CN109735488A

CN109735488A - 一种快速获得大量高纯度的间充质干细胞的方法

Info

Publication number: CN109735488A
Application number: CN201910059075.XA
Authority: CN
Inventors: 曹彤; 哈里什·德瑞; 曹哲厚; 吴立前; 韦俊; 维克拉姆·帕尔
Original assignee: Hangzhou Primitive Biology Technology Co Ltd
Current assignee: Hangzhou Primitive Biology Technology Co Ltd
Priority date: 2019-01-22
Filing date: 2019-01-22
Publication date: 2019-05-10

Abstract

本发明提供一种快速获得大量高纯度的间充质干细胞的方法，该方法包括：（1）、提供胚胎干细胞悬浮液，其中悬浮液中包括拟胚体（EB）培养液；（2）、将胚胎干细胞悬浮液接种到第一细胞培养皿中的第一初始位置，培养2‑3天后；（3）、将初始位置的胚胎干细胞悬浮液从第一培养皿中移除，并放入第二培养皿中第二初始位置培养2‑5天，其中，继续培养第一细胞培养皿中的细胞直至80‑90%以上的汇合度；循环步骤（2）和（3）。这样可以连续循环活动大量高纯度的间充质干细胞,成本低廉。

Description

一种快速获得大量高纯度的间充质干细胞的方法

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及使用人胚胎干细胞分化获得高纯度间充质干细胞的方法。

背景技术

干细胞是一种具有自我更新和多向分化潜能的细胞群体，干细胞技术在临床上的应用代表着医学发展的一大方向。按照发育阶段，干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞来自囊胚期的内细胞团，具有无限增殖和三胚层分化潜能。间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是最具代表性的成体干细胞之一，MSCs是属于中胚层的一类多潜能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，国际干细胞协会对人 MSCs的鉴定做了规定，且要求以下三点同时满足。(1)MSCs在标准培养条件下能贴壁生长 ; (2)MSCs表达 CD105、CD73和 CD90,不表达 CD45、CD14、CD11b、HLA-DR、CD79α或 CD119，其中 CD105、CD73、CD90的阳性率应≥95%，其他阴性标志物的阳性率应≤2%；(3)MSCs在体外能向成脂细胞、成骨细胞及成软骨细胞分化。

MSCs表面表达MHCⅠ类分子，但不表达MHCⅡ分子，同时MSCs也不表达共刺激分子CD40, CD80和CD86。虽然MSCs表面表达的MHCⅠ类分子会激活T细胞，但共刺激分子的缺失表达致使第二信号不能产生，因此异体应用MSCs不会引起免疫排斥反应。除具备自我复制和多系分化的潜能外，MSCs还通过分泌转化生长因子β肝细胞生长因子、一氧化氮/吲哚昔酚、白介素10、白介素6、白介素-1受体α、人白细胞抗原-G、前列腺素E2等多种可溶性因子实现免疫调节、支持造血、促血管新生等生物学功能。MSCs分泌的胞外膜泡(主要包括外泌体和微泡)也具有调控免疫反应、减轻氧化应激和组织纤维化等作用，在移植物抗宿主病、急性心梗、肝脏疾病等都发挥了治疗作用。MSCs能够定向归巢到炎症部位，发挥免疫调节作用，而且在不同的炎症微环境下MSCs能够发挥截然相反的作用。在炎症的早期, MSCs能够促进炎症反应，有利于病菌的清除，而到了炎症反应的中晚期，为了抑制过度炎症反应对组织造成的损伤，MSCs会改变表型，发挥抑制T细胞、B细胞、树突状细胞、NK细胞、巨噬细胞等免疫细胞活化的作用。

所以，间充质干细胞（MSCs）具有强大的增殖能力和分化能力，在适宜的体内或体外环境下具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和基质细胞等多种细胞的能力。间充质干细胞由于具备多向分化和免疫调节功能，因此在治疗一些退行性和自身免疫性疾病等方面具有广阔的临床应用前景。

间充质干细胞可以从骨髓、脂肪组织、外周血和脐带血等不同的组织和器官里分离得到。从骨髓虽然可以分离到较多的MSC，但是需要通过做手术才能获得，脂肪组织、外周血和脐带血方便获得，但是分离出的MSC数量偏少，同时也会受到供体疾病、体质、年龄的影响，质量不可靠，数量也有限。因此从这些组织和器官分离MSC并不是高效的方式。

将人 ESCs（胚胎干细胞）诱导分化为间充质干细胞，即人胚胎干细胞源性间充质干细胞 (human embryonic stem cell derived mesenchymal stem cells, hESC-MSCs)（hESC-MSCs意思是人胚胎干细胞来源的间充质干细胞，和成体MSC具有相似的性质）。hESC-MSCs与成体 MSCs具有相似的生物学特性和功能，来源丰富, 不产生畸胎瘤，均一性好。hESC-MSCs结合了ESCs和成体MSCs的优点，为临床应用提供了充足的MSCs来源。

目前hESC-MSCs的诱导方法主要有三种：拟胚体诱导法、饲养层法及培养基直接诱导法。拟胚体诱导法是 hESCs诱导分化的经典途径，通过拟胚体的形成启动分化过程，进而诱导获得 MSCs。然而，由于拟胚体内部分化不均一，导致MSCs的纯化过程较长。饲养层法一般是将骨髓基质细胞系作为饲养层，诱导获得MSCs细胞（培养的目标细胞，例如hESC-MSCs），然而，在诱导过程中，由于诱导MSCs与作为基质细胞的骨髓细胞具有类似的形态，因此分化过程不易观察，获得的细胞需通过流式细胞进行分选纯化，增加了细胞的损失和实验步骤，且获得的细胞容易被动物源性成分污染，不利于 hESC-MSCs的后期应用。虽然培养基直接诱导法步骤简单，可避免由于饲养层细胞的使用导致的细胞污染问题。然而，该诱导方法中血清浓度较高，不能很好地抑制其他成纤维样细胞的分化，初始获得的 MSCs 纯度不高，需通过数次传代或流式分选进行纯化，延长了诱导时间（一般是1-2个月）。

这就需要对传统的方法进行改进，期望可以获得大量纯度高的细胞，同时显著降低成本。

发明内容

针对传统的技术缺陷，我们发明小组发明了手工纯化hESC-MSCs的方法，避免培养非MSC细胞，可以较快地获得大量高纯度的hESC-MSCs，避免了使用抗体标记以及流式细胞仪进行纯化，节约了时间和成本。

所以，本发明提供的方法包括如下：（1）、提供胚胎干细胞悬浮液，其中悬浮液中包括拟胚体（EB）培养液；（2）、将胚胎干细胞悬浮液接种到第一细胞培养皿中的第一初始位置，培养2-3天后；（3）、将初始位置的胚胎干细胞悬浮液从第一培养皿中移除，并放入第二培养皿中第二初始位置培养2-5天，其中，继续培养第一细胞培养皿中的细胞直至90%以上的汇合度；循环步骤（2）和（3）。

在一些优选的方式中，该方法还包括胚胎干细胞悬浮液的准备步骤，包括如下步骤：6孔板中培养的胚胎干细胞用中性蛋白酶在37度培养箱消化5分钟后，弃去中性蛋白酶，加入2ml DMEM培养液，使用1ml无菌注射器的推杆刮掉ESC的克隆，将细胞悬液加入15ml离心管中，静置5分钟。

在另一些优选的方式中，将静置的离心管中的上清液去掉，加入2ml 拟胚体（EB）培养液（DMEM+KSR+L-glutaine+NEAA），用5ml血清管重悬细胞，加入超低吸附6孔板中，二氧化碳培养箱中培养6天，每两天更换培养液一次。

在一些优选的方式中，在循环步骤中，可以从第二培养皿中取出第二初始位子的拟胚体（EB）培养液的细胞放入第第三培养皿的第三初始位置进行培养，同时对第二培养皿中剩余的细胞进行培养直至90%以上的汇合度。在优选的方式中，对第三培养皿中剩余的细胞进行培养2-5天。

在一些优选的方式中，取走初始位置的拟胚体（EB）培养液的培养皿继续培养5天。

本发明提供一种大量培养间充质干细胞的方法，包括： 1、 6孔板中培养的胚胎干细胞用中性蛋白酶在37度培养箱消化5分钟后，弃去中性蛋白酶，加入2ml DMEM培养液，使用1ml无菌注射器的推杆刮掉ESC的克隆，将细胞悬液加入15ml离心管中，静置5分钟；

2、弃上清，加入2ml 拟胚体（EB）培养液（DMEM+KSR+L-glutaine+NEAA），用5ml血清管重悬细胞，加入超低吸附6孔板中，二氧化碳培养箱中培养6天，每两天更换培养液一次；

3、第6天将形成的EB接种到第一个6孔板中，培养2天后，EB周围会爬出类似MSC的细胞，再过3天有大量MSC爬出，将EB中心的部分用移液器挑出来放入第二个6孔板中培养，剩下的MSC细胞继续培养至90%的汇合度；

4、EB中心部分在新的培养皿里继续生长，5天后周围又长出新的MSC，将EB中心部分再次挑出，放入新的第三个培养皿培养，剩下的MSC继续培养至90%的汇合度。

有益效果：

采用本本发明的方法，不仅不需要使用抗体以及流式细胞仪进行分选纯化；而且所需时间短：可以快速连续获得大量MSCs；另外细胞纯度高：人工筛选出高纯度细胞。同时成本相对传统的方法要低很多。

附图说明

图1为EB细胞在培养容器中的位置和培养一端时间后，在培养容器中分化的细胞的结果图。

图2为培养的细胞阳性标记物的检测结果图。

图3为培养的细胞阴性标记物的检测结果图。

图4为MSCs分化潜能的验证的结果图，其中从左到有顺次为脂肪细胞，成骨细胞和软骨细胞，其结果说明 hESC-MSCs 具有向成脂、成骨和软骨细胞分化的潜能。

图5是本发明的一般操作流程示意图。

详细说明

下面对本发明涉及的结构或这些所使用的技术术语做进一步的说明。这些说明仅仅是采用举例的方式进行说明本发明的方式是如何实现的，并不能对本发明构成任何的限制。

具体实施方式

现在以具体的方式来说明本发明是如何实现的，但是，这样的方式并不是对本发明有任何限制，而是本发明精髓下的一个具体实现方式。

实施例子1:细胞培养的方法和纯化方法

1.材料和试剂

胚胎干细胞（来源：本公司自有的细胞）；中性蛋白酶（购买自STEMCELL Technologies）

DMEM的具体成分：购买自Biological Industries，成分为：无水氯化钙，硝酸铁,氯化钾，无水硫酸镁，氯化钠，无水磷酸二氢钠，L-盐酸精氨酸，L-盐酸胱氨酸，L-谷氨酰胺，甘氨酸，L-盐酸组氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-盐酸赖氨酸，L-甲硫氨酸，L-苯丙氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸钠盐，L-缬氨酸，D-泛酸钙，氯化胆碱，叶酸，肌醇，烟酰胺，核黄素，盐酸硫铵，盐酸吡哆辛，葡萄糖，丙酮酸钠，酚红。

1、6孔板中培养的胚胎干细胞用中性蛋白酶在37度培养箱消化5分钟后，弃去中性蛋白酶，加入2ml DMEM培养液，使用1ml无菌注射器的推杆刮掉ESC的克隆（即:ESC即胚胎干细胞，使用注射器的推杆把ESC克隆分割成小块刮下来，目的是使大的ESC变成小块的ESC，小块的ESC易于形成拟胚体。一般为边长大约为100-200μm的正方形，将细胞悬液加入15ml离心管中，静置5分钟；

2，弃上清，加入2ml 拟胚体（EB）培养液（DMEM+KSR+L-glutaine+NEAA，质量百分比为78%DMEM,20%KSR,1% L-glutamine,1%NEAA），用5ml血清管重悬细胞（用血清管吹打离心管底部的细胞块，使细胞悬浮于培养液中），加入超低吸附6孔板中（普通的培养皿是易于细胞吸附于底部生长的，超低吸附的培养皿细胞不容易贴壁，细胞会一直悬浮于培养液中，有利于拟胚体的形成，只有本步骤使用超低吸附培养皿，其他步骤都是普通的培养皿），二氧化碳培养箱中培养6天，每两天更换培养液一次；

3，第6天将形成的EB接种到6孔板中，培养2天后，EB周围会爬出类似MSC的细胞，再过3天有大量MSC爬出，将EB中心的部分用移液器挑出来放入另一个6孔板中培养(直径大约为20-40μm的EB中心部分)。（中心的位置是指EB中心未分化的部分，EB培养几天后边缘的细胞会分化，中心的细胞没有分化，我们取走未分化的部分，留下分化后的细胞，每次取走的未分化部分的大小随着取走次数的增加会逐渐减小，因为分化的细胞越来越多，未分化的细胞越来越少），剩下的MSC细胞继续培养至90%的汇合度；

4， EB中心部分在新的培养皿里继续生长，5天后周围又长出新的MSC，将EB中心部分再次挑出，放入新的培养皿培养，剩下的MSC继续培养至90%的汇合度（汇合度代表细胞在培养皿中的密度，指细胞覆盖培养皿底面积的比例，是细胞培养的一个常用名词）；

5，连续挑出EB中心部分可省时省力地连续获得MSC。

实施例子2：通过实施例子1培养的MSC细胞的验证试验。

将90%汇合度的MSC细胞传代至新的T75培养瓶培养5天，待细胞汇合度达到80%时，使用流式细胞仪鉴定MSC的纯度。检测MSC的阳性表面蛋白CD73,CD90,CD105和阴性表面蛋白CD11b,CD34, CD45, CD79A, HLA-DR的比率。具体见图2和图3的结果。从图2可以看出，MSC的阳性表面蛋白CD73,CD90,CD44,CD105分别为98.3%，98.6%，93.2%和99.2%，说明本发明的方法筛选的MSC细胞纯度高。相同的理由，阴性表面蛋白CD34, CD45, HLA-DR的比率分别是0.03%，0.23% 和0.17%，从另一侧面说明本发明的筛选的MSC细胞纯度高，没有其它细胞混合在其中。同时，对培养的细胞的分化能力进行考察，例如图4所示，可以看出本发明的细胞具有分化的潜能。

实施例子3：对本发明实施例子1的细胞的功能的进一步验证

MSCs的群体倍增时间

MSC的群体倍增时间(Population doubling level, PDL)在临床应用中，是最重要的一个参数，它是指群体中细胞数量增长一倍所需要的时间。PDL能准确表征细胞生长动力学。相比细胞传代次数，它更能准确的表征细胞的健康程度。群体倍增时间和细胞衰老直接相关，细胞衰老意味着分化能力下降。群体倍增时间和基因组的稳定性也直接相关。综上所述，群体倍增时间是和细胞衰老，基因组稳定性，分化能力等性质紧密相关的一个最重要的指标。PDL值可以在不同工艺中进行横向比较。

我们分别将100,000个本实施例子1中的hESC-MSC和脐带间充质干细胞（UC-MSC）接种到一个T75培养瓶中，培养5天后分别计数每个培养瓶中细胞数量，分别得到4,500,000个细胞和1,250,000个细胞。

表1. MSC群体倍增时间检测

细胞来源	初始细胞数量	五天后细胞数量	群体倍增时间
				UC-MSC	100,000	1,250,000	32.93小时
hESC-MSC（本发明）	100,000	4,500,000	21.85小时

由表中结果看出，胚胎干细胞来源的MSC比脐带来源MSC的群体倍增时间更短，说明我们分化出的MSC具有更强的增殖能力。

在缺少本文中所具体公开的任何元件、限制的情况下，可以实现本文所示和所述的发明。所采用的术语和表达法被用作说明的术语而非限制，并且不希望在这些术语和表达法的使用中排除所示和所述的特征或其部分的任何等同物，而且应该认识到各种改型在本发明的范围内都是可行的。因此应该理解，尽管通过各种实施例和可选的特征具体公开了本发明，但是本文所述的概念的修改和变型可以被本领域普通技术人员所采用，并且认为这些修改和变型落入所附权利要求书限定的本发明的范围之内。

本文中所述或记载的文章、专利、专利申请以及所有其他文献和以电子方式可得的信息的内容在某种程度上全文包括在此以作参考，就如同每个单独的出版物被具体和单独指出以作参考一样。申请人保留把来自任何这种文章、专利、专利申请或其他文献的任何及所有材料和信息结合入本申请中的权利。

Claims

1.一种快速获得大量高纯度的间充质干细胞的方法，该方法包括：（1）、提供胚胎干细胞悬浮液，其中悬浮液中包括拟胚体（EB）培养液；（2）、将胚胎干细胞悬浮液接种到第一细胞培养皿中的第一初始位置，培养2-3天后；（3）、将初始位置的胚胎干细胞悬浮液从第一培养皿中移除，并放入第二培养皿中第二初始位置培养2-5天，其中，继续培养第一细胞培养皿中的细胞直至80-90%以上的汇合度；循环步骤（2）和（3）。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，第二次初始培养的时间为2天。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，第一次初始培养的时间为2天。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，培养的细胞汇合度为90%以上。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法还包括胚胎干细胞悬浮液的准备步骤，包括如下步骤：6孔板中培养的胚胎干细胞用中性蛋白酶在37度培养箱消化5分钟后，弃去中性蛋白酶，加入2ml DMEM培养液，使用1ml无菌注射器的推杆刮掉ESC的克隆，将细胞悬液加入15ml离心管中，静置5分钟。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，将静置的离心管中的上清液去掉，加入2ml 拟胚体（EB）培养液，其具体组分包括：DMEM，KSR，L-glutaine和NEAA，用5ml血清管重悬细胞，加入超低吸附6孔板中，二氧化碳培养箱中培养6天，每两天更换培养液一次。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，在循环步骤中，可以从第二培养皿中取出第二初始位子的拟胚体（EB）培养液的细胞放入第第三培养皿的第三初始位置进行培养，同时对第二培养皿中剩余的细胞进行培养直至90%以上的汇合度。

8.一种快速获得大量高纯度的间充质干细胞的方法，该方法包括如下步骤：（1）、6孔板中培养的胚胎干细胞用中性蛋白酶在37度培养箱消化5分钟后，弃去中性蛋白酶，加入2mlDMEM培养液，使用1ml无菌注射器的推杆刮掉ESC的克隆，将细胞悬液加入15ml离心管中，静置5分钟；（2）、弃上清，加入2ml 拟胚体（EB）培养液，其中，培养的组成为质量百分比为78%DMEM,20%KSR,1% L-glutamine,1%NEAA，用5ml血清管重悬细胞，加入超低吸附6孔板中（二氧化碳培养箱中培养6天，每两天更换培养液一次；（3）、第6天将形成的EB接种到6孔板中，培养2天后，EB周围会爬出类似MSC的细胞，再过3天有大量MSC爬出，将EB中心的部分用移液器挑出来放入另一个6孔板中培养，剩下的MSC细胞继续培养至90%的汇合度；（4）、EB中心部分在新的培养皿里继续生长，5天后周围又长出新的MSC，将EB中心部分再次挑出，放入新的培养皿培养，剩下的MSC继续培养至90%的汇合度；（5）、连续挑出EB中心部分可省时省力地连续获得MSC。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述的中心位置是指指EB中心未分化的部分，EB培养几天后边缘的细胞会分化，中心的细胞没有分化，取走未分化的部分，留下分化后的细胞，每次取走的未分化部分的大小随着取走次数的增加会逐渐减小，因为分化的细胞越来越多，未分化的细胞越来越少。