CN1187456C - CpG岛甲基化检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因检测技术，具体是指用于肿瘤诊断、去甲基化药物筛选的CpG岛甲基化检测试剂盒及其应用。本试剂盒主要包含引物、提取模板DNA的药物、基因组修饰用药物、DNA纯化用药物、甲基化特异性PCR反应体系和阳性和阴性对照标本。本发明利用人类基因的基因序列，根据碱基错配原理设计引物，它们可选自细胞周期上二个基因即P₁₅ ^INK4B，P₁₆ ^INK4A基因，胰癌基因CpG，蛋白激酶相关蛋白基因CpG，乳腺癌基因2CpG，急性白血病相关基因，基因调节因子3基因，基因调节因子27基因，GTP激酶相关蛋白27基因，GTP激酶相关蛋白基因27B，GTP激酶相关蛋白基因2L引物中的任何一种，不同引物就组成检测不同疾病的试剂盒。本发明试剂盒准确、灵敏度高。可简便地检测对象CpG岛有无甲基化和筛选去甲基化药物。能广泛用于癌症的诊断和相关药物的筛选，具有良好的经济效益和社会效益。

Description

CpG岛甲基化检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及基因检测技术，具体是指用于肿瘤诊断、去甲基化药物筛选的CpG岛甲基化检测试剂盒及其应用。

背景技术

CpG岛是DNA的一段区域，长度约为0.5～2.6kb。在正常组织中CpG岛是非甲基化的。但是在人类恶性肿瘤中，DNA甲基化改变是最普遍的能被识别的基因异常现象之一。许多特定基因操纵区高甲基化在恶性肿瘤中一般发生于早期。

目前测定5′-CpG岛甲基化的方法有Southern blot，原理是利用对甲基化敏感的限制性内切酶不能切开含有一个或几个甲基化的CpG位点的序列，这种方法提供了估计CpG岛总体甲基化情况，要求大量DNA成分，它能提供甲基化敏感的限制性内切酶所能识别序列之内CpG位点的甲基化信息；另一种方法是利用甲基化敏感的限制性内切酶结合PCR的方法，酶消化后的DNA被覆盖着限制性位点的引物扩增，只有CpG位点甲基化的才能提供完整的模板。这种方法也只能提供限制性内切酶识别范围内的CpG位点甲基化信息，非甲基化的DNA必须完全限制，消化不完全的DNA可产生假阳性。

人们为寻找检测CpG岛甲基化，开展了长期深入的研究，得出了一些CpG岛的高甲基化的基因失活与肿瘤和白血病的关系，为诊断与治疗癌症提供了新途径。但目前在国内外均未见有关检测肿瘤基因甲基化和去甲基化试剂盒生产、销售、使用方面的报道。

发明内容

本发明的目的在于利用目前研究结果，开发一种能简便地检测对象CpG岛有无甲基化和筛选去甲基化药物的试剂盒，并将其应用于诊断相关的疾病和筛选相关的药物。

CpG岛甲基化检测试剂盒包含有下列药物：

(1)引物

利用人类基因组的基因序列，根据碱基错配原理，引物选自细胞周期上二个基因即P₁₅ ^INK4B，P₁₆ ^INK4A基因，胰癌基因CpG，蛋白激酶相关蛋白基因CpG，乳腺癌基因2CpG，急性白血病相关基因，基因调节因子3基因，基因调节因子27基因，GTP激酶相关蛋白27基因，GTP激酶相关蛋白基因27B，GTP激酶相关蛋白基因2L引物中的任何一种；

(2)提取模板DNA的药物

①内含200～400μg/ml的蛋白酶K的DNA提取液，

②饱和酚/氯仿/异戊醇体系，它们的体积比为20～25∶20～25∶1，

③醋酸钠，

④淋巴细胞分层液；

(3)基因组修饰用药物：

①硅精，

②氢醌，

③亚硫酸氢钠，

④矿物油；

(4)基因组修饰后的DNA纯化用药物

①DNA纯化用DEAE树脂，

②异丙醇；

(5)甲基化特异性PCR反应体系

①甲基化PCR缓冲液，10×buffer，

②四种核苷酸即dNTP，

③MgCl₂，

④耐高温聚合酶即Taq酶；

(6)阳性和阴性对照标本

①阳性标本甲基化Raji细胞，

②阴性标本非甲基化HL₆₀细胞。

提取模板DNA(MoDNA)的药物中饱和酚是指用50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷饱和的酚；饱和酚/氯仿/异戊醇体积比为24∶24∶1。

基因修饰用药物中硅精是指用常规DNA纯化方法纯化过的硅精，氢醌和亚硫酸氢钠采用分析纯干粉。

CpG岛甲基化检测试剂盒的应用，包括常规标本的收集；基因组DNA提取、修饰和纯化，其特征在于：

(1)基因组修饰中：

①纯化硅精DNA用量为0.51～2μg/份，

②氢醌的新鲜配制：将10～13mg的氢醌定容在10ml超净水中，

③亚硫酸氢钠的新鲜配制：将2.9～3.2g的亚硫酸氢钠定容在10ml超净水中，

④修饰的温度为50～60℃，

⑤孵育时间为12～18小时；

(2)修饰后模板DNA纯化中：

①DEAE树脂加入量为0.5～1.5mg，

②用异丙醇洗涤并过滤后离心，

③干燥树脂，

④加入50～60μl的预热至55～75℃超净水中，并离心，

⑤加入1mol/L的氢氧化钠，使其终浓度达0.2～0.4mmol/L、置室温保存，

⑥加无水乙醇并在-20℃下过夜，

⑦0℃离心，

⑧70％乙醇洗涤后干燥，

⑨超净水溶解后，-20℃保存；

(3)甲基化特异性PCR反应体系配制如下：

①反应体积50μl：

               加甲基化引物标准管PM     不加甲基化引物对照管PU

10×buffer     5μl                     5μl

dNTP           5～8μl                  5～8μl

MgCl₂         10～15μl                10～15μl

PM或PU         2～4μl

MoDNA          8～10μl                 8～10μl

Taq酶          1～4u                    1～4u

加H₂O至50ml，加50ml石蜡油

②反应条件：

将上述体系放入PCR机中进行如下反应：

首先93～95℃变性5～10min，然后按93～95℃30～45S→55～65℃30～45S→70～72℃30～45S的次序做24～34个循环，再70～72℃延伸5～10min，产物4℃下保存备用；

(4)阴阳性对照

甲基化特异性PCR反应中放Raji和HL₆₀细胞株分别做阳性和阴性对照，设不加模板DNA即MoDNA作空白对照；

除上述之外的其他应用过程均为常规技术，所用药物均为分析纯。

甲基化特异性PCR反应优选条件为：

按94℃ 35S→58℃ 35S→71℃ 35S做25个循环。

应用过程中所用离心均选9000～12000rpm。

本发明具有如下突出的优点：

本发明开发的CpG岛甲基化检测试剂盒在阳性与阴性细胞混合为1∶10⁴时可以测到甲基化阳性细胞，灵敏度高，准确，该试剂盒的生产和应用，将可达到如下使用目的：

(1)检测临床患者基因是否甲基化，在CpG岛基因甲基化说明该患者已有癌变的可能；

(2)测定肿瘤病人在治疗过程中的CpG岛基因甲基化的情况、从而可改变治疗方案，用去甲基化药物去甲基化后再化疗，疗效高；

(3)检测和筛选去甲基化的药物；

(4)检测肿瘤患者应用去甲基化药物治疗的结果。

广泛应用于癌症的诊断和相关药物的筛选，将会产生巨大经济效益和社会效益。

具体实施方式

制备CpG岛甲基化检测试剂盒实施例

试剂盒中常规试剂除外，其他药物分述如下：

本实施例中的药物为10人份

(1)引物不同就组成检测不同疾病的试剂盒，

各类引物如下：

胰癌基因CPG引物

AGTGGAGGACAAGTCAGGGG

GGGCTTCGAGAGGACAGAG

蛋白激酶相关蛋白基因CPG引物

TCTATGCCACTGTTGGGGTTA

AGGGAGCTCCAAAATCTCCT

乳腺癌基因2CPG引物

TCCGTCAGATACTGACGGTTG

GCAGAGACAAAAGGGCAAGAAG

急性白血病相关基因引物

TCACMACACTTGCCCTCTCT

AGGAAGACAGTGACGAAGACC

基因调节因子3基因引物

CTCTGACCTCCACTCACTCAT

AGCCTGTGCTCCTCCTGTGAG

基因调节因子27基因引物

ATAGCCCTGGACATCACTGCC

GAGAGAGTGTGTTTCTCACTG

GTP激酶相关蛋白27基因引物

GTCTTCTTTGCAAGGATTTCTGC

ATACCTGGTACGCTGCTGATT

GTP激酶相关蛋白基因27B引物

TTTGAAAGGGTCAGTCCTCCT

CATCCAAAGATACAGCATCTAA

GTP激酶相关蛋白基因2L引物

AAAACAGCGTAGAGCCTGAGAAG

AAAGATAAACATCCAAGCTCTTCC

P16基因引物

M1 GAGTACTTGGGGTGTGGCACT

M2 GATAACGATTCACAGACATTC

P15引物

M1 CGTTCGTATTTTGCGGTT

M2 GTACAATAACCGAACGACCGA

(2)提取模板DNA药物

①内含浓度为200μg/ml或300μg/ml或400μg/ml蛋白酶K的DNA提取液10ml，

②用50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷饱和的酚/氯仿/异戊醇比例为24∶24∶1，10ml，

③浓度范围为2.5～4.6ml/L，PH范围为4.6～5.2的醋酸钠，10ml，

④淋巴细胞分层液35ml；

(3)基因组的修饰所用药物

①用常规DNA纯化方法纯化过的硅精12μg，

②分析纯的粉末状氢醌13mg，

③分析纯的粉末状亚硫酸氢钠3.5mg，

④矿物油1.5ml；

(4)基因组修饰后的DNA纯化用药物

①DNA纯化用DEAE52树脂1g，

②分析纯的异丙醇20ml；

(5)甲基化特异性PCR反应体系

①甲基化PCR缓冲液，10×buffer：

含硫酸铵10mg、三羟甲基氨基甲烷10mg、PH8.8β-巯基乙醇0ml，

②浓度为25mol/L的dNTP即dTTP、dATP、dCTP、dGTP四种核苷酸各10μl，

③浓度为2.5mmol/L的MgCl₂ 1.5ml；

(6)阳性和阴性对照标本

甲基化的阳性标本DNA 15μg，

非甲基化阴性标本DNA 15μg；

将上述药物总装于试剂盒。

应用实施例：应用实施例1

不成熟B系细胞株Raji为P₁₅基因甲基化阳性的细胞株(中山医肿瘤医院研究所赠)；HL₆₀为P₁₅基因非甲基化阳性的髓系细胞株；K562为P₁₅基因纯合缺失的红-巨核系细胞株由本室提供。本实施例中

1.细胞培养  取传代用HL₆₀、K562、Raji细胞株分别转入RPMI1640100ml培养瓶中，RPMI1640，加5％灭活小牛血清，青霉素100U/ml，1％(v/v)谷酰胺。5％CO₂培养箱，37℃，培养72小时。

2.收集细胞  细胞混悬液转入10ml离心管，LXJ-II离心1800rpm，弃上清，1×PBS洗二遍，1×10⁷细胞转入2ml离心管。

3.消化  把含有10⁷个细胞体积的混悬液转入2ml小管离心沉淀，去净上清。

4.基因组DNA提取  加入1ml内含200～400μg/ml的蛋白酶K的DNA抽提液，使其终浓度达300μg/ml，充分搅动混匀，呈粘稠状，置37℃温箱过夜。加1ml酚/氯仿/异戊醇混合液于DNA抽提液中，用力震振荡并颠倒混匀至乳白色，放置3分钟后，室温下离心10000rpm，在TGL-16G离心机中离心20分钟，吸取上清，转入新管重复抽提1次；取上清约0.6ml，加醋酸钠0.6ml，2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，轻轻颠倒，可见白色絮状DNA。然后室温离心10000rpm 10分钟，弃上清，沉淀用70％乙醇洗二次，离心去尽上清和管壁液体，室温干燥，加超净水约500μl溶解DNA，并检测DNA的浓度和质量。

5.基因组DNA质检和浓度测定  取DNA溶液50μl，加水稀释10倍。用7521-紫外分光光度计测定OD260的值，并计算OD260/OD280之比值，若比值在1.70-1.90之间，则样品较纯，(＜1.7则污染有蛋白质，需重复抽提过程)。样品DNA含量＝OD260×稀释倍数×50μg/ml(lOD260相当于50μg/ml双链DNA)。

6.基因组亚硫酸氢盐修饰  取含有2μg的DNA溶液样本，加1mol/L氢氧化钠，使其终浓度达0.15mol/L，DNA在浓碱液中变性，变性温度为37℃，变性时间5分钟。然后加0.5μg的纯化硅精，再加入新鲜配制的10mol/L分析纯氢醌10μl和2mol/L亚硫酸氢钠400μl，充分混匀后，加矿物油覆盖液面，放入调至50℃温箱，孵育12小时。

7.修饰后模板DNA纯化  吸弃矿物油，底物体积约0.5ml，加1.5mg/lDEAE52树脂，颠倒数次混匀，推筒连接滤过头，把树脂混合物转入推筒，轻柔地插入推动推头，使混合物通过过滤头，DNA被吸附在树脂上，滞溜于过滤头，同法用异丙醇洗涤过滤头，并把过滤头接到1.5ml离心机管口，离心10000rpm，室温3分钟，干燥树脂，然后把过滤头接到新的离心管。加50μl预热至55℃超纯水，室温下放置1分钟，离心10000rpm，30秒离心洗脱DNA后，加1mol/L氢氧化钠，使其终浓度达0.2mol/L室温下5分钟后终止还原反应。加2倍体积-20℃预冷无水乙醇并在-20℃下过夜，沉淀DNA，0℃下12000rpm，离心13分钟，弃上清，1ml 70％乙醇洗涤2次去盐，每次于4℃ 12000rpm，离心5-10分钟，去净管壁液体，自然干燥，加20μl超净水溶解，-20℃保存。

8.甲基化特异性PCR反应体系  终体积50μl的PCR反应体系含1×MSPbuffer，1.5mmol/L的四种核苷酸dTTP、dATP、dCTP、dGTP共5μl，7mmol/L MgCl₂，300ng primer(单个)，修饰后模板DNA(MoDNA)1μg，Taq酶2μ，具体配制如下：

                         P₁₅M          P₁₅U

10×buffer(甲基化PCR)    5μl            5μl

dNTP                     5μl            5μl

MgCl₂                   10μl           10μl

P₁₅M1，P₁₅M₂          2μl(单个)

P₁₅U1，P₁₅U₂                          2μl(单个)

MoDNA                    10μl           10μl

Taq酶                    2u              2u

甲基化特异性PCR反应条件：

加H₂O至50μl，混匀后30μl消毒石腊油覆盖，轻微离心收集，并按下列条件做三次：

第一次：首先93℃变性10min，再按93℃ 45S→55℃ 45S→70℃ 45S做30个循环，然后70℃延伸10min，

第二次：94℃变性8min，再按94℃ 40S→55℃ 40S→71℃ 40S做28个循环，然后71℃延伸10min，

第三次：95℃变性5min，再按95℃ 35S→55℃ 35S→72℃ 35S做25个循环，然后72℃延伸5min，产物4℃下保存。

甲基化特异性PCR反应中放入Raji和HL₆₀细胞株，分别做阳性和阴性对照。同时，设不加模板MoDNA作空白对照。

9.甲基化特异性PCR特异度和灵敏度测定

以野生型DNA，MoDNA两种类型模板测定Raji，HL₆₀，K562的P₁₅M和P₁₅U PCR扩增，了解其特异性。将Raji和HL60按1∶10，1∶10²，1∶10³，1∶10⁴，1∶10⁵，1∶10⁶混合后进行P₁₅甲基化特异性PCR，测定其灵敏度。

10.检测样本结果

可选以下二种方法中的一种：

①产物加1.8％的琼脂糖加溴乙锭，在1.5～2.Sv/cm下电泳45～60分钟，在紫外检测仪下观察结果，并照像；在凝胶电泳分析系统上分析结果，

②将产物用荧光试剂标记，做等电聚焦定量PCR检测。

应用实施例2～10：

不成熟B系细胞株Raji为P₁₅基因甲基化阳性的细胞株，均为中山医肿瘤医院研究所赠；HL60为P₁₅基因非甲基化阳性的髓系细胞株；K562为P₁₅基因纯合缺失的红-巨核系细胞株由本室提供。除以下部分不一样之外，与应用实施例1相同。

(一)基因组亚硫酸氢盐修饰

应用实施例序号         1     2     3     4    5    6    7    8    9     10

加氢氧化钠终浓度(mol/L)0.15  0.15  0.2   0.2  0.3  0.3  0.4  0.4  0.25  0.25

37℃下变性时间(分钟)   5     6     7     8    9    10   5    8    10    15

硅精加入量μg          0.51  0.6   07    0.8  0.9  1.0  1.2  1.4  1.6   2.0

氢醌加入量μl          10    12    15    20   25   30   35   20   25    30

亚硫酸氢钠加入量μl    400   420   440   460  490  520  550  580  500   480

修饰温度℃             50    51    52    53   54   55   56   57   58    60

孵育时间小时           12    13    14    15   15   16   16   17   17    18

(二)修饰后模板DNA纯化

DEAE52树脂(mg)         0.5   0.6   0.7   0.8   0.9  1.0  1.2  1.3  1.4  1.5

加纯水的温度(℃)       55    58    62    65    68   70   72   75   60   65

加氢氧化钠终浓度mmol/L 0.2   0.2   0.25  0.25  0.3  0.3  0.35 035  0.4  0.4

(三)甲基化特异性PCR反应体系

dNTP(μl)              5     5.5   5.75  6.0   6.25 6.5  6.75 7.0  7.5  8.0

MgCl(μl)              10    11    12    13    14   15   16   17   18   19

P₁₅U₁，P₁₅U₂(μl) 10    11    12    13    14   15   16   17   18   19

P₁₅M₁，P₁₅M₂(μl) 10    11    12    13    14   15   16   17   18   19

MoDNA(μl)             8     8     9     9     10   10   11   11   12   12

Taq酶(ul)              1.0   1.5   2.0   2.0   2.5  2.5  3.0  3.0  3.5  4.0

(四)甲基化特异性PCR反应条件：

加H₂O至50μl，混匀加30μl石腊油，离心收集，并按下列条件做三次：

应用实施例2和7：

第一次：首先93℃变性10min，再按93℃ 45S→58℃ 45S→70℃ 45S做30个循环，然后70℃延伸10min；

第二次：94℃变性8min，再按94℃ 40S→58℃ 40S→71℃ 40S做28个循环，然后71℃延伸8min；

第三次：95℃变性5min，再按95℃ 35S→58℃ 35S→72℃ 35S做25个循环，然后72℃延伸5min，产物4℃下保存。

应用实施例3和8：

第一次：首先93℃变性10min，再按93℃ 45S→60℃ 45S→70℃ 45S做30个循环，然后70℃延伸10min；

第二次：94℃变性8min，再按94℃ 40S→60℃ 40S→71℃ 40S做28个循环，然后71℃延伸10min；

第三次：95℃变性5min，再按95℃ 35S→60℃ 35S→72℃ 35S做25个循环，然后72℃延伸5min，产物4℃下保存。

应用实施例4和9：

第一次：首先93℃变性10min，再按93℃ 45S→62℃ 45S→70℃ 45S做30个循环，然后70℃延伸10min；

第二次：94℃变性8min，再按94℃ 40S→62℃ 40S→71℃ 40S做28个循环，然后71℃延伸10min；

第三次：95℃变性5min，再按95℃ 35S→60℃ 35S→72℃ 35S做25个循环，然后72℃延伸5min，产物4℃下保存。

应用实施例5和10：

第一次：首先93℃变性10min，再按93℃ 45S→65℃ 45S→70℃ 45S做30个循环，然后70℃延伸10min；

第二次：94℃变性8min，再按94℃ 40S→65℃ 40S→71℃ 40S做30个循环，然后71℃延伸8min；

第三次：95℃变性5min，再按95℃ 35S→65℃ 35S→72℃ 35S做30个循环，然后72℃延伸5min，产物4℃下保存。

实施例6的MSP反应条件同实施例1。

Claims (4)

1、CpG岛甲基化检测试剂盒，其特征在于它包含有下列药物：

(1)引物

利用人类基因组的基因序列，根据碱基错配原理，引物选自P16INK4A，胰癌基因CPG，蛋白激酶相关蛋白基因CpG，乳腺基因2CpG，急性白血病相关基因，基因调节因子3基因，基因调节因子27基因，GTP激酶相关蛋白27基因，GTP激酶相关蛋白基因27B，GTP激酶相关蛋白基因2L引物中的任何一种；所述引物是下列引物中的一种：

胰癌基因CpG引物

    AGTGGAGGACAAGTCAGGGG

    GGGCTTCGAGAGGACAGAG

蛋白激酶相关蛋白基因CpG引物

    TCTATGCCACTGTTGGGGTTA

    AGGGAGCTCCAAAATCTCCT

乳腺癌基因2CpG引物

    TCCGTCAGAIACTGACGGTTG

    GCAGAGACAAAAGGGCAAGAAG

急性白血病相关基因引物

    TCACMACACTTGCCCTCTCT

    AGGAAGACAGTGACGAAGACC

基因调节因子3基因引物

    CTCTGACCTCCACTCACTCAT

    AGCCTGTGCTCCTCCTGTGAG

基因调节因子27基因引物

    ATAGCCCTGGACATCACTGCC

    GAGAGAGTGTGTTTCTCACTG

GTP激酶相关蛋白27基因引物

    GTCTTCTTTGCAAGGATTTCTGC

    ATACCTCCTACGCTGCTGATT

GTP激酶相关蛋白基因27B引物

    TTTGAAAGGGTCAGTCCTCCT

    CATCCAAAGAIACAGCATCTAA

GTP激酶相关蛋白基因2L引物

    AAAACAGCGTAGAGCCTGAGAAG

    AAAGAIAAACATCCAAGCTCTTCC

P16基因引物

    M1    GAGTACTTGGGGTGTGGCACT

    M2    GATAACCATTCACAGACATTC

P15引物

    M1    CGTTCGTATTTTGCGGTT

    M2    GTACAATAACCGAACGACCGA

(2)提取模板DNA的药物

①内含200～400μg/ml的蛋白酶K的DNA提取液，

②饱和酚氯仿异戊醇体系，它们的体积比为20～25∶20～25.1，

③醋酸钠，

④淋巴细胞分层液；

(3)基因组修饰用药物：

①硅精，

②氢醌，

③亚硫酸氢钠，

④矿物油；

(4)基因组修饰后的DNA纯化用药物

①DNA纯化用DEAE树脂，

②异丙醇；

(5)特异性MSP-PCR反应体系

①甲基化PCR缓冲液，10×buffer，

②四种核苷酸即dNTP，

③MgCl₂，

④耐高温聚合酶即Taq酶；

(6)阳性和阴性对照标本

①DNA纯化用DEAE树脂，

②阴性标本非甲基化HL₆₀细胞。

2、权利要求1所述CpG岛甲基化检测试剂盒的应用，包括常规标本的收集；基因组DNA提取、修饰和纯化，其特征在于：

(1)基因组修饰中：

①纯化硅精DNA用量为0.51～2μg/份，

②氢醌的新鲜配制：将10～13mg的氢醌定容在10ml超净水中，

③亚硫酸氢钠的新鲜配制：将2.9～3.2g的亚硫酸氢钠定容在10ml超净水中，

④修饰的温度为50～60℃，

⑤孵育时间为12～18小时；

(2)修饰后模板DNA纯化中：

i.DEAE树脂加入量为0.5～1.5mg，

ii.用异丙醇洗涤并过滤后离心，

iii.干燥树脂，

iv.加入50～60μl的预热至55～75℃超净水中，并离心，

v.加入1mol/L的氢氧化钠，使其终浓度达0.2～0.4mmol/L、置室温保存，

vi.加无水乙醇并在-20℃下过夜，

vii.0℃离心，

viii.70％乙醇洗涤后干燥，

ix.超净水溶解后，-20℃保存；

(3)特异性PCR即MSP反应体系配制如下：

①反应体积50μl：

                   PM            PU

10×buffer         5μl          5μl

dNTP               5～8μl       5～8μl

MgCl₂             10～15μl     10～15μl

PM或PU          2～4μl

MoDNA           8～10μl           8～10μl

Taq酶           1～4μl            1～4μl

加H₂O至50μl，加50μl石蜡油

②反应条件：

将上述体系放入PCR机中进行如下反应：

首先93～95℃变性5～10min，然后按93～95℃ 30～45S→55～65℃ 30～45S→70～72℃ 30～45S的次序做24～34个循环，70～72℃延伸5～10min，产物4℃下保存备用；

(4)阴阳性对照

MSP反应中放Raji和HL₆₀细胞株分别做阳性和阴性对照，设不加模板DNA即MODNA作空白对照；

除上述之外的其他应用过程均为常规技术，所用药物均为分析纯。

3、根据权利要求2所述的CpG岛甲基化检测试剂盒的应用，其特征在于特异性PCR即MSP反应条件为：

按94℃ 35S→58℃ 35S→71℃ 35S做25个循环。

4、根据权利要求3所述的CpG岛甲基化检测试剂盒的应用，其特征在于应用过程中所用离心均选9000～12000rpm。