CN114945673A - 无限增殖化成肌细胞系及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及尤其可用于细胞包封疗法的无限增殖化人细胞及其制备方法和用途。
Description
技术领域
本发明整体涉及包封领域，并且具体地涉及无限增殖化细胞系的开发和用于产生无限增殖化细胞系以用作包封细胞植入物以释放治疗性蛋白质或佐剂的方法。
背景技术
细胞包封技术允许在多个领域中长期和/或局部施用大分子。其基于将一个或若干个含有经遗传修饰的细胞的生物相容性胶囊植入受试者中以产生感兴趣的治疗性蛋白质。这种类型的胶囊通常由半透膜组成，半透膜提供机械保护并将经修饰的细胞隔离，从而避免移植细胞与免疫宿主细胞之间的接触，并导致包封细胞的存活期延长。此外，半透膜允许营养物质和氧气流入移植细胞，并允许感兴趣蛋白质流出至宿主，从而实现连续且延长的产生。
已经开发出使用可取出的包封细胞植入物的离体基因疗法作为用于局部和/或长期递送治疗性蛋白质的有效策略。具体地，已认为，调节患者的免疫系统的活力是一种用于治疗各种病症的新型方法，并且具体地，已开发出使用遗传工程化的包封细胞的治疗方案，诸如长期施用针对对抗神经退行性疾病的被动免疫的单克隆抗体和局部递送细胞因子作为抗癌疫苗的佐剂(Lathuilière等人，2015年，《国际分子科学杂志》，第16卷，第10578-10600页)。
最近已开发出一种针对抗癌主动免疫的技术，该技术使用分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的包封细胞并实现了由经遗传修饰的同种异体细胞(MVX-1细胞)标准化释放GM-CSF，GM-CSF具有对肿瘤消退有用的免疫保护活性和免疫增强活性。通过将受辐照的自体肿瘤细胞与2个含有MVX-1细胞的胶囊组合，在远离肿瘤沉积的健康皮肤中进行患者免疫，从而产生＞20ng/24h的huGM-CSF。这允许产生GM-CSF，并使免疫系统暴露于由注射部位处的自体肿瘤细胞表达的肿瘤相关抗原(TAA)。GM-CSF的局部表达募集并活化抗原呈递细胞(APC)，这在注射部位和全身诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和细胞毒性T淋巴细胞应答两者(WO 2017/064571)，如Mach等人，2015年，《肿瘤学年鉴》，第26卷(增刊第8期)，第1-4页，doi:10.1093/annonc/mdv513中所呈现的。
如果鉴于治疗面肩肱型肌营养不良(WO 2019/152820)，根据Stadler等人，2011年，《骨骼肌》，第1卷第12期，第94页已经通过CD4和hTERT的逆转录病毒转导使人原代成肌细胞系无限增殖，则用抗生素选择所得的无限增殖化细胞，这些抗生素对于在疗法中用作潜在的免疫原性来源十分不便。
其他利用hTERT、CDK4R24C突变体和细胞周期蛋白d1的过表达使原代人成肌细胞无限增殖的尝试不会产生具有肌原性潜能的成肌细胞或者不能扩展到临床应用(Min-wenJason等人，2019年，《细胞增值》，第52卷第3期)。
为了优化包封技术的人类应用，关键点是产生可植入、安全且可用的人细胞系作为用于感兴趣的重组蛋白的体内分泌的平台。因此，需要开发得到新开发的有效细胞系，这些有效细胞系尤其适用于兼顾安全性和长效性的包封技术。
发明内容
本发明基于一种用于制备和选择无限增殖化人成肌细胞的方法的意外发现，该方法允许在细胞包封装置中获得具有优异存活特征，具体地能够在恶劣的代谢条件下分化，同时维持重组蛋白的高分泌水平的无限增殖化人成肌细胞。
具体地，根据本发明的使人成肌细胞无限增殖的方法包括用编码CDK4蛋白的至少一种慢病毒载体(诸如pCLX型或pRRLSIN或其他合适的慢病毒载体，诸如Giry-Laterrière，2011年，《分子生物学方法》，第737卷，第183-209页中所述的那些)和编码hTERT蛋白的至少一种慢病毒载体(诸如pCLX型或pRRLSIN或其他合适的慢病毒载体，诸如Giry-Laterrière，2011年(出处同上)中所述的那些)转导从来自供体(例如健康供体或自体供体)的肌肉组织分离的人成肌细胞，以及选择与使用单细胞克隆技术的亲本细胞系相比，在包封时具有改善的体外增殖和稳定性特性(诸如延长的存活期)的至少一种无限增殖化单个克隆(不使用选择抗生素)。具体地，通过本发明的方法获得的选定无限增殖化人成肌细胞系(诸如例如以编号CCOS 1902保藏的细胞系)有利地在生物相容性胶囊中呈现长期存活和增殖能力，并长期保持成肌细胞特征(诸如例如高水平的MHC)。
此外，本发明的另一个方面基于本发明的无限增殖化人成肌细胞系可容易地被遗传工程化以表达感兴趣蛋白质，尤其可用于包封疗法技术领域的意外发现，并且提供了一种用于制备经遗传修饰的无限增殖化人成肌细胞的方法，其中所述方法包括在缺氧条件下被过度活化的启动子，尤其是PGK(磷酸甘油酸激酶)启动子，尤其是人PGK启动子的控制下用编码感兴趣蛋白质的至少一种慢病毒载体(例如pCLX或pRRLSIN型)转导根据本发明的无限增殖化人成肌细胞。在该启动子的控制下，在缺氧条件下，由根据本发明的经遗传修饰的无限增殖化人成肌细胞分泌的蛋白质有利地增加2至3倍，这使得这些细胞对于在使细胞经受缺氧条件的细胞包封技术中使用更有意义。具体地，通过本发明方法获得的分泌GM-CSF的经遗传修饰的无限增殖化人成肌细胞系(诸如例如以编号CCOS 1901保藏的细胞系)有利地在可植入装置中呈现长期存活和增殖能力，并长期保持高水平分泌GM-CSF的成肌细胞特征，这些对于癌细胞疗法非常有用。
本发明的一个目的是提供可用于细胞包封技术的无限增殖化人细胞系。
有用的是提供无限增殖化人细胞系，该细胞系不是致瘤的，并且即使在缺氧条件下也呈现延长的存活期。
有用的是提供用于自发移植的无限增殖化人细胞系，该细胞系可以在不限制免疫豁免位点的情况下使用。
有用的是提供具有优化特性的无限增殖化人细胞系，而无需借助于抗生素选择细胞系。
有用的是提供能够被遗传工程化以分泌高水平的感兴趣蛋白质的无限增殖化人细胞系。
有用的是提供能够维持感兴趣蛋白质的基因的高水平表达而不随时间推移沉默的遗传工程化的无限增殖化人细胞。
有用的是提供能够在包封装置中维持感兴趣蛋白质的高水平分泌的遗传工程化的无限增殖化人细胞。
有用的是提供遗传工程化的无限增殖化人细胞，这些细胞能够被冷冻并在装载到包封装置中之后解冻，并维持感兴趣蛋白质的高水平分泌。
本发明的目的已通过提供根据权利要求3和5所述的无限增殖化人成肌细胞系、其用途以及根据权利要求1所述的用于获得无限增殖化人成肌细胞系的方法而实现。
本发明的目的还已通过提供根据权利要求9和10所述的遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞、其用途以及根据权利要求7所述的用于获得遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞的方法而实现。
根据本发明的第一方面，本文公开了一种建立无限增殖化人成肌细胞系的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供至少一种原代人成肌细胞，该至少一种原代人成肌细胞表达表面标记物CD56和选自CD82和CD146的任选的至少一种其他表面标记物；
b)用编码细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)基因的慢病毒载体和编码人端粒酶(hTERT)基因的催化亚基的慢病毒载体转导所述至少一种原代人成肌细胞，以获得所述原代人成肌细胞的无限增殖；
c)在成肌细胞生长培养基中培养来自在步骤b)中获得的至少一种无限增殖化原代人成肌细胞的细胞，并从生长培养基中分离每种所获得的细胞，该每种所获得的细胞在单独培养基中呈现至少一种成肌细胞表型标记物；
d)在单独的培养和扩增培养基中分别培养在步骤c)中获得的每种所分离的细胞；
e)在步骤d)的所有单独的培养和扩增培养基中通过单细胞克隆从亲本细胞选择具有改善的稳定性或表达特性的至少一种细胞系；
f)控制所选择的至少一种细胞系的肌原性潜能；
g)基于单独的克隆在包封装置中存活的能力选择单独的克隆；
h)任选地依次重复步骤d)至g)以进一步改善所选择的细胞系。
根据本发明的另一个方面，提供了一种无限增殖化人成肌细胞系或其来源于原代人成肌细胞的子代或包含无限增殖化人成肌细胞的组合物包含无限增殖化人成肌细胞的组合物，其中所述细胞表达CDK4和hTERT并保留成肌细胞特征，并且其中所述细胞不表达抗生素抗性基因。
根据本发明的另一个方面，提供了一种无限增殖化人成肌细胞系或其子代或组合物，该无限增殖化人成肌细胞系以登记号1902由CCOS保藏(保藏于2019年6月20日)。
根据本发明的另一个方面，提供了一种无限增殖化人成肌细胞系或其来源于原代人成肌细胞的子代或包含无限增殖化人成肌细胞的组合物，该无限增殖化人成肌细胞系能够从根据本发明的方法获得。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于制备在缺氧条件下表达治疗性蛋白质的遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞的方法。
根据本发明的另一个方面，提供了一种根据本发明的遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞系或其子代或组合物。
根据本发明的另一个方面，提供了一种遗传无限增殖化人成肌细胞系或其子代或组合物，该遗传无限增殖化人成肌细胞系分泌GM-CSF并以登记号1901由CCOS保藏(保藏于2019年6月20日)。
根据本发明的另一个方面，提供了一种遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞系或其子代或组合物，该遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞系能够从根据本发明的方法获得。
根据本发明的另一个方面，提供了用于包封细胞疗法的本发明的遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞。
根据本发明的另一个方面，提供了一种药物组合物，该药物组合物包含根据本发明的至少一种遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞及其药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
根据另一个方面，本发明提供了本发明的遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞，这些遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞用于预防和/或治疗病症或疾病，尤其是癌症、炎性病症、感染性疾病，尤其是病毒感染或神经退化性病症。
根据另一个方面，本发明提供了本发明的遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞用于制备药物组合物或可植入包封细胞装置，以预防和/或治疗病症或疾病，尤其是癌症、炎性病症、感染性疾病，尤其是病毒感染或神经退化性病症的用途。
根据另一个方面，本发明提供了一种可植入生物相容性装置或试剂盒，该可植入生物相容性装置或试剂盒包含在细胞培养基中的根据本发明的至少一种无限增殖化人成肌细胞。
根据另一个方面，本发明提供了一种预防或治疗受试者中相关联的病症或疾病，尤其是癌症、炎性病症、感染性疾病，尤其是病毒感染或神经退化性病症的方法，所述方法包括在对其有需要的受试者中施用治疗有效量的本发明的遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞。
附图说明
图1代表增殖能力，其表示为与原代成肌细胞(P)相比，在转导本发明的无限增殖化人成肌细胞(I)之后，即在本发明方法的步骤d)之前，细胞群体倍增数(N)对比月数(M)，如通过实施例1中所述在每次传代时进行细胞计数所测量的。
图2代表增殖能力，其表示为在如实施例1中所述从9个选定克隆的无限增殖化人成肌细胞群体(I)分选克隆之后细胞群体倍增数(N)对比周数(W)。
图3示出通过本发明方法获得的克隆在无限增殖和分选之后(在步骤d)之后)与无限增殖化群体相比保持的肌原性特征，如通过流式细胞术定量的与分选之前的无限增殖化细胞群体(I)相比，随时间推移维持其表达肌原性标记物的能力(A)，以及通过免疫组织化学定量的与原代细胞(P3)和分别经过10次和24次传达的无限增殖化细胞群体(P10)和(P24)相比，保持其融合和分化成肌管的能力(B)所测量的，如实施例1中所述。
图4示出通过ELISA测量的由本发明的经遗传修饰的无限增殖化人成肌细胞(克隆2)刚好在转导之后(A)、对比克隆2转导之后的周数(W)(B)和方法的分选步骤(iv)之后的各种克隆在转导之后的不同周数(C)实现的GM-CSF分泌速率，如实施例3中所述。
图5示出增殖能力，其表示为在从10个选定克隆的经遗传修饰的无限增殖化人成肌细胞群体分选克隆之后细胞群体倍增数(N)对比周数(W)，如实施例3中所述。
图6示出通过本发明方法获得的克隆在分选之后(在步骤iv)之后)保持的肌原性特征，如通过流式细胞术定量的随时间推移维持其表达肌原性标记物的能力(A)，以及通过免疫组织化学定量的与亲本群体(MOI＝10和100)相比，保持其融合和分化成肌管的能力(B)所测量的，如实施例2中所述。
图7示出如通过ELISA测量的在体内移植之后不同周时与对照包封细胞(MVX-1)相比，由各种包封选定克隆实现的GM-CSF分泌速率，如实施例3中所述。
图8示出两个选定克隆61.27和62.14在以下方面随时间推移的稳定性：作为非包封细胞的体外增殖速率(A)，其表示为在从经遗传修饰的无限增殖化人成肌细胞群体分选克隆之后细胞群体倍增数(N)对比周数(W)；在分选之后作为非包封细胞的体外分泌速率对比周数(W)(B)和在包封之后作为包封细胞的体外分泌速率对比周数(W)(C)；与对照包封细胞(MVX-1)比较，作为包封细胞在小鼠中的体内分泌速率，如通过定量在植入之前比较的血清中的(D)和胶囊周围的组织(E)中的GM-CSF测量的，如实施例3中所述。
图9是用于实验中的具有本发明的包封细胞的可植入包封装置的图示。a：是根据本发明的一个实施方案的可植入胶囊的示意图。b：是穿过图9a的线II-II的剖视图；c：是类似于图9b的剖视图，其中胶囊的内部基质被移除；d：是含有根据本发明的无限增殖化成肌细胞24的可植入包封装置内部的细胞接收部分2的图9c中的圆圈IV的详细视图。e：是图9b的圆圈V的详细视图。
图10示出如通过ELISA测量的由本发明的冷冻包封的经遗传修饰的无限增殖化人成肌细胞(M)实现的GM-CSF分泌速率对比解冻之后的时间(以小时计)，这些细胞在作为冷冻培养基的5％(A)和10％(B和C)甘油中配制并且与冷冻培养基温育不同时间并与对照包封细胞(MVX-1)进行比较，如实施例3中所述。
图11支持在实施例1中从用编码利妥昔单抗的重链和轻链的慢病毒载体转导的克隆2获得的无限增殖化成肌细胞产生生物活性单克隆抗体的能力，如实施例4中所述。A：由本发明的经遗传修饰的细胞和商业利妥昔单抗分泌的IgG在与荧光标记的抗CD20抗体温育时表现相同；B和C：在B细胞系暴露于利妥昔单抗或成肌细胞产生的抗CD20之后，测试细胞毒性应答(IFN-γ(B)或CD107a(C)的过表达)的诱导的脱颗粒测定中，成肌细胞产生的IgG同样有效。
图12比较了两种不同胶囊和两种类型细胞的huGM-CSF释放，如实施例5中所述。A：以下组的胶囊上清液中的体外GM-CSF释放：A组：根据本发明的一个实施方案的含有分泌相同治疗性蛋白质GM-CSF的经遗传修饰的无限增殖化人成肌细胞的胶囊(图9中所示)，B组：根据本发明的一个实施方案的装载于同一胶囊中的表达人GM-CSF的K562人红白血病细胞，即对照细胞系(示于图9中)，和C组：含有相同对照细胞系，即表达人GM-CSF的K562人红白血病细胞的常规胶囊；B：来自从皮下植入小鼠中保持一周的外植胶囊的GM-CSF释放(各组与图A中的相同)；C：胶囊已植入一周的小鼠的血清中的GM-CSF水平(各组与图A中的相同)；D：一周后在所植入的胶囊周围的皮下组织中检测到的GM-CSF的量(各组与图A中的相同)。
图13代表在CTLA-4阻断报道基因测定中由根据本发明的无限增殖化成肌细胞产生的单克隆抗体的生物活性(成肌细胞被转导以用于表达对抗人CTLA4的单克隆人IgG：C2)并与作为阳性对照(C1)的伊匹单抗生物类似物(YervoyTM，百时美施贵宝公司(Bristol- Myers Squibb SA))进行比较，如实施例3中所述。
图14代表使用由无限增殖化成肌细胞产生的抗β-淀粉样蛋白单克隆抗体对阿尔茨海默病脑切片进行的免疫组织化学，如实施例4中所述。
图15代表使用两种不同的一抗AQ806和AI334，检测所转导的无限增殖化成肌细胞的纯培养物上清液或稀释(1:5、1:25)培养物上清液中的COVID-19纤突蛋白的斑点印迹，如实施例6中所述。
具体实施方式
如本文所用，“治疗”(“treatment”和“treating”等)通常是指获得期望的药理和生理效果。该效果在预防或部分预防疾病、其症状或病症方面可以是预防性的，并且/或者在部分或完全治愈疾病、病症、症状或由疾病引起的不良反应方面可以是治疗性的。如本文所用的术语“治疗”涵盖对哺乳动物，尤其是人中疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病在可能易患疾病但尚未诊断为患有该疾病的受试者中发生，诸如预防性早期无症状干预；(b)抑制疾病，即阻止其发展；或缓解疾病，即引起疾病和/或其症状或病症的消退，诸如损伤的改善或修复。具体地，根据本发明的方法、用途、制剂和组合物可用于包封细胞疗法。
如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物。例如，本发明所设想的哺乳动物包括人、灵长类、家畜(诸如牛、羊、猪、马)、实验室啮齿类动物、其他宠物等。
如本文所用的术语“有效量”是指在所寻求的组织、系统、动物或人中引起生物或药物应答的本发明的至少一种化合物或根据本发明的其药物制剂的量。在一个实施方案中，有效量是用于减轻所治疗的疾病或病症的症状的“治疗有效量”。在另一个实施方案中，有效量是用于预防所预防的疾病或病症的症状的“预防有效量”。该术语在本文中还包括足以减慢疾病的进展，特别是减慢或抑制病症的进展并由此引起所寻求的应答的本发明化合物的量(即“有效量”)。
根据本发明的术语治疗的“功效”可基于疾病过程中响应于根据本发明的用途或方法的变化来测量。例如，癌症治疗的功效可通过肿瘤尺寸的减小或通过总存活期(OS)或无进展存活期(PFS)的延长，或通过实现疾病稳定(SD)，或血清肿瘤标记物诸如前列腺特异性抗原(PSA)、癌抗原125(CA125)、癌胚抗原(CEA)的减少，或降低的代谢活性、降低的遗传异常诸如循环肿瘤脱氧核糖核酸(ctDNA)来测量。
术语“肌原性潜能”是指细胞形成肌管的能力。这种能力可通过标准技术诸如本文所述的技术或通过流式细胞术、蛋白质印迹法来测试。
术语“人成肌细胞表型标记物”是指人成肌细胞的表型特征，诸如CD56+、CD146+、CD82+。这些可通过荧光活化细胞分选(FACS)或通过免疫组织化学或蛋白质印迹法来评估。根据一个具体方面，所述至少一种成肌细胞表型标记物选自CD56+、CD146+和CD82+。
术语“细胞生长培养基”是指适于培养成肌细胞的培养基，诸如补充有至少一种生长因子诸如表皮生长因子、肌酸、尿苷、地塞米松、胎牛血清、胎球蛋白、牛血清白蛋白、胰岛素或丙酮酸盐的培养基。根据一个具体实施方案，扩增培养基可指如上定义的细胞生长培养基。
术语“药物制剂”是指这样的制剂：其以实现活性成分的明确有效的生物活性的形式存在，并且其不含对将施用所述制剂的受试者有毒的附加组分。
根据本发明的制备无限增殖化人成肌细胞的方法
根据一个方面，本发明提供了一种建立无限增殖化人成肌细胞系的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供至少一种原代人成肌细胞，该至少一种原代人成肌细胞表达表面标记物CD56和选自CD82和CD146的任选的至少一种其他表面标记物；
b)用编码细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)基因的慢病毒载体和编码人端粒酶(hTERT)基因的催化亚基的慢病毒载体转导所述至少一种原代人成肌细胞，以获得所述原代人成肌细胞的无限增殖；
c)在成肌细胞生长培养基中培养来自在步骤b)中获得的至少一种无限增殖化原代人成肌细胞的细胞，并从生长培养基中分离每种所获得的细胞，该每种所获得的细胞在单独培养基中呈现至少一种成肌细胞表型标记物；
d)在单独的培养和扩增培养基中分别培养在步骤c)中获得的每种所分离的细胞；
e)在步骤d)的所有单独的培养和扩增培养基中通过单细胞克隆从亲本细胞选择具有改善的稳定性或表达特性的至少一种细胞系；
f)控制所选择的至少一种细胞系的肌原性潜能；
g)基于单独的克隆在包封装置中存活的能力选择单独的克隆；
h)任选地依次重复步骤d)至g)以进一步改善所选择的细胞系。
根据一个具体方面，本发明方法的步骤a)可使用两种单独的慢病毒载体或单一的双顺反子载体进行，诸如Reiser等人，2000年，《病毒学杂志》，2000年，第74卷第22期，第10589-10599页；Amendola等人，2005年，《自然生物技术》，第23卷，第108-116页中所述。
根据一个具体方面，步骤b)中使用的慢病毒载体是pCLX型载体，诸如Salmon，2013年，《分子生物学方法》，第945卷，第417-448页中所述。
根据一个具体方面，在步骤b)中提供用于转导的所述至少一种原代人成肌细胞可通过标准方法诸如Laumonier等人，2017年，《可视化实验期刊》，第26卷第125期中所述的酶消化法从人肌肉组织分离。
根据另一个具体方面，步骤c)中的细胞生长直至非无限增殖化细胞死亡。
根据另一个具体方面，步骤c)中的细胞生长进行至少1.5个月，即非无限增殖化细胞死亡所需的时间。
根据一个具体实施方案，对表达表面标记物CD56并且任选地表达另外的表面标记物CD82和/或CD146的原代人成肌细胞的选择可通过流式细胞术实现。
根据一个具体方面，在本发明方法的步骤c)中选择的成肌细胞呈现成肌细胞表型标记物CD56+、CD146+和CD82+。另外特别出乎意料的是，本发明的方法允许选择具有该三阳性的细胞亚群，因为已经发现并非所有CD56阳性细胞都是CD82阳性细胞。根据另一个具体方面，根据本发明的方法有利地包括基于本文所述的表面标记物的选择/富集步骤。
根据一个具体方面，进行步骤d)直至细胞在培养物中维持4周时显示出稳定的增殖和活力。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于制备在缺氧条件下表达治疗性蛋白质的遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞的方法，其中所述方法包括以下步骤：
i)提供至少一种无限增殖化原代人成肌细胞；
ii)用慢病毒载体转导所述至少一种无限增殖化原代人成肌细胞，以用于在磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子(例如人PGK)控制下表达靶蛋白；
iii)在单独的培养和扩增培养基中分别培养在步骤ii)中获得的每种所分离的细胞；
iv)诸如通过ELISA或蛋白质印迹法在步骤iii)的所有单独的培养和扩增培养基中选择具有最高靶蛋白分泌水平的至少一种细胞系；
v)控制所选择的至少一种细胞系的肌原性潜能。
根据一个具体方面，在步骤iv)中选择的至少一种细胞系是呈现至少1pg/细胞/天的靶蛋白分泌水平的细胞系。
根据一个具体方面，靶蛋白是人糖蛋白。
根据一个具体方面，靶蛋白是人GM-CSF。
根据一个具体方面，靶蛋白是人单克隆抗体。
根据一个具体方面，靶蛋白选自利妥昔单抗(rituximab)、伊匹单抗(ipilimumab)和甘特珠单抗(gantenerumab)。
根据一个具体方面，靶蛋白是抗原。
根据一个具体方面，靶蛋白是病毒抗原。
根据一个具体方面，靶蛋白是COVID-19纤突蛋白或其抗原片段。
根据一个具体方面，根据本发明的方法在生长步骤中使用选自胎球蛋白、表皮生长因子或胰岛素的至少一种生长因子。
根据一个具体方面，根据本发明的方法允许在不需要涂覆培养板的情况下培养细胞。
根据另一个方面，本发明提供了一种通过免疫疗法治疗受试者的方法，所述方法包括在对其有需要的所述受试者中施用根据本发明的至少一种遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞。
根据另一个方面，本发明提供了一种用于治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括在所述受试者中施用根据本发明的至少一种遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞。
根据另一个方面，本发明提供了一种针对受试者中的病毒感染进行疫苗接种的方法，所述方法包括在对其有需要的受试者中施用治疗有效量的本发明的遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞，其中所述细胞表达病毒抗原。
根据本发明的细胞
根据本发明的一个具体方面，提供了一种无限增殖化人成肌细胞系或其来源于原代人成肌细胞的子代或包含无限增殖化人成肌细胞的组合物，其中所述细胞在不存在抗生素抗性基因表达的情况下表达CDK4和hTERT并保留成肌细胞特征，诸如分化成肌管的能力。
根据本发明的另一个方面，根据本发明的无限增殖化人成肌细胞系在至少6个月内呈现相当于约24小时至约72小时的倍增时间的增殖速率。
根据本发明的另一个方面，根据本发明的无限增殖化人成肌细胞系在标准成肌细胞培养基中在缺氧条件下呈现至少约48小时的存活期。
根据本发明的一个具体方面，提供了根据本发明的无限增殖化人成肌细胞，这些细胞能够在成肌细胞培养基中继续稳定生长长达至少六个月。
已证实根据本发明的无限增殖化人成肌细胞在包封装置中具有延长的存活期，同时维持感兴趣蛋白质的高水平分泌，并因此提供独特且非常有利的平台以供进一步开发被遗传工程化以在各个应用领域中分泌感兴趣蛋白质的新细胞系。
例如，遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞通常能够在标准成肌细胞培养条件下以约1pg/细胞/天至约15pg/细胞/天的速率分泌蛋白质。
根据本发明的另一个方面，提供了一种遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞系或其子代或包含遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞的组合物，其中所述细胞表达CDK4、hTERT并表达至少一种治疗性蛋白质或抗原，保留成肌细胞特征并能够分泌所述治疗性蛋白质或抗原。
例如，根据本发明的遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞表达GM-CSF并且能够分泌GM-CSF。通常，根据一个具体方面，根据本发明的遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞能够在标准成肌细胞培养条件下在约6个月内以约1pg/细胞/天至约5pg/细胞/天的速率分泌GM-CSF。
根据本发明的另一个方面，提供了一种遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞系，该遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞系表达人、人源化或嵌合单克隆抗体(例如抗CD20单克隆抗体利妥昔单抗、伊匹单抗、甘特珠单抗(gantenerumab))或重组蛋白(例如小鼠或人激素或生长因子)或抗原(例如病毒抗原，诸如COVID-19纤突蛋白抗原)。
根据本发明的组合物
本发明提供了细胞及其药物组合物，以及用于治疗患有医学病症的受试者，优选地哺乳动物受试者，并且最优选地人类患者的方法。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物含有本发明的至少一种细胞及其药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明的无限增殖化细胞或其制剂可作为药物制剂施用，该药物制剂可含有呈本文所述的任何形式的根据本发明的一种或多种试剂。为了用作包封细胞，可将细胞制备为在细胞生长培养基，优选地无动物成分培养基中的各种类型的悬浮液或其他流体制剂。
在一个实施方案中，细胞可悬浮在合适的流体培养基诸如生长或分化培养基中。流体培养基可包括用于活细胞的生长或维持的生理上可接受的水溶液。例如，流体培养基可包含细胞需要并在体外和/或体内使用的葡萄糖、盐、矿物质、缓冲剂、氨基酸、激素和生长因子。适用于包封细胞的流体培养基描述于例如PBS、HBSS、MyoCult或如本文所述的细胞生长培养基中。
在一个实施方案中，将细胞包封在水凝胶，诸如聚乙二醇(PEG)、藻酸盐或脱乙酰壳多糖水凝胶中。基于PEG的包封在Lathuillère等人，2014年，《生物材料》，第35卷，第780-790页中有更详细的描述。细胞可在支持基质诸如聚乙烯醇(PVA)、PEG、聚乙烯、聚酯上生长，诸如Li，2000年，《组织工程学》，第6卷第2期，第151-163页；Li，1999年，《组织工程学》，第5卷第5期，第453-466页(Uludag，2000年，《先进药物输送评论》，第42卷第1-2期，第29-64页中所述。
在一个实施方案中，包封在装置中的需要冷冻保存的细胞可在含有冷冻保护剂的制剂中制备，诸如Elliott等人，2017年，《低温生物学》，第76卷，第74-91页中所述。
包含本发明细胞的可植入装置或试剂盒
本发明的无限增殖化成肌细胞可用于ECT，并因此可被包封在细胞植入物中，诸如包封在Lathuillère等人，2014年(出处同上)或WO 2014/173441中所述的平板中，或包封在诸如Lathuillère等人，2015年(出处同上)中所述的中空纤维装置中，这取决于所分泌的蛋白质和装置的植入部位。也可使用诸如Orive等人，2019年，《视网膜与眼科研究进展》，第68卷，第67-82页中所述的另选装置。
根据一个具体方面，提供了一种含有有效量的本发明的无限增殖化人成肌细胞的可植入装置。
根据另一个具体方面，提供了一种用于哺乳动物中基于细胞的疗法的试剂盒和使用该试剂盒来制备细胞包封植入物的说明书，该试剂盒包含有效量的本发明的无限增殖化人成肌细胞。
根据另一个具体方面，提供了一种用于哺乳动物中基于细胞的疗法的试剂盒及其使用说明书，该试剂盒包括可植入装置，该可植入装置含有有效量的所述无限增殖化人成肌细胞。
根据另一个实施方案，本发明的试剂盒还可包含可用于抗癌或抗感染疫苗接种的抗原性材料(例如一种或多种抗原)。
根据一个具体实施方案，可植入装置的细胞室含有介于1.0×104个至8×105个之间的根据本发明的无限增殖化人成肌细胞(例如，1.0×104个、5.0×104个、1.0×105个、3.0×105个、5.0×105个或8×105或106个细胞)，这取决于应用和所分泌的蛋白质。本领域的技术人员将认识到，每个室中的精确细胞数目可取决于所包封的细胞/细胞系的生长速率和/或用于构建装置的单个室的体积两者。
根据一个具体实施方案，考虑到如在WO 2017/064571中所述的个性化抗肿瘤细胞免疫疗法中使用，分泌GM-CSF的无限增殖化人成肌细胞可在如其中所述的可植入胶囊中调理。
根据一个具体实施方案，含有根据本发明的至少一种无限增殖化人成肌细胞的可植入装置可被冷冻保存，并且这些冷冻保存的装置可使用本领域已知的任何方法在气相液氮(例如，-190℃)条件下和/或在干冰(例如，-70℃)条件下运输。
在植入之前，可使用本领域已知的任何方法，通常在37℃水浴或干浴中，在植入之前将冷冻保存的装置解冻。
根据一个具体方面，可在包封之前和/或在解冻之后植入之前进行细胞的活力和/或功能性测试以证实它们用于例如移植的适当性。这可使用本领域已知的多种方法来实现。例如，可使用活体染料，诸如例如台盼蓝或溴化乙锭或吖啶橙或Live/Dead测定试剂盒(分子探针；马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA))将细胞染色。在优选的实施方案中，适于移植的细胞群体具有至少约50％、至少约75％、至少约95％或至少约99％的活力。在其他实施方案中，可确定细胞的形态测量特征，作为细胞用于植入的适当性的量度。
施用模式
根据本发明的细胞及其制剂可通过植入生物相容性可植入装置来施用，该生物相容性可植入装置含有有效量的本发明的无限增殖化人成肌细胞并允许由植入物内部的活细胞分泌的蛋白质的缓慢释放。
根据另一个方面，根据本发明的细胞及其制剂可在微胶囊或微球中施用，诸如Acarregui等人，2013年，《生物大分子》，第14卷第2期，第322-330页中所述，或在疏水性基质或亲水性基质、生物可降解基质或矿物基质中施用。
根据另一个方面，根据本发明的细胞及其制剂可作为细胞悬浮液直接注射。
根据一个具体方面，适用于本发明细胞的可植入装置可如下：
本文公开了一种可植入胶囊，该可植入胶囊包括细胞接收部分，该细胞接收部分包括围绕细胞接收室的多孔膜，该细胞接收室用于接收在其中的液体培养基中的无限增殖化细胞以分泌治疗剂；该可植入胶囊的特征在于，该胶囊还包括插入细胞接收室内的细胞支持基质，该细胞支持基质被构造用于在细胞接收室内布置无限增殖化细胞。
在一个实施方案中，细胞支持基质包括至少一根纱(yarn)。
在一个有利的实施方案中，所述至少一根纱由聚酯材料组成或包括聚酯材料。
在一个有利的实施方案中，细胞支持基质包括多根所述纱。
在一个有利的实施方案中，该多根纱的范围为5至20根纱，优选地5至15根纱线，例如为约10根纱。
在一个有利的实施方案中，纱在细胞接收室内在室的基本上整个长度上延伸，或者在细胞接收室的至少80％长度上延伸。
在一个有利的实施方案中，细胞接收室包括聚酯纱。
在一个有利的实施方案中，细胞接收部分还包括安装在细胞接收室中的膜支撑体，该膜支撑体被构造用于向多孔膜提供结构支撑并由线圈组成或包括线圈，该线圈由生物相容性材料制成，例如不锈钢线圈。
在一个有利的实施方案中，胶囊还包括与细胞接收部分的提取器端耦接的提取器部分，该提取器部分被构造用于允许外科工具将可植入胶囊从植入部位拉出，并包括取出线。
在一个有利的实施方案中，取出线由聚丙烯线制成。
在一个有利的实施方案中，提取器部分包括锚管(8)，该锚管其中具有腔体，在该腔体内插入并粘结取出线(9)的锚部分(15)。
在一个有利的实施方案中，锚管由聚氨酯材料组成或包括聚氨酯材料。
在一个有利的实施方案中，提取器部分通过耦接头与细胞接收部分耦接，该耦接头包括连接器，该连接器包括插入到多孔膜的提取器端中的一部分和插入在锚管的耦接端中的第二部分。
在一个有利的实施方案中，连接器通过粘合剂，例如光固化甲基丙烯酸氨基甲酸酯类型的粘合剂，尤其是光固化性粘合剂粘结到锚管和细胞接收部分。
在一个有利的实施方案中，胶囊的外径在0.5毫米至3毫米的范围内，优选地在0.8毫米至1.5毫米的范围内，并且具有在5毫米至25毫米的范围内，优选地在8毫米至20毫米的范围内的长度。
在一个有利的实施方案中，胶囊的长度与直径比率在5至20的范围内。
参考图9，根据本发明的一个实施方案的可植入胶囊1包括通过耦接头4连接在一起的细胞接收部分2和提取器部分3。细胞接收部分2包括大致圆柱形的外部形状，其直径通常可在0.5毫米至3毫米的范围内，并且其长度通常可在5毫米至20毫米的范围内，例如为约10毫米。长度L与直径D的比率L/D优选地在5至20的范围内，优选地在5至15的范围内。胶囊可借助于植入装置植入患者的组织中，这些植入装置在植入物领域中本身是众所周知的，并且不需要在本文进一步描述。
细胞接收部分2包括多孔膜5，该多孔膜被构造用于允许由包含在胶囊中的细胞24产生的治疗剂穿过膜到达周围组织，并且允许用于细胞24的流体和电解质和营养物质穿过膜从周围组织进入胶囊。因此，膜的孔隙率和类型可取决于特定应用和包含在胶囊内的细胞的类型。在一个示例中，膜为例如聚醚砜(PES)膜的形式，该膜具有约0.65μm的孔隙度并且被构造成允许靶分子通过膜。可用于本发明的膜的示例详述于下文中：
基于其生物相容性化学组成、结构特性以及固有的膜性能，诸如优异的流速、下游清洁度和低蛋白结合亲和力，膜的一个示例性实施方案包含聚醚砜。它可呈不同形状挤出并在小直径管材中挤出。
细胞接受部分2可具有如Lathuillère等人，2014年，《生物材料》，第35卷，第780-790页或WO 2014/173441中所述的平板形式，或者如Lathuillère等人，2015年(出处同上)中所述的中空纤维形式，这取决于所分泌的蛋白质和装置的植入部位。
细胞接收部分2可含有有效量的细胞，诸如例如介于约1.0×104个至8×105个之间的根据本发明的细胞(例如，1.0×104、5.0×104、1.0×105、3.0×105、5.0×105或8×105或106个细胞)，这取决于应用和所分泌的蛋白质。本领域的技术人员将认识到，细胞接收部分中的精确细胞数目可取决于所包封的细胞/细胞系的生长速率和/或细胞接收部分的体积两者。
多孔膜5围绕细胞接收室13和细胞接收室13内的膜支撑体6。膜支撑体用于机械地支撑多孔膜，以保持细胞接收室13中的体积的稳定性并防止膜破裂。在例示的实施方案中，膜支撑体为线圈的形式，尤其是例如在WO 2017/0645701中所述的本身已知的不锈钢线圈。膜支撑体6还用于通过耦接头4锚定提取器部分3。
在例示的实施方案中，耦接头4包括连接器10，该连接器具有插入到膜支撑体6中，具体地在由本示例中的不锈钢线圈围绕的圆柱体内的部分10a。连接器插入部分10a的直径可被构造成以紧密配合接合在线圈的提取器端中，以保持两者间的稳定连接。耦接头4还包括接合提取器部分3的锚定件8的固定部分10b，由此在当前示出的实施方案中，锚定件8为管的形式，优选地为配合在连接器10的第二端10b上的聚氨酯(PU)管。在分别将细胞接收部分的提取器端12b、锚定件8的耦接端8a插入到连接器10上之前，可将粘合剂18a沉积在连接器上。粘合剂可有利地为光固化性粘合剂的形式，例如光固化甲基丙烯酸氨基甲酸酯类型的粘合剂(诸如dymax 1187 M SV)。
提取器部分3用于提供在使用结束时将植入物从患者的组织中拉出的装置。在例示的实施方案中，提取器部分还包括取出线9，该取出线包括固定到锚管8的锚部分15和延伸超出锚管的线部分16，该线部分被构造用于允许外科装置抓住线以将可植入胶囊拉出。在例示的实施方案中，取出线9由例如聚丙烯类型(诸如ProleneTM缝合线)的生物相容性纱或线制成。在一个实施方案中，一定长度的线在中空锚管8内延伸并包括结15a，锚部分15通过粘合剂例如如上所述的光固化性粘合剂保持在管内，这些结增加取出线附接到锚管的强度。因此，取出线是柔软且非常细的，以减少患者的不适感并且允许容易地移除植入物。
需注意，提取器部分3可具有不同的形状和构型，目的是允许外科装置夹持到植入物上并将其从患者的组织中拉出。
在一种变型中，取出线可直接固定到连接器10，或在不存在锚管的情况下与连接器10一体地形成。在此类变型中，连接器可例如包括孔，该孔允许线穿过孔进入并且允许将所植入的胶囊从患者的组织拉出。聚氨酯管或具有足够机械和生物特性的任何其他材料有利地提供支持取出线的耦接的结构。它也可在操纵期间(无论是在组装期间还是在植入期间)用作镊子的支撑体。
细胞接收部分2还包括插入在细胞接收室内的细胞支持基质7。在一个优选的实施方案中，细胞支持基质7包括生物相容性材料的一根或多根纱14，优选地在细胞接收室13内纵向延伸的多根纱。在一个优选的实施方案中，纱从提取器端12b处或附近的位置延伸到膜5的细胞装载端12a处或附近的位置。纱优选地在细胞接收室13的整个长度或大部分长度上延伸。在一个优选的实施方案中，纱可有利地由临床级聚酯(PE)制成，该临床级聚酯本身是众所周知的并且已经被批准用于外科植入用途。此类聚酯纱通常用于患者体内组织的缝合。可用于本发明的有利实施方案中的聚酯纱的示例为例如44/27-PET-5540-FTT-SS(纺织品开发协会公司(Textile Development Associates,Inc))。该材料是由变形聚酯制成的40旦尼尔27长丝纱。
已发现细胞支持基质7显著改善细胞接收室中含有的无限增殖化细胞的性能，提高了治疗剂释放的活性和随时间推移的耐久性，尤其是对于贴壁细胞而言。此类贴壁细胞是例如可用于细胞疗法的遗传工程化的细胞，诸如例如遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞、小鼠成肌细胞、人视网膜色素上皮细胞、干细胞、干细胞衍生的细胞系。由此发现这些细胞24倾向于与纱14的纤维对准，从而改善了优化用于治疗剂的释放和营养物质的摄取的细胞的密度和间隔。纱还有利地为粘附到其上的细胞提供大的总表面积。
在一个示例性实施方案中，将分泌GM-CSF的无限增殖化人成肌细胞装载在本发明的胶囊的细胞接收部分2中。这些胶囊可用于个性化抗肿瘤细胞免疫疗法。
将在适于细胞类型的补充有生长因子或胎牛血清的细胞生长培养基诸如Ham'sF12或DMEM中的细胞装载在细胞接收部分中。此外，对于将被冷冻的细胞，还将冷冻培养基/冷冻保存剂(诸如甘油)加入细胞生长培养基。
在一个示例性实施方案中，细胞接收腔13可在其中接收例如五至二十根纱14，这些纱在细胞接收腔内平行布置并在腔的基本上整个长度上延伸。一旦膜支撑体6和细胞支持基质14已被安装在多孔膜5中，纱就可通过将其一端拉动穿过细胞接收腔13而插入腔内，并将耦接头4安装在细胞接收部分2的提取器端12b上。
需注意，在将预组装的线圈和细胞支持基质7插入到管状多孔膜5中之前，例如通过将细胞支持基质和膜支撑体6插入穿过线圈的内部，可将细胞支持基质预组装到膜支撑体。
因此，细胞支持基质7，尤其是纱形式的细胞支持基质14具有优化细胞在细胞接收室内以有序方式分布的非常有益的效果，从而提高给定体积内的分泌产量和速率。此外，该构型允许通过简单地将纱的切割长度改变为多孔膜管和膜支撑体6的线圈的对应长度而容易地改变细胞接收部分的长度。此外，使用充分表征的生物相容性可植入聚酯不会不利地影响装置的安全性。
还观察到，细胞支持基质7的存在允许所包含的细胞冷冻和解冻而不影响细胞的活力。基质7的存在改善了胶囊的冷冻和解冻特性，这是特别有利的，因为它允许胶囊在冷冻状态下储存延长的时间段，以便在需要时用于患者的治疗。具体地，细胞(尤其是贴壁细胞)沿纱的分布改善似乎有助于在冷冻和解冻过程中保持高存活率。
液体培养基中的细胞可借助于细胞装载装置20(仅部分地和示意性地示于图示中)插入细胞接收室13中，该细胞装载装置包括出口喷嘴22，该出口喷嘴插入在多孔膜5的细胞装载端12a中。
可植入胶囊1可与细胞装载装置以预先组装的布置提供。在该实施方案中，细胞装载装置的喷嘴22可例如借助于粘合剂18c，例如上文已经描述的光固化性粘合剂附接到膜的细胞装载端12a。细胞装载装置可包括导管以允许液体培养基中的细胞通过导管注入到胶囊的细胞接收室中，细胞接收胶囊内包含的空气通过多孔膜5排出。
然而，如上所述，胶囊可填充有处于即用状态的无限增殖化细胞和培养基，细胞接收端12由塞子(未示出)密封，然后冷冻，直到需要对患者进行治疗。
本发明的可植入装置可在各个部位(包括在皮肤下面(例如皮下))植入到活受试者中。另选地，装置可在鞘内、脑内、骨内、肿瘤内、胸膜内、眼内或腹膜内部位处植入。
作为单次剂量或多次剂量施用给个体的剂量将根据多种因素而变化，这些因素包括药代动力学特性、患者状况和特征(性别、年龄、体重、健康状况、尺寸)、症状的程度、联合治疗、治疗频率和期望的效果。
组合
根据本发明，细胞及其药物制剂可单独施用，或与可用于预防和/或治疗癌症的共用药剂，尤其是癌细胞抗原和/或免疫检查点抑制剂诸如PD-1、PD-L1或CTLA4抑制剂组合施用，或与可用于预防和/或治疗自体免疫病症的共用药剂组合施用。
本发明涵盖本发明的细胞或其制剂的施用，其中将本发明的细胞或其制剂在其他治疗方案或共用药剂之前、与其他治疗方案或共用药剂同时地或依次地施用给受试者。
与所述共用药剂同时施用的本发明的细胞或根据本发明的其制剂可在相同或不同的组合物中施用并通过相同或不同的施用途径施用。
根据一个实施方案，提供了一种药物制剂，该药物制剂包含本发明的至少一种细胞与可用于预防和/或治疗癌症的至少一种共用药剂和至少一种药学上可接受的载体组合。
受试者
根据另一个方面，本发明的细胞、装置、试剂盒和方法可用于治疗需要通过治疗性蛋白质治疗的受试者。
根据一个具体方面，本发明的细胞、装置、试剂盒和方法可用于治疗癌症的。
根据一个具体方面，癌症选自非霍奇金淋巴瘤、头颈癌、黑素瘤、肺癌、膀胱癌、肾细胞癌、三阴性乳腺癌、结直肠癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肉瘤和脊索瘤。
根据另一个具体方面，本发明的细胞、装置、试剂盒和方法可用于通过免疫疗法进行治疗。
根据另一个具体方面，本发明的细胞、装置、试剂盒和方法可用于治疗炎性病症。
根据另一个具体方面，本发明的细胞、装置、试剂盒和方法可用于治疗神经退化性病症。
根据一个具体方面，神经退化性病症选自阿尔茨海默病和帕金森氏病。
根据另一个具体方面，本发明的细胞、装置、试剂盒和方法可用于预防和/或治疗感染性疾病，尤其是病毒感染。
根据一个具体方面，病毒感染是COVID-19病毒感染。
根据另一个具体方面，根据本发明的无限增殖化细胞和方法可用于接种肿瘤抗原(例如肿瘤或病毒抗原)疫苗或用于提高患者自身免疫系统的能力以增强对抗赘生性细胞或病毒颗粒的免疫应答的功效。
例如，分泌GM-CSF免疫刺激细胞因子的细胞可有效地用作个体化抗肿瘤细胞免疫疗法的一部分，如Gupta等人，2010年，“进展”，《医学探索》，第50卷，第52-60页中所述。
根据一个具体方面，根据本发明的无限增殖化细胞和方法可用于产生调节免疫应答强度，具体地阻断CTLA-4蛋白(免疫检查点抑制剂)以治疗癌症，尤其是黑素瘤的其他蛋白质(例如抗体或抗体片段)。
对于肿瘤学领域的应用，在本发明的上下文中，以下蛋白质可用于由包封细胞分泌：针对乳腺癌(HER2+)的曲妥珠单抗
帕妥珠单抗
针对淋巴瘤和CML(慢性髓细胞性白血病)的利妥昔单抗
针对急性淋巴细胞白血病(ALL)的博纳吐单抗
针对慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的奥比妥珠单抗
奥法木单抗
针对结肠癌和头颈癌的西妥昔单抗
针对结肠癌的帕尼单抗
针对肺癌的耐昔妥珠单抗
针对结肠癌或复发性脑肿瘤的贝伐单抗
针对胃癌的雷莫芦单抗
针对晚期癌症诸如黑素瘤、肺癌、头颈癌、膀胱癌和肾癌的纳武利尤单抗
帕博利珠单抗
阿替利珠单抗
德瓦鲁单抗
阿维鲁单抗
针对黑素瘤和肾癌的伊匹单抗
针对多发性骨髓瘤的达雷木单抗
或埃罗妥珠单抗
针对成神经细胞瘤的达妥昔单抗
针对软组织肉瘤的奥拉单抗
以及针对难治性卵巢癌的卡妥索单抗
对于炎性病症领域的应用，在本发明的上下文中，以下蛋白质可用于由包封细胞分泌：
针对结肠炎性病症、风湿性多发性关节炎、强直性脊柱炎风湿性多发性关节炎和牛皮癣的阿达木单抗
英夫利昔单抗
戈利木单抗
针对全身性红斑狼疮的贝利单抗
针对风湿性多发性关节炎或幼年型多发性关节炎的托珠单抗
沙利姆单抗
针对牛皮癣的布罗利尤单抗
依奇珠单抗
苏金单抗
针对牛皮癣的古塞奇尤单抗
针对牛皮癣和克罗恩病的优特克单抗
针对溃疡性结肠炎和克罗恩病的维多珠单抗
针对冷炎素相关周期热综合征的康纳单抗
针对多发性硬化症的达克珠单抗
或那他珠单抗
针对多发性硬化症的奥美珠单抗
针对特应性皮炎的度普利尤单抗
针对哮喘的美泊利单抗
瑞利珠单抗
和贝那利珠单抗
针对黄斑变性的兰尼单抗
对于在其他治疗领域中的应用，治疗性蛋白质，尤其是胰岛素或抗体，诸如Kaplon等人，2019年，《单克隆抗体》，第11卷第2期，第219-238页中所述。
对于神经退化性病症领域的应用，在本发明的上下文中，以下蛋白质可用于由包封细胞分泌：针对阿尔茨海默病、进行性核上性麻痹或额颞叶痴呆的甘特珠单抗(gantenerumab)、阿达木单抗、克雷珠单抗、Gosuraneamab、西瑞奈单抗或泽格特奈单抗；针对帕金森氏病或多系统萎缩症的PRX002/RG7935(Prasinezumab)、BIIB-054(辛帕奈单抗)或MEDI1341/TAK-341(阿斯利康公司(AstraZeneca)、武田药品工业公司(TakedaPharmaceutical Company))。
根据一个具体实施方案，在疫苗领域，在本发明的上下文中，以下蛋白质可用于由包封细胞分泌。
根据一个具体实施方案，抗原和疫苗佐剂可由根据本发明的遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞分泌，其中分泌抗原的所述细胞和分泌疫苗佐剂诸如GM-CSF的细胞被置于不同的可植入生物相容性装置中(在彼此附近施用)或那些不同的分泌细胞被装载在相同的可植入生物相容性装置中。
根据另一个具体实施方案，根据本发明的无限增殖化人成肌细胞可被转导以用于表达至少一种抗原和至少一种疫苗佐剂两者。
根据另一个具体实施方案，根据本发明的无限增殖化人成肌细胞可被转导以用于表达用于相同病理药剂的若干种抗原(例如，来自COVID-19的纤突蛋白和E蛋白)，或者可同时使用(例如，在相同的可植入装置中)分泌用于相同病理药剂的若干种抗原的根据本发明的遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞。
根据本发明的方法和用途
本发明提供了根据本发明的遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞，这些遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞用于预防和/或治疗病症或疾病，尤其是癌症、炎性病症或神经退化性病症。
本发明还提供了根据本发明的遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞用于制备药物制剂(例如，包封的细胞制剂)的用途，该药物制剂可用于预防和/或治疗病症或疾病，尤其是癌症、炎性病症或神经退化性病症。
本发明还提供了一种预防或治疗受试者中相关联的病症或疾病，尤其是癌症、炎性病症或神经退化性病症的方法，所述方法包括在对其有需要的受试者中施用治疗有效量的本发明的遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞。
根据一个方面，根据本发明的遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞可用于治疗(例如)癌症。例如，根据本发明的遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞分泌GM-CSF。
具体地，根据本发明的遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞可用于治疗癌症。
根据另一个方面，根据本发明的遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞可用于治疗炎性病症(例如类风湿性关节炎)。例如，根据本发明的遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞分泌抗TNFα抗体。
本文引用的参考文献据此全文以引用方式并入。已经描述本发明之后，以下实施例通过举例说明而非限制性方式给出。
实施例
根据本发明进行以下研究以支持本发明的细胞和方法的有效性。
下列缩写分别指以下定义：
DAPI(4,6-二脒基-2-苯基吲哚)；DMEM(杜氏改良伊格尔培养基)；DPBS(杜氏磷酸盐缓冲盐水)；EDTA(乙二胺四乙酸)；FBS(胎牛血清)；HBSS(Hank's缓冲盐溶液)；MEF(肌细胞增强因子)；PFA(多聚甲醛)。
实施例1：无限增殖化人成肌细胞系的制备
如下详述根据本发明的方法制备无限增殖化人成肌细胞系：
使用以下试剂：
成肌细胞生长培养基(GM)：
补充有以下物质的Ham's F10(GIBCO 41550021)：
—15％FBS(GIBCO 10101145)
—牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich A4503；0.5mg/mL)
—胎球蛋白(Desert Biological 302070；0.5mg/mL)
—表皮生长因子(R&D Systems 236-GMP-200；10ng/mL)
—地塞米松(PharmaServ 8016；0.39μg/mL)
—胰岛素(Sigma-Aldrich I9278；0.04mg/mL)
—一水合肌酸(ParmaServ 8114；149μg/mL)
—丙酮酸盐(Gibco 11360039；100μg/mL)
—尿苷((U3003；50μg/mL)
—庆大霉素(Gibco 15710049；5μg/mL)
成肌细胞分化培养基(DM)：
补充有以下物质的DMEM(GIBCO 61965026)
—牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich A4503；0.5mg/mL)
—表皮生长因子(R&D Systems 236-GMP-200；10ng/mL)
—胰岛素(Sigma-Aldrich I9278；10μg/mL)
—一水合肌酸(ParmaServ 8114；149μg/mL)
—丙酮酸盐(Gibco 11360039；100μg/mL)
—尿苷((U3003；50μg/mL)
—庆大霉素(Gibco 15710049；10μg/mL)
阻断溶液：
含有以下物质的DPBS(Sigma D8537)：
—山羊血清(Sigma G9023，2％)
—吐温20(AppliChem A1389，0.2％)
HBSS(GIBCO 14175053)
PFA 4％(Santa Cruz sc-281692)
Triton X-100(AppliChem A1388)
液体阻断剂(Arcus Biologicals NAN-012)
小鼠抗MF20抗体(Hybridoma Bank)
兔抗MEF2抗体(Santa Cruz sc-313)
山羊抗小鼠Alexa 488抗体(Life A11029)
山羊抗兔Alexa 546抗体(Life A11035)
DAPI Fluoromount-G(SouthernBiotech 0100-20)。
1.1人成肌细胞来源
从人肌肉组织获得人成肌细胞，该人肌肉组织是在知情同意下作为在重建手术期间从未吸烟的32岁女性供体解剖的小肌肉碎片获得的，该女性供体不具有重大病史或不患有遭受左膝创伤与前交叉韧带损伤的慢性疾病。组织捐赠的合格标准是根据FDA指南“人类细胞、组织以及基于细胞和组织的产品(HCT/P)的捐赠者的资格审定”来定义的。标准如下：
—年龄＞18岁
—健康受试者：无鉴定的慢性病症(包括肌肉疾病)
—计划的整形外科手术
—针对以下感染性疾病的筛选测试呈阴性：HIV 1和2型、HBV、HCV、梅毒螺旋体、HTLV 1和2、西尼罗病毒。
并且研究方案经过日内瓦道德委员会的批准。
1.2原代成肌细胞的分离和培养步骤
在细胞培养罩中的无菌条件下，用DMEM冲洗人肌肉组织。用小镊子和剪刀除去脂肪和纤维化组织。将组织置于含有5mL的0.05％胰蛋白酶EDTA的培养皿中，并用剪刀剪成毫米碎片。将肌肉碎片与胰蛋白酶转移到无菌解离瓶中。对于最大量为3g的组织，0.05％胰蛋白酶EDTA的体积达到90mL。将组织在37℃搅拌下温育60分钟。用10％FBS终止消化。然后将肌肉溶液通过70μm细胞过滤网过滤，并在室温(RT)下以1000rpm离心5分钟以将细胞制成球剂。弃去上清后，将球剂溶解于DMEM中，并通过40μm细胞过滤网过滤。将200'000个细胞接种于3.5mL生长培养基(GM)/60mm培养皿中。将细胞在37℃和5％CO2下温育。一旦细胞达到75％汇合度，除去GM并用HBSS洗涤细胞。施加最小体积的0.05％胰蛋白酶EDTA来覆盖细胞表面，并在37℃下温育3分钟。用相同体积的GM终止反应。收集细胞并在室温下以1000rpm离心5分钟。弃去上清液，用GM洗涤细胞，并再次离心。对于细胞染色，将细胞重悬于200μL的GM中，并加入下列抗体：3μL的抗CD56-AlexaFluor488、0.5μL的抗CD82-PE、3μL的抗CD146-PECy7。在4℃下温育30分钟后，洗涤细胞并使用MoFlo Astrios EQ(贝克曼库尔特公司(BeckmanCoulter))通过流式细胞术分选。成肌细胞被定义为CD56+CD146+CD82+。
1.3使用编码CDK4和hTERT的慢病毒载体使成肌细胞无限增殖(步骤b)和c))
通过转导2种基因：如先前提出的细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)和人端粒酶(hTERT)的催化亚基实现以上获得的成肌细胞的无限增殖(Zhu等人，2007年，《细胞衰老》，第6卷，第515-523页)。在人磷酸甘油酸激酶(hPGK)启动子的表达下，将转基因克隆到第三代pCLX慢病毒载体骨架中，如Salmon，2013年，《分子生物学方法》，第945卷，第417-448页中所述。在HeLa靶细胞上滴定特定病毒感染性，并以每mL转导单位(TU/mL)表示(Barde等人，2010年，《现代神经科学指南》，第4章，第4.21单元，doi:10.1002/0471142301.ns0421s53)。
在第0天，将原代人成肌细胞在500μL的GM中以20'000个细胞/孔至30'000个细胞/孔接种在24孔板中。在第1天，用慢病毒感染细胞。为了实现无限增殖，对于每种载体(如本文所述的pCLX-PGK-hTERT和pCLX-PGK-CDK4)，向细胞施加3的感染复数(MOI，病毒拷贝数/细胞)。在第2天，将500μL新鲜GM加入每个孔中。在第3天，将细胞在新的培养皿中传代。
将细胞保持在37℃、5％CO2下的培养物中，并使用自动细胞计数器(Countess，赛默飞世尔科技公司(ThermoFischer))来定量增殖。每次传代的群体倍增数被定义为log N/log 2，其中N是在汇合时收获的细胞数除以最初接种的细胞数。虽然在45天后原代成肌细胞停止增殖，但是用慢病毒转导的细胞继续稳定生长长达六个月，如在图1中可见。
这证实，用编码CDK4和hTERT的慢病毒载体转导原代成肌细胞可有效地使细胞无限增殖。
1.4成肌细胞生长和克隆(步骤d)和e))
一旦细胞达到75％汇合，就将细胞分离、洗涤并用抗CD56-AlexaFluor488、抗CD82-PE和抗CD146-PECy7染色，如先前在Laumonier等人，2017年(出处同上)中所述。在4℃下温育30分钟后，洗涤细胞并使用MoFlo Astrios EQ(贝克曼库尔特公司(BeckmanCoulter))在96孔板中以每个孔中一个细胞通过流式细胞术分选。成肌细胞被定义为CD56+CD146+CD82+。然后将单独的克隆在生长培养基中培养，扩增并通过使用单细胞克隆在96孔板中以1个细胞/孔从无限增殖化成肌细胞群体(I)分选来进行分选。总共分离出33个克隆，在每次传代时使用自动细胞计数来定量保持定性形态特征的9个选定克隆(1-3、5-6、13、17和20-21)的增殖速率，并且证明它们随时间推移保持稳定，如图2中可见。
1.5对成肌细胞分化成肌管的潜能的控制(步骤f)
为了评估通过本发明的方法获得的成肌细胞克隆在无限增殖化和分选之后(在步骤d)之后)的肌原性潜能，通过流式细胞术定量其随时间推移维持表达肌原性标记物的能力(对于CD56、CD82和CD146的三阳性)，并且如下定量保持其融合和分化成肌管的能力。将细胞接种到35mm培养皿中的GM中。当细胞达到100％汇合时，除去GM，用HBSS洗涤细胞，并加入分化培养基。72小时后，将细胞用DPBS洗涤两次，并用4％PFA在4℃下固定15分钟。用DPBS洗涤3次后，用防水笔在细胞周围画圆。将阻断溶液在室温下施加30分钟。一抗在4℃下温育过夜(小鼠抗MF20以1/1000稀释于阻断溶液中，并且兔抗MEF以1/300稀释于阻断溶液中)。在用DPBS洗涤3次并与阻断溶液温育5分钟之后，将二抗在RT下温育1小时(山羊抗小鼠Alexa 488以1/1000稀释于阻断溶液中，山羊抗兔Alexa546以1/1000稀释于阻断溶液中)。在用DPBS洗涤3次之后，用DAPIFluoromount-G封固盖玻片。为了定量分化百分比和融合指数，在荧光显微镜上以20X随机获取每种条件的七张图片。定量MEF阳性细胞核和DAPI细胞核的数目。
如图3中可见，通过本发明的方法获得的无限增殖化成肌细胞保持成肌细胞表型标记物诸如肌原性标记物(CD56、CD82和CD146)的表达和融合并分化成肌管的能力。可以看出，一些克隆表现出稳定的肌原性标记物，其他克隆则丧失表达，这表明稳定性较低，因此，呈现最佳稳定性的克隆用于进一步的实验。具体地，以编号CCOS 1901保藏的克隆61.27(来源于上文以编号CCOS 1902保藏的克隆2)用于包封研究。
如下表征所获得的无限增殖化成肌细胞系以便检查它们对封装技术的适当性：
成肌细胞包封能力
如下测定所获得的无限增殖化成肌细胞被包封的能力：除去GM并用HBSS洗涤75％汇合的细胞。加入最小体积的TrypLE(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher))以覆盖细胞表面，并在37℃下温育3分钟。然后将细胞从培养皿表面轻轻分离。用相同体积的HBSS终止反应。收集细胞，并使用自动细胞计数器(Countess II装置，赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher))一式两份计数。将细胞在RT下以1'000rpm离心5分钟，并且每800'000个-1'000'000个细胞重悬于25μL GM中。将25μL细胞悬浮液装载在如图9和实施例5中所述的含有中空纤维的胶囊中，该中空纤维具有用于分泌GM-CSF的遗传工程化的无限增殖化成肌细胞的内部基质。将经遗传修饰以产生GM-CSF的造血来源的无限增殖化人细胞(MVX-1)用作对照，这些无限增殖化人细胞装载在含有如Lathuiliere等人，2015年(出处同上)中所述的中空纤维的胶囊中并包封在如WO 2017/064571中所述的装置中。切割vasculon(胶囊的装载管)并使用紫外敏感粘合剂(Dymax公司)密封胶囊。然后在植入前将胶囊置于12孔板中的2mL GM中保持24小时。
基于它们的增殖速率和分化能力，选择6个克隆(#1、#2、#6、#13、#17和#21)进行评估。将这些克隆包封并保持在培养物中长达1个月。然后将胶囊固定并加以处理以供组织学分析。然后进行存活的定性评估，基于装置内部的活细胞密度(装置中间存在活细胞，以及细胞在装置内部如何扩散)，该分析推断克隆#2和#13具有良好的存活特性，然后如下详述选择这些克隆进行遗传工程化以表达GM-CSF。
缺氧条件下的成肌细胞培养
如下测试所获得的无限增殖化成肌细胞在缺氧条件下的行为：将细胞接种并在标准条件下培养24小时以允许细胞粘附。然后将培养皿置于含有1％氧气的37℃下的缺氧培养箱中，培养24小时。当需要在培养基中量化重组蛋白时，在定量之前将在缺氧室中预温育24小时的新鲜培养基加入细胞中保持两小时。
实施例2：在步骤d)中分选无限增殖化人成肌细胞的另选方法
另选地，在根据本发明建立无限增殖化人成肌细胞系的方法中，可根据步骤c1)至c4)对包封的成肌细胞群体进行步骤c)和d)中无限增殖化人成肌细胞克隆的分离。
将1.3下获得的无限增殖化成肌细胞群体包封到图9所述具有内部基质的可植入装置中。
将该装置植入小鼠皮下组织中保持3周。3周后，将该装置取出并放置在培养基中。将胶囊切片并将其内容物(细胞和基质)散布在培养皿中的培养基中。将细胞保持在培养物中若干周以进行扩增。然后将细胞分离并染色以用于人成肌细胞(被定义为CD56+CD146+CD82+)的FACS分选。从该成肌细胞群体分离出单独的人成肌细胞克隆。
这些克隆中的3个克隆的肌原性潜能(分化成肌管)似乎不受影响。还监测这些克隆在若干周内的增殖速率，并且在至少6个月内倍增时间为约24小时至约72小时。
实施例3：经遗传修饰的无限增殖化人成肌细胞系的制备
通过本发明的方法获得的无限增殖化人成肌细胞系可用于制备用于产生感兴趣蛋白质，具体地用于其在胶囊内的蛋白质分泌的经遗传修饰的细胞。
3.1用于分泌重组GM-CSF的成肌细胞转导(步骤ii))
为了表达人或小鼠GM-CSF，在人PGK启动子的表达下，将人或小鼠GM-CSF cDNA克隆到pCLX慢病毒载体中，如Salmon，2013年(出处同上)中所述。
人PGK启动子含有缺氧应答元件，这些缺氧应答元件为在缺氧条件下上调基因表达的增强子(Firth等人，1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第6496-6500页)。为了证实这一点，在磷酸甘油酸激酶(PGK)或泛素(UBI)启动子的表达下，用编码GFP的慢病毒载体转导原代成肌细胞(MOI＝5)，并且在1％氧气中36小时后，将细胞固定并通过流式细胞术来定量荧光，并且观察到在成肌细胞中，PGK启动子驱动相比于UBI更强的表达，并且成肌细胞在缺氧条件下当由PGK启动子驱动时(与UBI启动子相反)上调GFP的表达。
由于这个原因，PGK启动子用于本发明的无限增殖化人成肌细胞的遗传工程化，因为当成肌细胞被包封时，靶蛋白的分泌可能被增强。因此，用不同浓度的上述慢病毒转导实施例1中获得的克隆#2和#13，并对细胞施加不同的MOI(3-100)。
如下定量由经遗传修饰的无限增殖化人成肌细胞分泌重组蛋白的能力：
将细胞接种在T75细胞培养瓶中。一旦达到75％汇合，就用HBSS洗涤细胞，并加入5mL新鲜生长培养基在37℃下保持2小时。然后收集培养基用于GM-CSF定量，并使用自动细胞计数器(Countess II装置，赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher))对细胞计数。根据要定量的蛋白质使用不同的ELISA试剂盒(GM-CSF人ELISA试剂盒#KHC2011、GM-CSF小鼠ELISA试剂盒#BMS612、IgG(总)人ELISA试剂盒#BMS2091，赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher))。根据制造商的说明书应用方案。结果以pg/细胞/天报告。如图4A所示，从本发明的遗传无限增殖化人成肌细胞获得GM-CSF的表达。
在九周内每周监测由转导的无限增殖化克隆#2产生的细胞群体分泌的GM-CSF，并且证实用慢病毒载体转导会有效产生高度稳定的分泌GM-CSF的细胞系，如图4B所示。
3.2分泌人GM-CSF的克隆的分离(步骤iii)和iv))
从两种表达GM-CSF的群体(克隆#2.100和#13.10)分选125个单独的克隆，并测量每个克隆的GM-CSF表达。对于每种群体，监测在约1pg/细胞/天-4pg/细胞/天的范围内分泌最高水平的GM-CSF的10个克隆在若干周内的GM-CSF分泌(图4C)和增殖(图5A)。这些数据支持分泌GM-CSF的克隆的分泌和增殖速率随时间推移保持稳定。
如上文详述评估所分离的分泌GM-CSF的成肌细胞克隆随时间推移表达肌原性标记物的稳定性(对于CD56、CD82和CD146的三阳性)及其融合和分化成肌管的能力，并且如图6所示得到证实。
如下表征所获得的经遗传修饰的无限增殖化成肌细胞以便检查它们对封装技术的适当性：
成肌细胞包封能力
如上所述测定所获得的无限增殖化成肌细胞被包封的能力，并且将基于GM-CSF分泌水平、生长速率和肌原性特征(即，肌原性标记物表达和分化成肌管的能力)选择的六个克隆包封，然后在体内(小鼠皮下组织)测试。
中空纤维包封装置在小鼠体内的植入
根据瑞士关于实验动物的护理和使用的法规进行对小鼠的所有实验。在无特定病原体的环境中饲养和维持动物，并且让动物可以自由采食水和食物。用异氟烷麻醉成年Rag2/Il2rg双敲除小鼠(Shinkai，1992年3月6日，《细胞》，第68卷第5期，第855-867页)，并使用套管针将胶囊植入皮下组织中。用外科钉闭合伤口，并让动物在它们的居住笼中恢复。通过在麻醉前20分钟皮下注射0.1mg/kg丁丙诺啡和在三天内在饮用水中提供2mg/mL对乙酰氨基酚来提供止痛。在实验结束时，通过致命性注射戊巴比妥钠处死小鼠。将装置解剖，并直接固定以进行组织学分析，或放回培养基中以进一步定量重组蛋白表达。组织学处理如先前所述进行(Schwenter等人，2011年，《癌症基因治疗》，第18卷，第553-562页)。
在植入前和外植后(在1周和3周时)从胶囊测量GM-CSF分泌水平。也在小鼠血清中测量GM-CSF。在外植后还对胶囊进行组织学分析以定性地测量细胞存活。使用如实施例5和图9中所述具有内部基质的包封装置进行该实验。将分泌水平与通过经遗传修饰以产生GM-CSF的造血来源的无限增殖化人细胞(MVX-1)获得的那些水平进行比较，这些无限增殖化人细胞包封在如WO 2017/064571中所述的装置中，并且目前用于当前临床试验NCT02193503(I期)和NCT02999646(II期HNSCC)。
如图7中可见，所有包封的克隆呈现比MVX-1细胞高得多的分泌水平，因此证实了本发明的无限增殖化细胞的有利作用，尤其是用于包封疗法的有利作用。
然后，根据其高分泌速率(约3pg/细胞/天)和GM-CSF的最高血清水平(表明由61.27克隆高水平递送GM-CSF)选择以编号CCOS 1901保藏的克隆#61.27(来源于上文以编号1902保藏的克隆2)，并选择克隆#62.14，因为GM-CSF递送随时间推移保持稳定，这表明高细胞存活率。如图8中所述，在体外监测这两个克隆在6个月内的增殖速率并且也在体外监测作为非包封细胞和包封细胞在若干个月内的GM-CSF分泌速率。图8示出克隆61.27和62.14在以下方面随时间推移的稳定性：作为非包封细胞的体外增殖速率(A)，其表示为在从经遗传修饰的无限增殖化人成肌细胞群体分选克隆之后细胞群体倍增数(N)对比周数(W)；在分选之后作为非包封细胞的体外分泌速率对比周数(W)(B)和在包封之后作为包封细胞的体外分泌速率对比周数(W)(C)；与对照包封细胞(MVX-1)比较，作为包封细胞在小鼠中的体内分泌速率，如通过定量在植入之前比较的血清中的(D)和胶囊周围的组织(E)中的GM-CSF测量的，如实施例3中所述。
将那些克隆装载到如实施例5中所述且如图9所示的包封装置，并如上所述在体外监测与如上所定义的包封细胞(MVX-1)相比在若干个月内GM-CSF的分泌。
预装载有人成肌细胞的包封装置的冷冻和解冻
测试不同冷冻条件对解冻后GM-CSF表达水平的影响。将所述经遗传修饰的分泌GM-CSF的无限增殖化成肌细胞(在含有不同浓度甘油(用作冷冻保存剂)的冷冻培养基中的克隆61.27和62.14)装载到胶囊。冷冻前，将装载的胶囊悬浮在冷冻培养基中并在冷冻培养基中温育不同的时间段。为了冷冻，将胶囊置于预先填充有冷冻培养基的有机硅管中并转移至冷冻管中。将冷冻管迅速转移至CoolCell冷冻容器(Biocision公司)中，并在-80℃下放置过夜，然后转移至液氮中长期储存。
为了解冻，将有机硅管中的冷冻胶囊转移至10cm培养皿中的预热GM中。轻轻搅拌后，从有机硅管中取出胶囊，并将其置于含有GM的12孔培养板中。
如从图10中可见，在甘油中冷冻后，本发明的分泌GM-CSF的成肌细胞比起对照细胞系(MVX1)表现好得多(图10C)。使用10％甘油(图10B和图10C)作为冷冻培养基和在冷冻前细胞与冷冻培养基温育0至30分钟的时间的效果良好。
实施例4：产生治疗性蛋白质的可能的经遗传修饰的无限增殖化人成肌细胞系的多样性
根据本发明的无限增殖化成肌细胞被遗传工程化以用于表达感兴趣的治疗性复杂分子诸如抗体的能力。
治疗性大分子
用于分泌重组抗人CD20 IgG的成肌细胞转导(步骤ii))
为了表达抗人CD20 IgG，将利妥昔单抗重链的可变区插入在人IgG1重链主链中，并且将利妥昔单抗轻链的可变区插入在人κ轻链主链中。合成这两条序列，并将其克隆到如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所述的第3代pLV-hPGK-WPRE慢病毒载体(Vectorbuilder公司)中。用重链和轻链载体感染细胞，对于两种转基因使用相同的MOI感染，如Lathui lière，2016年，《分子生物学方法》，第1448卷，第139-155页中所述。
如实施例2中所述，使用已经描述的方法(Lathuiliere等人，2016年(出处同上))，使用不同剂量的慢病毒(MOI)，用编码利妥昔单抗的重链和轻链的慢病毒载体转导在实施例1中从克隆2获得的无限增殖化成肌细胞，利妥昔单抗是商业化的治疗性抗CD20单克隆抗体。然后在培养基中定量IgG的分泌，并通过流式细胞术证实所分泌的抗CD20 IgG的功能。在竞争测定中，将人PBMC(外周血单核细胞)与不同浓度的成肌细胞产生的抗CD20 IgG或商业利妥昔单抗预温育，然后与荧光标记的抗CD20抗体温育。这些实验支持，在该测定中所产生的IgG的作用与利妥昔单抗完全相同，如图11A所示。此外，如图图11B和图11C所示，在B细胞系暴露于利妥昔单抗或成肌细胞产生的抗CD20之后，测试细胞毒性应答(IFN-γ或CD107a的过表达)的诱导的脱颗粒测定中，成肌细胞产生的IgG同样有效。
然后将所获得的分泌抗CD20 IgG的成肌细胞装载到如实施例5和图9中所述的可植入装置中(测试两种细胞群体CD20.30和CD20.100，106个细胞/装置)，并植入小鼠皮下组织。在植入前，在培养基中定量从胶囊分泌的IgG。然后每隔两周定量来自活体动物的抗CD20 IgG血浆水平。
用于分泌抗CTLA4 IgG的成肌细胞转导
为了表达抗人CTLA4 IgG，将伊匹单抗重链的可变区(WO 200/1014424)插入在人IgG1重链主链中，并且将伊匹单抗轻链的可变区(WO 2001/014424)插入在人κ轻链主链中。合成这两条序列，并将其克隆到如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所述的第3代pLV-hPGK-WPRE慢病毒载体(Vectorbuilder公司)中。用重链和轻链载体感染细胞，对于两种转基因使用相同的MOI感染，如Lathuilière，2016年，《分子生物学方法》，第1448卷，第139-155页中所述。
如实施例2所述，使用已经描述的方法(Lathuiliere等人，2016年(出处同上))，使用不同剂量的慢病毒(MOI)，用编码伊匹单抗的重链和轻链的慢病毒载体转导在实施例1中从克隆2获得的无限增殖化成肌细胞，伊匹单抗是商业化的治疗性抗CTLA4单克隆抗体。然后通过ELISA在培养基中定量IgG的分泌，并且在CTLA-4阻断生物测定中证实所分泌的抗CTLA4 IgG的生物活性，如图13所示：在本研究中aAPC/Raji细胞和CTLA-4效应细胞分别是抗原呈递细胞和效应细胞。CTLA-4效应细胞是表达人CTLA-4和荧光素酶报道基因的JurkatT细胞，这些细胞的表达受上游NFAT-RE调节。aAPC/Raji细胞是表达内源性CD80/CD86和能够活化TCR的细胞表面蛋白的Raji细胞。
当加入阳性对照或所分泌的抗CTLA4时，它们可阻断CTLA-4与CD80/CD86之间的相互作用，并且解除免疫抑制，从而活化T细胞并活化NFAT诱导的萤光素酶表达。评估抗CTLA-4抗体在荧光素酶活性方面的阻断活性。如图13所示，将由根据本发明的遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞表达的成肌细胞产生的抗体与作为阳性对照的伊匹单抗生物类似物进行比较。该测定证明，成肌细胞产生的抗CTLA4对CTLA-4与CD80/CD86之间的相互作用显示显著的阻断活性。EC50等同于阳性对照(YervoyTM，百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb SA))，即1.519与对照的1.573进行比较。
用于分泌抗β-淀粉样蛋白(甘特珠单抗(gantenerumab))的成肌细胞转导
为了表达抗人β-淀粉样蛋白IgG，将甘特珠单抗(gantenerumab)重链的可变区(EP1960428)插入在人IgG1重链主链中，并且将甘特珠单抗(gantenerumab)轻链的可变区(EP1960428)插入在人κ轻链主链中。合成这两条序列，并将其克隆到如SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所述的第3代pLV-hPGK-WPRE慢病毒载体(Vectorbuilder公司)中。用重链和轻链载体感染细胞，对于两种转基因使用相同的MOI感染，如Lathuilière，2016年(出处同上)中所述。
然后如实施例2所述，使用已经描述的方法(Lathuiliere等人，2016年(出处同上))，使用不同剂量的慢病毒(MOI)，用编码如上所述制备的甘特珠单抗(gantenerumab)的重链和轻链的慢病毒载体转导在实施例1中从克隆2获得的无限增殖化成肌细胞，甘特珠单抗(gantenerumab)是III期研究治疗性抗β-淀粉样蛋白单克隆抗体。然后通过ELISA在培养基中定量IgG的分泌。通过对来自人阿尔茨海默病病例的脑切片执行免疫组织化学来测试抗体的功能。简言之，将切片脱蜡，在柠檬酸盐缓冲液中进行抗原修复，将切片与所转导的人成肌细胞的上清液在4℃下温育过夜。在PBS中洗涤后，将二抗在室温下温育2小时。洗涤切片并获得显微镜图像。在切片上观察到阳性染色，表明所分泌的抗体是功能性的(箭头，图14)。
异种蛋白
为了测试本发明的无限增殖化人成肌细胞被遗传工程化以从不同物种产生蛋白质的能力，用不同剂量(MOI)的编码小鼠GM-CSF(mu-GM-CSF)蛋白的慢病毒载体转导在实施例1中获得的无限增殖化成肌细胞克隆。然后从所转导的群体中分离单独的分泌mu-GM-CSF的克隆，选择一个克隆并将其包封到如实施例5和图9所述的可植入装置中(106个细胞/装置)。在体外定量muGM-CSF在若干周内的递送。
通过体内实验证实所分泌的muGM-CSF的生物活性，其中在皮下植入的包封装置周围检测到强烈细胞免疫应答。在植入前和外植后的不同时间点(在1天、3天、5天和7天后)测量muGM-CSF分泌水平。在实验期间将一些胶囊作为比较物保持在体外。观察到分泌水平降低，这与先前的发现一致，并且由GM-CSF生物活性产生的大量免疫浸润影响包封细胞存活。炎性细胞的流入可减少氧气和营养物质朝向包封细胞的扩散。
所有这些数据支持本发明的无限增殖化人成肌细胞甚至在包封环境中呈现优异的长期存活能力，同时保持成肌细胞特征>100天。那些无限增殖化人成肌细胞可被遗传工程化以在它们可以增殖的包封环境中产生高水平的感兴趣蛋白质(诸如抗体、抗体片段、生长因子、细胞因子等)。最后，这些细胞一旦被包封，就可在装载后直接冷冻，并在随后解冻，这是一种非常便于将来临床应用的重要特征。
实施例5：比较本发明的无限增殖化细胞在不同装置中的行为
在以下实验中，比较了两种类型的可植入胶囊：图9中针对A组和B组描述的胶囊对比WO 2017/064571中针对比较C组描述的胶囊(常规胶囊)。
A组：胶囊装载有本发明的细胞(表达人GM-CSF的无限增殖化人成肌细胞系(以编号CCOS1901保藏的细胞系))
B组：胶囊装载有对照细胞系：表达人GM-CSF的K562人红白血病细胞
C组：胶囊装载有相同的对照细胞系：表达人GM-CSF的K562人红白血病细胞。
常规胶囊不包封任何支持基质，因此其不适合装载贴壁细胞，诸如人成肌细胞。为了比较两种不同胶囊随时间推移产生huGM-CSF的功效，使用表达人GM-CSF的K562人红白血病细胞系作为用于产生感兴趣蛋白质的另选细胞系。B组和C组提供了对两种胶囊的性能的直接比较，因为这两种不同的胶囊含有表达根据本发明的相同感兴趣治疗性蛋白质的相同遗传工程化的细胞系。
在无菌培养条件下，将大约800000个细胞装载到胶囊中。将胶囊保持在37℃和5％CO2的培养基中。使用ELISA(试剂盒#KHC2011，赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher))在培养基中定量人GM-CSF的递送并以ng/24小时报告(图12A)。
然后将胶囊植入小鼠皮下组织中保持1周。处死动物后，从动物中取出胶囊并将其置于培养基中以定量人GM-CSF递送(图12B)。此外，在小鼠血清(图12C)以及胶囊周围的皮下组织(图12D)中定量GM-CSF。
这些数据支持表达人GM-CSF的已知遗传工程化的K562人红白血病细胞系在含有根据本发明的实施方案的大胶囊的基质中的培养物与如WO 2017/064571中所述胶囊相比已代表一种改进。然而，根据本发明的新型遗传工程化的无限增殖化成肌细胞在含有根据本发明的实施方案的大胶囊的基质中的组合迄今为止对于实现体外和体内两者持续稳定的GM-CSF产生是最有效的。
实施例6：产生感兴趣抗原的可能的经遗传修饰的无限增殖化人成肌细胞系的多样性
已经如下测定了根据本发明的无限增殖化成肌细胞被遗传工程化以表达和分泌诸如用于接种疫苗目的的感兴趣抗原的能力。
为了表达COVID-19纤突蛋白三聚体[NC_045512.2(21563..25384)]，编码COVID-19纤突蛋白的1-1'208残基的DNA序列(UNIPROT P0DTC2 SPIKE_SARS2)用以下项修饰：986位和987位脯氨酸取代、弗林蛋白酶切割位点682-685的GSAS取代、T4纤维蛋白三聚结构域的加成和密码子优化以在人细胞中表达(SEQ ID NO:1)。然后合成该修饰的序列并将其克隆到第3代pLV-hPGK-WPRE慢病毒载体(Vectorbuilder)中。采用各种MOI感染成肌细胞。通过斑点印迹评估纤突蛋白在培养基中的分泌。简言之，将3mL纯培养物上清液或稀释培养物上清液装载在硝酸纤维膜上，在含有3％奶粉的PBS中封闭膜，将膜在PBS中洗涤3次，并用1mg/mL AI 334(US 2010/0172917；Yuan等人，2020年5月8日，《科学》，第368卷第6491期，第630-633页)或AQ 806(https://oap.unige.ch/journals/abrep/article/view/186；https://oap.unige.ch/journals/abrep/article/view/219；Wrap等人，2020年5月28日，《细胞》，第181卷第5期，第1004-1015页)抗体过夜探测(请访问日内瓦抗体设施中心https://www.unige.ch/medecine/antibodies/cov-resources/)。与HRP标记的二抗温育后揭开膜。分析表明，在所转导的无限增殖化成肌细胞的上清液中分泌纤突蛋白(图15)。
这些数据支持根据本发明的无限增殖化成肌细胞可被成功修饰以表达多种感兴趣的治疗性蛋白质。就病毒抗原而言，根据本发明的被遗传工程化以表达那些病毒抗原的无限增殖化成肌细胞，尤其是与增强免疫应答的药剂组合可有利地用于疫苗接种策略。
序列表
SEQ ID NO:1—用于由无限增殖化成肌细胞表达纤突蛋白的DNA序列
ATGTTCGTTTTCCTTGTTCTGTTGCCTCTCGTTAGTAGCCAATGTGTCAACCTTACTACTAGAACCCAGCTCCCTCCAGCATATACCAACAGCTTCACCCGGGGCGTATATTATCCGGACAAAGTGTTTCGCTCAAGTGTGCTGCATTCTACGCAGGACCTTTTTTTGCCCTTTTTTAGTAATGTTACTTGGTTTCATGCTATCCATGTGTCTGGAACTAACGGAACCAAACGGTTTGACAACCCCGTCCTCCCTTTCAACGATGGCGTGTATTTCGCCTCCACGGAAAAGTCGAACATCATTCGCGGCTGGATCTTTGGTACAACACTCGACTCAAAGACGCAGAGCCTGCTAATCGTCAATAACGCTACAAATGTTGTGATCAAGGTGTGTGAATTTCAGTTCTGCAATGATCCCTTCCTGGGGGTGTACTACCATAAAAATAACAAGAGCTGGATGGAGTCCGAATTTAGGGTTTACAGTTCCGCTAACAACTGCACATTCGAGTACGTAAGCCAGCCATTTCTTATGGATCTTGAGGGCAAGCAAGGAAACTTCAAGAATTTAAGGGAGTTCGTGTTCAAAAATATCGATGGCTATTTTAAAATATATAGCAAGCACACTCCAATAAACTTAGTGCGAGACCTGCCCCAGGGATTTTCGGCTCTAGAGCCCCTGGTGGATCTGCCAATTGGAATAAACATAACCCGCTTTCAAACACTGCTAGCCCTGCATAGAAGTTACCTCACCCCTGGTGATAGTAGTTCCGGATGGACAGCAGGGGCCGCCGCATACTATGTCGGCTACCTGCAGCCTAGGACCTTCTTACTGAAGTATAACGAGAACGGTACAATAACCGACGCTGTGGACTGCGCTCTGGACCCTCTGTCCGAGACGAAGTGTACCCTAAAGAGCTTTACCGTTGAAAAAGGCATTTATCAAACCAGCAATTTCCGGGTCCAGCCAACCGAGAGCATCGTCAGATTTCCCAACATTACAAATCTGTGTCCCTTCGGCGAGGTGTTTAACGCCACACGTTTCGCCTCAGTGTACGCATGGAACCGTAAACGAATATCTAACTGTGTCGCGGATTATTCTGTCCTCTACAACTCCGCCTCTTTCTCCACCTTCAAGTGCTACGGGGTGTCACCGACTAAGCTGAACGATCTCTGCTTTACCAACGTCTACGCGGACTCCTTCGTGATCAGAGGGGATGAGGTGAGACAAATCGCCCCAGGTCAGACTGGGAAAATCGCAGATTACAACTACAAATTGCCTGATGATTTCACTGGGTGCGTCATCGCGTGGAACTCTAATAACCTCGATTCTAAGGTCGGGGGGAACTACAATTATCTGTACCGCCTATTTAGGAAGTCAAACCTGAAACCTTTCGAGCGGGATATTTCAACCGAAATCTATCAAGCGGGGTCAACACCTTGTAATGGTGTGGAAGGATTTAACTGCTACTTCCCCCTGCAGTCTTACGGATTTCAGCCAACCAATGGCGTGGGTTACCAACCTTATCGGGTGGTGGTTCTAAGTTTCGAACTGTTGCACGCTCCCGCCACGGTATGCGGGCCAAAAAAGAGCACTAACTTGGTGAAGAATAAGTGCGTGAATTTCAATTTCAATGGCCTCACTGGAACCGGAGTACTGACCGAATCCAATAAGAAGTTCTTGCCCTTTCAGCAGTTCGGAAGAGACATTGCCGACACAACCGACGCGGTGCGGGATCCTCAGACTCTGGAGATATTAGACATTACACCATGTAGCTTTGGCGGGGTGTCTGTCATTACTCCGGGCACGAATACTAGCAATCAGGTAGCCGTGCTGTACCAAGACGTGAATTGCACAGAGGTTCCCGTCGCAATTCACGCTGACCAGCTGACCCCCACGTGGAGGGTTTACAGCACTGGCAGTAATGTCTTCCAGACGAGAGCCGGTTGTTTGATCGGAGCGGAACATGTGAATAACTCCTACGAGTGCGACATCCCCATCGGAGCCGGTATATGCGCCTCTTATCAGACACAAACTAATTCACCCGGCTCCGCCTCCAGTGTAGCTTCTCAAAGCATTATAGCATATACAATGTCTCTTGGGGCCGAAAATTCCGTGGCCTATTCGAACAATTCAATCGCCATCCCAACCAACTTTACAATCAGCGTGACGACCGAAATTCTGCCTGTGAGCATGACGAAAACCAGCGTAGACTGCACTATGTATATCTGTGGGGACTCCACTGAGTGCTCCAACCTTCTCCTGCAGTACGGGAGCTTCTGTACCCAATTAAACCGTGCCCTTACAGGCATCGCTGTTGAGCAGGATAAGAATACCCAGGAAGTTTTTGCCCAGGTTAAGCAGATATACAAAACACCGCCAATTAAAGACTTCGGAGGCTTCAACTTCTCTCAGATACTGCCTGACCCTTCCAAGCCATCAAAACGGAGCTTCATTGAGGACCTCTTGTTCAACAAAGTGACTCTGGCTGATGCTGGCTTCATTAAGCAGTACGGAGATTGCCTGGGGGATATTGCTGCCAGGGATCTCATCTGTGCCCAGAAGTTTAATGGCCTGACAGTCTTGCCTCCACTTCTGACAGACGAGATGATTGCACAGTACACAAGTGCCCTCCTCGCTGGCACCATAACATCCGGATGGACATTTGGTGCAGGTGCTGCCCTCCAGATTCCCTTTGCAATGCAGATGGCGTATCGCTTTAACGGCATCGGTGTCACACAAAACGTGTTGTATGAGAACCAAAAGCTCATCGCTAACCAGTTTAATTCTGCTATTGGGAAAATTCAGGACAGCCTGTCATCGACCGCGTCTGCCCTTGGGAAGTTGCAGGACGTGGTGAATCAGAATGCTCAGGCCTTAAATACTCTGGTGAAACAACTCTCTTCAAATTTCGGCGCAATCAGCTCTGTGTTAAACGACATCCTAAGTAGGCTTGATCCGCCGGAGGCTGAAGTTCAAATTGATAGATTGATTACTGGCAGGCTCCAGTCTTTACAGACCTACGTTACACAGCAGCTGATCCGAGCGGCTGAGATTAGAGCTTCCGCCAATCTGGCCGCAACCAAGATGTCCGAATGTGTCCTGGGTCAGTCAAAGCGGGTCGACTTTTGTGGTAAAGGCTACCACCTCATGTCATTTCCCCAGAGTGCACCTCACGGAGTAGTGTTCCTCCACGTCACCTACGTTCCAGCACAGGAAAAGAATTTTACCACTGCACCGGCAATCTGTCACGACGGCAAGGCACACTTCCCCCGAGAGGGCGTATTCGTGTCGAATGGAACTCATTGGTTCGTCACACAGCGAAACTTTTATGAGCCTCAGATCATTACCACCGATAATACATTTGTGTCCGGGAACTGCGACGTTGTCATTGGAATCGTCAACAACACTGTATACGATCCACTTCAGCCAGAACTGGATAGCTTTAAGGAAGAATTGGACAAATATTTCAAAAATCACACTTCACCCGATGTGGACCTGGGGGACATTAGTGGGATCAATGCATCCGTGGTCAATATCCAAAAAGAGATTGACAGGCTCAACGAGGTGGCCAAAAATCTGAACGAAAGTCTTATCGATCTGCAAGAATTGGGAAAATATGAGCAGGGCAGCGGCTATATCCCAGAGGCCCCCCGCGACGGCCAGGCCTACGTACGCAAGGATGGCGAGTGGGTGCTGCTGAGCACCTTCCTGTGA
SEQ ID NO:2—编码伊匹单抗的轻链的慢病毒载体构建体(pLV-hPGK-WPRE)
AATGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGCAACATGGTAACGATGAGTTAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGACATGGATTGGACGAACCACTGAATTGCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACATAAACGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCGCTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCTCGACGGTATCGCTAGCTTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTACTAGTGATTATCGGATCAACTTTGTATAGAAAAGTTGGGGTTGCGCCTTTTCCAAGGCAGCCCTGGGTTTGCGCAGGGACGCGGCTGCTCTGGGCGTGGTTCCGGGAAACGCAGCGGCGCCGACCCTGGGTCTCGCACATTCTTCACGTCCGTTCGCAGCGTCACCCGGATCTTCGCCGCTACCCTTGTGGGCCCCCCGGCGACGCTTCCTGCTCCGCCCCTAAGTCGGGAAGGTTCCTTGCGGTTCGCGGCGTGCCGGACGTGACAAACGGAAGCCGCACGTCTCACTAGTACCCTCGCAGACGGACAGCGCCAGGGAGCAATGGCAGCGCGCCGACCGCGATGGGCTGTGGCCAATAGCGGCTGCTCAGCAGGGCGCGCCGAGAGCAGCGGCCGGGAAGGGGCGGTGCGGGAGGCGGGGTGTGGGGCGGTAGTGTGGGCCCTGTTCCTGCCCGCGCGGTGTTCCGCATTCTGCAAGCCTCCGGAGCGCACGTCGGCAGTCGGCTCCCTCGTTGACCGAATCACCGACCTCTCTCCCCAGGCAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCACCATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGGCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGAGAGCCACCCTGAGCTGCAGAGCCAGCCAGAGCGTGGGCAGCAGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGACTGCTGATCTACGGCGCCTTCAGCAGAGCCACCGGCATCCCCGACAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGACTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACGGCAGCAGCCCCTGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGAGAACCGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGAGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGAGCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGAGGCGAGTGCTGAACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATAATCGAATTCCGATAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCATCGGGAATTCCCGCGGTTCGCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAAGATCTGCTTTTTGCTTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTAGTAGTTCATGTCATCTTATTATTCAGTATTTATAACTTGCAAAGAAATGAATATCAGAGAGTGAGAGGAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGCTCTAGCTATCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGGACGTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACGCGCGCTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCC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SEQ ID NO:3—编码伊匹单抗的重链的慢病毒载体构建体(pLV-hPGK-ipi-HC-WPRE)
AATGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGCAACATGGTAACGATGAGTTAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGACATGGATTGGACGAACCACTGAATTGCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACATAAACGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCGCTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCTCGACGGTATCGCTAGCTTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTACTAGTGATTATCGGATCAACTTTGTATAGAAAAGTTGGGGTTGCGCCTTTTCCAAGGCAGCCCTGGGTTTGCGCAGGGACGCGGCTGCTCTGGGCGTGGTTCCGGGAAACGCAGCGGCGCCGACCCTGGGTCTCGCACATTCTTCACGTCCGTTCGCAGCGTCACCCGGATCTTCGCCGCTACCCTTGTGGGCCCCCCGGCGACGCTTCCTGCTCCGCCCCTAAGTCGGGAAGGTTCCTTGCGGTTCGCGGCGTGCCGGACGTGACAAACGGAAGCCGCACGTCTCACTAGTACCCTCGCAGACGGACAGCGCCAGGGAGCAATGGCAGCGCGCCGACCGCGATGGGCTGTGGCCAATAGCGGCTGCTCAGCAGGGCGCGCCGAGAGCAGCGGCCGGGAAGGGGCGGTGCGGGAGGCGGGGTGTGGGGCGGTAGTGTGGGCCCTGTTCCTGCCCGCGCGGTGTTCCGCATTCTGCAAGCCTCCGGAGCGCACGTCGGCAGTCGGCTCCCTCGTTGACCGAATCACCGACCTCTCTCCCCAGGCAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTTAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCCGGCAGAAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACACCATGCACTGGGTGAGACAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGACCTTCATCAGCTACGACGGCAACAACAAGTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCAGAGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAGAACCGGCTGGCTGGGCCCCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCAGAGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAGTGAACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATAATCGAATTCCGATAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCATCGGGAATTCCCGCGGTTCGCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAAGATCTGCTTTTTGCTTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTAGTAGTTCATGTCATCTTATTATTCAGTATTTATAACTTGCAAAGAAATGAATATCAGAGAGTGAGAGGAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACT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SEQ ID NO:4—编码甘特珠单抗(gantenerumab)的重链的慢病毒载体构建体(pLV-hPGK-Gant HC-WPRE)
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SEQ ID NO:5—编码甘特珠单抗(gantenerumab)的轻链的慢病毒载体构建体(pLV-hPGK-Gant LC-WPRE)
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SEQ ID NO:6—编码利妥昔单抗的轻链的慢病毒载体构建体(pLV-hPGK-ritux-LC-WPRE)
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序列表
<110> 迈斯免疫公司
日内瓦大学附属医院
日内瓦大学
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<223> 用于由无限增殖化成肌细胞表达纤突蛋白的DNA序列
<400> 1
atgttcgttt tccttgttct gttgcctctc gttagtagcc aatgtgtcaa ccttactact 60
agaacccagc tccctccagc atataccaac agcttcaccc ggggcgtata ttatccggac 120
aaagtgtttc gctcaagtgt gctgcattct acgcaggacc tttttttgcc cttttttagt 180
aatgttactt ggtttcatgc tatccatgtg tctggaacta acggaaccaa acggtttgac 240
aaccccgtcc tccctttcaa cgatggcgtg tatttcgcct ccacggaaaa gtcgaacatc 300
attcgcggct ggatctttgg tacaacactc gactcaaaga cgcagagcct gctaatcgtc 360
aataacgcta caaatgttgt gatcaaggtg tgtgaatttc agttctgcaa tgatcccttc 420
ctgggggtgt actaccataa aaataacaag agctggatgg agtccgaatt tagggtttac 480
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<400> 7
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tgccttacaa ggagagaaaa agcaccgtgc atgccgattg gtggaagtaa ggtggtacga 120
tcgtgcctta ttaggaaggc aacagacggg tctgacatgg attggacgaa ccactgaatt 180
gccgcattgc agagatattg tatttaagtg cctagctcga tacataaacg ggtctctctg 240
gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc 300
tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg 360
taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtggcgcccg 420
aacagggact tgaaagcgaa agggaaacca gaggagctct ctcgacgcag gactcggctt 480
gctgaagcgc gcacggcaag aggcgagggg cggcgactgg tgagtacgcc aaaaattttg 540
actagcggag gctagaagga gagagatggg tgcgagagcg tcagtattaa gcgggggaga 600
attagatcgc gatgggaaaa aattcggtta aggccagggg gaaagaaaaa atataaatta 660
aaacatatag tatgggcaag cagggagcta gaacgattcg cagttaatcc tggcctgtta 720
gaaacatcag aaggctgtag acaaatactg ggacagctac aaccatccct tcagacagga 780
tcagaagaac ttagatcatt atataataca gtagcaaccc tctattgtgt gcatcaaagg 840
atagagataa aagacaccaa ggaagcttta gacaagatag aggaagagca aaacaaaagt 900
aagaccaccg cacagcaagc ggccgctgat cttcagacct ggaggaggag atatgaggga 960
caattggaga agtgaattat ataaatataa agtagtaaaa attgaaccat taggagtagc 1020
acccaccaag gcaaagagaa gagtggtgca gagagaaaaa agagcagtgg gaataggagc 1080
tttgttcctt gggttcttgg gagcagcagg aagcactatg ggcgcagcgt caatgacgct 1140
gacggtacag gccagacaat tattgtctgg tatagtgcag cagcagaaca atttgctgag 1200
ggctattgag gcgcaacagc atctgttgca actcacagtc tggggcatca agcagctcca 1260
ggcaagaatc ctggctgtgg aaagatacct aaaggatcaa cagctcctgg ggatttgggg 1320
ttgctctgga aaactcattt gcaccactgc tgtgccttgg aatgctagtt ggagtaataa 1380
atctctggaa cagatttgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1440
ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1500
acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1560
ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1620
agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1680
tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1740
tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcgcta 1800
gcttttaaaa gaaaaggggg gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata 1860
atagcaacag acatacaaac taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt 1920
actagtgatt atcggatcaa ctttgtatag aaaagttggg gttgcgcctt ttccaaggca 1980
gccctgggtt tgcgcaggga cgcggctgct ctgggcgtgg ttccgggaaa cgcagcggcg 2040
ccgaccctgg gtctcgcaca ttcttcacgt ccgttcgcag cgtcacccgg atcttcgccg 2100
ctacccttgt gggccccccg gcgacgcttc ctgctccgcc cctaagtcgg gaaggttcct 2160
tgcggttcgc ggcgtgccgg acgtgacaaa cggaagccgc acgtctcact agtaccctcg 2220
cagacggaca gcgccaggga gcaatggcag cgcgccgacc gcgatgggct gtggccaata 2280
gcggctgctc agcagggcgc gccgagagca gcggccggga aggggcggtg cgggaggcgg 2340
ggtgtggggc ggtagtgtgg gccctgttcc tgcccgcgcg gtgttccgca ttctgcaagc 2400
ctccggagcg cacgtcggca gtcggctccc tcgttgaccg aatcaccgac ctctctcccc 2460
aggcaagttt gtacaaaaaa gcaggctgcc accatggagt ttgggctgag ctgggttttc 2520
ctcgttgctc tttttagagg tgtccagtgt caggttcagc tgcagcagcc tggcgccgaa 2580
cttgtgaaac ctggcgcctc tgtgaagatg agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc 2640
agctacaaca tgcactgggt caagcagacc cctggcagag gcctggaatg gatcggagcc 2700
atctatcccg gcaacggcga cacctcctac aaccagaagt tcaagggcaa agccacactg 2760
accgccgaca agagcagcag cacagcctac atgcagctgt ccagcctgac cagcgaagat 2820
agcgccgtgt actactgcgc cagaagcacc tattacggcg gcgactggta cttcaacgtg 2880
tggggagctg gcaccaccgt gacagtgtct gccgcctcta caaagggccc tagcgttttc 2940
ccactggctc ccagcagcaa gagcacatct ggtggaacag ccgctctggg ctgcctggtc 3000
aaggattact ttcccgagcc tgtgaccgtg tcctggaatt ctggcgctct gacaagcggc 3060
gtgcacacct ttccagcagt gctgcaaagc agcggcctgt actctctgag cagcgtggtc 3120
acagtgccta gctctagcct gggcacccag acctacatct gcaatgtgaa ccacaagcct 3180
agcaacacca aggtggacaa gaaggtggaa cccaagagct gcgacaagac ccacacctgt 3240
cctccatgtc ctgctccaga actgctcggc ggaccttccg tgttcctgtt tcctccaaag 3300
cctaaggaca ccctgatgat cagcagaacc cctgaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg 3360
tcccacgagg atcccgaagt gaagttcaat tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaac 3420
gccaagacca agcctagaga ggaacagtac aacagcacct acagagtggt gtccgtgctg 3480
accgtgctgc accaggattg gctgaacggc aaagagtaca agtgcaaggt gtccaacaag 3540
gccctgcctg ctcctatcga gaaaaccatc agcaaggcca agggccagcc tagggaaccc 3600
caggtttaca cactgcctcc aagcagggac gagctgacca agaatcaggt gtccctgacc 3660
tgtctcgtga agggcttcta cccctccgat atcgccgtgg aatgggagag caatggccag 3720
cctgagaaca actacaagac aacccctcct gtgctggact ccgacggctc attcttcctg 3780
tacagcaagc tgacagtgga caagtccaga tggcagcagg gcaacgtgtt ctcctgcagc 3840
gtgatgcacg aggccctgca caaccactac acccagaaaa gcctgtctct gagccccggc 3900
aaatagaccc agctttcttg tacaaagtgg tgataatcga attccgataa tcaacctctg 3960
gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt attcttaact atgttgctcc ttttacgcta 4020
tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat catgctattg cttcccgtat ggctttcatt 4080
ttctcctcct tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg aggagttgtg gcccgttgtc 4140
aggcaacgtg gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcaa cccccactgg ttggggcatt 4200
gccaccacct gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc ccctccctat tgccacggcg 4260
gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt gggcactgac 4320
aattccgtgg tgttgtcggg gaagctgacg tcctttccat ggctgctcgc ctgtgttgcc 4380
acctggattc tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa tccagcggac 4440
cttccttccc gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc cgcgtcttcg ccttcgccct 4500
cagacgagtc ggatctccct ttgggccgcc tccccgcatc gggaattccc gcggttcgct 4560
ttaagaccaa tgacttacaa ggcagctgta gatcttagcc actttttaaa agaaaagggg 4620
ggactggaag ggctaattca ctcccaacga agacaagatc tgctttttgc ttgtactggg 4680
tctctctggt tagaccagat ctgagcctgg gagctctctg gctaactagg gaacccactg 4740
cttaagcctc aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag tgtgtgcccg tctgttgtgt 4800
gactctggta actagagatc cctcagaccc ttttagtcag tgtggaaaat ctctagcagt 4860
agtagttcat gtcatcttat tattcagtat ttataacttg caaagaaatg aatatcagag 4920
agtgagagga acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca 4980
aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc 5040
aatgtatctt atcatgtctg gctctagcta tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc 5100
taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt tttatttatg 5160
cagaggccga ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg 5220
gaggcctagg gacgtaccca attcgcccta tagtgagtcg tattacgcgc gctcactggc 5280
cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc 5340
agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc 5400
ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg ggacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc 5460
ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc 5520
tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct 5580
aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa 5640
acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc 5700
tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact 5760
caaccctatc tcggtctatt cttttgattt ataagggatt ttgccgattt cggcctattg 5820
gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgct 5880
tacaatttag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc 5940
taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa 6000
tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt 6060
gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct 6120
gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc 6180
cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta 6240
tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac 6300
tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc 6360
atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac 6420
ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg 6480
gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac 6540
gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc 6600
gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt 6660
gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga 6720
gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc 6780
cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag 6840
atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca 6900
tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc 6960
ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca 7020
gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc 7080
tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta 7140
ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgttctt 7200
ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc 7260
gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg 7320
ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg 7380
tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag 7440
ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaagag agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc 7500
agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat 7560
agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg 7620
gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc 7680
tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt 7740
accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca 7800
gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg 7860
attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac 7920
gcaattaatg tgagttagct cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg 7980
gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac 8040
catgattacg ccaagcgcgc aattaaccct cactaaaggg aacaaaagct ggagctgcaa 8100
gctt 8104
Claims (26)
1.一种建立无限增殖化人成肌细胞系的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供至少一种原代人成肌细胞，其表达表面标记物CD56并且任选地表达其他表面标记物CD82和/或CD146；
b)用编码细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)基因的慢病毒载体和编码人端粒酶(hTERT)基因的催化亚基的慢病毒载体转导所述至少一种原代人成肌细胞，以获得所述原代人成肌细胞的无限增殖化；
c)在成肌细胞生长培养基中培养来自在步骤b)中获得的至少一种无限增殖化原代人成肌细胞的细胞，并从所述生长培养基中分离每种所获得的细胞，所述每种所获得的细胞在单独培养基中呈现至少一种成肌细胞表型标记物；
d)在单独的培养和扩增培养基中分别培养在步骤c)中获得的每种所分离的细胞；
e)在步骤d)的所有所述单独的培养和扩增培养基中通过单细胞克隆从亲本细胞选择具有改善的稳定性或表达特性的至少一种细胞系；
f)控制所选择的至少一种细胞系的肌原性潜能；
g)基于单独的克隆在包封装置中存活的能力选择所述单独的克隆；
h)任选地依次重复步骤d)至g)以进一步改善所选择的细胞系。
2.根据权利要求1所述的方法，其中使用两种单独的诸如pCLX类型的慢病毒载体或单一的双顺反子载体进行步骤b)。
3.一种无限增殖化人成肌细胞系或包含来源于原代人成肌细胞的无限增殖化人成肌细胞或其子代的组合物，其中所述细胞在不存在抗生素抗性基因表达的情况下表达CDK4和hTERT并保留成肌细胞特征。
4.根据权利要求3所述的无限增殖化成肌细胞系，其呈现出对于CD56、CD82和CD146的三阳性。
5.一种无限增殖化人成肌细胞系或其子代或组合物，其中所述无限增殖化人成肌细胞以登记号1902由CCOS保藏。
6.一种无限增殖化人成肌细胞系或包含来源于原代人成肌细胞的无限增殖化人成肌细胞或其子代的组合物，所述无限增殖化人成肌细胞系能够从根据权利要求1或2所述的方法获得。
7.一种用于制备在缺氧条件下表达治疗性蛋白质的遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞的方法，其中所述方法包括以下步骤：
i)提供至少一种无限增殖化原代人成肌细胞；
ii)用慢病毒载体转导所述至少一种无限增殖化原代人成肌细胞，以用于在磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子控制下表达靶蛋白；
iii)在单独的培养和扩增培养基中分别培养在步骤ii)中获得的每种所分离的细胞；
iv)在步骤iii)的所有所述单独的培养和扩增培养基中选择具有所述靶蛋白最高分泌水平的至少一种细胞系；
v)控制所选择的至少一种细胞系的肌原性潜能。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子是人PGK启动子。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述靶蛋白是人GM-CSF。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述靶蛋白是人单克隆抗体。
11.根据权利要求7所述的方法，其中所述靶蛋白选自利妥昔单抗、伊匹单抗和甘特珠单抗(gantenerumab)。
12.根据权利要求7所述的方法，其中所述靶蛋白是抗原，尤其是病毒抗原。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述靶蛋白是COVID-19纤突蛋白或其抗原片段。
14.一种遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞系或包含遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞或其子代的组合物，其中所述细胞在不存在抗生素抗性基因表达的情况下表达CDK4、hTERT并表达至少一种治疗性蛋白质或抗原，保留成肌细胞特征并能够分泌所述治疗性蛋白质或抗原。
15.一种遗传无限增殖化人成肌细胞系或其子代或组合物，所述遗传无限增殖化人成肌细胞系分泌GM-CSF并以登记号1901由CCOS保藏。
16.一种遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞系或其子代或组合物，所述遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞系能够从根据权利要求7至13中任一项所述的方法获得。
17.根据权利要求14至15中任一项所述的遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞的用途，所述遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞用于包封细胞疗法。
18.一种药物组合物，其包含根据权利要求2至6或14至15中任一项所述的至少一种无限增殖化人成肌细胞及其药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
19.根据权利要求14至15中任一项所述的遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞的用途，所述遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞用于预防和/或治疗病症或疾病，尤其是癌症、炎性病症、感染性疾病，尤其是病毒感染或神经退化性病症。
20.根据权利要求19所述的遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞用于预防和/或治疗癌症的用途，其中所述癌症选自非霍奇金淋巴瘤、头颈癌、黑素瘤、肺癌、膀胱癌、肾细胞癌、三阴性乳腺癌、结直肠癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肉瘤和脊索瘤。
21.根据权利要求19所述的遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞的用途，用于预防和/或治疗病毒感染。
22.根据权利要求21所述的遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞用于预防病毒感染的用途，其中所述预防是接种病毒抗原疫苗。
23.根据权利要求19所述的遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞用于预防和/或治疗病毒感染的用途，其中所述病毒是冠状病毒19(COVID-19)。
24.一种可植入生物相容性装置或试剂盒，所述可植入生物相容性装置或试剂盒包含在细胞培养基中的根据权利要求14至15所述的至少一种无限增殖化人成肌细胞，任选地还包含一种或多种抗原。
25.一种预防或治疗受试者中相关联的病症或疾病，尤其是癌症、炎性病症、感染性疾病，尤其是病毒感染或神经退化性病症的方法，所述方法包括在对其有需要的受试者中施用治疗有效量的根据权利要求14至15中任一项所述的遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞。
26.一种针对受试者中的病毒感染进行疫苗接种的方法，所述方法包括在对其有需要的受试者中施用治疗有效量的根据权利要求14至15中任一项所述的遗传工程化的无限增殖化人成肌细胞，其中所述细胞表达病毒抗原。
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