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CN119522274A - 脂肪酶变体和包含这样的脂肪酶变体的组合物 - Google Patents

脂肪酶变体和包含这样的脂肪酶变体的组合物 Download PDF

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CN119522274A
CN119522274A CN202380048434.6A CN202380048434A CN119522274A CN 119522274 A CN119522274 A CN 119522274A CN 202380048434 A CN202380048434 A CN 202380048434A CN 119522274 A CN119522274 A CN 119522274A
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CN
China
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amino acid
substitution
variant
acid residue
lipase
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Application number
CN202380048434.6A
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J·文德
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Novozymes AS
Original Assignee
Novozymes AS
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Publication date
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Abstract

本发明涉及与亲本相比在中性左右的pH的活性降低的脂肪酶变体。本发明还涉及包含本发明的脂肪酶变体的组合物；编码本发明的脂肪酶变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及产生和使用这些变体进行清洁的方法。

Description

脂肪酶变体和包含这样的脂肪酶变体的组合物
序列表的引用
本申请含有计算机可读形式的序列表，其通过援引并入本文。
发明背景
技术领域
本发明涉及脂肪酶变体、包含本发明的脂肪酶变体的组合物、编码本发明的变体的多核苷酸、包含本发明的多核苷酸的核酸构建体、包含本发明的多核苷酸或核酸构建体的表达载体、包含本发明的核酸构建体或表达载体的宿主细胞。最后，本发明涉及用本发明的变体或组合物清洁表面的方法、用本发明的脂肪酶变体或组合物水解脂肪酶底物的方法、用本发明的变体或组合物洗涤衣物的方法、以及产生本发明的变体的方法。
背景技术
脂肪酶是重要的生物催化剂，其已经示出对于不同应用是有用的。野生型疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶(与柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)同义)的变体作为洗涤剂组合物中的活性成分已被商业化，用于通过水解甘油三酯以产生脂肪酸来去除脂质污渍。
洗涤剂、清洁和/或织物护理组合物包含活性成分，这些成分干扰脂肪酶去除脂质污渍的能力。许多已知的具有良好洗涤性能的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶变体在洗涤期间形成产生气味的短链脂肪酸和/或具有短储存稳定性。
WO 2016/050661(诺维信公司(Novozymes))涉及具有减少的气味产生的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶变体，其中这些脂肪酶变体包含在对应于位置210(其不是带负电荷的氨基酸)和位置255(其不是I)的位置处的取代，并且其中位置256不是K。
WO 2017/001673(诺维信公司(Novozymes))披露了具有减少的气味产生的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶变体，其中这些脂肪酶变体包含一个或多个选自以下的取代：使用SEQID NO:10用于位置编号的F7H/K/R、F51A/I/L/V/Y、T143A/G/S/V、A150G/V、H198A/D/E/F/G/I/L/N/Q/S/T/V/Y、N200H/K/Q/R、I202G/L/V、S224C/F/H/I/L/P/Y、L227D/E/K/R、V228P、P229H/K/R、V230H/K/L/R、I255A/G/N/P/S/T/V/Y、P256A/K/N/Q/R/S/T/W、A257F/H/I/L/V/Y、L259F/Y、和W260D/E/F/H/I/L/N/Q/S/T/Y，或选自H198A/D/E/F/G/I/L/N/Q/S/T/V/Y、F7H/K/R、F51A/I/L/V/Y、T143A/G/S/V、A150G/V、N200H/K/Q/R、I202G/L/V、S224C/F/H/I/L/P/Y、L227D/E/K/R、V228P、P229H/K/R、V230H/K/L/R、I255A/G/N/P/S/T/V/Y、T256A/K/N/Q/R/S/P/W、A257F/H/I/L/V/Y、L259F/Y、和W260D/E/F/H/I/L/N/Q/S/T/Y的取代。
尽管取得了进展，但仍然需要和期望具有改善的特性的脂肪酶。
发明内容
本发明的一个重要目标是提供在中性左右的pH(即，约pH 6-8，特别地约pH 7)具有降低的脂肪酶活性的脂肪酶变体。降低的活性导致水解短链脂质底物的脂肪酶变体产生的气味减少。在更高的pH，即，约pH 8-11，脂肪酶变体所造成的气味产生比在中性左右的pH的更高。这样的脂肪酶变体可以有利地用于例如清洁衣物。在洗涤衣物期间，洗涤溶液的pH较高(例如，pH 8-11)，而在随后的漂洗周期期间漂洗水的pH为约中性，即，pH 6-8。因此，本发明的脂肪酶变体通过减少pH较低(即，约中性)的漂洗循环期间的气味产生，来减轻高pH的洗涤循环期间发生的气味产生问题。
本发明涉及分离的脂肪酶变体，其选自包含以下的组(i)、(ii)和(iii)中的一个或多个：
(i)在对应于SEQ ID NO:8的多肽的位置202、252和269的一个或多个位置处的取代；
(ii)在对应于SEQ ID NO:8的多肽的位置40、56、57、91、98、108、118、210、244和254的一个或多个位置处的取代；以及
(iii)在对应于SEQ ID NO:8的多肽的位置23、27、40、51、56、60、118、244和256的一个或多个位置处的取代；
其中该变体具有脂肪酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:8的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性，但小于100％的序列同一性，其中该变体任选地在N-末端和/或C-末端处包含一个或多个氨基酸延伸，或在N-末端和/或C-末端处包含一个或多个氨基酸截短，并且其中该变体具有脂肪酶活性。
在优选的实施例中，脂肪酶变体具有来自组(i)的一个或多个取代，特别地所有取代。在优选的实施例中，脂肪酶变体具有来自组(ii)的一个或多个取代，特别地所有取代。在优选的实施例中，脂肪酶变体具有来自组(i)的一个或多个取代，特别地所有取代，以及来自组(ii)的一个或多个取代，特别地所有取代。在另一个优选的实施例中，脂肪酶变体具有来自组(i)的一个或多个取代，特别地所有取代，以及来自组(iii)的一个或多个取代，特别地所有取代。
在一个方面，本发明涉及颗粒，这些颗粒包含：
(a)包含本发明的变体的核心，以及，任选地
(b)由包围该核心的一个或多个层组成的包衣。
在另一方面，本发明涉及液体组合物，这些液体组合物包含本发明的变体和酶稳定剂，例如多元醇如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、可逆蛋白酶抑制剂、硼酸或硼酸衍生物，例如芳族硼酸酯或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸。
本发明还涉及包含本发明的变体、本发明的颗粒、或本发明的液体组合物的组合物。在优选的实施例中，组合物包含一种或多种表面活性剂。
本发明还涉及一种编码本发明的变体的多核苷酸。
在一个方面，本发明涉及一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含本发明的多核苷酸。本发明还涉及一种用本发明的多核苷酸转化的重组宿主细胞。在一个方面，本发明涉及产生本发明的脂肪酶变体的方法，该方法包括：
a.在适合于表达该变体的条件下培养本发明的重组宿主细胞；以及
b.回收该变体。
本发明还涉及用于水解脂肪酶底物的方法，该方法包括在有利于本发明的脂肪酶变体水解该底物的条件下将该底物与该脂肪酶变体或本发明的组合物混合。
在另一方面，本发明涉及用于从表面去除脂质污渍材料的方法，这些方法包括在有利于本发明的脂肪酶变体水解该脂质污渍材料的条件下使该脂质污渍材料与该脂肪酶变体或本发明的组合物接触。
本发明还涉及用于从表面去除脂质污渍的方法，这些方法包括：将所述污渍与本发明的脂肪酶变体或本发明的组合物接触，随后漂洗该表面，并且任选地干燥。
本发明还涉及用于从表面去除脂质污渍的方法，这些方法包括：将所述污渍与本发明的脂肪酶变体或本发明的组合物接触，随后漂洗，并且任选地干燥，在该方法中，当与其中亲本脂肪酶(特别地分别为SEQ ID NO:2、4、6或8之一)与污渍接触的方法相比时，气味产生减少。
最后，本发明还涉及本发明的脂肪酶变体或本发明的组合物用于清洁表面的用途，该用途包括将该脂肪酶变体应用于待清洁的表面，随后漂洗，并任选地干燥。
附图说明
图1是使用在EMBL的欧洲生物信息学研究所网页(www.ebi.ac.uk)上提供的Clustal Omega(1.2.4)多序列比对软件的SEQ ID NO:2(野生型疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶)、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的亲本脂肪酶的比对。
定义
根据此详细描述，以下定义适用。注意，单数形式“一种/个(a/an)”以及“该(the)”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。
除非另外定义或由上下文明确指示，否则本文所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
脂肪酶：术语“脂肪酶(lipase)”、“脂肪酶(lipase enzyme)”、“脂肪分解酶”、“脂质酯酶”、“脂解多肽”以及“脂解蛋白”是指如酶命名法所定义的EC 3.1.1类中的酶。它可以具有脂肪酶活性(三酰基甘油脂肪酶，EC 3.1.1.3)、角质酶活性(EC 3.1.1.74)、固醇酯酶活性(EC 3.1.1.13)和/或蜡酯水解酶活性(EC 3.1.1.50)。
脂肪酶活性：出于本发明的目的，可以使用具有如实例中描述的不同链长度的底物用pNP测定确定脂肪酶活性(即脂肪酶的水解活性)。
在一个方面，本发明的变体具有亲本脂肪酶的脂肪酶活性的至少20％，例如至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％。在一个方面，亲本脂肪酶是SEQ ID NO:8的多肽或其具有脂肪酶活性的片段。SEQ ID NO:8与具有T231R+N233R取代的SEQ ID NO:2所示的野生型疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶相同。
效益风险因子：效益风险因子(BRF)描述与气味释放(风险)相比的洗涤性能(效益)，并且被定义为RP(洗涤)/RP(气味)。如果脂肪酶变体的效益风险因子大于1.0，则与参照脂肪酶(特别地分别为SEQ ID NO:2、4、6或8中的亲本脂肪酶)相比，该脂肪酶相对于释放的气味具有更好的洗涤性能。
cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，通过一系列步骤(包括剪接)对前体进行加工，然后呈现为成熟的剪接的mRNA。
编码序列：术语“编码序列”意指多核苷酸，该多核苷酸直接规定了变体的氨基酸序列。编码序列的边界通常由可读框确定，该可读框以起始密码子(例如ATG、GTG、或TTG)开始并且以终止密码子(例如TAA、TAG、或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指涉及在特定生物体内或体外调节多核苷酸表达的核酸序列。每个控制序列对于编码变体的多核苷酸而言可以是天然的(即，来自相同基因)或异源的(即，来自不同基因)，并且相对于彼此是天然的或异源的。这样的控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前原肽、前肽、信号肽、启动子、终止子、增强子以及转录或翻译起始子和终止子序列。最少，这些控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区域连接的特异性限制位点的目的，控制序列可以提供有接头。
表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：“表达载体”是指包含编码变体的DNA序列的线性或环状DNA构建体，该编码序列可操作地连接到能够影响DNA在合适宿主中表达的合适控制序列。这样的控制序列可包括影响转录的启动子、控制转录的任选操纵子序列、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列、增强子以及控制转录和翻译的终止的序列。
延伸：术语“延伸”意指在变体的氨基和/或羧基末端添加一个或多个氨基酸，其中该“延伸的”变体具有脂肪酶活性。
片段：术语“片段”意指在变体的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个氨基酸的变体；其中该片段具有脂肪酶活性。
融合多肽：术语“融合多肽”是其中一种多肽在本发明的变体的N-末端和/或C-末端融合的多肽。融合多肽通过将编码另一多肽的多核苷酸与本发明的多核苷酸融合或通过将本发明的两个或更多个多核苷酸融合在一起而产生。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列使得它们符合读框，而且融合多肽的表达处于一个或多个相同的启动子和终止子的控制之下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(Cooper等人,1993,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人,1994,Science[科学]266:776-779)。融合多肽可进一步包含两个多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：Martin等人,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物生物技术杂志]3:568-576；Svetina等人,2000,J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人,1997,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:498-503；和Contreras等人,1991,Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人,1986,Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics[蛋白质：结构、功能以及遗传学]6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World[药物发现世界]4:35-48。
异源的：对于宿主细胞，术语“异源的”意指多肽或核酸不是宿主细胞中天然存在的。对于多肽或核酸，术语“异源的”意指控制序列(例如多肽或核酸的启动子)不与该多肽或核酸天然相关联，即，控制序列是来自编码成熟多肽的基因以外的基因。
宿主菌株或宿主细胞：“宿主菌株”或“宿主细胞”是指其中已引入表达载体、噬菌体、病毒或其他DNA构建体(包括编码变体的多核苷酸)的生物体。示例性宿主菌株是能够表达目的多肽和/或发酵糖的微生物细胞(例如细菌、丝状真菌和酵母)。术语“宿主细胞”包括由细胞产生的原生质体。
改善的特性：术语“改善的特性”意指与相对于亲本有所改善的变体相关的特征。这样的改善的特性包括但不限于：与亲本脂肪酶，特别地分别为SEQ ID NO:2、4、6或8相比，在中性左右的pH，即约pH 6-8，优选地约pH 7具有降低的脂肪酶活性和/或减少的气味产生，和/或具有增加的效益风险因子(BRF)。
引入：在将核酸序列插入细胞的情况下，术语“引入”意指“转染”、“转化”或“转导”，如本领域已知的。
分离的：术语“分离的”意指与至少一种其他材料或组分(包括但不限于其他蛋白质、核酸、细胞等)分离的变体、核酸、细胞或其他指定材料或组分。因此，分离的多肽、核酸、细胞或其他材料呈自然界中不存在的形式。分离的多肽包括但不限于含有在宿主细胞中表达的分泌的变体的培养液。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在N-末端加工和/或C-末端加工(例如，信号肽的去除)后呈其成熟形式的多肽。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有脂肪酶活性的成熟多肽的多核苷酸。
突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。
天然：术语“天然”意指天然存在于宿主细胞中的核酸或多肽。
核酸：术语“核酸”涵盖DNA、RNA、异源双链体和能够编码变体的合成分子。核酸可以是单链或双链，并且可以是经化学修饰的。术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用。因为遗传密码是简并的，所以可使用多于一个密码子来编码特定氨基酸，并且本发明组合物和方法涵盖编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。除非另有说明，否则核酸序列以5'至3'取向呈现。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指分离自天然存在的基因或以原本不存在于自然界中的方式被修饰以含有核酸的区段或是合成的并且包含可操作地连接到核酸序列的一个或多个控制序列的单链或双链核酸分子。
可操作地连接：“可操作地连接”意指指定组分处于允许它们以预期方式起作用的关系(包括但不限于并置)。例如，调节序列可操作地连接到编码序列，使得编码序列的表达处于调节序列的控制之下。
亲本或亲本脂肪酶：术语“亲本”或“亲本脂肪酶”意指进行改变以产生本发明的脂肪酶变体的脂肪酶。
纯化的：术语“纯化的”意指基本上不含其他组分的核酸、变体或细胞，如通过本领域熟知的分析技术(例如，在电泳凝胶、色谱洗脱物和/或经受密度梯度离心的培养基中，纯化的变体或核酸可形成离散的条带)所确定。纯化的核酸或变体是至少约50％纯的，通常是至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％、约99.6％、约99.7％、约99.8％或更加纯的(例如，重量百分比或摩尔百分比)。在相关意义上，当在应用纯化或富集技术之后分子的浓度大幅度增加时，组合物富集了该分子。术语“富集”是指化合物、变体、细胞、核酸、氨基酸或其他指定材料或组分以高于起始组合物的相对或绝对浓度存在于组合物中。
在一个方面，如本文所用的术语“纯化的”是指变体或细胞基本上不含来自生产生物体的组分(尤其是不溶性组分)。在其他方面，术语“纯化的”是指变体基本上不含来自从中获得其的天然生物体的不溶性组分(尤其是不溶性组分)。在一个方面，将变体与从中回收其的生物体和培养基的一些可溶性组分分离。可通过单元操作过滤、沉淀或色谱法中的一种或多种来纯化(即，分离)变体。
相应地，可纯化变体，使得仅存在少量的其他蛋白，特别地其他多肽。如本文所用的术语“纯化的”可指去除存在于多肽来源的细胞中的其他组分，特别地其他蛋白并且最特别地其他酶。变体可以是“基本上纯的”，即不含来自产生其的生物体(例如，用于重组产生变体的宿主生物体)的其他组分。在一个方面，按制剂中存在的总多肽材料的重量计，多肽是至少40％纯的。在一个方面，按制剂中存在的总多肽材料的重量计，多肽是至少50％、60％、70％、80％或90％纯的。如本文所用，“基本上纯的多肽”可表示含有按重量计至多10％、优选地至多8％、更优选地至多6％、更优选地至多5％、更优选地至多4％、更优选地至多3％、甚至更优选地至多2％、最优选地至多1％并且甚至最优选地至多0.5％的与该多肽天然或重组缔合的其他多肽材料的多肽制剂。
因此，优选的是按制剂中存在的总多肽材料的重量计，基本上纯的变体是至少92％纯的、优选地至少94％纯的、更优选地至少95％纯的、更优选地至少96％纯的、更优选地至少97％纯的、更优选地至少98％纯的、甚至更优选地至少99％纯的、最优选地至少99.5％纯的。本发明的变体优选为基本上纯的形式(即，制剂基本上不含与其天然或重组缔合的其他多肽材料)。例如，这可通过经由熟知的重组方法或经由经典的纯化方法制备变体来完成。
重组：术语“重组”以其常规含义使用，是指对核酸序列进行操纵(例如，切割和重接)以形成与在自然界中发现的序列群不同的序列群。术语重组是指已从其天然状态修饰的细胞、核酸、变体或载体。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内未发现的基因，或与在自然界中发现的相比，以不同水平表达或在不同条件下表达天然基因。术语“重组”与“遗传修饰的”和“转基因的”同义。
回收：术语“回收(recover或recovery)”是指从选自细胞、核酸或其他指定材料的列表的至少一种发酵液组分中去除多肽，例如通过以下方法从全发酵液或从无细胞发酵液中回收多肽：通过多肽晶体收获、通过过滤(例如，深度过滤(通过使用助滤剂或填充过滤介质、箱式过滤器中的布过滤、转鼓过滤、鼓过滤、旋转真空鼓过滤、烛式过滤器、水平叶过滤器或类似物、在框架式或模块化装置中使用片状或垫式过滤)或膜过滤(使用板过滤，模块过滤，烛式过滤，微过滤，横流、动态横流或死端操作中的超滤))或者通过离心(使用卧式离心机、圆盘堆式离心机、水式漩涡分离器(hyrdo cyclone)或类似物)或者通过沉淀多肽并使用相关的固-液分离方法以通过使用粒度分级分离从肉汤培养基中收获多肽。回收涵盖多肽的分离和/或纯化。
序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人,2000,TrendsGenet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选6.6.0版本或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性作为“最长同一性”的输出。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。为了使Needle程序报告最长同一性，必须在命令行中指定-非简化(nobrief)选项。Needle标记的“最长同一性”的输出计算如下：
(相同的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人,2000,同上)(优选6.6.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,同上)来确定两个多核苷酸序列之间的序列同一性作为“最长同一性”的输出。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。为了使Needle程序报告最长同一性，必须在命令行中指定非简化选项。Needle标记的“最长同一性”的输出计算如下：
(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度–比对中的空位总数)
信号肽：“信号肽”是附接至蛋白质的N-末端部分的氨基酸序列，其促进蛋白质分泌到细胞外。细胞外蛋白质的成熟形式缺乏信号肽，该信号肽在分泌过程期间被切除。
子序列：术语“子序列”意指使一个或多个核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸；其中该子序列编码具有脂肪酶活性的片段。
变体：术语“变体”意指具有脂肪酶活性的，在一个或多个位置处包含取代、插入(包括延伸)和/或缺失(例如截短)的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占据某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；并且插入意指与占据一个位置的氨基酸相邻并紧接其后添加1-5个氨基酸(例如，1-3个氨基酸，特别地1个氨基酸)。
野生型：提及氨基酸序列或核酸序列时术语“野生型”意指该氨基酸序列或核酸序列是天然或天然存在的序列。如本文所用，术语“天然存在的”是指在自然界中发现的任何物质(例如蛋白、氨基酸或核酸序列)。相反，术语“非天然存在的”是指在自然界中未发现的任何物质(例如，在实验室中产生的重组核酸和蛋白质序列、或野生型序列的修饰)。
变体命名惯例
出于本发明的目的，SEQ ID NO:4中披露的成熟多肽用于确定另一种脂肪酶中的相应氨基酸位置。将另一种脂肪酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:4中披露的脂肪酶进行比对，并且基于比对，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定与SEQ ID NO:4中披露的多肽中的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。
在描述本发明的变体时，为了便于参考，以下描述的命名法经过了调整。采用了已接受的IUPAC单字母或三字母的氨基酸缩写。
取代.对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。相应地，将在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或“T226A”。多个突变通过加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表在位置205和位置411处的甘氨酸(G)和丝氨酸(S)分别被精氨酸(R)和苯丙氨酸(F)取代。
缺失.对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。相应地，将在位置195处的甘氨酸的缺失表示为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失通过加号(“+”)分开，例如“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
插入.对于氨基酸插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。相应地，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸表示为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2；等]。例如，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸表示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。
在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号而对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此会是：
亲本： 变体：
195 195 195a 195b
G G-K-A
多个改变.包含多个改变的变体通过加号(“+”)分开，例如，“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表在位置170处和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。
不同改变.在可于一个位置处引入不同改变的情况下，不同的改变通过逗号分开，例如，“Arg170Tyr,Glu”代表在位置170处的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”表示以下变体：
“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”、和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
具体实施方式
本发明的变体
本发明涉及脂肪酶变体，其选自包含以下的组(i)、(ii)和(iii)中的一个或多个：
(i)在对应于SEQ ID NO:8的多肽的位置202、252和269的一个或多个位置处的取代；
(ii)在对应于SEQ ID NO:8的多肽的位置40、56、57、91、98、108、118、210、244和254的一个或多个位置处的取代；以及
(iii)在对应于SEQ ID NO:8的多肽的位置23、27、40、51、56、60、118、244和256的一个或多个位置处的取代；
其中该变体具有脂肪酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:8的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性，但小于100％的序列同一性。
在优选的实施例中，脂肪酶变体具有来自组(i)的一个或多个取代，特别地所有取代。在优选的实施例中，脂肪酶变体具有来自组(ii)的一个或多个取代，特别地所有取代。在优选的实施例中，脂肪酶变体具有来自组(i)的一个或多个取代，特别地所有取代，以及来自组(ii)的一个或多个取代，特别地所有取代。在另一个优选的实施例中，脂肪酶变体具有来自组(i)的一个或多个取代，特别地所有取代，以及来自组(iii)的一个或多个取代，特别地所有取代。
变体可以进一步在N-末端和/或C-末端处包含一个或多个氨基酸的延伸(即，肽添加)。在一个优选的实施例中，延伸是位于脂肪酶N-末端处的SPIRR-肽(或其一个或多个氨基酸)。合适的脂肪酶延伸披露于WO1997/004079(通过引用特此并入)。C-末端延伸的实例披露于WO 2000/060063(通过引用特此并入)。可替代地，这些变体可以进一步在N-末端和/或C-末端处包含一个或多个氨基酸的截短。
在实施例中，变体与亲本脂肪酶的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列同一性。
在另一实施例中，变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在另一实施例中，变体与SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在另一实施例中，变体与SEQ ID NO:6的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在另一实施例中，变体与SEQ ID NO:8的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个方面，本发明的变体中改变(特别地取代)的数目是1-20个，例如，1-10个和1-5个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个改变(特别地取代)。
在实施例中，本发明的变体包含对应于SEQ ID NO:8中的位置的一个或多个取代(特别地所有取代)或由其组成，这些取代选自由以下组成的组的：
H对位置202处的氨基酸残基进行的取代；
H对位置252处的氨基酸残基进行的取代；以及
H对位置269处的氨基酸残基进行的取代。
在实施例中，本发明的变体包含以下取代组中的一个或由其组成，该取代组对应于：202H+252H；202H+269H；252H+269H；或202H+252H+269H(使用SEQ ID NO:8进行编号)。
在优选的实施例中，本发明的变体包含对应于SEQ ID NO:8中的位置的一个或多个取代(特别地所有取代)或由其组成，这些取代选自由以下组成的组的：
E对位置40处的氨基酸残基进行的取代；
R对位置56处的氨基酸残基进行的取代；
N对位置57处的氨基酸残基进行的取代；
T对位置91处的氨基酸残基进行的取代；
E对位置98处的氨基酸残基进行的取代；
K对位置108处的氨基酸残基进行的取代；
F对位置118处的氨基酸残基进行的取代；
K对位置210处的氨基酸残基进行的取代；
E对位置244处的氨基酸残基进行的取代；以及
S对位置254处的氨基酸残基进行的取代。
在另一个优选的实施例中，本发明的变体包含对应于SEQ ID NO:8中的位置的一个或多个取代(特别地所有取代)或由其组成，这些取代选自由以下组成的组的：
S对位置23处的氨基酸残基进行的取代；
N对位置27处的氨基酸残基进行的取代；
I对位置40处的氨基酸残基进行的取代；
I对位置51处的氨基酸残基进行的取代；
R对位置56处的氨基酸残基进行的取代；
K对位置60处的氨基酸残基进行的取代；
F对位置118处的氨基酸残基进行的取代；
E对位置244处的氨基酸残基进行的取代；以及
T对位置256处的氨基酸残基进行的取代。
在实施例中，本发明的变体具有对应于SEQ ID NO:8的I202H的取代，并且进一步包含对应于以下的以下取代或取代组中的一个：A40E、E56R、D57N、G91T、K98E、R108K、R118F、E210K、T244E、A40E+E56R、A40E+D57N、A40E+G91T、A40E+K98E、A40E+R108K、A40E+R118F、A40E+E210K、A40E+T244E、A40E+D254S、E56R+D57N、E56R+G91T、E56R+K98E、E56R+R108K、E56R+R118F、E56R+E210K、E56R+T244E、E56R+D254S、D57N+G91T、D57N+K98E、D57N+R108K、D57N+R118F、D57N+E210K、D57N+T244E、D57N+D254S、G91T+K98E、G91T+R108K、G91T+R118F、G91T+E210K、G91T+T244E、G91T+D254S、K98E+R108K、K98E+R118F、K98E+E210K、K98E+T244E、K98E+D254S、R108K+R118F、R108K+E210K、R108K+T244E、R108K+D254S、R118F+E210K、R118F+T244E、R118F+D254S、E210K+T244E、E210K+D254S、T244E+D254S、A40E+E56R+D57N、A40E+E56R+G91T、A40E+E56R+K98E、A40E+E56R+R108K、A40E+E56R+R118F、A40E+E56R+E210K、A40E+E56R+T244E、A40E+E56R+D254S、A40E+D57N+G91T、A40E+D57N+K98E、A40E+D57N+R108K、A40E+D57N+R118F、A40E+D57N+E210K、A40E+D57N+T244E、A40E+D57N+D254S、A40E+G91T+K98E、A40E+G91T+R108K、A40E+G91T+R118F、A40E+G91T+E210K、A40E+G91T+T244E、A40E+G91T+D254S、A40E+K98E+R108K、A40E+K98E+R118F、A40E+K98E+E210K、A40E+K98E+T244E、A40E+K98E+D254S、A40E+R108K+R118F、A40E+R108K+E210K、A40E+R108K+T244E、A40E+R108K+D254S、A40E+R118F+E210K、A40E+R118F+T244E、A40E+R118F+D254S、A40E+E210K+T244E、A40E+E210K+D254S、A40E+T244E+D254S、E56R+D57N+G91T、E56R+D57N+K98E、E56R+D57N+R108K、E56R+D57N+R118F、E56R+D57N+E210K、E56R+D57N+T244E、E56R+D57N+D254S、E56R+G91T+K98E、E56R+G91T+R108K、E56R+G91T+R118F、E56R+G91T+E210K、E56R+G91T+T244E、E56R+G91T+D254S、E56R+K98E+R108K、E56R+K98E+R118F、E56R+K98E+E210K、E56R+K98E+T244E、E56R+K98E+D254S、E56R+R108K+R118F、E56R+R108K+E210K、E56R+R108K+T244E、E56R+R108K+D254S、E56R+R118F+E210K、E56R+R118F+T244E、E56R+R118F+D254S、E56R+E210K+T244E、E56R+E210K+D254S、E56R+T244E+D254S、D57N+G91T+K98E、D57N+G91T+R108K、D57N+G91T+R118F、D57N+G91T+E210K、D57N+G91T+T244E、D57N+G91T+D254S、D57N+K98E+R108K、D57N+K98E+R118F、D57N+K98E+E210K、D57N+K98E+T244E、D57N+K98E+D254S、D57N+R108K+R118F、D57N+R108K+E210K、D57N+R108K+T244E、D57N+R108K+D254S、D57N+R118F+E210K、D57N+R118F+T244E、D57N+R118F+D254S、D57N+E210K+T244E、D57N+E210K+D254S、D57N+T244E+D254S、G91T+K98E+R108K、G91T+K98E+R118F、G91T+K98E+E210K、G91T+K98E+T244E、G91T+K98E+D254S、G91T+R108K+R118F、G91T+R108K+E210K、G91T+R108K+T244E、G91T+R108K+D254S、G91T+R118F+E210K、G91T+R118F+T244E、G91T+R118F+D254S、G91T+E210K+T244E、G91T+E210K+D254S、G91T+T244E+D254S、K98E+R108K+R118F、K98E+R108K+E210K、K98E+R108K+T244E、K98E+R108K+D254S、K98E+R118F+E210K、K98E+R118F+T244E、K98E+R118F+D254S、K98E+E210K+T244E、K98E+E210K+D254S、K98E+T244E+D254S、R108K+R118F+E210K、R108K+R118F+T244E、R108K+R118F+D254S、R108K+E210K+T244E、R108K+E210K+D254S、R108K+T244E+D254S、R118F+E210K+T244E、R118F+E210K+D254S、R118F+T244E+D254S、E210K+T244E+D254S、A40E+E56R+D57N+G91T、A40E+E56R+D57N+K98E、A40E+E56R+D57N+R108K、A40E+E56R+D57N+R118F、A40E+E56R+D57N+E210K、A40E+E56R+D57N+T244E、A40E+E56R+D57N+D254S、A40E+E56R+G91T+K98E、A40E+E56R+G91T+R108K、A40E+E56R+G91T+R118F、A40E+E56R+G91T+E210K、A40E+E56R+G91T+T244E、A40E+E56R+G91T+D254S、A40E+E56R+K98E+R108K、A40E+E56R+K98E+R118F、A40E+E56R+K98E+E210K、A40E+E56R+K98E+T244E、A40E+E56R+K98E+D254S、A40E+E56R+R108K+R118F、A40E+E56R+R108K+E210K、A40E+E56R+R108K+T244E、A40E+E56R+R108K+D254S、A40E+E56R+R118F+E210K、A40E+E56R+R118F+T244E、A40E+E56R+R118F+D254S、A40E+E56R+E210K+T244E、A40E+E56R+E210K+D254S、A40E+E56R+T244E+D254S、A40E+D57N+G91T+K98E、A40E+D57N+G91T+R108K、A40E+D57N+G91T+R118F、A40E+D57N+G91T+E210K、A40E+D57N+G91T+T244E、A40E+D57N+G91T+D254S、A40E+D57N+K98E+R108K、A40E+D57N+K98E+R118F、A40E+D57N+K98E+E210K、A40E+D57N+K98E+T244E、A40E+D57N+K98E+D254S、A40E+D57N+R108K+R118F、A40E+D57N+R108K+E210K、A40E+D57N+R108K+T244E、A40E+D57N+R108K+D254S、A40E+D57N+R118F+E210K、A40E+D57N+R118F+T244E、A40E+D57N+R118F+D254S、A40E+D57N+E210K+T244E、A40E+D57N+E210K+D254S、A40E+D57N+T244E+D254S、A40E+G91T+K98E+R108K、A40E+G91T+K98E+R118F、A40E+G91T+K98E+E210K、A40E+G91T+K98E+T244E、A40E+G91T+K98E+D254S、A40E+G91T+R108K+R118F、A40E+G91T+R108K+E210K、A40E+G91T+R108K+T244E、A40E+G91T+R108K+D254S、A40E+G91T+R118F+E210K、A40E+G91T+R118F+T244E、A40E+G91T+R118F+D254S、A40E+G91T+E210K+T244E、A40E+G91T+E210K+D254S、A40E+G91T+T244E+D254S、A40E+K98E+R108K+R118F、A40E+K98E+R108K+E210K、A40E+K98E+R108K+T244E、A40E+K98E+R108K+D254S、A40E+K98E+R118F+E210K、A40E+K98E+R118F+T244E、A40E+K98E+R118F+D254S、A40E+K98E+E210K+T244E、A40E+K98E+E210K+D254S、A40E+K98E+T244E+D254S、A40E+R108K+R118F+E210K、A40E+R108K+R118F+T244E、A40E+R108K+R118F+D254S、A40E+R108K+E210K+T244E、A40E+R108K+E210K+D254S、A40E+R108K+T244E+D254S、A40E+R118F+E210K+T244E、A40E+R118F+E210K+D254S、A40E+R118F+T244E+D254S、A40E+E210K+T244E+D254S、E56R+D57N+G91T+K98E、E56R+D57N+G91T+R108K、E56R+D57N+G91T+R118F、E56R+D57N+G91T+E210K、E56R+D57N+G91T+T244E、E56R+D57N+G91T+D254S、E56R+D57N+K98E+R108K、E56R+D57N+K98E+R118F、E56R+D57N+K98E+E210K、E56R+D57N+K98E+T244E、E56R+D57N+K98E+D254S、E56R+D57N+R108K+R118F、E56R+D57N+R108K+E210K、E56R+D57N+R108K+T244E、E56R+D57N+R108K+D254S、E56R+D57N+R118F+E210K、E56R+D57N+R118F+T244E、E56R+D57N+R118F+D254S、E56R+D57N+E210K+T244E、E56R+D57N+E210K+D254S、E56R+D57N+T244E+D254S、E56R+G91T+K98E+R108K、E56R+G91T+K98E+R118F、E56R+G91T+K98E+E210K、E56R+G91T+K98E+T244E、E56R+G91T+K98E+D254S、E56R+G91T+R108K+R118F、E56R+G91T+R108K+E210K、E56R+G91T+R108K+T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在实施例中，本发明的变体具有对应于SEQ ID NO:8的I252H的取代，并且进一步包含对应于以下的以下取代或取代组中的一个：A40E、E56R、D57N、G91T、K98E、R108K、R118F、E210K、T244E、A40E+E56R、A40E+D57N、A40E+G91T、A40E+K98E、A40E+R108K、A40E+R118F、A40E+E210K、A40E+T244E、A40E+D254S、E56R+D57N、E56R+G91T、E56R+K98E、E56R+R108K、E56R+R118F、E56R+E210K、E56R+T244E、E56R+D254S、D57N+G91T、D57N+K98E、D57N+R108K、D57N+R118F、D57N+E210K、D57N+T244E、D57N+D254S、G91T+K98E、G91T+R108K、G91T+R118F、G91T+E210K、G91T+T244E、G91T+D254S、K98E+R108K、K98E+R118F、K98E+E210K、K98E+T244E、K98E+D254S、R108K+R118F、R108K+E210K、R108K+T244E、R108K+D254S、R118F+E210K、R118F+T244E、R118F+D254S、E210K+T244E、E210K+D254S、T244E+D254S、A40E+E56R+D57N、A40E+E56R+G91T、A40E+E56R+K98E、A40E+E56R+R108K、A40E+E56R+R118F、A40E+E56R+E210K、A40E+E56R+T244E、A40E+E56R+D254S、A40E+D57N+G91T、A40E+D57N+K98E、A40E+D57N+R108K、A40E+D57N+R118F、A40E+D57N+E210K、A40E+D57N+T244E、A40E+D57N+D254S、A40E+G91T+K98E、A40E+G91T+R108K、A40E+G91T+R118F、A40E+G91T+E210K、A40E+G91T+T244E、A40E+G91T+D254S、A40E+K98E+R108K、A40E+K98E+R118F、A40E+K98E+E210K、A40E+K98E+T244E、A40E+K98E+D254S、A40E+R108K+R118F、A40E+R108K+E210K、A40E+R108K+T244E、A40E+R108K+D254S、A40E+R118F+E210K、A40E+R118F+T244E、A40E+R118F+D254S、A40E+E210K+T244E、A40E+E210K+D254S、A40E+T244E+D254S、E56R+D57N+G91T、E56R+D57N+K98E、E56R+D57N+R108K、E56R+D57N+R118F、E56R+D57N+E210K、E56R+D57N+T244E、E56R+D57N+D254S、E56R+G91T+K98E、E56R+G91T+R108K、E56R+G91T+R118F、E56R+G91T+E210K、E56R+G91T+T244E、E56R+G91T+D254S、E56R+K98E+R108K、E56R+K98E+R118F、E56R+K98E+E210K、E56R+K98E+T244E、E56R+K98E+D254S、E56R+R108K+R118F、E56R+R108K+E210K、E56R+R108K+T244E、E56R+R108K+D254S、E56R+R118F+E210K、E56R+R118F+T244E、E56R+R118F+D254S、E56R+E210K+T244E、E56R+E210K+D254S、E56R+T244E+D254S、D57N+G91T+K98E、D57N+G91T+R108K、D57N+G91T+R118F、D57N+G91T+E210K、D57N+G91T+T244E、D57N+G91T+D254S、D57N+K98E+R108K、D57N+K98E+R118F、D57N+K98E+E210K、D57N+K98E+T244E、D57N+K98E+D254S、D57N+R108K+R118F、D57N+R108K+E210K、D57N+R108K+T244E、D57N+R108K+D254S、D57N+R118F+E210K、D57N+R118F+T244E、D57N+R118F+D254S、D57N+E210K+T244E、D57N+E210K+D254S、D57N+T244E+D254S、G91T+K98E+R108K、G91T+K98E+R118F、G91T+K98E+E210K、G91T+K98E+T244E、G91T+K98E+D254S、G91T+R108K+R118F、G91T+R108K+E210K、G91T+R108K+T244E、G91T+R108K+D254S、G91T+R118F+E210K、G91T+R118F+T244E、G91T+R118F+D254S、G91T+E210K+T244E、G91T+E210K+D254S、G91T+T244E+D254S、K98E+R108K+R118F、K98E+R108K+E210K、K98E+R108K+T244E、K98E+R108K+D254S、K98E+R118F+E210K、K98E+R118F+T244E、K98E+R118F+D254S、K98E+E210K+T244E、K98E+E210K+D254S、K98E+T244E+D254S、R108K+R118F+E210K、R108K+R118F+T244E、R108K+R118F+D254S、R108K+E210K+T244E、R108K+E210K+D254S、R108K+T244E+D254S、R118F+E210K+T244E、R118F+E210K+D254S、R118F+T244E+D254S、E210K+T244E+D254S、A40E+E56R+D57N+G91T、A40E+E56R+D57N+K98E、A40E+E56R+D57N+R108K、A40E+E56R+D57N+R118F、A40E+E56R+D57N+E210K、A40E+E56R+D57N+T244E、A40E+E56R+D57N+D254S、A40E+E56R+G91T+K98E、A40E+E56R+G91T+R108K、A40E+E56R+G91T+R118F、A40E+E56R+G91T+E210K、A40E+E56R+G91T+T244E、A40E+E56R+G91T+D254S、A40E+E56R+K98E+R108K、A40E+E56R+K98E+R118F、A40E+E56R+K98E+E210K、A40E+E56R+K98E+T244E、A40E+E56R+K98E+D254S、A40E+E56R+R108K+R118F、A40E+E56R+R108K+E210K、A40E+E56R+R108K+T244E、A40E+E56R+R108K+D254S、A40E+E56R+R118F+E210K、A40E+E56R+R118F+T244E、A40E+E56R+R118F+D254S、A40E+E56R+E210K+T244E、A40E+E56R+E210K+D254S、A40E+E56R+T244E+D254S、A40E+D57N+G91T+K98E、A40E+D57N+G91T+R108K、A40E+D57N+G91T+R118F、A40E+D57N+G91T+E210K、A40E+D57N+G91T+T244E、A40E+D57N+G91T+D254S、A40E+D57N+K98E+R108K、A40E+D57N+K98E+R118F、A40E+D57N+K98E+E210K、A40E+D57N+K98E+T244E、A40E+D57N+K98E+D254S、A40E+D57N+R108K+R118F、A40E+D57N+R108K+E210K、A40E+D57N+R108K+T244E、A40E+D57N+R108K+D254S、A40E+D57N+R118F+E210K、A40E+D57N+R118F+T244E、A40E+D57N+R118F+D254S、A40E+D57N+E210K+T244E、A40E+D57N+E210K+D254S、A40E+D57N+T244E+D254S、A40E+G91T+K98E+R108K、A40E+G91T+K98E+R118F、A40E+G91T+K98E+E210K、A40E+G91T+K98E+T244E、A40E+G91T+K98E+D254S、A40E+G91T+R108K+R118F、A40E+G91T+R108K+E210K、A40E+G91T+R108K+T244E、A40E+G91T+R108K+D254S、A40E+G91T+R118F+E210K、A40E+G91T+R118F+T244E、A40E+G91T+R118F+D254S、A40E+G91T+E210K+T244E、A40E+G91T+E210K+D254S、A40E+G91T+T244E+D254S、A40E+K98E+R108K+R118F、A40E+K98E+R108K+E210K、A40E+K98E+R108K+T244E、A40E+K98E+R108K+D254S、A40E+K98E+R118F+E210K、A40E+K98E+R118F+T244E、A40E+K98E+R118F+D254S、A40E+K98E+E210K+T244E、A40E+K98E+E210K+D254S、A40E+K98E+T244E+D254S、A40E+R108K+R118F+E210K、A40E+R108K+R118F+T244E、A40E+R108K+R118F+D254S、A40E+R108K+E210K+T244E、A40E+R108K+E210K+D254S、A40E+R108K+T244E+D254S、A40E+R118F+E210K+T244E、A40E+R118F+E210K+D254S、A40E+R118F+T244E+D254S、A40E+E210K+T244E+D254S、E56R+D57N+G91T+K98E、E56R+D57N+G91T+R108K、E56R+D57N+G91T+R118F、E56R+D57N+G91T+E210K、E56R+D57N+G91T+T244E、E56R+D57N+G91T+D254S、E56R+D57N+K98E+R108K、E56R+D57N+K98E+R118F、E56R+D57N+K98E+E210K、E56R+D57N+K98E+T244E、E56R+D57N+K98E+D254S、E56R+D57N+R108K+R118F、E56R+D57N+R108K+E210K、E56R+D57N+R108K+T244E、E56R+D57N+R108K+D254S、E56R+D57N+R118F+E210K、E56R+D57N+R118F+T244E、E56R+D57N+R118F+D254S、E56R+D57N+E210K+T244E、E56R+D57N+E210K+D254S、E56R+D57N+T244E+D254S、E56R+G91T+K98E+R108K、E56R+G91T+K98E+R118F、E56R+G91T+K98E+E210K、E56R+G91T+K98E+T244E、E56R+G91T+K98E+D254S、E56R+G91T+R108K+R118F、E56R+G91T+R108K+E210K、E56R+G91T+R108K+T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在实施例中，本发明的变体具有对应于SEQ ID NO:8的L269H的取代，并且进一步包含对应于以下的以下取代或取代组中的一个：A40E、E56R、D57N、G91T、K98E、R108K、R118F、E210K、T244E、A40E+E56R、A40E+D57N、A40E+G91T、A40E+K98E、A40E+R108K、A40E+R118F、A40E+E210K、A40E+T244E、A40E+D254S、E56R+D57N、E56R+G91T、E56R+K98E、E56R+R108K、E56R+R118F、E56R+E210K、E56R+T244E、E56R+D254S、D57N+G91T、D57N+K98E、D57N+R108K、D57N+R118F、D57N+E210K、D57N+T244E、D57N+D254S、G91T+K98E、G91T+R108K、G91T+R118F、G91T+E210K、G91T+T244E、G91T+D254S、K98E+R108K、K98E+R118F、K98E+E210K、K98E+T244E、K98E+D254S、R108K+R118F、R108K+E210K、R108K+T244E、R108K+D254S、R118F+E210K、R118F+T244E、R118F+D254S、E210K+T244E、E210K+D254S、T244E+D254S、A40E+E56R+D57N、A40E+E56R+G91T、A40E+E56R+K98E、A40E+E56R+R108K、A40E+E56R+R118F、A40E+E56R+E210K、A40E+E56R+T244E、A40E+E56R+D254S、A40E+D57N+G91T、A40E+D57N+K98E、A40E+D57N+R108K、A40E+D57N+R118F、A40E+D57N+E210K、A40E+D57N+T244E、A40E+D57N+D254S、A40E+G91T+K98E、A40E+G91T+R108K、A40E+G91T+R118F、A40E+G91T+E210K、A40E+G91T+T244E、A40E+G91T+D254S、A40E+K98E+R108K、A40E+K98E+R118F、A40E+K98E+E210K、A40E+K98E+T244E、A40E+K98E+D254S、A40E+R108K+R118F、A40E+R108K+E210K、A40E+R108K+T244E、A40E+R108K+D254S、A40E+R118F+E210K、A40E+R118F+T244E、A40E+R118F+D254S、A40E+E210K+T244E、A40E+E210K+D254S、A40E+T244E+D254S、E56R+D57N+G91T、E56R+D57N+K98E、E56R+D57N+R108K、E56R+D57N+R118F、E56R+D57N+E210K、E56R+D57N+T244E、E56R+D57N+D254S、E56R+G91T+K98E、E56R+G91T+R108K、E56R+G91T+R118F、E56R+G91T+E210K、E56R+G91T+T244E、E56R+G91T+D254S、E56R+K98E+R108K、E56R+K98E+R118F、E56R+K98E+E210K、E56R+K98E+T244E、E56R+K98E+D254S、E56R+R108K+R118F、E56R+R108K+E210K、E56R+R108K+T244E、E56R+R108K+D254S、E56R+R118F+E210K、E56R+R118F+T244E、E56R+R118F+D254S、E56R+E210K+T244E、E56R+E210K+D254S、E56R+T244E+D254S、D57N+G91T+K98E、D57N+G91T+R108K、D57N+G91T+R118F、D57N+G91T+E210K、D57N+G91T+T244E、D57N+G91T+D254S、D57N+K98E+R108K、D57N+K98E+R118F、D57N+K98E+E210K、D57N+K98E+T244E、D57N+K98E+D254S、D57N+R108K+R118F、D57N+R108K+E210K、D57N+R108K+T244E、D57N+R108K+D254S、D57N+R118F+E210K、D57N+R118F+T244E、D57N+R118F+D254S、D57N+E210K+T244E、D57N+E210K+D254S、D57N+T244E+D254S、G91T+K98E+R108K、G91T+K98E+R118F、G91T+K98E+E210K、G91T+K98E+T244E、G91T+K98E+D254S、G91T+R108K+R118F、G91T+R108K+E210K、G91T+R108K+T244E、G91T+R108K+D254S、G91T+R118F+E210K、G91T+R118F+T244E、G91T+R118F+D254S、G91T+E210K+T244E、G91T+E210K+D254S、G91T+T244E+D254S、K98E+R108K+R118F、K98E+R108K+E210K、K98E+R108K+T244E、K98E+R108K+D254S、K98E+R118F+E210K、K98E+R118F+T244E、K98E+R118F+D254S、K98E+E210K+T244E、K98E+E210K+D254S、K98E+T244E+D254S、R108K+R118F+E210K、R108K+R118F+T244E、R108K+R118F+D254S、R108K+E210K+T244E、R108K+E210K+D254S、R108K+T244E+D254S、R118F+E210K+T244E、R118F+E210K+D254S、R118F+T244E+D254S、E210K+T244E+D254S、A40E+E56R+D57N+G91T、A40E+E56R+D57N+K98E、A40E+E56R+D57N+R108K、A40E+E56R+D57N+R118F、A40E+E56R+D57N+E210K、A40E+E56R+D57N+T244E、A40E+E56R+D57N+D254S、A40E+E56R+G91T+K98E、A40E+E56R+G91T+R108K、A40E+E56R+G91T+R118F、A40E+E56R+G91T+E210K、A40E+E56R+G91T+T244E、A40E+E56R+G91T+D254S、A40E+E56R+K98E+R108K、A40E+E56R+K98E+R118F、A40E+E56R+K98E+E210K、A40E+E56R+K98E+T244E、A40E+E56R+K98E+D254S、A40E+E56R+R108K+R118F、A40E+E56R+R108K+E210K、A40E+E56R+R108K+T244E、A40E+E56R+R108K+D254S、A40E+E56R+R118F+E210K、A40E+E56R+R118F+T244E、A40E+E56R+R118F+D254S、A40E+E56R+E210K+T244E、A40E+E56R+E210K+D254S、A40E+E56R+T244E+D254S、A40E+D57N+G91T+K98E、A40E+D57N+G91T+R108K、A40E+D57N+G91T+R118F、A40E+D57N+G91T+E210K、A40E+D57N+G91T+T244E、A40E+D57N+G91T+D254S、A40E+D57N+K98E+R108K、A40E+D57N+K98E+R118F、A40E+D57N+K98E+E210K、A40E+D57N+K98E+T244E、A40E+D57N+K98E+D254S、A40E+D57N+R108K+R118F、A40E+D57N+R108K+E210K、A40E+D57N+R108K+T244E、A40E+D57N+R108K+D254S、A40E+D57N+R118F+E210K、A40E+D57N+R118F+T244E、A40E+D57N+R118F+D254S、A40E+D57N+E210K+T244E、A40E+D57N+E210K+D254S、A40E+D57N+T244E+D254S、A40E+G91T+K98E+R108K、A40E+G91T+K98E+R118F、A40E+G91T+K98E+E210K、A40E+G91T+K98E+T244E、A40E+G91T+K98E+D254S、A40E+G91T+R108K+R118F、A40E+G91T+R108K+E210K、A40E+G91T+R108K+T244E、A40E+G91T+R108K+D254S、A40E+G91T+R118F+E210K、A40E+G91T+R118F+T244E、A40E+G91T+R118F+D254S、A40E+G91T+E210K+T244E、A40E+G91T+E210K+D254S、A40E+G91T+T244E+D254S、A40E+K98E+R108K+R118F、A40E+K98E+R108K+E210K、A40E+K98E+R108K+T244E、A40E+K98E+R108K+D254S、A40E+K98E+R118F+E210K、A40E+K98E+R118F+T244E、A40E+K98E+R118F+D254S、A40E+K98E+E210K+T244E、A40E+K98E+E210K+D254S、A40E+K98E+T244E+D254S、A40E+R108K+R118F+E210K、A40E+R108K+R118F+T244E、A40E+R108K+R118F+D254S、A40E+R108K+E210K+T244E、A40E+R108K+E210K+D254S、A40E+R108K+T244E+D254S、A40E+R118F+E210K+T244E、A40E+R118F+E210K+D254S、A40E+R118F+T244E+D254S、A40E+E210K+T244E+D254S、E56R+D57N+G91T+K98E、E56R+D57N+G91T+R108K、E56R+D57N+G91T+R118F、E56R+D57N+G91T+E210K、E56R+D57N+G91T+T244E、E56R+D57N+G91T+D254S、E56R+D57N+K98E+R108K、E56R+D57N+K98E+R118F、E56R+D57N+K98E+E210K、E56R+D57N+K98E+T244E、E56R+D57N+K98E+D254S、E56R+D57N+R108K+R118F、E56R+D57N+R108K+E210K、E56R+D57N+R108K+T244E、E56R+D57N+R108K+D254S、E56R+D57N+R118F+E210K、E56R+D57N+R118F+T244E、E56R+D57N+R118F+D254S、E56R+D57N+E210K+T244E、E56R+D57N+E210K+D254S、E56R+D57N+T244E+D254S、E56R+G91T+K98E+R108K、E56R+G91T+K98E+R118F、E56R+G91T+K98E+E210K、E56R+G91T+K98E+T244E、E56R+G91T+K98E+D254S、E56R+G91T+R108K+R118F、E56R+G91T+R108K+E210K、E56R+G91T+R108K+T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在实施例中，本发明的变体具有对应于SEQ ID NO:8的I202H的取代，并且进一步包含对应于以下的以下取代或取代组中的一个：G23S、D27N、A40I、F51I、E56R、V60K、R118F、T244E、P256T、G23S+D27N、G23S+A40I、G23S+F51I、G23S+E56R、G23S+V60K、G23S+R118F、G23S+T244E、G23S+P256T、D27N+A40I、D27N+F51I、D27N+E56R、D27N+V60K、D27N+R118F、D27N+T244E、D27N+P256T、A40I+F51I、A40I+E56R、A40I+V60K、A40I+R118F、A40I+T244E、A40I+P256T、F51I+E56R、F51I+V60K、F51I+R118F、F51I+T244E、F51I+P256T、E56R+V60K、E56R+R118F、E56R+T244E、E56R+P256T、V60K+R118F、V60K+T244E、V60K+P256T、R118F+T244E、R118F+P256T、T244E+P256T、G23S+D27N+A40I、G23S+D27N+F51I、G23S+D27N+E56R、G23S+D27N+V60K、G23S+D27N+R118F、G23S+D27N+T244E、G23S+D27N+P256T、G23S+A40I+F51I、G23S+A40I+E56R、G23S+A40I+V60K、G23S+A40I+R118F、G23S+A40I+T244E、G23S+A40I+P256T、G23S+F51I+E56R、G23S+F51I+V60K、G23S+F51I+R118F、G23S+F51I+T244E、G23S+F51I+P256T、G23S+E56R+V60K、G23S+E56R+R118F、G23S+E56R+T244E、G23S+E56R+P256T、G23S+V60K+R118F、G23S+V60K+T244E、G23S+V60K+P256T、G23S+R118F+T244E、G23S+R118F+P256T、G23S+T244E+P256T、D27N+A40I+F51I、D27N+A40I+E56R、D27N+A40I+V60K、D27N+A40I+R118F、D27N+A40I+T244E、D27N+A40I+P256T、D27N+F51I+E56R、D27N+F51I+V60K、D27N+F51I+R118F、D27N+F51I+T244E、D27N+F51I+P256T、D27N+E56R+V60K、D27N+E56R+R118F、D27N+E56R+T244E、D27N+E56R+P256T、D27N+V60K+R118F、D27N+V60K+T244E、D27N+V60K+P256T、D27N+R118F+T244E、D27N+R118F+P256T、D27N+T244E+P256T、A40I+F51I+E56R、A40I+F51I+V60K、A40I+F51I+R118F、A40I+F51I+T244E、A40I+F51I+P256T、A40I+E56R+V60K、A40I+E56R+R118F、A40I+E56R+T244E、A40I+E56R+P256T、A40I+V60K+R118F、A40I+V60K+T244E、A40I+V60K+P256T、A40I+R118F+T244E、A40I+R118F+P256T、A40I+T244E+P256T、F51I+E56R+V60K、F51I+E56R+R118F、F51I+E56R+T244E、F51I+E56R+P256T、F51I+V60K+R118F、F51I+V60K+T244E、F51I+V60K+P256T、F51I+R118F+T244E、F51I+R118F+P256T、F51I+T244E+P256T、E56R+V60K+R118F、E56R+V60K+T244E、E56R+V60K+P256T、E56R+R118F+T244E、E56R+R118F+P256T、E56R+T244E+P256T、V60K+R118F+T244E、V60K+R118F+P256T、V60K+T244E+P256T、R118F+T244E+P256T、G23S+D27N+A40I+F51I、G23S+D27N+A40I+E56R、G23S+D27N+A40I+V60K、G23S+D27N+A40I+R118F、G23S+D27N+A40I+T244E、G23S+D27N+A40I+P256T、G23S+D27N+F51I+E56R、G23S+D27N+F51I+V60K、G23S+D27N+F51I+R118F、G23S+D27N+F51I+T244E、G23S+D27N+F51I+P256T、G23S+D27N+E56R+V60K、G23S+D27N+E56R+R118F、G23S+D27N+E56R+T244E、G23S+D27N+E56R+P256T、G23S+D27N+V60K+R118F、G23S+D27N+V60K+T244E、G23S+D27N+V60K+P256T、G23S+D27N+R118F+T244E、G23S+D27N+R118F+P256T、G23S+D27N+T244E+P256T、G23S+A40I+F51I+E56R、G23S+A40I+F51I+V60K、G23S+A40I+F51I+R118F、G23S+A40I+F51I+T244E、G23S+A40I+F51I+P256T、G23S+A40I+E56R+V60K、G23S+A40I+E56R+R118F、G23S+A40I+E56R+T244E、G23S+A40I+E56R+P256T、G23S+A40I+V60K+R118F、G23S+A40I+V60K+T244E、G23S+A40I+V60K+P256T、G23S+A40I+R118F+T244E、G23S+A40I+R118F+P256T、G23S+A40I+T244E+P256T、G23S+F51I+E56R+V60K、G23S+F51I+E56R+R118F、G23S+F51I+E56R+T244E、G23S+F51I+E56R+P256T、G23S+F51I+V60K+R118F、G23S+F51I+V60K+T244E、G23S+F51I+V60K+P256T、G23S+F51I+R118F+T244E、G23S+F51I+R118F+P256T、G23S+F51I+T244E+P256T、G23S+E56R+V60K+R118F、G23S+E56R+V60K+T244E、G23S+E56R+V60K+P256T、G23S+E56R+R118F+T244E、G23S+E56R+R118F+P256T、G23S+E56R+T244E+P256T、G23S+V60K+R118F+T244E、G23S+V60K+R118F+P256T、G23S+V60K+T244E+P256T、G23S+R118F+T244E+P256T、D27N+A40I+F51I+E56R、D27N+A40I+F51I+V60K、D27N+A40I+F51I+R118F、D27N+A40I+F51I+T244E、D27N+A40I+F51I+P256T、D27N+A40I+E56R+V60K、D27N+A40I+E56R+R118F、D27N+A40I+E56R+T244E、D27N+A40I+E56R+P256T、D27N+A40I+V60K+R118F、D27N+A40I+V60K+T244E、D27N+A40I+V60K+P256T、D27N+A40I+R118F+T244E、D27N+A40I+R118F+P256T、D27N+A40I+T244E+P256T、D27N+F51I+E56R+V60K、D27N+F51I+E56R+R118F、D27N+F51I+E56R+T244E、D27N+F51I+E56R+P256T、D27N+F51I+V60K+R118F、D27N+F51I+V60K+T244E、D27N+F51I+V60K+P256T、D27N+F51I+R118F+T244E、D27N+F51I+R118F+P256T、D27N+F51I+T244E+P256T、D27N+E56R+V60K+R118F、D27N+E56R+V60K+T244E、D27N+E56R+V60K+P256T、D27N+E56R+R118F+T244E、D27N+E56R+R118F+P256T、D27N+E56R+T244E+P256T、D27N+V60K+R118F+T244E、D27N+V60K+R118F+P256T、D27N+V60K+T244E+P256T、D27N+R118F+T244E+P256T、A40I+F51I+E56R+V60K、A40I+F51I+E56R+R118F、A40I+F51I+E56R+T244E、A40I+F51I+E56R+P256T、A40I+F51I+V60K+R118F、A40I+F51I+V60K+T244E、A40I+F51I+V60K+P256T、A40I+F51I+R118F+T244E、A40I+F51I+R118F+P256T、A40I+F51I+T244E+P256T、A40I+E56R+V60K+R118F、A40I+E56R+V60K+T244E、A40I+E56R+V60K+P256T、A40I+E56R+R118F+T244E、A40I+E56R+R118F+P256T、A40I+E56R+T244E+P256T、A40I+V60K+R118F+T244E、A40I+V60K+R118F+P256T、A40I+V60K+T244E+P256T、A40I+R118F+T244E+P256T、F51I+E56R+V60K+R118F、F51I+E56R+V60K+T244E、F51I+E56R+V60K+P256T、F51I+E56R+R118F+T244E、F51I+E56R+R118F+P256T、F51I+E56R+T244E+P256T、F51I+V60K+R118F+T244E、F51I+V60K+R118F+P256T、F51I+V60K+T244E+P256T、F51I+R118F+T244E+P256T、E56R+V60K+R118F+T244E、E56R+V60K+R118F+P256T、E56R+V60K+T244E+P256T、E56R+R118F+T244E+P256T、V60K+R118F+T244E+P256T、G23S+D27N+A40I+F51I+E56R、G23S+D27N+A40I+F51I+V60K、G23S+D27N+A40I+F51I+R118F、G23S+D27N+A40I+F51I+T244E、G23S+D27N+A40I+F51I+P256T、G23S+D27N+A40I+E56R+V60K、G23S+D27N+A40I+E56R+R118F、G23S+D27N+A40I+E56R+T244E、G23S+D27N+A40I+E56R+P256T、G23S+D27N+A40I+V60K+R118F、G23S+D27N+A40I+V60K+T244E、G23S+D27N+A40I+V60K+P256T、G23S+D27N+A40I+R118F+T244E、G23S+D27N+A40I+R118F+P256T、G23S+D27N+A40I+T244E+P256T、G23S+D27N+F51I+E56R+V60K、G23S+D27N+F51I+E56R+R118F、G23S+D27N+F51I+E56R+T244E、G23S+D27N+F51I+E56R+P256T、G23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在实施例中，本发明的变体具有对应于SEQ ID NO:8的I252H的取代，并且进一步包含对应于以下的以下取代或取代组中的一个：G23S、D27N、A40I、F51I、E56R、V60K、R118F、T244E、P256T、G23S+D27N、G23S+A40I、G23S+F51I、G23S+E56R、G23S+V60K、G23S+R118F、G23S+T244E、G23S+P256T、D27N+A40I、D27N+F51I、D27N+E56R、D27N+V60K、D27N+R118F、D27N+T244E、D27N+P256T、A40I+F51I、A40I+E56R、A40I+V60K、A40I+R118F、A40I+T244E、A40I+P256T、F51I+E56R、F51I+V60K、F51I+R118F、F51I+T244E、F51I+P256T、E56R+V60K、E56R+R118F、E56R+T244E、E56R+P256T、V60K+R118F、V60K+T244E、V60K+P256T、R118F+T244E、R118F+P256T、T244E+P256T、G23S+D27N+A40I、G23S+D27N+F51I、G23S+D27N+E56R、G23S+D27N+V60K、G23S+D27N+R118F、G23S+D27N+T244E、G23S+D27N+P256T、G23S+A40I+F51I、G23S+A40I+E56R、G23S+A40I+V60K、G23S+A40I+R118F、G23S+A40I+T244E、G23S+A40I+P256T、G23S+F51I+E56R、G23S+F51I+V60K、G23S+F51I+R118F、G23S+F51I+T244E、G23S+F51I+P256T、G23S+E56R+V60K、G23S+E56R+R118F、G23S+E56R+T244E、G23S+E56R+P256T、G23S+V60K+R118F、G23S+V60K+T244E、G23S+V60K+P256T、G23S+R118F+T244E、G23S+R118F+P256T、G23S+T244E+P256T、D27N+A40I+F51I、D27N+A40I+E56R、D27N+A40I+V60K、D27N+A40I+R118F、D27N+A40I+T244E、D27N+A40I+P256T、D27N+F51I+E56R、D27N+F51I+V60K、D27N+F51I+R118F、D27N+F51I+T244E、D27N+F51I+P256T、D27N+E56R+V60K、D27N+E56R+R118F、D27N+E56R+T244E、D27N+E56R+P256T、D27N+V60K+R118F、D27N+V60K+T244E、D27N+V60K+P256T、D27N+R118F+T244E、D27N+R118F+P256T、D27N+T244E+P256T、A40I+F51I+E56R、A40I+F51I+V60K、A40I+F51I+R118F、A40I+F51I+T244E、A40I+F51I+P256T、A40I+E56R+V60K、A40I+E56R+R118F、A40I+E56R+T244E、A40I+E56R+P256T、A40I+V60K+R118F、A40I+V60K+T244E、A40I+V60K+P256T、A40I+R118F+T244E、A40I+R118F+P256T、A40I+T244E+P256T、F51I+E56R+V60K、F51I+E56R+R118F、F51I+E56R+T244E、F51I+E56R+P256T、F51I+V60K+R118F、F51I+V60K+T244E、F51I+V60K+P256T、F51I+R118F+T244E、F51I+R118F+P256T、F51I+T244E+P256T、E56R+V60K+R118F、E56R+V60K+T244E、E56R+V60K+P256T、E56R+R118F+T244E、E56R+R118F+P256T、E56R+T244E+P256T、V60K+R118F+T244E、V60K+R118F+P256T、V60K+T244E+P256T、R118F+T244E+P256T、G23S+D27N+A40I+F51I、G23S+D27N+A40I+E56R、G23S+D27N+A40I+V60K、G23S+D27N+A40I+R118F、G23S+D27N+A40I+T244E、G23S+D27N+A40I+P256T、G23S+D27N+F51I+E56R、G23S+D27N+F51I+V60K、G23S+D27N+F51I+R118F、G23S+D27N+F51I+T244E、G23S+D27N+F51I+P256T、G23S+D27N+E56R+V60K、G23S+D27N+E56R+R118F、G23S+D27N+E56R+T244E、G23S+D27N+E56R+P256T、G23S+D27N+V60K+R118F、G23S+D27N+V60K+T244E、G23S+D27N+V60K+P256T、G23S+D27N+R118F+T244E、G23S+D27N+R118F+P256T、G23S+D27N+T244E+P256T、G23S+A40I+F51I+E56R、G23S+A40I+F51I+V60K、G23S+A40I+F51I+R118F、G23S+A40I+F51I+T244E、G23S+A40I+F51I+P256T、G23S+A40I+E56R+V60K、G23S+A40I+E56R+R118F、G23S+A40I+E56R+T244E、G23S+A40I+E56R+P256T、G23S+A40I+V60K+R118F、G23S+A40I+V60K+T244E、G23S+A40I+V60K+P256T、G23S+A40I+R118F+T244E、G23S+A40I+R118F+P256T、G23S+A40I+T244E+P256T、G23S+F51I+E56R+V60K、G23S+F51I+E56R+R118F、G23S+F51I+E56R+T244E、G23S+F51I+E56R+P256T、G23S+F51I+V60K+R118F、G23S+F51I+V60K+T244E、G23S+F51I+V60K+P256T、G23S+F51I+R118F+T244E、G23S+F51I+R118F+P256T、G23S+F51I+T244E+P256T、G23S+E56R+V60K+R118F、G23S+E56R+V60K+T244E、G23S+E56R+V60K+P256T、G23S+E56R+R118F+T244E、G23S+E56R+R118F+P256T、G23S+E56R+T244E+P256T、G23S+V60K+R118F+T244E、G23S+V60K+R118F+P256T、G23S+V60K+T244E+P256T、G23S+R118F+T244E+P256T、D27N+A40I+F51I+E56R、D27N+A40I+F51I+V60K、D27N+A40I+F51I+R118F、D27N+A40I+F51I+T244E、D27N+A40I+F51I+P256T、D27N+A40I+E56R+V60K、D27N+A40I+E56R+R118F、D27N+A40I+E56R+T244E、D27N+A40I+E56R+P256T、D27N+A40I+V60K+R118F、D27N+A40I+V60K+T244E、D27N+A40I+V60K+P256T、D27N+A40I+R118F+T244E、D27N+A40I+R118F+P256T、D27N+A40I+T244E+P256T、D27N+F51I+E56R+V60K、D27N+F51I+E56R+R118F、D27N+F51I+E56R+T244E、D27N+F51I+E56R+P256T、D27N+F51I+V60K+R118F、D27N+F51I+V60K+T244E、D27N+F51I+V60K+P256T、D27N+F51I+R118F+T244E、D27N+F51I+R118F+P256T、D27N+F51I+T244E+P256T、D27N+E56R+V60K+R118F、D27N+E56R+V60K+T244E、D27N+E56R+V60K+P256T、D27N+E56R+R118F+T244E、D27N+E56R+R118F+P256T、D27N+E56R+T244E+P256T、D27N+V60K+R118F+T244E、D27N+V60K+R118F+P256T、D27N+V60K+T244E+P256T、D27N+R118F+T244E+P256T、A40I+F51I+E56R+V60K、A40I+F51I+E56R+R118F、A40I+F51I+E56R+T244E、A40I+F51I+E56R+P256T、A40I+F51I+V60K+R118F、A40I+F51I+V60K+T244E、A40I+F51I+V60K+P256T、A40I+F51I+R118F+T244E、A40I+F51I+R118F+P256T、A40I+F51I+T244E+P256T、A40I+E56R+V60K+R118F、A40I+E56R+V60K+T244E、A40I+E56R+V60K+P256T、A40I+E56R+R118F+T244E、A40I+E56R+R118F+P256T、A40I+E56R+T244E+P256T、A40I+V60K+R118F+T244E、A40I+V60K+R118F+P256T、A40I+V60K+T244E+P256T、A40I+R118F+T244E+P256T、F51I+E56R+V60K+R118F、F51I+E56R+V60K+T244E、F51I+E56R+V60K+P256T、F51I+E56R+R118F+T244E、F51I+E56R+R118F+P256T、F51I+E56R+T244E+P256T、F51I+V60K+R118F+T244E、F51I+V60K+R118F+P256T、F51I+V60K+T244E+P256T、F51I+R118F+T244E+P256T、E56R+V60K+R118F+T244E、E56R+V60K+R118F+P256T、E56R+V60K+T244E+P256T、E56R+R118F+T244E+P256T、V60K+R118F+T244E+P256T、G23S+D27N+A40I+F51I+E56R、G23S+D27N+A40I+F51I+V60K、G23S+D27N+A40I+F51I+R118F、G23S+D27N+A40I+F51I+T244E、G23S+D27N+A40I+F51I+P256T、G23S+D27N+A40I+E56R+V60K、G23S+D27N+A40I+E56R+R118F、G23S+D27N+A40I+E56R+T244E、G23S+D27N+A40I+E56R+P256T、G23S+D27N+A40I+V60K+R118F、G23S+D27N+A40I+V60K+T244E、G23S+D27N+A40I+V60K+P256T、G23S+D27N+A40I+R118F+T244E、G23S+D27N+A40I+R118F+P256T、G23S+D27N+A40I+T244E+P256T、G23S+D27N+F51I+E56R+V60K、G23S+D27N+F51I+E56R+R118F、G23S+D27N+F51I+E56R+T244E、G23S+D27N+F51I+E56R+P256T、G23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在实施例中，本发明的变体具有对应于SEQ ID NO:8的L269H的取代，并且进一步包含对应于以下的以下取代或取代组中的一个：G23S、D27N、A40I、F51I、E56R、V60K、R118F、T244E、P256T、G23S+D27N、G23S+A40I、G23S+F51I、G23S+E56R、G23S+V60K、G23S+R118F、G23S+T244E、G23S+P256T、D27N+A40I、D27N+F51I、D27N+E56R、D27N+V60K、D27N+R118F、D27N+T244E、D27N+P256T、A40I+F51I、A40I+E56R、A40I+V60K、A40I+R118F、A40I+T244E、A40I+P256T、F51I+E56R、F51I+V60K、F51I+R118F、F51I+T244E、F51I+P256T、E56R+V60K、E56R+R118F、E56R+T244E、E56R+P256T、V60K+R118F、V60K+T244E、V60K+P256T、R118F+T244E、R118F+P256T、T244E+P256T、G23S+D27N+A40I、G23S+D27N+F51I、G23S+D27N+E56R、G23S+D27N+V60K、G23S+D27N+R118F、G23S+D27N+T244E、G23S+D27N+P256T、G23S+A40I+F51I、G23S+A40I+E56R、G23S+A40I+V60K、G23S+A40I+R118F、G23S+A40I+T244E、G23S+A40I+P256T、G23S+F51I+E56R、G23S+F51I+V60K、G23S+F51I+R118F、G23S+F51I+T244E、G23S+F51I+P256T、G23S+E56R+V60K、G23S+E56R+R118F、G23S+E56R+T244E、G23S+E56R+P256T、G23S+V60K+R118F、G23S+V60K+T244E、G23S+V60K+P256T、G23S+R118F+T244E、G23S+R118F+P256T、G23S+T244E+P256T、D27N+A40I+F51I、D27N+A40I+E56R、D27N+A40I+V60K、D27N+A40I+R118F、D27N+A40I+T244E、D27N+A40I+P256T、D27N+F51I+E56R、D27N+F51I+V60K、D27N+F51I+R118F、D27N+F51I+T244E、D27N+F51I+P256T、D27N+E56R+V60K、D27N+E56R+R118F、D27N+E56R+T244E、D27N+E56R+P256T、D27N+V60K+R118F、D27N+V60K+T244E、D27N+V60K+P256T、D27N+R118F+T244E、D27N+R118F+P256T、D27N+T244E+P256T、A40I+F51I+E56R、A40I+F51I+V60K、A40I+F51I+R118F、A40I+F51I+T244E、A40I+F51I+P256T、A40I+E56R+V60K、A40I+E56R+R118F、A40I+E56R+T244E、A40I+E56R+P256T、A40I+V60K+R118F、A40I+V60K+T244E、A40I+V60K+P256T、A40I+R118F+T244E、A40I+R118F+P256T、A40I+T244E+P256T、F51I+E56R+V60K、F51I+E56R+R118F、F51I+E56R+T244E、F51I+E56R+P256T、F51I+V60K+R118F、F51I+V60K+T244E、F51I+V60K+P256T、F51I+R118F+T244E、F51I+R118F+P256T、F51I+T244E+P256T、E56R+V60K+R118F、E56R+V60K+T244E、E56R+V60K+P256T、E56R+R118F+T244E、E56R+R118F+P256T、E56R+T244E+P256T、V60K+R118F+T244E、V60K+R118F+P256T、V60K+T244E+P256T、R118F+T244E+P256T、G23S+D27N+A40I+F51I、G23S+D27N+A40I+E56R、G23S+D27N+A40I+V60K、G23S+D27N+A40I+R118F、G23S+D27N+A40I+T244E、G23S+D27N+A40I+P256T、G23S+D27N+F51I+E56R、G23S+D27N+F51I+V60K、G23S+D27N+F51I+R118F、G23S+D27N+F51I+T244E、G23S+D27N+F51I+P256T、G23S+D27N+E56R+V60K、G23S+D27N+E56R+R118F、G23S+D27N+E56R+T244E、G23S+D27N+E56R+P256T、G23S+D27N+V60K+R118F、G23S+D27N+V60K+T244E、G23S+D27N+V60K+P256T、G23S+D27N+R118F+T244E、G23S+D27N+R118F+P256T、G23S+D27N+T244E+P256T、G23S+A40I+F51I+E56R、G23S+A40I+F51I+V60K、G23S+A40I+F51I+R118F、G23S+A40I+F51I+T244E、G23S+A40I+F51I+P256T、G23S+A40I+E56R+V60K、G23S+A40I+E56R+R118F、G23S+A40I+E56R+T244E、G23S+A40I+E56R+P256T、G23S+A40I+V60K+R118F、G23S+A40I+V60K+T244E、G23S+A40I+V60K+P256T、G23S+A40I+R118F+T244E、G23S+A40I+R118F+P256T、G23S+A40I+T244E+P256T、G23S+F51I+E56R+V60K、G23S+F51I+E56R+R118F、G23S+F51I+E56R+T244E、G23S+F51I+E56R+P256T、G23S+F51I+V60K+R118F、G23S+F51I+V60K+T244E、G23S+F51I+V60K+P256T、G23S+F51I+R118F+T244E、G23S+F51I+R118F+P256T、G23S+F51I+T244E+P256T、G23S+E56R+V60K+R118F、G23S+E56R+V60K+T244E、G23S+E56R+V60K+P256T、G23S+E56R+R118F+T244E、G23S+E56R+R118F+P256T、G23S+E56R+T244E+P256T、G23S+V60K+R118F+T244E、G23S+V60K+R118F+P256T、G23S+V60K+T244E+P256T、G23S+R118F+T244E+P256T、D27N+A40I+F51I+E56R、D27N+A40I+F51I+V60K、D27N+A40I+F51I+R118F、D27N+A40I+F51I+T244E、D27N+A40I+F51I+P256T、D27N+A40I+E56R+V60K、D27N+A40I+E56R+R118F、D27N+A40I+E56R+T244E、D27N+A40I+E56R+P256T、D27N+A40I+V60K+R118F、D27N+A40I+V60K+T244E、D27N+A40I+V60K+P256T、D27N+A40I+R118F+T244E、D27N+A40I+R118F+P256T、D27N+A40I+T244E+P256T、D27N+F51I+E56R+V60K、D27N+F51I+E56R+R118F、D27N+F51I+E56R+T244E、D27N+F51I+E56R+P256T、D27N+F51I+V60K+R118F、D27N+F51I+V60K+T244E、D27N+F51I+V60K+P256T、D27N+F51I+R118F+T244E、D27N+F51I+R118F+P256T、D27N+F51I+T244E+P256T、D27N+E56R+V60K+R118F、D27N+E56R+V60K+T244E、D27N+E56R+V60K+P256T、D27N+E56R+R118F+T244E、D27N+E56R+R118F+P256T、D27N+E56R+T244E+P256T、D27N+V60K+R118F+T244E、D27N+V60K+R118F+P256T、D27N+V60K+T244E+P256T、D27N+R118F+T244E+P256T、A40I+F51I+E56R+V60K、A40I+F51I+E56R+R118F、A40I+F51I+E56R+T244E、A40I+F51I+E56R+P256T、A40I+F51I+V60K+R118F、A40I+F51I+V60K+T244E、A40I+F51I+V60K+P256T、A40I+F51I+R118F+T244E、A40I+F51I+R118F+P256T、A40I+F51I+T244E+P256T、A40I+E56R+V60K+R118F、A40I+E56R+V60K+T244E、A40I+E56R+V60K+P256T、A40I+E56R+R118F+T244E、A40I+E56R+R118F+P256T、A40I+E56R+T244E+P256T、A40I+V60K+R118F+T244E、A40I+V60K+R118F+P256T、A40I+V60K+T244E+P256T、A40I+R118F+T244E+P256T、F51I+E56R+V60K+R118F、F51I+E56R+V60K+T244E、F51I+E56R+V60K+P256T、F51I+E56R+R118F+T244E、F51I+E56R+R118F+P256T、F51I+E56R+T244E+P256T、F51I+V60K+R118F+T244E、F51I+V60K+R118F+P256T、F51I+V60K+T244E+P256T、F51I+R118F+T244E+P256T、E56R+V60K+R118F+T244E、E56R+V60K+R118F+P256T、E56R+V60K+T244E+P256T、E56R+R118F+T244E+P256T、V60K+R118F+T244E+P256T、G23S+D27N+A40I+F51I+E56R、G23S+D27N+A40I+F51I+V60K、G23S+D27N+A40I+F51I+R118F、G23S+D27N+A40I+F51I+T244E、G23S+D27N+A40I+F51I+P256T、G23S+D27N+A40I+E56R+V60K、G23S+D27N+A40I+E56R+R118F、G23S+D27N+A40I+E56R+T244E、G23S+D27N+A40I+E56R+P256T、G23S+D27N+A40I+V60K+R118F、G23S+D27N+A40I+V60K+T244E、G23S+D27N+A40I+V60K+P256T、G23S+D27N+A40I+R118F+T244E、G23S+D27N+A40I+R118F+P256T、G23S+D27N+A40I+T244E+P256T、G23S+D27N+F51I+E56R+V60K、G23S+D27N+F51I+E56R+R118F、G23S+D27N+F51I+E56R+T244E、G23S+D27N+F51I+E56R+P256T、G23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在优选的实施例中，本发明的变体包含对应于以下的以下取代组中的一个或由其组成：
A40E+E56R+D57N+G91T+K98E+R108K+R118F+E210K+T244E+D254S+I202H、A40E+E56R+D57N+G91T+K98E+R108K+R118F+E210K+T244E+D254S+I252H、A40E+E56R+D57N+G91T+K98E+R108K+R118F+E210K+T244E+D254S+L269H、A40E+E56R+D57N+G91T+K98E+R108K+R118F+E210K+T244E+D254S+I202H+I252H、A40E+E56R+D57N+G91T+K98E+R108K+R118F+E210K+T244E+D254S+I202H+L269H、A40E+E56R+D57N+G91T+K98E+R108K+R118F+E210K+T244E+D254S+I252H+L269H、A40E+E56R+D57N+G91T+K98E+R108K+R118F+E210K+T244E+D254S+I252H+L269H(使用SEQ ID NO:8进行编号)。
在优选的实施例中，本发明的变体包含对应于以下的以下取代组中的一个或由其组成：
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T244E+P256T+I202H、G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T244E+P256T+I252H、G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T244E+P256T+L269H、G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T244E+P256T+I202H+I252H、G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T244E+P256T+I202H+L269H、G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T244E+P256T+I252H+L269H、G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T244E+P256T+I202H+H252H+L269H(使用SEQ ID NO:8进行编号)。
在优选的实施例中，本发明的变体还可以进一步包含对应于F7K、F51I、F51L、F51V、F51Y、H198D、H198G、H198F、H198I、H198L、H198N、H198S、H198T、H198Y、N200Q、S224F、S224P、L227D、L227E、L227R、V228P、V230R、I255G、I255N、A257F和A257I(使用SEQ ID NO:8进行编号)的取代中的一个或多个。
氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基末端或羧基末端延伸，诸如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一功能(如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。
保守取代的实例在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins[蛋白质],Academic Press[学术出版社],纽约中描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。
可替代地，这些氨基酸改变具有使多肽的物理化学性质改变的这样一种性质。例如，氨基酸改变可以改善多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。
可以根据本领域中已知的程序，诸如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989,Science[科学]244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得分子的脂肪酶活性以鉴定对于该分子的活性关键的氨基酸残基。还参见，Hilton等人,1996,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性位点还可以通过对结构的物理分析来确定，如由诸如以下技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点氨基酸进行突变。参见例如，de Vos等人,1992,Science[科学]255:306-312；Smith等人,1992,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人,1992,FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]309:59-64。必需氨基酸的同一性也可以从与相关多肽的比对推断，和/或从与相关多肽或者多肽或蛋白质家族内与来自共同祖先的多肽/蛋白质(典型地具有相似的三维结构、功能和显著的序列相似性)的序列同源性和保守催化机制推断。另外地或可替代地，蛋白质结构预测工具可以用于蛋白质结构建模以鉴定多肽的必需氨基酸和/或活性位点。参见例如Jumper等人,2021,“Highly accurateprotein structure prediction with AlphaFold[利用α折叠进行高度准确的蛋白结构预测]”,Nature[自然]596:583-589。
本发明的变体优选地由269个氨基酸组成，但还可以在N-末端和/或C-末端处包含肽延伸/添加。肽延伸可以为1-20个氨基酸长。在N-末端处，肽延伸/添加可以优选地包含1-5个氨基酸SPIRR。
多肽可以是包含本发明的变体的融合多肽。在一个方面，变体是分离的。
本发明的变体相对于亲本具有改善的特性，因为与亲本脂肪酶(特别地分别为SEQID NO:2、4、6或8)相比，本发明的脂肪酶变体在中性左右的pH(即，约pH 6-8，优选地约pH7)具有降低的脂肪酶活性和/或减少的气味产生，和/或具有增加的效益风险因子(BRF)。
根据本发明，洗涤性能可以测量为与亲本脂肪酶(特别地分别为SEQ ID NO:2、4、6或8)相比的相对洗涤性能(RP(洗涤))。
在实施例中，相对洗涤性能(RP(洗涤))大于1.0、优选地大于1.1、优选地大于1.2、优选地大于1.3、优选地大于1.4、优选地大于1.5、优选地大于1.6、优选地大于1.7、优选地大于1.8、优选地大于1.9、优选地大于2.0、优选地大于2.5、优选地大于3.0、优选地大于3.5、优选地大于4.0、优选地大于5.0、优选地大于6.0、优选地大于7.0、优选地大于8.0、优选地大于9.0、优选地大于10.0。
根据本发明，气味产生可以测量为与亲本脂肪酶(特别地分别为SEQ ID NO:2、4、6或8)相比的相对气味产生(RP(气味))。
在实施例中，气味产生小于1.0、优选地小于0.9、优选地小于0.8、优选地小于0.7、优选地小于0.6、优选地小于0.5、优选地小于0.4、优选地小于0.3、优选地小于0.2、优选地小于0.1。
根据本发明，效益风险因子(BRF)是与相对气味产生(风险)相比的相对洗涤性能(效益)，并且计算为RP(洗涤)/RP(气味)。如果脂肪酶变体的效益风险因子大于1.0，则与参照脂肪酶(特别地分别为SEQ ID NO:2、4、6或8中的亲本脂肪酶)相比，该脂肪酶相对于释放的气味具有更好的洗涤性能。
在实施例中，BRF大于1.0、优选地大于1.1、优选地大于1.2、优选地大于1.3、优选地大于1.4、优选地大于1.5、优选地大于1.6、优选地大于1.7、优选地大于1.8、优选地大于1.9、优选地大于2.0、优选地大于2.5、优选地大于3.0、优选地大于3.5、优选地大于4.0、优选地大于5.0、优选地大于6.0、优选地大于7.0、优选地大于8.0、优选地大于9.0、优选地大于10.0。
在优选的实施例中，相对洗涤性能(RP(洗涤))和BRF都大于1.0、优选地1.1、优选地大于1.2、优选地大于1.3、优选地大于1.4、优选地大于1.5、优选地大于1.6、优选地大于1.7、优选地大于1.8、优选地大于1.9、优选地大于2.0、优选地大于2.5、优选地大于3.0、优选地大于3.5、优选地大于4.0、优选地大于5.0、优选地大于6.0、优选地大于7.0、优选地大于8.0、优选地大于9.0、优选地大于10.0。
亲本脂肪酶
亲本脂肪酶分别与SEQ ID NO:2、4、6或8的多肽(具有脂肪酶活性)具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。
SEQ ID NO:2是成熟的野生型疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(TLL)。
EVSQDLFNQF NLFAQYSAAA YCGKNNDAPA GTNITCTGNA CPEVEKADAT
FLYSFEDSGV GDVTGFLALD NTNKLIVLSF RGSRSIENWI GNLNFDLKEI
NDICSGCRGH DGFTSSWRSV ADTLRQKVED AVREHPDYRV VFTGHSLGGA
LATVAGADLR GNGYDIDVFS YGAPRVGNRA FAEFLTVQTG GTLYRITHTN
DIVPRLPPRE FGYSHSSPEY WIKSGTLVPV TRNDIVKIEG IDATGGNNQP
NIPDIPAHLW YFGLIGTCL
SEQ ID NO:4是SEQ ID NO:8中的脂肪酶的变体。
EVSQDLFNQF NLFAQYSAAA YCGKNNDAPA GTNITCTGNE CPEVEKADAT
FLYSFRNSGV GDVTGFLALD NTNKLIVLSF RGSRSIENWI TNLNFDLEEI
NDICSGCKGH DGFTSSWFSV ADTLRQKVED AVREHPDYRV VFTGHSLGGA
LATVAGADLR GNGYDIDVFS YGAPRVGNRA FAEFLTVQTG GTLYRITHTN
DIVPRLPPRK FGYSHSSPEY WIKSGTLVPV RRRDIVKIEG IDAEGGNNQP
NIPSIPAHLW YFGLIGTCL
SEQ ID NO:6是SEQ ID NO:8中所示的脂肪酶的变体。
EVSQDLFNQF NLFAQYSAAA YCSKNNNAPA GTNITCTGNI CPEVEKADAT
ILYSFRDSGK GDVTGFLALD NTNKLIVLSF RGSRSIENWI GNLNFDLKEI
NDICSGCRGH DGFTSSWFSV ADTLRQKVED AVREHPDYRV VFTGHSLGGA
LATVAGADLR GNGYDIDVFS YGAPRVGNRA FAEFLTVQTG GTLYRITHTN
DIVPRLPPRE FGYSHSSPEY WIKSGTLVPV RRRDIVKIEG IDAEGGNNQP
NIPDITAHLW YFGLIGTCL
SEQ ID NO:8是SEQ ID NO:2中所示的野生型疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(TLL)的变体。
EVSQDLFNQF NLFAQYSAAA YCGKNNDAPA GTNITCTGNA CPEVEKADAT
FLYSFEDSGV GDVTGFLALD NTNKLIVLSF RGSRSIENWI GNLNFDLKEI
NDICSGCRGH DGFTSSWRSV ADTLRQKVED AVREHPDYRV VFTGHSLGGA
LATVAGADLR GNGYDIDVFS YGAPRVGNRA FAEFLTVQTG GTLYRITHTN
DIVPRLPPRE FGYSHSSPEY WIKSGTLVPV RRRDIVKIEG IDATGGNNQP
NIPDIPAHLW YFGLIGTCL
在优选的方面，SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8中的任一个可以分别地是亲本脂肪酶。
在一个方面，亲本的氨基酸序列分别与SEQ ID NO:2、4、6或8的多肽相差多达10个氨基酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个。在另一方面，亲本包含SEQ ID NO:2、4、6或8的氨基酸序列，或由其组成。在另一方面，亲本是SEQ ID NO:2、4、6或8的多肽的、含有至少200个氨基酸残基例如至少250个氨基酸残基以及至少260个氨基酸残基的片段。
亲本可以是融合多肽或可切割的融合多肽。通过将编码另一种多肽的多核苷酸与本发明的多核苷酸融合来生产融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列使得它们符合读框，而且融合多肽的表达处于一个或多个相同的启动子和终止子的控制之下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(Cooper等人,1993,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人,1994,Science[科学]266:776-779)。
融合多肽可进一步包含两个多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：Martin等人,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物生物技术杂志]3:568-576；Svetina等人,2000,J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人,1997,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:498-503；和Contreras等人,1991,Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人,1986,Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics[蛋白质：结构、功能以及遗传学]6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World[药物发现世界]4:35-48。
亲本可以从任何属的微生物中获得。出于本发明的目的，如本文中与给定来源结合使用，术语“从……获得”应当意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一个方面，亲本是胞外分泌的。
在优选的实施例中，亲本是嗜热真菌属(Thermomyces)脂肪酶，特别地野生型疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶，尤其是SEQ ID NO:2的脂肪酶(以商品名LIPOLASETM出售)。在另一个优选的方面，亲本脂肪酶是SEQ ID NO:2的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的变体。在优选的实施例中，亲本脂肪酶是SEQ ID NO:8中所示的脂肪酶(以商品名LIPEXTM出售)，该脂肪酶是具有T231R+N233R取代的SEQ ID NO:2。在其他特别考虑的实施例中，亲本脂肪酶可以是如SEQID NO:4所示的SEQ ID NO:8的变体，该变体与SEQ ID NO:8相比具有以下取代：A40E+E56R+D57N+G91T+K98E+R108K+R118F+E210K+T244E+D254S。在另一个优选的实施例中，亲本脂肪酶可以是SEQ ID NO:6中所示的，SEQ ID NO:8的变体，该变体与SEQ ID NO:8相比具有以下突变：G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T244E+P256T，并且还披露于WO 2019/063499中(通过引用特此并入)。
变体的制备
本发明还涉及用于获得具有脂肪酶活性的本发明的变体的方法，这些方法包括：
(a)将选自包含以下的组(i)、(ii)和(iii)中的一个或多个的一个或多个取代引入亲本脂肪酶：
(i)在对应于SEQ ID NO:8的多肽的位置202、252和269的一个或多个位置处的取代；
(ii)在对应于SEQ ID NO:8的多肽的位置40、56、57、91、98、108、118、210、244和254的一个或多个位置处的取代；以及
(iii)在对应于SEQ ID NO:8的多肽的位置23、27、40、51、56、60、118、244和256的一个或多个位置处的取代；
其中该变体具有脂肪酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:8的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性，但小于100％的序列同一性，其中该变体任选地在N-末端和/或C-末端处包含一个或多个氨基酸延伸，或在N-末端和/或C-末端处包含一个或多个氨基酸截短，并且其中该变体具有脂肪酶活性；以及
(b)回收本发明的变体。
本发明的任何变体可以如上所述产生。
在优选的实施例中，所产生的变体选自本发明的变体，其包含对应于SEQ ID NO:8中的位置的一个或多个取代(特别地所有取代)或由其组成，这些选自由以下组成的组：
H对位置202处的氨基酸残基进行的取代；
H对位置252处的氨基酸残基进行的取代；以及
H对位置269处的氨基酸残基进行的取代。
在优选的实施例中，所产生的变体选自本发明的变体，其包含对应于以下的以下取代组中的一个或由其组成：202H+252H；202H+269H；252H+269H；或202H+252H+269H(使用SEQ ID NO:8进行编号)。
在另一个优选的实施例中，所产生的变体选自本发明的变体，其包含对应于SEQID NO:8中的位置的一个或多个取代(特别地所有取代)或由其组成，这些取代选自由以下组成的组：
E对位置40处的氨基酸残基进行的取代；
R对位置56处的氨基酸残基进行的取代；
N对位置57处的氨基酸残基进行的取代；
T对位置91处的氨基酸残基进行的取代；
E对位置98处的氨基酸残基进行的取代；
K对位置108处的氨基酸残基进行的取代；
F对位置118处的氨基酸残基进行的取代；
K对位置210处的氨基酸残基进行的取代；
E对位置244处的氨基酸残基进行的取代；以及
S对位置254处的氨基酸残基进行的取代。
在另一个实施例中，所产生的变体选自本发明的变体，其包含对应于SEQ ID NO:8中的位置的一个或多个取代(特别地所有取代)或由其组成，这些取代选自由以下组成的组：
S对位置23处的氨基酸残基进行的取代；
N对位置27处的氨基酸残基进行的取代；
I对位置40处的氨基酸残基进行的取代；
I对位置51处的氨基酸残基进行的取代；
R对位置56处的氨基酸残基进行的取代；
K对位置60处的氨基酸残基进行的取代；
F对位置118处的氨基酸残基进行的取代；
E对位置244处的氨基酸残基进行的取代；以及
T对位置256处的氨基酸残基进行的取代。
可以使用本领域已知的任何诱变程序，如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等制备变体。
定点诱变是在编码亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个突变的技术。
通过涉及使用含有所期望突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，该盒式诱变涉及由限制酶在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将含有突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化质粒和寡核苷酸的限制性酶是相同的，从而允许质粒和插入物的粘性末端彼此连接。参见例如，Scherer和Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]76:4949-4955；和Barton等人,1990,Nucleic Acids Res.[核酸研究]18:7349-4966。
还可以通过本领域中已知的方法在体内实现定点诱变。参见，例如US 2004/0171154；Storici等人,2001,Nature Biotechnol.[自然生物技术]19:773-776；Kren等人,1998,Nat.Med.[自然医学]4:285-290；以及Calissano和Macino,1996,FungalGenet.Newslett.[真菌遗传学时事通讯]43:15-16。
可以在本发明中使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的许多可商购的试剂盒。
合成基因构建需要设计的多核苷酸分子的体外合成以编码目的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，如由Tian等人,2004,Nature[自然]432:1050-1054所述的基于多路微芯片的技术,以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。
可以使用已知的诱变、重组和/或混编方法，随后进行相关的筛选程序做出单氨基酸或多氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，该相关的筛选程序例如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625披露的那些。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人,1991,Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；US 5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人,1986,Gene[基因]46:145；Ner等人,1988,DNA 7:127)。
诱变/改组方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等人,1999,Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。
通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是利用合成的多核苷酸片段的过程结合PCR技术。因此，基因的限定区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以进行易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。
颗粒
本发明还涉及包含本发明的脂肪酶变体的酶颗粒/粒子。在实施例中，颗粒包含核心以及任选地包围该核心的一个或多个包衣(外层)。
核心的直径(测量为当量球径(基于体积的平均粒度))可以是20-2000μm，特别地50-1500μm、100-1500μm或250-1200μm。可以使用激光衍射诸如使用马尔文帕纳科公司(Malvern)Mastersizer和/或在ISO13320(2020)下描述的方法来测定作为当量球径测量的核心直径。
在实施例中，核心包含本发明的脂肪酶变体。
核心可以包括另外的材料如填料、纤维材料(纤维素或合成纤维)、稳定剂、增溶剂、悬浮剂、粘度调节剂、轻球体、增塑剂、盐、润滑剂和芳香剂。
核心可以包括粘合剂，如合成聚合物、蜡、脂肪或碳水化合物。
核心典型地作为均匀的共混物可以包括多价阳离子的盐、还原剂、抗氧化剂、过氧化物分解催化剂和/或酸性缓冲剂组分。
核心可以包括惰性粒子，其中该变体被吸附到该惰性粒子中，或者被施加(例如，通过流化床涂覆)到表面上。
核心的直径可以是20-2000μm，特别地50-1500μm、100-1500μm或250-1200μm。
核心可被至少一个包衣包围，例如以改善储存稳定性、减少处理期间粉尘形成或用于着色该颗粒。任选的一种或多种包衣可包括盐包衣或其他适合的包衣材料，如聚乙二醇(PEG)、甲基羟基-丙基纤维素(MHPC)和聚乙烯醇(PVA)。
可按核心的重量计以至少0.1％(例如，至少0.5％、至少1％、至少5％、至少10％或至少15％)的量施加涂层。该量至多可以是100％、70％、50％、40％或30％。
包衣优选地是至少0.1μm厚，特别地至少0.5μm、至少1μm或至少5μm厚。在一些实施例中，包衣的厚度低于100μm，如低于60μm或低于40μm。
包衣应通过形成基本上连续的层来密封该核心单元。基本上连续的层应被理解为具有极少或没有孔洞的包衣，使得核心单元具有极少或没有未包衣的区域。层或包衣特别应在厚度上是均匀的。
涂层可以进一步包含如本领域已知的其他材料，例如填料、防粘剂、颜料、染料、增塑剂和/或粘合剂，如二氧化钛、高岭土、碳酸钙或滑石。
盐涂层可包含按重量计至少60％的盐，例如按重量计至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。
为了提供可接受的保护，盐涂层优选地是至少0.1μm厚，例如至少0.5μm、至少1μm、至少2μm、至少4μm、至少5μm或至少8μm。在特定的实施例中，盐包衣的厚度低于100μm，如低于60μm或低于40μm。
盐可以从盐溶液(其中该盐是完全溶解的)中添加，或者从盐悬浮液(其中这些细粒子小于50μm，例如小于10μm或小于5μm)中添加。
盐包衣可以包含单一盐或者两种或更多种盐的混合物。盐可以是水溶性的，特别地具有在20℃在100g水中至少0.1g的溶解度，优选地至少0.5g/100g水，例如至少1g/100g水、例如至少5g/100g水。
盐可以是无机盐，例如硫酸盐、亚硫酸盐、磷酸盐、膦酸盐、硝酸盐、氯盐或碳酸盐或者简单有机酸(小于10个碳原子，例如6个或更少的碳原子)的盐如柠檬酸盐、丙二酸盐或乙酸盐。在这些盐中的阳离子的实例是碱或碱土金属离子、铵离子或第一过渡系的金属离子，如钠、钾、镁、钙、锌或铝。阴离子的实例包括氯、溴、碘、硫酸根、亚硫酸根、亚硫酸氢根、硫代硫酸根、磷酸根、磷酸二氢根、二碱式磷酸根、次磷酸根、焦磷酸二氢根、四硼酸根、硼酸根、碳酸根、碳酸氢根、硅酸根、柠檬酸根、苹果酸根、马来酸根、丙二酸根、琥珀酸根、乳酸根、甲酸根、乙酸根、丁酸根、丙酸根、苯甲酸根、酒石酸根、抗坏血酸根或葡萄糖酸根。特别地，可以使用硫酸根、亚硫酸根、磷酸根、膦酸根、硝酸根、氯或碳酸根的碱或碱土金属盐或者简单有机酸的盐如柠檬酸盐、丙二酸盐或乙酸盐。
涂层中的盐在20℃可具有60％以上、特别是70％以上、80％以上或85％以上的恒定湿度，或者它可以是这样的盐的另一种水合物形式(例如，无水物)。盐包衣可以如WO 00/01793或WO 2006/034710中所述。
合适的盐的特定实例是NaCl(CH20℃＝76％)、Na2CO3(CH20℃＝92％)、NaNO3(CH20℃＝73％)、Na2HPO4(CH20℃＝95％)、Na3PO4(CH25℃＝92％)、NH4Cl(CH20℃＝79.5％)、(NH4)2HPO4(CH20℃＝93,0％)、NH4H2PO4(CH20℃＝93.1％)、(NH4)2SO4(CH20℃＝81.1％)、KCl(CH20℃＝85％)、K2HPO4(CH20℃＝92％)、KH2PO4(CH20℃＝96.5％)、KNO3(CH20℃＝93.5％)、Na2SO4(CH20℃＝93％)、K2SO4(CH20℃＝98％)、KHSO4(CH20℃＝86％)、MgSO4(CH20℃＝90％)、ZnSO4(CH20℃＝90％)和柠檬酸钠(CH25℃＝86％)。其他实例包括NaH2PO4、(NH4)H2PO4、CuSO4、Mg(NO3)2和乙酸镁。
该盐可以处于无水形式，或者它可以是水合盐，即具有结晶化的一个或多个结合水的结晶盐水合物，如描述于WO 99/32595中。特定实例包括无水硫酸钠(Na2SO4)、无水硫酸镁(MgSO4)、七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)、七水硫酸锌(ZnSO4·7H2O)、七水磷酸氢二钠(Na2HPO4·7H2O)、六水硝酸镁(Mg(NO3)2(6H2O))、二水柠檬酸钠和四水乙酸镁。
优选地，作为盐溶液使用该盐，例如使用流化床。
包衣材料可以是蜡状包衣材料和成膜包衣材料。蜡状包衣材料的实例是平均分子量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中该醇含有12至20个碳原子，并且其中存在15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯、和甘油二酯、和甘油三酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB 1483591中给出。
颗粒可任选地具有一个或多个另外的包衣。适合的包衣材料的实例是聚乙二醇(PEG)、甲基羟基-丙基纤维素(MHPC)和聚乙烯醇(PVA)。具有多个包衣的酶颗粒的实例描述于WO 93/07263和WO 97/23606中。
核心可以通过粒化成分的共混物来制备，例如通过包括造粒技术的方法，如结晶、沉淀、锅包衣(pan-coating)、流化床包衣、流化床凝集、旋转雾化、挤出、颗粒化(prilling)、滚圆(spheronization)、粒度减小法、转鼓造粒(drum granulation)和/或高剪切造粒。
用于制备核心的方法可见于Handbook of Powder Technology[粉末技术手册]；C.E.Capes的Particle size enlargement[粒度增大]；第1卷；1980；Elsevier[爱思唯尔出版公司]中。制备方法包括已知的饲料和颗粒配制技术，例如：
(a)喷雾干燥产品，其中在喷雾干燥塔中雾化液体含酶溶液以形成小液滴，在它们在沿干燥塔下降期间干燥形成含酶的微粒状材料。用这种方法可以产生非常小的粒子(Michael S.Showell(编辑)；Powdered detergents[粉状洗涤剂]；Surfactant ScienceSeries[表面活性剂科学系列]；1998；第71卷；140-142页；Marcel Dekker[马塞尔·德克尔公司])。
(b)层状产品，其中酶在预形成的惰性核心粒子周围包衣成层，其中含酶溶液典型地在流化床装置中被雾化，在该流化床装置中预形成的核心粒子被流体化并且含酶溶液附着到核心粒子上并干燥，直到使得干的酶层留在核心粒子的表面上。如果可以发现具有希望尺寸的有用核心粒子，则通过这种方式能够获得具有希望尺寸的粒子。这种类型的产品描述于，例如，WO 97/23606中。
(c)吸附的核心粒子，其中不是将变体在核心周围包衣成层，而是在核心的表面上和/或表面中吸附该酶。这样的方法描述于WO 97/39116中。
(d)挤出或丸粒化的产品，其中将含变体的糊剂压成丸粒或在压力下通过小的开口挤出并切割为粒子，随后干燥这些丸粒。这样的粒子通常具有相当大的尺寸，因为开有挤出开口的材料(通常是具有钻孔的平板)限制了通过挤出开口可允许的压降。此外，当使用小开口时，非常高的挤出压力增加了酶糊剂中的热发生，这对酶是有害的(MichaelS.Showell(编辑)；Powdered detergents[粉状洗涤剂]；Surfactant Science Series[表面活性剂科学系列]；1998；第71卷；140-142页；Marcel Dekker[马塞尔·德克尔公司])。
(e)喷射造粒产品，其中将含变体的粉末悬浮于熔化的蜡中，并将悬浮液喷射(例如通过转盘喷雾器)到冷却室中，在此冷却室中液滴快速地固化(Michael S.Showell(编辑)；Powdered detergents[粉状洗涤剂]；Surfactant Science Series[表面活性剂科学系列]；1998；第71卷；140-142页；Marcel Dekker[马塞尔·德克尔公司])。所获得的产品是变体均匀分布在整个惰性材料中而不是集中在其表面上的产品。US 4,016,040和US 4,713,245描述了这种技术。
(f)混合器造粒产品，其中将含变体的液体添加到常规造粒组分的干燥粉末组合物中。将液体和粉末以适合的比例混合，并且因为液体的水分为干燥粉末所吸收，干燥粉末的组分开始附着并凝集，并且粒子将累积，形成包含酶的颗粒。这样的方法描述于US 4,106,991、EP 170360、EP 304332、EP 304331、WO 90/09440和WO 90/09428中。在此方法的特定方面，各种高剪切混合器可以用作造粒机。将由变体、填料和粘合剂等组成的颗粒与纤维素纤维混合以强化粒子，从而产生所谓的T-颗粒。经强化的粒子更加坚固，并释放更少的酶粉尘。
(g)粒度减小，其中通过碾磨或压碎含酶的较大的粒子、丸粒、平片体、坯块(briquette)等产生核心。通过将碾磨或压碎的产物过筛获得所需要的核心粒子级分。可以回收尺寸过大和尺寸过小的粒子。粒度减小描述于Martin Rhodes(编辑)；Principles ofPowder Technology[粉末技术原理]；1990；第10章；John Wiley&Sons[约翰·威利父子出版社]中。
(h)流化床造粒。流化床造粒涉及将微粒悬浮于空气流中并经喷嘴喷射液体到流体化粒子上。被喷射的液滴击中的粒子湿润并发粘。发粘的粒子与其他粒子碰撞并附着到其上以形成颗粒。
(i)这些核心可经受干燥，例如在流化床干燥器中。本领域技术人员可以使用在饲料或酶工业中用于干燥颗粒的其他已知的方法。干燥优选地在从25℃至90℃的产品温度进行。对于一些酶来说，重要的是包含变体的核心在用盐包衣之前含有少量的水。如果在去除过量的水之前用盐包衣水敏性酶，则过量的水将被截留在核心中并且可能对酶的活性产生负面影响。干燥之后，这些核心优选地含有0.1％-10％w/w的水。
无粉尘颗粒可例如如US 4,106,991和US 4,661,452中所披露产生，并且可任选地通过本领域已知的方法被包衣。
该颗粒可以进一步包含一种或多种另外的酶。然后，每种酶将存在于更多颗粒中，确保酶的更均匀分布，并且还由于不同的粒度而减少不同酶的物理分离。用于产生多酶共颗粒的方法披露于ip.com披露内容IPCOM000200739D中。
通过使用共颗粒配制酶的另一个实例披露于WO 2013/188331中。
本发明还涉及根据EP 238216中披露的方法制备的受保护的酶。
在实施例中，颗粒进一步包含一种或多种另外的酶，例如，水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶和转移酶。一种或多种另外的酶优选地选自由以下组成的组：乙酰木聚糖酯酶、酰基甘油脂肪酶、淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、阿魏酸酯酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、溶血磷脂酶、溶菌酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶(甘露聚糖酶)、植酸酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶D、蛋白酶、普鲁兰酶、果胶酯酶、三酰基甘油脂肪酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶或其任何组合。
液体组合物
本发明还涉及包含本发明的变体的液体组合物。该组合物可包含酶稳定剂(该酶稳定剂的实例包括多元醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、可逆蛋白酶抑制剂、硼酸或硼酸衍生物如芳族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸)。
在一些实施例中，包括一种或多种填料或一种或多种运载体材料以增加这样的组合物的体积。合适的填料或运载体材料包括但不限于硫酸盐、碳酸盐和硅酸盐的各种盐以及滑石、粘土等。用于液体组合物的合适的填料或运载体材料包括但不限于水或低分子量伯醇和仲醇(包括多元醇和二元醇)。这样的醇的实例包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。在一些实施例中，这些组合物含有约5％至约90％的这样的材料。
在一个方面，该液体配制品包含20％-80％w/w的多元醇。在一个实施例中，该液体配制品包含0.001％-2％w/w防腐剂。
在另一个实施例中，本发明涉及液体配制品，其包含：
(A)0.001％-25％w/w的本发明的变体；
(B)20％-80％w/w的多元醇；
(C)任选地0.001％-2％w/w防腐剂；以及
(D)水。
在另一个实施例中，本发明涉及液体配制品，其包含：
(A)0.001％-25％w/w的本发明的变体；
(B)0.001％-2％w/w防腐剂；
(C)任选地20％-80％w/w的多元醇；以及
(D)水。
在另一个实施例中，液体配制品包含一种或多种配制剂，例如选自由以下组成的组的配制剂：多元醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、淀粉、PVA、乙酸盐和磷酸盐，优选地选自由以下组成的组：硫酸钠、糊精、纤维素、硫代硫酸钠、高岭土和碳酸钙。在一个实施例中，多元醇选自由以下组成的组：甘油、山梨醇、丙二醇(MPG)、乙二醇、二甘醇、三甘醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、二丙二醇、平均分子量低于约600的聚乙二醇(PEG)和平均分子量低于约600的聚丙二醇(PPG)，更优选地选自由以下组成的组：甘油、山梨醇和丙二醇(MPG)或其任何组合。
在另一个实施例中，液体配制品包含20％-80％多元醇(即多元醇的总量)，例如25％-75％多元醇、30％-70％多元醇、35％-65％多元醇或40％-60％多元醇。在一个实施例中，液体配制品包含20％-80％多元醇，例如25％-75％多元醇、30％-70％多元醇、35％-65％多元醇或40％-60％多元醇，其中该多元醇选自由以下组成的组：甘油、山梨醇、丙二醇(MPG)、乙二醇、二甘醇、三甘醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、二丙二醇、平均分子量低于约600的聚乙二醇(PEG)和平均分子量低于约600的聚丙二醇(PPG)。在一个实施例中，液体配制品包含20％-80％多元醇(即多元醇的总量)，例如25％-75％多元醇、30％-70％多元醇、35％-65％多元醇或40％-60％多元醇，其中该多元醇选自由以下组成的组：甘油、山梨醇和丙二醇(MPG)。
在另一个实施例中，防腐剂选自由以下组成的组：山梨酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钠和苯甲酸钾或其任何组合。在一个实施例中，液体配制品包含0.02％-1.5％w/w防腐剂，例如0.05％-1％w/w防腐剂或0.1％-0.5％w/w防腐剂。在一个实施例中，液体配制品包含0.001％-2％w/w防腐剂(即防腐剂的总量)，例如0.02％-1.5％w/w防腐剂、0.05％-1％w/w防腐剂或0.1％-0.5％w/w防腐剂，其中该防腐剂选自由以下组成的组：山梨酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钠和苯甲酸钾或其任何组合。
在另一个实施例中，液体配制品进一步包含一种或多种另外的酶，例如，水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶和转移酶。一种或多种另外的酶优选地选自由以下组成的组：乙酰木聚糖酯酶、酰基甘油脂肪酶、淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、阿魏酸酯酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、溶血磷脂酶、溶菌酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶(甘露聚糖酶)、植酸酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶D、蛋白酶、普鲁兰酶、果胶酯酶、三酰基甘油脂肪酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶或其任何组合。
组合物
本发明还涉及包含本发明的脂肪酶变体、本发明的颗粒或本发明的液体组合物的组合物。
与包含亲本脂肪酶(特别地分别为SEQ ID NO:2、4、6、8)的相同组合物相比，本发明的组合物具有减少的气味产生和/或增加的效益风险因子(BRF)。
在优选的实施例中，该组合物包含一种或多种表面活性剂。
下文阐述的组合物组分的非限制性列表适用于在组合物中使用，并且本文的方法可以理想地掺入本发明的某些实施例中，例如用以辅助或增强清洁性能，用于处理有待清洁的底物，或用以在与香料、着色剂、染料等一起的情况下修饰组合物的美感。掺入任何组合物中的任何此类组分的水平是除了先前引用的用于掺入的任何材料之外的。这些另外的组分的精确性质及其掺入水平将取决于组合物的物理形式和将在其中使用组合物的清洁操作的性质。尽管根据特定的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技术人员所理解，组分可以包含另外的功能性。
除非另外表明，否则以百分比计的量是按所述组合物的重量计(wt％)。适合的组分材料包括但不限于表面活性剂、助洗剂、螯合试剂、染料转移抑制试剂、分散剂、酶、以及酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸、聚合物分散剂、粘土去除/抗再沉积剂、增亮剂、泡沫抑制剂、染料、调色染料、香料、香料递送系统、结构弹力剂、织物软化剂、载体、水溶助剂、加工助剂、溶剂和/或颜料。除了以下披露内容，此类其他组分的适合的实例以及使用水平发现于US 5576282、US 6306812和US 6326348中，将其通过引用特此结合。
因此，在某些实施例中，本发明不含有以下附属材料的一种或多种：表面活性剂、皂、助洗剂、螯合试剂、染料转移抑制试剂、分散剂、另外的酶、酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸、聚合物分散剂、粘土去除/抗再沉积剂、增亮剂、泡沫抑制剂、染料、香料、香料递送系统、结构弹力剂、织物软化剂、载体、水溶助剂、加工助剂、溶剂和/或颜料。然而，当一种或多种组分存在时，这样的一种或多种组分可以如下文详述的那样存在：
表面活性剂-根据本发明的组合物可以包含表面活性剂或表面活性剂系统，其中该表面活性剂可以选自非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、兼性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂、及其混合物。当存在时，表面活性剂典型地以从0.1至60wt％、从0.2至40wt％、从0.5至30wt％、从1至50wt％、从1至40wt％、从1至30wt％、从1至20wt％、从3至10wt％、从3至5wt％、从5至40wt％、从5至30wt％、从5至15wt％、从3至20wt％、从3至10wt％、从8至12wt％、从10至12wt％、从20至25wt％或从25至60wt％的水平存在。
适合的阴离子去污表面活性剂包括硫酸盐和磺酸盐去污表面活性剂。
适合的磺酸盐去污表面活性剂包括烷基苯磺酸盐，在一个方面为C10-13烷基苯磺酸盐。适合的烷基苯磺酸盐(LAS)可以通过磺化可商购的直链烷基苯(LAB)来获得；适合的LAB包括低2-苯基LAB，例如或其他适合的LAB包括高2-苯基LAB，例如适合的阴离子去污表面活性剂是通过DETAL催化工艺获得的烷基苯磺酸盐，但其他合成路线(例如HF)也可以是适合的。在一个方面，使用LAS的镁盐。
适合的硫酸盐去污表面活性剂包括烷基硫酸盐，在一个方面为C8-18烷基硫酸盐，或主要为C12烷基硫酸盐。
另一种适合的硫酸盐去污表面活性剂是烷基烷氧基化硫酸盐，在一个方面为烷基乙氧基化硫酸盐，在一个方面为C8-18烷基烷氧基化硫酸盐，在另一个方面为C8-18烷基乙氧基化硫酸盐，典型地烷基烷氧基化硫酸盐具有从0.5至20或从0.5至10的平均烷氧基化度，典型地烷基烷氧基化硫酸盐是C8-18烷基乙氧基化硫酸盐，具有从0.5至10、从0.5至7、从0.5至5或从0.5至3的平均乙氧基化度。
烷基硫酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐和烷基苯磺酸盐可以是直链或支链的、取代或未取代的。
去污表面活性剂可以是中链分支的去污表面活性剂，在一个方面为中链分支的阴离子去污表面活性剂，在一个方面为中链分支的烷基硫酸盐和/或中链分支的烷基苯磺酸盐，例如中链分支的烷基硫酸盐。在一个方面，中链分支是C1-4烷基基团，典型地为甲基和/或乙基基团。
阴离子表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，特别是直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(例如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡烃磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括磺酸甲酯(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或皂的二酯和单酯、及其组合。
适合的非离子去污表面活性剂选自由以下组成的组：C8-C18烷基乙氧基化物，例如C6-C12烷基苯酚烷氧基化物，其中这些烷氧基化物单元可以是乙烯氧基单元、丙烯氧基单元或其混合物；C12-C18醇和C6-C12烷基苯酚与环氧乙烷/环氧丙烷嵌段聚合物的缩合物，例如C14-C22中链分支的醇；C14-C22中链分支的烷基烷氧基化物，典型地具有从1至30的平均烷氧基化度；烷基多糖，在一个方面为烷基多糖苷；多羟基脂肪酸酰胺；醚封端的聚(烷氧基化)醇表面活性剂；及其混合物。
适合的非离子去污表面活性剂包括烷基多糖苷和/或烷基烷氧基化醇。
在一个方面，非离子去污表面活性剂包括烷基烷氧基化醇，在一个方面为C8-18烷基烷氧基化醇，例如C8-18烷基乙氧基化醇，该烷基烷氧基化醇可以具有从1至50、从1至30、从1至20、或从1至10的平均烷氧基化度。在一个方面，烷基烷氧基化醇可以是C8-18烷基乙氧基化醇，具有从1至10、从1至7，更多是从1至5或从3至7的平均乙氧基化度。烷基烷氧基化醇可以是直链或支链的、以及取代或未取代的。适合的非离子表面活性剂包括
非离子表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化脂肪醇(PFA)、烷氧基化脂肪酸烷基酯(如乙氧基化和/或丙氧基化脂肪酸烷基酯)、烷基酚乙氧基化物(APE)、壬基酚乙氧基化物(NPE)、烷基多糖苷(APG)、烷氧基化胺、脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)、脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)、丙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)、或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))、以及以SPAN和TWEEN商品名可获得的产品、及其组合。
适合的阳离子去污表面活性剂包括烷基吡啶化合物、烷基季铵化合物、烷基季鏻化合物、烷基三锍化合物及其混合物。
适合的阳离子去污表面活性剂是具有以下通式的季铵化合物：(R)(R1)(R2)(R3)N+X-，其中R是直链或支链的、取代或未取代的C6-18烷基或烯基部分，R1和R2独立地选自甲基或乙基部分，R3是羟基、羟甲基或羟乙基部分，X是提供电荷中性的阴离子，适合的阴离子包括卤化物，例如氯化物；硫酸盐；以及磺酸盐。适合的阳离子去污表面活性剂是单-C6-18烷基单-羟乙基二甲基季铵氯化物。高度适合的阳离子去污表面活性剂是单-C8-10烷基单-羟乙基二甲基季铵氯化物、单C10-12烷基单-羟乙基二甲基季铵氯化物以及单-C10烷基单-羟乙基二甲基季铵氯化物。
阳离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二甲基二硬脂酰氯化铵(DSDMAC)、以及烷基苄基二甲基铵、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(AQA)化合物、酯季铵及其组合。
适合的两性表面活性剂/兼性离子表面活性剂包括氧化胺和甜菜碱(例如烷基二甲基甜菜碱、磺基甜菜碱)、或其组合。胺中和的阴离子表面活性剂-本发明的阴离子表面活性剂以及辅助阴离子助表面活性剂可以按酸形式存在，并且所述酸形式可以被中和以形成希望用于本发明的洗涤剂组合物的表面活性剂盐。典型的用于中和的试剂包括金属反离子碱，例如氢氧化物，例如NaOH或KOH。用于中和本发明的阴离子表面活性剂和处于其酸形式的辅助阴离子表面活性剂或助表面活性剂的另外优选的试剂包括氨、胺或烷醇胺。优选烷醇胺。适合的非限制性实例包括单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、以及其他本领域中已知的直链或支链的烷醇胺；例如，高度优选的烷醇胺包括2-氨基-1-丙醇、1-氨基丙醇、单异丙醇胺、或1-氨基-3-丙醇。胺中和可以进行到完全或部分的程度，例如，阴离子表面活性剂混合物的部分可以被钠或钾中和，并且阴离子表面活性剂混合物的部分可以被胺或烷醇胺中和。
半极性表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)，例如烷基二甲胺氧化物
包含一种或多种阴离子表面活性剂、和另外一种或多种非离子表面活性剂、以及任选的例如阳离子表面活性剂的另外表面活性剂的混合物的表面活性剂系统可能是优选的。优选的阴离子与非离子表面活性剂的重量比是至少2:1、或至少1:1至1:10。
在一个方面，表面活性剂系统可包括由式A以及式B代表的类异戊二烯表面活性剂的混合物：
其中Y是CH2或无，并且Z可以如此选择以使得所得表面活性剂是选自以下的表面活性剂：烷基羧酸酯表面活性剂、烷基多烷氧基表面活性剂、烷基阴离子多烷氧基硫酸酯表面活性剂、烷基甘油酯磺酸酯表面活性剂、烷基二甲基氧化胺表面活性剂、基于烷基多羟基的表面活性剂、烷基磷酸酯表面活性剂、烷基甘油磺酸酯表面活性剂、烷基多葡糖酸酯表面活性剂、烷基多磷酸酯表面活性剂、烷基膦酸酯表面活性剂、烷基多糖苷表面活性剂、烷基单糖苷表面活性剂、烷基二糖苷表面活性剂、烷基磺基琥珀酸酯表面活性剂、烷基二硫酸酯表面活性剂、烷基二磺酸酯表面活性剂、烷基磺化琥珀酰胺酸酯表面活性剂、烷基葡萄糖酰胺表面活性剂、烷基牛磺酸酯表面活性剂、烷基肌氨酸酯表面活性剂、烷基甘氨酸酯表面活性剂、烷基羟乙基磺酸酯表面活性剂、烷基二链烷醇酰胺表面活性剂、烷基单链烷醇酰胺表面活性剂、烷基单链烷醇酰胺硫酸酯表面活性剂、烷基二羟基乙酰胺表面活性剂、烷基二羟基乙酰胺硫酸酯表面活性剂、烷基甘油酯表面活性剂、烷基甘油酯硫酸酯表面活性剂、烷基甘油醚表面活性剂、烷基甘油醚硫酸酯表面活性剂、烷基甲基酯磺酸酯表面活性剂、烷基多甘油醚表面活性剂、烷基多甘油醚硫酸酯表面活性剂、烷基山梨聚糖酯表面活性剂、烷基氨基烷烃磺酸酯表面活性剂、烷基酰胺丙基甜菜碱表面活性剂、基于烷基烯丙基化季铵盐的表面活性剂、基于烷基单羟基烷基-二-烷基化季铵盐的表面活性剂、基于烷基二-羟基烷基单烷基季铵盐的表面活性剂、烷基化季铵盐表面活性剂、烷基三甲基铵季铵盐表面活性剂、基于烷基多羟基烷基氧基丙基季铵盐的表面活性剂、烷基甘油酯季铵盐表面活性剂、烷基乙二醇胺季铵盐表面活性剂、烷基单甲基二羟基乙基季铵表面活性剂、烷基二甲基单羟基乙基季铵表面活性剂、烷基三甲基铵表面活性剂、基于烷基咪唑啉的表面活性剂、烯烃-2-基-琥珀酸酯表面活性剂、烷基a-磺化羧酸表面活性剂、烷基a-磺化羧酸烷基酯表面活性剂、α烯烃磺酸酯表面活性剂、烷基苯酚乙氧基化物表面活性剂、烷基苯磺酸酯表面活性剂、烷基磺基甜菜碱表面活性剂、烷基羟基磺基甜菜碱表面活性剂、烷基铵基羧酸甜菜碱表面活性剂、烷基蔗糖酯表面活性剂、烷基烷醇酰胺表面活性剂、烷基二(聚氧化乙烯)单烷基铵表面活性剂、烷基单(聚氧化乙烯)二烷基铵表面活性剂、烷基苄基二甲基铵表面活性剂、烷基氨基丙酸酯表面活性剂、烷基酰胺丙基二甲胺表面活性剂、或其混合物；并且如果Z是带电部分，则Z被适合的金属或有机抗衡离子电荷平衡。适合的反离子包括金属反离子、胺、或烷醇胺，例如C1-C6烷醇铵。更确切地说，适合的反离子包括Na+、Ca+、Li+、K+、Mg+，例如单乙醇胺(MEA)、二乙醇胺(DEA)、三乙醇胺(TEA)、2-氨基-l-丙醇、1-氨基丙醇、甲基二乙醇胺、二甲基乙醇胺、单异丙醇胺、三异丙醇胺、l-氨基-3-丙醇、或其混合物。在一个实施例中，组合物含有从5％至97％的一种或多种非类异戊二烯表面活性剂；以及一种或多种辅助清洁添加剂；其中具有式A的表面活性剂与具有式B的表面活性剂的重量比是50:50至95:5。
皂-本文的组合物可以含有皂。不受理论的限制，可令人希望的是包括皂，因为它部分充当表面活性剂并且部分充当助洗剂，并且可用于抑制泡沫，并且此外，可以有利地与组合物的多种阳离子化合物相互作用以增强用本发明组合物处理的纺织品织物的柔软性。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何皂。在一个实施例中，组合物含有从0wt％至20wt％、从0.5wt％至20wt％、从4wt％至10wt％、或从4wt％至7wt％的皂。
本文有用的皂的实例包括油酸皂、棕榈酸皂、棕榈仁脂肪酸皂及其混合物。典型的皂处于具有不同链长和取代度的脂肪酸皂混合物的形式。一种这样的混合物是拔顶棕榈仁脂肪酸。
在一个实施例中，皂选自游离脂肪酸。适合的脂肪酸是饱和的和/或不饱和的并且可以从天然来源如植物或动物酯(例如，棕榈仁油、棕榈油、椰子油、巴巴苏油、红花油、妥尔油、蓖麻油、牛油和鱼油、油脂、及其混合物)中获得，或合成地制备(例如，经由石油的氧化或者经由费托法(Fisher Tropsch process)氢化一氧化碳)。
用于在本发明组合物中使用的适合的饱和脂肪酸的实例包括癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸和山萮酸。适合的不饱和脂肪酸种类包括：棕榈油酸、油酸、亚麻油酸、亚麻酸和蓖麻油酸。优选的脂肪酸的实例是饱和Cn脂肪酸、饱和Ci2-Ci4脂肪酸、和饱和或不饱和的Cn至Ci8脂肪酸及其混合物。
当存在时，织物柔软阳离子助表面活性剂与脂肪酸的重量比优选地是从约1:3至约3:1、更优选地从约1:1.5至约1.5:1、最优选地约1:1。
本文的皂和非皂阴离子表面活性剂的水平是以酸式基础指定的按洗涤剂组合物的重量计的百分比。然而，正如本领域中通常理解的，在实践中使用钠、钾或链烷醇铵碱例如氢氧化钠或单乙醇胺中和阴离子表面活性剂和皂。
水溶助剂–本发明的组合物可以包含一种或多种水溶助剂。水溶助剂是如下化合物，该化合物在水溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非极性环境中溶解极性物质)。典型地，水溶助剂具有亲水和疏水两种特征(所谓的两亲特性，如由表面活性剂已知的)；然而，水溶助剂的分子结构一般不利于自发性自聚集，参见例如通过Hodgdon和Kaler(2007),Current Opinion in Colloid&Interface Science[胶体和界面科学新见]12:121-128的综述。水溶助剂并不显示临界浓度，高于该浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集以及脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相。相反，许多水溶助剂显示连续类型的聚集过程，在该过程中聚集物的大小随着浓度增加而增长。然而，许多水溶助剂改变了含有极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相行为、稳定性、和胶体特性。水溶助剂常规地在从药学、个人护理、食品到技术应用的各个产业中应用。水溶助剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过去除水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，例如相分离或高粘度。
洗涤剂可以含有从0至10wt％，例如从0至5wt％、0.5至5wt％、或从3％至5wt％的水溶助剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何水溶助剂。水溶助剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠及其组合。
助洗剂-本发明的组合物可以包含一种或多种助洗剂、共助洗剂、助洗剂系统或其混合物。当使用助洗剂时，清洁组合物将典型地包含从0至65wt％、至少1wt％、从2至60wt％或从5至10wt％的助洗剂。在餐具洗涤清洁组合物中，助洗剂的水平典型地是40至65wt％或50至65wt％。组合物可以基本上不含助洗剂；基本上不含意指“没有有意添加的”沸石和/或磷酸盐。典型的沸石助洗剂包括沸石A、沸石P和沸石MAP。典型的磷酸盐助洗剂是三聚磷酸钠。
助洗剂和/或共助洗剂可以特别是与Ca和Mg形成水溶性络合物的螯合试剂。可以使用本领域中已知用于在洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐例如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例如偏硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺(例如2-氨基乙-1-醇(MEA)、亚氨基二乙醇(DEA)和2,2’,2”-次氮基三乙醇(TEA))、以及羧甲基菊粉(CMI)、及其组合。
清洁组合物可以单独地包括共助洗剂，或与助洗剂(例如沸石助洗剂)组合。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，例如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐、螯合剂(例如氨基羧酸盐、氨基聚羧酸盐、和膦酸盐)、以及烷基琥珀酸、或烯基琥珀酸。另外的特定实例包括2,2',2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨二琥珀酸(IDS)、乙二胺-N,N'-二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟基乙烷-1,1-二基双(膦酸)(HEDP)、乙二胺四(亚甲基)四(膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基)五(膦酸)(DTPMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨二琥珀酸(IDA)、N-(2-磺甲基)天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、对氨基苯磺酸-N、N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)和磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(羟乙基)-亚乙基二胺三乙酸(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)、及其组合和盐。另外的示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO 09/102854、US 5977053中。
螯合试剂和晶体生长抑制剂-本文的组合物可以含有螯合试剂和/或晶体生长抑制剂。适合的分子包括铜、离子和/或锰螯合试剂及其混合物。适合的分子包括DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)、HEDP(羟基乙烷二膦酸)、DTPMP(二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸))、1,2-二羟基苯-3,5-二磺酸二钠盐水合物、乙二胺、二亚乙基三胺、乙二胺二琥珀酸(EDDS)、N-羟基乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、N-羟基乙基亚氨基二乙酸(HEIDA)、二羟基乙基甘氨酸(DHEG)、亚乙基二胺四丙酸(EDTP)、羧甲基菊粉以及2-膦酰基丁烷1,2,4-三羧酸(AM)及其衍生物。典型地，组合物可以包含从0.005至15wt％或从3.0至10wt％的螯合试剂或晶体生长抑制剂。
漂白组分-适合用于掺入本发明的方法和组合物中的漂白组分包括多于一种漂白组分中的一种或混合物。适合的漂白组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸及其混合物。通常，当使用漂白组分时，本发明的组合物可以包含从0至30wt％、从0.00001至90wt％、0.0001至50wt％、从0.001至25wt％或从1至20wt％。适合的漂白组分的实例包括：
(1)预形成的过酸：适合的预形成的过酸包括但不限于选自由以下组成的组的化合物：预形成的过氧酸或其盐，典型地是过氧羧酸或其盐、或过氧硫酸或其盐。
预形成的过氧酸或其盐优选是过氧羧酸或其盐，典型地具有对应于以下化学式的化学结构：
其中：R14选自烷基、芳烷基、环烷基、芳基或杂环基团；R14基团可以是直链或支链的、取代或未取代的；并且Y是实现电荷中性的任何适合的反离子，优选地，Y选自氢、钠或钾。优选地，R14是直链或支链的、取代或未取代的C6-9烷基。优选地，过氧酸或其盐选自过氧己酸、过氧庚酸、过氧辛酸、过氧壬酸、过氧癸酸、及其盐，或其任何组合。特别优选的过氧酸是邻苯二甲酰亚胺基-过氧基-链烷酸，特别是ε-邻苯二甲酰亚胺基过氧基己酸(PAP)。优选地，过氧酸或其盐具有从30℃至60℃范围内的熔点。
预形成的过氧酸或其盐还可以是过氧硫酸或其盐，典型地具有对应于以下化学式的化学结构：
其中：R15选自烷基、芳烷基、环烷基、芳基或杂环基团；R15基团可以是直链或支链的、取代或未取代的；并且Z是达到电荷中性的任何适合的反离子，优选地，Z选自氢、钠或钾。优选地，R15是直链或支链的、取代或未取代的C6-9烷基。优选地，此类漂白组分可以按从0.01至50wt％或从0.1至20wt％的量存在于本发明的组合物中。
(2)过氧化氢源包括例如无机过氧化氢合物盐，包括碱金属盐，如过硼酸盐(通常是一水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐的钠盐及其混合物。在本发明的一个方面，无机过氧化氢合物盐是例如选自由以下组成的组的那些：过硼酸盐、过碳酸盐的钠盐及其混合物。当使用时，无机过氧化氢合物盐典型地以整体组合物的0.05至40wt％或1至30wt％的量存在并且典型地被掺入此类组合物中作为可以被包衣的结晶固体。适合的包衣包括：无机盐，例如碱金属硅酸盐、碳酸盐或硼酸盐或其混合物，或有机材料，如水溶性或水分散性聚合物、蜡、油或脂肪皂。优选地，此类漂白组分可以按0.01至50wt％或0.1至20wt％的量存在于本发明的组合物中。
(3)术语漂白活化剂本文意指与过氧化氢反应以经由过水解反应形成过酸的化合物。由此形成的过酸构成活化的漂白剂。本文有待使用的适合的漂白活化剂包括属于酯、酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些。适合的漂白活化剂是具有R-(C＝O)-L的那些，其中R是烷基基团(任选地是支链的)，当该漂白活化剂是疏水时，具有从6个至14个碳原子，或从8个至12个碳原子，并且当漂白活化剂是亲水时，具有小于6个碳原子或小于4个碳原子；并且L为离去基团。适合的离去基团的实例是苯甲酸及其衍生物-尤其是苯磺酸盐。适合的漂白活化剂包括十二酰氧基苯磺酸盐、癸酰氧基苯磺酸盐、癸酰氧基苯甲酸或其盐、3,5,5-三甲基己酰氧基苯磺酸盐、四乙酰基乙二胺(TAED)、4-[(3,5,5-三甲基己酰基)氧基]苯-1-磺酸钠(ISONOBS)、4-(十二酰基氧基)苯-1-磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯-1-磺酸盐、4-(癸酰基氧基)苯甲酸盐(DOBS或DOBA)、4-(壬酰基氧基)苯-1-磺酸盐(NOBS))、和/或披露于WO98/17767中的那些。漂白活化剂的家族披露于EP 624154中并且在那个家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酯(像三醋汀)具有以下优点，它是环境友好的。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三醋汀在储存时在产品中具有良好的水解稳定性，并且是有效的漂白活化剂。最后，ATC是多功能的，因为在过水解反应中释放的柠檬酸盐可以作为助洗剂起作用。可替代地，漂白系统可以包含例如酰胺、酰亚胺或砜类型的过氧酸。漂白系统还可以包含过酸，例如6-(苯二甲酰亚氨基)过己酸(PAP)。适合的漂白活化剂还披露于WO98/17767中。尽管可采用任何适合的漂白活化剂，但在本发明的一个方面，本主题清洁组合物可以包含NOBS、TAED或其混合物。当存在时，基于织物及家居护理组合物，过酸和/或漂白活化剂通常以0.1至60wt％、0.5至40wt％或0.6至10wt％的量存在于组合物中。可以将一种或多种疏水过酸或其前体与一种或多种亲水过酸或其前体组合使用。优选地，此类漂白组分可以按0.01至50wt％或0.1至20wt％的量存在于本发明的组合物中。
可以对过氧化氢源和过酸或漂白活化剂的量进行选择，以使得可用氧(来自过氧化物源)与过酸的摩尔比是从1:1至35:1，或甚至2:1至10:1。
(4)二酰基过氧化物–优选的二酰基过氧化物漂白种类包括选自具有以下通式的二酰基过氧化物的那些：R1-C(O)-OO-(O)C-R2，其中R1表示C6-C18烷基，优选地是包含具有至少5个碳原子的直链并且任选地包含一个或多个取代基(例如–N+(CH3)3、-COOH或-CN)和/或在烷基的相邻碳原子之间插入的一个或多个中断部分(例如-CONH-或-CH＝CH-)的C6-C12烷基基团，并且R2表示与过氧化物部分可相容的脂肪族基团，以使得R1和R2一起包含总共8个至30个碳原子。在一个优选的方面，R1和R2是直链的未取代的C6-C12烷基链。最优选地，R1和R2是相同的。二酰基过氧化物(其中R1和R2均是C6-C12烷基基团)是特别优选的。优选地，R基团(R1或R2)中的至少一个、最优选地仅有一个在α位不含有分支环或侧基环，或优选在α位或β位都不含有分支环或侧基环，或最优选在α位或β位或γ位都不含有分支环或侧基环。在一个另外优选的实施例中，DAP可以是不对称的，这样使得R1酰基基团优选地迅速水解以产生过酸，但是R2酰基基团的水解缓慢。
四酰基过氧化物漂白种类优选地选自以下通式的四酰基过氧化物：R3-C(O)-OO-C(O)-(CH2)n-C(O)-OO-C(O)-R3，其中R3表示C1-C9烷基或C3-C7基团，并且n表示从2至12或4至10(包括端值)的整数。
优选地，二酰基和/或四酰基过氧化物漂白种类以足够提供按重量计至少0.5ppm、至少10ppm、或至少50ppm的洗涤液的量存在。在一个优选的实施例中，漂白种类以足够提供按重量计从0.5ppm至300ppm、从30ppm至150ppm的洗涤液的量存在。
优选地，漂白组分包括漂白催化剂(5和6)。
(5)优选的是有机(非金属)漂白催化剂，包括能够接受来自过氧酸和/或其盐的氧原子并且将氧原子转移至可氧化的底物的漂白催化剂。适合的漂白催化剂包括但不限于：亚胺阳离子和聚离子；亚胺兼性离子；修饰的胺；修饰的氧化胺；N-磺酰基亚胺；N-磷酰基亚胺；N-酰基亚胺；噻二唑二氧化物；全氟亚胺；环状糖酮及其混合物。
适合的亚胺阳离子和聚离子包括但不限于，N-甲基-3,4-二氢异喹啉鎓四氟硼酸盐，如Tetrahedron[四面体](1992),49(2),423-38中所述的进行制备(例如化合物4，第433页)；N-甲基-3,4-二氢异喹啉鎓对甲苯磺酸盐，如US 5360569中所述的进行制备(例如第11栏，实例1)；以及N-辛基-3,4-二氢异喹啉鎓对-甲苯磺酸盐，如US 5360568所述的进行制备(例如第10栏，实例3)。
适合的亚胺兼性离子包括但不限于，N-(3-磺丙基)-3,4-二氢异喹啉鎓，内盐，如US 5576282中所述的进行制备(例如第31栏，实例II)；N-[2-(磺氧基)十二烷基]-3,4-二氢异喹啉鎓，内盐，如US 5817614中所述的进行制备(例如，第32栏，实例V)；2-[3-[(2-乙基己基)氧基]-2-(磺氧基)丙基]-3,4-二氢异喹啉鎓，内盐，如WO 05/047264中所述进行制备(例如，第18页实例8)，以及2-[3-[(2-丁基辛基)氧基]-2-(磺氧基)丙基]-3,4-二氢异喹啉鎓，内盐。
适合的修饰的胺氧转移催化剂包括但不限于1,2,3,4-四氢-2-甲基-1-异喹啉醇，其可根据Tetrahedron Letters[四面体通讯](1987),28(48),6061-6064中描述的程序制备。适合的修饰的氧化胺氧转移催化剂包括但不限于1-羟基-N-氧基-N-[2-(磺氧基)癸基]-1,2,3,4-四氢异喹啉钠。
适合的N-磺酰基亚胺氧转移催化剂包括但不限于3-甲基-1,2-苯并异噻唑1,1-二氧化物，其可根据Journal of Organic Chemistry[有机化学杂志](1990),55(4),1254-61中描述的程序制备。
适合的N-膦酰基亚胺氧转移催化剂包括但不限于[R-(E)]-N-[(2-氯-5-硝基苯基)亚甲基]-对苯基-对-(2,4,6-三甲基苯基)次膦酸酰胺，其可根据Journal of theChemical Society[化学学会杂志],Chemical Communications[化学通讯](1994),(22),2569-70中描述的程序制备。
适合的N-酰基亚胺氧转移催化剂包括但不限于可以[N(E)]-N-(苯基亚甲基)乙酰胺，其可根据Polish Journal of Chemistry[波兰化学杂志](2003),77(5),577-590中描述的程序制备。
适合的噻二唑二氧化物氧转移催化剂包括但不限于3-甲基-4-苯基-1,2,5-噻二唑1,1-二氧化物，其可根据US 5753599(第9栏，实例2)中描述的程序制备。
适合的全氟亚胺氧转移催化剂包括但不限于(Z)-2,2,3,3,4,4,4-七氟-N-(壬氟丁基)丁酰亚胺氟化物，其可根据Tetrahedron Letters[四面体通讯](1994),35(34),6329-30中描述的程序制备。
适合的环状糖酮氧转移催化剂包括但不限于如在US 6649085(第12栏，实例1)中制备的1,2:4,5-二-O-异亚丙基-D-赤-2,3-己二酮(hexodiuro)-2,6-吡喃糖。
优选地，漂白催化剂包含亚胺离子和/或羰基官能团，并且典型地能够在接受氧原子，尤其是从过氧酸和/或其盐接受氧原子后形成过氧亚胺正离子(oxaziridinium)和/或双环氧乙烷官能团。优选地，漂白催化剂包含过氧亚胺正离子官能团和/或在接受氧原子时，尤其是在接受来自过氧酸和/或其盐的氧原子时能够形成过氧亚胺正离子官能团。优选地，漂白催化剂包含环状亚胺离子官能团，优选其中该环状部分具有从五个至八个原子(包括氮原子)、优选六个原子的环大小。优选地，漂白催化剂包含芳基亚胺离子官能团，优选二环芳基亚胺官能团，优选是3,4-二氢异喹啉鎓官能团。典型地，亚胺官能团是季亚胺官能团并且典型地在接受氧原子时，尤其是在接受来自过氧酸和/或其盐的氧原子时能够形成季过氧亚胺正离子官能团。在另一方面，洗涤剂组合物包括具有不大于0、不大于-0.5、不大于-1.0、不大于-1.5、不大于-2.0、不大于-2.5、不大于-3.0、或不大于-3.5的logPo/w的漂白组分。下面更加详细地描述用于确定logPo/w的方法。
典型地，漂白成分能够产生具有从0.01至0.30、从0.05至0.25或从0.10至0.20的XSO的漂白种类。下面更加详细地描述用于确定XSO的方法。例如，具有异喹啉鎓结构的漂白成分能够产生具有过氧亚胺正离子结构的漂白种类。在此实例中，XSO是过氧亚胺正离子漂白种类的XSO。
优选地，漂白催化剂具有对应于以下化学式的化学结构：
其中：n和m独立地为0至4，优选n和m均为0；每个R1独立地选自取代或未取代的基团，该基团选自由以下组成的组：氢、烷基、环烷基、芳基、稠合芳基、杂环、稠合杂环、硝基、卤基、氰基、磺酸根、烷氧基、酮基、羧基以及烷氧羰基基团；并且任何两个连位的R1取代基可以合并以形成稠合芳基、稠合碳环或稠合杂环；每个R2独立地选自取代或未取代的基团，该基团独立地选自由以下组成的组：氢、羟基、烷基、环烷基、烷芳基、芳基、芳烷基、亚烷基、杂环、烷氧基、芳基羰基、羧基烷基以及酰胺基团；任何R2可以与任何其他的R2结合在一起以形成常见环的一部分；任何偕R2可以合并以形成羰基；并且任何两个R2可以合并以形成取代或未取代的稠合的不饱和部分；R3是C1至C20取代或未取代的烷基；R4为氢或Qt-A部分，其中：Q是分支或未分支的亚烷基，t＝0或1，并且A是选自由以下组成的组的阴离子基团：OSO3 -、SO3 -、CO2 -、OCO2 -、OPO3 2-、OPO3H-和OPO2 -；R5是氢或部分-CR11R12-Y-Gb-Yc-[(CR9R10)y-O]k-R8，其中：每个Y独立地选自由以下组成的组：O、S、N-H或N-R8；并且每个R8独立地选自由以下组成的组：烷基、芳基和杂芳基，所述部分是取代或未取代的，并且无论是取代还是未取代的，所述部分具有少于21个碳；每个G独立地选自由以下组成的组：CO、SO2、SO、PO和PO2；R9和R10独立地选自由以下组成的组：H和C1-C4烷基；R11和R12独立地选自由以下组成的组：H和烷基，或者当放一起时可以结合形成羰基；b＝0或1；c可以＝0或1，但是如果b＝0，c必须＝0；y是从1至6的整数；k是从0至20的整数；R6是H，或是烷基、芳基或杂芳基部分；所述部分是取代或未取代的；并且如果X存在的话，它是适合的电荷平衡反离子，当R4为氢时X优选存在，适合的X包括但不限于：氯化物、溴化物、硫酸盐、甲硫酸盐、磺酸盐、对甲苯磺酸盐、四氟化硼以及磷酸盐。
在本发明的一个实施例中，漂白催化剂具有对应于以下通式的结构：
其中R13是含有从三个至24个碳原子(包括分支的碳原子)的支链烷基基团或含有从一个至24个碳原子的直链烷基基团；优选地，R13是含有从八个至18个碳原子的支链烷基基团或含有从八个至十八个碳原子的直链烷基基团；优选地，R13选自由以下组成的组：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基、正十八烷基、异壬基、异癸基、异十三烷基和异十五烷基；优选地，R13选自由以下组成的组：2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、异-十三烷基和异-十五烷基。
优选地，除了漂白催化剂，特别是有机漂白催化剂以外，漂白组分还包含过酸源。过酸源可以选自(a)预形成的过酸；(b)过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐(过氧化氢源)，优选与漂白活化剂组合；和(c)过水解酶以及酯，用于在纺织品或硬表面处理步骤中在水的存在下原位形成过酸。
当存在时，基于组合物，过酸和/或漂白活化剂通常以从0.1至60wt％、从0.5至40wt％或从0.6至10wt％的量存在于组合物中。可以将一种或多种疏水过酸或其前体与一种或多种亲水过酸或其前体组合使用。
可以对过氧化氢源和过酸或漂白活化剂的量进行选择，以使得可用氧(来自过氧化物源)与过酸的摩尔比是从1:1至35:1、或2:1至10:1。
(6)含有金属的漂白催化剂–可以由催化金属络合物提供漂白组分。一种类型的含有金属的漂白催化剂是以下催化系统，该催化系统包含具有限定的漂白催化活性的过渡金属阳离子(例如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子)，具有很少或不具有漂白催化活性的辅助性金属阳离子(例如锌或铝阳离子)，以及对于催化性和辅助性金属阳离子具有限定的稳定性常数的隔离物，特别是乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)及其水溶性盐。此类催化剂披露于US 4430243中。优选的催化剂描述于WO 09/839406、US 6218351和WO 00/012667中。特别优选的是过渡金属催化剂或因此作为交联桥多齿N-供体配体的配体。
如果希望的话，可以借助锰化合物催化本文的组合物。此类化合物以及使用水平在本领域中是熟知的并且包括例如披露于US 5576282中的基于锰的催化剂。
本文有用的钴漂白催化剂是已知的并且例如描述于US 5597936；US 5595967中。通过已知的程序可容易地制备这样的钴催化剂，如像US 5597936和US 5595967中传授的程序。
本文的组合物还可以适合地包括配体的过渡金属络合物，例如双哌啶酮(bispidone)(US 7501389)和/或大多环刚性配体-缩写为“MRL”。作为一个实际问题而并不作为限制之用，可以调节本文的组合物和方法，以在水性洗涤介质中提供大约至少一亿分之一的活性MRL种类，并且将典型地在洗涤液中提供从0.005ppm至25ppm、从0.05ppm至10ppm、或从0.1ppm至5ppm的MRL。
本发明的过渡金属漂白催化剂中的适合的过渡金属包括例如锰、铁和铬。适合的MRL包括5,12-二乙基-1,5,8,12-四氮杂双环[6.6.2]十六烷。通过已知的程序可容易地制备适合的过渡金属MRL，例如像US 6225464和WO 00/32601中传授的程序。
(7)光漂白剂-适合的光漂白剂包括例如磺化的酞菁锌、磺化的酞菁铝、呫吨染料及其混合物。用于在本发明的组合物中使用的优选漂白组分包含过氧化氢源、漂白活化剂和/或有机过氧酸，任选地通过过氧化氢源和漂白活化剂与漂白催化剂相组合的反应而原位产生。优选的漂白组分包含漂白催化剂，优选如上文所述的有机漂白催化剂。
特别优选的漂白组分是漂白催化剂，特别是有机漂白催化剂。
示例性漂白系统还描述于例如WO 2007/087258、WO 2007/087244、WO 2007/087259以及WO 2007/087242中。
织物调色剂-组合物可以包含织物调色剂。适合的织物调色剂包括染料、染料-粘土共轭物、以及颜料。适合的染料包括小分子染料和聚合物染料。适合的小分子染料包括选自由属于以下比色指数(C.I.)分类的染料组成的组的小分子染料：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红或其混合物。
在另一方面，适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由以下各项组成：比色指数(染工和着色师学会(Society of Dyers and Colorists)，布拉德福德，英国)编号直接紫9、直接紫35、直接紫48、直接紫51、直接紫66、直接紫99、直接蓝1、直接蓝71、直接蓝80、直接蓝279、酸性红17、酸性红73、酸性红88、酸性红150、酸性紫15、酸性紫17、酸性紫24、酸性紫43、酸性红52、酸性紫49、酸性紫50、酸性蓝15、酸性蓝17、酸性蓝25、酸性蓝29、酸性蓝40、酸性蓝45、酸性蓝75、酸性蓝80、酸性蓝83、酸性蓝90和酸性蓝113、酸性黑1、碱性紫1、碱性紫3、碱性紫4、碱性紫10、碱性紫35、碱性蓝3、碱性蓝16、碱性蓝22、碱性蓝47、碱性蓝66、碱性蓝75、碱性蓝159及其混合物。在另一方面，适合的小分子染料包括选自由以下组成的组的小分子染料：比色指数(染工和着色师学会，布拉德福德，英国)编号酸性紫17、酸性紫43、酸性红52、酸性红73、酸性红88、酸性红150、酸性蓝25、酸性蓝29、酸性蓝45、酸性蓝113、酸性黑1、直接蓝1、直接蓝71、直接紫51及其混合物。在另一方面，适合的小分子染料包括选自由以下组成的组的小分子染料：比色指数(染工和着色师学会，布拉德福德，英国)编号酸性紫17、直接蓝71、直接紫51、直接蓝1、酸性红88、酸性红150、酸性蓝29、酸性蓝113或其混合物。
适合的聚合物染料包括选自由以下组成的组的聚合物染料：含有共轭色原体的聚合物(染料-聚合物共轭物)以及色原体共聚到聚合物主链中的聚合物，及其混合物。
在另一方面，适合的聚合物染料包括选自由以下组成的组的聚合物染料：在(美利肯(Milliken))名称之下出售的织物实质性着色剂，从至少一种反应性染料和选自由以下组成的组的聚合物形成的染料-聚合物共轭物：包含选自由羟基部分、一级胺部分、二级胺部分、硫醇部分及其混合物组成的组的部分的聚合物。在仍另一方面，适合的聚合物染料包括选自由以下组成的组的聚合物染料：紫色CT，与活性蓝、活性紫或活性红染料共轭的羧甲基纤维素(CMC)(如与C.I.活性蓝19(由爱尔兰威克洛的麦格酶公司(Megazyme)在产品名AZO-CM-CELLULOSE生产代码S-ACMC下售卖)共轭的CMC)，烷氧基化的三苯基-甲烷聚合物着色剂，烷氧基化的噻吩聚合物着色剂，及其混合物。
优选的调色染料包括发现于WO 08/87497中的增白剂。这些增白剂可以由以下结构(I)表征：
其中R1和R2可以独立地选自：
a)[(CH2CR'HO)x(CH2CR"HO)yH]
其中R’选自由以下组成的组：H、CH3、CH2O(CH2CH2O)zH、及其混合物；其中R”选自由以下组成的组：H、CH2O(CH2CH2O)zH、及其混合物；其中x+y≤5；其中y≥1；并且其中z＝0至5；
b)R1＝烷基、芳基或芳基烷基，并且R2＝[(CH2CR'HO)x(CH2CR"HO)yH]
其中R’选自由以下组成的组：H、CH3、CH2O(CH2CH2O)zH、及其混合物；其中R”选自由以下组成的组：H、CH2O(CH2CH2O)zH、及其混合物；其中x+y≤10；其中y≥1；并且其中z＝0至5；
c)R1＝[CH2CH2(OR3)CH2OR4]并且R2＝[CH2CH2(O R3)CH2O R4]
其中R3选自由以下组成的组：H、(CH2CH2O)zH及其混合物；并且其中z＝0至10；
其中R4选自由以下组成的组：(C1-C16)烷基、芳基基团、及其混合物；并且
d)其中R1和R2可以独立地选自氧化苯乙烯、缩水甘油甲醚、异丁基缩水甘油醚、异丙基缩水甘油醚、叔丁基缩水甘油醚、2-乙基己基缩水甘油醚、以及缩水甘油十六烷基醚的氨基加成产物，随后为从1至10个环氧烷单位的加成。
本发明的优选增白剂可以由以下结构(II)表征：
其中R’选自由以下组成的组：H、CH3、CH2O(CH2CH2O)zH、及其混合物；其中R”选自由以下组成的组：H、CH2O(CH2CH2O)zH、及其混合物；其中x+y≤5；其中y≥1；并且其中z＝0至5。
本发明的另外优选的增白剂可以由以下结构(III)表征：
典型地包含具有一共5个EO基团的混合物。适合的优选分子是在结构I中的具有在上文中“部分a”中的以下侧基的那些。
表1
R1 R2
R’ R” X y R’ R” x y
A H H 3 1 H H 0 1
B H H 2 1 H H 1 1
c＝b H H 1 1 H H 2 1
d＝a H H 0 1 H H 3 1
使用的另外的增白剂包括描述于US2008/34511(联合利华(Unilever))中的那些。优选的试剂是“紫色13”。
适合的染料粘土共轭物包括选自下组的染料粘土共轭物，该组包含至少一种阳离子/碱性染料和绿土及其混合物。在另一方面，适合的染料粘土共轭物包括选自由一种阳离子/碱性染料和粘土组成的组的染料粘土共轭物，该阳离子/碱性染料选自由以下组成的组：C.I.碱性黄1至108、C.I.碱性橙1至69、C.I.碱性红1至118、C.I.碱性紫1至51、C.I.碱性蓝1至164、C.I.碱性绿1至14、C.I.碱性棕色1至23、CI碱性黑1至11，并且该粘土选自由以下组成的组：蒙脱石粘土、水辉石粘土、皂石粘土及其混合物。在仍另一方面，适合的染料粘土共轭物包括选自由以下组成的组的染料粘土共轭物：蒙脱石碱性蓝B7 C.I.42595共轭物，蒙脱石碱性蓝B9 C.I.52015共轭物，蒙脱石碱性紫V3 C.I.42555共轭物，蒙脱石碱性绿G1C.I.42040共轭物，蒙脱石碱性红R1 C.I.45160共轭物，蒙脱石C.I.碱性黑2共轭物，锂蒙脱石碱性蓝B7C.I.42595共轭物，锂蒙脱石碱性蓝B9 C.I.52015共轭物，锂蒙脱石碱性紫V3C.I.42555共轭物，锂蒙脱石碱性绿G1 C.I.42040共轭物，锂蒙脱石碱性红R1 C.I.45160共轭物，锂蒙脱石C.I.碱性黑2共轭物，皂石碱性蓝B7C.I.42595共轭物，皂石碱性蓝B9C.I.52015共轭物，皂石碱性紫V3 C.I.42555共轭物，皂石碱性绿G1 C.I.42040共轭物，皂石碱性红R1 C.I.45160共轭物，皂石C.I.碱性黑2共轭物及其混合物。
适合的颜料包括选自由以下组成的组的颜料：黄士酮、阴丹酮、含有从1至4个氯原子的含氯阴丹酮、皮蒽酮、二氯皮蒽酮、单溴二氯皮蒽酮、二溴二氯皮蒽酮、四溴皮蒽酮、二萘嵌苯-3,4,9,10-四羧酸二酰亚胺(其中这些酰亚胺基团可以是未取代的或被C1-C3-烷基或苯基或杂环基团取代的，并且其中该苯基和杂环基团可以另外地带有不赋予在水中的溶解度的取代基)、蒽素嘧啶羧酸酰胺、蒽酮紫、异蒽酮紫、二噁嗪颜料、每个分子可以含有高达2个氯原子的酞菁铜、多氯-酞菁铜或每个分子含有高达14个溴原子的多溴氯-酞菁铜，及其混合物。
在另一方面，适合的颜料包括选自由以下组成的组的颜料：群青蓝(C.I.颜料蓝29)、群青紫罗兰(C.I.颜料紫罗兰15)以及其混合物。
上述织物调色剂可以组合使用(可以使用织物调色剂的任何混合物)。适合的调色剂更详细地描述于US 7208459中。染料在本发明的组合物中的优选水平是0.00001至0.5wt％、或0.0001至0.25wt％。优选在水中用于处理和/或清洁步骤的染料的浓度是从1ppb至5ppm、10ppb至5ppm或20ppb至5ppm。在优选的组合物中，表面活性剂的浓度将是从0.2至3g/l。
胶囊化物-组合物可以包含胶囊化物。在一个方面，胶囊化物包含核心、具有内表面和外表面的包壳，所述包壳包封所述核心。
在所述胶囊化物的一个方面，所述核心可以包含选自由以下组成的组的材料：香料；增亮剂；染料；驱虫剂；硅酮；蜡；调味剂；维生素；织物柔软剂；护肤剂；在一个方面，石蜡；酶；抗细菌剂；漂白剂；感受剂(sensate)；及其混合物；并且所述包壳可以包含选自由以下组成的组的材料：聚乙烯；聚酰胺；聚乙烯醇，任选地含有其他共聚单体；聚苯乙烯；聚异戊二烯；聚碳酸酯；聚酯；聚丙烯酸酯；氨基塑料，在一个方面，所述氨基塑料可以包含聚脲、聚氨酯和/或聚脲聚氨酯，在一个方面，所述聚脲可以包含聚氧基亚甲基脲和/或三聚氰胺甲醛；聚烯烃；多糖，在一个方面，所述多糖可以包含藻朊酸盐和/或壳聚糖；明胶；虫胶；环氧树脂；乙烯基聚合物；水不溶性无机物；硅酮；及其混合物。
在所述胶囊化物的一个方面，所述核心可以包含香料。
在所述胶囊化物的一个方面，所述包壳可以包含三聚氰胺甲醛和/或交联的三聚氰胺甲醛。
在一个方面，披露了适合的胶囊化物可以包含核心材料和包壳，所述包壳至少部分地包围所述核心材料。所述胶囊化物的至少75％、85％或90％可以具有从0.2至10MPa、从0.4至5MPa、从0.6至3.5MPa或从0.7至3MPa的抗断强度；并且具有从0％至30％、从0％至20％或从0％至5％的有益试剂泄露。
在一个方面，所述胶囊化物的至少75％、85％或90％可以具有从1至80微米、从5至60微米、从10至50微米或从15至40微米的粒度。
在一个方面，所述胶囊化物的至少75％、85％或90％可以具有从30至250nm、从80至180nm、或从100至160nm的粒子壁厚。
在一个方面，所述胶囊化物的核心材料可以包括选自由香料原料组成的组的材料，和/或任选地包括选自由以下组成的组的材料：植物油，包括纯净植物油和/或共混植物油，包括蓖麻油、椰子油、棉籽油、葡萄籽油、油菜籽、大豆油、玉米油、棕榈油、亚麻籽油、红花油、橄榄油、花生油、椰子油、棕榈仁油、蓖麻油、柠檬油及其混合物；植物油的酯，酯，包括己二酸二丁酯、酞酸二丁酯、己二酸丁基苄酯、己二酸辛基苄酯、磷酸三甲苯酯、磷酸三辛酯及其混合物；直链或支链烃，包括具有高于约80℃的沸点的那些直链或支链烃；部分氢化的三联苯、二烷基邻苯二甲酸酯、烷基联苯(包括单异丙基联苯)、烷基化的萘(包括二丙基萘)、石油精(包括煤油)、矿物油及其混合物；芳族溶剂，包括苯、甲苯及其混合物；硅酮油；及其混合物。
在一个方面，所述胶囊化物的壁材料可以包括适合的树脂，该树脂包括醛和胺的反应产物，适合的醛包括甲醛。适合的胺包括三聚氰胺、脲、苯并胍胺、甘脲及其混合物。适合的三聚氰胺包括羟甲基三聚氰胺、甲基化的羟甲基三聚氰胺、亚氨基三聚氰胺及其混合物。适合的脲包括二羟甲基脲、甲基化的二羟甲基脲、脲-间苯二酚及其混合物。
在一个方面，在将胶囊化物添加至组合物之前、期间或之后，适合的甲醛清除剂可以与例如处于胶囊浆料中的胶囊化物一起使用和/或添加至这样的组合物中。适合的胶囊可以通过US2008/0305982、和/或US2009/0247449的以下教导来制成。
在优选的方面，组合物还可以包含沉积助剂，优选由下组组成，该组包含阳离子或非离子聚合物。适合的聚合物包括阳离子淀粉、阳离子羟基乙基纤维素、聚乙烯甲醛、槐树豆胶、甘露聚糖、木葡聚糖、罗望子胶、聚乙二醇对苯二甲酸酯，以及含有甲基丙烯酸二甲胺乙酯的聚合物，任选地具有一种或选自包含丙烯酸和丙烯酰胺的组的单体。
香料-在一个方面，组合物包含香料，所述香料包含选自由以下组成的组的一种或多种香料原材料：1,1’-氧基双-2-丙醇；1,4-环己烷二甲酸二乙酯；(乙氧基甲氧基)环十二烷；1,3-壬二醇单乙酸酯；(3-甲基丁氧基)乙酸2-丙烯基酯；β-甲基环十二烷乙醇；2-甲基-3-[(1,7,7-三甲基双环[2.2.1]庚-2-基)氧]-1-丙醇；氧杂环十六烷-2-酮；α-甲基-苯甲醇酯；反式-3-乙氧基-1,1,5-三甲基环己烷；4-(1,1-二甲基乙基)环己醇乙酸酯；十二氢-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2,1-b]呋喃；β-甲基苯丙醛；β-甲基-3-(1-甲基乙基)苯丙醛；4-苯基-2-丁酮；2-甲基丁酸乙酯；苯甲醛；2-甲基丁酸1-甲基乙酯；二氢-5-戊基-2(3H)呋喃酮；(2E)-1-(2,6,6-三甲基-2-环己烯-1-基)-2-丁烯-1-酮；十二醛；十一醛；2-乙基-α，α-二甲基苯丙醛；癸醛；α，α-二甲基苯乙醇乙酸酯；2-(苯基亚甲基)辛醛；2-[[3-[4-(1,1-二甲基乙基)苯基]-2-甲基亚丙基]氨基]苯甲酸甲酯；1-(2,6,6-三甲基-3-环己烯-1-基)-2-丁烯-1-酮；2-戊基环戊酮；3-氧代-2-戊基环戊乙酸甲酯；4-羟基-3-甲氧基苯甲醛；3-乙氧基-4-羟基苯甲醛；2-庚基环戊酮；1-(4-甲基苯基)乙酮；(3E)-4-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)-3-丁烯-2-酮；(3E)-4-(2,6,6-三甲基-2-环己烯-1-基)-3-丁烯-2-酮；苯乙醇；2H-1-苯并吡喃-2-酮；4-甲氧基苯甲醛；10-十一烯醛；丙酸苯甲酯；β-甲基苯戊醇；1,1-二乙氧基-3,7-二甲基-2,6-辛二烯；α，α-二甲基苯乙醇；(2E)-1-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2-丁烯-1-酮；乙酸苯甲酯；环己基丙酸-2-丙烯酯；己酸-2-丙烯酯；1,2-二甲氧基-4-(2-丙烯基)苯；1,5-二甲基-双环[3.2.1]辛烷-8-酮肟；4-(4-羟基-4-甲基戊基)-3-环己烯-1-甲醛；3-丁烯-2-醇；2-[[[2,4(或3,5)-二甲基-3-环己烯-1-基]亚甲基]氨基]苯甲酸甲酯；8-环十六烯-1-酮；甲基紫罗兰酮；2,6-二甲基-7-辛烯-2-醇；2-甲氧基-4-(2-丙烯基)苯酚；(2E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇；2-羟基-苯甲酸(3Z)-3-己烯酯；2-十三碳烯腈；4-(2,2-二甲基-6-亚甲基环己基)-3-甲基-3-丁烯-2-酮；四氢-4-甲基-2-(2-甲基-1-丙烯基)-2H-吡喃；乙酸(2-甲基丁氧基)-2-丙烯基酯；苯甲酸2-羟基-3-甲基丁酯；(Z)-1-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2-丁烯-1-酮；2-己基-3-氧代环戊烷甲酸甲酯；4-乙基-α,α-二甲基-苯丙醛；3-(4-羟基-4-甲基戊基)-3-环己烯-1-甲醛；1-(2,3,4,7,8,8a-六氢-3,6,8,8-四甲基-1H-3a,7-桥亚甲基薁-5-基)-[3R-(3α,3aβ,7β,8aα)]-乙酮；2-甲基-2H-吡喃-2-酮6-丁基四氢-十一醛；4-(1,1-二甲基乙基)-α-甲基-苯丙醛；5-庚基二氢-2(3H)-呋喃酮；2-[(7-羟基-3,7-二甲基亚辛基)氨基]苯甲酸甲酯；2-羟基-苯甲酸苯甲酯；2-甲氧基萘；2-己基-2-环戊烯-1-酮；5-己基二氢-2(3H)-呋喃酮；3-甲基-3-苯基-环氧乙烷羧酸乙酯；1,3,3-三甲基-2-氧杂双环[2.2.2]辛烷；苯戊醇，.γ.-甲基-；3,7-二甲基-3-辛醇；3,7-二甲基-2,6-辛二烯腈；3,7-二甲基-6-辛烯-1-醇；萜品醇乙酸酯；2-甲基-6-亚甲基-7-辛烯-2-醇二氢衍生物；3a,4,5,6,7,7a-六氢-4,7-桥亚甲基-1H-茚-6-醇丙酸酯；3-甲基-2-丁烯-1-醇乙酸酯；(Z)-3-己烯-1-醇乙酸酯；2-乙基-4-(2,2,3-三甲基-3-环戊烯-1-基)-2-丁烯-1-醇；4-(八氢-4,7-桥亚甲基-5H-茚-5-亚基)-丁醛；3-2,4-二甲基-环己烯-1-甲醛；1-(1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-2,3,8,8-四甲基-2-萘)-乙酮；2-羟基-苯甲酸甲酯；2-羟基-苯甲酸己酯；2-苯氧基-乙醇；2-羟基-苯甲酸戊酯；2,3-庚二酮；2-己烯-1-醇；2,6-二甲基-6-辛烯-2-醇；大马酮(α、β、γ或δ或其混合物)，3a,4,5,6,7,7a-六氢-4,7-桥亚甲基-1H-茚-6-醇乙酸酯；9-十一烯醛；8-十一烯醛；异环柠檬醛；1-(1,2,3,5,6,7,8,8a-八氢-2,3,8,8-四甲基-2-萘)-乙酮；3,5-二甲基-3-环己烯-1-甲醛；2,4-二甲基-3-环己烯-1-甲醛；3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇；3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇乙酸酯；铃兰醛(p-t-Bucinal)、和2-[2-(4-甲基-3-环己烯-1-基)丙基]-环戊酮和1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)环己烯及其混合物。
在一个方面，组合物可以包含胶囊化的香料粒子，该粒子包含水溶性羟基化合物或三聚氰胺-甲醛或修饰的聚乙烯醇。在一个方面，胶囊化物包含(a)至少部分水溶的固体基质，该基质包含一种或多种水溶性羟基化合物，优选淀粉；以及(b)由该固体基质包封的香料油。
在另一方面，香料可以是与多胺(优选聚乙烯亚胺)预复合的，以形成席夫碱(Schiff base)。
聚合物-组合物可以包含一种或多种聚合物。实例为羧甲基纤维素、聚(乙烯基-吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯(例如聚丙烯酸酯)、马来酸/丙烯酸共聚物、以及甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
组合物可以包含一种或多种两亲清洁聚合物，例如具有以下一般结构的化合物：双((C2H5O)(C2H4O)n)(CH3)-N+-CxH2x-N+-(CH3)-bis((C2H5O)(C2H4O)n)，其中n＝从20至30，并且x＝从3至8，或其硫酸化的或磺化的变体。
组合物可以包含两亲烷氧基化油脂清洁聚合物，该聚合物具有平衡的亲水和疏水特性，这样使得它们从织物和表面去除油脂粒子。本发明的两亲烷氧基化油脂清洁聚合物的特定实施例包含一个核心结构和与那个核心结构连接的多个烷氧基化基团。这些可以包含烷氧基化聚烯属烃亚胺(polyalkylenimine)，优选具有内聚环氧乙烷嵌段和外聚环氧丙烷嵌段。
烷氧基化聚羧酸酯(例如从聚丙烯酸酯制备的那些)可在本文用于提供另外的油脂去除性能。此类材料描述于WO 91/08281和PCT90/01815中。在化学上，这些材料包括每7-8个丙烯酸酯单元具有一条乙氧基侧链的聚丙烯酸酯。侧链具有式-(CH2CH2O)m(CH2)nCH3，其中m是2-3并且n是6-12。侧链是酯连接至聚丙烯酸酯“主链”，以提供“梳子状”聚合物类型结构。分子量可以不同，但典型地处于2000至50,000的范围内。此类烷氧基化聚羧酸酯可以包含本文的组合物的从0.05wt％至10wt％。
本发明的类异戊二烯衍生的表面活性剂，以及与其他助表面活性剂和其他辅助成分一起形成的混合物特别适合与两亲接枝共聚物使用，优选地该两亲接枝共聚物包含(i)聚乙二醇主链；以及(ii)和至少一个侧基部分，该侧基部分选自聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇及其混合物。优选的两亲接枝共聚物是由巴斯夫公司(BASF)供应的Sokalan HP22。适合的聚合物包括随机接枝共聚物，优选聚乙酸乙烯酯接枝的聚环氧乙烷共聚物，具有聚环氧乙烷主链和多重聚乙酸乙烯酯侧链。聚环氧乙烷主链的分子量优选是6000，并且聚环氧乙烷与聚乙酸乙烯酯的重量比是40比60，并且每50个环氧乙烷单位有不多于1个接枝点。
羧酸酯聚合物-本发明的组合物还可以包括一种或多种羧酸酯聚合物，例如马来酸酯/丙烯酸酯随机共聚物或聚丙烯酸酯均聚物。在一个方面，羧酸酯聚合物是具有从4,000至9,000Da或从6,000至9,000Da的分子量的聚丙烯酸酯均聚物。
去污聚合物-本发明的组合物还可以包括一种或多种去污聚合物，所述聚合物具有如由以下结构(I)、(II)或(III)之一所定义的结构：
(I)-[(OCHR1-CHR2)a-O-OC-Ar-CO-]d
(II)-[(OCHR3-CHR4)b-O-OC-sAr-CO-]e
(III)-[(OCHR5-CHR6)c-OR7]f
其中：
a、b和c是从1至200；
d、e和f是从1至50；
Ar是1,4-取代的亚苯基；
sAr是1,3-取代的亚苯基，该亚苯基在5位上被SO3Me取代；
Me是Li、K、Mg/2、Ca/2、Al/3、铵、单烷基铵、二烷基铵、三烷基铵或四烷基铵，其中烷基基团是C1-C18烷基或C2-C10羟基烷基，或其混合物；
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自H或C1-C18正烷基或异烷基；并且
R7是直链或支链的C1-C18烷基，或直链或支链的C2-C30烯基，或具有5至9个碳原子的环烷基，或C8-C30芳基，或C6-C30芳基烷基。
适合的去污聚合物是聚酯去污聚合物，例如Repel-o-tex聚合物，包括Repel-o-tex、SF-2和SRP6，由罗地亚(Rhodia)供应。其他适合的去污聚合物包括Texcare聚合物，包括Texcare SRA100、SRA300、SRN100、SRN170、SRN240、SRN300和SRN325，由科莱恩(Clariant)供应。其他适合的去污聚合物是Marloquest聚合物，例如Marloquest SL，由萨索尔公司(Sasol)供应。
纤维素聚合物-本发明的组合物还可以包含一种或多种纤维素聚合物，包括选自烷基纤维素、烷基烷氧基烷基纤维素、羧基烷基纤维素、烷基羧基烷基纤维素的那些。在一个方面，纤维素聚合物选自包含以下的组：羧甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟基乙基纤维素、甲基羧甲基纤维素及其混合物。在一个方面，羧甲基纤维素具有从0.5至0.9的羧甲基取代度以及从100,000Da至300,000Da的分子量。
酶-除了本发明的脂肪酶变体以外，组合物还可以包含提供清洁性能和/或织物护理益处的一种或多种酶。适合的酶的实例包括但不限于半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、其他脂肪分解酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、甘露聚糖酶、果胶裂解酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂加氧酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、聚戊糖酶、马拉纳酶(malanase)、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、叶绿素酶、淀粉酶或其混合物。典型的组合是酶混合物，可以包含例如蛋白酶和脂肪酶连同淀粉酶。当存在于组合物中时，前述另外的酶可以按组合物的重量计以从0.00001wt％至2wt％、从0.0001wt％至1wt％或从0.001wt％至0.5wt％酶蛋白的水平存在。
通常，选择的一种或多种酶的特性应当与所选择的洗涤剂相容(即，最适pH，与其他酶成分或非酶成分的相容性等)，并且该一种或多种酶应当以有效量存在。
在一方面，优选的酶将包括纤维素酶。适合的纤维素酶包括细菌来源或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自以下属的纤维素酶：芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、腐质霉属(Humicola)、镰孢属(Fusarium)、梭孢壳属(Thielavia)、枝顶孢霉属(Acremonium)，例如US 4435307、US5648263、US 5691178、US 5776757以及WO 89/09259中披露的由特异腐质霉(Humicolainsolens)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)以及尖孢镰孢(Fusariumoxysporum)产生的真菌纤维素酶。
特别适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的实例是EP 0495257、EP 0531372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中描述的纤维素酶。其他实例是纤维素酶变体，如WO 94/07998、EP 0531315、US 5457046、US 5686593、US5763254、WO 95/24471、WO 98/12307以及PCT/DK98/00299中描述的那些。
可商购的纤维素酶包括CelluzymeTM、和CarezymeTM(诺维信公司(Novozymes A/S))、ClazinaseTM、和Puradax HATM(杰能科国际公司(Genencor International Inc.))、以及KAC-500(B)TM(花王株式会社(Kao Corporation))。
在一方面，优选的酶将包括蛋白酶。适合的蛋白酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物来源的那些，例如植物或微生物来源。优选微生物来源。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。它可以是碱性蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族的(如胰蛋白酶)或S8家族的(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶蛋白酶可以例如是来自例如M4家族的嗜热菌蛋白酶或其他金属蛋白酶，如来自M5、M7或M8家族的那些。
术语“枯草杆菌酶”是指根据Siezen等人,Protein Engng.[蛋白质工程]4(1991)719-737和Siezen等人,Protein Science[蛋白质科学]6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶是特征为在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸的蛋白酶的亚组。枯草杆菌酶可以被划分为6个亚类，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶家族、蛋白酶K家族、羊毛硫氨酸抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。
枯草杆菌酶的实例是衍生自芽孢杆菌属的那些，如描述于US 7262042和WO 09/021867中的迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)和吉氏芽孢杆菌(Bacillus gibsonii)；和描述于WO 89/06279中的迟缓枯草杆菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168以及描述于(WO 93/18140)中的蛋白酶PD138。其他有用的蛋白酶可以是描述于WO 92/175177、WO 01/016285、WO 02/026024和WO 02/016547中的那些。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和镰孢属蛋白酶(描述于WO 89/06270、WO 94/25583和WO 05/040372中)，以及源自纤维单胞菌(Cellumonas)的胰凝乳蛋白酶(描述于WO05/052161和WO 05/052146中)。
另外优选的蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的碱性蛋白酶(如在例如WO 95/23221中所述)、及其变体(描述于WO 92/21760、WO 95/23221、EP 1921147和EP 1921148中)。
金属蛋白酶的实例是如WO 07/044993(杰能科国际公司)中所述的中性金属蛋白酶，例如源自解淀粉芽孢杆菌的那些。
有用的蛋白酶的实例是描述于以下中的变体：WO 92/19729、WO 96/034946、WO98/20115、WO 98/20116、WO 99/011768、WO 01/44452、WO 03/006602、WO 04/03186、WO 04/041979、WO 07/006305、WO 11/036263、WO 11/036264，尤其是在以下位置中的一个或多个处具有取代的变体：3、4、9、15、27、36、57、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252以及274，使用BPN’进行编号。更优选地，枯草杆菌酶变体可以包含以下突变：S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、*36D、V68A、N76D、N87S,R、*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,R S103A、V104I,Y,N、S106A、G118V,R、H120D,N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN’进行编号)。
适合的可商购的蛋白酶酶包括以以下商品名出售的那些： DuralaseTm、DurazymTm、Ultra、 Ultra、Ultra、Ultra、和所有这些能以或(诺维信公司)出售；以以下商品名出售的那些：PurafectPreferenzTm、PurafectPurafectPurafect EffectenzTm、 和(丹尼斯克/杜邦公司(Danisco/DuPont))、AxapemTM(吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocases N.V.))、BLAP(序列示于US 5352604的图29中)及其变体(汉高股份(Henkel AG))以及来自花王株式会社(Kao)的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。
在一方面，优选的酶将包括淀粉酶。适合的淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以是细菌或真菌来源的。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如获得自芽孢杆菌属的α-淀粉酶，例如GB 1296839中更详细描述的地衣芽孢杆菌特定菌株的α-淀粉酶。
适合的淀粉酶包括具有WO 95/10603中的SEQ ID NO:3的淀粉酶或其与SEQ IDNO:3具有90％序列同一性的变体。优选的变体描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 97/43424以及WO 99/019467的SEQ ID NO:4中，例如在以下位置中的一个或多个处具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408和444。
不同的适合的淀粉酶包括具有WO 02/010355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQ ID NO:6具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:6的优选的变体是在位置181和182中具有缺失并且在位置193中具有取代的那些。
其他适合的淀粉酶是包含示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的源自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或其具有90％序列同一性的变体。该杂合α-淀粉酶的优选的变体是在以下位置中的一个或多个处具有取代、缺失、或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209、和Q264。包括示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的源自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQ ID NO:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选变体是具有以下取代的那些：
M197T；
H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或
G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。
适合的另外的淀粉酶是具有WO 99/019467中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQID NO:6具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:6的优选的变体是在以下位置中的一个或多个处具有取代、缺失、或插入的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216和K269。特别优选的淀粉酶是在位置R181和G182、或位置H183和G184中具有缺失的那些。
可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 96/023873的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:2或SEQ ID NO:7的那些或其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:7具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:7的优选的变体是在以下位置中的一个或多个处具有取代、缺失、或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304以及476。更优选的变体是在位置181和182或位置183和184处具有缺失的那些。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:7的最优选的淀粉酶变体是在位置183和184处具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304和476中的一个或多个处具有取代的那些。
可以使用的其他淀粉酶是具有WO 08/153815的SEQ ID NO:2、WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的淀粉酶或其与WO 08/153815的SEQ ID NO:2具有90％序列同一性或与WO01/66712中的SEQ ID NO:10具有90％序列同一性的变体。WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的优选的变体是在以下位置中的一个或多个处具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211、和264。
另外的适合的淀粉酶是具有WO 09/061380的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQ IDNO:2具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:2的优选的变体是在以下位置中的一个或多个处具有C-末端截短、和/或取代、缺失、或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444、和G475。SEQ ID NO:2的更优选的变体是在以下位置中的一个或多个处具有取代的那些：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E、以及G475K，和/或在位置R180和/或S181或T182和/或G183处具有缺失的那些。SEQ ID NO:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：
N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；
N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；
S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或
S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中这些变体是C-末端截短的，并且任选地进一步包含在位置243处的取代和/或在位置180和/或位置181处的缺失。
其他适合的淀粉酶是具有WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的α-淀粉酶或与SEQ IDNO:12具有至少90％序列同一性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO 01/66712中的SEQ IDNO:12的以下位置中的一个或多个处具有取代、缺失或插入的那些：R28、R118、N174；R181、G182、D183、G184、G186、W189、N195、M202、Y298、N299、K302、S303、N306、R310、N314；R320、H324、E345、Y396、R400、W439、R444、N445、K446、Q449、R458、N471、N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有取代R118K、N195F、R320K和R458K的变体，以及另外在选自下组的一个或多个位置处具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345、和A339，最优选的是另外在所有这些位置中具有取代的变体。
其他实例是淀粉酶变体，例如在WO 2011/098531、WO 2013/001078和WO 2013/001087中描述的那些。
可商购的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、Termamyl UltraTM、FungamylTM、BanTM、StainzymeTM、Stainzyme PlusTM、Prime、SupramylTM、NatalaseTM、Liquozyme X和BANTM(来自诺维信公司)、AT 9000(百因美生物技术贸易有限公司(Biozym Biotech Trading GmbH)威利斯塔斯(Wehlistrasse)27b A-1200奥地利维也纳(Wien Austria))、和RapidaseTM、PurastarTM/EffectenzTM、Powerase、Preferenz S100、Preferenx S110、OPTISIZE以及PURASTAR(丹尼斯克/杜邦公司)以及(花王株式会社)。
另外的合适的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体酶或蛋白质工程化的突变体酶。实例包括来自嗜热真菌属的脂肪酶，例如，如EP 258068和EP 305216中所述的来自疏绵状嗜热丝孢菌(早先命名为疏棉状腐质霉)；来自腐质霉属的角质酶，例如特异腐质霉(WO 96/13580)；来自假单胞菌属的菌株的脂肪酶(这些中的一些现在改名为伯克霍尔德菌属)，例如产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌(EP 218272)、洋葱假单胞菌(EP 331376)、假单胞菌属菌株SD705(WO 95/06720&WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)；GDSL-型链霉菌属脂肪酶(WO 10/065455)；来自稻瘟病菌的角质酶(WO 10/107560)；来自门多萨假单胞菌的角质酶(US 5,389,536)；来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的脂肪酶(WO 11/084412，WO 13/033318)；嗜热脂肪土芽孢杆菌脂肪酶(WO 11/084417)；来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶(WO 11/084599)；以及来自灰色链霉菌(WO 11/150157)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)的脂肪酶(WO 12/137147)。
其他实例是另外的脂肪酶变体，如EP 407225、WO 92/05249、WO94/01541、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/30744、WO 95/35381、WO 95/22615、WO 96/00292、WO 97/04079、WO 97/07202、WO 00/34450、WO 00/60063、WO 01/92502、WO 07/87508以及WO 09/109500中描述的那些。
优选的另外的商业化脂肪酶产品包括LipolaseTM、LipexTM；Lipex evitry100L、Lipex Evity 200L、LipolexTM和LipocleanTM(诺维信公司)、Lumafast(来自杰能科公司(Genencor))、Lipomax(来自吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocades))、以及Preferenz L100(来自丹尼斯科美国公司(Danisco US Inc))。
仍其他实例是有时称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶，例如与南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO 10/111143)、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶(WO 05/56782)、来自CE 7家族的过水解酶(WO 09/67279)以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体(特别地来自亨斯迈纺织品染化有限公司(Huntsman Textile Effects Pte Ltd)的商业化产品Gentle Power Bleach中所用的S54V变体)(WO 10/100028)。
在一个方面，其他优选的酶包括微生物起源的展现出内切-β-1,4-葡聚糖酶活性的内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)，包括对于芽孢杆菌属的成员而言内源的细菌多肽(该多肽具有与US 7141403中的氨基酸序列SEQ ID NO:2具有至少90％、94％、97％或99％同一性的序列)及其混合物。适合的内切葡聚糖酶是在商标名和(诺维信公司)下售卖的。
其他优选的酶包括在商标名下售卖的果胶裂解酶，以及在商标名下售卖的甘露聚糖酶(诺维信公司)，以及(丹尼斯克/杜邦公司(Danisco/DuPont))。
可以通过添加含有一种或多种酶的单独添加剂、或通过添加含有所有这些酶的组合添加剂而将一种或多种洗涤剂酶包含于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即单独的或组合的添加剂，可以配制成例如颗粒、液体、浆料等。优选的洗涤剂添加剂配制品为颗粒，特别地无粉尘颗粒；液体，特别地稳定化液体；或者浆料。
无粉尘颗粒可以例如US 4106991和US 4661452中所披露来制造，并且可以任选地通过本领域中已知的方法来包衣。蜡状包衣材料的实例是平均分子量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中该醇含有12至20个碳原子，并且其中存在15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯、和甘油二酯、和甘油三酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB 1483591中给出。液体酶制剂可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP 238216中披露的方法来制备。
染料转移抑制试剂-本发明的组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制试剂。适合的聚合物染料转移抑制试剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。当存在于组合物中时，染料转移抑制试剂可以按从0.0001至10wt％、从0.01至5wt％或从0.1至3wt％的水平存在。
增亮剂-本发明的组合物还可以包含可以给正在清洁的物品着色的另外的组分，例如荧光增亮剂。
组合物可以包含具有以下结构的呈α-晶体形式的C.I.荧光增亮剂260：
在一个方面，增亮剂是冷水可溶性增亮剂，例如呈α-晶体形式的C.I.荧光增亮剂260。在一个方面，增亮剂主要处于α-晶体形式，这意味着典型地至少50wt％、至少75wt％、至少90wt％、至少99wt％、或甚至基本上全部的C.I.荧光增亮剂260是处于α-晶体形式。
增亮剂典型地是处于微粒化微粒形式，具有从3至30微米、从3微米至20微米、或从3至10微米的加权平均初级粒度。
组合物可以包含呈β-晶体形式的C.I.荧光增亮剂260，并且(i)呈α-晶体形式的C.I.荧光增亮剂260与(ii)呈β-晶体形式的C.I.荧光增亮剂260的重量比可以是至少0.1或至少0.6。BE680847涉及用于制得呈α-晶体形式的C.I.荧光增亮剂260的方法。
可以用于本发明中的商业化光学增亮剂可以划分为多个亚组，这些亚组包括但不必限于：二苯乙烯、吡唑啉、香豆素、羧酸、次甲基菁、二苯并噻吩-5,5-二氧化物、唑类、5元和6元环杂环的衍生物以及其他混杂剂。此类增亮剂的实例披露于“The Production andApplication of Fluorescent Brightening Agents”[荧光增亮剂的产生和应用],M.Zahradnik,由纽约John Wiley&Sons[约翰威利父子公司]出版(1982)。可以用于本发明组合物的光学增亮剂的特定非限制性实例是在US 4790856和US 3646015中鉴定的那些。
另外适合的增亮剂具有以下结构：
适合的荧光增亮剂水平包括从0.01wt％、从0.05wt％、从0.1wt％或从0.2wt％的较低水平至0.5wt％或0.75wt％的较高水平。
在一个方面，增亮剂可以装载在粘土上以形成粒子。硅酸盐-本发明的组合物还可以含有硅酸盐，例如硅酸钠或硅酸钾。组合物可以包含从0wt％至小于10wt％的硅酸盐，至9wt％、或至8wt％、或至7wt％、或至6wt％、或至5wt％、或至4wt％、或至3wt％、或甚至至2wt％，并且从高于0wt％、或从0.5wt％、或从1wt％的硅酸盐。适合的硅酸盐是硅酸钠。
分散剂-本发明的组合物还可以含有分散剂。适合的水溶性有机材料包括均聚的或共聚的酸或其盐，其中聚羧酸包含被不多于两个碳原子彼此分开的至少两个羧基基团。
酶稳定剂-用于组合物中的酶可以通过各种技术来稳定。本文使用的酶可以通过钙和/或镁离子的水溶性来源的存在来稳定。常规稳定试剂的实例是例如多元醇，例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、肽醛、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如芳族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物，例如4-甲酰苯基硼酸，并且可以如在例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述来配制所述组合物。在包含蛋白酶的水性组合物的情况下，可以添加可逆蛋白酶抑制剂来进一步改善稳定性，所述可逆蛋白酶抑制剂例如是硼化合物，包括硼酸盐、4-甲酰基苯基硼酸、苯基硼酸及其衍生物；或化合物，例如甲酸钙、甲酸钠和1,2-丙二醇。肽醛可以具有式B2-B1-B0-R，其中：R是氢、CH3、CX3、CHX2或CH2X，其中X是卤素原子；B0是在对位处和/或在间位处具有OH取代基的苯丙氨酸残基；B1是单个氨基酸残基；并且B2由一个或多个氨基酸残基组成，任选地包含N-末端保护基团。优选的肽醛包括但不限于：Z-RAY-H、Ac-GAY-H、Z-GAY-H、Z-GAL-H、Z-GAF-H、Z-GAV-H、Z-RVY-H、Z-LVY-H、Ac-LGAY-H、Ac-FGAY-H、Ac-YGAY-H、Ac-FGVY-H或Ac-WLVY-H，其中Z是苄氧基羰基，而Ac是乙酰基。
溶剂-适合的溶剂包括水和其他溶剂，例如亲脂性流体。适合的亲脂性流体的实例包括硅氧烷、其他硅酮、烃、乙二醇醚、甘油衍生物(例如甘油醚)、全氟化的胺、全氟化的和氢氟醚溶剂、低挥发性非氟化的有机溶剂、二醇溶剂、其他环境友好型溶剂及其混合物。
结构化剂/增稠剂-结构化液体可以从内部结构化，由此结构由初级成分(例如，表面活性剂材料)形成，和/或通过使用次级成分(例如，聚合物、粘土和/或硅酸盐材料)提供三维基质结构而从外部结构化。组合物可以包含从0.01至5wt％、或从0.1至2.0wt％的结构化剂。结构化剂典型地选自由以下组成的组：甘油二酯和甘油三酯、硬脂酸乙二醇双酯、微晶纤维素、基于纤维素的材料、微纤维纤维素、疏水修饰的碱性可膨胀的乳液(例如PolygelW30(3V西格玛(Sigma)))、生物聚合物，黄原胶、吉兰糖胶及其混合物。适合的结构化剂包括氢化蓖麻油及其非乙氧基化衍生物。适合的结构化剂披露于US 6855680中。此类结构化剂具有螺纹样结构化系统，该系统具有一定范围的纵横比。其他适合的结构化剂和用于制得它们的方法描述于WO 10/034736中。
调节剂-本发明的组合物可以包括高熔点脂肪化合物。本文有用的高熔点脂肪化合物具有25℃或更高的熔点，并且选自由以下组成的组：脂肪醇、脂肪酸、脂肪醇衍生物、脂肪酸衍生物及其混合物。此类具有低熔点的化合物并非旨在被包括在此部分中。高熔点化合物的非限制性实例发现于International Cosmetic Ingredient Dictionary[国际化妆品成分词典],第五版,1993,以及CTFACosmetic Ingredient Handbook[CTFA化妆品成分手册],第二版,1992中。
鉴于提供改善的调节益处(例如在施加至湿发的过程中的湿滑感、柔软性以及对干发的保湿感)，高熔点脂肪化合物以从0.1至40wt％、从1至30wt％、从1.5至16wt％、从1.5至8wt％的水平包括在组合物中。
本发明的组合物可以含有阳离子聚合物。组合物中阳离子聚合物的浓度典型地范围为从0.05至3wt％、从0.075至2.0wt％、或从0.1至1.0wt％。在预期使用组合物的pH下，适合的阳离子聚合物将具有至少0.5meq/gm、至少0.9meq/gm、至少1.2meq/gm、至少1.5meq/gm、或小于7meq/gm、以及小于5meq/gm的阳离子电荷密度，pH的范围将大体上是从pH 3至pH9、或在pH 4与pH 8之间。本文，聚合物的“阳离子电荷密度”是指聚合物上的正电荷数目与聚合物的分子量之比。此类适合的阳离子聚合物的平均分子量将大体上是在10,000与10,000,000之间、在50,000与5,000,000之间或在100,000与3,000,000之间。
用于在本发明的组合物中使用的适合的阳离子聚合物含有阳离子含氮部分，如季铵或阳离子质子化的氨基部分。可以将任何阴离子反离子与阳离子聚合物关联使用，只要聚合物保持溶解于水中、组合物中、或组合物的凝聚相中，并且只要反离子在物理和化学上与组合物的主要成分相容或以另外的方式不会不适当地损害组合物性能、稳定性或美感。此类反离子的非限制性实例包括卤化物(例如，氯化物、氟化物、溴化物、碘化物)、硫酸盐和甲基硫酸盐。
此类聚合物的非限制性实例描述于CTFA Cosmetic Ingredient Dictionary[CTFA化妆品成分词典]，第3版，由Estrin、Crosley、和Haynes编著(The Cosmetic,Toiletry,and Fragrance Association,Inc.[化妆品、化妆用具以及香水联合公司]，Washington,D.C.[华盛顿特区](1982))。
用于在组合物中使用的其他适合的阳离子聚合物包括多糖聚合物，阳离子瓜尔胶衍生物，含四价氮的纤维素醚，合成聚合物，醚化纤维素、瓜尔胶和淀粉的共聚物。当使用的时候，本文的阳离子聚合物可溶解于组合物中或可溶解于组合物中的复合凝聚相中，该凝聚相是由上文所述的阳离子聚合物和阴离子、两性和/或兼性离子表面活性剂组分形成。阳离子聚合物的复合凝聚物还可以与组合物中其他带电荷的材料形成。适合的阳离子聚合物描述于US 3962418；US 3958581；和US2007/0207109中。
本发明的组合物可以包含作为调节剂的非离子聚合物。具有大于1000的分子量的聚亚烷基乙二醇(polyalkylene glycol)在本文是有用的。具有以下通式的那些是有用的：
其中R95选自由以下组成的组：H、甲基及其混合物。调节剂，并且特别是硅酮，可以被包括在组合物中。用于本发明的组合物中的调节剂典型地包含形成乳化液体粒子的水不溶性、水分散性、非挥发性的液体。用于在组合物中使用的适合的调节剂是通常表征为以下的那些调节剂：硅酮(例如，硅酮油、阳离子硅酮、硅酮胶、高折射性硅酮、以及硅酮树脂)、有机调节油(例如，烃油、聚烯烃、以及脂肪酯)或其组合，或者以另外方式于本文的水性表面活性剂基质中形成液体分散粒子的那些调节剂。此类调节剂应该在物理和化学上是与组合物的主要组分相容的，并且不应该以另外的方式不适当地损害组合物稳定性、美感或性能。
组合物中调节剂的浓度应该足以提供所希望的调节益处。这种浓度可以随着调节剂、所希望的调节性能、调节剂粒子的平均大小、其他组分的类型和浓度以及其他类似因素而变化。
硅酮调节剂的浓度范围典型地是从0.01至10wt％。适合的硅酮调节剂以及对于硅酮的任选的悬浮剂的非限制性实例描述于美国再公告专利号34,584；US 5104646；US5106609；US 4152416；US2826551；US 3964500；US 4364837；US 6607717；US 6482969；US5807956；US 5981681；US 6207782；US 7465439；US 7041767；US 7217777；US2007/0286837A1；US2005/0048549A1；US2007/0041929A1；GB 849433；DE 10036533，将所有文献通过引用并入本文；Chemistry and Technology of Silicones[硅酮的化学与技术]，纽约：Academic Press[学术出版社](1968)；通用电气硅酮橡胶产品数据列表SE 30、SE 33、SE 54和SE 76；硅酮化合物，彼特拉克系统公司(Petrarch Systems,Inc.)(1984)；以及Encyclopedia of Polymer Science and Engineering[聚合物科学与工程化百科全书],第15卷,第2版,第204-308页John Wiley&Sons,Inc.[约翰威利父子公司](1989)中。
本发明的组合物还可以包含从0.05至3wt％的至少一种有机调节油作为调节剂，单独或与其他调节剂例如(本文所述的)硅酮组合。适合的调节油包括烃油、聚烯烃、以及脂肪酯。还适合用于本文的组合物中的是在US 5674478和US 5750122或在US 4529586；US4507280；US 4663158；US 4197865；US 4217914；US 4381919；以及US 4422853中所述的调节剂。
卫生与恶臭味-本发明的组合物还可以包含蓖麻酸锌、百里酚、季铵盐(如)、聚乙烯亚胺(例如来自巴斯夫公司(BASF)的)及其锌络合物、银和银化合物(尤其是被设计为缓慢释放Ag+或纳米银分散体的那些)中的一种或多种。
益生素-组合物可以包含益生素，如WO 09/043709中所述的那些。
增泡剂-如果高的起泡是希望的，增泡剂(例如C10-C16烷醇酰胺或C10-C14烷基硫酸酯)可以典型地以1至10wt％的水平掺入组合物中。C10-C14单乙醇和二乙醇酰胺阐述了此类增泡剂的典型的类别。此类增泡剂与高的起泡辅助表面活性剂(如，以上提及的氧化胺、甜菜碱、以及磺基甜菜碱(sultaine))一起使用也是有利的。如果希望的话，水溶性镁和/或钙盐(例如MgCl2、MgSO4、CaCl2、CaSO4等)可以典型地以0.1至2wt％的水平添加，以提供另外的泡沫并且以增强油脂去除性能。
泡沫抑制剂-用于减少或抑制泡沫形成的化合物可以掺入本发明的组合物中。泡沫抑制在如在US 4489455和US 4489574中描述的所谓“高浓度清洁工艺”中以及在前载式(front-loading-style)洗涤机中可能是特别重要的。多种多样的材料可以用作泡沫抑制剂，并且泡沫抑制剂对于本领域的技术人员而言是熟知的。参见，例如Kirk OthmerEncyclopedia of Chemical Technology[柯克·奥思默化工百科全书],第三版,第7卷,第430-447页(John Wiley&Sons,Inc.[约翰威利父子公司],1979)。泡沫抑制剂的实例包括单羧基脂肪酸以及其中的可溶盐，高分子量烃例如石蜡，脂肪酸酯(例如，脂肪酸甘油三酯)，单价醇的脂肪酸酯，脂肪族C18-C40酮(例如，硬脂酮)，N-烷基化的氨基三嗪，优选具有约100℃之下的熔点的蜡烃，硅酮泡沫抑制剂，以及二级醇。泡沫抑制剂描述于US2954347；US4265779；US 4265779；US 3455839；US 3933672；US 4652392；US 4978471；US 4983316；US5288431；US 4639489；US 4749740；US 4798679；US 4075118；EP 89307851.9；EP 150872；和DOS2,124,526中。
对于有待用于自动洗衣机中的任何洗涤剂组合物，泡沫不应该形成到它们溢出洗涤机的程度。当使用时，泡沫抑制剂优选以“泡沫抑制量”存在。“泡沫抑制量”意指组合物的配制者可以选择这种泡沫控制剂的量，这个量将充分地控制泡沫以导致用于自动洗衣机中的低起泡衣物洗涤剂。
本文的组合物将通常包含从0至10wt％的泡沫抑制剂。当用作泡沫抑制剂时，单羧基脂肪酸以及其中的盐将典型地以高达5wt％的量存在。优选地，使用从0.5至3wt％的脂肪单羧酸酯泡沫抑制剂。典型地以高达2.0wt％的量使用硅酮泡沫抑制剂，虽然可以使用更高的量。通常以从0.1至2wt％范围的量使用单硬脂酰磷酸酯泡沫抑制剂。典型地以从0.01至5.0wt％范围的量使用烃泡沫抑制剂，虽然可以使用更高的水平。典型地以0.2至3wt％使用醇泡沫抑制剂。
本文的组合物可以在宽范围的pH内具有清洁活性。在某些实施例中，组合物具有从pH 4至pH 11.5的清洁活性。在其他实施例中，组合物从pH 6至pH 11、从pH 7至pH 11、从pH 8至pH 11、从pH 9至pH 11、或从pH 10至pH 11.5具有活性。
本文的组合物可以在宽范围的温度(例如从10℃或更低至90℃)内具有清洁活性。优选地，温度将是低于50℃或40℃或甚至30℃。在某些实施例中，对于组合物来说的最适温度范围是从10℃至20℃、从15℃至25℃、从15℃至30℃、从20℃至30℃、从25℃至35℃、从30℃至40℃、从35℃至45℃、或从40℃至50℃。
组合物的形式
本文所述的组合物被有利地用在例如洗衣应用、硬表面清洁、餐具洗涤应用(自动餐具洗涤(ADW)和手动餐具洗涤(HDW))、连同化妆品应用(如义齿、牙齿、毛发和皮肤)中。
本发明的组合物特别地是固体或液体清洁和/或处理组合物。在一个方面，本发明涉及一种组合物，其中所述组合物的形式选自由以下组成的组：规则的、压缩的或浓缩的液体；凝胶；膏；皂条；规则的或压缩的粉末；颗粒状固体；具有两个或更多个层(相同或不同相)的均匀或多层片剂；具有一个或多个室的袋；单个或多个室单位剂型；或其任何组合。
组合物的形式可以将多个室(例如像可水溶的袋)中或片剂的不同层中的组分物理地彼此分离。因此，可以避免组分间的不良的储存相互作用。在洗涤溶液中，每个室的不同溶解曲线还可以引起所选择的组分的延迟溶解。
袋可以被配置为单一室或多室。它可以具有适合容持该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。该袋由水溶性膜制成，它包含了一个内部体积。可以将所述内部体积分成袋的室。优选的膜是聚合物材料，优选地形成膜或薄片的聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选地是聚乙烯醇共聚物以及羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，聚合物在膜例如PVA中的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混组合物，这些共混组合物包含可水解降解并且可水溶的聚合物共混物，如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参考号M8630下，如由美国印第安纳州的MonoSol有限责任公司(MonoSol LLC)销售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇、及其混合物。袋可以包含固体衣物清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在组成上可以与含有固体的室不同(US2009/0011970 A1)。
水溶性膜-本发明的组合物还可以被包封于水溶性膜之内。优选地，优选的膜材料是聚合物材料。膜材料可以是例如通过聚合物材料的铸造、吹塑、挤出或吹胀挤塑来获得，如本领域中已知的。适合用于用作袋材料的优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚环氧烷、丙烯酰胺、丙烯酸、纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺、聚乙烯乙酸酯、聚羧酸和盐、聚氨基酸或肽、聚酰胺、聚丙烯酰胺、马来酸/丙烯酸的共聚物、多糖(包括淀粉和明胶)、天然胶(例如黄原胶和卡拉胶(carragum))。更优选的聚合物选自聚丙烯酸酯和水溶性丙烯酸脂共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、糊精、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，并且最优选地选自聚乙烯醇、聚乙烯醇共聚物和羟丙基甲基纤维素(HPMC)、及其组合。优选地，聚合物(例如，PVA聚合物)在袋材料中的水平是至少60wt％。聚合物可以具有任何重均分子量，优选是从约1.000至1.000.000、从约10.000至300.000、从约20.000至150.000。聚合物的混合物还可以用作袋材料。
天然地，不同的膜材料和/或不同厚度的膜可以用于制作本发明的室。在选择不同的膜中的益处是所得的室可以展现不同溶解度或释放特征。
优选的膜材料是在MonoSol商标名称M8630、M8900、H8779下已知的PVA膜，以及描述于US 6166117和US 6787512中的那些，以及具有相应溶解度和变形特征的PVA膜。
本文的膜材料还可以包括一种或多种添加剂成分。例如，可以有益的是添加增塑剂，例如甘油、乙二醇、二乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。其他添加剂包括有待被递送至洗涤水的功能性洗涤剂添加剂，例如有机聚合物分散剂等。
制造组合物的方法
可以将本发明的组合物配制为任何适合的形式，并且可通过被配制者所选择的任何方法来制备，所述方法的非限制性实例描述于申请人的实例中以及US 4990280；US20030087791A1；US20030087790A1；US 20050003983A1；US20040048764A1；US 4762636；US 6291412；US 20050227891A1；EP 1070115A2；US 5879584；US 5691297；US 5574005；US5569645；US 5565422；US 5516448；US 5489392；US 5486303中，将所有文献通过引用并入本文。本发明的组合物或根据本发明制备的组合物包括清洁和/或处理组合物，包括但不限于用于在织物和家居护理领域中处理织物、硬表面和任何其他表面的组合物，包括：空气护理(包括空气清新剂和气味递送系统)、汽车护理、餐具洗涤、织物调节(包括软化和/或清新)、洗衣去垢、洗衣和漂洗添加剂和/或护理、硬表面清洁和/或处理(包括地板和马桶清洁剂)、颗粒或粉末形式通用型或“重垢”洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊剂形式的全效洗涤剂，尤其是所谓的重垢液体类型；液体精细织物洗涤剂；手洗餐具洗涤剂或轻垢餐具洗涤剂，尤其是高起泡类型的那些；机器餐具洗涤剂，包括用于供家庭和公共机构使用的不同的片剂、颗粒、液体和漂洗助剂类型：汽车或地毯香波，浴室清洁剂(包括马桶清洁剂)；以及清洁辅助剂，例如漂白添加剂以及“去污棒”或预处理类型、装载底物的组合物(例如添加干燥剂的片层)。优选的是用于清洁和/或处理纺织品和/或硬表面(最优选为纺织品)的组合物和方法。组合物优选地是在洗涤过程的预处理步骤中或主要洗涤步骤中(最优选用于纺织品洗涤步骤)使用的组合物。
如本文使用的，术语“织物和/或硬表面清洁和/或处理组合物”是清洁和处理组合物的子集，除非另外指出，所述子集包括颗粒或粉末形式通用型或“重垢”洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊剂形式的全效洗涤剂，尤其是所谓的重垢液体类型；液体精细织物洗涤剂；手洗餐具洗涤剂或轻垢餐具洗涤剂，尤其是高起泡类型的那些；机器餐具洗涤剂，包括用于供家庭和公共机构使用的不同的片剂、颗粒、液体和漂洗助剂类型；液体清洁和消毒剂，汽车或地毯香波，浴室清洁剂(包括马桶清洁剂)；织物调节组合物(包括软化和/或清新)，可以呈液体、固体和/或干燥剂片层形式；以及清洁辅助剂，例如漂白添加剂以及“去污棒”或预处理类型、装载底物的组合物(例如添加干燥剂的片层)。所有的可应用的此类组合物可以呈标准的、浓缩的或甚至高度浓缩的形式，甚至到此类组合物可以在某些方面呈非水性的程度。
使用方法
本发明包括在织物和/或家居护理领域中用于清洁任何表面(包括处理纺织品或硬表面或其他表面)的方法。考虑了如所述的清洁可以处于小规模(例如家庭家务(familyhousehold))连同处于大规模(例如工业和专业环境)两者。
在本发明的一个方面，该方法包括在洗涤过程的预处理步骤或主要洗涤步骤(最优选用于在纺织品洗涤步骤中使用或可替代地用于在餐具洗涤(包括手动以及自动/机械餐具洗涤两者)中使用)中接触有待处理的表面的步骤。
在本发明的一个实施例中，将脂肪酶变体和其他组分顺序地添加至用于清洁和/或处理表面的方法中。可替代地，同时地添加本发明的脂肪酶变体和其他组分。
如本文使用的，洗涤包括但不限于擦洗和机械搅拌。洗涤可以用泡沫组合物进行(如WO 08/101958中所述的)，和/或通过施加交变压力(压力/真空)作为擦洗和机械搅拌的附加方法或替代方案来进行。对此类表面或织物进行干燥可以通过在家庭或工业环境中采用的通用手段中的任一种来完成。
本发明的清洁组合物理想地适用于在洗衣以及餐具洗涤应用(ADW或HDW)中使用。相应地，本发明包括用于清洁物体(包括但不限于织物、餐具、刀具以及厨具)的方法。该方法包括使待清洁的物体与所述清洁组合物接触的步骤，该清洁组合物包含至少一种本发明的清洁组合物、清洁添加剂或其混合物。织物可以包含能够在常规消费者或公共机构使用条件下被洗涤的任何织物。所述溶液可以具有从8至10.5的pH。可以在溶液中以从500至15.000ppm的浓度使用本发明的组合物。水温范围典型地是从5℃至90℃。水与织物之比典型地是从1:1至30:1。
在一个方面，本发明涉及一种用于水解脂肪酶底物的方法，该方法包括在有利于本发明的脂肪酶变体水解底物的条件下将该底物与该脂肪酶变体或本发明的组合物混合。
在另一方面，本发明涉及一种用于从表面去除脂质污渍材料的方法，该方法包括在有利于本发明的脂肪酶变体水解该脂质污渍材料的条件下使该脂质污渍材料与该脂肪酶变体或本发明的组合物接触。
在另一方面，本发明涉及用于一种用于从表面去除脂质污渍的方法，该方法包括：将所述污渍与本发明的脂肪酶变体或本发明的组合物接触，随后漂洗该表面，并且任选地干燥，在该方法中，与其中亲本脂肪酶(特别地分别为SEQ ID NO:2、4、6或8之一)与污渍接触的方法相比，气味产生减少。
在一个方面，本发明涉及本发明的脂肪酶变体或本发明的组合物用于清洁表面的用途，该用途包括将该脂肪酶变体应用于待清洁的表面，漂洗该表面，以及任选地干燥该表面。
根据本发明，脂肪酶变体用于清洁表面的用途包括：将本发明的脂肪酶变体或本发明的组合物应用于所述待清洁的表面，漂洗该表面，并且任选地干燥，其中当与其中将亲本脂肪酶(特别地SEQ ID NO:2、4、6或8中的一个)应用于该待清洁的表面的用途相比时，气味产生减少。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的脂肪酶变体的多核苷酸。
多核苷酸可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA、合成RNA、mRNA或它们的组合。
在一个方面，多核苷酸是分离的。在另一方面，多核苷酸是纯化的。
核酸构建体
本发明还涉及核酸构建体，其包含编码本发明的脂肪酶变体的多核苷酸。在优选的实施例中，核酸构建体包含编码本发明的脂肪酶变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中表达。
可以按多种方式来操纵多核苷酸以提供变体的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操纵可能是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
启动子
控制序列可以是启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明的变体的多核苷酸进行表达的多核苷酸。启动子含有介导变体的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变启动子、截短启动子和杂合启动子，并且可以获得自编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因。
用于指导本发明的多核苷酸在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从曲霉属(Aspergillus)、镰孢属、根毛霉属(Rhizomucor)和木霉属(Trichoderma)细胞获得的启动子，如Mukherjee等人,2013,“Trichoderma:Biology and Applications[木霉属：生物学和应用]”中以及Schmoll和2016,“Gene Expression Systems inFungi:Advancements and Applications[真菌中的基因表达系统：进展和应用]”,FungalBiology[真菌生物学]所述的启动子。
终止子
控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。终止子可操作地连接至编码变体的多核苷酸的3'末端。在宿主细胞中有功能的任何终止子均可用于本发明中。
丝状真菌宿主细胞的优选终止子可从曲霉属或木霉属物种获得，如从黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖淀粉酶、里氏木霉(Trichoderma reesei)β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I和里氏木霉内切葡聚糖酶I的基因获得，如Mukherjee等人,2013,“Trichoderma:Biology and Applications[木霉属：生物学和应用]”中以及Schmoll和2016,“Gene Expression Systems in Fungi:Advancements andApplications[真菌中的基因表达系统：进展和应用]”,Fungal Biology[真菌生物学]所述的终止子。
mRNA稳定剂
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区域，其增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定子区域的实例获得自苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人,1995,J.Bacteriol.[细菌学杂志]177:3465-3471)。
真菌细胞的mRNA稳定子区域的实例描述于Geisberg等人,2014,Cell[细胞]156(4):812-824以及Morozov等人,2006,Eukaryotic Cell[真核细胞]5(11):1838-1846中。
前导序列
控制序列也可以是前导序列，即对宿主细胞翻译很重要的mRNA的非翻译区域。前导序列可操作地连接至编码变体的多核苷酸的5'末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。
丝状真菌宿主细胞的优选前导序列可从以下项的基因获得：米曲霉(Aspergillusoryzae)TAKA淀粉酶和构巢曲霉(Aspergillus nidulans)磷酸丙糖异构酶。
多腺苷酸化序列
控制序列还可以是多腺苷酸化序列，即，与多核苷酸的3’-末端可操作地连接并且当转录时由宿主细胞识别为将多腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何多腺苷酸化序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列从以下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
信号肽
控制序列还可以是信号肽编码区域，该编码区域编码与变体的N-末端连接的信号肽，并且指导该变体进入细胞的分泌途径。多核苷酸的编码序列的5'-端可以固有地含有信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码该变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，编码序列的5'端可以含有对编码序列而言外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地含有信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地替代天然信号肽编码序列，以便增强变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下项的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶，如由Xu等人,2018,Biotechnology Letters[生物技术快报]40:949-955描述的信号肽。
前肽
控制序列还可以是编码位于变体的N-末端处的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割前肽而被转化成活性变体。前肽编码序列可从以下基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉虫漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子。
在信号肽和前肽序列两者都存在的情况下，将前肽序列紧邻变体的N-末端定位并且将信号肽序列紧邻该前肽序列的N-末端定位。
调节序列
还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节变体的表达的调节序列。调节序列的实例是引起基因表达以响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些。
在丝状真菌中，可使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子和里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是使基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。
转录因子
控制序列也可以是转录因子，即编码多核苷酸特异性DNA结合多肽的多核苷酸，其通过与特定多核苷酸序列结合来控制遗传信息从DNA到mRNA的转录速率。转录因子可单独发挥作用和/或与复合物中的一种或多种其他多肽或转录因子一起通过促进或阻断RNA聚合酶的募集而发挥作用。转录因子的特征在于包含至少一个DNA结合结构域，该结合结构域通常附接到与由转录因子调节的遗传元件相邻的特定DNA序列。转录因子可直接(即通过与其启动子结合来激活编码目的蛋白的基因的转录)或间接(即如通过与另外的转录因子(其调节编码目的蛋白的基因的转录)的启动子结合来激活另外的转录因子的转录)调节目的蛋白的表达。真菌宿主细胞的合适转录因子描述于WO 2017/144177中。原核宿主细胞的合适转录因子描述于Seshasayee等人,2011,Subcellular Biochemistry[亚细胞生物化学]52:7-23以及Balleza等人,2009,FEMS Microbiol.Rev.[FEMS微生物学综述]33(1):133-151中。
表达载体
本发明还涉及重组表达载体，这些重组表达载体包含编码本发明的变体的多核苷酸。在优选的实施例中，包含编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。
各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个合宜的限制位点以允许在此类位点处插入或取代编码变体的多核苷酸。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列如此位于载体中，使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单个载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。
载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。
载体优选地含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的至少一个元件。
为了整合到宿主细胞基因组中，载体可依赖于编码多肽的多核苷酸序列或用于通过同源重组(如同源定向修复(HDR))或非同源重组(如非同源末端连接(NHEJ))整合到基因组中的载体的任何其他元件。
为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，该复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
可将本发明多核苷酸的多于一个拷贝插入宿主细胞以提高多肽的生产。例如，将2个或3个或4个或5个或更多个拷贝插入宿主细胞。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数量，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含本发明的多核苷酸。在优选的实施例中，包含本发明的多核苷酸的该重组宿主细胞可操作地连接至指导本发明脂肪酶变体的产生的一个或多个调控序列。
将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持，如较早前所述。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码变体的基因及其来源。重组宿主细胞可包含本发明的多核苷酸的单拷贝或至少两个拷贝，例如三个、四个、五个或更多个拷贝。
宿主细胞可以是可用于重组产生本发明的变体的任何细胞，例如原核细胞或真菌细胞。
宿主细胞可以是可用于重组产生本发明的多肽的任何微生物细胞，例如原核细胞或真菌细胞。
宿主细胞优选地可以是真菌细胞。如本文所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如由以下所定义的：Hawksworth等人,于,Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi[安斯沃思和拜斯比真菌词典],第8版,1995,CAB International[国际应用生物科学中心],UniversityPress[大学出版社],英国剑桥)。
真菌细胞可通过涉及原生质体介导的转化、土壤杆菌介导的转化、电穿孔、基因枪方法和冲击波介导的转化的过程(如Li等人,2017,Microbial Cell Factories[微生物细胞工厂]16:168中所综述)以及EP 238023，Yelton等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474；Christensen等人,1988,Bio/Technology[生物技术]6:1419-1422以及Lubertozzi和Keasling,2009,Biotechn.Advances[生物技术进展]27:53-75中所述的程序来转化。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入真菌宿主细胞中的任何方法，并且DNA可以作为线性化或环状多核苷酸引入。
真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人,1995,同上所定义的)。丝状真菌一般的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、和其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸来进行的，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)来进行的，而碳分解代谢可以是发酵性的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、篮状菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)、或木霉属(Trichoderma)细胞。在优选的实施例中，丝状真菌宿主细胞是曲霉属、木霉属或镰孢属细胞。在另外优选的实施例中，丝状真菌宿主细胞是黑曲霉、米曲霉、里氏木霉或镶片镰孢(Fusarium venenatum)细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管霉(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡菌(Ceriporiopsis gilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsis rivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、女王杜香金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporiumtropicum)、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、谷类镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑根毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉胞菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、埃默森篮状菌、土生梭孢霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。
在一个方面，宿主细胞是分离的。在另一方面，宿主细胞是纯化的。
产生方法
本发明还涉及产生本发明的脂肪酶变体的方法，这些方法包括
a.在有助于产生变体的条件下培养本发明的重组宿主细胞；以及
b.任选地回收该变体。
使用本领域已知的方法在适用于产生本发明的脂肪酶变体的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在合适的培养基中并在允许变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养细胞。合适的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果变体被分泌到营养培养基中，则变体可以直接从培养基回收。如果变体没有分泌，则它可以从细胞裂解液中回收。
可使用本领域已知的对变体特异的方法来检测变体，包括但不限于使用特异性抗体、酶产物形成、酶底物消失或者确定变体的相对活性或比活性的酶测定法。
可使用本领域已知的方法从培养基中回收变体，包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。在一个方面，回收全发酵液。在另一方面，回收包含多肽的无细胞发酵液。
变体可以通过本领域已知的多种程序来纯化，以获得基本上纯的变体和/或片段(参见例如，Wingfield,2015,Current Protocols in Protein Science[蛋白质科学的最新方案]；80(1):6.1.1-6.1.35；Labrou,2014,Protein Downstream Processing[蛋白质下游加工],1129:3-10)。
在可替代的方面，不回收变体。
在一个方面，本发明涉及一种洗涤衣物的方法，该方法包括以下步骤：
i)通过将该衣物用本发明的脂肪酶、本发明的颗粒、本发明的液体组合物或本发明的组合物进行洗涤；
ii)漂洗该衣物；以及任选地
iii)干燥该衣物。
在优选的实施例中，步骤i)中的洗涤循环在约8-11的pH进行，并且漂洗步骤ii)在约6-8，优选地约7的pH进行。
在优选的实施例中，洗涤周期和/或漂洗步骤在水性溶液中进行。
在优选的实施例中，步骤i)中的洗涤循环在10℃-90℃之间进行，特别地在20℃和40℃之间或在50℃和70℃之间进行。
用途
在一个方面，本发明涉及本发明的脂肪酶变体或本发明的组合物用于清洁表面的用途，该用途包括将该脂肪酶变体应用于待清洁的表面。
在实施例中，本发明涉及本发明的脂肪酶变体用于清洁表面的用途，该用途包括：用本发明的脂肪酶变体、本发明的颗粒、本发明的液体组合物或本发明的组合物处理所述待清洁的表面。
通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应理解为对本发明的范围进行限制。
在以下编号的段落中描述了本发明：
1.一种脂肪酶变体，其选自包含以下的组(i)、(ii)和(iii)中的一个或多个：
(i)在对应于SEQ ID NO:8的多肽的位置202、252和269的一个或多个位置处的取代；
(ii)在对应于SEQ ID NO:8的多肽的位置40、56、57、91、98、108、118、210、244和254的一个或多个位置处的取代；以及
(iii)在对应于SEQ ID NO:8的多肽的位置23、27、40、51、56、60、118、244和256的一个或多个位置处的取代；
其中该变体具有脂肪酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:8的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性，但小于100％的序列同一性，其中该变体任选地在N-末端和/或C-末端处包含一个或多个氨基酸延伸，或在N-末端和/或C-末端处包含一个或多个氨基酸截短，并且其中该变体具有脂肪酶活性。
2.如段落1所述的变体，该变体包含对应于SEQ ID NO:8中的这些位置的一个或多个取代，特别地所有取代，或由其组成，这些取代选自由以下组成的组：
H对位置202处的氨基酸残基进行的取代；
H对位置252处的氨基酸残基进行的取代；以及
H对位置269处的氨基酸残基进行的取代。
3.如段落1或2所述的变体，其中该变体包含以下取代组中的一个，或由其组成：202H+252H；202H+269H；252H+269H；或202H+252H+269H。
4.如段落1-3中任一项所述的变体，该变体包含对应于SEQ ID NO:8中的这些位置的一个或多个取代，特别地所有取代，或由其组成，这些取代选自由以下组成的组：
E对位置40处的氨基酸残基进行的取代；
R对位置56处的氨基酸残基进行的取代；
N对位置57处的氨基酸残基进行的取代；
T对位置91处的氨基酸残基进行的取代；
E对位置98处的氨基酸残基进行的取代；
K对位置108处的氨基酸残基进行的取代；
F对位置118处的氨基酸残基进行的取代；
K对位置210处的氨基酸残基进行的取代；
E对位置244处的氨基酸残基进行的取代；以及
S对位置254处的氨基酸残基进行的取代。
5.如段落1-4中任一项所述的变体，该变体包含对应于SEQ ID NO:8中的这些位置的一个或多个取代，特别地所有取代，或由其组成，这些取代选自由以下组成的组：
S对位置23处的氨基酸残基进行的取代；
N对位置27处的氨基酸残基进行的取代；
I对位置40处的氨基酸残基进行的取代；
I对位置51处的氨基酸残基进行的取代；
R对位置56处的氨基酸残基进行的取代；
K对位置60处的氨基酸残基进行的取代；
F对位置118处的氨基酸残基进行的取代；
E对位置244处的氨基酸残基进行的取代；以及
T对位置256处的氨基酸残基进行的取代。
6.如段落1-5中任一项所述的变体，其中该变体具有对应于SEQ ID NO:8的I202H的取代，并且进一步包含对应于以下的以下取代或取代组中的一个：
A40E、E56R、D57N、G91T、K98E、R108K、R118F、E210K、T244E、D254SA40E+E56R、A40E+D57N、A40E+G91T、A40E+K98E、A40E+R108K、A40E+R118F、A40E+E210K、A40E+T244E、A40E+D254S、E56R+D57N、E56R+G91T、E56R+K98E、E56R+R108K、E56R+R118F、E56R+E210K、E56R+T244E、E56R+D254S、D57N+G91T、D57N+K98E、D57N+R108K、D57N+R118F、D57N+E210K、D57N+T244E、D57N+D254S、G91T+K98E、G91T+R108K、G91T+R118F、G91T+E210K、G91T+T244E、G91T+D254S、K98E+R108K、K98E+R118F、K98E+E210K、K98E+T244E、K98E+D254S、R108K+R118F、R108K+E210K、R108K+T244E、R108K+D254S、R118F+E210K、R118F+T244E、R118F+D254S、E210K+T244E、E210K+D254S、T244E+D254S、A40E+E56R+D57N、A40E+E56R+G91T、A40E+E56R+K98E、A40E+E56R+R108K、A40E+E56R+R118F、A40E+E56R+E210K、A40E+E56R+T244E、A40E+E56R+D254S、A40E+D57N+G91T、A40E+D57N+K98E、A40E+D57N+R108K、A40E+D57N+R118F、A40E+D57N+E210K、A40E+D57N+T244E、A40E+D57N+D254S、A40E+G91T+K98E、A40E+G91T+R108K、A40E+G91T+R118F、A40E+G91T+E210K、A40E+G91T+T244E、A40E+G91T+D254S、A40E+K98E+R108K、A40E+K98E+R118F、A40E+K98E+E210K、A40E+K98E+T244E、A40E+K98E+D254S、A40E+R108K+R118F、A40E+R108K+E210K、A40E+R108K+T244E、A40E+R108K+D254S、A40E+R118F+E210K、A40E+R118F+T244E、A40E+R118F+D254S、A40E+E210K+T244E、A40E+E210K+D254S、A40E+T244E+D254S、E56R+D57N+G91T、E56R+D57N+K98E、E56R+D57N+R108K、E56R+D57N+R118F、E56R+D57N+E210K、E56R+D57N+T244E、E56R+D57N+D254S、E56R+G91T+K98E、E56R+G91T+R108K、E56R+G91T+R118F、E56R+G91T+E210K、E56R+G91T+T244E、E56R+G91T+D254S、E56R+K98E+R108K、E56R+K98E+R118F、E56R+K98E+E210K、E56R+K98E+T244E、E56R+K98E+D254S、E56R+R108K+R118F、E56R+R108K+E210K、E56R+R108K+T244E、E56R+R108K+D254S、E56R+R118F+E210K、E56R+R118F+T244E、E56R+R118F+D254S、E56R+E210K+T244E、E56R+E210K+D254S、E56R+T244E+D254S、D57N+G91T+K98E、D57N+G91T+R108K、D57N+G91T+R118F、D57N+G91T+E210K、D57N+G91T+T244E、D57N+G91T+D254S、D57N+K98E+R108K、D57N+K98E+R118F、D57N+K98E+E210K、D57N+K98E+T244E、D57N+K98E+D254S、D57N+R108K+R118F、D57N+R108K+E210K、D57N+R108K+T244E、D57N+R108K+D254S、D57N+R118F+E210K、D57N+R118F+T244E、D57N+R118F+D254S、D57N+E210K+T244E、D57N+E210K+D254S、D57N+T244E+D254S、G91T+K98E+R108K、G91T+K98E+R118F、G91T+K98E+E210K、G91T+K98E+T244E、G91T+K98E+D254S、G91T+R108K+R118F、G91T+R108K+E210K、G91T+R108K+T244E、G91T+R108K+D254S、G91T+R118F+E210K、G91T+R118F+T244E、G91T+R118F+D254S、G91T+E210K+T244E、G91T+E210K+D254S、G91T+T244E+D254S、K98E+R108K+R118F、K98E+R108K+E210K、K98E+R108K+T244E、K98E+R108K+D254S、K98E+R118F+E210K、K98E+R118F+T244E、K98E+R118F+D254S、K98E+E210K+T244E、K98E+E210K+D254S、K98E+T244E+D254S、R108K+R118F+E210K、R108K+R118F+T244E、R108K+R118F+D254S、R108K+E210K+T244E、R108K+E210K+D254S、R108K+T244E+D254S、R118F+E210K+T244E、R118F+E210K+D254S、R118F+T244E+D254S、E210K+T244E+D254S、A40E+E56R+D57N+G91T、A40E+E56R+D57N+K98E、A40E+E56R+D57N+R108K、A40E+E56R+D57N+R118F、A40E+E56R+D57N+E210K、A40E+E56R+D57N+T244E、A40E+E56R+D57N+D254S、A40E+E56R+G91T+K98E、A40E+E56R+G91T+R108K、A40E+E56R+G91T+R118F、A40E+E56R+G91T+E210K、A40E+E56R+G91T+T244E、A40E+E56R+G91T+D254S、A40E+E56R+K98E+R108K、A40E+E56R+K98E+R118F、A40E+E56R+K98E+E210K、A40E+E56R+K98E+T244E、A40E+E56R+K98E+D254S、A40E+E56R+R108K+R118F、A40E+E56R+R108K+E210K、A40E+E56R+R108K+T244E、A40E+E56R+R108K+D254S、A40E+E56R+R118F+E210K、A40E+E56R+R118F+T244E、A40E+E56R+R118F+D254S、A40E+E56R+E210K+T244E、A40E+E56R+E210K+D254S、A40E+E56R+T244E+D254S、A40E+D57N+G91T+K98E、A40E+D57N+G91T+R108K、A40E+D57N+G91T+R118F、A40E+D57N+G91T+E210K、A40E+D57N+G91T+T244E、A40E+D57N+G91T+D254S、A40E+D57N+K98E+R108K、A40E+D57N+K98E+R118F、A40E+D57N+K98E+E210K、A40E+D57N+K98E+T244E、A40E+D57N+K98E+D254S、A40E+D57N+R108K+R118F、A40E+D57N+R108K+E210K、A40E+D57N+R108K+T244E、A40E+D57N+R108K+D254S、A40E+D57N+R118F+E210K、A40E+D57N+R118F+T244E、A40E+D57N+R118F+D254S、A40E+D57N+E210K+T244E、A40E+D57N+E210K+D254S、A40E+D57N+T244E+D254S、A40E+G91T+K98E+R108K、A40E+G91T+K98E+R118F、A40E+G91T+K98E+E210K、A40E+G91T+K98E+T244E、A40E+G91T+K98E+D254S、A40E+G91T+R108K+R118F、A40E+G91T+R108K+E210K、A40E+G91T+R108K+T244E、A40E+G91T+R108K+D254S、A40E+G91T+R118F+E210K、A40E+G91T+R118F+T244E、A40E+G91T+R118F+D254S、A40E+G91T+E210K+T244E、A40E+G91T+E210K+D254S、A40E+G91T+T244E+D254S、A40E+K98E+R108K+R118F、A40E+K98E+R108K+E210K、A40E+K98E+R108K+T244E、A40E+K98E+R108K+D254S、A40E+K98E+R118F+E210K、A40E+K98E+R118F+T244E、A40E+K98E+R118F+D254S、A40E+K98E+E210K+T244E、A40E+K98E+E210K+D254S、A40E+K98E+T244E+D254S、A40E+R108K+R118F+E210K、A40E+R108K+R118F+T244E、A40E+R108K+R118F+D254S、A40E+R108K+E210K+T244E、A40E+R108K+E210K+D254S、A40E+R108K+T244E+D254S、A40E+R118F+E210K+T244E、A40E+R118F+E210K+D254S、A40E+R118F+T244E+D254S、A40E+E210K+T244E+D254S、E56R+D57N+G91T+K98E、E56R+D57N+G91T+R108K、E56R+D57N+G91T+R118F、E56R+D57N+G91T+E210K、E56R+D57N+G91T+T244E、E56R+D57N+G91T+D254S、E56R+D57N+K98E+R108K、E56R+D57N+K98E+R118F、E56R+D57N+K98E+E210K、E56R+D57N+K98E+T244E、E56R+D57N+K98E+D254S、E56R+D57N+R108K+R118F、E56R+D57N+R108K+E210K、E56R+D57N+R108K+T244E、E56R+D57N+R108K+D254S、E56R+D57N+R118F+E210K、E56R+D57N+R118F+T244E、E56R+D57N+R118F+D254S、E56R+D57N+E210K+T244E、E56R+D57N+E210K+D254S、E56R+D57N+T244E+D254S、E56R+G91T+K98E+R108K、E56R+G91T+K98E+R118F、E56R+G91T+K98E+E210K、E56R+G91T+K98E+T244E、E56R+G91T+K98E+D254S、E56R+G91T+R108K+R118F、E56R+G91T+R108K+E210K、E56R+G91T+R108K+T244E、E56R+G91T+R108K+D254S、E56R+G91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7.如段落1-5中任一项所述的变体，其中该变体具有对应于SEQ ID NO:8的I252H的取代，并且进一步包含对应于以下的以下取代或取代组中的一个：
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8.如段落1-5中任一项所述的变体，其中该变体具有对应于SEQ ID NO:8的L269H的取代，并且进一步包含对应于以下的以下取代或取代组中的一个：
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9.如段落1-5中任一项所述的变体，其中该变体具有对应于SEQ ID NO:8的I202H的取代，并且进一步包含对应于以下的以下取代或取代组中的一个：
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10.如段落1-5中任一项所述的变体，其中该变体具有对应于SEQ ID NO:8的I252H的取代，并且进一步包含对应于以下的以下取代或取代组中的一个：
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11.如段落1-5中任一项所述的变体，其中该变体具有对应于SEQ ID NO:8的L269H的取代，并且进一步包含对应于以下的以下取代或取代组中的一个：
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+E56R+V60K+T244E+P256T、D27N+A40I+E56R+R118F+T244E+P256T、D27N+A40I+V60K+R118F+T244E+P256T、D27N+F51I+E56R+V60K+R118F+T244E、D27N+F51I+E56R+V60K+R118F+P256T、D27N+F51I+E56R+V60K+T244E+P256T、D27N+F51I+E56R+R118F+T244E+P256T、D27N+F51I+V60K+R118F+T244E+P256T、D27N+E56R+V60K+R118F+T244E+P256T、A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T244E、A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+P256T、A40I+F51I+E56R+V60K+T244E+P256T、A40I+F51I+E56R+R118F+T244E+P256T、A40I+F51I+V60K+R118F+T244E+P256T、A40I+E56R+V60K+R118F+T244E+P256T、F51I+E56R+V60K+R118F+T244E+P256T、G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F、G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+T244E、G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+P256T、G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T244E、G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+P256T、G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+T244E+P256T、G23S+D27N+A40I+F51I+V60K+R118F+T244E、G23S+D27N+A40I+F51I+V60K+R118F+P256T、G23S+D27N+A40I+F51I+V60K+T244E+P256T、G23S+D27N+A40I+F51I+R118F+T244E+P256T、G23S+D27N+A40I+E56R+V60K+R118F+T244E、G23S+D27N+A40I+E56R+V60K+R118F+P256T、G23S+D27N+A40I+E56R+V60K+T244E+P256T、G23S+D27N+A40I+E56R+R118F+T244E+P256T、G23S+D27N+A40I+V60K+R118F+T244E+P256T、G23S+D27N+F51I+E56R+V60K+R118F+T244E、G23S+D27N+F51I+E56R+V60K+R118F+P256T、G23S+D27N+F51I+E56R+V60K+T244E+P256T、G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T244E+P256T、G23S+D27N+F51I+V60K+R118F+T244E+P256T、G23S+D27N+E56R+V60K+R118F+T244E+P256T、G23S+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T244E、G23S+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+P256T、G23S+A40I+F51I+E56R+V60K+T244E+P256T、G23S+A40I+F51I+E56R+R118F+T244E+P256T、G23S+A40I+F51I+V60K+R118F+T244E+P256T、G23S+A40I+E56R+V60K+R118F+T244E+P256T、G23S+F51I+E56R+V60K+R118F+T244E+P256T、D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T244E、D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+P256T、D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+T244E+P256T、D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T244E+P256T、D27N+A40I+F51I+V60K+R118F+T244E+P256T、D27N+A40I+E56R+V60K+R118F+T244E+P256T、D27N+F51I+E56R+V60K+R118F+T244E+P256T、A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T244E+P256T、G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T244E、G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+P256T、G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+T244E+P256T、G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T244E+P256T、G23S+D27N+A40I+F51I+V60K+R118F+T244E+P256T、G23S+D27N+A40I+E56R+V60K+R118F+T244E+P256T、G23S+D27N+F51I+E56R+V60K+R118F+T244E+P256T、G23S+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T244E+P256T、D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T244E+P256T、G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T244E+P256T。
12.如段落1-11中任一项所述的变体，其中该变体包含对应于以下的以下取代组中的一个，或由其组成：
A40E+E56R+D57N+G91T+K98E+R108K+R118F+E210K+T244E+D254S+I202H、
A40E+E56R+D57N+G91T+K98E+R108K+R118F+E210K+T244E+D254S+I252H、
A40E+E56R+D57N+G91T+K98E+R108K+R118F+E210K+T244E+D254S+L269H、
A40E+E56R+D57N+G91T+K98E+R108K+R118F+E210K+T244E+D254S+I202H+I252H、
A40E+E56R+D57N+G91T+K98E+R108K+R118F+E210K+T244E+D254S+I202H+L269H、
A40E+E56R+D57N+G91T+K98E+R108K+R118F+E210K+T244E+D254S+I252H+L269H、
A40E+E56R+D57N+G91T+K98E+R108K+R118F+E210K+T244E+D254S+I252H+L269H(使用SEQ ID NO:8进行编号)。
13.如段落1-12中任一项所述的变体，其中该变体包含对应于以下的以下取代组中的一个，或由其组成：
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T244E+P256T+I202H、
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T244E+P256T+I252H、
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T244E+P256T+L269H、
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T244E+P256T+I202H+I252H、
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T244E+P256T+I202H+L269H、
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T244E+P256T+I252H+L269H、
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T244E+P256T+I202H+H252H+L269H(使用SEQ ID NO:8进行编号)。
14.如段落1-13中任一项所述的变体，该变体进一步包含对应于以下的一个或多个取代：F7K、F51I、F51L、F51V、F51Y、H198D、H198G、H198F、H198I、H198L、H198N、H198S、H198T、H198Y、N200Q、S224F、S224P、L227D、L227E、L227R、V228P、V230R、I255G、I255N、A257F和A257I(使用SEQ ID NO:8进行编号)。
15.如段落1-14中任一项所述的变体，其中与亲本脂肪酶，特别地分别为SEQ IDNO:2、4、6或8相比，该脂肪酶变体在中性左右的pH，即约pH 6-8，优选地约pH 7具有降低的脂肪酶活性和/或减少的气味产生，和/或具有增加的效益风险因子(BRF)。
16.一种颗粒，该颗粒包含：
(a)包含如段落1-15中任一项所述的变体的核心，和任选地
(b)由包围该核心的一个或多个层组成的包衣。
17.一种颗粒，该颗粒包含：
(a)核心，和
(b)由包围该核心的一个或多个层组成的包衣，其中该包衣包含如段落1-15中任一项所述的变体。
18.一种液体组合物，该液体组合物包含如段落1-15中任一项所述的变体和酶稳定剂，例如多元醇如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、可逆蛋白酶抑制剂、硼酸或硼酸衍生物，例如芳族硼酸酯或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸。
19.如段落18所述的液体组合物，该液体组合物进一步包含填料或运载体材料。
20.如段落18或19所述的液体组合物，该液体组合物进一步包含防腐剂。
21.一种组合物，该组合物包含如段落1-15中任一项所述的变体、如段落16或17所述的颗粒、或如段落18-20中任一项所述的液体组合物。
22.如段落21所述的组合物，其中该组合物包含一种或多种表面活性剂。
23.如段落21或22所述的组合物，其中该一种或多种表面活性剂以从0.1至60wt％、从0.2至40wt％、从0.5至30wt％、从1至50wt％、从1至40wt％、从1至30wt％、从1至20wt％、从3至10wt％、从3至5wt％、从5至40wt％、从5至30wt％、从5至15wt％、从3至20wt％、从3至10wt％、从8至12wt％、从10至12wt％、从20至25wt％或从25-60wt％的水平存在。
24.如段落21-23中任一项所述的组合物，其中该组合物包含一种或多种表面活性剂，其中该一种或多种表面活性剂选自非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、兼性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂、及其混合物。
25.如段落21-24中任一项所述的组合物，其中该组合物包含一种或多种阴离子表面活性剂和/或一种或多种非离子表面活性剂。
26.如段落21-25中任一项所述的组合物，其中该组合物包含一种或多种阴离子表面活性剂，优选地直链烷基苯磺酸(LAS)、醇醚硫酸盐(AEOS)和/或烷基硫酸盐(AS)，特别地月桂基硫酸钠(SLS)。
27.如段落21-26中任一项所述的组合物，其中该组合物包含一种或多种非离子表面活性剂，优选地醇乙氧基化物(AEO)，特别地直链醇(C12-15)乙氧基化物。
28.如段落21-27中任一项所述的组合物，其中该组合物包含一种或多种阴离子表面活性剂和一种或多种非离子表面活性剂。
29.如段落21-28中任一项所述的组合物，其中该组合物包含阴离子表面活性剂直链烷基苯磺酸(LAS)和非离子表面活性剂醇乙氧基化物(AEO)。
30.如段落21-29中任一项所述的组合物，其中该组合物进一步包含选自下组的一种或多种组分：助洗剂、螯合试剂、染料转移抑制试剂、分散剂、酶、以及酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸、聚合物分散剂、粘土去除/抗再沉积剂、增亮剂、泡沫抑制剂、染料、调色染料、香料、香料递送系统、结构弹力剂、织物软化剂、载体、水溶助剂、加工助剂、溶剂和/或颜料。
31.如段落21-30中任一项所述的组合物，其中将该组合物配制为规则的、压缩的或浓缩的液体；凝胶；膏；皂条；规则的或压缩的粉末；颗粒状固体；具有两个或更多个层(相同或不同相)的均匀或多层片剂；具有一个或多个室的袋；单个或多个室单位剂型；或其任何组合。
32.如段落21-31中任一项所述的组合物，其中与亲本脂肪酶，特别地分别为SEQID NO:2、4、6或8相比，该组合物在中性左右的pH，即约pH 6-8，优选地约pH 7具有降低的脂肪酶活性和/或减少的气味产生，和/或具有增加的效益风险因子(BRF)。
33.一种多核苷酸，该多核苷酸编码如段落1-15中任一项所述的变体。
34.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含如段落33所述的多核苷酸。
35.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞用如段落33所述的多核苷酸转化。
36.一种产生脂肪酶变体的方法，该方法包括：
a.在适用于表达该变体的条件下培养如段落35所述的重组宿主细胞；以及
b.任选地回收该变体。
37.一种用于水解脂肪酶底物的方法，该方法包括在有利于如段落1至15中任一项所述的脂肪酶变体水解该底物的条件下将该底物与该脂肪酶变体，或段落21至32中任一项所述的组合物混合。
38.一种用于从表面去除脂质污渍材料的方法，该方法包括在有利于如段落1至15中任一项所述的脂肪酶变体水解该脂质污渍材料的条件下，使该脂质污渍材料与该脂肪酶变体或如段落21至32中任一项所述的组合物接触。
39.一种用于从表面去除脂质污渍的方法，该方法包括：使所述污渍与如段落1至15中任一项所述的脂肪酶变体，或如段落21至32中任一项所述的组合物接触，随后漂洗该表面，并且任选地干燥。
40.一种用于从表面去除脂质污渍的方法，该方法包括：将所述污渍与如段落1至15中任一项所述的脂肪酶变体，或如段落21至32中任一项所述的组合物接触，随后漂洗该表面，并且任选地干燥，在该方法中，当与其中将亲本脂肪酶，特别地分别为SEQ ID NO:2、4、6或8之一与该污渍接触的方法相比时，气味产生减少。
41.一种用于洗涤衣物的方法，该方法包括以下步骤：
i)通过将所述衣物用如段落1-15中任一项所述的脂肪酶、如段落16或17中任一项所述的颗粒、如段落18-20中任一项所述的液体组合物、或如段落21-32中任一项所述的组合物进行洗涤；
ii)漂洗该衣物；以及
iii)任选地干燥该衣物。
42.如段落41所述的方法，其中步骤i)中的洗涤循环在约8-11的pH进行，并且漂洗步骤ii)在约6-8，优选地约7的pH进行。
43.如段落41或42所述的方法，其中该洗涤周期和/或漂洗步骤在水性溶液中进行。
44.如段落41-43中任一项所述的方法，其中该步骤i)中的洗涤循环在10℃-90℃之间，特别地20℃和40℃之间或50℃和70℃之间进行。
45.如段落1至15中任一项所述的脂肪酶变体、如段落16或17中任一项所述的颗粒、如段落18-20中任一项所述的液体组合物、或如段落21至32中任一项所述的组合物用于清洁表面的用途，该用途包括将该脂肪酶变体应用于待清洁的表面。
46.脂肪酶变体用于清洁表面的用途，该用途包括：用如段落1-15中任一项所述的脂肪酶变体、如段落16或17中任一项所述的颗粒、如段落18-20中任一项所述的液体组合物、或如段落21-32中任一项所述的组合物处理所述待清洁的表面。
材料与方法
标准洗涤剂A2(液体)
组合物洗涤剂 活性物含量
直链烷基苯磺酸钠(Na-LAS) 12.0％
月桂基乙醚硫酸钠(SLES) 4.1％
具有7mol EO的醇乙氧基化物(AEO) 12.0％
拔顶棕榈仁脂肪酸 3.0％
氢氧化钠 0.5％
乙醇 6.0％
丙二醇(MPG) 2.0％
三乙醇胺(TEA) 2.0％
柠檬酸三钠二水合物 3.9％
二亚乙基三胺五(亚甲基)五(膦酸)，七钠盐(DTPMP Na7) 1.6％
2-苯氧乙醇 0.5％
水(脱矿质) 添加至100％
目标pH 8.2-8.6 8.4
Terg-O-tometer(TOM)
Terg-O-tometer(TOM)是一种中等规模标准洗涤系统，它可以应用于同时测试12种不同的洗涤条件。TOM基本上是大型温控水浴，其中浸入了多达12个开口金属烧杯。每个烧杯构成一个小的顶装式洗衣机并且在实验期间，每个烧杯将含有特定洗涤剂/酶系统的溶液并且在弄脏的和未弄脏的织物上测试其性能。通过旋转搅拌臂获得机械应力，该旋转搅拌臂搅拌在每个烧杯内的液体。因为TOM烧杯没有盖子，所以能够在TOM实验期间收回样品并且在洗涤期间在线分析信息。
实例
实例1
脂肪酶His-变体的生长和脂肪酶对硝基苯基(pNP)活性测定。
将表达脂肪酶变体的米曲霉菌株接种于在96孔MTP中的具有0.5％尿素的200μlMDU2培养基中。将板在有湿布的盒子中(以避免干燥)，在30℃孵育4天，不进行振荡。
孵育后，从每个长满的孔中取出含有表达的脂肪酶变体的培养基。
将每个孔中的10μl培养基稀释于90ml缓冲液(50mM Tris pH7.0、50mM TrispH9.0或50mM甘氨酸缓冲液pH10)中。
如下确定经稀释的培养基中的脂肪酶活性：将200μl的1mM pNP-棕榈酸酯溶液(50mM Tris pH7.0、50mM Tris pH9.0或50mM甘氨酸缓冲液pH10加0.4％ TritonX-100和10mM CaCl2中)添加到96孔MTP中的10μl的经稀释的培养基中。还用水硬度为15°dH的3.3g/L标准洗涤剂A2中的1mM pNP-棕榈酸酯溶液进行活性测量。该活性通过测量405nm处吸光度的增加量(由于pNP(对-硝基苯酚)的释放)来测量。确定了线性范围内初始活性的斜率，作为在给定pH的给定比活性的指示。斜率越陡，脂肪酶变体的活性就越大。
实例2
在pH7和pH9的His-变体的脂肪酶活性
本实验的目的是证明与在更高的pH相比，约中性pH的脂肪酶活性降低。
测试重复三次，结果如下(Vmax-数据)。
数据表明与pH 9相比，I202H、I252H和L269H变体在pH 7的脂肪酶活性降低。这表明洗涤周期期间的脂肪酶活性(和气味产生)高于漂洗周期期间的脂肪酶活性(和气味产生)。
实例3
洗涤性能、气味产生和His-变体的BRF
融化猪油，并将100μL猪油施加于5x 5cm的棉织物小块布样(WFK80A，100％棉，蓝色)上，并在100℃孵育20分钟。冷却后，将这些小块布样在分析天平上称重。
将四个小块布样使用3.3g标准洗涤剂A2和0.05mg脂肪酶/L洗涤溶液，在Terg-O-tometer洗涤机中进行洗涤。水硬度为15°dH Ca++/Mg++/HCO3-(比率为4:1:7.5)。将这些小块布样在20℃，120rpm，pH 8.2(洗涤前和洗涤后)洗涤20分钟，并且然后在流动的自来水下在5L烧杯中漂洗(漂洗后pH 7.4)。
在洗涤和漂洗后，将小块布样在100℃孵育20分钟，并在冷却后，将这些小块布样在分析天平上称重。
洗涤测试由每个处理的两个重复组成。
如下计算脂肪去除：
脂肪去除％＝((洗涤前猪油污染的小块布样的重量)-(洗涤后猪油污染的小块布样的重量))/((洗涤前猪油污染的小块布样的重量)-(污染前小块布样的重量))
测量了洗涤性能和气味产生，并且计算了效益风险因子(BRF)关系。
与气味相比，性能越好，关系就越好。模板(SEQ ID NO:8)设为1.0。
突变 洗涤性能 气味产生 BRF
SEQ ID NO:8(亲本) 1.0 1.0 1.0
SEQ ID NO:8+I202H 0.70 0.30 2.3
SEQ ID NO:8+I252H 0.85 0.61 1.4
SEQ ID NO:8+L269H 0.93 0.56 1.7
实例4
脂肪酶His-变体的生长和在pH7和pH10的His-变体的pNP-测定
将表达脂肪酶变体的米曲霉菌株接种于在96孔MTP中的具有0.5％尿素的200μlMDU2培养基中。将板在有湿布的盒子中(以避免干燥)，在30℃孵育4天，不进行振荡。
孵育后，从每个长满的孔中取出含有表达的脂肪酶变体的培养基。将每个孔中的10μl培养基稀释于90ml缓冲液(50mM Tris pH7.0或50mM甘氨酸缓冲液pH10)中。
如下确定经稀释的培养基中的活性：将200μl的1mM pNP-棕榈酸酯溶液(50mMTris pH7.0或50mM甘氨酸缓冲液pH10加0.4％ TritonX-100和10mM CaCl2)添加到96孔MTP中的10μl的经稀释的培养基中。该活性通过测量405nm处吸光度的增加量(由于pNP(对-硝基苯酚)的释放)来测量。确定了线性范围内初始活性的斜率，作为在给定pH的给定比活性的指示。斜率越陡，脂肪酶变体的活性就越大。
本文描述和要求保护的本发明不限于本文披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明几个方面的说明。任何等同方面旨在处于本发明的范围之内。实际上，除本文所示和描述的那些之外，本发明的各种修改因前述说明而对本领域的技术人员变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。

Claims (15)

1.一种脂肪酶变体，其选自包含以下的组(i)、(ii)和(iii)中的一个或多个：
(i)在对应于SEQ ID NO:8的多肽的位置252、202和269的一个或多个位置处的取代；
(ii)在对应于SEQ ID NO:8的多肽的位置40、56、57、91、98、108、118、210、244和254的一个或多个位置处的取代；以及
(iii)在对应于SEQ ID NO:8的多肽的位置23、27、40、51、56、60、118、244和256的一个或多个位置处的取代；
其中该变体具有脂肪酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:8的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性，但小于100％的序列同一性，其中该变体任选地在N-末端和/或C-末端处包含一个或多个氨基酸延伸，或在N-末端和/或C-末端处包含一个或多个氨基酸截短，并且其中该变体具有脂肪酶活性。
2.如权利要求1所述的变体，该变体包含对应于SEQ ID NO:8中的这些位置的一个或多个取代，特别地所有取代，或由其组成，这些取代选自由以下组成的组：
H对位置202处的氨基酸残基进行的取代；
H对位置252处的氨基酸残基进行的取代；以及
H对位置269处的氨基酸残基进行的取代；或
其中该变体包含以下取代组中的一个，或由其组成：202H+252H；202H+269H；252H+269H；或202H+252H+269H。
3.如权利要求1-2中任一项所述的变体，该变体包含对应于SEQ ID NO:8中的这些位置的一个或多个取代，特别地所有取代，或由其组成，这些取代选自由以下组成的组：
E对位置40处的氨基酸残基进行的取代；
R对位置56处的氨基酸残基进行的取代；
N对位置57处的氨基酸残基进行的取代；
T对位置91处的氨基酸残基进行的取代；
E对位置98处的氨基酸残基进行的取代；
K对位置108处的氨基酸残基进行的取代；
F对位置118处的氨基酸残基进行的取代；
K对位置210处的氨基酸残基进行的取代；
E对位置244处的氨基酸残基进行的取代；以及
S对位置254处的氨基酸残基进行的取代。
4.如权利要求1-3中任一项所述的变体，该变体包含对应于SEQ ID NO:8中的这些位置的一个或多个取代，特别地所有取代，或由其组成，这些取代选自由以下组成的组：
S对位置23处的氨基酸残基进行的取代；
N对位置27处的氨基酸残基进行的取代；
I对位置40处的氨基酸残基进行的取代；
I对位置51处的氨基酸残基进行的取代；
R对位置56处的氨基酸残基进行的取代；
K对位置60处的氨基酸残基进行的取代；
F对位置118处的氨基酸残基进行的取代；
E对位置244处的氨基酸残基进行的取代；以及
T对位置256处的氨基酸残基进行的取代。
5.如权利要求1-4中任一项所述的变体，其中与亲本脂肪酶，特别地分别为SEQ ID NO:2、4、6或8相比，该脂肪酶变体在中性左右的pH，即约pH 6-8，优选地约pH 7具有降低的脂肪酶活性和/或减少的气味产生，和/或具有增加的效益风险因子(BRF)。
6.一种颗粒，该颗粒包含：
(a)包含如权利要求1-5中任一项所述的变体的核心，和任选地
(b)由包围该核心的一个或多个层组成的包衣，或
该颗粒包含：
(a)核心，和
(b)由包围该核心的一个或多个层组成的包衣，其中该包衣包含如权利要求1-5中任一项所述的变体。
7.一种液体组合物，该液体组合物包含如权利要求1-5中任一项所述的变体和酶稳定剂，例如多元醇如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、可逆蛋白酶抑制剂、硼酸或硼酸衍生物，例如芳族硼酸酯或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸。
8.一种组合物，该组合物包含如权利要求1-5中任一项所述的变体、如权利要求6所述的颗粒、或如权利要求7所述的液体组合物。
9.一种多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求1-5中任一项所述的变体。
10.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含如权利要求9所述的多核苷酸。
11.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞用如权利要求9所述的多核苷酸转化。
12.一种产生脂肪酶变体的方法，该方法包括：
a.在适用于表达该变体的条件下培养如权利要求11所述的重组宿主细胞；以及
b.任选地回收该变体。
13.一种用于水解脂肪酶底物的方法，该方法包括在有利于如权利要求1至5中任一项所述的脂肪酶变体水解该底物的条件下将该底物与该脂肪酶变体或如权利要求8所述的组合物混合。
14.一种用于从表面去除脂质污渍的方法，该方法包括：使所述污渍与如权利要求1至5中任一项所述的脂肪酶变体或如权利要求8所述的组合物接触，随后漂洗该表面，并且任选地干燥。
15.一种用于洗涤衣物的方法，该方法包括以下步骤：
i)通过将所述衣物用如权利要求1-5中任一项所述的脂肪酶、如权利要求6所述的颗粒、如权利要求7所述的液体组合物、或如权利要求8所述的组合物进行洗涤；
ii)漂洗该衣物；以及
iii)任选地干燥该衣物。
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