CN1176576C - 澳洲青苹快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
一种澳洲青苹快速繁殖方法，采用了组培苗的制备、组培苗生根培养、长苗炼苗培养、移栽组培方法，在暗室进行组培苗的制备和组培苗生根培养，并在自然光下长苗、长根、炼苗同步进行，组培步骤采用了适合于澳洲青苹快速繁殖的增殖培养基和生根培养基，增殖和生根效果好，使澳洲青苹生根率达79%以上，而且根系粗壮整齐，同时组培苗生长健壮，叶色浓绿，有效地节约了人力和物力，移栽成活率可达85.07%，为工厂化生产奠定了基础。本发明组培方法具有简便易行、简化了程序、提高了工效、降低了成本等优点，可用于澳洲青苹的快速繁殖。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术的植物再生，以及未分化的人类、动物或植物细胞技术领域，具体涉及到澳洲青苹的快速繁殖方法。
背景技术
澳洲青苹(Granny Smith Shoots)是我国70年代由阿尔巴尼亚引进的品种，果实色泽翠绿、汁液多、耐贮藏，是加工、鲜食兼用的优良品种，曾在许多果区推广，但由于果味太酸在国内市场出售困难而被放弃。近年随着我国加入WTO以及国际市场高酸苹果和高酸果汁的流行，澳洲青苹鲜果外贸出口前景好，以其为原料的加工果汁不需人工调酸，酸度即可达4.5以上，不但价格高而且深受外商欢迎，澳洲青苹的需求量也正在迅速扩大，呈供不应求趋势。
采用植物组织培养方法可以在短期内快速繁殖多种植物，不仅繁殖速率极高，且因为其是无性繁殖，可以保持原繁殖母株的优良性状，近年来在生产上应用越来越广。植物组织培养方法是利用植物细胞的全能性，即组成植物体的每一个细胞都具有发育成为一个完整植株的潜在能力，采取植物体上的单个细胞、细胞团、分生组织或器官的一部分，通过人工配制不同营养成分和激素的培养基来培养并调控其发育，使这些细胞、组织等形成成千上万个小植株并且保持了母本植株的全部的优良性状，这种方法可以在短时间内获得大量的组培苗，并能在人工控制条件的车间内一年四季进行，因而可以实现种苗繁殖的工厂化生产，在较小的面积内进行大规模生产，无需占用大量土地。
上述的植物组织培养方法，先培养成无根苗，再将无根苗在生根培养基中诱导生根，长苗和生根在两种不同培养基中进行，在繁殖生根培养和炼苗阶段，通常先在室内培养一段时间，然后移到自然光下进行长苗和炼苗。增加了繁殖生根培养和炼苗时间。
澳洲青苹组培苗生根困难，移栽成活率低使其一直无法实现大规模工厂化生产，至今国内外尚未见到利用组织培养方法进行大规模生产澳洲青苹苗的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题以及解决其技术问题所采用的技术方案是它包括如下步骤：
(1)组培苗的制备
剪取大田栽培的盛果期优良单株的无病虫害的营养枝为母本，在光照强度为800～8000lx、温度20～25℃、湿度为75％～90％的温室保湿沙培，利用新生长的幼嫩枝条作为外植体，然后取澳洲青苹的幼嫩茎段，流水冲洗干净，滤纸吸干。在超净工作台上将取下的茎尖或侧芽在75％酒精中浸泡10～30秒，无菌水冲洗3次，每次5分钟，置入0.1％HgCl2溶液中灭菌5～15分钟，用无菌水冲洗3～5次，每次5分钟，用无菌滤纸吸干，切成带1～2个芽的茎段，作为外植体扦插入增殖培养基中进行增殖培养，该增殖培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
白砂糖 10～35g
琼脂粉 4～8g
6-(苄胺基)嘌呤 0.1～0.5mg
萘乙酸 0.08～0.12mg
配制好的培养基分装在培养瓶中，每瓶装25～35毫升，盖好瓶盖，在压力为0.1～0.15MPa下灭菌25分钟，将培养瓶置于光照强度为3500～4500lx、温度为20℃～30℃、湿度为70％～90％的培养室中培养。选取繁殖8～30代的4～6cm高健壮组培苗为材料，切成长1.4～1.6cm带顶芽或1～2个侧芽的上部茎段和中部茎段进行生根培养。
(2)组培苗生根培养
将(1)中切好的茎段放入生根培养基中进行生根培养，所用的生根培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
白砂糖 10～35g
琼脂粉 4～8g
吲哚-3-丁酸 0.4～1mg
萘乙酸 0.08～0.14mg
或所用的生根培养基为在1升1/2MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
白砂糖 10～35g
琼脂粉 4～8g
吲哚-3-丁酸 0.4～1mg
萘乙酸 0.08～0.14mg
多效唑 0.8～1.5mg
将配制好的生根培养基分装在培养瓶中，每瓶25～35毫升，盖好瓶盖，在压力为0.1～0.15MPa下灭菌25分钟，培养瓶移入温度为18℃～22℃、湿度为70％～90％的暗室中进行暗培养，暗培养3～7天。
(3)长苗炼苗培养
将经过暗培养的培养瓶直接移入光照强度为800～8000lx、温度20～25℃、湿度为75％～90％的温室内，每天光照9～11小时，驯化20～25天，打开瓶盖，炼苗5～10天，开盖炼苗时培养瓶加0.5～1.0厘米高的自来水防污保湿，当苗高5～8厘米，根长1～2.5厘米时进行移栽。
(4)移栽
取出(3)中经过炼苗的幼苗，洗净根上残留的生根培养基，将根在含50ppm的萘乙酸泥浆中浸泡处理2小时，移入装有营养土的移栽容器中，移栽前浇足1/10MS基本培养基，上覆盖塑料薄膜，保持湿度在70％～100％，7天后逐渐通风，15天后揭膜，在此期间喷洒1/10MS基本培养基溶液，继续在光照强度为800～8000lx、温度20～25℃、湿度为70％～90％的温室内，培养20～50天，在苗高15～20厘米，有8～15片叶时移栽入大田。
本发明的优选增殖培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
白砂糖 15～30g
琼脂粉 4～6g
6-(苄胺基)嘌呤 0.2～0.4mg
萘乙酸 0.09～0.11mg
本发明的优选生根培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
白砂糖 15～30g
琼脂粉 4～6g
吲哚-3-丁酸 0.6～0.8mg
萘乙酸 0.08～0.13mg
本发明的优选生根培养基也可以为在1升1/2MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
白砂糖 15～30g
琼脂粉 4～6g
吲哚-3-丁酸 0.6～0.8mg
萘乙酸 0.08～0.13mg
多效唑 0.8～1.2mg
本发明的最佳增殖培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
白砂糖 20g
琼脂粉 4.5g
6-(苄胺基)嘌呤 0.3mg
萘乙酸 0.1mg
本发明的最佳生根培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
白砂糖 20g
琼脂粉 4.5g
吲哚-3-丁酸 0.7mg
萘乙酸 0.1mg
本发明的最佳生根培养基也可以为在1升1/2MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
白砂糖 20g
琼脂粉 4.5g
吲哚-3-丁酸 0.7mg
萘乙酸 0.1mg
多效唑 1mg
本发明采用暗培养进行组培苗的制备和组培苗生根培养促进生根和培育壮苗，并在自然光下长苗、长根、炼苗同步进行的组织培养方法，组培步骤采用了适合于澳洲青苹快速繁殖的增殖培养基和生根培养基，增殖和生根效果好，使澳洲青苹生根率达79％以上，而且根系粗壮整齐，同时组培苗生长健壮，叶色浓绿，有效地节约了人力和物力，移栽成活率可达85.07％，为工厂化生产奠定了基础。本发明组培方法具有简便易行、简化了程序、提高了工效、降低了成本等优点，可用于澳洲青苹的快速繁殖。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
(1)组培苗的制备
原材料的预处理：剪取大田栽培的盛果期优良单株的无病虫害的健壮营养枝为母本，在温室保湿沙培，利用新生长的幼嫩枝条作为外植体，温室条件为：光照强度为800-8000lx，温度20～25℃，湿度为75％～90％；取材：取澳洲青苹的幼嫩茎段，流水冲洗干净，滤纸吸干；材料消毒：在超净工作台上将取下的茎尖或侧芽在75％酒精中浸泡10～30秒，无菌水冲洗3次，每次5分钟，置入0.1％HgCl2溶液中灭菌5～15分钟，用无菌水冲洗3～5次，每次5分钟，用无菌滤纸吸干，切成带1～2个芽的茎段，作为外植体扦插入增殖培养基中进行增殖培养。
组培苗长至4～6厘米时，可在超净工作台上，无菌条件下，将苗取出，再切成带1～2个芽的茎段，插入新配制的增殖培养基中进行增殖，如此反复，可实现苗木的快速繁殖，在短期内获得大量的无菌苗。组培苗的增殖培养在放有增殖培养基的无菌培养瓶中进行。本实施例所用的增殖培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
白砂糖 20g
琼脂粉 4.5g
6-(苄胺基)嘌呤 0.3mg
萘乙酸 0.1mg
配制好的增殖培养基分装在培养瓶中，每瓶装25～35毫升，盖好瓶盖，在压力为0.1～0.15MPa下灭菌25分钟。将培养瓶置于培养室中培养，培养室内的光照强度为3500～4500lx，温度为20℃～30℃，湿度为70％～90％，每一次继代培养使用新鲜配置的增殖培养基，继代培养条件与第一代培养条件相同。选取繁殖8～30代的4～6cm高健壮组培苗为材料，切成长1.4～1.6cm带顶芽或1～2个侧芽的上部茎段和中部茎段进行生根培养，下部茎段用于繁殖。实验表明上部茎段和中部茎段的生根率分别为：78.85％和73.68％，是组培苗生根的最佳部位，而基部茎段生根率较低，作繁殖之用较好。
(2)组培苗生根培养
将(1)中切好的茎段放入生根培养基中进行生根培养，本实施例的生根培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
白砂糖 20g
琼脂粉 4.5g
吲哚-3-丁酸 0.7mg
萘乙酸 0.1mg
将配制好的生根培养基分装在培养瓶中，每瓶25～35毫升，盖好瓶盖，在压力为0.1～0.15MPa下灭菌25分钟。培养瓶移入暗室中进行暗培养，暗室中温度为18℃～22℃，湿度为70％～90％，暗培养可明显促使组培苗生根，3～7天的暗培养促进组培苗生根，平均生根率为79％～90％，平均根数为3～5条，且根系整齐健壮，并且在一定程度上可以解除多效唑对组培苗生长的抑制作用，在生根的同时保证组培苗生长健壮。
上述配比中的吲哚-3-丁酸和萘乙酸可使生根率达81.82％，且根洁白、粗壮、整齐；当吲哚-3-丁酸浓度提高到1.3mg/L时虽然生根率有所提高，但是根色发黄，且根的发育呈现畸形。
(3)长苗炼苗培养
将经过暗培养的培养瓶直接移入光照强度为800～8000lx、温度20～25℃、湿度为75％～90％的温室内，每天光照9～11小时，驯化20～25天，打开瓶盖，炼苗5～10天，开盖炼苗时培养瓶加0.5～1.0厘米高自来水防污保湿。当苗高5～8厘米，根长1～2.5厘米时进行移栽。
(4)移栽
取出(3)中经过炼苗的幼苗，洗净根上残留的生根培养基，将根在含50ppm的萘乙酸泥浆中浸泡处理2小时，可使移栽成活率提高到85.07％，将苗移入装有营养土(蛭石∶腐殖土∶田园土＝2∶1∶2)的移栽容器中，移栽容器可采用塑料钵或育苗盘或苗床，移栽前浇足1/10MS基本培养基溶液，上覆盖塑料薄膜，保持湿度在70％～100％，7天后逐渐通风，15天后揭膜，在此期间喷洒1/10MS基本培养基溶液，继续在光照强度为800～8000lx、温度20～25℃、湿度为70％～90％的温室内，培养20～50天，在苗高6～15厘米，有8～15片叶时移栽入大田。经移栽实验，蛭石和营养土为移栽基质组培苗成活率在77％以上，而且苗生长整齐一致，以田园土作基质组培苗成活率最低，适宜组培苗移栽的基质应当保水性强通气性好，为了使组培苗更好的生长，移栽基质还应当有足够的营养物质，虽然以蛭石为基质移栽成活率高，但蛭石缺乏营养、疏松易散，移栽成活后还要再次移栽，增加了工序、降低了成苗率，故以营养土为移栽基质最为适宜，成活率为77.78％，而且苗生长健壮整齐。
实施例2
在本实施例组培苗的培养步骤中，所用的增殖培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
白砂糖 10g
琼脂粉 4g
6-(苄胺基)嘌呤 0.1mg
萘乙酸 0.08mg
在组培苗生根培养步骤中，所用的生根培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
白砂糖 10g
琼脂粉 4g
吲哚-3-丁酸 0.4mg
萘乙酸 0.08mg
在本实施例中其它培养步骤与实施例1相同。
实施例3
在本实施例组培苗的培养步骤中，所用的增殖培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
白砂糖 35g
琼脂粉 8g
6-(苄胺基)嘌呤 0.5mg
萘乙酸 0.12mg
在组培苗生根培养步骤中，所用的生根培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
白砂糖 35g
琼脂粉 8g
吲哚-3-丁酸 1mg
萘乙酸 0.14mg
在本实施例中其它培养步骤与实施例1相同。
实施例4
在以上实施例1～3组培苗生根培养步骤中，所用的生根培养基也可以为在1升1/2MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
白砂糖 20g
琼脂粉 4.5g
吲哚-3-丁酸 0.7mg
萘乙酸 0.1mg
多效唑 1mg
在本实施例中所用的增殖培养基与相应的实施例相同。其它培养步骤与实施例1相同。实验结果表明：本实施例的生根培养基在1/2MS基本培养基中加入吲哚-3-丁酸0.7mg/L、萘乙酸0.1mg/L、多效唑1mg/L能同时完成生根和长苗，生根率达80％，同时幼苗生长健壮整齐，简化了培养程序、赢得了时间、提高了工效、降低了成本，为工厂化生产奠定了基础。
实施例5
在以上实施例1～3组培苗生根培养步骤中，所用的生根培养基也可以为在1升1/2MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
白砂糖 10g
琼脂粉 4g
吲哚-3-丁酸 0.4mg
萘乙酸 0.08mg
多效唑 0.8mg
在本实施例中所用的增殖培养基与相应的实施例相同。其它培养步骤与实施例1相同。
实施例6
在以上实施例1～3组培苗生根培养步骤中，所用的生根培养基也可以为在1升1/2MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
白砂糖 35g
琼脂粉 8g
吲哚-3-丁酸 1mg
萘乙酸 0.14mg
多效唑 1.5mg
在本实施例中所用的增殖培养基与相应的实施例相同。其它培养步骤与实施例1相同。
为了证明本发明的有益效果，发明人采用了本发明第一个实施例1方法以及培养过程中所用的增殖培养基、生根培养基，进行了实验室实验，实验情况如下：
实验材料：澳洲青苹枝条、MS培养基、1/2MS培养基、萘乙酸、吲哚-3-丁酸、多效唑、6-(苄胺基)嘌呤、琼脂粉、白砂糖。
材料提供单位：澳洲青苹枝条由陕西恒兴饮料有限公司提供，MS基本培养基和1/2MS基本培养基按照《植物组织培养》一书MS基本培养基配方由陕西师范大学生命科学院中药材组培快繁实验室配制，萘乙酸由北京市双旋微生物培养基制品厂生产，吲哚-3-丁酸、多效唑和6-(苄胺基)嘌呤由中国医药(集团)上海化学试剂公司生产，琼脂粉由北京奥博星生物技术责任有限公司生产，白砂糖市售。
实验仪器：超净工作台、培养瓶。
实验方法与实验结果：
1、组培苗不同茎段生根的比较
本试验是在增殖生长的基础上，选取生长整齐一致的组培苗分别切成上中下三段接种在1/2MS加入吲哚-3-丁酸0.5mg/L培养基上在自然光下生根并长苗，实验结果见表1。
表1 不同茎段生根效果表
茎段 接种株数 生根株数 生根率(％) 平均根数
上 52 41 78.85 3.29
中 38 28 73.68 3.04
下 46 32 69.56 2.97
实验结论：上部茎段和中部茎段是组培苗生根的最佳部位，而基部茎段作繁殖之用较好。
2、激素对生根的影响
(1)萘乙酸和不同浓度的吲哚-3-丁酸对生根的影响
在1/2MS中加入萘乙酸0.1mg/L和吲哚-3-丁酸进行生根培养，实验结果见表2。
表2 萘乙酸与吲哚-3-丁酸不同浓度对生根的影响表
培养 吲哚-3-丁酸 萘乙酸浓度 接种株数 生根株数 生根率
基号 浓度(mg/L) (mg/L) (％)
1 0.4 0.1 56 42 75.00
2 0.7 0.1 54 43 79.63
3 1.0 0.1 55 45 81.82
4 1.3 0.1 57 47 82.46
实验结论：吲哚-3-丁酸浓度为1.0和萘乙酸浓度为0.1时生根率达81.82％，且根洁白、粗壮、整齐；当吲哚-3-丁酸浓度提高到1.3mg/L时虽然生根率有所提高，但是根色发黄，且根的发育呈现畸形。
(2)多效唑浓度对生根的影响
在1/2MS基本培养基中加入吲哚-3-丁酸0.7mg/L、萘乙酸0.1mg/L作为进行多效唑试验的基本配比，加入多效唑0.0～5.0mg/L，进行生根培养，实验结果见表3。
表3 多效唑不同浓度对生根的影响表
多效唑浓度 接种株数 生根株数 生根率(％) 平均苗高(cm) 长势
(mg/L)
0 70 54 77.29 4.54 ++++
1 72 57 79.17 4.25 +++
3 79 63 79.75 3.87 +++
5 77 62 80.52 3.55 ++
实验结论：在1/2MS基本培养基中加入吲哚-3-丁酸0.7mg/L、萘乙酸0.1mg/L、多效唑1mg/L能同时完成生根和长苗，简化了培养程序、赢得了时间、提高了工效、降低了成本，为工厂化生产奠定了基础。
3、暗培养对生根的促进作用
将澳洲青苹组培苗接种于1/2MS基本培养基加入吲哚-3-丁酸0.7mg/L、萘乙酸0.1mg/L、多效唑1mg/L的培养基上，分别进行0、3、7、12天暗培养后即进行自然光长苗和炼苗，实验结果见表4。
表4 不同暗培养时间对生根的影响表
暗培养时间 接种株数 生根株数 生根率 平均根数 平均苗高(cm)
(天)
0 59 47 79.66 3.34 4.22
3 62 51 82.26 3.86 4.28
7 59 51 86.44 4.39 4.61
12 52 46 88.46 4.58 5.32
实验结论：3～7天的暗培养不仅有效促进组培苗生根且经光培养炼苗生长健壮，同时还发现适当的暗培养能够解除多效唑对苗生长的拟制作用。
4移栽
(1)移栽基质实验
分别试验了蛭石、营养土(蛭石∶腐殖土∶田园土＝2∶1∶2)、田园土对组培苗移栽成活率的影响情况，实验结果见表5。
表5 不同基质对组培苗移栽成活率的影响表
基质 处理株数 成活株数 成活率(％)
蛭石 130 102 78.46
营养土 135 105 77.78
田园土 122 76 62.29
实验结论：以蛭石和营养土为移栽基质组培苗成活率高、生长整齐一致，而以田园土作基质组培苗成活率最低，适宜组培苗移栽的基质应当保水性强通气性好，为了使组培苗更好的生长，移栽基质还应当有足够的营养物质，虽然以蛭石为基质移栽成活率高，但蛭石缺乏营养、疏松易散，移栽成活后还要再次移栽，增加了工序、降低了成苗率，故以营养土为移栽基质最为适宜。
(2)萘乙酸对组培苗移栽成活率的影响
以清水为对照进行了萘乙酸不同浓度及处理方法对组培苗移栽成活率影响的试验，将处理过的小苗直接移栽在营养土中，实验结果见表6。
表6 不同浓度萘乙酸及处理方法对组培苗移栽成活率的影响表
萘乙酸浓度(mg/L) 处理株数 成活株数 成活率(％)
0(清水) 203 164 80.79
50(清水) 220 185 84.09
50(泥浆) 221 188 85.07
100(清水) 214 179 83.64
实验结论：含50ppm的萘乙酸泥浆浸泡处理幼苗根2小时可有效提高组培苗移栽成活率。
Claims (3)
1、一种澳洲青苹快速繁殖方法，其特征在于它包括如下步骤：
(1)组培苗的制备
剪取大田栽培的盛果期优良单株的无病虫害的营养枝为母本，在光照强度为800～8000lx、温度20～25℃、湿度为75％～90％的温室保湿沙培，利用新生长的幼嫩枝条作为外植体，然后取澳洲青苹的幼嫩茎段，流水冲洗干净，滤纸吸干；在超净工作台上将取下的茎尖或侧芽在75％酒精中浸泡10～30秒，无菌水冲洗3次，每次5分钟，置入0.1％HgCl2溶液中灭菌5～15分钟，用无菌水冲洗3～5次，每次5分钟，用无菌滤纸吸干，切成带1～2个芽的茎段，作为外植体扦插入增殖培养基中进行增殖培养，该增殖培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
白砂糖 10～35g
琼脂粉 4～8g
6-(苄胺基)嘌呤 0.1～0.5mg
萘乙酸 0.08～0.12mg
配制好的培养基分装在培养瓶中，每瓶装25～35毫升，盖好瓶盖，在压力为0.1～0.15MPa下灭菌25分钟，将培养瓶置于光照强度为3500～4500lx、温度为20℃～30℃、湿度为70％～90％的培养室中培养，选取繁殖8～30代的4～6cm高健壮组培苗为材料，切成长1.4～1.6cm带顶芽或1～2个侧芽的上部茎段和中部茎段进行生根培养；
(2)组培苗生根培养
将(1)中切好的茎段放入生根培养基中进行生根培养，所用的生根培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
白砂糖 10～35g
琼脂粉 4～8g
吲哚-3-丁酸 0.4～1mg
萘乙酸 0.08～0.14mg
或所用的生根培养基为在1升1/2MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
白砂糖 10～35g
琼脂粉 4～8g
吲哚-3-丁酸 0.4～1mg
萘乙酸 0.08～0.14mg
多效唑 0.8～1.5mg
将配制好的生根培养基分装在培养瓶中，每瓶25～35毫升，盖好瓶盖，在压力为0.1～0.15MPa下灭菌25分钟，培养瓶移入温度为18℃～22℃、湿度为70％～90％的暗室中进行暗培养，暗培养3～7天；
(3)长苗炼苗培养
将经过暗培养的培养瓶直接移入光照强度为800～8000lx、温度20～25℃、湿度为75％～90％的温室内，每天光照9～11小时，驯化20～25天，打开瓶盖，炼苗5～10天，开盖炼苗时培养瓶加0.5～1.0厘米高的自来水防污保湿，当苗高5～8厘米，根长1～2.5厘米时进行移栽；
(4)移栽
取出(3)中经过炼苗的幼苗，洗净根上残留的生根培养基，将根在含50ppm的萘乙酸泥浆中浸泡处理2小时，移入装有营养土的移栽容器中，移栽前浇足1/10MS基本培养基，上覆盖塑料薄膜，保持湿度在70％～100％，7天后逐渐通风，15天后揭膜，在此期间喷洒1/10MS基本培养基溶液，继续在光照强度为800～8000lx、温度20～25℃、湿度为70％～90％的温室内，培养20～50天，在苗高15～20厘米，有8～15片叶时移栽入大田。
2、按照权利要求1所述的澳洲青苹快速繁殖方法，其中增殖培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
白砂糖 15～30g
琼脂粉 4～6g
6-(苄胺基)嘌呤 0.2～0.4mg
萘乙酸 0.09～0.11mg
其中生根培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
白砂糖 15～30g
琼脂粉 4～6g
吲哚-3-丁酸 0.6～0.8mg
萘乙酸 0.08～0.13mg
其中生根培养基或为在1升1/2MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
白砂糖 15～30g
琼脂粉 4～6g
吲哚-3-丁酸 0.6～0.8mg
萘乙酸 0.08～0.13mg
多效唑 0.8～1.2mg
3、按照权利要求1所述的澳洲青苹快速繁殖方法，其中增殖培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
白砂糖 20g
琼脂粉 4.5g
6-(苄胺基)嘌呤 0.3mg
萘乙酸 0.1mg
其中生根培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
白砂糖 20g
琼脂粉 4.5g
吲哚-3-丁酸 0.7mg
萘乙酸 0.1mg
其中生根培养基或为在1升1/2MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
白砂糖 20g
琼脂粉 4.5g
吲哚-3-丁酸 0.7mg
萘乙酸 0.1mg
多效唑 1mg
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