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CN1212009A - 有蹄动物胚胎干样细胞、制法及用该细胞产生转基因的有蹄动物的方法 - Google Patents

有蹄动物胚胎干样细胞、制法及用该细胞产生转基因的有蹄动物的方法 Download PDF

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CN1212009A
CN1212009A CN97192440.6A CN97192440A CN1212009A CN 1212009 A CN1212009 A CN 1212009A CN 97192440 A CN97192440 A CN 97192440A CN 1212009 A CN1212009 A CN 1212009A
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CN
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ungulate
embryo
embryonic stem
pig
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CN97192440.6A
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G·B·安德森
H·希马
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University of California San Diego UCSD
Original Assignee
University of California San Diego UCSD
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Abstract

从有蹄动物的后胚泡胚胎中取出原生殖细胞,如从25天的猪胚胎或34—40天的牛胚胎的性腺嵴中取出原生殖细胞。在长期培养(超过30天)中培养原生殖细胞会形成形态上和维持多能性方面与胚胎干细胞相象的细胞。获得的细胞可在培养物中维持数月,并且可用同源重组技术进行遗传操作,从而将所需的遗传物质掺入细胞遗传互补体的所需位置。经遗传操作的细胞可被插入胚泡中(该胚泡取自与获得所衍生细胞相同种的动物),从而产生嵌合型有蹄动物。通过遗传工程,可使这些有蹄动物产生所需的医药产品。

Description

有蹄动物胚胎干样细胞、制法及用该细胞产生转基因的有蹄动物的方法
发明领域
本发明主要涉及的领域是未分化细胞和产生这类细胞的方法。更具体地，本发明涉及多能性有蹄动物(ungulate)细胞，尤其是猪细胞，还涉及用这类细胞产生的转基因的和嵌合的有蹄动物。
发明背景
胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)首先是用鼠成纤维细胞的饲养层或含水牛鼠(buffalo rat)肝细胞的条件培养基。从鼠胚胎中培养出的。用鼠胚胎建立的ES细胞系，其特征性的表型包括：细胞核大，核仁明显和细胞质较少。采用合适的培养条件时，这些细胞可以相对无限地生长。通过使用维甲酸或自发地去除饲养层或条件(conditioned)培养基，可以在体外诱导它们分化。此外，这些细胞可以被注射到鼠胚泡中，形成体细胞嵌合体或种系嵌合体。这后一种特性使得鼠ES细胞可被用于产生具有基因组特定变化的转基因鼠。参见M.Evans等人，“自然”，292,154(1981)；G.Martin，＂美国科学院院报＂78,7638(1981)；A.Smith等人，＂发育生物学＂(Developmental Biology)121,1(1987)；T.Doetschman等人，＂发育生物学＂(Developmental Biology)127,224(1988)；A.Handyside等人，＂Roux′s Arch Dev.Biol″198,48(1989)。
使鼠胚胎干细胞能被培养的活性物质已经被鉴别为分化抑制活性物质(differentiation inhibiting activity,DIA)，也被称为白血病抑制因子(LIF)。参见A.Smith,＂J.Tiss.Cult.Meth＂.13,89(1991)；J.Nichols等人，＂Development″110,1341(1990)。可使用重组形式的LIF，从而从鼠胚胎中获得ES细胞。参见S.Pease等人，＂发育生物学＂(Developmental Biology)141,344(1990)。还请参见1992年11月24日授权给Williams等人的美国专利No.5,166,065。
在小鼠胚胎的研究工作之后，有几个研究小组尝试开发羊、猪和牛的干细胞系。一些报道表明，使用类似用于小鼠的培养条件，已从猪胚胎中培养出具有干细胞样(stem cell-like)外表的细胞系。参见M.Evans等人，PCT申请WO90/03432；E.Notarianni等人，＂J.Reprod.Fert.,Suppl.″41,51(1990)；J.Piedrahita等人，＂Theriogenology″34,879(1990)；E.Notarianni等人，＂Proceedngs ofthe 4th WorldCongress on Genetics Applied to Livestock Products＂,58(Edinburgh,July 1990)。
已尝试培养来自鸟类胚胎的胚胎干细胞。但没有经病毒或化学转化，是难以建立连续的鸡细胞系，而且大多数原代鸡细胞系不能存活超过2-3个月。培养来自未孵育(unincubated)胚胎的细胞是困难的，而且在所报道的条件下这些细胞不能存活超过2周。参见E.Mitrani等人，＂Differentiation″21,56-61(1982)；E.Sanders等人，＂细胞组织研究＂(Cell Tissue Res.)220,539(1981)。
在美国专利5,340,740中，Petille等人在条件培养基存在下，于小鼠饲养层上培养鸡的胚胎细胞，并获得了培养的干细胞。
胚胎干细胞(ES细胞)是胚泡的多能性派生物，它能在体外被培养和操作，然后再返回到胚胎环境中，并通常可形成包括种系在内的所有组织(可参见Robertson,E.G.(1986)＂Trends in Genetics″2:9-13)。体外繁殖的ES细胞不仅能够有效地形成嵌合体(包括种系嵌合体)，而且这些细胞能够在体外进行操作而不会丧失其形成种系嵌合体的能力(Robertson,E.J．等人，(1986)＂自然＂323∶445-447)。
这样，ES细胞便提供了一种产生转基因动物如转基因鼠的途径。对于将新遗传物质引入动物，这种途径与更常规的技术如合子注射法和病毒感染法相比，具有许多重要的优点(Wagner和Stewart(1986)＂Experimental Approaches toEmbryonic Development＂,J.Rossant和A.Pedersen编辑，Cambridge；CambridgeUniversity Press)。
然而，已知ES细胞和某些EC(embryonal carcinoma，胚胎癌性)细胞系在成纤维细胞的饲养层(如鼠STO细胞，Martin,G.R．和Evans,M.J.(1975)＂美国科学院院报＂72∶1441-1445)上培养时，或者在含有某些细胞的条件培养基(如Koopman,P.和Cotton,R.G.H.(1984)＂Exp.Cell Res.＂154∶233-242；Smith,A.G．和Hooper,M.L.(1987)＂发育生物学＂(Devel.Bio1.)121:1-91)上培养时，会仅保留干细胞表型。在没有饲养细胞或条件培养基时，ES细胞会自发地分化成各种不同的细胞类型，很象那些在胚胎发生和成年动物中发现的细胞类型。但是，对于负责维持ES细胞多能性的因子，仍没有被充分定性。
上述方法需要将ES细胞用作起始原料。但可供使用的这种细胞其数目非常有限。因此非常迫切需要能大量产生ES细胞的方法。
发明概述
公开了一种产生具有胚胎干细胞表型的有蹄动物细胞尤其猪细胞的方法，还公开了用该细胞形成的多能性细胞和嵌合的有蹄动物(如猪)。从处于发育特定阶段的有蹄动物胚胎(如25天的猪胚胎)的性腺嵴，分离出原生殖细胞。较佳地，从具体物种胚胎中取出原生殖细胞时所处的发育阶段，随物种不同有所改变。例如，宜从34-40天的牛胚胎中取出原生殖细胞。使用此处所提供的指导信息和本领域的常规技术，可以方便地确定进行取出操作时的合适胚胎发育阶段。在长期细胞培养中(超过30天)，在诱导生长的条件下，于失活的STO细胞上培养PG细胞。形成的细胞在形态上很象ES细胞，其中包括与分化的成熟细胞相比细胞核大、核仁明显和细胞质减少。细胞可在培养物中传代数次，可在培养物中维持数月，并可在液氮低温贮藏后存活。
本发明的一个目的是提供一种产生具有ES细胞表型的有蹄动物细胞(如猪细胞)的方法。
另一目的是将生殖细胞作为原料来提供多能性细胞。
另一目的是用本发明的多能性细胞来提供嵌合的有蹄动物(如猪和牛)。
另一目的是从用本发明细胞而产生的嵌合的或转基因的有蹄动物中，提供有用的药物产品。
本发明的优点是，可以用被认为已发育过度从而不能作为多能性细胞来源的胚胎细胞，快速而有效地产生大量的多能性细胞。
另一优点是，通过同源重组方法，本发明的多能性细胞可用于产生各种不同的嵌合有蹄动物(如猪)。
本发明另一优点是，用从单个有蹄动物胚胎中抽提出的生殖细胞，可以快速而有效地产生成千上万个的多能性细胞。
本发明的特征是，原料是从有蹄动物胚胎(如25天的猪胚胎或34-40天的牛胚胎)的性腺嵴中分离出的原生殖细胞。
本发明的另一目的是提供用下列方法产生的转基因有蹄动物细胞，该方法包括步骤：
(a)从有蹄动物胚胎的性腺嵴中收集原生殖细胞；
(b)培养该生殖细胞超过30天；
(c)从培养的细胞中，选择出与有蹄动物胚胎干细胞相象并表现出胚胎干细胞表型的培养的生殖细胞；和
(d)将外源DNA引入该培养的生殖细胞。
本发明的另一目的是提供用下列方法产生的蛋白质，该方法包括步骤：
(a)从有蹄动物胚胎的性腺嵴中收集原生殖细胞；
(b)培养该生殖细胞超过30天；
(c)从培养的细胞中，选择出与有蹄动物胚胎干细胞相象并表现出胚胎干细胞表型的培养的生殖细胞；
(d)将外源DNA引入该培养的生殖细胞，其中该DNA编码人的蛋白质；
(e)将步骤(d)的细胞置于处于植入前(preimplantation)阶段的受体胚胎中；
(f)将步骤(e)的胚胎引入适合完成发育的环境，以形成转基因的有蹄动物；和
(g)从步骤(f)的转基因的有蹄动物中提取蛋白质。
本发明的另一目的是提供用下列方法产生的嵌合的有蹄动物，该方法包括步骤：
(a)从有蹄动物胚胎的性腺嵴中收集原生殖细胞；
(b)培养该生殖细胞超过30天；
(c)从培养的细胞中，选择出与有蹄动物胚胎干细胞相象并表现出胚胎干细胞表型的培养的生殖细胞；
(d)从步骤(c)的生殖细胞中取出细胞核，并可任选地将外源DNA引入该细胞核；
(e)将步骤(d)的细胞核引入选自下组的细胞：去核的卵母细胞和去核的胚胎细胞；
(f)将步骤(e)的胚胎引入适合完成发育的环境，以形成转基因的有蹄动物。
本发明的另一目的是提供从有蹄动物取得的生物材料，具体地该材料选自：细胞、组织、器官和体液。
对于本领域的技术人员而言，通过阅读下面有关具胚胎干细胞表型的有蹄动物细胞、制备方法、以及嵌合的和转基因的有蹄动物等方面更详细描述的细节，会理解本发明的这些及其他目的、优点和特征。
优选实施例的描述
在描述表现出胚胎干细胞表型的有蹄动物细胞及制备该有蹄动物细胞的方法之前，应理解，本发明并不限于所描述的特定细胞、方法或嵌合的有蹄动物，因为这些细胞、方法和有蹄动物显然可以改变。还应理解，此处所用的术语仅仅是为了描述具体的例子，而不应起限定作用，因为本发明的范围仅由所附权利要求书加以限定。
除非另外说明，所有的技术和科学术语具有本发明所属领域的一般技术人员公知的相同含义。尽管与此处所描述的相似或等价的方法和材料，都可用于实施或验证本发明，但现在描述的是优选的方法和材料。所有在本文中提及出版物都在此引用作为参考，以公开和描述与这些文献有关的方法和/或材料。
提及此处论述的出版物是因为它们的公开早于本申请的申请日。但这并不表示承认本发明晚于这些公开和在先申请的申请日。
定义
术语“有蹄动物”指任何物种或亚种的猪、牛、绵羊和山羊。一般，该术语包括有蹄的家畜。
术语“猪(procine)”和“猪猡(pig)”在本文中可互换使用，都指任何的猪的种和/或猪亚种。同样含义也适用于牛、绵羊和山羊。
术语“胚胎干细胞表型”和“胚胎干样细胞(embryonic stem-like cell)”在本文中可互换使用，都指未分化的因而具多能性的细胞，该细胞可通过视觉观察而与同一动物的其他分化成熟细胞区分开，例如与同一动物的分化成熟细胞相比，有大得多的细胞核(大25％或更大)、更大更明显的核仁以及更小的细胞质(小25％或更小)。
术语“原生殖细胞”用于描述从有蹄动物胚胎(如25天的猪胚胎或34-40天的牛胚胎)的性腺嵴中分离出的未分化细胞。
术语“胚胎生殖细胞”和“具有ES细胞表型的生殖细胞”都指本发明的、表现出胚胎干细胞表型的细胞。
术语“胚胎干细胞”指从胚泡阶段胚胎(尤其是受精后8天或更短天数的胚泡阶段的猪胚胎)的内细胞物质中，以其天然形式分离出的未分化细胞。胚胎干细胞是多能性的，而且与相同动物的成熟细胞相比有大得多的细胞核、明显的核仁和更小的细胞质。
术语“STO细胞”指鼠胚胎成纤维细胞(如市售的种类)，并包括保藏号为ATCC CRL 1503和ATCC 56-X的细胞。
术语“嵌合的”用于描述含有来自不同生物体的遗传物质的生物体。具体地，通过将本发明从第一生物体中抽提出的、表现胚胎干细胞表型的细胞插入第二种不同生物体的早期胚胎(诸如胚泡阶段的植入前胚胎)，可以产生嵌合体。用这种方法产生的动物会含有来自第一生物体和第二生物体的遗传物质，因而是“嵌合的”生物体。如果表现出胚胎干细胞表型的细胞经过遗传操作以含有外源物质，那么形成的嵌合体含有在某些细胞(但不是所有细胞)中含有该外源物质。
术语“转基因”用于描述在所有细胞中含有外源遗传物质的动物。通过两个嵌合动物(它们的繁殖细胞中含有外源遗传物质)的杂交繁育，可以产生“转基因”动物。形成的子代中25％是转基因动物，即在所有细胞的两个等位基因上都含有外源遗传物质的动物。形成的动物中50％在一个等位基因上含有外源遗传物质，而25％的动物不含外源遗传物质。
猪胚胎干样细胞
从25天的猪胚胎的性腺嵴中，分离出天然的原生殖细胞。可以从背侧肠系膜的任何地方分离出细胞，只要细胞的碱性磷酸酶活性测试为阳性。可在受精后约23-27天范围期间分离细胞。在该范围之外的细胞可用本发明方法进行测试，以确定是否可以获得所需结果。通常，在25天之前可供收集的细胞较少，而在25天之后多能性细胞的百分比会下降。在25天时，可从一个猪胚胎中分离出约10,000个具有碱性磷酸酶活性(AP-阳性)的细胞。分离出的细胞纯度一般约为70-90％。
在96孔组织培养板的每个孔中放置2000～4000个AP阳性细胞。在含5％二氧化碳的空气，39℃，于失活的STO细胞上培养。
在培养基中使用3种不同生长因子的所有组合形式。生长因子是1,000单位/毫升的白血病抑制因子(LIF)、60ng/ml的干细胞生长因子，和20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子。尽管PG细胞在原代培养物中可繁殖3天和存活至少5天，但是在该有限时间内没有一种生长因子明显地诱导PG细胞的增殖。但是，当用相同方式抽提出的原生殖细胞被培养更长的时间(超过30天)，并用AP染色法和形态加以评估时，发现细胞在形态上象ES细胞并且是AP阳性的。使用LIF似乎并不是必需的，即生长培养基可以仅含有干细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子。
有蹄动物胚胎干样细胞
可用与上述猪胚胎干样细胞相似的方法，对包括牛、绵羊和山羊在内的其他有蹄动物进行操作。首先，使有蹄动物受精。为方便起见，可用人工方式进行受精。在发育约等于25天±2天(猪)或34-40天(牛胚胎)时，取出胚胎。具体地，必须在性腺嵴开始形成时积累原生殖细胞，但是不能让性腺嵴发育到细胞开始分化的程度。可以从背侧肠系膜或性腺嵴收集细胞。对于不同动物，可以在不同的时间点取出胚胎，从胚胎的性腺区域取出细胞，并将碱性磷酸酶活性(和形态)作为多能性细胞的阳性测试法进行测试。在分离ALP-阳性细胞时，对来自相同集落、具有相同形态的细胞加以培养(如用合适的条件和培养基，在失活的STO细胞上培养)。为了得到表现胚胎干细胞表型的所需细胞，这些细胞必须培养一段长时间(超过30天)。
嵌合体猪
用本发明方法产生的细胞，在制备嵌合体动物中特别有用，而嵌合动物又能繁殖而产生转基因动物。具体地，本发明的具有胚胎干细胞表型的细胞可用各种不同方式进行遗传操作。例如，可以用电穿孔法将携带所需基因的基因构建物插入这些细胞中。经遗传操作而引入外源DNA之后，可将细胞微注射到相同种的有蹄动物的胚泡中，如将猪细胞注入猪胚泡中。再将该胚泡置于假孕雌性猪中。然后，“寄养母亲”就携带植入的胚泡直至足月。类似的用于小鼠的程序是已知的。请参见M.Evans等人，“自然”，292,154(1981)；G.Martin，＂美国科学院院报＂78,7638(1981)；A.Smith等人，＂发育生物学＂(Developmental Biology)121,1(1987)；T.Doetschman等人，＂发育生物学＂(Developmental Biology)127,224(1988)；A.Handyside等人，＂Roux′s Arch Dev.Biol″198,48(1989)。还可参见1995年2月7日授予Cordell的美国专利5,387,742。这些已出版的程序可由本领域技术人员加以改动，以通用地应用于有蹄动物及具体地应用于猪，请参见出版的PCT出版物WO94/26884，该文献全部在此引用作为参考。
用上述方法产生的嵌合猪，可用于形成任何所需的药物活性产物。例如，外源DNA可以是编码人胰岛素的基因，通过电穿孔技术将该基因引入本发明细胞中。然后用上述方法将含有人胰岛素基因的细胞引入猪胚泡中，从而形成嵌合猪，该猪具有产生人胰岛素的细胞。这些胰岛素可以被提取、纯化并作为药物使用。
嵌合的有蹄动物
表现出胚胎干细胞形态并用本发明方法产生的细胞，可用于产生其他的嵌合有蹄动物，其中包括牛、绵羊和山羊。如上所述，可对具有胚胎干细胞表型的细胞进行遗传操作，从而使它们含有外源遗传物质。典型地，对细胞进行电穿孔处理，从而插入携带所需基因的载体。然后，将经遗传操作的细胞微注射到与所得生殖细胞相同种的有蹄动物的胚泡中。再将胚泡插入假孕的雌性有蹄动物中，让它携带胚泡直至足月。因此，本发明包括：将经操作的、具有胚胎干细胞表型特征和第一遗传互补体(complement)的有蹄动物细胞，插入与获得原生殖细胞相同物种的宿主胚胎(尤其是处于胚泡阶段的胚胎)中。宿主胚胎具有通常与第一遗传互补体不同的第二遗传互补体。
用途
本发明方法和细胞具有多种不同用途。除了如上产生包括猪在内的嵌合有蹄动物之外，这些细胞还可用于研究胚胎发育。例如，本发明的具有胚胎干细胞表型的细胞可用标记物或标记基因进行遗传操作。然后标记物便被插入胚泡中，以便观察动物生长过程中分布情况。
有蹄动物的胚胎干细胞可含有编码任何可选择标记物的外源核苷酸片段。合适的标记例子是潮霉素(Hph)(Yates等人，1985)、新霉素(Neo)(Mansour等人，1988,nature.336:348-352)和嘌呤霉素(Pac)标记，包括ada(腺苷脱氨酶)和dHFR(二氢叶酸还原酶)。标记可用于跟踪感兴趣的连锁转基因的遗传情况。
使用本发明具有胚胎干细胞表型的细胞的一些具体优点如下。首先，感兴趣基因可在体外进行引入，而且它的整合和表达也可在体外进行定性研究。其次，可在体外研究引入外源基因时对ES细胞生长的影响。第三，经确定具有新引入的外源基因的ES样细胞，可有效地通过胚泡注射法或胚胎聚集法而引入胚胎，然后在出生前和出生后，监测所引入基因对形成的转基因或嵌合动物发育的影响。第四，可对引入基因发生整合的ES细胞基因组位点进行操作，从而可以进行基因定位和基因替换(Thomas,K.R．和Capecci,M.R.(1987)＂细胞＂51:503-512)。还可参见1995年11月7日授予Capecci等人的美国专利5,464,764。去除某一基因，然后长期研究该基因对有蹄动物发育的影响。
嵌合的和转基因的动物是另一种通过重组遗传技术生产有用蛋白质的“工厂”。对于某些不能用诸如微生物或小型动物之类的宿主获得的产物诸如猪、牛、绵羊和山羊之类的大型动物是生产这些产品的潜在工厂。这些产品的例子有可植入人体的器官。
实施例
提供下面的实施例，以便给本领域技术人员提供完整的公开内容和描述(即任何制备和使用表现胚胎干细胞表型的有蹄动物细胞，以及本发明嵌合的和转基因的有蹄动物)。但是这些实施例并不用于，也不能用于限定本发明人的发明的范围。对于所用的数字(如数量、时间、温度等)，已努力保证其准确性，但是应理解可能有某些试验误差和偏差。除非另外说明，份数指重量份数，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，而压力等于或接近于大气压。
实施例1
收集原生殖细胞
从24-25天±1天的猪胚胎或34-40天的牛胚胎的性腺嵴中取出原生殖细胞。每个胚胎可取出约30,000个细胞。通过检查细胞形态、细胞核型以及碱性磷酸酶(AP)活性的染色，对取出的细胞样品进行测试。符合形态标准并AP阳性的细胞是所需要的，一般占取出样品的70-90％。这些细胞通常还具有正常的染色体。
按Anderson等人，Theriogenology 42:204-212中所述的方法，制备胚胎供体。在妊娠第24-25±1天时，从17头杂交繁育的母猪供体(Hampshire×Yorkshire；约6个月大)的子宫中解剖得到174个胚胎。如果肉眼看得到，那么就切下性腺嵴并取下；否则，取下包括性腺嵴原基(anlagen)的背侧肠系膜(Cook等人，Meth.Enzymol.225:37-58 1993)。
取出的组织用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤一次，然后在室温下孵育在0.2％EDTA溶液中约20分钟。然后用细钳子轻柔地分开切下的组织，从而使PGC解离。收集形成的细胞悬浮液，在约800×g下离心5分钟。在标准的PGC培养基中再悬浮沉淀物中的生殖细胞。
实施例2
检测收获的EG细胞的形态和碱性磷酸酶活性
如上所述，在优选例子中，从新生的性腺嵴收获原生殖细胞，因为它们所处的早期发育阶段抑制了随后的分化和多能性的丧失。
为了确定收获的细胞是否处于合适的发育阶段，应对收获细胞进行检测，看其是否符合鉴别多能性PGC的形态标准(DeFelici和McLaren,Exp.Cell Res.,142:476-482,1982)。为了进一步证实多能性，随后应对取出细胞测试其碱性磷酸酶(AP)活性。多能细胞的标记对于鉴别培养物中的干细胞常常很有用。EG细胞通常会表现出碱性磷酸酶(AP)活性，而且AP阳性细胞通常是干细胞。在体外，随着EG细胞的分化，AP活性会快速丧失。AP的表达已经在下列动物的ES和ES样细胞中得以表现：小鼠(Wobus等人，Exp.Cell Res.:152:212-219,1984；Pease等人，＂发育生物学＂(Dev.Bio.)141:344-352,1990)，大鼠(Ouhibi等人，Mol.Repro.Dev.40:311-324,1995)，猪(Talbot等人，Mol.Repro.Dev.36:139-147,1993b)和牛(Talbot等人，Mol.Repro.Dev.42:35-52,1995)。还在鼠PGC(Chiquoine,Anat.Rec.118:135-146,1954)、鼠EG细胞(Matsui等人，Cell.70:841-847,1992；Resnick等人，Nature 359:550-551,1992)和猪PGC中检测到AP活性。结合EG细胞集落的形态学评估，AP表达可作为一种方便的标记来鉴别培养物中未分化细胞。
用光学显微镜，评估来自实施例1所产生的细胞悬浮液的细胞样品是否符合表示推定的PGC的形态标准。该标准由以下构成：(1)细胞核比同一物种成年细胞的细胞核的直径大约25％；(2)大而明显的核仁；和(3)在体积上，细胞质的体积被同一物种成年细胞的细胞质体积大25％，或有高的核质比(即与其他细胞相比有高的比值)。随后，用AP细胞化学试剂盒(Sigma Chemical Co.；St.Louis,Mo.)和方案，通过在80％乙醇中固定(Buehr和McLaren,Meth.Enzymol.,255:58-77,1993)并染色，而测试符合这一标准的细胞中的碱性磷酸酶活性。
结果表示，AP活性在新鲜的PGC中，以及在EG细胞的原代培养物和传代培养物中持续表达。因此，在形态标准和AP活性测试中都为阳性的细胞表示了ES样细胞，这些细胞通常占所有收获细胞的70-90％。
实施例3
通过在体外分化，猪EG细胞表现出多能性
鼠ES细胞能够在体外分化成多种细胞，其中包括骨骼肌样细胞、心肌样细胞、神经元样细胞和血细胞样细胞(Martin,G.R，美国科学院院报，78:7634-7638,1981；Smith,A.G．和Hooper,M.L.,＂发育生物学＂(Dev.Biol.)121:1-9,1987；Bain,G．等人，＂发育生物学＂(Dev.Biol.),168:342-357,1995)。来自牛(Talbot,N.C．等人,Mo1.Reprod.Dev.42:35-52,1995)、猪(Talbot等人，＂体外细胞发育生物学＂(In Vitro Cell Dev.Biol)29A:543-554,1993a,b)和羊(Talbot等人，Mol.Reprod.Dev.36:139-147,1993b)的外胚层的细胞系，都表现出能在体外分化层各种不同细胞类型的能力。类似地，测试猪EG细胞在体外分化成各种细胞类型的能力，包括分化成内胚层样细胞、滋养层样细胞、上皮样细胞、成纤维细胞样细胞和神经元样细胞的能力。
为了在单层培养的细胞层中诱导分化，可培养EG细胞2周而不将其传代至新鲜的STO饲养层。为了在悬浮培养中诱导分化，可如上所述的那样，将细胞传代至凝胶化平板上以消除可能存在的成纤维细胞污染。在培养4-7天后，用吸口式移液管(mouth pipette)将集落从平板上轻轻地取下，并在0.25％胰蛋白酶-EDTA中孵育10-15分钟而解聚。解离后的细胞在位于35毫米非粘附型培养皿(Falcon)上的，含0.3μM维甲酸的PGC培养基微滴中培养。每天监测悬浮培养物是否形成了胚胎样的物体(这是分化表型的标志)。每隔一天更换细胞培养基。
根据形态学标准，用这种方式处理EG细胞而得到的数据显示，至少有5种分化的表型，其中包括：(1)内胚层样细胞、(2)滋养层样细胞、(3)上皮样细胞、(4)成纤维细胞样细胞和(5)神经元样细胞。
神经元样的表型表现为从小的细胞体伸出许多轴突。神经元样细胞还常形成被称为“神经玫瑰花结”的簇。成纤维细胞样细胞表型是培养过程快速生长和伸长，轻易地与饲养细胞混合而且比未分化的干细胞长得快多。上皮样表型是形成单层的多边形细胞，并可看见细胞间的边界，而未分化的EG细胞不显示出明显的细胞边界。偶尔在由单个细胞(其直径比EG细胞大)形成的松散集落中，发现滋养层样细胞。
当EG集落形成多层的帐篷式的凸起时，集落常常会在集落的边缘形成内胚层。用上述方法测量发现，AP的表达随着EG细胞的分化而迅速下降。例如，一旦内胚层分化，那么集落的外层就丧失了AP活性，但是在由干细胞构成的胚状体核心处仍有AP活性。因为分化发生于内胚层样表型的外层，所以我们认为在集落核心处的细胞仍然是未分化的。因而，由于处于未分化状态，所以胚状体核心处的EG细胞仍表现出AP活性。
还可以在悬浮培养的EG细胞中诱导分化。在悬浮培养约7天之后，EG细胞形成了简单的胚状体，每个胚状体具有由大的内胚层细胞构成的外层。如上所述，这些内胚层细胞是从未分化的干细胞核心分出来的。
EG细胞在体外分化的能力表明，本技术中的EG细胞是全能性的，而且在潜能方面与以前描述的鼠ES细胞类型相似。
                                 表1在注入胚泡后，猪EG细胞系的体内分化情况
EG细胞系 转入的胚胎数 受体数目 怀孕受体数目 出生的小猪数目 出生的嵌合体数目
 PEGC142     105     4     4     20     1
 PEGC272     25     1     1     10     0
 PEGC367     56     2     1     11     0
实施例4
培养的EG细胞表现出正常的核型
由于ES细胞在培养中会快速地增殖，因此已报道形成的ES细胞会含有异常的核型(Abbondanzo,S.J．等人，Meth.Enzymol.,225:803-823,1993)。此外，对低温贮藏的ES细胞反复冻融会增加诱发染色体异常的危险。为了在使用EG细胞时增加种系遗传操作(如基因导向)的成功可能性，具有正常二倍体核型的EG细胞系是优选的。此外，雄性EG细胞系比雌性EG细胞系要好得多。为了确定猪EG细胞系是否表现出正常核型，就对本文上述培养的猪EG细胞系进行测试。通过检查细胞染色体的结构和数量方面的异常，检查每个EG细胞系中约10-20处于分裂中期的核型。
将EG细胞置于4孔培养皿上，并在含有0.02微克/毫升秋水仙酰胺(GIBCO BRL)的PGC培养基中，在5％二氧化碳、95％空气和39℃下培养过夜。随后用PBS洗涤细胞，用0.25胰蛋白酶-EDTA在39℃处理10-15分钟，取出并在800×g离心5分钟。将细胞在冷的Carnoy氏固定剂(体积比为3∶1的无水甲醇和冰乙酸)中固定5分钟，用PBS进行洗涤，如上进行离心，然后再悬浮于0.5毫升的Carnoy氏固定剂中。用滴管取一滴形成的细胞悬浮液，滴在已经用Carnoy氏固定剂预先洗涤过的显微镜载玻片上。让载玻片风干，进行吉姆萨染色(GIBCO BRL)，再用自来水漂洗。在第二次干燥之后，在载玻片上盖上盖玻片，然后在油浸条件下用400倍光学显微镜观察。
结果示于表2。所有被检查的EG细胞都有正常的整套猪染色体(即36条常染色体和2条性染色体)。此外，没有观察到断裂、缺失或染色体形状和数目的其他异常情况。3个细胞系(PEGC142、PEGC273和PEGC367)表现出正常的雄性二倍体核型，1个细胞系(PEGC62)表现出正常的雌性二倍体核型。另外，在低温贮藏并随后培养后存活EG细胞也没有表现出染色体异常或表型特征的显性变化。
                         表2猪EG细胞系的特征
EG细胞系  PGC的来源 添加的生长因子 核型(2N) 目前的传代次数
 PEGC142     性腺嵴     猪LIF     38,XY     29
 PEGC273     性腺嵴     无     38,XY     19
 PEGC367     性腺嵴     无     38,XY     19
 PEGC62 背侧肠系膜     无     38,XY     16
实施例5
原代EG细胞培养
将如实施例1那样取出的，来自单个小母猪胚胎的所有原生殖细胞合并在一起。将这些生殖细胞分配在96孔的组织培养板上(它们早已在灭活的STO饲养细胞单细胞层上接种过)。以约30,000个细胞/孔的密度，将生殖细胞接种于板上，然后在含5％二氧化碳的空气和39℃下进行培养。在板接种后约4-7天，从饲养层上挑取紧密的EG样集落，在39℃，于0.25％胰蛋白酶-EDTA(GIBCO BRL；Grand Island,NY)的微滴中解离10-15分钟。
解离的细胞被接种在位于4孔复式培养皿(multidish)中的，如上制备的新鲜的饲养层。这一程序可重复，直到EG细胞集落的汇合度(confluency)大于50％。
对于额外的传代培养，可每隔4-7天用PBS洗涤含EG集落和饲养细胞的平板，然后在39℃，用0.25％胰蛋白酶-EDTA处理10-15分钟。取出处理过的EG细胞，在800×g离心5于分钟。将离心沉淀物再悬浮于PGC培养基中，然后将再悬浮的生殖细胞再次接种于4孔复式培养皿中的新鲜饲养层上。将所有的培养都维持在39℃，5％二氧化碳和95％空气中，并每隔一天更换PGC培养基。在该实施例中，分离出EG细胞系，然后维持在含有和不含有猪LIF(1000单位/毫升)(Alexion Pharmaceuticals,New Haven,CT)的培养基中。在添加或不添加LIF的培养基之间，没有观察到差别。如本文所述，EG细胞培养可以持续5个月之上。
基本培养基是Dulbecco改进的Eagles培养基(DMEM)，其中还含有15％(v/v)胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺(1mM)、MEM非必需氨基酸(0.1M)、2-巯基乙醇(10μM)、青霉素(100单位/毫升)和链霉素(0.5mg/ml)。这是在体外环境维持和繁殖动物细胞的通用组织培养基。
                                    表3
       用于在体外培养动物细胞的Dulbecco改进的Eagles培养基(DMEM)
成分     mM     gm/L
Dulbecco改进的Eagles培养基(DMEM,(Sigma-Hybrimax D 6655))，它含有： --     13.4
NaCl     110.0     6.4
Na2HPO4     0.80     0.109
葡萄糖     25.0     4.5
酚红钠盐(phenol rad-Na)     0.043     0.016
L-精氨酸     0.39     0.084
L-半胱氨酸     0.40     0.063
L谷氨酰胺     4.01     0.584
甘氨酸     0.40     0.030
L-组氨酸     0.271     0.042
L-异亮氨酸     0.80     0.105
L-亮氨酸     0.80     0.105
L-赖氨酸     1.01     0.146
L-甲硫氨酸     0.20     0.030
L-苯丙氨酸     0.40     0.066
L-丝氨酸     0.40     0.042
L-苏氨酸     0.80     0.095
L-色氨酸     0.08     0.016
L-酪氨酸     0.60     0.104
L-缬氨酸     0.80     0.094
氯化胆碱     0.03     0.004
叶酸     0.01     0.004
肌醇     0.04     0.007
烟酰胺     0.04     0.004
D-泛酸     0.02     0.004
吡哆醛     0.02     0.004
核黄素     0.001     0.0004
硫胺     0.012     0.004
氯化钙     1.8     0.265
硝酸铁     0.0002     0.0001
硫酸镁     0.83     0.100
氯化钾     5.37     0.400
NaCHO3     7.6     1.5
加蒸馏水至     1升
用1N HCl将pH调至7.3，过滤灭菌，然后在4℃储藏2周。
分离出并在长期培养中维持的猪EG细胞系结果示于表4。从不同小母猪的PGC分离出的4个EG细胞系都在长期培养中存活；一个细胞系存活了29代以上。这些EG细胞系在超过6个月期间的反复传代培养中无限地进行繁殖。
                   表4猪LIF对EG细胞系分离的影响
生长因子的添加 原代培养次数     在传代后存活的细胞系数目
    1     2     3     4     10
无 10     9     7     6     3     3
猪LIF 7     5     3     2     1     1
EG细胞系产生形态上与鼠ES细胞相似的紧密的集落，但是猪EG集落比鼠ES细胞更扁平和更半透明。猪EG细胞不含有脂质样(lipid-like)的液泡。而液泡在鼠和猪ES细胞中常出现(Gerfen,R.W.和Wheeler,M.B.,Anim.Biotech 6:1-14,1995)。EG集落的大小和形状有所不同，各EG细胞的直径为5-15微米，约为STO饲养细胞直径的1/3。每个猪EG细胞含有大的细胞核，有1或2个明显的核仁，并有较少量的细胞质(Gerfen,R.W.和Wheeler,M.B.,Anim.Biotech 6:1-14,1995)。
3个细胞系是从性腺嵴收集的PGC分离而得的，一个细胞系来自背侧肠系膜(表5)。在分离的EG细胞系中，在形态、增殖和AP活性方面没有观察到明显的差别。EG细胞具有AP活性，这在原代培养和传代培养的EG细胞和PGC中始终观察到，但是在STO饲养细胞中没有观察到。当EG细胞在体外分化时，它们迅速地丧失AP活性。在传代8-12次后，全部4个分离的细胞系都有正常的猪的整套38条染色体(36条常染色体和2条性染色体)。与上述情况相同，没有在分离的EG细胞的染色体中发现明显的异常、增加或缺失。
实施例6
分离表现胚胎干细胞表型的生殖细胞
按照实施例5的EG培养程序，连续培养30天以上，然后每隔4-7天测试分离出的细胞样品，并每次传代于新的饲养细胞层。在进行长期培养时，数组细胞会分化成不同的细胞类型，包括神经元样细胞、滋养层样丝状细胞、和内胚层样细胞、上皮样细胞、和成纤维细胞样细胞。弃去已分化的细胞。通过检查细胞形态并选择具有大细胞核和明显核仁的细胞，将推定的具有胚胎干细胞表型的细胞样品取出。分离出测试为阳性(ALP阳性)或具有所需形态的克隆，然后用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液使这样的集落解聚开。将解聚后的细胞转移至新的饲养层。
用Hogan,B．等人，Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY，第二版，pp.253-290中的方法，制备和维持饲养细胞。简而言之，在含有10微克/毫升丝裂霉素C(Sigma)的培养基中孵育灭活的STO细胞2小时。在将ES细胞转至饲养层之前约24小时，将STO细胞以5×104细胞/孔的密度接种于96孔平板(Falcon；FranklinLakes,NJ)，或以2.5×105细胞/孔的密度接种于4孔的复式平板上(Nunclon；Roskilde,Denmark)。
长期(超过30天)培养ES细胞。可测试这些细胞，它们AP测试为阳性并表达阶段特异性胚胎抗原-1(stage-specific embryonic antigen-1,SSEA-1)。细胞可传代10以上，而且可维持未分化状态超过5个月。细胞系可在液氮低温贮藏后存活，并可确保EG细胞的活力以便以后使用。从最早第3次传代开始，可以在每次传代时进行低温贮藏。低温贮藏和冻融方法与Robertson,E.J.,IRL Press,Oxford,pp.71-112,(1987)的相似。
实施例7
用表现胚胎干细胞表型的EG细胞来产生嵌合动物
采用类似于用ES细胞产生嵌合动物的方法，可用如上制备的、表现胚胎干细胞表型的EG细胞来产生嵌合的有蹄动物。参见WO94/26684，该文献在此全部(包括所有图表和附图)引用作为参考。
在体外用第一遗传互补体(如含有外源基因的核苷酸序列)转化表现胚胎干细胞表型的生殖细胞，这可用本领域技术人员已知的任何方法完成。这类方法的具体例子包括：电穿孔、磷酸钙沉淀法、Polybrene沉淀法、转导(逆转录病毒)、受体介导的DNA转化法、脂转染法、微注射法或其他方法。
在一个代表性例子中，将外源的标记DNA序列整合到宿主细胞基因组的特定位点。如果转化后的宿主细胞是表现胚胎干细胞表型的多能或全能细胞，而且该表现胚胎干细胞表型的生殖细胞被掺入，那么就可产生嵌合的有蹄动物，该动物在宿主基因组的特定位置上有特异的遗传改变。可对引入基因发生整合的表现胚胎干细胞表型的生殖细胞基因组位点进行操作，从而可以进行基因定位和基因替换(Thomas,K.R．和Capecci,M.R.(1987)＂细胞＂51L:503-512)。还可参见1995年11月7日授予Capecci等人的美国专利5,464,764。将嵌合体动物转变成转基因动物的所需条件是：存在一配子，该配子是表现胚胎干细胞表型的生殖细胞的后代，而且该配子被用于产生嵌合体的后代。有稳定的细胞培养物，便可得到具有相同遗传互补体并表现ES表型的生殖细胞克隆。因此，杂交繁育具有相同遗传互补体的嵌合有蹄动物的机会就增大了。这种杂交繁育会导致25％子代是转基因的，即动物的所有细胞在两个等位基因位置上含有外源遗传物质。
可对各细胞系方便地进行筛选，以检测外源DNA同源或非同源地重组入染色体DNA中的情况。用本发明方法生产的细胞系，可产生在特定染色体位置上有转基因的嵌合体或转基因有蹄动物。通过将特定基因引入特定位点，可以方便地产生稳定的、遗传上改变的转基因有蹄动物品系。可用同源重组来产生上述的基因剔除体(指剔除原基因)或基因替换体，并将单一基因整合到特定位置，从而避免引入多个拷贝的基因以及拷贝数目和位置不可预计的问题(这些问题在以前产生转基因动物的方法中会造成麻烦)。
产生嵌合有蹄动物的方法包括：将表现胚胎干细胞表型的生殖细胞引入受体胚胎中，从而形成嵌合胚胎，其中该生殖细胞宜有全能性并含有第一遗传互补体，而受体胚胎具有第二遗传互补体。
第一遗传互补体的核苷酸序列如标记基因，可通过从基因组DNA中分离、从cDNA中沉淀、直接合成、重组技术或组合使用这些方法而获得。可包含合适的调控序列。
根据产生基因组有蹄动物的具体目的，选择用于转化的第一遗传互补体，如分离出的标记基因的核苷酸序列(皮肤色素基因等)。对转化的限制条件是本领域技术人员熟知的那些限制条件。第一遗传互补体可以是相对宿主(受体)而言外来(外源)的核苷酸序列，也可以是宿主物种天然的核苷酸序列。在后一种情况下，核苷酸序列可以与宿主中天然存在的序列不同。
可用作第一遗传互补体，并掺入到嵌合体并随后掺入到转基因有蹄动物中的外源核苷酸序列，包括编码下列物质的人基因：
1)凝血因子如因子Ⅷ和Ⅸ；
2)可用于抑制脂肪细胞的TNFα；
3)生长因子如
a)EGF，它可用于恢复新生儿腹泻后受损的胃肠内膜(lining)；
b)神经生长因子NGF；
4)铁结合球蛋白；
5)用于人工血液或治疗贫血的血红蛋白；
6)激素如胰岛素、FSHβ、GH、LHβ、PMSG；和
7)下列基因：
a)SLA或MHC，它们与疾病抗性有关；
b)细胞因子基因；
c)补体基因。
血管生成因子、药用或诊断蛋白质和抗体是另一些可由转基因有蹄动物生产的有用产品，比如在其奶中。
在选定了合适的具有胚胎干细胞表型的转化生殖细胞(实施例1-3)之后，在合适阶段将其引入同一物种的受体胚胎中，通常为桑椹胚阶段或胚泡阶段(前植入阶段)。其他阶段也是合适的，如单细胞、二个细胞或8个细胞阶段。然后立刻将胚胎转移至合适的受体母亲中，或者在培养保持至多10天(Polge,C.(1982),Cole,K.J.A．等人编辑，“Control ofPig Reproduction”,London；Butterworth Scientific；1982；和Webel,S.K．等人(1970)＂动物科学杂志(J.Animal Science)＂,30:565-568)。
任何用于将细胞引入宿主胚胎中的方法都是合适的，其中包括微注射。如果引入成功，那么就产生了嵌合的有蹄动物。嵌合性可用适合检测引入基因(该基因是通过转化具有胚胎干细胞表型的生殖细胞而引入的)的方法进行检测，通常是通过检测表达产物或通过与鉴别探针进行杂交。例如，对于在宿主胚泡基因组中不存在的皮肤色素基因，可用动物身体上的斑点作为标识进行检测。
嵌合胚胎被置于适合完成发育过程的环境中，以形成嵌合的成熟体，并且嵌合胚胎被发育至性成熟。嵌合动物可与另一嵌合动物进行繁殖以产生子代，其中25％是转基因型的。
较佳地，通过检测子代中的第一遗传互补体(转基因)，来判断子代是否是转基因的有蹄动物。这或者通过检测其表达产物，或者通过检测其特异的核苷酸序列。遗传标记可用于跟踪转基因的细胞谱系。
已引入转化的具有胚胎干细胞表型的生殖细胞的胚胎所产生的有蹄动物，被认为是嵌合体。当然，事实上并不是所有这样产生的动物都是嵌合的，因为存在技术偏差和机率。
然后将假定的嵌合有蹄动物进行繁殖，以产生子代。用作亲代的某些嵌合动物具有转化的配子。通过转化的配子被用于受精，那么产生的子代就是转基因动物，因为其所有细胞都来自转化配子形成的合子。因此预期所有的子代细胞都是转基因的。然而，并不是所有的嵌合猪子代都是转基因型的，因为不是所有的嵌合有蹄动物都有转化配子，或并不是所有的配子都是转化型。
为了产生转基因动物，最初转化本发明具有胚胎干细胞表型的生殖细胞的遗传互补体(例如分离出的核苷酸序列)，必须被整合到宿主基因组中。如果转化用核苷酸序列包括外源DNA，那么外源DNA必须整合到宿主的内源DNA中。整合通过可用非同源重组法完成。然而，还可将同源重组作为实现DNA重组的手段。同源重组被定义为相关或相同DNA序列之间的重组；非同源重组被定义为非相关DNA序列之间的重组。
作为蛋白质产生的结果，转基因的有蹄动物具有改变了的组织或奶蛋白或化合物，其中包括药用蛋白、治疗用蛋白、生物医学蛋白、加工用蛋白、制造用蛋白或复合蛋白，比如下列蛋白：
1)血液蛋白(凝血因子Ⅷ和Ⅸ，补体因子或组份，血红蛋白或其他血液蛋白等)；
2)激素(胰岛素、生长激素、甲状腺激素、儿茶酚胺、促性腺激素、PMSG、营养因子、催乳素、催产素、多巴胺等)；
3)生长因子如EGF、PDGF、NGF、IGF等；
4)细胞因子，如白细胞介素、CSF、GMCSF、TNF、TGFα、TGFβ等；
5)酶(组织纤溶酶原激活物、链激酶、胆固醇生物合成或降解酶、消化酶、类固醇生成酶、激酶、磷酸二酯酶、甲基化酶、脱甲基化酶、脱氢酶、纤维素酶、蛋白酶、脂酶、磷脂酶、芳香酶(aromatase)、细胞色素、腺苷酸或鸟苷酸环化酶等)；
6)激素或其他受体(LDL、HDL、类固醇、蛋白质、肽、脂类、或前列腺素等)；
7)结合蛋白(类固醇结合蛋白、生长激素或生长因子结合蛋白等)；
8)免疫系统蛋白(抗体、SLA或MHC基因)；
9)抗原(细菌的、寄生虫的、病毒的抗原、变应原等)；
10)翻译或转录因子、癌蛋白或原癌蛋白、奶蛋白(酪蛋白、乳白蛋白、乳清等)；和
11)肌肉蛋白(肌球蛋白、原肌球蛋白等)。
通过将来自具有胚胎干细胞表型的生殖细胞的细胞核，转移至胚胎细胞或未受精的卵母细胞中，可以产生遗传工程改造过的相同子代，从而使形成的细胞系、组织、器官或子代含有被转移细胞核的全部或部分遗传物质。
来自特定细胞系的、具有胚胎干细胞表型的生殖细胞(具有或不具有外源基因)，可通过显微操作而转移至外源细胞质中，如去核的卵母细胞或胚胎细胞。培养形成的细胞，以形成新细胞系，并可用于形成嵌合胚胎、组织和/或器官，或者被转移至替代母亲以产出遗传工程改造的子代。将多个或单个具有胚胎干细胞表型的生殖细胞或细胞核转移至去核的卵母细胞或胚胎细胞，可通过显微操作而完成。被转移细胞或细胞核的融合，可用电脉冲、暴露于融合剂(如仙台病毒或聚乙二醇)、或暴露于改变细胞膜离子通量(fluxes)的离子载体而完成。用具有胚胎干细胞表型的有蹄动物生殖细胞形成的、遗传改造过的个体，可作为有蹄动物新品系或品种的基础动物。例如，携带转基因的、具有胚胎干细胞表型的生殖细胞，可与去核的卵母细胞融合以产生具有相同核DNA的细胞，以便生产出克隆的细胞、组织、器官(例如肾移植)或动物。
可用各种不同方法将转基因引入具有胚胎干细胞表型的生殖细胞。这些方法包括：电穿孔、微注射、脂转染法、逆转录病毒感染法和磷酸钙法。细胞可用抗生素G418(当构建物含有neo基因时)或其他合适的药物或化合物进行筛选(参见例如，Wheller,WO94/26884以确定筛选表达neo的猪细胞时的最佳G418剂量)。在筛选后留下的集落被克隆，并用本领域技术人员移植的方法检查转基因的整合情况。这些方法包括(但并不限于)：PCR、Southern分析、Northern分析或Western分析。
实施例8
用胚胎干细胞样的生殖细胞形成嵌合体
用连于显微操作器(Narashige Inc.,Tokyo,Japan)的直径25-30微米剥离注射针，将约1-30个(较佳地5-20个)含有转基因的、本发明的具有胚胎干细胞表型的生殖细胞，置于细胞团(桑椹胚)或胚泡腔(胚泡和膨胀的胚泡)中。在注射之后，立刻将胚胎转移至受体母猪、母牛、母羊或母山羊，这些母兽已在胚胎供体之后处于发情期24小时。
将嵌合体设计成易于筛选，例如使用毛色标记(对牛选用Meishan X Duroc、Angus X Hereford，对绵羊选用Dorset X Lincoln(纯合的黑色品系)，对山羊选用Saanen X Toggenburg或Black或Brown Nubian)。形成的各嵌合体动物会具有来自各胚胎细胞家系的不同颜色的皮肤和毛发斑块。
用细胞核转移法而产生嵌合体或克隆，可通过将具有胚胎干细胞表型的生殖细胞与处于下列阶段的植入前胚胎聚集起来而实现：单细胞、双细胞、四细胞、八细胞、16细胞、32细胞、桑椹胚、胚泡和孵化胚泡(hatched blastocyst)。克隆的核转移子代的产生，还可通过将具有胚胎干细胞表型的生殖细胞的细胞核注入去核的、处于相同阶段(单细胞、双细胞、四细胞、八细胞、16细胞、32细胞、桑椹胚、胚泡和孵化胚泡)的植入前胚胎细胞，或与该前胚胎细胞融合而实现。
在用胚胎干细胞制备嵌合体中所用的培养基和溶液制剂，也可用于从具有胚胎干细胞表型的生殖细胞产生嵌合体的过程。这样的培养基和溶液配方由Wheeler(WO 94/26884)描述过，该文献全部(包括所有图表、附图和参考文献)在此引用作为参考。
实施例9
产生猪嵌合体
如实施例8所述，在注射了宿主胚泡之后，检测猪EG细胞系的体内分化能力以及产生嵌合小猪的能力。将Duroc小母猪(约6个月大小)用作宿主胚泡供体，将Duroc或Hampshire×Yorkshire杂交母猪(约1岁大小)用作受体。用类似于Anderson等人(1994)的方法，使胚胎供体和受体的发情期同步。毛皮颜色标记被用于初步鉴别推定的嵌合小猪。从Hampshire×Yorkshire杂交胚胎(黑色和白色的着色，两者都是共显性的等位基因)分离出EG细胞系，而宿主胚胎是Duroc(红色着色是隐性等位基因)。在Duroc小母猪发情期第一天起6天后，收集处于胚泡阶段的胚胎。
将体外传代7-15次的猪EG细胞系用于注射。从饲养层上挑取的EG细胞集落被孵育在0.25％胰蛋白酶-EDTA中5-10分钟，从而解离成每个含有10-20个细胞的小块。用如上所述并类似于Butler等人(1987)的方法，将每个EG细胞块注射入上述的宿主胚泡的胚泡腔。将注射后的胚泡用手术方法转移至受体的子宫，受体处于发情周期的第4天(比供体母猪晚2天)。对宿主胚胎供体进行多次公畜输精，并且在用EG进行注射之后合并宿主的胚泡，以保证有足够数量的胚胎来维持转移后的怀孕。在出生时，检查小猪是否有双重着色情况，这是成功嵌合的预判断标志。
假定的嵌合小猪在出生后5天被杀死，从耳。脑、垂体腺、肺、肝、心、脾、肾、肌肉、睾丸、附睾、胰腺、肠、甲状腺、以及3个不同的表皮部位切取组织样品。从每种切取的组织样品中分离出DNA，用标准PCR扩增法进行分析(类似于Rohrer,G.A.，等人，Genetics,136:231-245,(1994))。还从EG细胞系、假定嵌合体的血细胞、和来自宿主胚泡的亲代的血细胞中分离出DNA，并通过聚合酶链反应(PCR)扩增微卫星(MS)标记SW472而进行分析。PCR扩增产物通过在2％琼脂糖凝胶上凝胶电泳1小时而加以分离，然后按标准的分子生物学程序(Maniatis,目前版本)，用溴化乙锭使DNA条带显现。
如表5所示，总共186个宿主胚胎被来自3种细胞系的EG细胞注射，然后被转入7个受体。6个受体怀孕了(怀孕率=86％)并产下了41头小猪(4头出生时死亡)。一头雄性小组(编号363)表现出显性的皮肤着色嵌合性，这种嵌合性是将EG细胞系PEGC142(Hampshire×Yorkshire杂交种)注入Duroc宿主胚泡后的结果。在小猪的侧面和后面观察到来自EG细胞的白色条，在左后腿最为明显。
嵌合猪No.363在出生后第5天被杀死，从各种主要器官收集组织并如上用PCR进行分析。对微卫星DNA标记进行的PCR扩增证实了嵌合性。
尽管电泳条带的大小大于微卫星标记MS SW472的典型等位基因(Rohrer,J.A.,等人，Genetics,136:231-245,1994)，但是EG细胞和着色嵌合体之间相同的条带图案证实了，该嵌合猪的组织源自EG细胞。对从EG细胞系PEGC142和小猪363获得DNA进行PCR扩增时，扩增出2条DNA条带；但是在宿主胚胎供体母猪和公猪的DNA扩增产物中没有该条带。
嵌合组织包括：脑、垂体腺、肺、肾、肌肉、睾丸、附睾、肠、甲状腺，以及来自耳、侧面、后面和后腿的皮肤。EG细胞特异性条带在肝样品泳道中的染色很浅，并且在来自心脏、脾和胰腺的样品中没有观察到。在这些组织中没有观察到嵌合性可能表示，在肝中只有较少EG细胞对嵌合体有贡献，而在心脏、脾和胰腺中很少或没有贡献。
为了分析微卫星DNA，聚丙烯酰胺凝胶比琼脂糖凝胶更经常使用。因此，将微卫星SW871作为遗传标记来证实皮肤着色嵌合体的嵌合性。表现出皮肤着色嵌合性的猪，在出生后5天被杀死，从血、脑、垂体腺、肺、肝、心、脾、肾、肌肉、睾丸、附睾、胰腺、肠、甲状腺和皮肤收集组织样品。从每种组织样品中分离出DNA，用标准聚合酶链反应(PCR)扩增MS SW871而进行分析。对来自宿主胚泡的亲代、EG细胞系、和皮肤着色嵌合体的组织样品进行MS SW871的PCR扩增之后，扩增片段用8％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳而加以分析。PCR条件如Rohrer等人，Genetics,136:231-245,1994中所述，并且在PCR之前用32P标记引物末端。凝胶通过放射自显影而显现。宿主胚泡的亲代、EG细胞系、和皮肤着色嵌合体的组织样品的微卫星图谱证实了嵌合性。在观察凝胶时，在注射的EG细胞系(PEGC142)和来自皮肤着色嵌合体(小猪363)的大多数组织中，都存在120碱基对的MS SW871等位基因。但是在宿主胚泡的亲代中没有该等位基因。大多数被检查的组织是嵌合的，其中包括血。脑、垂体腺、肺、肝、肾、肌肉、睾丸、附睾、胰腺、肠、甲状腺和皮肤
            表5在注入胚泡后猪EG细胞系的体内分化情况
EG细胞系 转入的胚胎数目 受体数目 怀孕受体数目 出生小猪数目 出生的嵌合小猪数目
PEGC142     105     4     4     20     1
PEGC272     25     1     1     10     0
PEGC367     56     2     1     11     0
实施例10
具有胚胎干细胞表型的生殖细胞的用途
异体移植(异体间移植)。具有外源主要组织相容性(MHC)或其他减低宿主生物体对移植物排异现象的外源或内源抗原和/或基因的细胞、组织或器官，可用本发明方法生产。可用下列方法将外源DNA或同源DNA转至具有胚胎干细胞表型的生殖细胞：电穿孔法、磷酸钙暴露法、微注射法、脂转染法、逆转录病毒或其他病毒或微生物载体法、或其他方法。可对具有胚胎干细胞表型的生殖细胞进行筛选以确定该DNA的掺入情况或抗原表达情况，或直接将其转入胚胎以产生嵌合体，或者用于核转移系统以克隆有蹄动物。从胚胎、胎兽、新生兽、或形成的成熟个体中收获这些细胞、组织和器官，以用于异体移植。用这种方法，可以获得人源化的有蹄动物移植物。
为了替换、修复或增加受损的、无功能的或受破坏的细胞或组织，而生产分化细胞是另一种用途。可用下列方法将外源DNA或同源DNA转至具有胚胎干细胞表型的生殖细胞：电穿孔法、磷酸钙暴露法、微注射法、脂转染法、逆转录病毒或其他病毒或微生物载体法、或其他方法。可对具有胚胎干细胞表型的生殖细胞进行筛选以确定该DNA的掺入情况，直接将其转入胚胎以产生嵌合体，或者用于核转移系统以克隆有蹄动物。从胚胎、或形成的成熟个体中收获这些细胞和组织，以用于修复或修补缺陷。例如，从有蹄动物胎或新生兽获得的器官可用于治疗帕金森氏病人，这种病人有心脏病或脊髓损伤。
生产生物分子
用于制造或加工工艺的，以及作为食物补充剂、添加剂等的药物、诊断试剂或抗体，可用本发明的具有胚胎干细胞表型的猪、牛、绵羊或山羊的生殖细胞进行生产。可用下列方法将外源DNA或同源DNA转至有蹄动物具有胚胎干细胞表型的生殖细胞中：电穿孔法、磷酸钙暴露法、微注射法、脂转染法、逆转录病毒或其他病毒或微生物载体法、或其他方法。可对具有胚胎干细胞表型的生殖细胞进行筛选以确定该DNA的掺入情况，或直接将其转入胚胎以产生嵌合体，或者用于核转移系统以克隆有蹄动物。从胚胎、胎兽、新生兽、或形成的成熟个体中收获这些这些蛋白质或其他分子，进行进一步纯化。例如，可在猪、牛、绵羊和山羊奶中生产人凝血因子Ⅸ，以用于治疗血友病。
可产生具有不同组织或奶蛋白质的转基因猪、牛、绵羊和山羊，然后收集这些蛋白质用于商业或实验用途。可用这种方式产生的医药、治疗、加工、组织或复合蛋白质的例子有下列：血液蛋白(凝血因子Ⅷ和Ⅸ，补体因子或组份，血红蛋白或其他血液蛋白等)；激素(胰岛素、生长激素、甲状腺激素、促性腺激素、PMSG、营养因子、催乳素、催产素、多巴胺、儿茶酚胺等)；生长因子(EGF、PDGF、NGF、IGF等)；细胞因子(白细胞介素、CSF、GMCSF、TNF、TGFα、TGF β等)；酶(组织纤溶酶原激活物、链激酶、胆固醇生物合成或降解酶、消化酶、类固醇生成酶、激酶、磷酸二酯酶。甲基化酶、脱甲基化酶、脱氢酶、纤维素酶、蛋白酶、脂酶、磷脂酶、芳香酶(aromatase)、细胞色素、腺苷酸或鸟苷酸环化酶等)；激素或其他受体(LDL、HDL、类固醇、蛋白质、肽、脂类、或前列腺素等)；结合蛋白(类固醇结合蛋白、生长激素或生长因子结合蛋白等)；免疫系统蛋白(抗体、SLA或MHC基因产物)；抗原(细菌的、寄生虫的、病毒的抗原、变应原等)；翻译或转录因子、癌蛋白或原癌蛋白、奶蛋白(酪蛋白、乳白蛋白、乳清等)；肌肉蛋白(肌球蛋白、原肌球蛋白等)。
转基因的核苷酸序列可以是最终从基因组猪、牛、绵羊和山羊获得的蛋白质的前体形式。较佳地，例如通过使用组织特异性转录起始序列，而使转基因的表达针对感兴趣的组织。或者，可用本领域技术人员熟知的技术来筛选组织，以确定转基因的表达，如通过将转基因用作探针来检测选定组织的mRNA。在适当组织中表达转基因的嵌合和转基因动物，被进行繁育并从子代中获得转基因产物。
增强家畜的遗传品质
猪、牛、绵羊和山羊的具有胚胎干细胞表型的生殖细胞可被用于改善疾病抗性，生长速度和效率，奶产量、重量和组成，繁殖效率和性能。此外，通过控制特定基因在发育和成长成熟过程的表达可以改善性能，其中包括对病原体的自身免疫反应、提高生长促进物质的分泌、刺激包括哺乳在内的繁殖过程。用具有胚胎干细胞表型的有蹄动物生殖细胞形成的、遗传改造过的个体，可作为猪、牛、绵羊和山羊新品系或品种的基础动物。例如，奶蛋白质成分的改变可以提高子代的成活率并提高生长速度。
可通过具有胚胎干细胞表型的生殖细胞中的同源重组来除去或改变有害的等位基因、基因、或DNA序列。将这种转基因的具有胚胎干细胞表型的生殖细胞引入宿主胚胎中，然后产生转基因个体。这些遗传改造过的个体，可作为猪、牛、绵羊和山羊新品系或品种的基础动物。
本发明是用认为最实用和最优选的例子进行说明和描述的。但是，应理解，本领域技术人员在阅读了公开内容之后，可在本发明范围在内对本发明作跟踪改动和改进。

Claims (10)

1．一种生产未分化的、具有胚胎干细胞表型的有蹄动物细胞的持续培养物的方法，其特征在于，它包括：
从有蹄动物胚胎中收集原生殖细胞；
培养该生殖细胞超过30天；
从培养的生殖细胞中选择出与猪胚胎干细胞相象并表现出胚胎干细胞表型的细胞。
2．如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：
从收集的生殖细胞中预选择那些碱性磷酸酶活性为阳性的细胞；
其中该原生殖细胞是从选自下组的胚胎的背侧肠系膜或性腺嵴中收集的：22-28天的猪胚胎，和34-40天的牛胚胎。
3．如权利要求2所述的方法，其特征在于，该培养是在含5％±2％二氧化碳的空气，温度为39℃±3℃，使用含15％(v/v)胎牛血清和1mM L-谷氨酰胺的Dulbecco改进的Eagles培养基，在失活的STO细胞上进行；
其中有蹄动物胚胎是25天±1天的猪胚胎；
而且其中该方法形成超过1000个具有胚胎干细胞表型的猪胚胎干细胞；
且选出的具有胚胎干细胞表型的细胞在该STO细胞上培养时，可维持该表型120天。
4．一种持续的有蹄动物细胞培养物，它是具有胚胎干细胞表型的未分化的有蹄动物细胞，该细胞来自有蹄动物胚胎的性腺嵴；
其中所述细胞是猪细胞，而且培养物中含有超过2000个具有胚胎干细胞表型的猪胚胎干细胞。
5．一种制备嵌合的有蹄动物的方法，其特征在于，它包括：
(a)将衍生自生殖细胞、具有胚胎干细胞表型并具有第一遗传互补体的有蹄动物细胞，引入与生殖细胞相同物种的受体胚胎中，该受体具有第二遗传互补体，从而形成嵌合的有蹄动物胚胎，
(b)将嵌合的有蹄动物胚胎置于适合完成发育过程的环境中，从而形成嵌合的有蹄动物。
6．如权利要求11所述的方法，其特征在于，该细胞被引入处于植入前阶段如胚泡阶段的胚胎中；
其中，第一遗传互补体与第二遗传互补体不同，
其中，第一遗传互补体包括：稳定地整合入具有胚胎干细胞表型的细胞的遗传互补体中的外源核苷酸序列。
7．如权利要求6所述的方法，其特征在于，该第一遗传互补体包括编码选自下组蛋白质的外源核苷酸序列：以可回收形式和数量表达的人因子Ⅸ、人血液蛋白、人激素、人生长因子、人细胞因子、人酶、人激素受体、人结合蛋白、抗原、翻译因子、转录因子、癌蛋白、原癌蛋白、人奶蛋白质、人肌肉蛋白。
8．如权利要求6所述的方法，其特征在于，该第一遗传互补体包括编码选自下组蛋白质的猪核苷酸序列：改善猪畜体组成、猪畜体重量、猪疾病抗性和猪奶产量的蛋白。
9．一种转基因的有蹄动物，其特征在于，它是用包括下列步骤的方法产生的：
(a)从有蹄动物胚胎的性腺嵴中收集原生殖细胞；
(b)培养该生殖细胞超过30天；
(c)从培养的细胞中，选择出与有蹄动物胚胎干细胞相象并表现出胚胎干细胞表型的培养的生殖细胞；
(d)将外源DNA引入培养的生殖细胞；
(e)将步骤(d)的细胞引入处于植入前阶段的受体胚胎；和
(f)将步骤(e)的胚胎引入适合完成发育的环境，形成转基因的有蹄动物。
10．如权利要求9所述的转基因的有蹄动物，其特征在于，该有蹄动物是与步骤(f)的转基因有蹄动物交配而得的子代。
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