¹¹个细胞的5次施用。在一些实施方案中，于5天连续期间提供约2×10¹¹个细胞的5次施用。

在另一实施方案中，在施用HSCs之前，用生长因子、细胞因子或激素处理HSCs，以诱发对特定分化状态的决定。脂肪来源的HSCs可通过使用于本文他处所叙述的分化因子处理细胞和通过在本领域中已知的标准方法而进行体外分化。

部分或终端分化的细胞可以特征在于，指示HSCs至特定终端分化状态的谱系决定的表面及胞内蛋白、基因、和/或其它标记的识别。这些方法可包括，但不限于，(a)由免疫荧光法使用以第二荧光标记连接的蛋白质特异性单克隆抗体的细胞表面蛋白质检测，其包括流式细胞技术方法的使用；(b)由免疫荧光法使用以第二荧光标记连接的蛋白质特异性单克隆抗体的胞内蛋白检测，其包括流式细胞技术方法的使用；(c)由聚合酶链式反应、原位杂交、及/或RNA印迹分析的细胞基因的检测。

在另一个实施方案中，脂肪来源的基质细胞(ASCs)也施用至受体受试者，以提供造血支持细胞以协助HSCs的植入。ASCs可与HSCs共灌注或可以在HSC施用之前或之后施用。ASCs可使用提供用于HSCs的类似剂量指南施用。

III.基因修饰

在另一个实施方案中，基因修饰本发明的脂肪来源的HSCs，例如以表达外源基因或编码序列，或是抑制或是改变内源基因的表达。当将该HSCs施用至受试者时，此种基因修饰可具有医疗效益。备选地，基因修饰可提供一种追踪或辨识这样修饰的细胞的方式，例如，在将此种基因修饰的脂肪来源的HSCs移植进入个体之后，追踪或辨识该如此修饰的细胞。追踪细胞可包括追踪移植的基因修饰细胞的迁移、同化及存活。基因修饰还可以包括至少第二基因。第二基因可编码，例如，可选择性抗生素抗性基因或是其它可选择性标记。

有效用于追踪细胞的蛋白质包括，但不限于，绿色荧光蛋白(GFP)、任何其它荧光蛋白(例如，增强型绿色、蓝绿色、黄色、蓝色及红色荧光蛋白；Clontech，Palo Alto，CA)，或是其它标记蛋白(例如，LacZ、FLAG-标签、Myc、His₆等)。

追踪本发明的细胞的迁移、分化及整合不限于使用由载体或病毒表达的可检测分子。细胞的迁移、整合、及分化可使用允许移植的HSCs的局部化的一系列探针确定。追踪移植的细胞可进一步由使用于本文他处所详述的针对细胞特异性标记的抗体或核酸探针完成。

基因修饰的HSCs的治疗使用包括，但不限于，提供在患者中是突变的、缺乏的或另外是功能异常的蛋白质的表达。例如，可以基因修饰HSCs，以提供血红蛋白A取代血红蛋白S，或是除血红蛋白S之外还提供血红蛋白A，以进行镰刀形细胞贫血症的治疗。地中海型贫血及X-连锁的重度联合免疫缺陷症是使用离体基因修饰的HSCs的基因疗法的其它、非限制候选病症。表达所欲分离的核酸的细胞可用于向另一个细胞、组织、或是整个哺乳动物提供分离的核酸的产物，其中较高含量的基因产物有效用于治疗或减缓伴随不正常的表达和/或活性的疾病、失调或病症。所以，本发明包括表达编码需要序列的经分离的核酸的HSC，其中增加表达、蛋白质水平、和/或需要的蛋白质的活性可以对治疗或减缓涉及造血系统的疾病、失调或病症是有用的。

本发明还包括HSC，当向其中引入分离的核酸，并且由该核酸编码的蛋白质由此表达时得到益处，其先前不存在或是不在细胞中表达，或是其现在以一种水平表达或是在与引入转基因之前不同的情况下表达。此种益处可包括已提供一种系统，在该系统中所需核酸的表达可在实验室或是该细胞所在的哺乳动物中进行体外研究，提供一种系统，其中包含所引入的核酸的细胞可用做研究、诊断及医疗工具，并且提供一种系统，其中产生有效用于哺乳动物中所选择疾病状态的新诊断及医疗工具的开发的哺乳动物模型。

因此，本发明包括表达载体及将外源DNA引入到HSCs中使该外源DNA在细胞中表达的方法。熟练的技术人员熟悉产生表达载体及使用它们转化细胞的技术。参考如Sambrook等(2001，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，冷泉港实验室(Cold SpringHarbor Laboratory)，纽约)，及Ausubel等(1997，分子生物当代流程(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley&Sons，纽约)。

表达载体为一种适合用于将表达盒递送至细胞的基因载体。依据所需的终端应用而定，可如此利用任何此种载体以基因修饰该细胞(例如，质粒、裸DNA、病毒如腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、慢病毒、乳头状瘤病毒、反转录病毒、等)。可使用在此种载体内构建所需表达盒的任何方法，这些方法中的许多为本领域所熟知，如直接克隆、同源重组、等。所需载体主要地决定用于将该载体引入细胞的方法，其为本领域所普遍熟知。适当技术包括原生质体融合、磷酸钙沉淀、基因枪、电穿孔、光穿孔、DEAE葡聚糖或脂质载体介导的转染、及使用病毒载体的感染。

表达载体包含表达盒，所述表达盒包含与表达控制序列如启动子操纵性连接的要表达的核苷酸序列。要表达的核苷酸序列可编码一种蛋白质，或是其可编码生物活性RNA，如反义RNA.、siRNA或核酶。因此，该编码多核苷酸可编码一种赋与例如针对下列各项的抗性的基因：毒素、激素(如肽生长激素、激素释放因子、及细胞因子如干扰素、白介素、及淋巴因子)、细胞表面结合的胞内信号传导部分(如细胞黏附分子及激素受体)、及促进已提供分化谱系的因子，或是任何其它编码序列。

合适的启动子的实例包括原核生物启动子及病毒启动子(例如，反转录ITRs、LTRs、即时早期病毒启动子(IEp)、如疱疹病毒IEp(例如ICP4-IEp及ICP0-IEEp)、巨细胞病毒(CMV)IEp、及其它病毒启动子，如劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、及鼠白血病病毒(MLV)启动子)。其它合适的启动子为真核生物启动子，如增强子(例如，兔β-珠蛋白调节元件)、组成型主动启动子(例如，β-肌动蛋白启动子，等)、信号特异性启动子(例如，可诱导的启动子如对应于RU486的启动子，等)，及组织特异性启动子。选择适合用于在预定细胞背景下驱动基因表达的启动子也在本领域的技术内。该表达盒可包括超过一个编码多核苷酸，并且如果需要的话，其可以包括其它组件(例如，多聚腺苷酸化序列、编码膜嵌入信号或分泌前导肽的序列、核醣体进入序列、转录调控元件(例如、增强子、沉默子等)，等)。

实验实验例

本发明进一步参考下列实验例详细叙述。这些实施例仅提供用于说明目的，除非特别指定，其并不欲为限制性的。因此，本发明绝不解释为限制于下列实例，而是，应解释为包含任何及所有变化，所述变化因为本发明提供的教导而是显而易见的。

实施例1：从脂肪吸取物脂肪组织分离造血干细胞

脂肪组织得自因美容原因而在人受试者中获得的吸脂脂肪吸取物。将50毫升(ml)脂肪吸取物物质通过与50毫升PBS(磷酸缓冲盐水)混合及抽取脂肪下的水层进行清洗。再用PBS洗细胞悬浮液两次直到洗液为淡黄色。将水相洗液集中起来，并储存做为“脂肪吸取物洗后团块”(APWP)。95mg胶原酶溶解于50ml PBS+1％牛血清白蛋白(BSA)的五十(50)ml溶液加至经清洗的细胞悬浮液，并将混合物移至T-185烧瓶。将烧瓶在Belly震荡器(Stovall Life Science，Greensboro，NC)上于37℃温育1小时。

将溶解的脂肪于约550xg(1600rpm)离心6分钟。将约10-20ml的顶部脂肪层倒掉。将细胞团块再次悬浮于剩余的上层清液中，并倒出通过100微米细胞过滤网以除去残屑。通过的流体于约550xg(1600rpm)离心6分钟以沉淀细胞。丢弃上层清液。

将细胞沉淀悬浮于红细胞裂解缓冲液(eBioscience)中。将所悬浮的细胞置于冰上3分钟，接着于约550xg(1600rpm)离心6分钟。丢弃上层清液。(后续工作显示红细胞裂解步骤对从SVF分离HSCs不是必要的或理想的)。

将细胞沉淀悬浮于PBS以清洗细胞，并且细胞如上述沉淀。接着将细胞沉淀悬浮于5ml培养基(补充了10％胎牛血清、青霉素、链霉素及抗生素和0.25微克(μg)/ml两性霉素B的DMEM/F12Ham’s)中。这些细胞为“未分离的SVF”。

计数未分离的SVF细胞，并使用锥虫蓝染色排除法决定存活力。接着将细胞以约50,000活细胞/cm²接种在T-185烧瓶中。

将烧瓶于处于5％CO₂的37℃培养箱中培养。在24小时后，移除包含非黏附细胞的培养基，并更换新鲜培养基。非黏附细胞部分保留做为“非黏附SVF”。

非黏附SVF细胞的表面免疫类型通过流式细胞技术表征。先检查CD34及CD45的表达，其是HSCs的典型标记。如在图1中所示，中央版，发现来自此脂肪组织样品的约40.88％的非黏附SVF细胞表达CD34⁺，CD34⁺是一种HSCs的熟知标记。(使用来自其它供体的脂肪组织的实验显示多至约50％-约60％的非黏附SVF细胞表达CD34⁺)。这些数据显示来自约100ml人脂肪组织可能产生至少约1×10⁷CD34⁺细胞。

在该非黏附SVF群中观察到多种CD34⁺亚群。对此代表性供体观察到两个不同的侧向角散射群，低CD34⁺(CD34^lo)及高CD34⁺(CD34^hi)。CD34^hi细胞包括约27.2％(23％+4.29％)的该非黏附SVF细胞，并且CD34^lo包括约13.59％(8.88％+4.71％)。CD34^hiCD45^-群包括约23％的该细胞。CD34^loCD45^-群包括约8.88％的该非黏附SVF细胞。CD34⁺CD45⁺群包括约9％的该非黏附SVF细胞(4.29％+4.71％)。

还进行了反向圈选(back-gating)以检查各种CD34⁺亚群的正向及侧向散射。此分析显示存在许多不同侧向角散射群(图1，在左侧的两版及在右侧的两版)。与CD34^lo群(底部左侧及底部右侧版)相较，发现CD34^hi群(顶部左侧及顶部右侧版)具有较低侧向角散射(SSC^lo)。低侧向角散射典型地与造血干细胞群相关。

CD38及CD41为已用于辨识CD34⁺细胞亚群的细胞表面标记，并且适度地有效用于预测改善的HSC移植。CD41表达显示造血作用的开始，并且也用于在CD34⁺细胞混合群中区分内皮祖细胞(CD34⁺CD41⁺细胞)和HSCs(CD34⁺CD38^-CD41^-细胞)。如在图2中所示(左两版)，包含约13％非黏附SVF群的高侧向角散射CD34⁺群包含显著量的CD41⁺细胞。值得注意地，该低侧向角散射CD34⁺群(非黏附SVF群的～16％)缺乏CD38和CD41二者的表达，这与HSCs典型的免疫表型一致。

在鉴定光散射采集点图中两个主要CD34⁺细胞群之后，分别闸控(gated)细胞以决定内皮(CD31)或基质标记(CD105及CD90)是否与CD34共表达。虽然CD90也可以在造血细胞上表达，但是Endogin(CD105)是排他性的基质谱系标记。如在图3中所示，在具有低侧向角散射的CD34⁺细胞及具有高侧向角散射的CD34⁺细胞中观察到各种共表达及谱系阴性群的水平。预测CD31及CD105不在CD34+HSCs上表达，CD34+CD31+细胞和CD34+CD105+细胞可能是内皮和基质细胞谱系。

因此，非黏附SVF细胞包括异相混合物内不同表型标记表达的多种置换：CD34+SSC^lo群、CD34⁺SSC^lo群、CD34^hiSSC^lo群、CD34^hiCD38^-CD41^-SSC^lo群；CD34^loCD45^-群；及CD34^loCD45⁺群。c-kit(CD117)的表达，其也是一种与HSCs相关的标记，也在约2-3％的非黏附SVF细胞上观察到。

另一种HSC标记即ABCG2的表达，在约16％的非黏附SVF细胞上观察到(图8B)。有利的是，具有光亮ABCG2荧光的非黏附SVF细胞具有不连续的光散射模式。在图8A中，圈起的细胞区域，表示约25％的总细胞，包含具有光亮ABCG2荧光的细胞。此特征允许仅基于光散射数据富集这些细胞且不需使用抗体或任何其它化学操作的可能性。因此，该非黏附SVF包括显现出与骨髓来源的HSCs相当的免疫表型及分化潜能的细胞。

集落形成单位测定使用有限稀释法以定量特定谱系祖细胞的频率。标示为“脂肪吸取物洗后沉淀”(APWP)“未分离的SVF”及“非黏附SVF”的单独细胞群在

培养基(干细胞技术(Stem Cell Technologies)，温哥华，加拿大)中接种，以研究造血集落形成祖细胞的存在。各种细胞成分以两种细胞浓度接种，25,000细胞/ml及50,000细胞/ml。将1.1mlMethocult培养基细胞悬浮液的等分试样添加至一式两份的35mm培养皿中。在培养14天后，计数及分析每板的CFUs数目以决定BFU-E、CFU-GM及CFU-GEMM集落的频率。一个实验的结果示于表1。

尽管在所分析的该三个细胞群的每一个中观察到所有三种类型的集落，包括BFU-E、CFU-GM及CFU-GEMM，但是在所述“非黏附SVF”群中观察到最高频率。图4-7显示在非黏附SVF细胞观察到的代表性集落。图4和5显示在40X放大率下的BFU-E集落。图6显示CFU-GM集落及图7显示CFU-GEMM集落。

表1

	APWP	SVF	非黏附SVF
				BFU-E	1∶25,000	1∶2,000	1∶600
CFU-GM	未观察到	1∶7,000	1∶5,000
				CFU-GEMM	未观察到	1∶50,000	1∶25,000

注意：APWP＝脂肪吸取物洗后沉淀；BFU-E＝爆发集落形成单位红细胞；GM＝粒细胞，巨噬细胞；GEMM＝粒细胞，红细胞，巨噬细胞，巨核细胞

醛脱氢酶(ALDH)的表达也已用于鉴定造血亚群。进行ALDH活性及PCR阵列分析，以鉴定在脂肪吸取物的基质血管成分的非黏附群内的潜在的造血亚群。初期数据显示ALDH^brSSC^lo群包括约17％的该非黏附SVF细胞群。

实施例2：使用脂肪来源的HSCs的骨髓再增殖测定

得自实施例1的人脂肪组织来源的造血干细胞基于骨髓再增殖测定进行关于造血分化的检测。将免疫缺陷SCID或是裸/米色鼠以11Gy的γ-照射以分多次剂量的致死量照射，并保持为酸化水及高压蒸汽处理灭菌的饮食。当为鼠来源时，造血细胞以约10⁷细胞/移植体造血细胞的量(10⁷骨髓来源的细胞)分离，或当为人类来源时，是约10⁶细胞/移植体的量(10⁶脂肪来源的HSCs或10⁶SVF细胞)分离，并且在以致死量照射16小时后经由尾静脉或后眼窝静脉或腹膜内注射引入小鼠。备选地，在移植进入经亚致死量照射的宿主动物之前，将人细胞与鼠造血细胞以约1∶10的比例混合，以研究竞争性的再增殖。动物在甲氧氟烷麻醉下输液。

在移植后六至十二周，从受体动物收集血液，并使用对人造血细胞标记包括，但不限于，Thy 1(T细胞标记)、B220(B细胞标记)、Mac 1(巨噬细胞标记)、及HLA(H-2K，人标记)特异的单克隆抗体进行流式细胞技术分析。确定相对于鼠来源的人总外周造血细胞的百分率。在类似研究中，从受体小鼠收集骨髓及脾脏，并且进行针对特定造血谱系的体外产克隆测定。这些研究利用基于甲基纤维素集落的研究。使用针对特定谱系决定的可比较的免疫荧光法分析细胞。

实施例3：使用脂肪来源的HSCs的骨髓再增殖测定

得自个体人供体的人脂肪组织通过吸脂分离，并且根据上文所叙述方法体外分离脂肪来源的HSCs。在包含10％胎牛血清、5％鸡胚提取物、干细胞因子、fit-3配体及抗生素的Iscove’s培养基中在37℃初始接种之后，这些细胞以原代培养物培养多至约5天的时间。

如在高剂量化疗之后，将细胞立即用于患有造血疾病的患者，或是冷冻保存以在供体或组织相容的受体有紧急医疗需求的情况下将来使用。在严重危及骨髓功能及免疫反应能力的任何事件之后，例如化疗或辐射之后，脂肪来源的HSCs以自体移植或同种异体移植的方式输注到受体。脂肪来源的HSCs以荧光标记标示，以允许医生在移植后可追踪其结局。加速骨髓恢复的证据使用流式细胞技术方法基于外周血流中新合成的造血细胞(淋巴细胞、脊髓细胞、红细胞、及血小板)的检测而进行监侧。

本文所引用的每一个专利、专利申请案、及公布的内容以其全文并入本文作为参考。

尽管本发明已参考特定实施方案进行了公开，但是，显然本发明其它实施方案及变化可由本领域技术人员作出且不偏离本发明真实意旨及范围。所附权利要求意欲解释为包含所有此种实施方案及其等价的变化。

Claims (36)

1.一种自脂肪组织分离造血干细胞的方法，所述方法包含：

取得脂肪组织，

自所述脂肪组织制备基质血管成分(SVF)；

及

分离在所述SVF中的非黏附细胞，

其中所述非黏附细胞包含造血干细胞，其中所述造血干细胞选自由下列各项所组成的组：ALDH^brSSC^lo细胞、CD34⁺细胞、CD34⁺SSC^lo细胞、CD34⁺CD45⁺细胞、CD34⁺CD38^-CD41^-细胞、CD34⁺CD45^-细胞、CD34⁺CD38^-CD41^-SSC^lo细胞及ABCG2-表达细胞。

2.权利要求1的方法，其中所述取得步骤包括吸脂。

3.权利要求1的方法，其中所述脂肪组织为人类的。

4.权利要求1的方法，其进一步包括自所述非黏附细胞分离CD34^hi细胞的步骤。

5.权利要求1的方法，其进一步包括自所述非黏附细胞分离ALDH^br细胞的步骤。

6.权利要求5的方法，其中所述ALDH^br细胞为ALDH^brSSC^lo。

7.权利要求1的方法，其中所述造血干细胞选自由下列各项组成的组：集落形成单位粒细胞巨噬细胞(CFU-GM)、爆发集落形成单位红细胞(BFU-E)和集落形成单位粒细胞红细胞巨噬细胞巨核细胞(CFU-GEMM)。

8.一种分离CD34⁺细胞的方法，所述方法包括：

取得脂肪组织；

自所述脂肪组织制备基质血管成分(SVF)；

分离在所述SVF中的非黏附细胞与黏附细胞，及

自所述非黏附细胞分离CD34⁺细胞，由此分离CD34⁺细胞，其中该CD34⁺细胞选自由下列各项组成的组：CD34⁺SSC^lo细胞、CD34⁺CD45⁺细胞、CD34^hiCD38^-CD41^-细胞、CD34⁺CD38^-CD41^-SSC^lo、CD34^loCD45^-细胞、CD34^loCD45⁺细胞、CD34⁺ALDH^br细胞和CD34⁺ALDH^brSSC^lo细胞。

9.权利要求8的方法，其中所述SVF包含至少40%CD34⁺细胞。

10.权利要求9的方法，其中该CD34⁺细胞以每100毫升脂肪组织分离至少1x10⁷CD34⁺细胞的比率分离。

11.权利要求8的方法，其中所述取得步骤包括吸脂。

12.权利要求8的方法，其中所述脂肪组织为人类的。

13.权利要求8的方法，其进一步包括分离CD34^hi细胞或CD34^lo细胞的步骤。

14.一种包含CD34⁺细胞的组合物，所述CD34⁺细胞按照权利要求8的方法分离，其中所述CD34⁺细胞以每1毫升脂肪组织分离至少1x10⁵CD34⁺细胞的比率分离。

15.权利要求14的组合物，其中所述脂肪组织为人类的。

16.治疗有效量的造血干细胞在制备用于向需要其的受体受试者提供的试剂中的应用，其中所述造血干细胞通过如下方式获得：自供体受试者取得脂肪组织，

自所述脂肪组织制备基质血管成分(SVF)，

分离在所述SVF中的非黏附细胞，和

自所述非黏附细胞分离造血干细胞，

其中所述造血干细胞选自由下列各项所组成的组：ALDH^brSSC^lo细胞、CD34⁺细胞、CD34⁺SSC^lo细胞、CD34⁺CD45⁺细胞、CD34⁺CD38^-CD41^-细胞、CD34⁺CD45^-细胞、CD34⁺CD38^-CD41^-SSC^lo细胞及ABCG2-表达细胞。

17.权利要求16的应用，其中所述供体受试者及所述受体受试者为人。

18.权利要求17的应用，其中所述供体受试者及所述受体受试者为相同的人。

19.权利要求17的应用，其中所述供体受试者及所述受体受试者不是相同的人。

20.权利要求16的应用，其中所述造血干细胞为CD34⁺且以每100ml脂肪组织分离至少1x10⁷CD34⁺细胞的比率分离。

21.权利要求18的应用，其中所述取得步骤包括吸脂。

22.权利要求16的应用，其中所述分离步骤包括分离ALDH^brSSC^lo细胞或CD34⁺CD38^-CD41^-SSC^lo细胞。

23.一种分离的细胞的组合物，其包含按照权利要求8的方法分离的至少40%非黏附、基质血管成分(SVF)CD34⁺细胞。

24.权利要求23的组合物，其中所述分离的细胞包含至少20%CD34⁺CD45^-细胞。

25.权利要求23的组合物，其中所述基质血管成分得自人脂肪组织。

26.权利要求23的组合物，其中所述CD34⁺细胞包含CD34⁺CD38^-CD41^-ALDH^br细胞。

27.权利要求23的组合物，其中所述CD34⁺细胞包含CD34⁺CD38^-CD41^-SSC^lo细胞。

28.权利要求23的组合物，其中所述CD34⁺细胞包含集落形成单位粒细胞巨噬细胞(CFU-GM)、爆发集落形成单位红细胞(BFU-E)及集落形成单位粒细胞红细胞巨噬细胞巨核细胞(CFU-GEMM)。

29.权利要求23的组合物，其中所述细胞是基因修饰的。

30.一种分离的细胞的组合物，其包含按照权利要求5的方法分离的至少10%非黏附、基质血管成分(SVF)ALDH^br细胞。

31.权利要求30的组合物，其包含至少15%非黏附SVF ALDH^br细胞。

32.权利要求30的组合物，其中所述ALDH^br细胞为ALDH^brSSC^lo细胞。

33.权利要求30的组合物，其中所述SVF得自人脂肪组织。

34.一种药物组合物，其包含权利要求14的组合物及药用载体。

35.一种药物组合物，其包含权利要求23的组合物及药用载体。

36.一种药物组合物，其包含权利要求30的组合物及药用载体。

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