CN1249223C - 培养来自人体组织的癌细胞的方法和制备组织样品的装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及培养用于自然科学系列研究的癌细胞的方法，其中就污染物，正常细胞和肿瘤细胞而言为异质性的组织样品用顺序-平行分裂法局部分离，进一步分裂该局部分离的样品裂片，其中将该组织裂片的组织片段和液体分别置于给定的细胞培养基并在预定的培养条件下生长。本发明也涉及细胞培养基和将组织样品分裂成盘状裂片的装置。该本发明的方法连同该分裂装置和该培养基可以快速培养获自人组织的癌细胞，对所有类型的肿瘤的增裂率为100%。

Description

培养来自人体组织的癌细胞的方法和 制备组织样品的装置

本发明涉及一种培养来自人体组织的癌细胞用于自然科学，优选分子生物学和细胞生物学系列研究的方法以及实施此方法的细胞培养基和制备组织样品的装置。

对于分子生物学研究，特别是带有预言性意义的研究来说，培养由细针和钻孔活检获得的初级细胞材料具有重要意义。但是，在已知的方法中，由人体组织分离出的细胞的增裂率(“Angehrate”)很低。目前，对于有些种类的肿瘤还未实现细胞培养。其问题在于，肿瘤组织周围的正常细胞和/或浸润肿瘤组织的结缔组织细胞首先增长，因此，生长优于待研究的肿瘤细胞，且阻止其生长。此外，卓有成效地培养癌细胞会受到各种各样的污染物，特别是细菌或真菌的抑制。

目前增养癌细胞使用的细胞培养基，如RPMI 1640，Basal MediumEagle，ISCOVE’s，Medium 199，Leibovitz L-15等，不能充分地促进癌细胞生长同时防止正常细胞和细菌的污染。目前通常不加控制地使用抗生素虽然对污染的负面影响有反作用，但同时也妨碍了肿瘤细胞的生长。

在已知的增养癌细胞的方法中，由细针或钻孔活检获得的组织样品的制备是通过机械-酶组织-解聚作用进行的，这里，异质的由不同层组成的形成组织样品的钻孔柱在精细切碎后作为整体分散到糊状物料中，借助于酶而转变成单个细胞。但是，通过精细切碎，取来的组织样品的异质结构遭到破坏，造成肿瘤细胞与正常细胞和污染物的强烈混合。一方面，精细磨碎损害了肿瘤细胞存活力。另一方面，通过破坏了组织样品的非均匀性，样品材料糊与正常细胞和污染物混合，以致于肿瘤细胞的生长基于上述原因而减少或甚至于完全受到抑止。在这种整体材料的机械-酶组织-解聚作用下，不可能表述肿瘤的结构。

目前已知的繁殖和提纯由组织样品获得的肿瘤材料的方法中，细胞繁殖通过将肿瘤材料移殖到裸鼠身上进行(异种移植)。虽然这种方法实现了50％，偶尔还会更多的移植肿瘤组织的增裂率，但是(取决于肿瘤种类和特性)细胞在体内繁殖需要数周，甚至数月。基于大量消耗和时间，目前为了病程检查和预言目的用病人个体的原初细胞进行的常规试验还未开始应用于临床。由于培养取自病人的组织材料的实验费时并经常是徒劳的，检测结果太迟，以致于不能按常规方法从试验结果出发及时改变治疗方案。除了大量耗时外，必需进行的动物实验和高额的成本费用也是缺陷。

这里，本发明的主题是，说明一种不依赖于实验动物的培养来自人体组织样品的癌细胞的方法，保证在相对较短的少数几天时间内安全繁殖来自组织样品的肿瘤细胞，可重复性表述肿瘤结构和恶性以及生长和结构变化或治疗效果。本发明的另一目的在于提供基于此方法的用于可重复性制备组织样品以及体外繁殖癌细胞的合适的培养基的装置。

根据本发明，此主题用这样的一种培养癌细胞的方法来解决，即提供一种培养来自人体组织的癌细胞的用于分子生物学的系列研究的方法，其中，基于涉及肿瘤细胞，正常细胞和污染物的异质结构将组织样品通过顺序-平行机械切开而局部分离为盘状裂片，单个组织样品裂片分离，进一步分为组织片断，得到的局部分离的组织样品裂片的小的、分开的组织片断和组织液在一定的细胞培养基中，在给定培养条件下选择性生长，抑制了正常细胞和污染物的干扰影响。

本发明的基本思想在于，在顺序-平行的切割过程中，将组织样品分割成许多独立的组织裂片，以此局部分离基于污染物，正常细胞和肿瘤细胞异质的组织样品或其异质性。然后，组织裂片各自独立地进一步切碎，这样形成的小的、分开的组织片断和组织液以及在组织样品的顺序-平行分裂过程中形成的、同样各自独立获得的组织液在特定的细胞培养基中，在选定的培养条件下培养。通过局部分离组织样品，已有的在通常(机械或酶)制备组织样品过程中优于肿瘤细胞生长的正常细胞的影响得到消除或抑制。同样，污染物，如真菌或细菌的数量大大减少，且众所周知妨碍肿瘤细胞繁殖的抗生素可以节省或针对性使用，不会对癌细胞培养起负作用。

提出的方法在本发明的其它内容中通过适合很小量组织以一种细胞培养基以及通过关于氧和二氧化碳气氛，空气湿度和温度以及使用生物基质的培养条件有利加以补充。由此总体上实现促进癌细胞生长的条件，这些条件基本上限制了正常细胞和污染物或甚至完全消除。

其它有利的工艺特征来自可以从如下的描述中看出。

组织样品可以由细针，抽吸和外科手术内的活检或切除样品获得，与组织样品获得，与组织样品上粘附的来自相关病人的样品取样点范围内的红细胞一起置于细胞培养基中，直至制备出组织片断。

在一个方案中，用于保存新鲜组织样品的细胞培养基与培养肿瘤细胞的细胞培养基是一致的。

根据一个实施方案，由局部分离的组织样品裂片产生的组织片断和组织液独立地在用生物基质涂覆并装满细胞培养基的细胞培养瓶中，在含氧气0.01-3％，含二氧化碳0.1-5％以及空气湿度为100％，温度为30℃-36.5℃条件下培养。

例如，在细胞培养物初次建立和进行细胞粘附之后一定时间内，将培养瓶中细胞培养基用新鲜的但同样组成的培养基替换。

进一步地，根据污染物，如细菌或真菌存在的情况，在同样或减少了抗生素组分情况下将细胞培养基替换。

用于本发明的细胞培养基，其组成为；

无机盐，即

Ca(NO₃)₂        10-100mg/L

CaCl₂·2H₂O     80-150mg/L

Kcl                200-1000mg/L

MgSO₄·7H₂O     200-700mg/L

NaCl               3000-10000mg/L

NaHCO₃           1500-4000mg/L

Na₂HPO₄         100-1000mg/L；

氨基酸，即

L-精氨酸·4HCl     10-500mg/L

L-天冬酰胺(自由碱)           10-500mg/L

L-天冬氨酸                   10-500mg/L

L-胱氨酸                     10-500mg/L

L-谷氨酸                     10-500mg/L

L-谷氨酰胺                   10-500mg/L

甘氨酸                       10-500mg/L

L-组氨酸(自由碱)             10-500mg/L

L-羟脯氨酸                   10-500mg/L

L-异亮氨酸                   10-500mg/L

L-亮氨酸                     10-500mg/L

L-赖氨酸·HCl                10-500mg/L

L-甲硫氨酸                   10-500mg/L

L-苯丙氨酸                   10-500mg/L

 L-脯氨酸                    10-500mg/L

 L-丝氨酸                    10-500mg/L

 L-苏氨酸                    10-500mg/L

 L-色氨酸                    10-400mg/L

 L-酪氨酸                    10-500mg/L

 L-缬氨酸                    10-500mg/L

 L-丙氨酸                    10-300mg/L

维生素，即

生物素                       0,01-10mg/L

 D-泛酸钙                    0,01-10mg/L

盐酸胆碱                     0,1-50mg/L

叶酸                         0,01-10mg/L

i-肌醇                       0,1-100mg/L

烟酰胺                       0,01-10mg/L

吡哆醛·HCl                  0,01-10mg/L

核黄素            0,1-100μg/L

硫氨素·HCl       0,1-50mg/L

对氨基苯甲酸      1-1000μg/L

维生素B₁₂        1-1000μg/L

烟酸              1-100μg/L

抗坏血酸          1-5000μg/L

甲酰四氢叶酸      1-100μg/L

脂酮酸            1-100μg/L

维生素A(醋酸盐)   10-1000μg/L

吡哆素·HCl       1-100μg/L

烟酰胺            1-100μg/L

α-维生素E磷酸酯  0-1000μg/L

以及

D-葡萄糖          100-5000mg/L

酚红              0,1-1000mg/L

谷胱甘肽(还原型)  0,01-10mg/L

丙酮酸钠          0,1-50nM

表皮生长因子(表皮生长因子，EGF重组体)1-3000 ng/L

胎牛血清(FBS)

牛胰岛素(冻干)    0,1-50mg/L

和抗生素

这方面例如发现，在直接来源于病人组织样品的取样点的红细胞存在下，肿瘤细胞特别快地生长，具有比只是放入纯细胞培养基进行生长的细胞更高的。此外，当组织样品在细胞培养基中在约4℃至12℃下保存至少2小时，但不长于24小时，以适应接下来应完成癌细胞繁殖的细胞培养基，已经证明这是有利的。在上述工艺条件下，如果设定与组织取样方式一致的培养温度，在1至12小时后就显示出来自制备的组织片断的肿瘤细胞在细胞培养瓶中的生物基质上的粘附。

借助此和其它下面在实施方案中详细描述的发明，给出了体外肿瘤细胞繁殖的方法，由此实现在相对较短时间内对于各种肿瘤细胞以100％增裂率培养由人体组织获得的细胞。与在裸鼠(异种移植)上实现约50％增裂率的细胞繁殖相比，不仅避免了动物试验，节省了成本，还明显缩短了繁殖细胞材料需要的时间，与体内肿瘤生长期为几周或甚至几个月相比，这里本发明提出的方法一般只为1-10天。

由此首次可能以简单和重复性的方式快速和低成本地进行常规研究以实行癌症病程的检查和用于预后目的(对辐射，化学疗法，体温疗法的敏感性试验)或鉴别对新抗癌活性物质的抗性之早期检测，作为对细胞学或组织病理学的组织鉴定的补充，及用于基础研究。

根据本发明的另一个特征，提供了用于制备本发明局部分离的组织样品的装置作为有效细胞繁殖的前提条件。这个装置一方面包括用于顺序-平行分离组织样品的切割设备，另一方面包括用于进一步加工由切割设备制备的组织裂片的切碎仪器。在这些设备中进行的切割过程中，取自异质组织样品的不同位置的各个组织片断和组织液在装置中彼此保持分开，由此它们可选择性用于细胞繁殖。

具体地，本发明提供了这样用于局部分离制备组织样品的装置，其中，有一个用于顺序-平行地将组织样品切碎为各个彼此分开的组织裂片和属于相应切割位置的组织液的切割装置，包括划分为带有次级小室的小室的接收盘，在其上可拆卸地固定的带有向接收盘部分开放的切割槽的切割板以及为切割刀具设置的切割刀具架，其中切割刀具在切割刀具架中的排列与切割槽在切割板中的排列一致，对每个切割槽设置一个位于其下方的各自的次级小室；以及一个用于进一步制备局部分裂的组织样品裂片的切碎仪器，其包括一个划分为小室的液体接收盘，一个带有凹槽的在其上可拆卸地固定的加工板以及带有旋转立柱刀具的旋转立柱，其中凹槽有孔洞，分别位于小室上方，旋转立柱与相连。

切割设备一般包括一个上面活动安装切割板的划分为小室的接收盘以及一个切割刀具架。在切割板里以预先确定间隔构成的切割槽，其在切割范围内向接收盘开放，各自位于小室的上方。切割刀具架中，切割刀具或切割金属丝以与切割槽间隔相一致的间隔安装。通过各自在切割槽范围内切割位于切割板上的组织样品，实现了整齐割下组织裂片，同时剩余片断和组织液到达切割槽下方的小室。

另一种制备组织裂片的工艺中提供切碎仪器，其包括一个划分为小室的液体接收盘，一个在其上可拆卸地固定的带有用以容纳组织裂片的凹槽的加工板，单独或在一个支撑板上可旋转并可纵向活动性安装的正面固定有刀的旋转立柱。用此仪器产生了最后用于细胞繁殖的小组织片断。同样可使用的在切割过程中形成的组织液经在凹槽中形成的孔洞到达液体接收盘中各自下方的小室中，同样用于细胞繁殖。

本发明装置的其它特征和有利的其它构成从以下内容看出。

在一个方案中，切割板具有垂直于切割槽方向伸展且居中安装的锉纹支撑面以稳定放置组织样品。

进一步地，切割板在支撑面范围内向其下方的次级小室开放，以便于切割过程中形成的组织液或组织片断分别收集到各自的次级小室。

更进一步地，切割槽的宽度大于切割刀具的厚度。

另外，切割刀具固定在切割刀具架的盖板上。

可以将切割刀具设计成切割刀具架中张紧的切割金属丝。

在进一步的方案中，切割板和加工板各自保持在接收盘或液体接收盘上的导轨中，其中在带有切割槽的切割板所用导轨中形成排成直线的凹槽。

在另一方案中，旋转立柱-支撑板的钻孔中，旋转立柱沿垂直方向可移动或可旋转来安装。

本发明的实施方案在下面加以描述，这里关于体外细胞繁殖请参考附表，其中给出了所用细胞培养基的组成，而关于组织样品的加工请参考附图。图中表示：

图1：用以按本发明顺序-平行制备组织样品的切割装置的分拆透视图；

图2：用以进一步制备在按图1的装置中制备的用于体外细胞繁殖的组织裂片的装置的分拆透视图；

图3：沿图1中B-B线方向的接收盘的剖面图；

图4：沿图1中A-A线方向在切割槽范围内通过切割板的垂直切割面；和

图5：装配状态下，按图2的装置的横截面图。

从病人以细针或钻孔活检形式取得的组织样品以组织钻孔柱形式存在，但是也可以是按其它方法获得的小组织片断或不同形状和大小的组织片断。带有粘附的来自病人的取样点的红细胞的组织样品为运输到研究地点而保存在细胞培养基中，温度为2℃-12℃，时间虽然至少2小时，但最长为24小时。在这段时间内，避免组织片断遭受机械负荷。这里，组织片断已经能适应接下来用于细胞繁殖的同样组成的细胞培养基，其中上述温度特别有利。

用于细胞培养的组织样品的加工用图中所表示的装置完成。

用于顺序-平行地将组织样品分解为一定的，预先给定长度的段，并用于分离这些段或其组分的装置包括接收盘1，保持在接收盘1上的切割板2和切割刀具架3。切割板2划分为同样宽度的5段。在每一段内有分别以不同间隔设置的切割槽4，它们在其中间范围内向接收盘1开放。切割槽4在5段内分别设置间距为1mm，2mm，3mm，5mm和1mm。在切割板的长度方向，其中间区域内形成锉纹的支撑面5，以固定切割过程中放在其上的组织样品6。在此范围内，切割槽4向下开放。切割板2可移动地保持在2个在接收盘1长度侧面上安装的导轨7中。切割板2的切割槽4在导轨中的凹口8中连续。

接收盘1相应于切割板2中安装的槽段通过隔板12划分为5个小室1a-1e，其中切割槽通过在相关小室1a，1b，1c和1e中的其它中间隔板分别布置有次级小室1a1至1a9，1b1至1b4，1c1至1c3和1e1至1e9。次级小室为了确切地局部布置各个组织样品裂片6a或组织样品残余或组织液而相应不同地加以标记。

切割刀具架3包括盖板上固定有切割刀具10的盖或支撑架。不用切割刀具10还可以在框架侧面张紧切割金属丝。切割刀具10按与切割板中切割槽4同样的间距安装。切割刀具架3这样计算尺寸安装，或切割刀具10这样安装，以便切割元件可在切割槽4和凹口8上方或内部移来移去。切割刀具架3可以在接收盘1的长度侧面曲柄状固定，而且这样使得它能在切割板2上存在的但与组织样品交叉的位置移动，以便在切割位置整齐切开样品。

根据组织样品的长度和希望的切割间距，组织样品6放在切割板2的锉纹支撑面5上。通过在组织样品上放置(翻转)的切割刀具架3的来回移动，制品在切割槽4范围内切开。切割过程形成的液体经过在切割板2的支撑面5范围内在切割槽4中设置的孔洞4a，流入各自下方的次级小室。收集的液体如同分开的样品裂片一样可用于细胞繁殖，或者留在切割板2上，或通过切割槽4中的孔洞4a落入下方的次级小室。

用图1，3和4表示的装置，可以重复性按预先给定的尺寸精确，均匀以及光滑地切割而不损坏样品材料。借此，从相应于由病人取来的组织片断的异质性通过分裂而局部分离的组织样品来完成细胞繁殖。由此，正常细胞和污染物对肿瘤细胞生长(筛选)的妨碍作用得以抑制或消除。此外，在组织样品切割过程中局部分离形成的组织液，其含有重要的干细胞，也可以用于细胞繁殖。作为在下面描述的进一步制备组织样品的过程之后体外细胞繁殖的结果，可表述异质形成的组织样品的结构，肿瘤核的排列或恶性。最后，以各个局部分离的样品裂片的制备也是可重复的，以便可以可靠表述病变的进程或治疗措施的效果。

在上述切割装置的各种实施方案中，组织样品的切割也可以用独立的刀具立柱(未示出)来完成，其上以与切割槽4之间一致的间距安装切割刀具或切割金属丝。

图2和图5中示出了一种用于进一步制备局部分离提供的样品裂片6a或残余片断的装置。在此装置中，液体接收盘13通过垂直隔板11划分为多个小室13a至13e。在两个于液体接收盘13的上边缘上安装的导轨14中支撑着一个在其中以一定间隔成型的凹槽16的加工板15。凹槽16在底部有小孔17。在加工板15完全插入导轨14中的位置，凹槽16分别位于小室13a-13e的上方。事先分开的组织样品6的样品裂片6a放入凹槽16，用在旋转立柱18上固定的旋转立柱刀具19进一步切碎。优选在旋转立柱的正面安装2个或多个旋转立柱刀具19。样品裂片6a的切碎在轻压下，还可能同时伴随着旋转立柱18的来回旋转来完成。

如图2所示，支撑板20中也可以有多个旋转立柱18保持可旋转移动和可升降。旋转立柱18之间的间距相应于加工板15中凹槽16的间距。

样品裂片6a经过进一步切分过程后，其切分片断(组织片断)和在分开过程中形成的组织液，它经过凹槽16中的孔洞17到达小室13a至13e，用于细胞繁殖。

图1至5所表示的用于局部分离的顺序-平行的切割和进一步制备组织样品的装置由耐热达121℃、适于高压釜中处理的材料，优选聚四氟乙烯，金属或塑料构成。对于切割刀具优选使用玻璃。

局部分离制备的样品裂片6a的各个切分片断和各自的组织液独立地引入充满细胞培养基的细胞培养瓶中，所述细胞培养基与贮存取自患者的样品组织6之培养基相同。在取样后保存组织样品的剩余细胞培养基同样装入细胞培养瓶。细胞培养瓶各自用生物基质(这里为胶原或多聚赖氨酸)涂覆。这里用于体外细胞繁殖的细胞培养基的组成在下表中给出：

无机盐

Ca(NO₃)₂          250mg/L

CaCl₂·2H₂O       132mg/L

Kcl                  400mg/L

MgSO₄·7H₂O       150mg/L

NaCl                 6400mg/L

NaHCO₃              2100mg/L

Na₂HPO₄           400mg/L

氨基酸

L-精氨酸·4HCl       110mg/L

L-天冬酰胺(自由碱)   38mg/L

L-天冬氨酸           23mg/L

L-胱氨酸             31mg/L

L-谷氨酸             25mg/L

L-谷氨酰胺           296mg/L

甘氨酸            13mg/L

L-组氨酸(自由碱)  12mg/L

L-羟脯氨酸        10mg/L

L-异亮氨酸        38mg/L

L-亮氨酸          38mg/L

L-赖氨酸·HCl     35mg/L

L-甲硫氨酸        12mg/L

L-苯丙氨酸        16mg/L

L-脯氨酸          22mg/L

L-丝氨酸          26mg/L

L-苏氨酸          22mg/L

L-色氨酸          5mg/L

L-酪氨酸          19mg/L

L-缬氨酸          22mg/L

L-丙氨酸          10mg/L

维生素

生物素            0,6mg/L

D-泛酸钙          0,7mg/L

盐酸胆碱          3,5mg/L

叶酸              1,0mg/L

i-肌醇            35,9mg/L

烟酰胺            1,0mg/L

吡哆醛·HCl       1,0mg/L

核黄素            20μg/L

硫胺素·HCl       1,0mg/L

对氨基苯甲酸      500μg/L

维生素B₁₂        5μg/L

烟酸              25μg/L

抗坏血酸            50μg/L

甲酰四氢叶酸        6μg/L

脂酮酸              21μg/L

维生素A(醋酸盐)     100μg/L

吡哆素·HCl         25μg/L

烟酰胺              25μg/L

α-维生素E磷酸酯    10μg/L

其它组分

D-葡萄糖            1750mg/L

酚红                7mg/L

谷胱甘肽(还原型)    0,5mg/L

丙酮酸钠            1mM

表皮生长因子(表皮生长因子，EGF重组体)250ng/L

胎牛血清(FBS)       12,5％

牛胰岛素(冻干)      8mg/L(26U/mg)

根据技术状况使用抗生素。

然后，用生物基质涂覆的含有本发明的细胞培养基和其中已有的按前面所述制备方法制备的小组织片断或组织液的细胞培养瓶放入恒温箱，那里在温度为30℃-36.5℃，含氧气0.01-3％，含二氧化碳0.1-5％，空气湿度为100％条件下保存。准确的温度取决于取组织样品时测得的温度。

至早在1-12小时后，肿瘤细胞粘附到细胞培养瓶中的生物基质基体上。在培养物初次建立后约24小时，进行细胞粘附之后，将细胞培养瓶中的培养基用同第一次具有相同组成的新鲜培养基替换。其它培养基的变化应当-根据污染物存在情况-在第一周内进行。当肿瘤细胞在休眠期之后建立并开始繁殖后，将它们维持在一种无抗生素的培养基中，接着开始大量繁殖。

通过上述早期将组织样品在2-24小时后切分为独立的组织裂片或更小的组织片断，培养瓶中污染的概率和污染物大量繁殖的概率很小。但是，偶尔发现的含高污染负荷的培养瓶被丢弃。如果由于操作失误正常细胞强烈繁殖且生长超过肿瘤细胞，可以进行磁力分离，然后在上面说明的培养条件下可保证恶性细胞的选择性生长。

                     相关图例

1                    接收盘

1a1至1a10            次级小室

1b1至1b5             次级小室

1c1至1c3             次级小室

1d

1e1至1e10            次级小室

2                    切割板

3                    切割刀具架

4                    切割槽

4a                   4中孔洞

5                    支撑面

6                    组织样品

6a                   样品裂片

7                    导轨

8                    凹槽

10                   切割刀具/切割金属丝

11                   隔板

12                   隔板

13                   液体接收盘

13a-13e              小室

14                   导轨

15                   加工板

16                   凹槽

17                              孔洞

18                              旋转立柱

19                              旋转立柱刀具

20                              旋转立柱-支撑板

Claims (13)

1.一种培养来自人体组织的癌细胞的用于分子生物学的系列研究的方法，其特征为，基于涉及肿瘤细胞，正常细胞和污染物的异质结构将组织样品(6)通过顺序-平行机械切开而局部分离为盘状裂片，单个组织样品裂片分离，进一步分为组织片断，得到的局部分离的组织样品裂片(6a)的小的、分开的组织片断和组织液独立地在用生物基质涂覆并装满细胞培养基的细胞培养瓶中，在含氧气0.01-3％，含二氧化碳0.1-5％以及空气湿度为100％，温度为30℃-36.5℃条件下选择性培养，其中使用具有下列组成的细胞培养基：

下列的无机盐：

Ca(NO₃)₂                      50mg/L

CaCl₂·2H₂O                   132mg/L

Kcl                              400mg/L

MgSO₄·7H₂O                   150mg/L

NaCl                             6400mg/L

NaHCO₃                          2100mg/L

Na₂HPO₄                       400mg/L

下列的氨基酸：

L-精氨酸·4HCl                  100mg/L

L-天冬酰胺，自由碱              38mg/L

L-天冬氨酸                      23mg/L

L-胱氨酸                        31mg/L

L-谷氨酸                        25mg/L

L-谷氨酰胺                      296mg/L

甘氨酸                          13mg/L

L-组氨酸，自由碱                12mg/L

L-羟脯氨酸                      10mg/L

L-异亮氨酸                      38mg/L

L-亮氨酸                        38mg/L

L-赖氨酸·HCl                   35mg/L

L-甲硫氨酸                      12mg/L

L-苯丙氨酸                      16mg/L

L-脯氨酸                        22mg/L

L-丝氨酸                        26mg/L

L-苏氨酸                        22mg/L

L-色氨酸                        5mg/L

L-酪氨酸                        19mg/L

L-缬氨酸                        22mg/L

L-丙氨酸                        10mg/L

下列的维生素：

生物素                          0.6mg/L

D-泛酸钙                        0.7mg/L

盐酸胆碱                        3.5mg/L

叶酸                            1.0mg/L

i-肌醇                          35.9mg/L

烟酰胺                          1.0mg/L

吡哆醛·HCl                     1.0mg/L

核黄素                          20μg/L

硫胺素·HCl                     1.0mg/L

对氨基苯甲酸                    500μg/L

维生素B₁₂                      5μg/L

烟酸                            25μg/L

抗坏血酸                        50μg/L

甲酰四氢叶酸                    6μg/L

脂酮酸                          21μg/L

维生素A，醋酸盐                100μg/L

吡哆素·HCl                    25μg/L

烟酰胺                         25μg/L

α-维生素E磷酸酯               10μg/L

下列的其它组分：

D-葡萄糖                       1750mg/L

酚红                           7mg/L

谷胱甘肽，还原型               0.5mg/L

丙酮酸钠                       1mM

表皮生长因子，重组体           250ng/L

胎牛血清                       12.5％

牛胰岛素，冻干                 8mg/L(26U/mg)

和抗生素。

2.权利要求1的方法，其特征为，一种与培养肿瘤细胞的细胞培养基一致的细胞培养基用于保存新鲜组织样品。

3.权利要求1的方法，其特征为，组织样品(6)在其中保留至少2小时，但不长于24小时，温度为4℃-12℃。

4.权利要求1的方法，其特征为，在细胞培养物初次建立和进行细胞粘附之后，将培养瓶中细胞培养基用新鲜的但同样组成的培养基替换。

5.权利要求4的方法，其特征为，根据污染物存在的情况，将细胞培养基替换。

6.实施权利要求1的方法、用于局部分离制备组织样品的装置，其特征为，有一个用于顺序-平行地将组织样品(6)切碎为各个彼此分开的组织裂片(6a)和属于相应切割位置的组织液的切割装置，包括划分为带有次级小室(1a1至1a10，1b1至1b5，1c1至1c3，1d和1e1至1e10)的小室的接收盘(1)，在其上可拆卸地固定的带有向接收盘(1)部分开放的切割槽(4)的切割板(2)以及为切割刀具(10)设置的切割刀具架(3)，其中切割刀具(10)在切割刀具架(3)中的排列与切割槽(4)在切割板(2)中的排列一致，对每个切割槽(4)设置一个位于其下方的各自的次级小室；以及一个用于进一步制备局部分裂的组织样品裂片(6a)的切碎仪器，其包括一个划分为小室(13a-13e)的液体接收盘(13)，一个带有凹槽(16)的在其上可拆卸地固定的加工板(15)以及带有旋转立柱刀具(19)的旋转立柱(18)，其中凹槽(16)有孔洞(17)，分别位于小室(13a至13e)上方，旋转立柱(18)与(16)相连。

7.权利要求6的装置，其特征为，切割板(2)具有垂直于切割槽(4)方向伸展且居中安装的锉纹支撑面(5)以稳定放置组织样品(6)。

8.权利要求6的装置，其特征为，切割板(4)在支撑面(5)范围内向其下方的次级小室开放，以便于切割过程中形成的组织液或组织片断分别收集到各自的次级小室。

9.权利要求6的装置，其特征为，切割槽(4)的宽度大于切割刀具(10)的厚度。

10.权利要求6的装置，其特征为，切割刀具(10)固定在切割刀具架(3)的盖板上。

11.权利要求6的装置，其特征为，切割刀具(10)设计成切割刀具架(3)中张紧的切割金属丝。

12.权利要求6的装置，其特征为，切割板(2)和加工板(15)各自保持在接收盘(1)或液体接收盘(13)上的导轨中(7或14)，其中在带有切割槽(4)的切割板(2)所用导轨(7)中形成排成直线的凹槽(8)。

13.权利要求6的装置，其特征为，旋转立柱-支撑板(20)的钻孔中，旋转立柱(18)沿垂直方向可移动或可旋转来安装。

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