SK283314B6 - Imortalizovaná ľudská keratinocytová bunková línia a/alebo imortalizovaná melanocytová bunková línia, spôsob imortalizácie ľudských kožných buniek a bezsérové kultivačné prostredie na ich izoláciu a prípravu - Google Patents

Abstract

Je uvedený modifikovaný spôsob na imortalizáciu ľudských kožných buniek, najmä keratinocytov a melanocytov, a ľudskej keratinocytovej alebo melanocytovej bunkovej línie získateľnej týmto spôsobom. Je opísané tiež nové bezsérové médium na izoláciu, prípravu a udržiavanie imortalizovaných keratinocytových a melanocytových bunkových línií a modifikovaný test, ktorý využíva imortalizované keratinocyty a/alebo melanocyty a rovnako modifikovaný spôsob transplantácie kože, ktorý zahŕňa použitie primárnych keratinocytov alebo melanocytov pripravených uvedeným spôsobom, ako štepov kožného tkaniva.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka modifikovaného spôsobu na imortalizáciu ľudských kožných buniek, najmä keratinocytov a melanocytov, a ľudskej keratínocytovej alebo melanocytovej bunkovej línie získateľnej týmto spôsobom, ktorá si zachováva schopnosť exprimovať diferenciačné proteíny aj po početných pasážach. Vynález sa týka tiež nového bezsérového média na izoláciu, prípravu a udržiavanie imortalizovaných kcratinocytových a melanocytových bunkových línií, ktoré nevyžaduje použitie vyživujúcich buniek. Vynález sa ďalej týka aj modifikovaného testu, ktorý využíva imortalizované keratinocyty a/alebo melanocyty, a modifikovaného spôsobu transplantácie kože, ktorý zahŕňa použitie primárnych keratinocytov alebo melanocytov pripravených spôsobom podľa vynálezu, ako štepov kožného tkaniva.

Doterajší stav techniky

Príprava imortalizovaných bunkových línií odvodených z tkanív kože človeka bola už opísaná. Spôsoby ich prípravy vo všeobecnosti zahŕňajú transfekciu alebo transformáciu buniek kože človeka, napríklad keratinocytov a melanocytov, kultivovaných in vitro s činidlami, ktoré poskytujú imortalitu.

Imortalizácia označuje prípravu buniek, ktoré sú schopné kultivácie po dlhý čas in vitro, v ideálnom prípade nekonečne dlho. Tieto bunky sa tiež označujú ako kontinuálne bunkové línie. Nie nesmrteľné bunky, na rozdiel od imortalizovaných buniek, sú schopné rastu in vitro iba v konečnom počte bunkových delení. Imortalizované bunky sú veľmi potrebné, pretože poskytujú stály, potenciálne nekonečný zdroj buniek, ktoré majú určité vlastnosti. Bežné prostriedky na prípravu imortalizovaných bunkových línií a imortalizovaných línií buniek ľudskej kože zahŕňajú najmä napr. vírusy, rekombinantné vírusy a plazmidy, ktoré obsahujú sekvencie DNA, zaisťujúce imortalizáciu.

Pravdepodobne najviac používaný spôsob prípravy imortalizovaných ľudských bunkových línii využíva ako činidlá poskytujúce imortabilitu DNA sekvencie SV 40 antigénu, konkrétnejšie SV40 veľkého T antigénu. Napríklad Steinberg a ďalší, J. Celí. Phys. 123. 117 až 125 (1985); Reddel a ďalší, patent USA 4 885 238 zverejnený 5. decembra 1989; Major, patent USA 4 707 448, zverejnený 17. novembra 1987; Stoner a ďalší, Cancer. Res. 51, 365 až 371 (1991); Chopra a ďalší, In Vitro Celí. Dev. Biol. 30A, 539 až 546 (1994), ); Chopra a ďalší, In Vitro Celí. Dev. Biol. 27A, 763 až 765 (1991); Christian a ďalší, Cancer Res. 47, 6066 až 6073 (1987); Rhim a ďalší, Science 227, 1250 až 1252 (1985); a Grubman a ďalší, Gastrointest. Liver Physiol., 29, G1 OôOažGl 070(1994) objasňujú použitie SV40 vektorov a vektorov obsahujúcich SV40 veľkú T antigénovú sekvenciu na prípravu imortalizovaných ľudských bunkových línii. Vloženie uvedených sekvencií je všeobecne spôsobené infekciou vírusom SV40 alebo hybridným vírusom adenovírus-12 SV40, alebo transfekciou buniek s rekombinantným plazmidom, obsahujúcim dlhú koncovú repetíciu vírusu Rousovho sarkómu a skorú oblasť Ori-SV40, koprecipitáciou s fosforečnanom strontnatým. (Pozri: Brash a ďalší, Mol. Celí. Biol. 7, 2 031 - 2 034 (1987)).

Iný známy spôsob prípravy imortalizovaných bunkových línií a najmä imortalizovaných ľudských keratinocytov zahŕňa transfekciu alebo infekciu buniek s DNA sekvenciou vírusu ľudského papilómu. Napríklad patent USA

376 542 Schlegela, zverejnený 27. decembra 1994, opisuje imortalizáciu ľudských epitelových buniek s izolovaným génmi HPV-16, 18, 31, 33 alebo 35 E6 a E7 alebo samotným génom E7 na prípravu nenádorovotvomej imortalizovanej bunkovej línie. Tiež Barbosa a ďalší, Oncogene 4, 1529 až 1532 (1989) a Míinger a ďalší, J. Virol. 63(10). 4417 až 4421 (1989) uvádzajú použitie génov HPV-16 a HPV-18 E6 a E7 na prípravu imortalizovaných ľudských keratinocytov.

Zatiaľ čo početné skupiny referujú o imortalizovaných bunkových líniách keratinocytov a o ich použití in vitro, doteraz imortalizované bunkové línie keratinocytov a bunkové línie melanocytov majú pri použití typicky jednu alebo viac vlastností, ktoré spôsobujú ich nevýhodnosť. Napríklad, doteraz uvádzané imortalizované keratinocyty majú jednu alebo viac z ďalej uvedených vlastností: a) majú zníženú alebo strácajú schopnosť exprimovať diferenciačné markery, napríklad proteíny, ktoré sú exprimované normálnymi diferencovanými keratinocytmi a b) zmenené rastové vlastnosti v tkanivovej kultúre.

Jetten a ďalší, J. Invest. Dermat. 92, 203 až 209 (1989) napríklad opisuje SV40 imortalizované keratinocyty, získané po vysokom počte pasáží (>12 pasáží) s použitím vektora NHEK - SV 40 -T 8 -1, ktoré nie sú schopné diferenciácie. Podobne Bernard a ďalší, Cancer. Res. 45, 1707 až 1716 (1985) opisuje izoláciu imortalizovaných bunkových línií keratinocytov označovaných ako SVK14, ktoré opisuje ako takmer celkom neschopné diferenciácie. Táto bunková línia nevykazuje tiež nijakú expresiu keratínov K.l/10 ( >53 kD ) a 50 kD keratínu (keratín K14), ktoré sú normálne exprimované diferencovanými keratinocytmi.

Ďalej, Steinberg a ďalší, J. Celí. Physiol. 123, 117 až 125 (1985) opisuje keratinocyty, transformované s SV 40, ktoré postupne strácajú schopnosť exprimovať keratíny, príznačné svojou normálnou stavbou keratínových buniek. Hronis a ďalší, Cancer Res. 44, 5797 až 5804 (1984) tiež uvádza keratinocyty, imortalizované s SV 40 DNA, ktoré stratili schopnosť produkovať keratíny K5, K6, K14/15, K16 a K17 a involukrín, ktoré sú charakteristické pre normálnu diferenciáciu keratinocytov. Ešte ďalší, Morris a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82. 8 498 až 8 502 (1985) opisuje keratinocyty, imortalizované s SV 40, ktoré pri vyššom počte pasáží (>14 pasáží) vykazujú značne zníženú expresiu keratínov II. typu aj I. typu; uvedené keratinocyty napríklad nevykazujú takmer žiadnu expresiu K13 (Id).

Banks-Schlegel a ďalší, v J. Celí. Biol. 96, 330 až 337 (1983) tiež opísali SV40 imortalizované keratinocyty, ktoré v tkanivovej kultúre vykazujú zmenené rastové vlastnosti. Na rozdiel od normálnych keratinocytov, tieto imortalizované bunky vyžadujú na svoj rast 3T3 vyživujúcu vrstvu.

Doteraz opísané spôsoby prípravy imortalizovaných ľudských keratinocytov a melanocytov typicky používali techniku vyživujúcich buniek (v ktorej ako vyživujúce bunky zvyčajne slúžia fibroblasty) a všeobecne kultiváciu buniek v médiu, obsahujúcom sérum. Napríklad Sexton a ďalší, „Stable transfection of human keratinocytes: HPV immortalization”, Kcratonocyte Methods, editori Leigh 1. M. a ďalší, University Press, 179 až 180 (1994); Garlick, „Retroviral Vectors”, Keranocyte Methods (editori Leigh I. M., a ďalší, Cambridge University Press 181 až 183 (1994)) uvádzajú pri izolácii a príprave imortalizovaných keratinocytov použitie kultivačného média, obsahujúceho fetálne teľacie sérum a vyživujúce bunky.

Použitie bezsérového média na izoláciu a prípravu imortalizovaných epitelových buniek, najmä ľudských keratinocytov už bolo opísané. Barbosa a ďalší, Oncogene 4,

1529 až 1532 (1989) napríklad opisuje prvotnú kultiváciu ľudských keratinocytov, transfektovaných elektroporáciou alebo lipofekciou v médiu s nízkym obsahom vápnika a bez séra až do konfluencie.

Napriek doteraz publikovaným výsledkom prác v tejto oblasti, stále však existuje významná požiadavka na imortalizované ľudské keratinocyty a melanocyty, ktoré by mali lepšie vlastnosti, najmä aby si udržiavali svoj diferenciačný potenciál normálnych keratinocytov a melanocytov, a ktoré by exprimovali diferenciačné proteíny, charakteristické pre diferencované melanocyty a keratinocyty aj po veľmi početných pasážach. Uvedené bunky by boli veľmi užitočné v mnohých rôznych použitiach, najmä v prácach, ktoré vyžadujú diferencované bunky kože. V tejto oblasti ďalej stále existuje požiadavka na zdokonalené kultivačné médiá, schopné udržiavať primáme a imortalizované keratinocyty a melanocyty, ako aj požiadavka na zlepšené spôsoby kultivácie, ktoré nevyžadujú použitie vyživujúcich buniek.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je spôsob produkcie zlepšených kontinuálnych (imortalizovaných) bunkových línií, odvodených z normálneho tkaniva kože človeka, najmä línií imortalizovaných keratinocytových a/alebo melanocytových buniek, odvodených z normálneho ľudského kožného tkaniva, ktoré zachovávajú schopnosť diferencovať a exprimovať diferenciačné proteíny aj pri vysokom počte pasáží. Bližšie, podstatou vynálezu je získať imortalizované keratinocyty, ktoré si zachovávajú schopnosť exprimovať keratíny, cytochrómy, ako aj ďalšie diferenciačné proteíny, napríklad involukrín, fílagrín a lorikrín, ktoré doteraz bežne imortalizované keratinocytové bunkové línie exprimujú buď málo, alebo vôbec neexprimujú. Ďalším hľadiskom tohto vynálezu je získať imortalizované keratinocyty a melanocyty, ktoré exprimujú enzýmy, ktoré sú normálne exprimované diferencovanými keratinocytmi a melanocytmi, najmä enzýmy II. fázy, ako sú glutation-S-transferázy, ako aj enzýmy a/alebo proteíny, ktoré sú v spojení s bunkovou oxidáciou a zápalovými reakciami.

Z iného hľadiska tento vynález poskytuje nové bezsérové médium na kultiváciu, produkciu a udržiavanie normálnych alebo imortalizovaných keratinocytov a/alebo melanocytov v tkanivových kultúrach. Toto nové bezsérové médium je užitočné tiež pri izolácii, množení a imortalizácii buniek ľudskej kože, na získavanie imortalizovaných melanocytov a keratinocytov podľa tohto vynálezu. Vynález teda poskytuje úplne definované kultivačné médium (bez neznámych alebo nedostatočne definovaných zložiek) na kultiváciu keratinocytov bez vyživujúcich buniek; nové médium obsahuje epinefrín, ktorý sa neočakávane ukázal ako silný rastový potenciátor normálnych keratinocytov v bezsérovom médiu.

Z iného hľadiska tento vynález poskytuje nový spôsob izolácie, kultivácie a imortalizácie buniek ľudskej kože na získanie línií imortalizovaných melanocytových a keratinocytových buniek, odvodených z normálneho kožného tkaniva, pričom uvedený spôsob používa bezsérové médiá, najmä médiá podľa tohto vynálezu a prídavný koktail, obsahujúci fibronektín, BSA akolagén I. typu, bez „vyživujúcich” buniek (napríklad fibroblastov).

Tento vynález z ďalšieho hľadiska poskytuje primárne keratinocyty alebo melanocyty, pripravené v podmienkach bez použitia séra a bez použitia akýchkoľvek vyživujúcich buniek, pričom uvedené primáme keratinocyty a melano cyty sa použijú na kožné štepy a v ex vivo genetickej terapii.

Z ešte ďalšieho hľadiska tento vynález poskytuje spôsob použitia uvedených nových a zlepšených imortalizovaných keratinocytových a melanocytových bunkových línií, napríklad ich použitie na imunologické, farmakologické, foto- a chemotoxikologické reakčné kožné testy a na expresiu heterológnych génov.

Tento vynález poskytuje kontinuálne (imortalizované) bunkové línie, odvodené z normálnych tkanív kože človeka, napríklad imortalizované keratinocyty a melanocyty, ktoré si zachovávajú schopnosť diferenciácie a schopnosť exprimovať diferenciačné proteíny, ktoré sú exprimované normálnymi keratinocytmi alebo melanocytmi aj pri vysokých počtoch pasáží. Vysokým počtom pasáží sa rozumie najmenej 10 pasáží, výhodne najmenej 20 až 30 pasáží, výhodnejšie najmenej 50 pasáží, a ideálne nekonečný počet pasáží. Imortalizované keratinocyty, pripravené podľa tohto vynálezu, napríklad exprimujú po značnom počte pasáží v tkaninovej kultúre diferenciačné proteíny keratín Kl/10, keratín K.14, involukrín, fílagrín a lorikrín. To je rozdiel oproti doteraz opísaným imortalizovaným keratinocytom, ktoré neexprimujú tieto diferenciačné proteíny, alebo ktoré exprimujú tieto diferenciačné proteíny iba v obmedzenej miere.

Tento vynález teda poskytuje primáme keratinocyty a melanocyty, pripravené v podmienkach bez použití séra a bez vyživujúcich buniek, ktoré si zachovávajú schopnosť diferencovať a exprimovať proteíny, charakteristické pre diferencované melanocyty a keratinocyty.

Predmetné imortalizované keratinocyty majú cytochrómny profil p450 (CYP450), ktorý je obdobný, ak nie rovnaký, ako profil normálnych keratinocytov. Predmetné bunky napríklad exprimujú CYP450 3A5 a nie CYP450 3A4. Predmetné imortalizované keratinocyty teda exprimujú enzýmy fázy II, napríklad glutation-S-tranferázu (GST), bližšie glutation-S-transferázy GSTa, GSTp a GSTrr, porovnateľne ako normálne neimortalizované keratinocyty.

Predmetné imortalizované keratinocyty ďalej exprimujú proteíny a enzýmy, súvisiace s bunkovou oxidáciou a zápalovými reakciami, napríklad superoxidovú dismutázu (SOD), kolagenázu I. typu a nekrotický faktor alfa (TNFa) po pôsobení forbolových esterov obdobne alebo rovnako, ako normálne diferencované keratinocyty. Uvedenými vlastnosťami poskytujú tieto bunkové línie vysoko stály a opakovateľný zdroj buniek na imunologické, farmakologické, zápalové, foto- a chemotoxikologické štúdie reakcií kože.

Predmetné imortalizované melanocyty ďalej exprimujú melanínové endogénne asociované proteíny (pozri ďalej uvedené príklady 14 a 15).

Ak sa uvedené imortalizované bunkové línie keratinocytov a melanocytov kultivujú v organotypovej kultúre, vytvárajú tiež vysoko stratifikovaný a polarizovaný epitel, ktorý má zrohovatenú povrchovú vrstvu (stratum comeum). Toto bolo doteraz možné dosiahnuť iba za bežných kultivačných podmienok, to znamená v médiách obsahujúcich sérum, technikou vyživujúcich buniek (pozri napríklad Lechner a ďalší, Virology 185. 536 až 571 (1991)).

Uvedené imortalizované keratinocyty a melanocyty sa ďalej môžu získať z normálnej kože v podmienkach bez použitia séra a bez použitia akýchkoľvek vyživujúcich buniek. Uvedené imortalizované (večné) keratinocyty a melanocyty možno vo všeobecnosti získať nasledujúcimi krokmi:

i) odobratím vzorky kožného tkaniva človeka;

ii) prípravou uvedenej vzorky kože na kultiváciu in vitro;

iii) odobratím keratinocytov a/alebo melanocytov z uvedenej pripravenej vzorky kože a očkovaním uvedených keratinocytov a/alebo melanocytov do rastového média bez séra, výhodne buď do média NR - 3 alebo do média NR - 4 (pre melanocyty) (sú opísané v ďalšom texte) na kultivačných platniach s poťahom, ktorý uľahčuje prichytávanie buniek a ich rast; uvedený poťah obsahuje fibronektín, kolagén typu I a BSA;

i v) výmenou média, ak je nevyhnutné optimalizovať konfluentný rast kultivovaných buniek, za súčasného stáleho udržiavania poťahu na kultivačných platniach;

v) prenosom keratinocytov alebo melanocytov do selekčného média, výhodne do bezsérového média, na kultivačné platne, obdobne vopred vybavené poťahom;

vi) infektovaním keratinocytov alebo melanocytov retrovírusovým konštruktom, výhodne s SV 40 alebo konštruktom založenom na víruse papilómu 16, ako je SV 40 plazmid pLXSHD+SV40(#328), ktorý obsahuje T antigén (T- Ag) vírusu Simian 40, alebo plazmid pLXSHD+E6/E7, ktorý obsahuje gény E6/E7 vírusu papilómu 16 (HPV 16) (opísané v ďalšom texte);

vii) prenosom výsledných imortalizovaných keratinocytov alebo melanocytov do proliferačného média, vhodného na proliferáciu imortalizovaných keratinocytov alebo melanocytov na kultivačné platne, obdobne vopred vybavené poťahom, výhodne do média NR-2 alebo do média NR-3 (opísané v ďalšom texte) a do melanocytového média M2 (zdroj M. Olsson, Inst. of Dermatology, Uppsala, Švédsko); a viii) prenosom výsledných proliferovaných keratinocytov do diferenciačného média, výhodne do média NR-2 (opísané v ďalšom texte) alebo do upraveného média MCDB 153 (opísané v ďalšom texte), ktoré obsahuje vysokú hladinu vápnika, výhodne 1,5 mM, na kultivačné disky, vopred obdobne vybavené poťahom (Boyce a ďalší, J. Tissue Cult. Meth. 9, 83 až 93 (1985); Pittlekow a ďalší, J. Invest. Dermatol. 86, 410 až 417 (1986)).

Krok i) bude konkrétnejšie zahŕňať odber ľudského kožného tkaniva od darcov, napríklad vzorky odobraté v priebehu chirurgických alebo pediatrických zákrokov. Imortalizácia jednej vzorky kožnej bunky, to znamená autológnej vzorky kožnej bunky, umožňuje prípravu imortalizovných bunkových línií keratinocytov a melanocytov, ktoré majú určité vlastnosti, napríklad určitý receptorový profil, ktorý'je charakteristický pre konkrétneho darcu.

Odobratá vzorka kože sa potom v kroku ii) pripraví tak, aby bola vhodná na kultiváciu in vitro. Toto sa výhodne vykoná úvodným opláchnutím vzorky kože, napríklad použitím rovnakého média, ako sa použije na kultiváciu. Výhodne sa to vykoná v médiu NR-2 , v médiu bez séra, ktorého presné zloženie sa uvádza v ďalšom texte; zistilo sa, že uvedené médium je na kultiváciu normálnych keratinocytov a melanocytov výhodné. Je výhodné, ak sa kožná vzorka po premytí oholí, napríklad dermatómom, a potom sa exciduje na malé kúsky.

Výsledné rezy kože sa potom výhodne rozdelia na zamšu (dermís) a pokožku (epidermis). Rozdelenie sa môže vykonať fyzikálne a/alebo enzymaticky. Môže sa vykonať napríklad trypsináciou, napríklad vnorením rezov kože do roztoku trypsínu (napríklad do asi 0,5 %-ného roztoku trypsínu), obsahujúceho EDTA (napríklad asi 0,1 %), na dostatočne dlhý čas, aby sa dosiahlo oddelenie buniek, napríklad asi na 30 až 60 minút pri 37 °C, alebo cez noc pri 4 °C.

Po oddelení zamše (na izoláciu fibroblastov, pozri príklad 2) sa pokožka (epidermis) vloží do suspenzného média. Suspenzné médium výhodne obsahuje roztok sójového trypsínového inhibítora (SBTI) a bude v styku s bunkami dostatočne dlhý čas, typicky asi 5 minút, aby sa inaktivoval trypsín a dosiahlo sa uvoľnenie buniek. Aby sa získali požadované bunky, to znamená keratinocyty a/alebo melanocyty, pridá sa tkaninové kultivačné médium, výhodne bezsérové médium NR-2 (opísané v ďalšom texte) a vloží sa filter (napríklad lOOmm filter).

V kroku ii) získaná výsledná primárna keratinocytová/melanocytová kultúra sa potom očkovala do bezsérového média, výhodne do média NR-3 (podrobne opísaného v ďalšom texte), vo vhodnej koncentrácii buniek, výhodne približne 1,2 . 10⁴ buniek na 1 cm², na kultivačné platne, vopred vybavené poťahom. Vhodná koncentrácia buniek však môže byť rôzna v širokom intervale hodnôt. Kultivačné platne sú výhodne súvislo pokryté zloženie, ktorý má zloženie, pri ktorom sa neočakávane zistilo, že zlepšuje aj prichytávanie aj rast keratinocytov a melanocytov; poťah je konkrétne tvorený roztokom fibronektínu, BSA a kolagénu

I. typu. Uvedené zloženie poťahu bolo už opísané v súvislosti s použitím pri práci s bronchiálnymi bunkami (Lechner a ďalší, J. Tissuc Cult. Meth. 9, 43 - 48 (1985)); tento odkaz sa zahŕňa do vynálezu týmto odkazom.

V kroku iv) sa kultivačné médium vymieňa tak často, ako je nevyhnutné na optimalizáciu rastu buniek. Médium sa výhodne vymení približne každý druhý deň. Interval výmeny však môže byť veľmi závislý od určitej vzorky kože. Po dosiahnutí takmer úplnej konfluencie, napríklad 90 %-nej konfluencie, čo typicky nastáva po asi 10 až 14 dňoch, sa keratinocyty a melanocyty potom oddelia. Oddelenie sa môže vykonať ktorýmkoľvek spôsobom, umožňujúcim vhodné oddelenie buniek bez škodlivého ovplyvnenia melanocytov a/alebo keratinocytov. Môže sa napríklad vykonať diferenčnou trypsináciou. Pritom sa na melanocyty alebo keratinocyty výhodne pôsobí roztokom trypsínu s EDTA a potom sa prenesú do selekčného média. V prípade keratinocytov sa bunky výhodne spracujú s roztokom trypsínu s EDTA (0,025 %-ný roztok trypsínu a 0,01 %-ný roztok EDTA) počas 5 až 10 minút a potom sa v kroku v) očkujú do média NR-3 na platniach, vopred vybavených poťahom. Treba poznamenať, že médium NR-3 podporuje rast keratinocytov na úkor melanocytov. V prípade melanocytov sa na bunky výhodne pôsobí roztokom trypsínu/EDTA (0,025 %-ný/0,01 %-ný roztok) počas 2 až 4 minút a potom sa v kroku v) očkujú do média NR-4 na kultivačné platne, obdobne pokryté poťahom. Treba poznamenať, že médium NR-4 špecificky inhibuje rast keratinocytov.

Na takto pripravené bunky sa potom pôsobí imortalizačným činidlom. Voliteľne sa bunky môžu až do začiatku imortalizácie zmraziť, napríklad v kvapalnom dusíku. Infekcia a imortalizácia sa výhodne vykoná použitím konštruktu SV 40, označeného ako pLXSHD+SV40(# 328), ktorý je znázornený na obr. 2a a ktorý opísal Stockshlaeder a ďalší (GeneBank, prístupové číslo M64 753; Stockshlaeder a ďalší, Human Gen. Therapy 2, 33 až 39 (1991)), alebo konštruktu HPV 16, označeného ako pLXSHD+E6/E7, ktorý je znázornený na obr. 2b. Uvedený konštrukt pLXSHD+SV40(#328) obsahuje medzi inými sekvenciami sekvenciu SV40 T-Ag, 5' a 3' sekvencie LTR z SV 40, sekvencie pBR322 pre replikáciu v E. coli, a viacnásobné klonové miesto, SV 40 polyadenylačnú sekvenciu. Uvedený konštrukt pLXSHD+E6/E7 miesto T-Ag obsahuje fragment Ncol/Cfol génu E6/E7 ľudského vírusu papilómu 16. Spôsob konštrukcie plazmidu E6/E7 je založený na práci

SK 283314 Β6

Diirsta a ďalší (Durst a ďalší, Oncogene 1, 251 až 256 (1987)). Po imortalizácii sa bunky nechávajú pasážovať podľa potreby kultiváciou a výsledné imortalizované bunky sa potom prenesú do proliferačného média v kroku vii). V prípade keratinocytov sa tento prenos výhodne vykoná pri druhej pasáži.

V kroku viii) sa imortalizované bunky v proliferačnom médiu pre imortalizované keratinocyty a melanocyty rozmnožia; médium neobsahuje sérum a výhodne je to médium NR-2 alebo NR-3 pre keratinocyty alebo médium M2 pre melanocyty (zloženia médiu sa uvádzajú v ďalšom texte). Imortalizované bunky sa znova kultivujú na kultivačných platniach, vopred súvisle pokrytých poťahom; poťah znova obsahuje roztok fibronektínu, BSA a kolagénu I. typu.

Po rozmnožení imortalizovaných buniek v proliferačnom médiu sa bunky v kroku viii) prenesú do média, ktoré slúži na diferenciáciu normálnych a imortalizovaných buniek. Uvedené médium bude výhodne obsahovať médium NR-2 alebo modifikované médium M2, obsahujúce vysokú hladinu vápnika, výhodne asi 1,5 mM vápnika. Kultivácia sa opäť vykoná na kultivačných platniach, ktoré boli vopred súvislo pokryté poťahom z roztoku fibronektínu, BSA a kolagénu I. typu.

Bolo už uvedené, že sa neočakávane zistilo, že imortalizované bunkové línie keratinocytov a melanocytov, pripravené spôsobom podľa tohto vynálezu, zachovávajú si svoju schopnosť diferencovať sa a exprimovať diferenciačné proteíny, ktorými sa vyznačujú normálne diferencované keratinocyty a melanocyty aj pri vysokom počte pasáží tkanivovej kultúre, to znamená najmenej po vykonaní 10 pasáží. Uvedené imortalizované keratinocyty exprimujú keratíny, ako aj ďalšie proteíny, napríklad involukrín, filagrin, lorikrín aj po vysokom počte pasáží, ktoré nie sú exprimované, alebo sú iba málo exprimované doteraz známymi keratinocytmi, imortalizovanými s SV 40.

Konkrétnejšie, niekoľko imortalizovaných bunkových línií keratinocytov, pripravených podľa tohto vynálezu, línie DK2-NR, DK3-NR a FK2-NR (pozri tabuľku 7 a 8 v ďalšom texte), exprimuje proteíny keratín Kl/10, keratín K14, involukrín, filagrin a lorikrín aj pri vysokom počte pasáží (počet pasáží viac ako 30).

Imortalizované keratinocyty, pripravené podľa tohto vynálezu majú profil CYP450, ktorý je podobný, ak nie totožný s profilom normálnych ľudských keratinocytov. Napríklad, uvedené imortalizované keratinocyty exprimujú CYP450 1A1, 2C, 2E1 a 3A5, ale neexprimujú CYP450 1A2, 2A6, 2B6 a 2D6, čo je príznačné pre cytochrómový profil 450 normálnych keratinocytov. Bolo to po prvý raz, čo sa mohlo predviesť, že normálne a imortalizované ľudské keratinocyty exprimujú CYP450 3A5 a nie CYP450 3A4.

Ďalej, predmetné imortalizované bunkové línie keratinocytov exprimujú enzýmy fázy II, napríklad gíutation-S-transferázu (GST) porovnávateľne s normálnymi diferencovanými keratinocytmi. Konkrétnejšie, predmetné imortalizované bunkové línie keratinocytov exprimujú glutation-S-transferázy GSTa, GSTp a GSTn porovnateľne, ako normálne neimortalizované keratinocyty.

Predmetné imortalizované keratinocyty ďalej exprimujú ďalšie proteíny a enzýmy, súvisiace s bunkovou oxidáciou a zápalovými reakciami, porovnávateľne s normálnymi keratinocytmi. Imortalizované keratinocyty, pripravené podľa tohto vynálezu produkujú napríklad superoxidovú dismutázu (SOD); imortalizované keratinocyty, pripravené podľa tohto vynálezu v reakcii na forbolové estery exprimujú kolagenázu I. typu (mediátor zápalov) a nádorový nekrotický faktor alfa (TNFct).

Predmetné melanocyty majú schopnosť exprimovať melanínové asociované proteíny a vimentín.

Ak predmetné línie imortalizovaných buniek rastú v organotypových kultúrach, vytvárajú navyše stratifikovaný a polarizovaný epitel, ktorý má zrohovatenú povrchovú vrstvu (stratum comeum) aj po vysokých počtoch pasáží (počet pasáži vyšší ako 20). Tento jav bol doteraz opísaný iba pre imortalizované bunkové línie keratinocytov, vytvorené za bežných kultivačných podmienok, to znamená v médiu, obsahujúcom sérum a s využitím vyživovacej vrstvy.

Predmetné imortalizované bunkové línie podľa tohto vynálezu sa získajú v celkom bezsérových podmienkach a bez použitia akýchkoľvek vyživujúcich vrstiev v priebehu kultivácie.

Ako sa podrobnejšie opisuje v ďalšom texte, neočakávane sa navyše zistilo, že epinefrin, použitý do média bez obsahu séra je silným rastovým faktorom normálnych keratinocytov. Tak médium NR-3, opísané ďalej, obsahuje epinefrín, o ktorom sa zistilo, že podporuje rast normálnych keratinocytov (pozri obr. 1). To je celkom neočakávateľné, pretože epinefrin bol doteraz opisovaný ako inhibítor rastu keratinocytov (Halprin, J., Invest. Dermatol. 81, 533 až 557 (1983)), alebo že má iba mierny účinok na rast keratinocytových buniek (Koizumi a ďalší, J. Invest. Dermatol. 96, 234 až 237 (1991)).

Prekvapujúco sa tiež ďalej zistilo, že súvislé pokrytie kultivačných platní, misiek alebo diskov, používaných na kultivovanie primárnych a imortalizovaných keratinocytov a/alebo melanocytov, poťahom, konkrétne poťahom alebo „koktailom”, ktorý obsahuje fibronektín, BSA a kolagén I. typu, zlepšuje prichytávanie keratinocytov a melanocytov na kultivačnej platni alebo kultivačnej miske, ako aj podporuje rast buniek. Použitie uvedeného materiálu na poťahy na použitie s imortalizovanými keratinocytmi a/alebo melanocytmi nebolo doteraz opísané.

Ako už bolo uvedené, tento vynález ďalej konkrétne poskytuje nové bezsérové médium, označované ako médium NR-3. Uvedené médium umožňuje kultiváciu a izoláciu normálnych keratinocytov a/alebo melanocytov z ľudskej kože v bezsérových podmienkach bez použitia vyživujúcej vrstvy. Zistilo sa, že uvedené médium zlepšuje rast normálnych keratinocytov a umožňuje vytvorenie normálnych keratinocytových kultúr bez akéhokoľvek styku so sérom alebo vyživujúcimi bunkami.

Presné zloženie média je opísané v tabuľke 1. Médium obsahuje rôzne aminokyseliny, anorganické soli ako stopové prvky, vitamíny, rastové faktory a ďalšie zložky. Uvedené médium napríklad obsahuje ako rastové faktory epidermálny rastový faktor (EGF rekombinantný), inzulín, hydrokortizon, transferín (ľudský), výťažok z hovädzej hypofýzy a epinefrin. Už bolo uvedené, že epinefrin prekvapujúco podporuje rast primárnych keratinocytov v tkanivovej kultúre.

Uvedené médium obsahuje ako aminokyseliny L-alanín, L-arginín.HCl, asparagín.H₂O, kyselinu L-asparágovú, L-cysteín.HCl.H₂O, kyselinu L-glutámovú, glutamín, glycín, L-histidín.HCl.H₂O, L-izoleucín, L-leucín, L-lyzín.HCl, L-metionín, L-fcnylalanín, L-prolín, L-serín, L-treonín, L-tryptofán, L-tyrozín a L-valín.

Soli, obsiahnuté v uvedenom médiu sú metavanadičnan amónny, molybdenan amónny, chlorid vápenatý, síran meďnatý, síran železnatý, chlorid horečnatý, chlorid manganatý, síran nikelnatý, chlorid draselný, octan sodný, hydrogenuhličitan sodný, chlorid sodný, hydrogenfosforečnan disodný, sodná soľ kyseliny pyrohroznovej, seleničitan sodný, kremičitan sodný, chlorid cínatý a síran zinočnatý.

Vitamíny, obsiahnuté v médiu NR-3 sú d-biotín, d-pantotenát vápenatý, chlorid cholínu, kyanokokalbumín, kyselina listová, i-inozitol, nikotín-amid, pyridoxín a riboflavín.

Uvedené médium ďalej obsahuje adenín, etanolamín, fosfoetanolamín, sodnú soľ fenolovej červenej, dihydrochlorid putrescínu, hydrochlorid tiamínu, lipoovú kyselinu, tymidín, glukózu, HEPES a antibiotiká (fungizón, penicilín a streptomycín).

Výhodné zloženie média NR-3 sa uvádza v tabuľke 12. Predpokladá sa však, že koncentrácia jednotlivých zložiek média NR-3 sa môže v širokom rozmedzí meniť. Konkrétnejšie, predpokladá sa, že podiely jednotlivých zložiek sa môžu meniť ± 50 až ± 0,1 %, ešte výhodnejšie od ± 10 do ± 0,1 %, od hodnôt uvedených v tabuľke 12. Navyše sa ešte predpokladá, že jedna alebo viac z uvedených zložiek sa môže vynechať a iné zložky sa môžu dodať za predpokladu, že také zložky v podstate nemajú na izoláciu a vznik keratinocytových alebo melanocytových bunkových kultúr a imortalizovaných bunkových línií škodlivý vplyv. To môže zistiť odborník skúsený v danej oblasti, analýzou na základe metódy pokusov a chýb.

Ako už bolo uvedené, významnou zložkou predmetného bezsérového média NR-3 je epinefrín. Zistilo sa, že epinefrín má veľmi silný účinok na podporu rastu primárnych ľudských keratinocytov.

Príčina, že epinefrín posilňuje množenie keratinocytov nie je jasná. Uvádza sa, že ľudské keratinocyty exprimujú enzýmy epinefrínovej syntézy a tiež exprimujú beta-2-adrenoreceptory s vysokou hustotou (Schallreither a ďalší, „Production of catecholamines in the human epidermis”, Biochem. & Biophys. Res. Comm., 189, 72 - 78 (1992)). Tieto enzýmy sú súčasťou katecholamínovej biosyntetickej reakčnej cesty, bližšie vo fenyletanolamín-.V-metyltransferáze a na biopterínu závislej tyrozínovej hydroxyláze. Na rozdiel od naposledy uvedeného, uvedené enzymatická aktivity nemožno zistiť v melanocytoch a fibroblastoch. Podľa toho tieto enzymatické aktivity a/alebo receptorová expresia môžu vysvetľovať schopnosť epinefrínu modulovať proliferáciu keratinocytov.

Autori tohto vynálezu vytvorili hypotézu, že médium NR-3 podporuje izoláciu a rozvoj primárnych bunkových kultúr a bunkových línií, pretože potláča bunkovú diferenciáciu, čo vedie k obohateniu buniek, ktoré si zachovávajú schopnosť diferenciácie a exprimácie proteínov a enzýmov, exprimovaných normálnymi diferencovanými keratinocytmi amelanocytmi.

Konkrétnejšie sa usudzuje, že pri raste keratinocytov alebo melanocytov v médiu, ktoré obsahuje sérum, uprednostňuje sa diferenciácia pri prvej pasáži. Toto je však nevýhodné (v počiatočnom štádiu kultivácie), pretože diferencované bunky dobre nerastú. To má potom za následok premnoženie a selekciu množených kožných buniek s iba slabou schopnosťou diferenciácie. Ak sa sérum pridá do média pred imortalizáciou, následne sa zníži počet buniek s vysokou schopnosťou diferenciácie.

Na rozdiel od uvedeného sa podľa tohto vynálezu kultivujú keratinocyty a melanocyty v médiu bez séra a v podmienkach, ktoré zamedzujú diferenciácii melanocytov a keratinocytov. V tomto vynáleze sa výhodne použije bezsérové médium v celom priebehu kultivácie, pred aj počas imortalizácie, ako aj počas proliferácie a diferenciácie.

Ako už bolo uvedené, predmetné bezsérové kultivačné médium NR-3 inhibuje diferenciáciu keratinocytov a týmto spôsobom umožňuje lepšiu izoláciu keratinocytových primárnych bunkových kultúr a imortalizovaných bunkových línií z uvedeného média. Toto bezsérové médium má navyše nízku koncentráciu vápnika, čo selektívne inhibuje rast súčasne izolovaných fibroblastov. Výsledkom je potom vysoko selektívne rastové médium, ktoré je výhodné na produkciu kultúr, ktoré obsahujú prevažne melanocyty a keratinocyty. Podľa uvedeného je predmetné bezsérové médium NR-3 výhodné, pretože inhibuje keratinocytovú diferenciáciu a inhibuje tiež rast fibroblastov.

Suspenzia buniek, produkovaná z jednej kožnej vzorky, obsahujúca disociované melanocyty, keratinocyty a fibroblasty sa podľa uvedeného bude kultivovať výhodne v predmetnom médiu NR-3. Dosiahne sa to očkovaním bunkami na kultivačné platne, ktoré sú súvislo pokryté kompozíciou, ktorá uľahčuje prichytávanie buniek. Uvedený poťah bude výhodne obsahovať zmes fibronektínu, hovädzieho sérového albumínu a I. typu kolagénu. Tento poťah, „koktail”, sa už opísal na použitie s bronchiálnymi bunkami (Lechner a ďalší, J. Tiss. Cult. Meth., 9, 43 až 48 (1985)). Autori tohto vynálezu zistili, že na plastových kultivačných platniach tento koktail podporuje aj prichytávanie keratinocytov a melanocytov. Navyše sa neočakávateľne zistilo, že uvedený súvislý poťah kultivačných platní, ktorý' sa použil na kultiváciu primárnych aj imortalizovaných keratinocytov, zlepšuje rast buniek. Použitie súvislého poťahu kultivačných platní pri práci s imortalizovanými keratinocytmi alebo melanocytmi nebolo doteraz zverejnené.

Počas kultivácie sa primáme bunkové kultúry rozdelia, keď dosiahnu alebo v podstate dosiahnu konfluenciu a potom sa rozmnožia na ďalšie pokryté kultivačné platne. V bunkových kultúrach nastáva delenie typicky približne každých 10 až 14 dní.

Po kultivácii primárnych melanocytov a/alebo keratinocytov v bezsérovom médiu NR-3 použitím kultivačných platní s poťahom, keď sa dosiahne požadovaný počet buniek, bunky sa imortalizujú. Výhodne sa imortalizujú melanocyty a/alebo keratinocyty, ktoré vykázali najlepší rast. Ešte neimortalizované expandované primárne melanocyty alebo keratinocyty sa môžu voliteľne použiť napríklad pri testoch, kožných štepoch alebo v génovej terapii.

Imortalizácia melanocytov aj keratinocytov sa môže vykonať vektorom, ktorý umožňuje expresiu SV 40 T -

- antigénu, alebo expresiu E6/E7 génu vírusu 16 (HPV16) ľudského papilómu. Imortalizácia sa výhodne vykoná naočkovaním melanocytov alebo keratinocytov retrovírusovýcm konštruktom, ktorý’ umožňuje expresiu SV 40 T -

- antigénu alebo génu E6/E7 vírusu HPV16. Bunková T-Ag infekcia sa vykoná podľa protokolu Pfeifera a ďalší, Meth. Celí. Sci T7, 83 až 89 (1995) (s výnimkou, že vírus sa oddelil z baliacej bunkovej línie v DMEM, 10 % fetálne teľacie sérum).V priebehu infekcie sa môže použiť médium, obsahujúce sérum. Bezsérové médium je však pre melanocyty a keratinocyty výhodné, napríklad to môže byť médium PC-1 , opísané v článku Pfeifera a ďalší, Meth. Celí. Sci. 14, 83 až 89 (1995); týmto odkazom sa uvedený článok zahŕňa do tohto vynálezu. Najvýhodnejšie sa imortalizácia vykoná s použitím retrovírusového konštruktu, označovaného ako pLXSHD+AV40(#328), znázorneného na obr. 2a, podľa Pfeifera a ďalší a Stockshlaedera a ďalší (GeneBank, prístupové číslo M64 753), alebo ako pLXSHD+E6/E7, znázorneného na obr. 2b podľa Diirsta a ďalší, Oncogene 1, 251 až 256 (1987).

Po vykonanej imortalizácii sa imortalizované bunkové línie prenesú do proliferačného média, výhodne do média NR-2 alebo NR-3, alebo do média M2 (pre melanocyty), pričom sa použijú kultivačné platne vopred vybavené poťahom. Keď sa bunky rozmnožia na požadovaný počet buniek, prenesú sa do diferenciačného média, vhodného na

SK 283314 Β6 kultiváciu normálnych a imortalizovaných keratínocytov. Výhodné médium bude mať zloženie média NR-2, alebo upravené zloženie MCDB 153 s vysokým obsahom vápnika (1,5 mM) alebo M2 (pre melanocyty) a použijú sa kultivačné platne, vopred pokryté poťahom (rovnaký poťah s BSA, 1. typom kolagénu a s fibronektínom).

Už bolo uvedené, že diferencované imortalizované keratinocytové a melanocytové bunkové línie, pripravené podľa tohto vynálezu sa vyznačujú lepšími vlastnosťami, ktoré ich umožňujú označiť ako veľmi vhodné na použitie v testoch, pri ktorých sa vyžadujú diferencované bunky ľudskej kože. Zistilo sa, že tieto bunkové línie sa vyznačujú expresiou proteínov, ktoré sú typické pre normálne diferencované melanocyty a keratinocyty, a to aj pri vysokých počtoch pasáží.

Ak sa imortalizované bunky, pripravené podľa tohto vynálezu, testujú napríklad Westernovým blotom a RTPCR, poskytujú cytochrómový profil p450 (CYP450), ktorý je podobný, ak nie rovnaký ako u normálnych keratinocytov. Konkrétnejšie, imortalizované keratinocyty, pripravené podľa tohto vynálezu exprimujú CYP450 1A1, 2C, 2EI, 3A5 a neexprimujú CYP450 1A2, 2A6, 2B6 a 2D6. Tento profil CYP450 je zhodný s normálnymi keratinocytmi. Pri imortalizovaných keratinocytoch nebol tento metabolický profil doteraz opísaný. V skutočnosti je to po prvý raz, čo sa mohlo ukázať, že normálne a imortalizované keratinocyty exprimujú CYP450 3A5, a nie CYP450 3A4. Zistilo sa tiež, že pri testovaní imortalizované keratinocyty, pripravené podľa tohto vynálezu, s použitím protilátok špecifických pre diferenciačné značkovače (markery), exprimujú ďalšie diferenciačné proteíny aj po vysokom počte pasáží. Konkrétnejšie, predmetné bunkové línie exprimujú diferenčné proteíny Kl/10, keratín K14, involukrín, filagrín a lorikrín aj pri vysokých počtoch pasáží, to znamená po vykonaní 10 pasáží a po značne vyšších počtoch pasáží.

Uvedené imortalizované keratinocyty a melanocyty tiež prijímajú exogénne esenciálne mastné kyseliny ( EFA) a vykazujú desaturáciu a predĺženie reťazca EFA, vysoko zhodné s normálnymi melanocytmi a keratinocytmi.

Ďalej, porovnateľne s normálnymi keratinocytmi, uvedené imortalizované keratinocyty exprimujú TNFa a zápalový mediátor kolagenázu I. typu, ak sa vystavia účinku forbolových esterov, čo je podrobnejšie uvedené v ďalšom texte. Uvedené imortalizované keratinocyty exprimujú ďalej superoxidovú dismutázu, enzým zapojený do bunkovej oxidácie, podobne ako normálne diferencované keratinocyty.

Ďalej, imortalizované melanocyty, pripravené podľa tohto vynálezu, majú rovnakú biologickú reakciu ako normálne melanocyty, ak sú vystavené účinku melanogenéznym induktorov (napríklad teofylinu a tyrozinu) a melanogenéznym inhibítorom (kyselina kójová).

Uvedené imortalizované keratinocyty a melanocyty sú podľa uvedených vlastností veľmi vhodné na imunologické, farmakologické, foto- a chemo-toxikologické reakčné kožné testy.

Uvedené imortalizované keratinocytové a melanocytové bunkové línie a primáme melanocyty a keratinocyty sa môžu použiť pri testoch, ktoré vyžadujú diferencované kožné bunky, napríklad v bariérovo-fúnkčných testoch (komifikácia) rekonštruovanej kože, v testoch metabolizmu diferencovaných keratínocytov (metabolizmus mastných kyselín, metabolizmus antioxidantov), v testoch týkajúcich sa vplyvu ultrafialového žiarenia na kožné bunky, v testoch týkajúcich sa účinkov potenciálnych kožných iritantov a senzibilátorov na kožné bunky, v testoch na stanovenie vplyvu zlúčenín na produkciu melanínu, v teste metabolizmu lipidov, pri hodnotení topikálneho účinku xenobiotík (napríklad kozmetických olejov, vyhľadávanie potenciálnych ochranných látok, napríklad fotoprotektorov), v testoch zápalov a dráždenia kože a v podobných ďalších testoch.

Imortalizované keratinocytové a melanocytové bunkové línie a primáme melanocyty a keratinocyty pripravené podľa tohto vynálezu sú užitočné tiež na vyhľadávanie potenciálnych protirakovinových liečivých zlúčenín a zlúčenín na liečbu kožných chorôb. To bude vo všeobecnosti typicky zahŕňať vystavenie bunkovej línie alebo primárnych buniek nejaký čas vplyvu uvedených zlúčenín a zistenie, že uvedené zlúčeniny nemajú škodlivé účinky, napríklad xenotoxickosť, vznik aduktov DNA, mutagénnosť, transformáciu buniek alebo cytotoxicitu.

Uvedené melanocytové a keratinocytové bunkové línie sú vhodné aj na expresiu rekombinantných proteínov, napríklad ľudských proteínov a polypeptidov, ako aj na produkciu RNA a DNA.

Uvedené imortalizované bunkové línie majú ďalej potenciálne využitie v ex vivo genetickej terapii. Uvedené bunkové línie poskytujú užitočný prostriedok genetického usmernenia a pri vývoji genetickým inžinierstvom konštruovaných buniek, ktoré exprimujú požadované génové produkty, napríklad na terapeutické aplikácie, alebo v štúdiách bunkovej toxicity/mutagenity. Ďalej, v dôsledku skutočnosti, že uvedené bunkové línie sú vernou podobou normálnych kožných buniek, môžu byť veľmi vhodné na testy biosenzitivity.

Primárne keratinocyty a melanocyty, pripravené podľa tohto vynálezu sú pripravené bez použitia séra, a preto sú vhodne použiteľné v génovej terapii. Pretože uvedené bunky neboli v styku so sérom, napríklad hovädzím alebo iným živočíšnym sérom (s výnimkou počas vírusovej infekcie a uloženia v kvapalnom dusíku), ich možná kontaminácia vírusmi alebo inými patogénnymi látkami bude značne nižšia, ako pri použití séra. Minimalizuje sa tak riziko prenosu patogénnych alebo infekčných faktorov týmito bunkami pri ich použití v génovej terapii. Uvedená ex vivo genetická terapia má možné využitie pri liečbe porúch, ako je Epidermolysis bullosa (keratínová mutačná porucha), Vitiligo (porucha, zahŕňajúca gény melanínovej syntézy), karcinómy a melanómy, alergické ochorenia a ochorenia príbuzné zápalom. Z pohľadu terapeutického účinku je jediným potenciálnym zdrojom kontaminácie hovädzí extrakt z hypofýzy, hovädzí inzulín, hovädzí kolagén, hovädzie albumínové sérum alebo ľudský fibronektín a ľudský transferín.

Uvedené imortalizované melanocytové a keratinocytové bunkové línie a primáme melanocyty a keratinocyty sú použiteľné aj v testoch DNA mutagenézy, v kožných mutagénových skríningových testoch, v testoch na identifikáciu látok poškodzujúcich chromozómy, v testoch malígnej transformácie, v biochemických testoch buniek (napríklad CYP450 aktivačné testy), pri vyhľadávaní zlúčenín a kompozícií, napríklad koktailov esenciálnych mastných kyselín, ktoré sa podieľajú na zápalových a alergických reakciách, v testoch aktivity kolagenázy (vo vzťahu k zápalovým procesom), zahŕňajúce detekciu interleukínu a TNFa.

Významné potenciálne využitie primárnych keratinocytov alebo melanocytov, pripravených podľa tohto vynálezu, najmä pre ich dostupnosť a spôsob prípravy je v oblasti transplantátov (štepov) kože. Pretože uvedené primárne keratinocyty a melanocyty sa pripravia v podmienkach bez použitia séra, je ich použitie spojené iba s malým rizikom možnej kontaminácie patogénmi (napríklad vírusmi) a infekčnými činidlami. Uvedené melanocyty a keratinocyty môžu byť navyše odvodené od autológneho hostiteľa, napríklad od pacienta s veľkým poranením, čo môže znižovať alebo vylučovať riziko odmietnutia kožného štepu, alebo iné imunologické reakcie, ako aj minimalizovať nebezpečenstvo infekcie.

Príkladmi špecifických imortalizovaných bunkových línií keratínocytov, pripravených podľa tohto vynálezu sú FK2-NR, DK2-NR a DK3-NR, ktoré boli uložené 5. októbra 1995 v DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, ktorej adresa je Mascheroder Weg lb, D-38 124 Braunschweig, Spolková republika Nemecko) a boli zaznamenané pod prístupovými číslami DSM ACC2240, DSM ACC2238 a DSM ACC2239. Ďalším príkladom špecifických imortalizovaných ľudských melanocytových línii, pripravených podľa tohto vynálezu je DM2-NR, ktorá bola uložená 11. decembra 1996 v Pasteurovom ústave, ktorého adresa je 25 rue de Docteur Roux 75 724 Paris, Francúzsko a ktorý bol zaznamenaný pod prístupovým číslom CNCM I - 1 796. Uvedené uloženia sa vykonali v zhode s Budapeštianskou dohodou. Všetky obmedzenia, až po dostupnosť týchto bunkových línií budú neodvolateľné zrušené po vydaní patentu k tejto prihláške, alebo k inej prihláške, v ktorej je nárokovaná prednosť vzhľadom na túto prihlášku.

Ďalšie znaky tohto vynálezu budú zrejmé z ďalej uvedeného opisu uskutočnení pomocou príkladov, ktoré sa uvádzajú ďalej iba na objasnenie vynálezu a nemajú nijaký vplyv na obmedzenie rozsahu vynálezu.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 porovnáva rast (vyjadrený počtom buniek) neimortalizovaných DK.0-NR keratínocytov po 6 dňoch, v troch rozdielnych médiách, to znamená v NR-3, v MCDB 153 médiu doplnenom epinefrínom a v médiu MCDB 153.

Obr. 2a znázorňuje SV 40 retrovírusový konštrukt pLXSHD+SV40(#328) výhodne použitý na imortalizáciu predmetných melanocytov a/alebo keratynocytov.

Obr. 2b znázorňuje HPV retrovírusový konštrukt PLXSHD+E6/E7.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Charakterizácia použitých kožných buniek

V tabuľke 1 sú zhrnuté vzorky kože, ktoré sa spracovali na vírusovú infekciu. Izolované keratinocyty, ktoré vykazovali najlepší rast buniek, sa potom použili na imortalizáciu.

Tabuľka 1

Vzorky kože, použité na izoláciu v médiu NR-3

Pôvod tkaniva	Označenie kmeňa buniek	Vek	Pohlavie	Rast buniek1
stehno	OS 1	36	f	++
stehno	OS 2	68	f	-
stehno	OS 3	51	f	+
očné viečko	EL 1	46	f	+
očné viečko	EL2	49	f	+
abdomen	Thor 1	58	f	-
predkožka	FK 1-NR	5	m	+++
predkožka	FK 0-NR	13	m
abdomen	GK 0-NR	26	f	+++
hruď	DK 0-NR	29	f	+++

Pozn.¹: Spôsob stanovenia: bunky sa oddelili v trypsíne/EDTA (0,05 %/0,01 %) a počítali s použitím hemocytometra; ako výsledok sa uvádza stredná hodnota troch stanovení.

Z kožných vzoriek FKO-NR, GKO-NR a DKO-NR sa izolovali ľudské fíbroblasty. Po oddelení zamše a pokožky sa pokožka (epidermis) rozrezala na malé kúsky 0,2 x 0,2 mm, ktoré sa upevnili na 6 cm kultivačnú platňu so sérom. Po 2 až 4 hodinách sa pridalo Dulbeccovo minimálne esenciálne médium (DMEM, 10 % FCS). Explantovaná kultúra sa potom inkubovala, až bolo viditeľné vyrastanie fibroblastov. Konfluentné fíbroblastové kultúry sa rozdelili a rozmnožili na uloženie zmrazením.

Príklad 2

1. Charakterizácia rastu keratínocytov v médiu bez séra

Primáme bunkové kultúry sa kultivovali v modifikovanom MCDB 153 (Boyce a ďalší, J. Tiss. Cult. Meth., 9, 83 až 93 (1985); a Pittlekow a ďalší, J. Invest. Dermatol., 86, 410 až 417 (1986)) a v médiu NR - 3. Najlepší rast buniek sa pozoroval v médiu NR-3 (obr. 1). V porovnaní s rastom v modifikovanom médiu MCDB 153 bez BPE, zlepšený rast sa pozoroval tiež v úplne definovanom NR-3 médiu (NR-3 bez hovädzieho extraktu z hypofýzy, BPE).

Obr. 1 znázorňuje rast buniek v médiu NR-3, ďalej v médiu MCDB 153 modifikovanom doplnením o epinefrín (keratinocvtové rastové médium) a v médiu MCDB 153. Keratinocyty sa oddelili v trypsíne/EDTA (0,05 %/0,01 %) a počítali pomocou hemocytometra. Výsledky uvedené na obr. 1 sú strednou hodnotou troch stanovení.

2. Vplyv poťahu na kultivačnej platni na prichytávanie buniek a rast buniek

Zistilo sa, že uvedený poťah kultivačných platní zlepšuje zachytávanie a rast buniek normálnych keratínocytov. Výsledky v tabuľke 2 bližšie porovnávajú prichytávanie a rast na nepokrytých kultivačných platniach a na platniach s poťahom. Na 3,5cm platne, ktoré obsahovali médium NR-

3. sa očkovalo 100 000 keratínocytov.

Tabuľka 2

Vplyv poťahu na povrchu kultivačných platní na zachytávanie buniek

	Zachytené bunky 24 hodín po očkovaní1	Počet buniek po 4 dňoch2
	bez poťahu0/»	s poťahom %	bez poťahu	s poťahom
DKO - NR po izolácii	21,4	68,2	44 600	143 800
DKO- NR pasáž 2	73,8	86,8	175 500	282 300

¹ Počet prichytených buniek delený počtom buniek pri očkovaní. Prichytené bunky sa oddelili v trypsíne/EDTA (0,05 %/0,01 %) a počítali pomocou hemocytometra;

² bunky sa oddelili v trypsíne/EDTA (0,05 %/0,01 %) a počítali pomocou hemocytometra; ako výsledok sa udáva stredná hodnota troch stanovení.

Príklad 3

1. Imortalizácia keratínocytov

Suspenzia buniek, pripravená zo vzoriek kože spôsobom, ktorý sa uvádza v príklade 1, obsahuje disociované melanocyty, keratinocyty a fíbroblasty. Suspenzia buniek sa kultivovala v uvedenom médiu NR-3. Kultivácia sa vykonala očkovaním uvedených buniek na kultivačné platne, ktoré boli vopred pokryté súvislým poťahom s „koktai

SK 283314 Β6 reťazová reakcia) so špecifickým primerom pre CYP450 (Macé a ďalší, publikácia sa pripravuje).

lom”, už opísaným na použitie pri práci s bronchiálnymi bunkami (Lechner a ďalší, J. Tiss., Cult. Meth. 9, 43 až 48 (1985)). Keď sa pri kultivácii primárnych bunkových kultúr dosiahla, alebo v podstate dosiahla, konfluencia, tak sa bunky na 4 minúty vystavili účinku roztoku trypsínu/EDTA (0,025 %/0,01 %). V priebehu pôsobenia tohto roztoku sa melanocyty oddelili z keratinocytovej kultúry a odseparovali sa. V tomto štádiu sa teda oddelili primáme melanocyty a keratinocyty. Po kultivácii primárnych keratinocytov a nárastu buniek na požadovaný počet v médiu NR-3 bez séra a použitím kultivačných platní s uvedeným poťahom (poťah podporuje rast keratinocytov na úkor melanocytov) sa následne bunky imortalizovali. Imortalizácia keratinocytov sa vykonala s retrovírusovým konštruktom pLXSHD+SV40(#328), ktorý exprimuje SV 40 T-antigén (pozri Pfeifer a ďalší, Meth. Celí Sci. 17.83 až 89 (1995)); vírus sa získal oddelením z obaľovanej bunkovej línie v DMEM, 10 % fetálneho teľacieho séra). Počas inľekcie sa použilo bezsérové médium PC-1, opísané v článku Pfeifera a ďalší, Meth. Celí Sci., 14, 83 až 89 (1995). Po imortalizácii sa imortalizované bunky preniesli do proliferačného média NR-2 alebo NR-3 použitím kultivačných platní, vopred pokrytých uvedeným poťahom. Po rozmnožení buniek na požadovaný počet sa bunky preniesli do diferenciačného média, vhodného na kultiváciu normálnych a imortalizovaných keratinocytov.

2. Bunková proliferácia imortalizovaných keratinocytov pri vysokom počte pasáží

Ukázalo sa, že imortalizované keratinocyty vykazujú zlepšený rast aj pri vysokom počte pasáží. Je to zrejmé z tabuľky 3, uvedenej ďalej. Ukázalo sa to pri stanovení priemerného generačného času (času zdvojnásobenia populácie, PDT: population doubling tíme) v priebehu logaritmickej fázy rastu. Spôsob stanovenia: keratinocyty sa oddelili v roztoku trypsínu/EDTA (0,05 %, 0,01 %) a počítali sa použitím hemocytometra; udávané výsledky sú strednou hodnotou z troch stanovení.

Tabuľka 3

Čas zdvojnásobenia populácie (PDT) keratinocytových línií rastúcich v NR-3

Keratinocyty	Počet pasáží	PDT (hodín)	Kritická1 pasáž
FK - 2 NR	15	48,00	16-18
FK - 2 NR	39	21,16
DK- 1 NR	12	23,20	25-30
DK - 1 NR	15	31,05
DK -1 NR	31	32,99
DK - 2 NR	15	22,26	20-21
DK - 2 NR	40	24,34

¹ Kritická pasáž znamená tú pasáž, pri ktorej sa zaznamená zníženie rýchlosti rastu buniek.

3. Expresia CYP450 v imortalizovaných humánnych keratinocytových líniách

V normálnych a v imortalizovaných keratinocytových bunkách kože sa analyzovala expresia CYP450 IAl, 1A2, 3A5, 2E1, 2B6, 2A6 a 2D6 prostredníctvom Westcm blotu (proteínová expresia) a RT-PCR (mRNA-expresia, pozri tabuľku 4). CYP450, exprimovaný v imortalizovaných keratinocytoch je podobný CYP450 z normálnych keratinocytov. Rýchlosť expresie je mierne znížená. Línia DK-2 NR vykazuje však normálnu rýchlosť expresie CYP450. Spôsob: RT-PCR (reverzná transkriptázová polymerázová

Tabuľka 4

Expresia CYP mRNA v humánnych keratinocytoch

Keratinocyty	Počet pasáží	1A1'	2C**	2E1	3A5	1A2, 2A6, 2B6, 2D6
FK-0 NR	4	+	+	+	+	-
FK-2 NR	36		+	+	+	-
DK-0 NR	3	+	+	+		-
DK-1 NR	31	+	+	+	+	-
DK-2 NR	13	+	+	+	+	-

expresia 1A1 mRNA v imortalizovaných bunkách bola zvýšená po indukcii s benz(a)pyrénom (1,5 μΜ; Amersham Inc.). Zvýšenie bolo porovnateľné s normálnymi bunkami ** 2C17/19 a2C18.

4. Reakcia na induktory CYP450

Bunkové línie vykazovali reakciu na induktor CP450 benz(a)pyrén podobne ako neimortalizované bunky, a to aj pri vysokých počtoch pasáží (pozri tabuľku 5). Pre T-Ag imortalizované keratinocyty nie je táto indukcia opísaná.

Tabuľka 5

7-Etoxyrezorufín-O-deetylázová (EROD; Sigma Inc.) aktivita v humánnych keratinocytoch po indukcii benzpyrénom (B(a)P)’

Keratinocyty	počet pasáží	EROD, (pmol/mg proteínu)
FK-0 NR	2	nezistiteľný
FK-0 NR + B(a)P	2	0,58
FK-2 NR	37	0,01
FK-2 NR + B(a)P	37	1,05
DK-0 NR	1	0,02
DK-0NR+B(a)P	1	1,03
DK-1 NR	32	0,04
DK-1 NR + B(a)P	32	1,78
DK-2 NR	14	0,02
DK-2NR + B(a)P	14	0,69
DK-3 NR	39	0,01
DK-3 NR + B(a)P	39	1,86

* Keratinocyty sa inkubovali 24 hodín s B(a)P (1,5 μΜ). Aktivita EROD sa merala po inkubácii pri 37 °C stanovením fluorescencie rezorufinového produktu (excitácia pri 560 nm, emisia pri 586 nm).

5. Diľerenciácia buniek

Využitím špecifických protilátok sa analyzovali diferenciačné markery. Použité špecifické protilátky sa uvádzajú v tabuľke 6. Ako klony s najvyššou diferenciačnou schopnosťou možno označiť klony DK-2 NR a DK-1 NR (tabuľka 7 a 8).

Tabuľka 6

Protilátky použité na detekciu keratinocytových špecifických proteínov

Špecifickosť	Názov protilátky	Dodávateľ/odkaz
T-Ag	Ab-2	Oncogene, Manhassat, NY, USA
Involukrín	ΒΤΊ BT-576	BTI, Stoughton, MA, USA
Filagrín	Filagrín	Paesel + Lorei, Frankfurt, BRD

Tabuľka 9

Proteínová expresia GST enzýmu

Lorikrín	aAg 73	Magnaldo a ďalší, 1992
Vimentín	V9	Dáko, Glostrup, Dánsko
Keratin K4	6B10	Sigma, St. Louis, USA
Keratin K7	LDS-68	Sigma, St. Louis, USA
Keratin K8	M20	Sigma, St. Louis, USA
Keratin K10/1	K8.60	Sigma, St. Louis, USA
Keratin KÍ3	KS-1A3	Sigma, St. Louis, USA
Keratin K14	CKB1	Sigma, St. Louis, USA
Keratin K17	CK-E3	Sigma, St. Louis, USA
Keratin K18	CY-90	Sigma, St. Louis, USA
Keratin KÍ 9	A53-B/A2	Sigma, St. Louis, USA

Tabuľka 7

Detekcia T-Ag a diferenciačných produktov epidermálnych keratinocytov

Keratinocyt	Počet pasáží	T- Ag	Involukrín	Filagrín	Lorikrín	Vimentín
FK-0 NR	2		+++	++	+	++
FK-2 NR	25	+++	++	++	+	++
DK-0 NR	2	-	+++	+++	++	+++
DK-1 NR	13	+++	+++	++	++	++
DK-1 NR	30	+++	++	++	+	++
DK-2 NR	11	+++	+++	+++	++	+++
DK-3 NR	36	+++	++	++	+	4-4-

Tabuľka 8

Detekcia keratínov (K) v keratinocytoch

Keratinocyt	Počet pasáží	K4	K7	K8	KÍ 0/1
FK-0 NR	2	4-4-		4-4-	++
FK-2 NR	25	H-+4-		++	4-+
DK-0 NR	2	4-4-		-	+++
DK-1 NR	13	++		++	4-4-+
DK-1 NR	30	+		++	++
DK-2 NR	11	+++		+++	+++
DK-3 NR	36	+		4-4-4-	+++

Pokračovanie tabuľky 8

Keratinocyt	Počet pasáží	K13	K14	K17	K18	K19
FK-0 NR	2	+++	++	++	+	+
FK-2 NR	25	+++	++	-H-	+	+
DK-0 NR	2	+++	+++	+++	-	+
DK-1 NR	13	+++	++	++	+	+
DK-1 NR	30	++	++	+	++	+
DK-2 NR	11	+++	+++	+++	+++	++
DK-3 NR	36	+++	+++	+++	+++	++

Spôsoby stanovenia (tabuľky 7 a 8): Keratinocyty sa na podložných sklíčkach po fixácii v čistom metanole vyfarbili protilátkami, uvedenými v tabuľke 6;

+++ znamená najvyššiu koncentráciu proteínu, kvantifikovanú fluorescenčnou mikroskopiou;

- znamená, že nenastala nijaká expresia proteínu,

6. Expresia glutation-S-transferázy

Enzým druhej fázy glutation-.S'-transferáza (GST) sa analyzoval použitím techník Northern blot a Western blot. Všetky keratinocytové línie silne exprimovali mRNA pre GSTrr, ale nie pre GSTa a GSTp (Tabuľka 9, spôsob: Northern blot). Proteínový exprimačný profil GSTa, GSTp a GSTa v bunkových líniách bol podobný normálnym keratinocytom.

Keratinocyty	GSTa	GSTp	GSTn
FK-2 NR	-		+++
DK-0 NR	-		+++
DK-1 NR	-		+++
DK-2 NR	-		+++
DK-3 NR	-		+++

7. Metabolizmus esenciálnych mastných kyselín (EFA)

Na analýzu a porovnanie desaturácie a predĺženia pridaných EFA v keratinocytoch sa pôsobilo na imortalizované (DK-1 NR, FK-2 NR) a normálne keratinocyty kyselinou linolovou (LA, 15 μΜ) a kyselinou a-linolénovou (LN, 15 μΜ). Na tieto pokusy sa použilo médium NR-2, nedostatkové na EFA (Biofluids Inc.). Na bunky sa takto pôsobilo až po dosiahnutie konfluencie. Bunky sa nechali v styku s EFA počas 4 dní (obnovené po 2 dňoch).

Analýzy EFA sa vykonali extrakciou a separáciou fosfolipidov pomocou TLC (chromatografiou v tenkej vrstve) a kvantifikáciou metylesterov mastných kyselín pomocou GLC (kvapalinová plynová chromatografia). Preukázal sa vznik desaturácie a elongačných produktov kyseliny linolovej (20: 4n-6 a 22: 4n-6) a linolénovej (20: 5n-3 , 22: 5n-3 a 22: 6n-3). Tento metabolický profil je konzistentný s profilom pozorovaným pri normálnych keratinocytoch.

8. Druhové hodnotenie (karyotyping)

Všetky bunkové línie boli hypodiploidné s najväčším počtom chromozómov v diploidnej oblasti (s výnimkou DK2-NR s chromozómami tiež v hypotctraploidnej oblasti). Iné bunky ako analyzované bunkové línie sa v kultúrach nezistili. Tento výsledok potvrdzuje čistotu bunkových línií a neprítomnosť bunkovej kontaminácie z iných zdrojov.

9. Charakterizácia in vivo

Tumorogenicita imortalizovaných keratinocytov sa určovala subkutánnou injekciou (1-2 mio keratinocytov) do tela myši. Testované keratinocytové línie DK2-NR, DK3-NR, FK2-NR nie sú v myši tumorogénnc (4 mesiace inkubácie). DK.3-NR však bol slabo tumorogénny u šiestich zvierat z desiatich po 5-mesačnej inkubácii.

10. Reakcia na kožné dráždivé látky

Northern blotom a biologickými testami sa analyzovala indukcia „stresového génu” (nádorový nekrotický faktor alfa) po pôsobení kožných dráždivých látok (iritantov) PMA (forbol-12-myristát-13-acetát), SDS (dodecylsiran sodný), DMSO (dimetylsulfoxid), IL -1 β (interleukin 1 beta) a UV - B (ultrafialová B) (tabuľka 10). Uvedené keratinocyty vykazovali odozvu na PMA a UV-B a exprimovali proteín TNFa aj po vysokom počte pasáží.

Po pôsobení forbolových esterov (PMA) na imortalizované keratinocyty sa pozorovalo zvýšenie expresie kolagenázy I. typu.

Tabuľka 10

Vylučovanie TNFa v keratinocytoch po indukcii kožnými dráždivými látkami

SK 283314 Β6

Testovanie proteínovej aktivity: začleňovanie ³H-tymidínu do buniek citlivých na TNFa*.

	sekrécia TNFa po indukcii s:
Keratinocyty	počet pasáží	PMA	SDS	DMSO	IL-1 β	UV-B
DKO - NR	3	+	-		n	+
DK1 - NR	20-22	+	+		+	+
DK1 - NR	32	1	-		n	+
DK2-NR	16	+	-		-	+
DK2-NR	31	+	-		n

n - nestanovované

- citlivé bunky: fibrosarkómová bunková línia myši WEH1164 kloň 1.14 (ATCC).

11. Organotypové kultúry

Vykonala sa kultivácia ľudských keratinocytov tiež v organotypových podmienkach (rast keratinocytov na kolagénovom géli s vyživujúcimi bunkami s expozíciou na vzduchu). Všetky keratinocytové línie v porovnaní s normálnymi keratinocytmi vykázali hyperproliferačnú morfológiu. Tieto testy sa vykonávali v kultivačnom médiu so sérom. Hyperproliferačný rast buniek bol znížený v podmienkach bez prítomnosti séra (NR-2 s vysokým obsahom vápnika (1,5 mM) na plastových kultivačných platniach bez kolagénového gélu a bez vyživujúcich buniek).

Príklad 4

1. Imortalizácia melanocytov

V uvedenom médiu NR-3 sa kultivovala suspenzia buniek, pripravená zo vzorky kože DKO-NR, opísaná v príklade 1, ktorá obsahovala disociované melanocyty, keratinocyty a fibroblasty. Kultivácia sa vykonala očkovaním uvedených buniek na kultivačné platne, ktoré boli vopred súvisle pokryté „koktailovým” poťahom, opísaným na použitie s bronchiálnymi bunkami (Lechner a ďalší, J. Tissue Cult. Meth. 9, 43 až 48 (1985)). V priebehu kultivácie primárnych bunkových kultúr, keď sa dosiahne, alebo sa takmer dosiahne konfluencia, pôsobí sa na bunky počas 4 minút s trypsínom/EDTA (0,025 %/0,01 %). V priebehu účinku tohto trypsínového média sa melanocyty uvoľnia od keratinocytovej kultúry a oddelia. Primáme keratinocyty a primárne melanocyty sa tak v tejto fáze vzájomne oddelia. Oddelené primáme melanocyty sa potom očkujú v NR-4 bezsérovom médiu, ktoré špecificky inhibuje rast keratinocytov. Po kultivovaní a rozmnožení primárnych melanocytov na požadovaný počet buniek v bezsérovom médiu NR-4 s použitím kultivačných platní s poťahom sa potom

Zloženie média NR-1 (pozri ďalej uvedenú tabuľku)

Tabuľka 11 bunky imortalizujú. Imortalizácia melanocytov sa vykoná s retrovírusovým konštruktom pLXSHD+SV40(#328), ktorý exprimuje SV 40 T-antigén (pozri Pfeifer a ďalší, Meth. Celí Sci. 17, 83 až 89 (1995); vírus sa získal oddelením z obaľovanej bunkovej línie v DMEM, 10 % fetálneho teľacieho séra). Počas infekcie sa použilo bezsérové médium PC-1, opísané v článku Pfeifera a ďalší, Meth. Celí Sci., 14, 83 až 89 (1995). Po imortalizácii sa imortalizované bunky preniesli do proliferačného média M-2 a diferenciačného média (DMEM/F12, Biofluids, číslo 148); tieto médiá možno zakúpiť od M. Olssena, Uppsala, Švédsko).

2. Charakterizácia ľudských melanocytov exprimujúcich T-Ag

Porovnávala sa expresia melanínových proteínov imortalizovaných melanocytov, pripravených podľa tohto vynálezu (najmä DM2-NR), s normálnymi melanocytmi. Preukázalo sa, že imortalizované bunky exprimujú melanínové proteíny, melanómový antigén (MAA) a HMB45, podobne ako normálne bunky, hoci na nižších hladinách expresie.

3. Indukcia syntézy melanínu

Porovnávala sa melanogenéza T - Ag exprimujúcich melanocytových bunkových línií (najmä línie DM2-NR) s normálnymi bunkami. Melanocyty sa vystavili účinku induktorov melanogenézy tyrozínu a teofylínu a účinku inhibítora melanogenézy kyseliny kójovej. Uvedené melanocytové línie (najmä línia DM2-NR) vykazovali na modulátory melanogenézy reakciu porovnateľnú s normálnymi bunkami. Preukázalo sa tiež, že indukcia/inhibícia melanogenézy je závislá tiež od dávky.

Príklad 5

Kmeň DKO-NR, opísaný v príklade 1, sa imortalizoval, ako sa opisuje skôr, retrovírusovým konštruktom pLXSHD+E6/E7, založenom na HPV16, ktorý je znázornený na obraze 2b. Vybralo sa niekoľko súvislých línií keratinocytov. Výsledkom analýzy bolo, že z hľadiska diferenciačných produktov (cytokeratíny, GST, TNFa, inolukrin, filagrin, lorikrín, vimentín) sú tieto línie podobné produktom získaným z línií DK2-NR a DK3-NR.

Príklad 6

Zloženie nového média NR-3 podľa tohto vynálezu a zloženia niekoľkých ďalších bezsérových médií podľa tohto vynálezu, to znamená zloženia médií NR-1, NR-2 a NR-4 sú uvedené v nasledujúcom texte:

Zloženie média NR-1 (pozri ďalej uvedenú tabuľku)

Aminokyseliny	NR-1 (mg/1)
L- alanín	9,0000
L- arginín.HCl	316,0000
Asparagín.H2O	15,0000
Kyselina L-asparágová	4,0000
L-cysteín.HCI.H2O	42,0000
Kyselina L-glutámová	14,8000
Glutamín	877,0000
Glycín	7,6000
L-histidín.HCl.H2O	50,4000
L-Izoleucín	98,4000
L-Leucín	131,2000
L-lyzín.HCl	36,6000
L-metionín	13,4000
L-fenylalanín	14,9000

SK 283314 Β6

L-prolín L-serín L-treonin L-tryptofán L-tyrozín L-valín	34.6000 126,2000 23,8000 9,2000 13.6000 70,2000
Anorganické soli	NR-1 (mg/1)
Metavanadičnan amónny, NH4VO3	0,0006
Molybdenan amónny, (NH4)ĎMo7O24.4H2O	0,0010
Chlorid vápenatý, CaCl2.2H2O	16,2000
Síran meďnatý, CuSO4.5H2O	0,0025
Síran železnatý, FeSO4.7H2O	1,4000
Chlorid horečnatý, MgCl2.6H2O	122,0000
Chlorid manganatý, MnCl2.4H2O	0,0002
Síran nikelnatý. NiSO4.6H2O	0,0003
Chlorid draselný, KC1	112,0000
Octan sodný	301,5000
Hydrogenuhličitan sodný, NaHCO3	1088,0000
Chlorid sodný, NaCl	5200,0000
Hydrogenfosforečnan disodný Na2HPO4.7H2O	536,0000
Sodná soľ kyseliny pyrohroznovej	55,5000
Seleničnan sodný, Na2SeO3	0,0050
Kremičitan sodný, Na2SiO3.9H2O	0,1420
Chlorid cínatý, SnCl2.'2H2O	0,0001
Síran zinočnatý, ZnSO4.7H2O	0,5100
Vitamíny	NR-1 (mg/1)
d-Biotín	0,0200
d-Pantotenát vápenatý	0,2600
Chlorid cholínu	28,0000
Kyanobalamín (B12)	0,4100
Kyselina listová	0,7900
I-Inozitol	18,0000
Nikotínamid (B3)	0,0400
Pyridoxín (B6 .H2O)	0,0600
Riboflavín (B2)	0,0400
Ostatné látky	NR-1 (mg/1)
Adenín	27,3000
Epidermálny rastový faktor (EGF, ľudský, rekomb.)	0,0010
Etanolamín	0,0310
Glukóza	1080,0000
HEPES	6000,0000
Hydrokortizón	0,5000
Inzulín (bovinný)	5,0000
Fcnolová červeň	1,2000
Fosfoetanolamín	0,0710
Putrescín 2 HCI	0,1600
Hydrochlorid tiamínu	0,3400
Kyselina tioktová	0,2100
Tymídín	0,7300
Transferín (ľudský)	10,0000
Osmotické prísady	280 - 285 mOsm/ι

1. Zloženie média NR-2

Rovnaké ako NR-1, ale doplnené extraktom bovinnej hypofýzy (Biofluid Inc.) v množstve 35 mg na liter, a obsahujúce antibiotiká (Gibco BRL, Life Technologies Inc.) fungizón (0,25 mg na liter), penicilín (10,000 jednotiek na liter) a streptomycín (10 mg na liter).

2. Zloženia média NR-3

Rovnaké zložky ako v médiu NR-2, ale doplnené epinefrínom (Biofluid Inc.) (250 pg na liter).

3. Zloženie média NR-4

Rovnaké zložky ako v médiu NR-2, ale doplnené PFGF (základný fibroblastový rastový faktor, získaný od firmy

Sigma Inc.) a forbol-12-myristátom-12-acetátom (10 pg na liter) (PMA) (C.C.R. Inc.).

Hoci je vynález vo vzťahu k určitým výhodným uskutočneniam opísaný dostatočne podrobne, v jeho rozsahu sú možné aj ďalšie uskutočnenia. Podľa toho ani opis vynálezu, ani ďalej uvedené nároky nie sú a ani nemajú byť spájané s obmedzením vynálezu podľa v ňom uvedeného opisu výhodných uskutočnení.

Claims (29)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Modifikovaný spôsob na imortalizáciu ľudských kožných buniek na získanie imortalizovaných keratinocy12 tov a melanocytov, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa nasledujúce kroky:

   (i) odobratie vzorky ľudského kožného tkaniva;

   (ii) prípravu uvedenej vzorky kože na kultiváciu in vitro·, (iii) získanie keratinocytov a/alebo melanocytov vychádzajúc z uvedenej pripravenej kožnej tkanivovej vzorky a vysiatie keratinocytov a/alebo melanocytov na bezsérové rastové médium, na kultivačné platne s poťahom obsahujúcim fibronektín, kolagén typu 1 a BSA, ktorý uľahčuje pripojenie a rast buniek;

   (iv) výmenu média, ak je to nevyhnutné na optimalizáciu súvislého rastu kultivovaných buniek, pričom sa kontinuálne udržiava poťah na kultivačných platniach;

   (v) prenesenie keratinocytov alebo melanocytov do bezsérového média, vhodného na selekciu medzi keratinocytmi alebo melanocytmi, na podobne, vopred potiahnuté kultivačné platne;

   (vi) infikovanie keratinocytov alebo melanocytov s retrovírusovým konštruktom, (vii) prenesenie výsledných imortalizovaných keratinocytov alebo melanocytov do bezsérového proliferačného média, vhodného na proliferáciu imortalizovaných keratinocytov alebo melanocytov na podobne, vopred potiahnuté kultivačné platne; a (viii) prenesenie výsledných proliferovaných keratinocytov do bezsérového diferenciačného média, ktoré má vysoký obsah vápnika, do podobne, vopred potiahnutých kultivačných fliaš.
2. 2. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že retrovírusovým konštruktom je vektor pLXSHD+SV40(#328) odvodený od vírusu SV40 alebo vektor pLXSHD+E6/E7 odvodený od ľudského papiloma vírusu 16, HPV 16.
3. 3. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že bezsérové médium v kroku iii) je NR-3 médium, ktoré obsahuje zlúčeniny uvedené v tabuľke 11 a extrakt hovädzej hypofýzy - 35 mg/ml, fungiozón - 0,25 mg/1, penicilín - 10 000 jednotíek/1 a streptomycín - 10 mg/1 a je doplnené epinefŕínom - 250 pg/l.
4. 4. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa t ý m , že bezsérové médium v kroku v) je NR-3 médium podľa nároku 3 alebo NR-4 médium, ktoré obsahuje zlúčeniny uvedené v tabuľke 11 a extrakt hovädzej hypofýzy 35 mg/ml, fungiozón - 0,25 mg/1, penicilín - 10000 jednotiek/1 a streptomycín - 10 mg/1 a je doplnené 3FGF - 3 pg/l a forbol-12-myristát-13-acetátom -10 pg/l.
5. 5. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa t ý m , že proliferačné médium v kroku (vii) je NR-2 médium, ktoré obsahuje zlúčeniny uvedené v tabuľke 11 a extrakt hovädzej hypofýzy - 35 mg/ml, fungiozón - 0,25 mg/1, penicilín - 10000 jednotiek/1 a streptomycín - 10 mg/1 alebo NR-3 médium podľa nároku 3, a M2 médium pre mclanocyty.
6. 6. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že diferenciačné médium v kroku (viii) je NR-2 médium alebo modifikované MCDB 153 médium, ktoré má obsah vápnika najmenej 1,5 mM.
7. 7. Imortalizovaná ľudská keratinocytová bunková línia alebo melanocytová bunková línia získateľná spôsobom podľa nárokov 1 až 6.
8. 8. Imortalizovaná keratinocytová bunková línia podľa nároku 7, ktorá exprimuje keratínové proteiny a ďalšie proteiny v podstate rovnakým spôsobom, ako sú exprimované normálnymi diferencovanými keratinocytmi.
9. 9. Imortalizovaná keratinocytová bunková línia podľa nároku 8, kde keratínové proteiny zahŕňajú keratín K.l/10, keratín K14 a ďalšie proteiny zahŕňajú involukrín, filagrín a lorikrín.
10. 10. Imortalizovaná keratinocytová bunková línia podľa nároku 7, ktorá má CYP450-profil, ktorý je identický, alebo v podstate identický s profilom normálnych diferencovaných keratinocytov.
11. 11. Imortalizovaná keratinocytová bunková línia podľa nároku 10, ktorá exprimuje CYP450 1 Al, 2C, 2E1 a 3A5, ale neexprimuje CYP450 1A2, 2A6, 2B6 a 2D6.
12. 12. Imortalizovaná línia ľudských kožných buniek vybraná zo skupiny, ktorá obsahuje keratinocytové línie DK2-NR (DSM ACC2238), DK3-NR (DSM ACC2239) a KF2-NR (DSM ACC2240) a melanocytovú líniu DM2-NR (CNCM 1-1796).
13. 13. Imortalizovaná keratinocytová bunková línia podľa nároku 7, ktorá exprimuje mRNA kódujúcu glutation-S-transferázu GST-a, GST-μ a GST-π.
14. 14. Imortalizovaná keratinocytová bunková línia podľa nároku 7, ktorá, ak sa kultivuje v organotypickej kultúre, vytvára vysoko stratifikovaný a polarizovaný epitel, ktorý má zhrubnuté povrchové vrstvy, v podmienkach bez použitia séra alebo vyživujúcich buniek.
15. 15. Imortalizovaná keratinocytová bunková línia podľa nároku 7, ktorá exprimuje kolegenázu typu 1 a TNFa po vystavení účinku forbolových esterov.
16. 16. Imortalizovaná keratinocytová bunková línia podľa nároku 7, ktorá exprimuje proteín vybraný zo skupiny obsahujúcej involukrín, filagrín a lorikrín v podstate rovnakým spôsobom ako normálne keratinocyty.
17. 17. Modifikované bezsérové kultivačné médium adaptované na izoláciu a produkciu ľudských keratinocytov a melanocytov podľa nárokov 1 až 6, vyznačujúce sa t ý m , že obsahuje aminokyseliny alebo soli aminokyselín; anorganické soli; vitamíny; adenín, etanolamín, glukózu, HEPES, fenolovú červeň, putrescín.2HCl, tiamín.HCl, tymidín, epidermálny rastový faktor; inzulín; hydrokortizón; fosfoetanolamín; a extrakt hovädzej hypofýzy, ktorý obsahuje kyselinu tioktovú a transferín v množstve dostatočnom na izoláciu a produkciu ľudských keratinocytov alebo melanocytov podľa nárokov 7 až 16.
18. 18. Médium podľa nároku 17, vyznačujúce sa t ý m , že ďalej obsahuje epinefŕín.
19. 19. Médium podľa nároku 18, vyznačujúce sa t ý m , že koncentrácia epinefrínu je dostatočná na podporu rastu keratinocytov.
20. 20. Médium podľa nároku 17, vyznačujúce sa t ý m , že aminokyseliny obsiahnuté v médiu sú vybrané zo skupiny zahŕňajúcej L-alanín, L-arginín.HCl, asparagín.H₂O, kyselinu L-asparágovú, L-cysteín.HCl.H₂O, kyselinu L-glutámovú, glutamín, glycín, L-histidín.HCl.H₂O, L-izoleucín, L-leucín, L-lyzín.HCl, L-metionín, L-fenylalanín, L-prolín, L-serín, L-treonín, L-tryptofán, L-tyrozín, L-valin a ich soli.
21. 21. Médium podľa nároku 17, vyznačujúce sa t ý m , že anorganické soli sa vybrané zo skupiny obsahujúcej metavanadičnan amónny, molybdénan amónny, chlorid vápenatý, síran meďnatý, síran železnatý, chlorid horečnatý, chlorid manganatý, síran nikelnatý, chlorid draselný, octan sodný, hydrogénuhličitan sodný, chlorid sodný, hydrogenfosforečnan disodný, sodnú soľ kyseliny pyrohroznovej, seleničitan sodný, kremičitan sodný, chlorid cínatý a síran zinočnatý.
22. 22. Médium podľa nároku 17, vyznačujúce sa t ý m , že vitamíny sa vyberú zo skupiny, ktorá zahŕňa d-biotín, d-pantotenát vápenatý, chlorid cholínu, kyanokobalamín, kyselinu listovú, i-inozitol, nikotínamid, pyridoxín a riboflavín.

    SK 283314 Β6
23. 23. Modifikované bezsérové médium na izoláciu, produkciu a/alebo udržiavanie imortalizovaných keratinocytov a/alebo melanocytov, vyznačujúce sa tým, že sa vyberie zo skupiny zahŕňajúcej NR-2 médium, NR-3 médium a NR-4 médium podľa ktoréhokoľvek z nárokov 4 alebo 5.
24. 24. Modifikovaný test, ktorý využíva diferencované keratinocyty a/alebo melanocyty, vyznačujúci sa tým, že modifikácia zahŕňa použitie imortalizovaných keratinocytov a/alebo melanocytov podľa nároku 7.
25. 25. Test podľa nároku 24, vyznačujúci sa t ý m , že bunky sa vyberú zo skupiny zahŕňajúcej DK.2-NR (DSM ACC2238), DK3-NR (DSM ACC2239), DM2-NR (CNCM1-1796) a FK2-NR (DSM ACC2240).
26. 26. Test podľa nároku 24, vyznačujúci sa t ý m , že pozostáva z testovania zápalovej reakcie.
27. 27. Modifikovaný test využívajúci primáme melanocyty alebo keratinocyty, vyznačujúci sa t ý m , že modifikácia zahŕňa použitie primárnych melanocytov alebo keratinocytov, získaných podľa nároku 1 (iii).
28. 28. Test podľa nároku 27, vyznačujúci sa t ý m , že pozostáva z testovania zápalovej reakcie.
29. 29. Modifikovaný spôsob transplantácie kože, v y značujúci sa tým, že zahŕňa použitie primárnych keratinocytov alebo melanocytov, pripravených podľa nároku 1 (iii), ako štepov kožného tkaniva.