[go: up one dir, main page]

HU226195B1 - Javított immortalizált humán bõrsejtvonalak és szérrummentes tápközeg elõállításukra - Google Patents

Javított immortalizált humán bõrsejtvonalak és szérrummentes tápközeg elõállításukra Download PDF

Info

Publication number
HU226195B1
HU226195B1 HU9903742A HUP9903742A HU226195B1 HU 226195 B1 HU226195 B1 HU 226195B1 HU 9903742 A HU9903742 A HU 9903742A HU P9903742 A HUP9903742 A HU P9903742A HU 226195 B1 HU226195 B1 HU 226195B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
keratinocytes
medium
melanocytes
immortalized
serum
Prior art date
Application number
HU9903742A
Other languages
English (en)
Inventor
Markus Baur
Catherine Mace
Armand Malnoe
Andrea M A Pfeifer
Marcelle Regnier
Original Assignee
Nestle Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nestle Sa filed Critical Nestle Sa
Publication of HUP9903742A2 publication Critical patent/HUP9903742A2/hu
Publication of HUP9903742A3 publication Critical patent/HUP9903742A3/hu
Publication of HU226195B1 publication Critical patent/HU226195B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C12N5/0629—Keratinocytes; Whole skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/40—Nucleotides, nucleosides or bases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/44—Thiols, e.g. mercaptoethanol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/39—Steroid hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/80—Neurotransmitters; Neurohormones
    • C12N2501/81—Adrenaline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/04—Immortalised cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

A találmány tárgyát normális emberi bőrszövetből származó javított folytonos (immortalizált) sejtvonalak - közelebbről, keratinocita és melanocita sejtvonalak - képezik, amelyek számos passzálás után is megtartják azon képességüket, hogy a differenciálódott melanocitákra, illetve keratinocitákra jellemző differenciálódási proteineket expresszáljanak. Szintén a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti sejtvonalak előállítására alkalmas szérummentes tápközegek, amelyek nem igénylik táplálósejtek alkalmazását.
A találmány szerinti immortalizált keratinocita és melanocita sejtvonalak előnyösen alkalmazhatók olyan vizsgálati eljárásokban, amelyekben differenciálódott bőrsejtekre van szükség. Ezenfelül, a találmány szerinti szérummentes tápközegek, illetve tenyésztési eljárások alkalmasak a primer és az immortalizált keratinociták és melanociták izolálására, előállítására és fenntartására.
Az emberi bőrszövetekből származó immortalizált sejtvonalak előállítását korábban már leírták. Általában az ilyen eljárások az immortalizációt elősegítő hatóanyagokkal in vitro tenyésztett humán bőrsejtek (például keratinociták vagy és melanociták) transzfektálását vagy transzformálását foglalják magukban.
Az immortalizáció olyan sejtek előállítását jelenti, amelyek in vitro hosszú ideig - ideális esetben meghatározatlan ideig - tenyészthetők. Az ilyen sejteket folytonos sejtvonalaknak is nevezzük. Ezzel szemben, a nem immortalizált sejtek csak véges számú in vitro sejtosztódásig szaporíthatok. Az immortalizált sejtek különösen előnyösek, mivel a meghatározott jellemzőkkel bíró sejtek potenciálisan korlátlan ideig tartó forrásaként szolgálnak. Az immortalizált sejtvonalak - közelebbről, az immortalizált humán bőrsejtvonalak - előállítására alkalmas hagyományos hatóanyagok közé tartoznak az immortalizációt biztosító DNS-szekvenciákat tartalmazó vírusok, rekombináns vírusok és plazmidok.
Az immortalizált humán sejtvonalak előállításának valószínűleg legáltalánosabb eljárásában immortalizáló hatóanyagként SV40 szekvenciákat, közelebbről, az SV40 nagy T-antigén DNS-ét alkalmazzák. Például Steinberg és munkatársai [J. Cell. Phys. 123, 117 (1985)]; Reddel és munkatársai [4,885,238 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás (1987. december 5.)]; Major [4,707,448 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás (1987. november 17.)]; Stoner és munkatársai [Cancer Rés. 51, 365 (1991)]; Chopra és munkatársai [In Vitro Cell. Dev. Bioi. 30A, 539 (1994)]; Chopra és munkatársai [In Vitro Cell. Dev. Bioi, 27A, 763 (1991)]; Christian és munkatársai [Cancer Rés. 47, 6066 (1987)]; Rhim és munkatársai [Science 227, 1250 (1985)]; és Grubman és munkatársai [Gastroinvest. Liver Physiol. 29, G1060 (1994)] az SV40 vektorok és az SV40 nagy T-antigén-szekvenciát tartalmazó vektorok immortalizált humán sejtvonalak előállítására történő alkalmazását ismertették. Az ilyen szekvenciák sejtekbe történő bevitelét általában SV40 vírus vagy adenovírus-12 és SV40 hibridvírus alkalmazásával végzett fertőzéssel, vagy a sejtek - Rous-szarkómavírus hosszú terminális ismétlődését és Ori-SV40 korai régiót tartalmazó - rekombináns plazmiddal, stronciumfoszfátos együttes precipitációval végzett transzfektálásával hajtják végre [Id. Brash és munkatársai: Mól.
Cell. Bioi. 7, 2031 (1987)].
Az immortalizált sejtvonalak - közelebbről, az immortalizált humán keratinociták - előállításának egy másik ismert eljárása a sejtek humán papillomavírus-DNSszekvenciákkal végzett transzfektálását vagy fertőzését foglalja magában. Például az 5,376,542 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (1994. december 27.) Schegel humán epitelsejtek izolált HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33 vagy HPV-35 E6- és E7-génjével vagy önmagában az E7-génnel végzett immortalizálását írja le; ezzel az eljárással nem tumorogén immortalizált sejtvonalakat hoztak létre. Barbosa és munkatársai [Oncogene 4, 1529 (1989)] és Münger és munkatársai [J. Virol. 63(10), 4417 (1989)] a HPV-16 és HPV-18 E6- és E7-génjének immortalizált humán keratinociták előállítására történő alkalmazását írják le.
Miközben számos kutatócsoport beszámolt az immortalizált keratinocita sejtvonalakról és ezek in vitro vizsgálati eljárásokban történő alkalmazásáról, a korábbi immortalizált keratinocita és melanocita sejtvonalak rendszerint egy vagy több olyan tulajdonságot mutattak, amelyek előnytelenné tették alkalmazásukat. Például a korábban leírt immortalizált keratinocita sejtvonalak a következő tulajdonságok legalább egyikével bírnak: (i) a differenciálódási markerek (például a normálisan differenciálódott keratinociták által expresszált proteinek) expressziójának csökkenése vagy hiánya; és (ii) szövettenyészetben megváltozott szaporodási jellemzők.
Például Jetten és munkatársai [J. Invest. Dermatol. 92, 203 (1989)] olyan - SV40 szekvenciákkal, NHEKSV40-T8-1-vektor alkalmazásával immortalizált - keratinocitákat írtak le, amelyek sok (12-nél több) passzálás után nem voltak képesek differenciálódni. Hasonlóan, Bemard és munkatársai [Cancer Rés. 45, 1707 (1985)] immortalizált keratinocita sejtvonal (SVK14) izolálásáról számoltak be, amely csaknem teljesen képtelen a differenciálódásra. Ugyanakkor, ez a sejtvonal nem expresszálja az 53 kD-nál nagyobb molekulatömegű K1/10 keratinokat és az 50 kD-os keratint (K14), mely proteineket normális esetben a differenciálódott keratinociták expresszálják.
Steinberg és munkatársai [J. Cell. Physiol. 123, 117 (1985)] SV40-nel transzformált keratinocitákat írtak le, amelyek fokozatosan elvesztették - a normális keratincitoszkeleton építőanyagát képező - keratinokat expresszáló képességüket. A normális keratinexpresszió megszűnése kb. 10-15 passzálás után következett be. Hronis és munkatársai [Cancer Rés. 44, 5797 (1984)] SV40-DNS-sel immortalizált keratinocitákat írtak le, amelyek elvesztették K5-, K6-, K14/15-, K16- és K17keratinokat és involucrint termelő képességüket (ezek a proteinek a normálisan differenciálódó keratinocitákra jellemzők). Morris és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 8498 (1985)] SV40-DNS-sel immortalizált keratinocitákat ismertettek, amelyekben nagyobb számú (14-nél több) passzálás után a II. és I. osztályba
HU 226 195 Β1 tartozó keratinok nagymértékben csökkent expressziója volt kimutatható. Például ezek a keratinociták gyakorlatilag nem expresszálnak K13-keratinocitát.
Banks-Schlegel és munkatársai [J. Cell. Bioi. 96, 330 (1983)] szintén SV40-nel immortalizált keratinocitákat írtak le, amelyek szövettenyészetben módosított szaporodási tulajdonságokat mutatnak. Például az általuk leírt keratinociták - a normális keratinocitákkal ellentétben - szaporodásukhoz 3T3 táplálóréteget igényelnek.
Az immortalizált humán keratinociták és melanociták előállítására alkalmas korábbi eljárásokban rendszerint a táplálósejtes („feeder cell) technológiát alkalmazzák, melyekben általában fibroblasztok funkcionálnak tápláiósejtként. Például Sexton és munkatársai [„Stable transfection of humán keratinocytes: HPV immortalization, Keratinocyte Methods, szerk.: Leigh, I. M. és munkatársai, University Press, 179-180. old. (1994)]; Garlick [„Retroviral Vectors”, Keratinocyte Methods, szerk.: Leigh, I. M. és munkatársai, University Press, 181-183. old. (1994)] az immortalizált keratinociták izolálására és előállítására magzati borjúszérumot tartalmazó tápközeg alkalmazását ismertették.
Korábban már leírták a szérummentes tápközeg immortalizált epithelsejtek - közelebbről a humán keratinociták - izolálására és előállítására történő alkalmazását. Például Barbosa és munkatársai [Oncogene 4, 1529 (1989)] az elektroporációval vagy lipofekcióval transzfektált humán keratinociták kis kalciumkoncentrációjú, szérummentes tápközegben konfluens állapot eléréséig történő tenyésztését írták le.
A korábban leírt eljárások ellenére továbbra is jelentős szükség van olyan immortalizált humán keratinocitákra és melanocitákra, amelyek javított tulajdonságokkal bírnak, közelebbről, amelyek számos passzálást követően is megtartják a normális keratinociták és melanociták differenciálódási képességét, és amelyek differenciálódott melanocitákra és keratinocitákra jellemző differenciálódási proteineket expresszálnak. Az ilyen sejtek számos célra előnyösen alkalmazhatók, elsősorban olyan vizsgálati eljárásokban, amelyekben differenciálódott bőrsejtekre van szükség. Ezen túlmenően, szükség van olyan tenyésztő tápközegre, amelyek alkalmasak a primer és az immortalizált keratinociták és melanociták fenntartására, továbbá olyan javított tenyésztési eljárásokra is igény van, amelyek nem igénylik táplálósejtek alkalmazását.
A fentieknek megfelelően, a találmány szerinti megoldás kidolgozása során normális emberi bőrszövetből származó javított folytonos (immortalizált) sejtvonalak, elsősorban normális emberi bőrszövetből származó immortalizált keratinocita és melanocita sejtvonalak előállítását tűztük ki célul, amelyek számos passzálás után is megtartják differenciálódási képességüket és differenciálódási proteineket expresszáló képességüket. Közelebbről, olyan immortalizált keratinociták előállítását tűztük ki célul, amelyek megtartják keratinokat, citokrómokat, valamint egyéb differenciálódási proteineket (például involucrint, filaggrint és loricrint) expreszáló képességüket, mely proteineket a hagyományos, immortalizált keratinocita sejtvonalak nem, vagy csak kis mennyiségben expresszálják. További célul tűztük ki olyan immortalizált keratinociták és melanociták előállítását, amelyek a differenciálódott keratinociták és melanociták által normális esetben expresszált enzimeket expresszálnak, elsősorban II. fázisú enzimeket (mint például a glutation-S-transzferázok), valamint a celluláris oxidációban és a gyulladásos reakcióban szerepet játszó enzimeket és/vagy proteineket.
A találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósítása során további célul tűztük ki olyan új szérummentes tenyésztő tápközegek kifejlesztését, amely alkalmas a normális vagy folytonos keratinocita és/vagy melanocita sejtvonalak tenyésztésére, előállítására és fenntartására. Az ilyen szérummentes tápközegek a találmány szerinti folytonos melanocita és keratinocita sejtvonalak alapjául szolgáló emberi bőrsejtek izolálására, kialakítására és immortalizálására is alkalmas. Ennek megfelelően, további célul tűztük ki egy teljesen meghatározott összetételű (ismeretlen vagy rosszul meghatározott komponensek nélküli) tenyésztő tápközeg létrehozását, amely alkalmas a keratinociták táplálósejtek nélküli tenyésztésére, és amely epinefrint tartalmaz, amelyről felismertük, hogy szérummentes tápközegben - váratlan módon - nagymértékben elősegíti a normális keratinociták szaporodását.
További célul tűztük ki egy eljárás kifejlesztését emberi bőrsejtek izolálására, kialakítására és immortalizálására, amely alkalmas a normális bőrszövetből származó folytonos melanocita és keratinocita sejtvonalak létrehozására. Az ilyen eljárás során szérummentes tápközegeket, nevezetesen a találmány szerinti szérummentes tápközegeket, valamint - fibronektint, szarvasmarha-szérumalbumint és I. típusú kollagént tartalmazó - táplálósejtek (például fibroblasztok) nélküli sejtösszekapcsoló koktélt alkalmazunk.
A találmány szerinti megoldás kidolgozása során további célként tűztük ki táplálósejtek alkalmazása nélkül, szérummentes körülmények között előállított primer keratinociták vagy melanociták létrehozását, amelyek bőrátültetésre és ex vivő génterápiára alkalmazhatók.
További célul tűztük ki a találmány szerinti javított folytonos keratinocita és melanocita sejtvonalak - például immonológiai, farmakológiai, foto- és kemotoxikológiai bőrreakció tesztekben és heterológ gének expresszáltatására történő - alkalmazási eljárásainak kifejlesztését.
A következőkben az ábrák rövid leírását ismertetjük.
Az 1. ábrán a nem immortalizált DKO-NR keratinociták három különböző tápközegben, azaz NR-3-tápközegben, epinefrinnel kiegészített, módosított MCDB-153-tápközegben és MCDB-153-tápközegben 6 napos tenyésztést követően megfigyelhető szaporodását (a sejtszám növekedését) hasonlítjuk össze.
A 2/A. ábrán a pLXSHD+SV40(#328) SV40 retrovirális konstrukciót mutatjuk be, amely előnyö3
HU 226 195 Β1 sen alkalmazható a melanociták és/vagy keratinociták immortalizálására.
A2/B. ábrán a pLXSHD+E6/E7 HPV16 retrovirális konstrukciót mutatjuk be.
A találmány tárgyát normális emberi bőrszövetekből származó folytonos (immortalizált) sejtvonalak, közelebbről, immortalizált keratinociták és melanociták képezik, amelyek számos passzálás után is megtartják differenciálódási képességüket, illetve a normális keratinociták vagy melanociták által expresszált differenciálódási proteineket expresszáló képességüket. A „számos passzálás kifejezésen legalább tíz, előnyösen legalább 20-30, még előnyösebben legalább 50 passzálást, legelőnyösebben meghatározatlan számú passzálást értünk. Például a találmány szerinti eljárással előállított, immortalizált keratinociták szövettenyészetben, még számos passzálás után is K1/10 keratinokat, K14-keratint, involucrint, filaggrint és loricrint expresszálnak, ellentétben a korábban leírt immortalizált keratinocitákkal, amelyek nem vagy alig expresszálják ezeket a differenciálódási proteineket.
Szintén a találmány tárgyát képezik a szérummentes feltételek mellett és táplálósejtek alkalmazása nélkül előállított primer keratinociták és melanociták, amelyek megtartják differenciálódási képességüket, és differenciálódott melanocitákra és keratinocitákra jellemző proteineket expresszálnak.
A találmány szerinti immortalizált keratinociták olyan p450 citokróm profilt (CYP450) mutatnak, amely hasonló - ha nem azonos - a normális keratinocitákéval. Például a találmány szerinti sejtek CYP450 3A5-öt expresszálnak, CYP450 3A4-et azonban nem. Ugyannakkor, a találmány szerinti immortalizált keratinociták hasonló mértékben expresszálnak II. fázisú enzimeket, például glutation-S-transzferázt (GST), közelebbről GSTa-t, GSTp-t és GSTn-t, mint a normális, nem immortalizált keratinociták.
A találmány szerinti immortalizált keratinociták forbol-észterekkel végzett kezelést követően - a normális, differenciálódott keratinocitákhoz hasonló vagy azonos mértékben - celluláris oxidációban és gyulladásos reakciókban szerepet játszó proteineket és enzimeket expresszálnak, például szuperoxid-dizmutázt (SÓD), I. típusú kollagenázt és tumornekrózis-faktorα-t (TNFa). E tulajdonságoknak köszönhetően a találmány szerinti sejtvonalak immunológiai, farmakológiai, gyulladásos, foto- és kemotoxikológiai bőrreakció-vizsgálati eljárásokban alkalmazható sejtek rendkívül stabil, reprodukálható forrását biztosítják.
Ezenfelül, a találmány szerinti immortalizált melanociták endogén módon melaninnal összefüggő proteineket expresszálnak (lásd 14. és 15. példa).
A találmány szerinti immortalizált keratinocita és melanocita sejtvonalak organotípusos tenyészetben tenyésztve nagymértékben rétegzett és polarizált epitheliumot képeznek, amely elszarusodott felső rétegeket (stratum corneum) tartalmaz. Ezt korábban csak hagyományos tenyészeti feltételekkel - vagyis szérumot és táplálóréteget tartalmazó tápközeg alkalmazásával
- sikerült megvalósítani [Id. például Lechner és munkatársai: Virology 185, 536 (1991)].
A találmány szerinti immortalizált keratinociták és melanociták normális bőrből szérummentes feltételek mellett, táplálósejtek alkalmazása nélkül vannak előállítva. A találmány szerinti immortalizált keratinocitákat és melanocitákat általában a következő lépések szerint állítjuk elő:
(i) emberi bőrszövetmintát veszünk;
(ii) a bőrmintát in vitro tenyésztés céljára előkészítjük;
(iii) az előkészített bőrmintából keratinocitákat és/vagy melanocitákat nyerünk ki, és az így kapott keratinocitákat és/vagy melanocitákat - a sejtek tapadását és szaporodását elősegítő bevonattal (amely fibronektint, I. típusú kollagént és szarvasmarha-szérumalbumint tartalmaz) ellátott tenyésztőtálcákon szérummentes szaporító tápközegbe, előnyösen NR-3-tápközegbe vagy (a melanociták esetében) NR-4-tápközegbe (lásd később) helyezzük;
(iv) a tápközeget a tenyésztett sejtek konfluens szaporodásának optimalizálásának megfelelően cseréljük, miközben a tenyésztőtálcákon a bevonatot megtartjuk;
(v) a keratinocitákat, illetve melanocitákat - az említett bevonattal ellátott tenyésztőtálcákon - szelektáló tápközegbe, előnyösen szérummentes tápközegbe helyezzük át;
(vi) a keratinocitákat, illetve melanocitákat retrovirális konstrukcióval, előnyösen SV40 vagy papillomavírus-16-alapú konstrukcióval - például az SV40-vírus nagy T-antigénjét (T-Ag) kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó pLXSHD+SV40(#328) SV40-plazmiddal vagy a papillomavírus-16 (HPV16) E6/E7 génjét tartalmazó pLXSHD+E6/E7-plazmiddal (lásd később) - infektáljuk;
(vii) az immortalizált keratinocitákat, illetve melanocitákat - előzetesen a fenti bevonattal ellátott tenyésztőtálcákon - az immortalizált keratinociták, illetve melanociták proliferációját elősegítő proliferációs tápközegbe, előnyösen NR-2- vagy NR-3-tápközegbe (lásd később), illetve M2-es melanocita tápközegbe (M. Olsson, Inst. of Dermatology, Uppsala, Svédország) tesszük; és (viii) a proliferálódott keratinocitákat - előzetesen a fentiekhez hasonlóan bevont - tenyésztőlemezeken differenciáló tápközegbe, előnyösen NR-2-tápközegbe (lásd később) vagy nagy (előnyösen 1,5 mM) kalciumkoncentrációjú, módosított MCDB-153-tápközegbe (lásd később) helyezzük [Boyce és munkatársai: J. Tissue Cult. Meth. 9, 83 (1985); Pittlekow és munkatársai: J. Invest. Dermatol. 86, 410 (1986)].
Az (i) lépésben az emberi bőrszövetmintákat emberekből vesszük, például sebészeti vagy gyermekgyógyászati beavatkozás során. Egy önálló bőrsejtminta (például egy autológ bőrsejtminta) immortalizálásával meghatározott tulajdonságú (például egy adott donorra jellemző receptor profilú) immortalizált keratinocita és melanocita sejtvonalak állíthatók elő.
Az (ii) lépésben a bőrmintát úgy készítjük elő, hogy alkalmas legyen az in vitro tenyésztésre. Ezt általában
HU 226 195 Β1 úgy hajtjuk végre, hogy a bőrmintát először - például a tenyésztésre alkalmazott tápközeggel, előnyösen szérummentes NR-2-tápközeggel (amelynek pontos összetételét később adjuk meg) - mossuk. Ez a kezelés a normális keratinociták és melanociták tenyésztése szempontjából előnyösnek bizonyult. Mosás után a bőrmintát - például „dermatome” alkalmazásával - leborotváljuk, majd apró darabokra vágjuk.
Az így kapott bőrmetszeteket ezután előnyösen irharétegre (dermis) és irha alatti rétegre (epidermis) választjuk szét. Ez fizikai és/vagy enzimatikus módon valósítható meg. Például a szétválasztást tripszines kezeléssel végezhetjük, melynek során a bőrdarabokat EDTA-t (például kb. 0,1% koncentrációban) tartalmazó - (például kb. 0,5%-os) tripszinoldatban, a sejtek szétválasztásához megfelelő ideig, például 37 °C-on 30-60 percig vagy 4 °C-on egy éjszakán át áztatjuk.
A dermist - a fibroblasztok izolálása céljából (lásd 2. példa) - elkülönítjük, majd az epidermist szuszpendáló tápközegbe helyezzük. A szuszpendáló tápközeg előnyösen szójabab-tripszininhibitor (SBTI) oldatot tartalmaz. Ezzel a tápközeggel a sejteket a tripszin inaktiválásához és a sejtek szétválasztásához elégséges ideig (rendszerint kb. 5 percig) érintkeztetjük. Ezután a sejtekhez szövettenyésztő tápközeget - előnyösen szérummentes NR-2-tápközeget (lásd később) - és filtert (például 100 mm-es filtert) adunk, miáltal a kívánt sejteket (vagyis a keratinocitákat és/vagy a melanocitákat) kapjuk.
Ezt követően az (ii) lépésben kapott primer keratinocita/melanocita tenyészetet megfelelő sejtkoncentrációban (például 1,2*104 sejt/cm2) - előzetesen összefüggő bevonattal ellátott tenyésztőtálcákon - szérummentes tápközegbe, előnyösen NR-3-tápközegbe (lásd később) helyezzük. A sejtkoncentráció tág határok között változtatható. A tenyésztőtálcákat folyamatosan olyan készítménnyel vonjuk be, amelyről bebizonyosodott, hogy - váratlan módon - egyaránt serkenti a keratinociták és melanociták tapadását, illetve szaporodását. Ez a készítmény fibronektin, szarvasmarhaszérumalbumin és 1. típusú kollagén oldatából áll. Ezt a bevonatkészítményt korábban bronchialls sejtekhez alkalmazták [Lechner és munkatársai: J. Tissue Cult. Meth. 9, 43 (1985), melyet teljes terjedelmében a kitanítás részének kell tekinteni],
A (iv) lépésben a tenyésztő tápközeget az optimális sejtszaporodásnak megfelelő gyakorisággal (előnyösen másnaponként) cseréljük, de a csereperiódus az adott bőrmintától függően változhat. A csaknem teljesen (például 90%-ban) konfluens állapot elérése után, ami általában 10-14 nap elteltével következik be, a keratinocitákat és melanocitákat elkülönítjük. Ez bármilyen eljárással megvalósítható, amely a melanociták és/vagy keratinociták károsítása nélkül biztosítja a sejtek megfelelő elkülönítését. Ilyen eljárás, például a differenciális tripszines kezelés. A melanocitákat, illetve keratinocitákat előnyösen tripszin/EDTA oldattal kezeljük, majd szelektáló tápközegbe helyezzük. A keratinoclták esetében a sejteket előnyösen 5-10 percig tripszin/EDTA (0,025%/0,01%) oldattal kezeljük, majd az (v) lépésben - előzetesen bevonattal ellátott tálcákon NR-3-tápközegbe helyezzük őket. Lényeges megjegyezni, hogy az NR-3-tápközeg a keratinociták szaporodását serkenti, a melanocitákét azonban nem. A melanociták esetében a sejteket előnyösen 2-4 percig tripszin/EDTA (0,025%/0,01%) oldattal kezeljük, majd az (v) lépésben - előzetesen hasonló bevonattal ellátott tálcákon - NR-4-tápközegbe helyezzük őket. Lényeges megjegyezni, hogy az NR-4-tápközeg specifikusan gátolja a keratinociták szaporodását.
Ezeket a sejteket később immortalizáló hatóanyaggal kezeljük, vagy más módon, a sejteket az immortalizálás végrehajtásáig - például folyékony nitrogénben lefagyasztjuk. Az infekciót és immortalizálást előnyösen a pLXSHD+SV40(#328) elnevezésű SV40-konstrukció [Id. 2/A. ábra; Stockshlaeder és munkatársai: Humán Gén. Therapy 2, 33 (1991); GeneBank nyilvántartási szám: M64753] vagy a pLXSHD+E6/E7 HPV16konstrukció [Id. 2/B. ábra] alkalmazásával hajtjuk végre. A pLXSHD+SV40(#328)-konstrukció - többek között - az SV40 nagy T-antigénjét kódoló szekvenciát, az SV40 5’- és 3’-oldali LTR-szekvenciáit, E. colban replikációt biztosító pBR322-szekvenciákat, többszörös klónozóhelyet és SV40-poliadenilációs szekvenciát tartalmaz. A pLXSHD+E6/E7-konstrukció a nagy T-antigén helyett a humán papillomavírus-16 E6/E7-génjének Ncol/Cfol-fragmensét tartalmazza. Az E6/E7-plazmid előállítási eljárását Dürst és munkatársai írták le [Dürst és munkatársai: Oncogene 1, 251 (1987)]. Az immortallzálás után a sejteket kellő számú alkalommal passzáltuk, majd a kapott, immortalizált sejteket proliferációs tápközegbe helyeztük át [(vii) lépés]. A keratinociták esetében a proliferációs tápközegbe történő áthelyezést előnyösen a 2. passzálásnál hajtjuk végre.
A (viii) lépésben az immortalizált sejteket az immortalizált keratinociták és melanociták szaporítására alkalmas proliferációs tápközegben szaporítjuk, amely egy szérummentes tápközeg, és előnyösen NR-2vagy NR-3-tápközeget, és a melanociták esetében M2-tápközeget tartalmaz (lásd később). Az immortalizált sejteket előzetesen - fibronektin, szarvasmarhaszérumalbumin és 1. típusú kollagén oldatát tartalmazó - összefüggő bevonattal ellátott tenyésztőtálcákon tenyésztjük.
Az immortalizált sejtek proliferációs tápközegben történő szaporítása után a sejteket a (viii) lépésben olyan tápközegbe helyezzük, amely lehetővé teszi a normális és immortalizált keratinociták differenciálódását. Ez a tápközeg előnyösen - nagy (előnyösen kb. 1,5 mM) kalciumkoncentrációjú NR-2-tápközeg vagy módosított MCDB153-tápközeg. A tenyésztést ebben az esetben is folyamatosan fibronektin, szarvasmarhaszérumalbumin és 1. típusú kollagén oldatával bevont tenyésztőtálcákon hajtjuk végre.
Ahogy fentebb említettük, váratlanul felismertük, hogy a találmány szerinti eljárással előállított, immortalizált keratinocita és melanocita sejtvonalak megtartják differenciálódási képességüket, és olyan differenciálódási proteineket expresszálnak, amelyek szövettenyészetben sok (azaz legalább 10) passzálás után is meg5
HU 226 195 Β1 tartják differenciálódási képességüket, illetve a normális keratinociták vagy melanociták által expresszált differenciálódási proteineket expresszáló képességüket. Például a találmány szerinti immortalizált keratinociták számos passzálás után keratinokat, továbbá egyéb proteineket (például involucrint, filaggrint és loricrint) expresszálnak, melyeket a korábban leírt, SV40 szekvenciákkal immortalizált keratinociták nem vagy alig expresszálnak.
Közelebbről, több - találmányunk szerinti eljárással előállított - immortalizált keratinocita sejtvonal, így a DK2-NR, DK3-NR és FK2-NR (lásd 7. és 8. táblázat), sok (több, mint 30) passzálás után is expresszálják a K1/10 keratinokat, a K14-keratint, az involucrint, a filaggrint és a loricrint.
Ezenfelül, a találmány szerinti eljárással előállított, immortalizált keratinociták olyan CYP450-profilt mutatnak, amely hasonló - ha nem azonos - a normális humán keratinociták CYP450-profiljával. Például a találmány szerinti immortalizált keratinociták expresszálják a CYP450-1A1-et, CYP450-2C-t, CYP450-2E1-et és CYP450-3A5-öt, a CYP450-1A2-t, CYP450-2A6-ot, CYP450-2B6-ot és CYP450-2D6-ot azonban nem; ez a normális keratinociták citokróm-450 profiljára jellemző. Első alkalommal sikerült bebizonyítani, hogy a normális és az immortalizált keratinociták expresszálják CYP450-3A5-öt, a CYP450-3A4-et azonban nem.
Ezen túlmenően, a találmány szerinti immortalizált keratinocita sejtvonalak II. fázisú enzimeket [például glutation-S-transzferázokat (GST)] is a normális, differenciálódott keratinocitákhoz hasonló mértékben expresszálnak. így például a találmány szerinti keratinocita sejtvonalak a GSTa-t, GSTp-t és GSn-t a normális keratinocitákhoz hasonló mértékben expresszálják.
A találmány szerinti immortalizált keratinociták - a normális keratinocitákhoz hasonló vagy azonos mértékben - celluláris oxidációban és gyulladásos reakciókban szerepet játszó proteineket és enzimeket expresszálnak, például szuperoxid-dizmutázt (SÓD). Ezenfelül, a találmány szerinti eljárásokkal előállított immortalizált keratinociták - forbol-észterekkel végzett kezelés hatására - I. típusú kollagenázt (ami egy gyulladásközvetítő anyag) és tumornekrózis-faktor-a-t (TNFa) expresszálnak.
A találmány szerinti melanociták képesek melaninnal összefüggő proteineket és vimentint expresszálni.
A találmány szerinti immortalizált sejtvonalak organotípusos tenyészetben szaporítva nagymértékben rétegzett és polarizált epitheliumot képeznek, amely elszarusodott felső rétegeket (stratum corneum) tartalmaz. Ezt korábban csak hagyományos tenyészeti feltételekkel - vagyis szérumot és táplálóréteget tartalmazó tápközeg alkalmazásával - sikerült megvalósítani.
A találmány szerinti immortalizált sejtvonalak teljesen szérummentes feltételekkel, táplálóréteg nélkül vannak előállítva.
Ezen túlmenően, ahogy azt a későbbiekben részletesen leírjuk, váratlanul felismertük, hogy az epinefrin szérummentes tápközegben alkalmazva - a normális keratinociták nagy hatású növekedési faktora. Közelebbről; a későbbiekben leírt NR-3-tápközeg epinefrint tartalmaz, amelyről felismertük, hogy serkenti a normális keratinociták szaporodását (lásd 1. ábra). Ez teljesen meglepő, mivel az epinefrinről korábban leírták, hogy gátolja a keratinociták szaporodását [Halprin: J. Invest. Dermatol. 81, 553 (1983)], illetve, csak mérsékelt hatást gyakorol a keratinociták szaporodására [Koizumí és munkatársai: Invest. Dermatol. 96, 234 (1991)].
Felismertük azt is, hogy a primer és immortalizált keratinociták tenyésztésére alkalmazott tenyésztőcsészék vagy -tálcák - különösen fibronektint, szarvasmarha-szérumalbumint és I. típusú kollagént tartalmazó bevonattal vagy „koktéllal történő - összefüggő bevonása, váratlan módon, javítja a keratinociták és melanociták tálcákhoz, illetve csészékhez történő tapadását, továbbá serkenti a sejtszaporodást. Az ilyen bevonóanyag alkalmazását immortalizált keratinociták és/vagy melanociták esetében korábban nem írták le.
A találmány tárgyát képezi egy új szérummentes tápközeg is, amelyet NR-3-tápközegnek nevezünk. Ez a tápközeg lehetővé teszi az emberi bőrből származó normális keratinociták és/vagy melanociták szérummentes körülmények között, táplálóréteg alkalmazása nélkül történő tenyésztését és izolálását. Megállapítottuk, hogy a találmány szerinti tápközeg serkenti a normális keratinociták szaporodását, és szérummal, illetve táplálósejtekkel történő érintkezés nélkül lehetővé teszi normális keratinocitatenyészetek létrehozását.
Az NR-3-tápközeg pontos összetételét az 1. táblázatban adjuk meg. Ez a tápközeg különféle aminosavakat, nyomelemekként szervetlen sókat, továbbá vitaminokat, növekedési faktorokat és egyéb komponenseket tartalmaz. Az NR-3-tápközeg növekedési faktorként epidermális növekedési faktort (rekombináns EGF), inzulint, hidrokortizont, (humán) transzferrint, szarvasmarha-hipofíziskivonatot és epinefrint tartalmaz. Ahogy fentebb említettük, az epinefrinről kimutattuk, hogy szövettenyészetben serkenti a primer keratinociták szaporodását.
Az NR-3-tápközeg aminosavakként L-alanint, L-arginin-HCI-ot, L-aszparagin-H2O-t, L-aszparaginsavat, L-cisztein-HCI-H2O-t, L-glutaminsavat, glutamint, glicint, L-hisztidin-HCI-H2O-t, L-izoleucint, L-leucint, L-lizin-HCI-ot, L-metionint, L-fenil-alanint, L-prolint, L-szerint, L-treonint, L-triptofánt, L-tirozint és L-valint tartalmaz.
A tápközegben lévő szervetlen savak a következők: ammónium-metavanadát, ammónium-molibdát, kalcium-klorid, rézszulfát, vas(lll)-szulfát, magnézium-klorid, mangán-klorid, nikkel-szulfát, kálium-klorid, nátrium-acetát, nátrium-hidrogén-karbonát, nátrium-klorid, dinátrium-hidrogén-foszfát, nátrium-piruvát, nátriumszelenit, nátrium-szilikát, ón-klorid és cink-szulfát.
Az NR-3-tápközeg vitaminokként d-biotint, d-kalcium-pantotenátot, kolin-kloridot, ciano-kobalamint, folsavat, i-inozitolt, nikotin-amidot, piridoxint és riboflavint tartalmaz.
A találmány szerinti NR-3-tápközeg a fentieken kívül adenint, etanol-amint, foszfoetanol-amint, fenolvö6
HU 226 195 Β1 rös-Na-t, putrescin-2HCI-ot, tiamin-HCI-ot, tioktasavat („thioctic acid), timidint, glükózt, HEPES-puffert és antibiotikumokat (fungizont, penicillint és sztreptomicint) is tartalmaz.
Az NR-3-tápközeg előnyös összetételét a 12. táblázatban adjuk meg, azonban a tápközeg alkotórészeinek koncentrációja tág határok között változtatható. Közelebbről, a különböző komponensek mennyisége a 12. táblázatban megadott koncentrációktól ±50%tól±0,1%-ig, előnyösebben ±10%-tól±0,1 %-ig terjedő arányban térhet el. Ezen túlmenően, a tápközegből a felsorolt komponensek közül egy vagy több kihagyható, és más komponensek alkalmazhatók, feltéve, hogy az újabb alkotórészek nem befolyásolják károsan a keratinocita és melanocita primer sejttenyészetek és immortalizált sejtvonalak izolálását és kialakítását. Ez kísérletezéssel és hibaanaiízissel határozható meg.
Ahogy említettük, a találmány szerinti szérummentes NR-3-tápközeg lényeges komponense az epinefrin. Korábban beszámoltak arról, hogy a humán keratinociták enzimeket expresszálnak az epinefrin-szintézishez, és nagy mennyiségben expresszálnak béta-2adrenoreceptorokat [Schallreuther és munkatársai: „Production of catecholamines in the humán epidermis”, Biochem. and Biophys. Rés. Commun. 189, 72 (1992)]. Ezek az enzimek - elsősorban a fenil-etanolamin-N-metil-transzferáz és a biopterinfüggő tirozinhidroxiláz - a katekolamin bioszintézises reakcióútjában játszanak szerepet Ezzel szemben, melanocitákban és fibroblasztokban nem mutatható ki ilyen enzimaktivitás. Ilyenformán, az enzimatikus aktivitás és/vagy a receptorexpresszió magyarázatot adhat az epinefrin keratinocita-proliferációt befolyásoló hatására.
Feltételezzük, hogy az NR-3-tápközeg azért segíti elő a primer sejttenyészetek és sejtvonalak izolálását és kialakítását, mert gátolja a sejtek differenciálódását, ami az olyan sejtek felszaporodását eredményezi, amelyek megőrzik differenciálódási képességüket, valamint a normális, differenciálódott keratinociták és melanociták által expresszált proteineket és enzimeket expresszáló képességüket.
Másfelől, úgy véljük, hogy a keratinociták, illetve melanociták szérumtartalmú tápközegben történő szaporítása az első passzáláskor elősegíti a differenciációt, ez azonban - az első tenyésztési periódus során kedvezőtlen, mivel a differenciálódott sejtek nem szaporodnak jól. Ez végül azon proliferatív bőrsejtek túlszaporításához és szelektálásához vezet, amelyek csak gyenge differenciálódási kapacitást mutatnak. Ennek megfelelően, a nagy differenciálódási képességű sejtek száma csökken, ha az immortalizálás előtt a tápközeghez szérumot adunk.
Ezzel szemben, a találmány szerinti megoldás értelmében a keratinocitákat és melanocitákat szérummentes tápközegben tenyésztjük, ami gátolja e sejtek differenciálódását. A találmány szerinti megoldás értelmében előnyösen a teljes tenyésztés során szérummentes tápközeget alkalmazunk, mind az immortalizálás előtt és közben, mind a proliferáció és differenciáció során.
Ahogy említettük, a találmány szerinti szérummentes NR-3-tápközeg gátolja a keratinociták szaporodását, ezáltal lehetővé teszi a keratinocita primer sejttenyészetek, valamint a belőlük származó immortalizált sejtvonalak jobb izolálhatóságát. Ez a szérummentes tápközeg kis koncentrációban tartalmaz kalciumot, így szelektíven gátolja a keratinocitákkal együtt izolált fibroblasztok szaporodását. Ennek megfelelően, ez a tápközeg egy igen szelektív szaporító tápközeg, amely a döntő többségben melanocitákat és keratinocitákat tartalmazó sejttenyészetek előállításának kedvez. Következésképpen, a találmány szerinti szérummentes NR-3-tápközeg a találmány szerinti megoldás szempontjából előnyös, mivel gátolja a keratinociták differenciálódását, és gátolja a fibroblasztok szaporodását.
A találmány szerinti megoldás értelmében egy egyedi bőrmintából létrehozott sejtszuszpenziót amely disszociált melanocitákat, keratinocitákat és fibroblasztokat tartalmaz - előnyösen találmány szerinti NR-3-tápközegben tenyésztünk, melynek során a sejteket először - tapadásukat elősegítő készítménnyel összefüggően bevont tenyésztőcsészékbe helyezzük. Ez a bevonat előnyösen fibronektin, szarvasmarhaszérumalbumin és I. típusú kollagén elegyéből áll. Ezt a bevonatkészítményt korábban bronchialis sejtekhez alkalmazták [Lechner és munkatársai: J. Tissue Cult. Meth. 9, 43 (1985)]. Felismertük, hogy ez a „koktél” elősegíti a keratinociták és melanociták műanyag tenyésztőtálcákhoz történő tapadását, sőt, megállapítottuk, hogy a primer és immortalizált keratinociták tenyésztésére alkalmazott tenyésztőtálcák összefüggő bevonása, váratlan módon, tovább fokozza a sejtszaporodást. Korábban a tenyésztőtálcák összefüggő bevonását immortalizált keratinociták és melanociták esetében nem írták le.
A tenyésztés során a primer sejttenyészeteket kellőképpen magas fokú konfluens állapot elérésekor felosztjuk, és újabb - bevonattal ellátott - tenyésztőtálcákra helyezzük. A sejttenyészeteket rendszerint 10-14 naponként osztjuk fel.
A primer melanocitákat és/vagy keratinocitákat szérummentes NR-3-tápközegben, a fentebb leírt bevonattal ellátott tenyésztőtálcák alkalmazásával végzett tenyésztésük és kívánt sejtszámra történő felszaporításuk után - immortalizáljuk. Előnyösen a legjobban szaporodó melanoitákat és keratinocitákat immortalizáljuk. A felszaporított primer melanociták és keratinociták az immortalizálás előtt, például vizsgálati eljárásokban, bőrátültetésre vagy génterápiás célokra is alkalmazhatók.
Mind a melanociták, mind a keratinociták immortalizálását olyan vektorral végezzük, amely lehetővé teszi az SV40 nagy T-antigénjének vagy a humán papillomavírus-16 (HPV16) E6/E7-génjének expresszióját. Az immortalizálást előnyösen úgy hajtjuk végre, hogy a melanocitákat, illetve keratinocitákat - az SV40 T-antigén vagy a HPV16 E6/E7-gén expresszióját lehetővé tevő - retrovirális konstrukcióval fertőzzük. A celluláris T-Ag fertőzést Pfeifer és munkatársai eljárás [Meth. Cell. Sci. 17, 83 (1995)] alapján végezzük, azzal a kü7
HU 226 195 Β1 lönbséggel, hogy a vírust 10% magzati borjúszérumot tartalmazó DMEM-tápközegben növesztett csomagoló sejtvonalból gyűjtöttük. A fertőzés során alkalmazhatunk szérumtartalmú tápközeget is, azonban a melanociták és keratinociták esetében előnyösebb szérummentes tápközeget alkalmazni, például a Pfeifer és munkatársai által leírt PC-1-tápközeget [Pfeifer és munkatársai: Meth. Cell. Sci. 14, 83 (1995); mely forrást teljes terjedelmében a kitanítás részének kell tekinteni], Az immortalizálást előnyösebben a pLXSHD+SV40(#328) elnevezésű retrovíruskonstrukció (lásd 2/A. ábra; Pfeifer és munkatársai és Stockshlaeder és munkatársai; GeneBank nyilvántartási szám: M64753) vagy a pLXSHD+E6/E7 retrovíruskonstrukció alkalmazásával [Id. 2/B. ábra; Dürst és munkatársai: Oncogene 1, 251 (1987)] végezzük.
Az immortalizálás után az immortalizált sejtvonalakat - előzetesen bevonattal ellátott tenyésztőtálcákon - proliferációs tápközegbe (előnyösen NR-2- vagy NR-3-tápközegbe, vagy a melanociták esetében M2-tápközegbe) tesszük át. A sejteket - kívánt sejtszám elérése után - előzetesen (szarvasmarha-szérumalbumint, I. típusú kollagént és fibronektint tartalmazó) bevonattal ellátott - tenyésztőtálcákon normális és immortalizált keratinociták tenyésztésére alkalmas differenciáló tápközegbe helyezzük. Ez a tápközeg előnyösen NR-2-tápközeg vagy nagy kalciumkoncentrációjú (1,5 mM) módosított MCDB-153-tápközeg, illetve (a melanociták esetében) NR-2-tápközeg.
Ahogy fentebb említettük, a találmány szerinti eljárással előállított, differenciálódott, immortalizált keratinocita és melanocita sejtvonalak olyan javított tulajdonságokat hordoznak, amelyek e sejtvonalakat alkalmassá teszik a differenciálódott emberi bőrsejteket igénylő vizsgálati eljárásokban történő felhasználásra. Közelebbről, ezek a sejtvonalak számos passzálás után is olyan proteineket expresszálnak, amelyek a normális, differenciálódott melanocitákra és keratinocitákra jellemzők.
Például ha a találmány szerinti eljárással előállított, immortalizált keratinocitákat „Western-blof-analízissel és reverz transzkriptázos polimeráz-láncreakcióval (RT-PCR) vizsgáljuk, a normális keratinocitákéhoz hasonló ha nem azonos - citokróm p450 (CYP450) profilt mutatnak. Közelebbről, a találmány szerinti immortalizált keratinociták expresszálják a CYP450-1A1-et, CYP450-2C-t, CYP450-2E1-et és CYP450-3A5-öt, azonban nem expresszálják a CYP450-1 A2-t, CYP450-2A6-ot, CYP450-2B6-ot és CYP450-2D6-ot. Ez a CYP450-profil megegyezik a normális keratinocitákéval. Első alkalommal sikerült bebizonyítani, hogy a normális és az immortalizált keratinociták expresszálják CYP450-3A5-öt, a CYP450-3A4-et azonban nem. Ezenfelül, a találmány szerinti eljárással előállított, immortalizált keratinocitákról - differenciálódási markerekre specifikus antitestek alkalmazásával végzett vizsgálatban - bebizonyosodott, hogy számos passzálás után is expresszálnak egyéb differenciálódási proteineket. Közelebbről, a találmány szerinti sejtvonalak még sok (például 10 vagy jóval több) passzálás után is expresszálnak K1/10 keratinokat, K14-keratint, involucrint, filaggrint és loricrint.
A találmány szerinti immortalizált keratinociták és melanociták a normális melanocitákra és keratinocitákra jellemző módon vesznek fel exogén esszenciális zsírsavakat (EFA), és az ilyen zsírasavak deszaturálását és lánchosszabbítását szintén a normális sejtekhez igen hasonló módon végzik.
Ezen túlmenően, ahogy azt a későbbiekben részletesen leírjuk, a találmány szerinti immortalizált keratinociták forbol-észterekkel végzett kezelés hatására a normális keratinocitákhoz hasonlóan TNFa-t és I. típusú kollagenázt (amely egy gyulladásközvetítő anyag) expresszálnak. A találmány szerinti immortalizált keratinociták a celluláris oxidációban szerepet játszó szuperoxid-dizmutázt is a normális, differenciálódott keratinocitákhoz hasonlóan expresszálják.
A találmány szerinti eljárással előállított, immortalizált melanociták melanogenezist indukáló szerekkel (például teofillinnel vagy tirozinnal) és melanogenezisinhibitorokkal [kojsav („kojic acid”)] kezelve hasonlóan reagálnak, mint a normális melanociták.
A találmány szerinti immortalizált keratinociták és melanociták a felsorolt tulajdonságoknak köszönhetően alkalmasak immunológiai, farmakológiai, valamint foto- és kemotoxikológiai bőrreakció tesztekben történő felhasználásra.
Például a találmány szerinti immortalizált keratinocita és melanocita sejtvonalak és primer melanociták és keratinociták differenciálódott bőrsejteket igénylő vizsgálati eljárásokban alkalmazhatók, így például a rekonstruált bőr gátfunkciójának (elszarusodásának) vizsgálati eljárásában; a differenciálódott keratinociták anyagcsere-vizsgálataiban (zsírsav-anyagcsere, antioxidáns anyagcsere); az ultraibolya sugárzás bőrsejtekre vonatkozó hatásainak vizsgálati eljárásaiban; a potenciális bőrirritáló és érzékenyítő anyagok bőrsejtekre vonatkozó hatásainak vizsgálati eljárásaiban; a vegyületek melanintermelésre vonatkozó hatásait mérő vizsgálatokban; lipidanyagcsere vizsgálatokban; xenobiotikumokkal (például kozmetikai olajokkal, feltételezhetően védőhatású vegyületekkel, például fényvédő anyagokkal) végzett helyi kezelés hatásának vizsgálatában; bőrgyulladás- és bőrirritációs vizsgálatokban stb.
A találmány szerinti eljárással előállított immortalizált keratinocita és melanocita sejtvonalak, valamint primer melanociták és keratinociták előnyösen alkalmazhatók potenciálisan rákellenes vegyületek és bőrbetegségek kezelésére alkalmas vegyületek tesztelésére. Az ilyen eljárások során a sejtvonalat vagy a primer sejteket adott időtartamban a kérdéses vegyülettel kezeljük, majd megállapítjuk, hogy indukálnak-e zavaró hatásokat, például genotoxicitást, DNS-adduktumok képződését, mutagenezist, sejttranszformációt, illetve citotoxicitást.
A találmány szerinti melanocita és keratinocita sejtvonalak alkalmasak rekombináns proteinek, például humán proteinek és polipeptidek expresszáltatására, továbbá RNS és DNS előállítására.
HU 226 195 Β1
Ezenfelül, a találmány szerinti immortalizált sejtvonalak potenciálisan ex vivő génterápiára is alkalmazhatók. A találmány szerinti sejtvonalak hatásos eszközként alkalmazhatók a genetikai célba juttatásra („targeting”) és olyan, génsebészeti módszerekkel kezelt sej- 5 tek kifejlesztésére, amelyek kívánt (például terápiás felhasználásra vagy sejttoxicitási/mutagenitási vizsgálatokra alkalmas) géntermékeket expresszálnak. Ezen túlmenően, mivel a találmány szerinti sejtvonalak nagyon hasonlítanak a normális bőrsejtekre, bioszenziti- 10 vitási vizsgálatokra is alkalmazhatók.
A találmány szerinti eljárással előállított primer keratinociták és melanociták, mivel előállításuk szérummentes feltételek között történt, génterápiás célokra is hasznosak. Közelebbről, mivel ezek a sejtek nem 15 érintkeztek vérszérummal, például szarvasmarha vagy más állati szérummal (kivéve a vírusfertőzést és a folyékony nitrogénben történő tárolást), kevésbé vannak kitéve vírusok vagy más patogén ágensek okozta esetleges szennyeződésnek, s ez minimálisra csökkenti annak kockázatát, hogy ezek a sejtek a génterápia során patogén vagy fertőző faktorokat juttatnának át. Az ilyen ex vivő génterápiák olyan betegségek kezelésére hatásosak, mint az epidermolysis bullosa (keratinmutációs rendellenesség), a vitiligo (a melaninszintézis- 25 ben szerepet játszó gének rendellenessége), karcinómák és melanómák, allergiás betegségek, valamint gyulladással kapcsolatos rendellenességek. A terápiás kezelést illetően a szennyezés potenciális forrása a szarvasmarha-hipofíziskivonat, a szarvasmarha-inzu- 30 lin, a szarvasmarha-kollagén, a szarvasmarha-szérumalbumin vagy humán fibronektin, illetve a humán transzferrin.
A találmány szerinti immortalizált melanocita és keratinocita sejtvonalak, valamint a primer melanociták 35 és keratinociták a fentieken kívül DNS-mutagenezises vizsgálati eljárásokban, bőrmutegének szkrínelési eljárásaiban, kromoszómakárosító anyagok azonosítási vizsgálataiban, malignáns transzformációs vizsgálatokban, celluláris biokémiai vizsgálatokban (például 40 CYP450-aktiválási vizsgálatban), a gyulladásos és allergiás reakciókban szerepet játszó vegyületek és készítmények (például esszenciális zsírsavkoktél) tesztelésében, (gyulladással összefüggő) kollagenázaktiválási vizsgálatokban (beleértve a TNFa- és interleukindetektálást) alkalmazhatók.
A találmány szerinti primer keratinociták és melanociták egy jelentős alkalmazási területe - hozzáférhetőségüknek és előállítási eljárásuknak köszönhetően - a bőrátültetés. Mivel e primer keratinociták és melanociták előállítása szérummentes feltételek között történik, kevésbé vannak kitéve patogén (például vírusok) és fertőző ágensek okozta esetleges szennyeződésnek, sőt, mivel ezek a melanociták és keratinociták autológ gazdaszervezetből (például nagy sebbel rendelkező páciensből) származnak, alkalmazásukkal az átültetett bőr kilökődésének vagy más immunológiai reakció kockázata, illetve a fertőzés veszélye minimálisra csökkenthető.
A találmány szerinti eljárással előállított specifikus immortalizált keratinocita sejtvonalak példái az FK2-NR, DK2-NR és DK3-NR, melyeket a „DSMDeutsche Sammlung von Mikroorganismen Und Zell20 Kulturen GmbH”-nál (Mascheroder Weg 1b D-38124 Branschweig, Németország) 1995. október 5-én DSM ACC2240, DSM ACC2238, illetve DSM ACC2239 deponálási számon helyeztünk letétbe. A találmány szerinti eljárással előállított specifikus immortalizált melanocita sejtvonalak példája a DM2-NR, amelyet 1996 december 11-én a Pasteur Intézetnél (25 rue de Docteur Roux 75724, Párizs, Franciaország) CNCM 1-1796 deponálási számon helyeztünk letétbe. A deponálásokat a Budapesti Szerződés értelmében végeztük. A sejtvonalak hozzáférhetőségével kapcsolatos korlátozásainkat visszavonhatatlanul megszüntetjük, amennyiben jelen bejelentésünkre - vagy annak elsőbbségét igénylő más bejelentésünkre - szabadalmat kapunk.
A találmány szerinti megoldás egyéb jellemzőit a kísérleti példákon keresztül mutatjuk be. A példákat a találmány szerinti megoldás szemléltetése, és nem az oltalmi kör korlátozása céljából írjuk le.
1. példa
A tenyészetté alakított bőrsejtek karakterizálása
Az 1. táblázatban a vírusfertőzéshez előkezelt bőrmintákat soroljuk fel. Az immortalizálásra a legjobb szaporodást mutató izolált keratinocitákat alkalmaztuk.
1. táblázat
NR-3-tápközegben sejtizolálásra alkalmazott bőrminták
Szövet eredete Sejttörzs Kor Nem Sejtszaporodás1
Comb OS1 36 nő ++
Comb OS2 68 nő -
Comb OS3 51 nő +
Szemhéj EL1 46 nő +
Szemhéj EL2 49 nő +
Has Thorl 58 nő -
Preputium FK1-NR 5 ffi +++
HU 226 195 Β1
1. táblázat (folytatás)
Szövet eredete Sejttörzs Kor Nem Sejtszaporodás1
Preputium FKO-NR 13 ffi ++++
Has GKO-NR 26 nő +++
Emlő DKO-NR 29 nő +++
1 A sejteket tripszin/EDTA (0,05%/0,01 %) oldatban összegyűjtöttük, és hemocitométer alkalmazásával számláltuk. Az eredményeket három mérés átlagaként kaptuk.
Az FKO-NR, GKO-NR és DKO-NR bőrmintából humán fibroblasztokat izoláltunk. A dermális és epidermális kompartment elválasztása után a dermist 0,2 *0,2 mm-es darabokra vágtuk, 6 cm-es csészében szérummal fixáltuk, majd 2-4 óra elteltével Dulbeccoféle minimál esszenciális tápközeget (DMEM, 10% magzati borjúszérum) adtunk hozzájuk. Az így kapott explantátumtenyészetet addig inkubáltuk, amíg a fibroblasztok kinövése láthatóvá nem vált. A konfluens fibroblaszttenyészeteket szétosztottuk, és lefagyasztott törzseket hoztunk létre.
2. példa
1) A karatinociták szaporodásának jellemzése szérummentes tápközegben
Primer sejttenyészeteket módosított MCDB153tápközegben [Boyce és munkatársai: J. Tissue Cult. Meth. 9, 83 (1985); és Pittlekow és munkatársai: J. Invest. Dermatol. 86, 410 (1986)] és NR-3-tápközegben szaporítottunk. A legjobb sejtszaporodást az NR-3tápközegben figyeltük meg (1. ábra). A teljes mértékben definiált NR-3-tápközegben (szarvasmarha-hipofíziskivonat nélküli NR-3-tápközeg) jobb szaporodást ta15 pasztaltunk, mint a szarvasmarha-hipofíziskivonat nélküli MCDB153-tápközegben.
Az 1. ábrán az NR-3-tápközegben és az epinefrinnel kiegészített MCDB153-tápközegben (keratinocitaszaporító tápközeg) hat nap elteltével megfigyelt sejtszaporo20 dást mutatjuk be. A keratinocitákat tripszin/EDTA (0,05%/0,01%) oldatban gyűjtöttük össze, és hemocitométer alkalmazásával számláltuk. Az eredményeket három mérés átlagaként - az 1. ábrán mutatjuk be.
2) A tenyésztőcsészék bevonásának hatása a sejtek tapadására és a sejtszaporodásra
Azt tapasztaltuk, hogy a tenyésztőcsészék megfelelő bevonattal történő ellátása serkenti a normális keratinociták tapadását és szaporodását. A 2. táblázatban bemutatott eredmények a keratinociták bevont, illetve bevonat nélküli csészékben megfigyelhető szaporodásának összehasonlítását össze. NR-3-tápközeget tartalmazó 3,5 cm-es csészékbe egyenként 100 000 keratinocitát helyeztünk.
2. táblázat
A felületi bevonat hatása a sejtek tapadására
Letapadt sejtek száma az inkubálás megkezdése után 24 órával1 Sejtszám 4 nap után2
bevonat nélkül (%) bevonattal (%) bevonat nélkül bevonattal
DKO-NR izolálás után 21,4 68,2 44 600 143 800
DKO-NR 2. passzálás 73,8 86,8 175 500 282 300
1 A letapadt sejtek száma osztva a tenyészetbe helyezett sejtek számával. A letapadt sejteket tripszin/EDTA (0,05%/0,01%) oldatban gyűjtöttük össze, és hemocitométer alkalmazásával számláltuk.
2 A sejteket tripszin/EDTA (0,05%/0,01%) oldatban összegyűjtöttük, és hemocitométer alkalmazásával számláltuk. Az eredmények három mérés átlagát tükrözik.
3. példa
1) Keratinociták immortalízálása 55
Az 1. példában leírt bőrmintákból előállított - különálló melanocitákat, keratinocitákat és fibroblasztokat tartalmazó - sejtszuszpenziót a találmány szerinti NR-3-tápközegben tenyésztettük. A sejteket - korábban bronchiális sejtek esetében alkalmazott „bevonó- 60 koktéllal” [Lechner és munkatársai: J. Tiss. Cult. Meth. 9, 43 (1985)] - összefüggően bevont tenyésztőcsészékbe helyeztük. Amikor a sejtek a primer sejttenyészetben kellőképpen konfluens állapotot értek el, a sejteket 4 percig 0,025% tripszint és 0,01% EDTA-t tartalmazó oldattal kezeltük. E kezelés hatására a melanociták különváltak a keratinocitáktól, és e két sejttí10
HU 226 195 Β1
3. táblázat
Az NR-3-tápközegben szaporított keratinocita sejtvonalak populáció-kétszereződési ideje (PDT) pust szétválasztva összegyűjtöttük. A primer keratinocitákat szérummentes NR-3-tápközegben - a fentebb leírt bevonattal (amely a keratinociták szaporodását serkenti, a melanocitákét azonban nem) ellátott csészék alkalmazásával - kívánt sejtszám eléréséig te- 5 nyésztettük, majd immortalizáltuk. A keratinociták immortalizálását a pLXSHD+SV40(#328) SV40 retrovirális konstrukció alkalmazásával hajtottuk végre. Ez a konstrukció lehetővé teszi az SV40 T-antigénjének expresszióját [Id. Pfeiffer és munkatársai: Meth. Cell. 10 Sci. 17, 83 (1995); azzal a különbséggel, hogy a vírust 10% magzati borjúszérumot tartalmazó DMEM-tápközegben növesztett csomagolósejtvonalból gyűjtöttük].
Az infekció során PC-1 -tápközeget [Id. Pfeifer és munkatársai: Meth. Cell. Sci. 14, 83 (1995)] alkalmaz- 15 tünk. Az immortalizálás után az immortalizált sejtvonalakat - előzetesen bevonattal ellátott tenyésztőcsészéken - NR-2 vagy NR-3 proliferációs tápközegbe helyeztük át. A kívánt sejtszám elérése után a sejteket differenciáló tápközegbe tettük, amely alkalmas 20 a normális és immortalizált keratinociták tenyésztésére.
2) Az immortalizált keratinociták proliferációja számos passzálás során
Az immortalizált keratinocitákról bebizonyítottuk, hogy számos passzálás során javított sejtszaporodást mutatnak. Az eredményeket a 3. táblázatban mutatjuk be. A kísérlet során megbecsültük a populáció megkétszereződési idejét („population doubling time”; PDT: a logaritmikus szaporodási fázisban a sejtpopuláció egyszeri megkétszereződéséhez szükséges idő). A keratinocitákat 0,05% tripszint és 0,01% EDTA-t tartalmazó oldatban összegyűjtöttük, majd hemocitométer alkalmazásával megszámláltuk. Az eredményeket három mérés átlagaként adjuk meg.
Keratinociták Passzálás száma PDT (óra) Krízis passzáláskor*
FK2-NR 15 48,00 16-18
FK2-NR 39 21,16 16-18
DK1-NR 12 23,20 25-30
DK1-NR 15 31,05 25-30
DK1-NR 31 32,99 25-30
DK2-NR 15 22,26 20-21
DK3-NR 40 24,34 -
* Krízis: csökkent proliferációs sebességű sejtszaporodás.
3) CYP450-expresszió immortalizált humán keratinocita sejtvonalakban A CYP4501A1, CYP4501A2, CYP4503A5, CYP4502E1, CYP4502B6, CYP4502A6 és CYP4502D6 expresszióját „Westem-blot”-analízissel (protein expresszió) és reverz transzkriptázos polimeráz-láncreakcióval (mRNS-expresszió) normál és immortalizált keratinocitákban vizsgáltuk (lásd 4. táblázat). Az immortalizált keratinocitákban az expresszálódott CYP450-összetétel hasonló a normál keratinocitákban megfigyelhetőhöz, az expresszió sebessége azonban valamivel kisebb. Ezzel szemben, a DK2-NR-sejtvonal a CYP450-expresszió majdnem normális sebességű. A reverz transzkriptázos polimeráz-láncreakciót a CYP450-re specifikus láncindítók alkalmazásával végeztük [Macé és munkatársai, előkészületben].
4. táblázat
CYP-mRNS-expresszió humán keratinocitákban
Keratinociták Passzálás száma 1A1a 2Cb 2E1 3A5 1A2, 2A6, 2B6, 2D6
FK0-NR 4 + + + + -
FK2-NR 36 + + + + -
DK0-NR 3 + + + + -
DK1-NR 31 + + + + -
DK2-NR 13 + + + + -
a Az immortalizált sejtvonalakban az 1 A1-mRNS-expresszió benz[a]pirénnel (1,5 μΜ; Amersham Inc.) végzett indukciót követően fokozódott. Ez a fokozódás hasonló a normális sejtekben megfigyelhetőhöz. b2C17/19és 2C18.
4) CYP450-lndukáló anyagokra adott reakció A vizsgált sejtvonalak még számos passzálás után is hasonló módon reagálnak a benz[a]pirén nevű 60
CYP450-indukáló vegyületre, mint a nem immortalizált sejtek (lásd 5. táblázat). Ez az indukció a T-Ag-vel immortalizált keratinocitákra nincs leírva.
HU 226 195 Β1
5. táblázat
7-etoxi-resorufin-O-deetiláz (ERoD; Sigma Inc.) aktivitás benzpirénnel (B[a]P)* végzett indukció után humán keratinocitákban
6. táblázat
A keratinocitaspecifikus proteinek detektálására alkalmazott antitestek
Keratinociták Passzálás száma EROD (pmol/mg protein)
FKO-NR 2 kimutathatatlan
FK0-NR+B[a]P 2 0,58
FK2-NR 37 0,01
FK2-NR+B[a]P 37 1,05
DKO-NR 1 0,02
DK0-NR+B[a]P 1 1,03
DK1-NR 32 0,04
DK1-NR+B[a]P 32 1,78
DK2-NR 14 0,02
DK2-NR+B[aJP 14 0,69
DK3-NR 39 0,01
DK3-NR+B[a]P 39 1,86
* A keratinocitákat 24 órán át 1,5 μΜ B[a]P jelenlétében inkubáltuk. Az EROD-aktivitást 37 °C-on végzett inkubálás után a resorufin termék fluoreszcens detektálása alapján mértük (560 nm gerjesztés, 586 nm emisszió).
5) Sejtdifferenciáció
Specifikus antitestek alkalmazásával differenciálódási markereket analizáltunk. A specifikus antitesteket a 6. táblázatban soroljuk fel. A legnagyobb differenciálódási képességet a DK2-NR- és DK1-NR-klónban figyeltük meg (7. és 8. táblázat).
Specifitás Antitest Forrás/hivatkozás
T-Ag Ab-2 Oncogene, Manhassat, NY
Involucrin BTI BT-576 bti, Stoughton, MA
Filaggrin Filaggrin Paesel+Lorei, Frankfurt, Németország
Loricrin aAg 73 Magnaldo és munkatársai (1992)
Vimentin V9 Dako, Glostrup, Dánia
Keratin K4 6B10 Sigma, St. Louis, USA
Keratin K7 LDS-68 Sigma, St. Louis, USA
Keratin K8 M20 Sigma, St. Louis, USA
Keratin K10/1 K8.60 Sigma, St. Louis, USA
Keratin K13 KS-1A3 Sigma, St. Louis, USA
Keratin K14 CKB1 Sigma, St. Louis, USA
Keratin K17 CK-E3 Sigma, St. Louis, USA
Keratin K18 CY-90 Sigma, St. Louis, USA
Keratin K19 A53-B/A2 Sigma, St. Louis, USA
7. táblázat
A T-Ag és az epidermális keratinociták differenciálódási termékeinek detektálása
Keratinocita Passzálás száma T-Ag Involucrin Filaggrin Loricrin Vimentin
FKO-NR 2 - +++ ++ + ++
FK2-NR 25 +++ ++ ++ + ++
DKO-NR 2 - +++ +++ ++ +++
DK1-NR 13 +++ +++ ++ ++ ++
DK1-NR 30 +++ ++ ++ + ++
DK2-NR 11 +++ +++ +++ ++ +++
DK3-NR 36 +++ ++ ++ + ++
8. táblázat
Keratinok (K) kimutatása a keratinocitákban
Keratinocita Passzálás száma K4 K7 K8 K10/1 K13 K14 K17 K18 K19
FKO-NR 2 ++ - ++ ++ +++ ++ ++ + +
FK2-NR 25 +++ - ++ ++ +++ ++ ++ + +
HU 226 195 Β1
8. táblázat (folytatás)
Keratinocita Passzálás száma K4 K7 K8 K10/1 K13 K14 K17 K18 K19
DKO-NR 2 ++ - - +++ +++ +++ +++ +
DK1-NR 13 ++ - ++ +++ +++ ++ ++ + +
DK1-NR 30 + - ++ ++ ++ ++ + ++ +
DK2-NR 11 +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++
DK3-NR 36 + - +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++
Módszer (a 7. és 8. táblázathoz): az üreges tárgylemezeken szaporított keratinocitákat - tiszta metanolban végzett fixálást követően - a 6. táblázatban felsorolt antitestekkel jelöltük.
+++: legnagyobb proteinkoncentráció (fluoreszcens mikroszkóppal végzett vizsgálat alapján).
-: proteinexpresszió hiánya.
6) Glutation-S-transzferáz expressziőja A glutation-S-transzferáz (GST) II. fázisú enzimet „Northern-blot”-analízÍssel és „Western-blot”-analízissei vizsgáltuk. Valamennyi keratinocita sejtvonal nagy mennyiségben expresszálja a GSTn mRNS-ét, a GSTa-ét és a GSTp-ét azonban nem (9. táblázat; „Northern-blot”). A vizsgált sejtvonalakban a GSTa, GSTp és GSTk proteinexpressziós profilja hasonló volt a normális keratinociták profiljához.
9. táblázat
A glutation-S-transzferáz (GST) proteinexpressziója
Keratinoci- ták GSTa θετμ GSTrc
FK2-NR - - +++
DKO-NR - - +++
DK1-NR - - +++
DK2-NR - - +++
DK3-NR - - +++
7) Esszenciális zsírsav (EFA) metabolizmus Keratinocitákban a hozzáadott esszenciális zsírsav deszaturációjának és elongációjának vizsgálata és összehasonlítása érdekében immortalizált keratinocitákat (DK1-NR, FK2-NR) és normális keratinocitákat linolsawal (LA; 15 μΜ) és α-linolénsawal (LN; 15 μΜ) kezeltünk. Ezekhez a kísérletekhez az EFA-deficiens NR-2-tápközeget (Biofluids Inc.) alkalmaztuk. A sejttenyészetek kezelését konfluens állapot elérése és az NR-2-tápközeg nagy (1,5 mM) kalciumkoncentrációra történő beállítása után kezdtük meg. A sejteket négy napig kezeltük (a tápközeget két nap elteltével kicseréltük).
Az EFA-analízist a foszfolipidek vékonyréteg-kromatográfiával végzett kivonásával és elválasztásával, 60 illetve a zsírsav-metil-észterek gáz-folyadékkromatográfiával végzett mennyiségi meghatározásával végeztük. Ezzel a kísérlettel demonstrálható a linolsav, illetve az α-linolénsav deszaturációs és lánchosszab25 bításos termékeinek (20:4n-6 és 22:4n-6, illetve 20:5n-3, 22:5n-3 és 22:6n-3) képződése. A kapott metabolikus profil összhangban áll a normális keratinocitákéval.
8) Karíotipizálás
Valamennyi sejtvonal hipodiploid volt, azzal, hogy a legtöbb kromoszómaszám diploid tartományba tartozott (kivéve a DK2-NR sejtvonalat, amelynek kromoszómaszámai hipotetraploid tartományba tartoztak). A vizsgált sejtvonalaktól eltérő sejteket a tenyészetekben nem detektáltunk. Ez az eredmény alátámasztja a sejtvonalak tisztaságát és az egyéb forrásokból származó celluláris szennyeződés hiányát.
9) In vivő karakterizálás
Az immortalizált keratinociták tumorkeltő hatását csupasz egereknek adott szubkután injekcióval (1-2 millió keratinocita) határoztuk meg. A tesztelt keratinocita-vonalak (DK2-NR, DK3-NR, FK2-NR) csupasz egerekben nem voltak tumorkeltőek (négy hónapos inkubálással). Ezzel szemben, a DK3-NR vonal öt hónapos inkubálást követően tíz állat közül hatban tumorkeltőnek bizonyult.
10) Bőrirritáló ágensekre adott reakció
A TNFa „stresszgén indukcióját forbol-12-mirisz50 tát-13-acetáttal (PMA), nátrium-dodecil-szulfáttal (SDS), dimetil-szulfoxiddal (DMSO), interleukin-1 βval (IL—1β) és ultraibolya-B (UV-B) sugárzással végzett kezelést követően „Northern-blot”-analízíssel és biológiai eljárásokkal vizsgáltuk (10. táblázat). A kera55 tinocita-vonalak számos passzálás után is reagáltak a PMA-ra és az UV-B-re, és expresszálták a TNFa-proteint.
Az immortalizált keratinociták forbol-észterekkel (PMA) végzett kezelése után az I. típusú kollagenáz expressziójának fokozódását tapasztaltuk.
HU 226 195 Β1
10. táblázat
A keratinociták TNFa-szekréciója bőrirritáló ágensekkel végzett indukció után (Proteinaktivitási vizsgálat: 3H-timidin beépülése TNFa-szenzitív sejtekbe*)
TNFct-szekréció az alábbi irritátorok hatására
Keratinociták passzálás PMA SDS DMSO ΙΙ_-1β UV-B
DKO-NR 3 + - - nt +
DK1-NR 20-22 + + - + +
DK1-NR 32 + - - nt +
DK2-NR 16 + - - - +
DK2-NR 31 + - - nt +
nt: nem teszteltük;
*: szenzitív sejtekként a WEHI 164 egér fibrosarcoma sejtvonal 1.14 kiónját (ATCC) alkalmaztuk.
11) Organotípusos tenyészetek A humán keratinocitákat organotípusos körülmények között is tenyésztettük (a keratinocitákat kollagéngélen, levegőn, táplálósejtekkel együtt szaporítottuk). A normális keratinocitákhoz képest valamennyi keratinocita sejtvonal hiperproliferatív morfológiát mutatott. Ezeket a kísérleteket szérumot tartalmazó tenyésztő tápközegben végeztük. A hiperproliferatív sejtszaporodás szérummentes feltételek mellett csökkenthető; ilyenkor a sejteket nagy (1,5 mM) kalciumkoncentrációjú NR-2-tápközegben, műanyag tenyésztőcsészékben, kollagéngél és táplálósejtek alkalmazása nélkül szaporítjuk.
4. példa
1) Melanociták immortalizálása
Az 1. példában leírt DKO-NR bőrmintából előállított sejtszuszpenziót (amely disszociált melanocitákat, keratinocitákat és fibroblasztokat tartalmaz) a találmány szerinti NR-3-tápközegben tenyésztettük. A sejteket korábban bronchiális sejtek esetében alkalmazott „bevonókoktéllal [Lechner és munkatársai: J. Tiss. Cult. Meth. 9, 43 (1985)] - összefüggően bevont tenyésztőcsészékbe helyeztük. Amikor a sejtek a primer sejttenyészetben kellőképpen konfluens állapotot értek el, a sejteket 4 percig 0,025% tripszint és 0,01% EDTA-t tartalmazó oldattal kezeltük. E kezelés hatására a melanociták különváltak a keratinocitáktól, és e két sejttípust szétválasztva összegyűjtöttük. Ilyenformán, a primer melanocitákat és keratinocitákat ebben a stádiumban különítettük el. Az összegyűjtött primer melanocitákat - a keratinociták szaporodását specifikusan gátló - szérummentes NR-4-tápközegbe helyeztük, majd a fentebb leírt bevonattal ellátott tenyésztőcsészékben tenyésztettük, és a kívánt sejtszám elérése után immortalizáltuk. A melanociták immortalizálását a pLXSHD+SV40(#328) SV40 retrovirális konstrukció alkalmazásával hajtottuk végre. Ez a konstrukció lehetővé teszi az SV40 T-antigénjének expresszióját [Id. Pfeiffer és munkatársai: Meth. Cell. Sci. 17, 83 (1995); azzal a különbséggel, hogy a vírust 10% magzati borjúszérumot tartalmazó DMEM-tápközegben növesztett csomagolósejtvonalból gyűjtöttük]. Az infekció során szérummentes PC-1-tápközeget [Id. Pfeifer és munkatársai: Meth. Cell. Sci. 14, 83 (1995)] alkalmaztunk. Az immortalizálás után az immortalizált sejtvonalakat M2 proliferációs tápközegbe és differenciáló tápközegbe (DMEM/F12 tápközeg, Biofluids, No 148.; M. Olssen, Uppsala, Svédország).
2) A T-Ag-t expresszáló humán melanociták karakterizálása
A találmány szerinti eljárással előállított melanociták (elsősorban a DM2-NR) meianinnal összefüggő proteinjeinek expresszióját a normális melanociták proteinjeinek expressziójával hasonlítottuk össze. Kimutattuk, hogy az immortalizált sejtek a normális sejtekhez hasonlóan, de kisebb mennyiségben expresszálják a melanomával összefüggő antigént („melanoma associated antigén”; MAA) és a HMB45-öt.
3) A melaninszintézis indukciója
A T-Ag-t expresszáló melanocita sejtvonalak (különösen a DM2-NR) melanogenezisét a normális melanocitákéval hasonlítottuk össze. A melanocitákat tirozinnal és teofillinnel (melanogenezisindukáló szerek) és kojsawal (melanogenezisinhibitor) kezeltük. A melanocitavonalak (különösen a DM2-NR) hasonlóan reagáltak a melanogenezis-modulátorra, mint a normális sejtek. A melanogenezis indukciója/gátlása dózisfüggőnek bizonyult.
5. példa
Az 1. példában leírt DKO-NR törzset a HPV16-alapú retrovirális pLXSHD+E6/E7-konstrukcióval (lásd 2/B. ábra) a fentiek szerint immortalizáltuk. Több folytonos keratinocitavonalat szelektáltunk. E vonalak differenciálódási termékekre (citokeratinok, GST, TNFa, involucrin, filaggrin, loricrin, vimentin) vonatkozó analízisének eredményei hasonlóak a DK2-NR és DK3-NR sejtvonal eredményeivel.
6. példa
A találmány szerinti NR-3-tápközeg összetételét több más, találmány szerinti szérummentes tápközeg (NR—1, NR-2 és NR-4) összetételével hasonlítottuk össze.
HU 226 195 Β1
1) Az NR-1 -tápközeg összetétele
Aminosavak Koncentráció (mg/l)
L-alanin 9,0000
L-arginin, HCI 316,0000
Aszparagin, H2O 15,0000
L-aszparaginsav 4,0000
L-cisztein, HCI, H2O 42,0000
L-glutaminsav 14,8000
Glutamin 877,0000
Glicin 7,6000
L-hisztidin, HCI, H2O 50,4000
L-izoleucin 98,4000
L-leucin 131,2000
L-lizin, HCI 36,6000
L-metionin 13,4000
L-fenil-alanin 14,9000
L-prolin 34,6000
L-szerin 126,2000
L-treonin 23,8000
L-triptofán 9,2000
L-tirozin 13,6000
L-valin 70,2000
Szervetlen sók Koncentráció (mg/l)
Ammónium-metavanadát [NH4VO3] 0,0006
Ammónium-molibdát [(NH4)6MO7O24-4H2O] 0,0010
Kalcium-klorid [CaCI2-2H2O] 16,2000
Réz(ll)-szulfát [CuSO4-5H2O] 0,0025
Vas(ll)-szulfát [FeSO4-7H2O] 1,4000
Magnézium-klorid [MgCI2 6H2O] 122,0000
Mangán-klorid [MnCI2-4H2O] 0,0002
Nikkel-szulfát [NiSO4-6H2O] 0,0003
Kálium-klorid [KCI] 112,0000
Nátrium-acetát 301,5000
Nátrium-hidrogén-karbonát [NaHCO3] 1088,0000
Nátrium-klorid [NaCI] 5200,0000
Dinátrium-hidrogén-foszfát [Na2HPO4-7H2O] 536,0000
Nátrium-piruvát 55,5000
Nátrium-szelenit [Na2SeO3] 0,0050
Nátrium-szillkát [Na2SiO3-9H2O] 0,1420
Ón-klorid [SnCI2-2H2O] 0,0001
Cink-szulfát [ZnSO4-7H2O] 0,5100
Vitaminok Koncentráció (mg/l)
d-biotin 0,0200
d-kalcium-pantotenát 0,2600
Kolin-klorid 28,0000
Ciano-kobalamin (B12) 0,4100
Folsav 0,7900
i-lnozitol 18,0000
Nikotin-amid (B3) 0,0400
Piridoxin (Β6Ή2Ο] 0,0600
Riboflavin (B2) 0,0400
Adenin 27,3000
Epidermális növekedési faktor (EGF, humán, rekombináns) 0,0010
Etanol-amin 0,0310
Glükóz 1080,0000
HEPES 6000,0000
Hidrokortizon 0,5000
Inzulin (szarvasmarha) 5,0000
Fenolvörös 1,2000
Foszfo-etanol-amin 0,0710
Putrescin-2HCI 0,1600
Tiamin-HCI 0,3400
Tioktasav 0,2100
Timidin 0,7300
Transzferrin (humán) 10,0000
Ozmolaritás 280-285 mOsm/kg
2) Az NR-2-tápközeg összetétele
Az NR-2-tápközeg összetétele megegyezik az NR-1-tápközegével, de tartalmaz még 35 mg/l szarvasmarha-hipofíziskivonatot (Biofluid Inc.), valamint antibiotikumokat (Gibco BRL, Life Technologies Inc.), így fungizont (0,15 mg/l), penicillint (10 000 egység/l) és sztreptomicint (10 mg/l).
3) Az NR-3-tápközeg összetétele
Az NR-3-tápközeg összetétele megegyezik az NR-2 összetételével, de 250 pg/l epinefrint (Biofluid Inc.) is tartalmaz.
4) Az NR-4-tápközeg összetétele
Megegyezik az NR-2 összetételével, azzal a különbséggel, hogy 3 pg/l bázikus fibroblaszt növekedési
HU 226 195 Β1 faktort ^FGF; Sigma Inc.) és 10 pg/l forbol-12-mirisztát-13-acetátot (PMA; C.C.R. Inc.) is tartalmaz.
Bár a találmányt előnyös megvalósítási módjain keresztül szemléltettük, a találmány szerinti megoldás egyéb megvalósítási módjai is kivitelezhetők. Ennek megfelelően, a találmány leírása, valamint a következő igénypontok tartalma nem korlátozódik az előnyös megvalósítási módok leírására.

Claims (29)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás emberi bőrsejtek - immortalizált keratinociták és melanociták előállítása céljából történő - immortalizálására, azzal jellemezve, hogy (i) emberi bőrszövetmintát veszünk;
    (ii) a bőrmintát in vitro tenyésztés céljára előkészítjük;
    (iii) az előkészített bőrmintából keratinocltákat és/vagy melanocitákat nyerünk ki, és az így kapott keratinocitákat és/vagy melanocitákat a sejtek tapadását és szaporodását elősegítő - fibronektint, I. típusú kollagént és szarvasmarha-szérumalbumint tartalmazó bevonattal ellátott tenyésztőcsészéken szérummentes szaporító tápközegbe helyezzük;
    (iv) a tápközeget a tenyésztett sejtek konfluens szaporodása optimalizálásának megfelelően cseréljük, miközben a tenyésztöcsészéken a bevonatot összefüggően tartjuk;
    (v) a keratinocitákat vagy melanocitákat - az említett bevonattal ellátott tenyésztőcsészéken - szérummentes szelektáló tápközegbe helyezzük át;
    (vi) a keratinocitákat vagy melanocitákat retrovirális konstrukcióval infektáljuk;
    (vii) az immortalizált keratinocitákat vagy melanocitákat - előzetesen a fenti bevonattal ellátott tenyésztőcsészéken - az immortalizált keratinociták, illetve melanociták proliferációját elősegítő proliferációs tápközegbe helyezzük át; és (viii) a proliferálódott keratinocitákat - előzetesen a fentiekhez hasonlóan bevont - tenyésztőcsészékben nagy kalciumkoncentrációjú, szérummentes differenciáló tápközegbe tesszük át.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy retrovirális konstrukcióként a pLXSHD+SV40(328) SV40 konstrukciót vagy a pLXSHD+E6/E7 HPV16konstrukciót alkalmazzuk.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (iii) lépésben szérummentes tápközegként a 11. táblázatban megadott vegyületekböl álló és szarvasmarha-hipofíziskivonatot (35 mg/ml), fungizont (0,25 mg/l), penicillint (10 000 egység/l) és sztreptomicint (10 mg/l) tartalmazó, és epinefrinnel (250 pg/l) kiegészített NR-3-tápközeget alkalmazunk.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (v) lépésben szérummentes tápközegként a 3. igénypont szerinti NR-3- vagy a 11. táblázatban megadott vegyületekböl álló és szarvasmarha-hipofíziskivonatot (35 mg/ml), fungizont (0,25 mg/l), penicillint (10 000 egység/l) és sztreptomicint (10 mg/l) tartalmazó, és pFGF-fel (3 pg/l) és forbol-12-mirisztát-actetáttal (10 pg/l) kiegészített NR-4-tápközeget alkalmazunk.
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (vii) lépésben szaporító tápközegként a 11. táblázatban megadott vegyületekböl álló és szarvasmarha-hipofíziskivonatot (35 mg/ml), fungizont (0,25 mg/l), penicillint (10 000 egység/l) és sztreptomicint (10 mg/l) tartalmazó NR-2-tápközeget vagy a 3. igénypont szerinti NR-3-tápközeget, és a melanociták esetében M2-tápközeget alkalmazunk.
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (viii) lépésben differenciáló tápközegként NR-2-tápközeget vagy módosított MCDB-153-tápközeget alkalmazunk, amelynek kalciumkoncentrációja legalább 1,5 mM.
  7. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállítható immortalizált emberi keratinocita sejtvonal vagy melanocita sejtvonal.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti immortalizált keratinocita sejtvonal, azzal jellemezve, hogy keratin típusú fehérjéket expresszál lényegében azonos mintázattal, mint amely a normál differenciálódott keratinocitákra jellemző.
  9. 9. A 8. igénypont szerinti immortalizált keratinocita sejtvonal, amely keratinproteinekként K1/10-keratint, K14-keratint, a normális, differenciálódott keratinociták által expresszált egyéb proteinekként pedig involucrint, filaggrint és loricrint expresszál.
  10. 10. A 7. igénypont szerinti immortalizált keratinocita sejtvonal, amelynek CYP450-profilja azonos vagy lényegében azonos a normális, differenciálódott keratinociták CYP450-profiljával.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti immortalizált keratinocita sejtvonal, amely CYP450-1A1-et, CYP450-2C-t, CYP450-2E1-et és CYP450-3A5-öt expresszál, CYP450-1A2-t, CYP450-2A6-ot, CYP450-2B6-ot és CYP450-2D6-ot azonban nem.
  12. 12. Humán bőrsejtvonal, amely a DK2-NR (DSM ACC2238), a DK3-NR (DSM ACC2239), az FK2-NR (DSM ACC2240) keratinocitavonal és a DM2-NR melanocitavonal (CNCM 1-1796) bármelyike.
  13. 13. A 7. igénypont szerinti immortalizált keratinocita sejtvonal, amely GST-a, GST-μ és GST-π glutation-Stranszferázokat kódoló mRNS-t expresszál.
  14. 14. A 7. igénypont szerinti Immortalizált keratinocita sejtvonal, amely organotípusos tenyészetben, szérum és táplálósejtek hiányában tenyésztve nagymértékben rétegzett és polarizált - elszarusodott felső rétegeket tartalmazó - epitheliumot képez.
  15. 15. A 7. igénypont szerinti immortalizált keratinocita sejtvonal, amely forbol-észterekkel kezelve I. típusú kollagenázt és tumomekrózis-faktor-a-t (TNF-a) expresszál.
  16. 16. A 7. igénypont szerinti immortalizált keratinocita sejtvonal, amely az involucrin, filaggrin és loricrin fehérjék bármelyikét a normális keratinocitákra jellemző mintázattal lényegében megegyező módon expresszálja.
  17. 17. Szérummentes tenyésztő tápközeg az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti humán keratinociták és melanociták izolálására és előállítására, amely aminosavakat vagy aminosavsókat, szervetlen sókat, vita16
    HU 226 195 Β1 minokat, adenint, etanol-amint, glükózt, HEPES-puffert, fenolvöröst, putrescin-2HCI-ot, tiamin-HCI-ot, timidint, epidermális növekedési faktort, inzulint, hidrokortizont, foszfo-etanol-amint és szarvasmarha-hipofíziskivonatot tartalmaz, amely szarvasmarha-hipofíziskivonat tartalmaz tiooktasavat és transzferrint a 7. igénypont szerinti emberi keratinociták és melanociták izolálásához és előállításához szükséges mennyiségben.
  18. 18. A 17. igénypont szerinti tápközeg, amely a fentieken kívül epinefrint is tartalmaz.
  19. 19. A 18. igénypont szerinti tápközeg, amely a keratinociták szaporodásának serkentéséhez elégséges koncentrációjú epinefrint tartalmaz.
  20. 20. A 17. igénypont szerinti tápközeg, amely aminosavként L-alanin, L-arginin-HCI, L-aszparagin-H2O, L-aszparaginsav, L-cisztein-HCI-H2O, L-glutaminsav, glutamin, glicin, L-hisztidin-HCI-H2O, L-izoleucin, L-leucin, L-lizin-HCI, L-metionin, L-fenil-alanin, L-prolin, L-szerin, L-treonin, L-triptofán, L-tirozin, L-valin és ezek sói közül egyet vagy többet tartalmaz.
  21. 21. A 17. igénypont szerinti tápközeg, amely szervetlen sóként ammónium-metavanadát, ammóniummolibdát, kalcium-klorid, réz-szulfát, vas(lll)-szulfát, magnézium-klorid, mangán-klorid, nikkel-szulfát, kálium-klorid, nátrium-acetát, nátrium-hidrogén-karbonát, nátrium-klorid, dinátrium-hidrogén-foszfát, nátrium-piruvát, nátrium-szelenit, nátrium-szilikát, ón-klorid és cink-szulfát közül egyet vagy többet tartalmaz.
  22. 22. A 17. igénypont szerinti tápközeg, amely vitaminként d-biotin, d-kalcium-pantotenát, kolin-klorid, ciano-kobalamin, folsav, i-inozitol, nikotin-amid, piridoxin vagy riboflavin közül egyet vagy többet tartalmaz.
  23. 23. Szérummentes tápközeg immortalizált keratinociták és/vagy melanociták izolálására, előállítására és/vagy fenntartására, mely tápközeg a 4. vagy 5. igénypont szerinti NR-2-, NR-3- vagy NR-4-tápközeg.
  24. 24. Vizsgálati eljárás amely differenciálódott keratinociták és/vagy melanociták alkalmazásán alapul, azzal jellemezve, hogy az 7. igénypont szerinti keratinocitákat és/vagy melanocitákat alkalmazzuk.
  25. 25. A 24. igénypont szerinti vizsgálati eljárás, azzal jellemezve, hogy DK2-NR (DSM ACC2238), DK3-NR (DSM ACC2239) DM2-NR (CNCM 1-1796) vagy FK2-NR (DSM ACC2240) sejteket alkalmazunk.
  26. 26. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gyulladásvizsgálati eljárás.
  27. 27. Vizsgálati eljárás, amely primer melanociták vagy keratinociták alkalmazásán alapul, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont (iii) lépésében leírtak szerint kapott primer melanocitákat vagy keratinocitákat alkalmazunk.
  28. 28. A 27. igénypont szerinti vizsgálati eljárás azzal jellemezve, hogy a vizsgálati eljárás gyulladásvizsgálati eljárás.
  29. 29. Az 1. igénypont (iii) lépésében leírtak szerint kapott primer keratinociták vagy melanociták, bőrátültetési eljárásban történő alkalmazásra, amely eljárás szerint átültetett bőrszövetként az 1. igénypont (iii) lépésében leírtak szerint kapott primer keratinocitákat vagy melanocitákat alkalmazunk.
HU9903742A 1995-12-21 1996-12-19 Javított immortalizált humán bõrsejtvonalak és szérrummentes tápközeg elõállításukra HU226195B1 (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US57648395A 1995-12-21 1995-12-21
PCT/EP1996/005812 WO1997023602A1 (en) 1995-12-21 1996-12-19 Improved immortalized human skin cell lines and novel serum-free medium useful for the production thereof

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP9903742A2 HUP9903742A2 (hu) 2000-03-28
HUP9903742A3 HUP9903742A3 (en) 2000-10-30
HU226195B1 true HU226195B1 (hu) 2008-06-30

Family

ID=24304605

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9903742A HU226195B1 (hu) 1995-12-21 1996-12-19 Javított immortalizált humán bõrsejtvonalak és szérrummentes tápközeg elõállításukra

Country Status (23)

Country Link
US (2) US6423540B2 (hu)
EP (2) EP0780469B1 (hu)
JP (1) JP4404965B2 (hu)
KR (1) KR100455006B1 (hu)
CN (1) CN1154717C (hu)
AT (1) ATE199390T1 (hu)
AU (1) AU730222B2 (hu)
BR (1) BR9612256B1 (hu)
CA (1) CA2234118C (hu)
CZ (1) CZ297289B6 (hu)
DE (1) DE69611894T2 (hu)
DK (1) DK0780469T3 (hu)
ES (1) ES2155166T3 (hu)
GR (1) GR3035719T3 (hu)
HU (1) HU226195B1 (hu)
IL (1) IL124191A (hu)
NO (1) NO326190B1 (hu)
NZ (1) NZ325814A (hu)
PL (1) PL195108B1 (hu)
PT (1) PT780469E (hu)
RU (1) RU2215030C2 (hu)
SK (1) SK283314B6 (hu)
WO (1) WO1997023602A1 (hu)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SK283314B6 (sk) * 1995-12-21 2003-05-02 Soci�t� Des Produits Nestl� S. A. Imortalizovaná ľudská keratinocytová bunková línia a/alebo imortalizovaná melanocytová bunková línia, spôsob imortalizácie ľudských kožných buniek a bezsérové kultivačné prostredie na ich izoláciu a prípravu
JP4671504B2 (ja) * 1998-04-17 2011-04-20 ソシエテ・デ・プロデュイ・ネスレ・エス・アー 正常ヒト皮膚組織由来の不死化した細胞系
US6964869B2 (en) 1998-07-13 2005-11-15 Wisconsin Alumni Research Foundation Method and composition for skin grafts
CN1087778C (zh) * 1999-03-02 2002-07-17 华东理工大学 杂交瘤细胞无血清培养基
DE19912798C1 (de) 1999-03-10 2000-02-17 Andreas Jordan Verfahren zur Kultivierung von Krebszellen aus Humangewebe und Vorrichtung zur Aufbereitung von Gewebeproben
AUPR298901A0 (en) 2001-02-07 2001-03-08 McComb Foundation, Inc., The Cell suspension preparation technique and device
IL158526A0 (en) * 2001-04-24 2004-05-12 Wisconsin Alumni Res Found Method and composition for skin grafts
US7262174B2 (en) 2001-05-09 2007-08-28 Geron Corporation Treatment for wounds
US20030022369A1 (en) * 2001-05-18 2003-01-30 Helen Fillmore Differentiation of specialized dermal and epidermal cells into neuronal cells
WO2003005628A2 (en) * 2001-07-06 2003-01-16 Lipomics Technologies, Inc. Generating, viewing, interpreting, and utilizing a quantitative database of metabolites
GB0208041D0 (en) 2002-04-08 2002-05-22 Lonza Biologics Plc Method of culturing animal cells
US20050025737A1 (en) * 2003-07-30 2005-02-03 Sebagh Jean Louis Compositions containing melon extracts
CA2537462A1 (en) * 2003-09-18 2005-03-31 Raven Biotechnologies, Inc. Cell culture media comprising fructose as the primary energy source
WO2005071065A1 (en) * 2004-01-26 2005-08-04 Cognis France S.A.S Method for studying functional interactions between sensory neurons and keratinocytes or melanocytes
EP1865884B1 (en) 2005-03-17 2017-01-18 Stratatech Corporation Skin substitutes with improved purity
DE602007008627D1 (de) * 2006-02-14 2010-10-07 Genetix Ltd Zellkulturmedium
WO2010065907A2 (en) * 2008-12-05 2010-06-10 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Use of a rock inhibitor to sustain primary human keratinocytes in a proliferative state
WO2010134619A1 (ja) * 2009-05-18 2010-11-25 国立大学法人東北大学 人工多能性幹細胞からの上皮系前駆細胞・幹細胞群及び角膜上皮細胞群の分化誘導方法
KR101768632B1 (ko) * 2011-05-18 2017-08-17 (주)아모레퍼시픽 칼슘 펄스를 통한 배양상피세포층의 분리방법
KR101664175B1 (ko) * 2011-07-12 2016-10-11 푸드체크 시스템스, 아이엔씨. 살모넬라 및 대장균을 배양하기 위한 배양 배지, 방법 및 살모넬라 및 대장균을 검출하기 위한 방법
WO2013129885A1 (ko) * 2012-02-28 2013-09-06 건국대학교 산학협력단 세포 배양액
JP6414945B2 (ja) 2013-03-11 2018-10-31 Ｊｃｒファーマ株式会社 ヒト角膜上皮シートの製造法
AU2013205148B2 (en) 2013-03-14 2014-10-30 AVITA Medical Americas, LLC Systems and methods for tissue processing and preparation of cell suspension therefrom
KR20160065038A (ko) 2014-11-28 2016-06-08 (주)아모레퍼시픽 멜라닌 세포주 계대배양계 및 이를 이용한 노화 수준 판단, 미용 정보 제공, 또는 스크리닝 방법
GB2547605A (en) * 2015-01-26 2017-08-23 Halliburton Energy Services Inc Rotating superhard cutting element
CN105238739A (zh) * 2015-11-11 2016-01-13 朱宁文 临床治疗级细胞治疗用黑色素细胞(melanocytes)规模化制备人类细胞外基质筛选培养方法
CN106520674A (zh) * 2016-12-24 2017-03-22 严志海 一种用于表皮黑素细胞体外培养的无血清培养基
CN107115219A (zh) * 2017-05-12 2017-09-01 青岛赛欧凯普图乐生物医药有限公司 一种纤维芽母细胞活化液面膜配方
CN114058565A (zh) * 2020-07-31 2022-02-18 上海尚瑞生物医药科技有限公司 一种无血清的黑素母细胞培养液及其培养方法
KR102583179B1 (ko) * 2020-11-27 2023-09-26 (주)엑셀세라퓨틱스 칼슘, 상피세포성장인자 및 알부민을 포함하는 각질형성세포 수립 또는 배양용 배지 조성물
US20240209307A1 (en) 2022-12-27 2024-06-27 AVITA Medical Americas, LLC System for automated preparation of a regenerative epidermal suspension and related methods of use

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4940666A (en) * 1983-07-15 1990-07-10 University Patents, Inc. Process and defined medium for growth of human epidermal keratinocyte cells
US4885238A (en) 1987-10-30 1989-12-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Immortalized human bronchial epitherial mesothelial cell lines
US5292655A (en) * 1990-01-29 1994-03-08 Wille Jr John J Method for the formation of a histologically-complete skin substitute
US5376542A (en) 1992-04-27 1994-12-27 Georgetown University Method for producing immortalized cell lines using human papilluma virus genes
WO1995027510A1 (en) * 1994-04-12 1995-10-19 Alza Corporation Screening methods for integumental inflammation modulating agents
DE19617261A1 (de) * 1995-04-21 1996-11-28 Naeher Helmut Dr Med Priv Doz Hautverträglichkeitstest
SK283314B6 (sk) * 1995-12-21 2003-05-02 Soci�t� Des Produits Nestl� S. A. Imortalizovaná ľudská keratinocytová bunková línia a/alebo imortalizovaná melanocytová bunková línia, spôsob imortalizácie ľudských kožných buniek a bezsérové kultivačné prostredie na ich izoláciu a prípravu

Also Published As

Publication number Publication date
IL124191A (en) 2004-06-01
NO326190B1 (no) 2008-10-13
US20020012993A1 (en) 2002-01-31
CZ194598A3 (cs) 1998-11-11
AU1305497A (en) 1997-07-17
CA2234118C (en) 2009-04-07
PL327320A1 (en) 1998-12-07
JP2000506374A (ja) 2000-05-30
CZ297289B6 (cs) 2006-10-11
NO982810D0 (no) 1998-06-18
SK283314B6 (sk) 2003-05-02
CA2234118A1 (en) 1997-07-03
NO982810L (no) 1998-08-21
RU2215030C2 (ru) 2003-10-27
EP0780469B1 (fr) 2001-02-28
CN1205737A (zh) 1999-01-20
KR100455006B1 (ko) 2005-01-13
US20020042129A1 (en) 2002-04-11
EP0877797A1 (en) 1998-11-18
NZ325814A (en) 2000-10-27
US6423540B2 (en) 2002-07-23
KR19990071817A (ko) 1999-09-27
BR9612256B1 (pt) 2010-08-10
JP4404965B2 (ja) 2010-01-27
PL195108B1 (pl) 2007-08-31
ATE199390T1 (de) 2001-03-15
HUP9903742A2 (hu) 2000-03-28
DK0780469T3 (da) 2001-03-26
DE69611894D1 (de) 2001-04-05
PT780469E (pt) 2001-06-29
AU730222B2 (en) 2001-03-01
SK83598A3 (en) 1999-01-11
US6949381B2 (en) 2005-09-27
WO1997023602A1 (en) 1997-07-03
ES2155166T3 (es) 2001-05-01
CN1154717C (zh) 2004-06-23
DE69611894T2 (de) 2001-09-13
EP0780469A1 (fr) 1997-06-25
GR3035719T3 (en) 2001-07-31
BR9612256A (pt) 1999-07-13
HUP9903742A3 (en) 2000-10-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU226195B1 (hu) Javított immortalizált humán bõrsejtvonalak és szérrummentes tápközeg elõállításukra
JP2000506374A5 (hu)
KR101022032B1 (ko) 중간엽 줄기세포를 이용하여 모유두 조직을 제조하는 방법
US5324656A (en) Media for normal human muscle satellite cells
AU756151B2 (en) Immortalised cell lines derived from normal human skin tissues
US20050019310A1 (en) Method for culturing and expansion of mammalian undifferentiated epidermal kerainocytes exhibiting stem cell characteristics
US5266479A (en) High calcium chemically defined culture medium
CA2555021A1 (en) Medium for preparing feeder cells for embryonic stem cells and feeder cells
MXPA00009558A (en) Immortalised cell lines derived from normal human skin tissues

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees