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CN116096883A - Angptl3的碱基编辑和使用其治疗疾病的方法 - Google Patents

Angptl3的碱基编辑和使用其治疗疾病的方法

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Publication number
CN116096883A
CN116096883A CN202180041917.4A CN202180041917A CN116096883A CN 116096883 A CN116096883 A CN 116096883A CN 202180041917 A CN202180041917 A CN 202180041917A CN 116096883 A CN116096883 A CN 116096883A
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CN
China
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composition
administered
editing
cynomolgus monkeys
guide rna
Prior art date
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Pending
Application number
CN202180041917.4A
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English (en)
Inventor
亚历山德拉·查德威克
卡兰特赫塔西尔·G·拉杰夫
埃伦·罗德
克里斯多佛·程
卡罗琳·瑞斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Weihu Medical Co ltd
Original Assignee
Weihu Medical Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Weihu Medical Co ltd filed Critical Weihu Medical Co ltd
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Pending legal-status Critical Current

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Abstract

本文提供了用于基因修饰或编辑的组合物及其治疗或预防某些病症的使用方法。公开了能够安全且有效地编辑肝脏中表达的基因靶标以持久地降低LDL‑C、从而治疗心血管疾病的主要病因的特定组合物和方法。

Description

ANGPTL3的碱基编辑和使用其治疗疾病的方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119要求于2020年4月9日提交的临时申请序列号63/007,803；于2020年4月9日提交的临时申请序列号63/007,797；于2021年1月11日提交的临时申请序列号63/136,087；于2020年6月26日提交的临时申请序列号63/045,032；于2020年6月26日提交的临时申请序列号63/045,033的权益，其公开内容通过引用以其全文并入本文。
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子递交的序列表并且所述序列表特此通过引用以其全文并入。创建于2021年4月8日的所述ASCII副本经命名为53989_711_601_SL.txt，并且大小是1,105,762字节。
技术领域
本文提供了用于基因修饰或编辑的组合物及其使用方法，所述方法能够治疗或预防某些病症，诸如心血管疾病和与其相关联的病症或疾病，诸如糖尿病。
背景技术
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，就好像每个单独的出版物、专利或专利申请被明确地并单独地指示通过引用并入一样。这并不是承认本文明确地或隐含地引用的任何出版物或信息是现有技术或必然与要求保护的主题相关。在通过引用并入的出版物或专利或专利申请与说明书中包含的公开内容相矛盾或不一致的情况下，此类引用或并入的参考文献应被视为对本公开的补充，并理解说明书旨在替代和/或优先于任何不可协调的不一致或矛盾的材料。
发明内容
本申请中公开的发明性主题涉及能够编辑多核苷酸或靶基因的组合物以及这些组合物的使用方法。所述组合物及其组成组分，单独地和组合地，被认为是本发明性主题的独立方面，其可以通过本文所述的它们各自的物理和/或功能属性以任何组合而不受限制地定义和要求保护。本发明性主题的广度、特异性和变化通过这里总结的具体方面进一步说明。
本文所述的发明性主题的一个重要方面涉及心血管疾病(CVD)的治疗，根据世界卫生组织统计，所述疾病是世界范围内的主要死因，造成近三分之一的死亡。CVD也是预期寿命减少的主要原因，并且是护理最昂贵的健康病症之一。根据美国疾病控制与预防中心(CDC)，CVD是一个巨大的经济负担，每年使美国医疗保健系统付出超过3200亿美元的年度成本和生产力损失。CVD总体上是指心脏和血管的疾病，其被诊断为动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)或心肌病等。ASCVD是CVD的一大子集，其中胆固醇驱动动脉粥样硬化性斑块的发展，所述动脉粥样硬化性斑块是血管壁中导致动脉硬化的胆固醇、细胞和细胞碎片的混合物。当前治疗和预防ASCVD的基础是降低血脂的累积暴露，这旨在尽可能长时间地将低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C，通常称为“坏”胆固醇)和/或甘油三酯维持尽可能低。例如，有大量证据表明，在足够长的时间段内将LDL-C维持在足够低水平的个体发展ASCVD的可能性要小得多。降低LDL-C与减少ASCVD之间的关系在医学中是被理解得最好的关系之一。已经显示，在确诊ASCVD的患者中在5年内将LDL-C降低39mg/dL使ASCVD风险降低21％，而在一生中在相同程度上将LDL-C降低39mg/dL使首次ASCVD事件的风险降低88％。当前的护理标准是慢性护理模式，其通常需要每天服用大量丸剂和/或进行间歇性注射，并且经常不能充分控制LDL-C的累积暴露。尽管可以获得此类慢性护理疗法，但在许多患有ASCVD的患者中，LDL-C的累积暴露经常没有得到充分的控制，并且很大一部分确诊ASCVD的个体的LDL-C水平高于建议目标。较高的累积LDL-C暴露导致胆固醇斑块在心脏或颈部动脉中加速积聚，并且其破裂可能导致心脏病发作、心脏死亡、中风并且需要侵入性医疗程序，诸如冠状动脉内支架置入术和冠状动脉搭桥手术。
本文公开的一方面是能够安全且有效地编辑肝脏中表达的基因靶标以持久地降低LDL-C和/或甘油三酯、从而治疗CVD诸如ASCVD的组合物和方法。
本文公开的另一方面是当作为单程或单剂量(一次性完成)疗法、以重复或连续剂量和组合基因编辑疗法剂量施用时本文所述的基因编辑组合物的功效和安全性。本文所述的组合物的功效和安全性在本文所述的涉及各种细胞和动物实验(包括小鼠和非人灵长类动物实验)的体外和体内研究中示出，并且在这些研究中所表示的本文公开的组合物的结果或性能各自构成本发明的各个方面。
本文公开的组合物和方法的另一方面涉及在基因中进行编辑的位置，包括例如涉及在剪接位点中编辑基因的组合物和方法。
本文公开的组合物和方法的另一方面是组成指导RNA(gRNA)和碱基编辑器，其构成能够在单个碱基对处精确编辑基因而不在靶基因中赋予双链断裂的组合物。这些gRNA和碱基编辑器(包括表达并编码碱基编辑器的核苷酸或mRNA序列)的组合物和使用方法构成又一方面。
本文公开的另一方面是封装gRNA和碱基编辑器药物物质的脂质纳米颗粒(LNP)配制品、LNP的选择以及单独和作为LNP的一部分的药物物质组合物的各种组分之间的相对比例。
本文公开的另一方面涉及基因编辑组合物，诸如本文所述的那些基因编辑组合物的给药，以及给药和重复给药对于功效和安全性概况标记的影响。
本文公开的另一方面是所述组合物和使用方法包括被设计来靶向或编辑特定基因诸如PCSK9、ANGPTL3、APOC3和/或Lp(a)和/或对于由这些基因表达的蛋白质的蛋白质水平具有影响的实施方式。
在一个方面，本文提供了一种用于编辑基因靶标的组合物，包含：(i)碱基编辑器融合蛋白，所述碱基编辑器融合蛋白包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶，或编码其的mRNA，(ii)指导RNA，所述指导RNA包含tracr序列和间隔子序列，所述tracr序列用作所述碱基编辑器融合蛋白的结合支架，所述间隔子序列对应于ANGPTL3基因上的原间隔子(protospacer)，其中所述指导RNA引导所述碱基编辑器融合蛋白在施用给哺乳动物对象时在体内实现所述ANGPTL3基因中的核碱基改变，其中当所述指导RNA和所述mRNA以至少0.5mg/kg的总量施用时，所述碱基改变发生在所述哺乳动物对象的全部肝细胞的至少35％中，如通过下一代测序或桑格(Sanger)测序所测量。在一些实施方案中，所述哺乳动物对象是食蟹猴，其中当所述指导RNA和所述mRNA以约1mg/kg的总量施用时，所述碱基改变发生在所述食蟹猴的全部肝细胞的至少35％中，如通过下一代测序或桑格测序所测量。在一些实施方案中，所述哺乳动物对象是食蟹猴，其中当所述指导RNA和所述mRNA以约3mg/kg的总量施用时，所述碱基改变发生在所述食蟹猴的全部肝细胞的至少50％中，如通过下一代测序或桑格测序所测量。在一些实施方案中，与所述施用前相比，所述核碱基改变导致所述食蟹猴中血液甘油三酯水平降低至少20％。在一些实施方案中，与所述施用前相比，所述核碱基改变导致所述食蟹猴中血液甘油三酯水平降低至少50％。在一些实施方案中，所述原间隔子位于剪接位点中。在一些实施方案中，所述原间隔子互补序列位于所述ANGPTL3基因的反义链中。在一些实施方案中，所述原间隔子互补序列位于所述ANGPTL3基因的有义链中。在一些实施方案中，所述碱基改变发生在所述ANGPTL3基因上的所述原间隔子之外(脱靶位点)，其中表14中列出的脱靶位点的编辑百分比分别低于或等于表14中列出的编辑百分比。在一些实施方案中，所述脱氨酶是腺嘌呤脱氨酶并且其中所述核碱基改变是A·T到G·C的改变。在一些实施方案中，所述可编程DNA结合结构域包含核酸酶活性丧失的Cas9或Cas9切口酶。在一些实施方案中，所述核碱基改变位于所述ANGPTL3基因的剪接位点处。在一些实施方案中，所述核碱基改变位于所述ANGPTL3基因的剪接供体位点处。在一些实施方案中，所述剪接供体位点位于如SEQ ID NO:7中所引用的ANGPTL3内含子6的5’末端。在一些实施方案中，所述核碱基改变位于所述ANGPTL3基因的剪接受体位点处。在一些实施方案中，所述核碱基改变导致由所述ANGPTL3基因编码的转录物中的移码、提前终止密码子、插入或缺失。在一些实施方案中，所述核碱基改变导致由所述ANGPTL3基因编码的异常转录物。在一些实施方案中，所述指导RNA经化学修饰。在一些实施方案中，所述指导RNA的tracr序列按照图7中描绘的方案进行化学修饰。在一些实施方案中，所述间隔子序列包含表1中列出的ANGPTL3 ABE指导RNA间隔子序列。在一些实施方案中，所述指导RNA包含如表1中所列出的GA067、GA091、GA098、GA099、GA100、GA101、GA102、GA103、GA347、GA441、GA442、GA472、GA473、GA474、GA475、GA476、GA517或GA547的ANGPTL3 ABE指导RNA序列。在一些实施方案中，所述原间隔子序列包含表1中列出的ANGPTL3 ABE原间隔子序列。在一些实施方案中，所述原间隔子包含序列5’-AAGATACCTGAATAACTCTC-3’(SEQ ID No:14)、5’-AAGATACCTGAATAACCCTC-3’(SEQ ID No:15)、5’-GATACCTGAATAACTCTC-3’(SEQ ID No:1606)、5’-AGATACCTGAATAACCCTC-3’(SEQ ID No:248)或5’-GATACCTGAATAACCCTC-3’(SEQID No:249)。在一些实施方案中，所述碱基编辑器融合蛋白包含SEQ ID No:2137的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述mRNA序列的GC％含量大于50％。在一些实施方案中，所述mRNA序列的GC％含量大于56％。在一些实施方案中，所述mRNA序列的GC％含量大于或等于63％。在一些实施方案中，所述mRNA包含腺嘌呤tTNA脱氨酶(TadA)区域、Cas9区域和核定位序列(NLS)区域。在一些实施方案中，所述mRNA进一步包含将所述TadA区域和所述Cas9区域连接的第一接头区域，以及将所述Cas9区域和所述NLS区域连接的第二接头区域。在一些实施方案中，所述TadA区域的GC％含量大于60％。在一些实施方案中，所述TadA区域的GC％含量大于或等于70％。在一些实施方案中，所述Cas9区域的GC％含量大于56％。在一些实施方案中，所述Cas9区域的GC％含量大于或等于62％。在一些实施方案中，所述NLS区域的GC％含量大于54％。在一些实施方案中，所述NLS区域的GC％含量大于或等于63％。在一些实施方案中，所述第一接头区域的GC％含量大于65％。在一些实施方案中，所述第一接头区域的GC％含量大于或等于79％。在一些实施方案中，所述第二接头区域的GC％含量大于67％。在一些实施方案中，所述第二接头区域的GC％含量大于或等于83％。在一些实施方案中，所述TadA区域的GC％含量大于60％，所述Cas9区域的GC％含量大于56％，所述NLS区域的GC％含量大于54％，所述第一接头区域的GC％含量大于65％，并且所述第二接头区域的GC％含量大于67％。在一些实施方案中，所述mRNA包含选自表23的mRNA序列。在一些实施方案中，所述mRNA包含SEQ ID No:2136的mRNA序列。在一些实施方案中，所述mRNA包含多聚A尾。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含包封(i)的脂质纳米颗粒(LNP)。在一些实施方案中，所述LNP进一步包封(ii)。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含包封(ii)的第二LNP。在一些实施方案中，所述指导RNA和编码所述碱基编辑器融合蛋白的所述mRNA的重量比率为约1:10至约10:1。在一些实施方案中，所述指导RNA与编码所述碱基编辑器融合蛋白的所述mRNA的重量比率为约1:1、1.5:1、2:1、3:1、4:1、1:1.5、1:2、1:3或1:4。在一些实施方案中，所述指导RNA和编码所述碱基编辑器融合蛋白的所述mRNA的重量比率为约1:1。
在另一方面，本文提供了一种药物组合物，包含如本文所提供的组合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
在另一方面，本文提供了一种用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的如本文所提供的组合物。在一些实施方案中，所述施用是通过静脉内输注。在一些实施方案中，所述方法包括顺序施用包封(i)的LNP和包封(ii)的LNP。在一些实施方案中，所述方法包括并行施用所述包封(i)的LNP和所述包封(ii)的LNP。在一些实施方案中，所述方法包括施用单剂量的所述包封(ii)的LNP，然后在1天的间隔中施用交错剂量的所述包封(i)的LNP。在一些实施方案中，所述方法包括施用单剂量的所述包封(ii)的LNP，然后在2天的间隔中施用交错剂量的所述包封(i)的LNP。在一些实施方案中，所述方法包括施用单剂量的所述包封(ii)的LNP，然后在3天的间隔中施用交错剂量的所述包封(i)的LNP。在一些实施方案中，所述方法包括施用单剂量的所述包封(ii)的LNP，然后在4天的间隔中施用交错剂量的所述包封(i)的LNP。在一些实施方案中，所述方法包括施用单剂量的所述包封(ii)的LNP，然后在5天的间隔中施用交错剂量的所述包封(i)的LNP。在一些实施方案中，所述方法包括施用单剂量的所述包封(ii)的LNP，然后在6天的间隔中施用交错剂量的所述包封(i)的LNP。在一些实施方案中，所述方法包括施用单剂量的所述包封(ii)的LNP，然后在7天的间隔中施用交错剂量的所述包封(i)的LNP。在一些实施方案中，所述方法包括施用单剂量的所述包封(i)和(ii)的LNP。在一些实施方案中，所述LNP的所述单剂量为约0.3至约3mg/kg。在一些实施方案中，所述方法包括向所述对象施用一个或多个治疗的疗程，其中所述一个或多个治疗中的每一个包括一个或多个所述单剂量的所述LNP。在一些实施方案中，所述方法包括施用两个至十个治疗的疗程。在一些实施方案中，所述方法包括施用两个至五个治疗的疗程。在一些实施方案中，所述方法包括施用两个治疗的疗程。在一些实施方案中，所述方法包括施用三个治疗的疗程。在一些实施方案中，所述方法包括施用四个治疗的疗程。在一些实施方案中，所述方法包括施用五个治疗的疗程。在一些实施方案中，所述方法包括所述病症是动脉粥样硬化性心血管疾病。在一些实施方案中，所述病症是动脉粥样硬化性血管疾病。在一些实施方案中，所述对象是人。
在另一方面，本文提供了一种用于编辑基因靶标的组合物，包含：(i)碱基编辑器融合蛋白，所述碱基编辑器融合蛋白包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶，或编码其的mRNA，(ii)指导RNA，所述指导RNA包含tracr序列和间隔子序列，所述tracr序列用作所述碱基编辑器融合蛋白的结合支架，所述间隔子序列对应于ANGPTL3基因上的原间隔子，其中所述指导RNA引导所述碱基编辑器融合蛋白在施用给哺乳动物对象时在体内实现所述ANGPTL3基因中的核碱基改变，并且其中所述指导RNA包含如表1中所列出的ANGPTL3ABE指导RNA序列。在另一方面，本文提供了一种用于编辑基因靶标的组合物，包含：(i)碱基编辑器融合蛋白，所述碱基编辑器融合蛋白包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶，或编码其的mRNA，(ii)指导RNA，所述指导RNA包含tracr序列和间隔子序列，所述tracr序列用作所述碱基编辑器融合蛋白的结合支架，所述间隔子序列对应于ANGPTL3基因上的原间隔子，其中所述指导RNA引导所述碱基编辑器融合蛋白在施用给哺乳动物对象时在体内实现所述ANGPTL3基因中的核碱基改变，并且其中所述mRNA包含选自表23的序列。
在另一个方面，本文提供了一种在有需要的对象中治疗或预防动脉粥样硬化性心血管疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的第一组合物和第二组合物，所述第一组合物包含(i)碱基编辑器融合蛋白，所述碱基编辑器融合蛋白包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶，或编码其的mRNA，(ii)指导RNA，所述指导RNA包含tracr序列和间隔子序列，所述tracr序列用作所述碱基编辑器融合蛋白的结合支架，所述间隔子序列对应于PCSK9基因上的原间隔子，其中所述指导RNA引导所述碱基编辑器融合蛋白在施用给哺乳动物对象时在体内实现所述PCSK9基因中的核碱基改变，其中当所述指导RNA和所述mRNA以至少0.5mg/kg的总量施用时，所述碱基改变发生在所述哺乳动物对象的全部肝细胞的至少35％中，如通过下一代测序或桑格测序所测量；所述第二组合物包含(i)碱基编辑器融合蛋白，所述碱基编辑器融合蛋白包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶，或编码其的mRNA，(ii)指导RNA，所述指导RNA包含tracr序列和间隔子序列，所述tracr序列用作所述碱基编辑器融合蛋白的结合支架，所述间隔子序列对应于ANGPTL3基因上的原间隔子，其中所述指导RNA引导所述碱基编辑器融合蛋白在施用给哺乳动物对象时在体内实现所述ANGPTL3基因中的核碱基改变，其中当所述指导RNA和所述mRNA以至少1mg/kg的总量施用时，所述碱基改变发生在所述哺乳动物对象的全部肝细胞的至少35％中，如通过下一代测序或桑格测序所测量。在一些实施方案中，所述方法包括顺序施用所述第一组合物和所述第二组合物。在一些实施方案中，所述方法包括施用一个或多个剂量的所述第一组合物，随后施用一个或多个剂量的所述第二组合物。在一些实施方案中，所述方法包括施用一个或多个剂量的所述第二组合物，随后施用一个或多个剂量的所述第一组合物。在一些实施方案中，所述方法包括并行施用所述第一组合物和所述第二组合物。在一些实施方案中，所述方法包括一个或多个剂量的所述第一组合物和所述第二组合物。
在另一个方面，本文提供了一种用于编辑基因靶标的组合物，包含：(i)碱基编辑器融合蛋白，所述碱基编辑器融合蛋白包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶，或编码其的mRNA，(ii)指导RNA，所述指导RNA包含tracr序列和间隔子序列，所述tracr序列用作所述碱基编辑器融合蛋白的结合支架，所述间隔子序列对应于ANGPTL3基因上的原间隔子，其中所述指导RNA引导所述碱基编辑器融合蛋白在体外实现所述ANGPTL3基因中的核碱基改变，其中当所述指导RNA和所述mRNA以至少0.5mg/kg的总量施用时，所述碱基改变发生在所述哺乳动物对象的全部肝细胞的至少35％中，如通过下一代测序或桑格测序所测量。在一些实施方案中，当所述指导RNA和所述mRNA以至少1mg/kg的总量施用时，所述碱基改变发生在所述哺乳动物对象的全部肝细胞的至少40％中，如通过下一代测序或桑格测序所测量。在一些实施方案中，当所述指导RNA和所述mRNA以至少1.5mg/kg的总量施用时，所述碱基改变发生在所述哺乳动物对象的全部肝细胞的至少45％中，如通过下一代测序或桑格测序所测量。在一些实施方案中，当所述指导RNA和所述mRNA以至少2mg/kg的总量施用时，所述碱基改变发生在所述哺乳动物对象的全部肝细胞的至少50％中，如通过下一代测序或桑格测序所测量。在一些实施方案中，当所述指导RNA和所述mRNA以至少2.5mg/kg的总量施用时，所述碱基改变发生在所述哺乳动物对象的全部肝细胞的至少55％中，如通过下一代测序或桑格测序所测量。在一些实施方案中，当所述指导RNA和所述mRNA以至少3mg/kg的总量施用时，所述碱基改变发生在所述哺乳动物对象的全部肝细胞的至少60％中，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
在另一个方面，本文提供了一种用于编辑ANGPTL3基因的组合物，包含：(a)mRNA，所述mRNA编码具有编辑窗口的腺嘌呤碱基编辑器蛋白，和(b)指导RNA，所述指导RNA包含tracr序列和间隔子序列，所述tracr序列用作所述碱基编辑器蛋白的结合支架，所述间隔子序列用于将所述碱基编辑器蛋白指引至ANGPTL3基因上的原间隔子序列，其中所述间隔子序列至少部分地与所述ANGPTL3基因的剪接位点或外显子区域互补。在一些实施方案中，当所述碱基编辑器蛋白与所述指导RNA可操作地结合并且所述指导RNA与所述ANGPTL3基因上的所述原间隔子序列的互补链杂交时，所述编辑窗口涵盖所述ANGPTL3基因的所述剪接位点。在一些实施方案中，当所述碱基编辑器蛋白与所述指导RNA可操作地结合并且所述指导RNA与所述ANGPTL3基因上的所述原间隔子序列的互补链杂交时，所述编辑窗口涵盖所述ANGPTL3基因的内含子的区域。在一些实施方案中，当所述碱基编辑器蛋白与所述指导RNA可操作地结合并且所述指导RNA与所述ANGPTL3基因上的所述原间隔子序列的互补链杂交时，所述编辑窗口涵盖所述ANGPTL3基因的内含子1、内含子3或内含子4的区域。在一些实施方案中，当所述碱基编辑器蛋白与所述指导RNA可操作地结合并且所述指导RNA与所述ANGPTL3基因上的所述原间隔子序列的互补链杂交时，所述编辑窗口涵盖所述ANGPTL3基因的内含子1的区域。在一些实施方案中，所述间隔子序列与选自经鉴定为GA067、GA100和GA574的指导RNA序列的间隔子序列具有80％-100％核苷酸序列同一性。在一些实施方案中，所述tracr序列与选自经鉴定为GA067、GA091、GA098、GA099、GA100、GA101、GA102、GA103、GA347、GA441、GA442、GA472、GA473、GA474、GA475、GA476、GA517和GA547的指导RNA序列的tracr序列具有80％-100％核苷酸序列同一性。在一些实施方案中，所述mRNA与经鉴定为MA002、MA004、MA040、MA0041或MA045的mRNA序列具有80％-100％序列同一性。在一些实施方案中，所述mRNA具有下表中列出的GC核苷酸区域百分比中的一个或多个：
核苷酸区域 平均GC核苷酸含量
27-213 67-73％
389-661 67-71％
735-829 63-74％
4207-4286 67-70％
4537-4569 65-73％
4683-4741 62-67％
在一些实施方案中，所述mRNA具有下表中列出的GC核苷酸区域百分比中的一个或多个：
Figure BDA0003991453200000111
Figure BDA0003991453200000121
在一些实施方案中，所述mRNA和gRNA被封装在脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，所述mRNA和gRNA被封装在脂质纳米颗粒中，所述脂质纳米颗粒具有以下项：
LNP组合物(mol％)：
40-65％iLipid
2-20％DSPC
1-5％PEG
剩余的mol％余量是胆固醇；
LNP粒径：55-120nm Z平均流体动力学直径；和
通过动态光散射确定的多分散性指数<0.2。
在一些实施方案中，所述mRNA和gRNA被封装在LNP粒径为50-70nm Z平均流体动力学直径的脂质纳米颗粒内。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于40％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于50％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于30％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于40％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于50％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于60％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于70％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于40％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于50％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于60％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于70％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于80％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于40％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于50％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于60％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于70％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于80％。在一些实施方案中，在给药后15天时经由所述猴的肝脏活检或尸检通过分析经给药的食蟹猴肝脏来确定所述编辑百分比。在一些实施方案中，通过对经给药的所述食蟹猴进行定期肝脏活检测试确定了所述编辑百分比得以在给药后至少168天的跨度内持久地保持。在一些实施方案中，通过对经给药的所述食蟹猴进行定期肝脏活检测试确定了所述编辑百分比得以在给药后至少300天的跨度内持久地保持。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少35％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少40％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg猴重量约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少50％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少60％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少70％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少80％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少35％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少40％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少50％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少60％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少70％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少80％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少35％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少40％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少50％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少60％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少70％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少80％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少35％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少40％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少50％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少60％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少70％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少80％。在一些实施方案中，在给药后15天时通过对经给药的食蟹猴的血液采样和分析来确定血浆蛋白的所述减少。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg猴重量约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少20％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少25％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少30％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少35％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少40％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少45％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少20％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少25％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少30％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少35％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少40％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少45％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少50％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少55％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少60％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少20％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少25％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少30％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少35％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少40％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少45％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少50％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少55％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少60％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少65％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少20％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少25％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少30％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少35％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少40％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少45％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少50％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少55％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少60％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少65％。在一些实施方案中，在给药后15天时通过对经给药的所述食蟹猴的血液采样和分析来确定甘油三酯水平的所述降低。在一些实施方案中，通过对经给药的食蟹猴进行定期血液采样和分析确定甘油三酯水平的所述降低得以在至少168天的跨度内持久地保持。在一些实施方案中，通过对经给药的所述食蟹猴进行定期血液采样和分析确定甘油三酯水平的所述降低得以在至少300天的跨度内持久地保持。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的脂蛋白(a)平均减少至少10％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的脂蛋白(a)水平平均降低至少15％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的脂蛋白(a)水平平均降低至少20％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的脂蛋白(a)水平平均降低至少25％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的脂蛋白(a)水平平均降低至少30％。在一些实施方案中，所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的脂蛋白(a)水平平均降低约35％。在一些实施方案中，在给药后15天时通过对经给药的所述食蟹猴的血液采样和分析来确定脂蛋白(a)的所述减少。在一些实施方案中，通过对经给药的所述食蟹猴进行定期血液采样和分析确定脂蛋白(a)的所述减少得以在至少224天的跨度内持久地保持。在一些实施方案中，通过对经给药的所述食蟹猴进行定期血液采样和分析确定脂蛋白(a)的减少得以在至少300天的跨度内持久地保持。在一些实施方案中，就对食蟹猴的给药导致AST、ALT或细胞因子升高而言，由所述组合物的给药引起的所述升高是短暂的并且在给药后3-15天内消退回至大约基线水平。在一些实施方案中，ANGPTL3的编辑百分比在肝、脾和肾上腺组织之外是可忽略的，如图27所示。在一些实施方案中，在ANGPTL3编辑百分比的编辑百分比方面，重复给药结果是相加的。在一些实施方案中，所述重复给药不引起细胞因子激活，也不引起免疫应答。在一些实施方案中，所述间隔子序列与所述ANGPTL3基因上的靶向的原间隔子的核苷酸序列具有至少80％的核苷酸相关性，其中如果所述间隔子序列上的RNA核苷酸与所述原间隔子的DNA核苷酸具有相同顺序的相同核苷酸，则所述RNA核苷酸与所述DNA核苷酸相关，并且其中出于确定相关性的目的将尿嘧啶碱基和胸腺嘧啶碱基认为是相同的核苷酸。在一些实施方案中，所述间隔子序列与所述ANGPTL3基因上的靶向的原间隔子的核苷酸序列具有至少85％的核苷酸相关性。在一些实施方案中，所述间隔子序列与所述ANGPTL3基因上的靶向的原间隔子的核苷酸序列具有至少90％的核苷酸相关性。在一些实施方案中，所述间隔子序列与所述ANGPTL3基因上的靶向的原间隔子的核苷酸序列具有至少95％的核苷酸相关性。在一些实施方案中，所述间隔子序列与所述ANGPTL3基因上的靶向的原间隔子的核苷酸序列具有至少99％的核苷酸相关性。在一些实施方案中，所述间隔子序列与所述ANGPTL3基因上的靶向的原间隔子的核苷酸序列具有至少100％的核苷酸相关性。
在另一方面，本文提供了一种在有需要的对象中治疗或预防动脉粥样硬化性心血管疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的(a)mRNA，所述mRNA编码具有编辑窗口的腺嘌呤碱基编辑器蛋白，(b)第一指导RNA，所述第一指导RNA包含tracr序列和间隔子序列，所述tracr序列用作所述碱基编辑器蛋白的结合支架，所述间隔子序列用于将所述碱基编辑器蛋白指引至PCSK9基因上的原间隔子序列，其中所述间隔子序列至少部分地与所述PCSK9基因的剪接位点或外显子区域互补；和(c)第二指导RNA，所述第二指导RNA包含tracr序列和间隔子序列，所述tracr序列用作所述碱基编辑器蛋白的结合支架，所述间隔子序列用于将所述碱基编辑器蛋白指引至ANGPTL3基因上的原间隔子序列，其中所述间隔子序列至少部分地与所述ANGPTL3基因的剪接位点或外显子区域互补。在一些实施方案中，所述方法进一步包括包封(a)的第一LNP。在一些实施方案中，所述第一LNP包封(b)和(c)。在一些实施方案中，重复施用所述第一LNP。在一些实施方案中，以一至六十天的间隔重复施用所述第一LNP。在一些实施方案中，以七天的间隔重复施用所述第一LNP。在一些实施方案中，所述第一LNP进一步包封(b)。在一些实施方案中，所述方法进一步包括包封(a)和(c)的第二LNP。在一些实施方案中，顺序施用所述第一LNP和所述第二LNP。在一些实施方案中，以一天至12个月的间隔顺序施用所述第一LNP和所述第二LNP。在一些实施方案中，所述间隔是一天。在一些实施方案中，所述间隔是五天。在一些实施方案中，所述间隔是十天。在一些实施方案中，所述间隔是十五天。在一些实施方案中，所述间隔是二十天。在一些实施方案中，所述间隔是二十五天。在一些实施方案中，所述间隔是一个月。在一些实施方案中，所述间隔是两个月。在一些实施方案中，所述间隔是三个月。在一些实施方案中，所述间隔是五个月。在一些实施方案中，所述间隔是八个月。在一些实施方案中，所述间隔是十个月。在一些实施方案中，所述间隔是十二个月。
附图说明
本申请的主题的特征、原理、优点和说明性实施方案、实施方式、分析和实例在包括所附权利要求的本文中列出，其各方面在附图中说明，在附图中：
图1A-图1C分别说明了Cas9、胞苷碱基编辑器(CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(ABE)的操作模式以及本申请中使用的相关术语，包括“原间隔子”、“PAM”、“间隔子”(Mali,P.等人2013Nat Methods 10,957-963；Anzalone,AV.2020Nat Biotechnol 38,824-844)。图1D是本文公开的mcPCSK9指导RNA(gRNA)-Tracr的设计示意图。示出了具有茎-环指导物分子内相互作用(茎上的W-C碱基配对)的核糖核蛋白(RNP)-单指导RNA(sgRNA)比对。gRNA的tracrRNA序列充当cas蛋白的结合支架。在设计gRNA时，环核苷酸可以与蛋白质比对，并且在gRNA-Tracr的设计中可以考虑每个核苷酸的碱基(H键)、糖部分的2’-羟基(2’-OH)、4’-氧(环氧)、磷酸酯键与蛋白质的氨基酸侧链的相互作用。RNP-空间相互作用内核苷酸的空间排列、容纳大体积取代像2’-O-甲基(2’-OMe)和硫代磷酸酯(PS)的空间也可以考虑在内。图1D按出现顺序分别公开了SEQ ID NO 70-71。
图2是描述在基于结构设计本文公开的gRNA时如何选择SpCas9晶体结构的两个表。上图是总结具有蛋白质数据库(PDB)ID和状态的CRISPR/Cas系统的不同组分的表。下图示出了比对之后每个结构的蛋白质链之间的均方根偏差(RMSD)值。RNP状态(4ZT0)和催化前三元复合物(5F9R)与确定与RNP形成相关的接触和与催化相关的接触最相关。蛋白质的一些重排发生在这两种状态之间。在apo状态与RNP之间的蛋白质中可能发生大量重排。
图3描绘了基于4ZT0和5F9R晶体结构的sgRNA的gRNA二级结构，其中sgRNA与SpCas9结合，作为单独的RNP或作为具有DNA的三元复合物的一部分。二级结构关系在Leontis和Westhof命名法中示出(RNA,2001,7,499-512)(SEQ ID NO:72)。
图4描绘了具有PCSK9间隔子的gRNA二级结构，其示出了基于RNP PDB 4ZT0预测的接触(sgRNA+SpCas9 RNP)。由于缺乏清楚的电子密度(SEQ ID NO:73)，位置1-10和位置83-100未在此晶体结构中建模。具有白色字母标记的黑色圆圈：蛋白质接触，具有黑色字母标记的浅灰色圆圈：空间位阻(如果并入2’-O-Me)或远距离接触，具有黑色字母标记的深灰色圆圈：RNA接触。如本领域技术人员将理解，如本文所用的术语“位阻”是指结构中物理上不太可能重叠的原子体积。在这些情况下并入2’O-Me修饰将潜在地导致一个或多个结构重排，这对于RNP功能可能是有害的。如本领域技术人员将理解，如本文所用的术语“接触”意指两个官能团之间的稳定非共价相互作用(例如，氢键)。
图5描绘了具有PCSK9间隔子的gRNA二级结构，其示出了基于PDB 5F9R预测的接触(催化前三元复合物)(SEQ ID NO:74)。具有白色字母标记的黑色圆圈：蛋白质接触，具有黑色字母标记的浅灰色圆圈：空间位阻(如果并入2’-O-Me)或远距离接触，具有黑色字母标记的深灰色圆圈：RNA接触。
图6描绘了通过基于结构的设计确定的2’-OMe取代的合理位置(SEQ ID NO:73)。具有白色字母标记的黑色圆圈：2’-OMe和硫代磷酸酯取代，具有黑色字母标记的浅灰色圆圈：仅2’-OMe取代，具有黑色字母标记白色圆圈：未修饰的核苷酸。
图7A描绘了在单指导RNA的tracr区中鉴定的2’-OMe位置的三种模式，所述模式来自结构指导的2’-O-甲基核糖修饰并入，所述修饰在体内产生稳健的编辑：(1)小鼠：图16，GA054(tracr1)和GA055(tracr2)，和(2)NHP：图28，GA096(tracr1)、GA097(tracr2)和GA346(tracr3)。具有白色字母标记的黑色圆圈：2’-OMe和硫代磷酸酯取代，具有黑色字母标记的浅灰色圆圈：仅2’-OMe取代，具有黑色字母标记白色圆圈：未修饰的核苷酸。(SEQ ID NO:73)图7B描绘了未修饰的SEQ ID NO:61、参考tracrRNA序列(“Lit Tracr”)、tracr1、tracr2和tracr3的序列比对。(SEQ ID NO:73)
图8示出了通过腺苷碱基编辑器系统在修饰原代人肝细胞中的PCSK9中对靶剪接位点进行的碱基编辑。暗线表示使用鉴定为GA066的gRNA获得的剪接位点编辑百分比。
图9描绘了桑格测序色谱图，其展示了PCSK9外显子1的末端处剪接供体处的反义链中腺嘌呤碱基的编辑(由用2500-ng/mL剂量转染的细胞的基因组DNA进行PCR扩增)，描绘出剪接位点破坏如何产生框内终止密码子。天然存在的单核苷酸多态性(SNP)的杂合性在编辑位点的下游是显而易见的。此方案显示，通过腺苷碱基编辑器系统进行A至G碱基编辑，以敲除原代人肝细胞中的PCSK9。图9公开了SEQ ID NO:75。
图10描绘了桑格测序色谱图，其展示了ANGPTL3外显子6的末端处剪接供体处的反义链中腺嘌呤碱基的编辑(由用2500-ng/mL剂量转染的细胞的基因组DNA进行PCR扩增)，描绘出剪接位点破坏如何产生框内终止密码子。通过腺苷碱基编辑器系统在修饰原代人肝细胞中的ANGPTL3中实现A至G碱基编辑。图10公开了SEQ ID NO:76。
图11示出了来自从以下分离的PCR扩增的基因组DNA的三个桑格测序色谱图：1)未处理的原代肝细胞(上图)；2)SpCas9mRNA/PCSK9 gRNA GA097处理的原代肝细胞(中间图)；3)ABE8.8 mRNA/PCSK9 gRNA处理的原代肝细胞(下图)。PCSK9-gRNA GA097原间隔子序列以灰色突出显示。箭头指向原间隔子的位置6，所述位置被ABE8.8编辑器靶向以进行A至G碱基编辑。剪刀描绘了通过SpCas9核酸酶在此靶位点处进行切割时发生的双链断裂的一般位点。细胞中的SpCas9 mRNA和GA097递送导致双链断裂位点处的显著基因编辑(如剪刀所示)，但这在细胞中的ABE8.8和GA097递送中未看到。相反，相同的gRNA GA097与ABE8.8mRNA组合产生了稳健的A至G碱基编辑。图11按出现顺序分别公开了SEQ ID NO 77-79。
图12描绘了示出破坏剪接供体或剪接受体序列的潜在剪接结果的示意图。其他结果也是可能的，诸如在剪接产物中包含一部分内含子1。示出了剪接供体或剪接受体位点的改变(上图)。原代人肝细胞中通过PCSK9外显子1剪接供体腺嘌呤碱基的编辑产生的PCSK9内含子1内的替代剪接供体位点在下图中示出。*使用四个不同的引物对(表9)对对照/经处理样品进行RT-PCR。
图13示出了原代人肝细胞中缺乏指导RNA依赖性DNA脱靶编辑。将人原代肝细胞用gRNA(GA097或GA346)和ABE8.8 mRNA温育，如实施例4所述。脱靶读取计算为来自四个个体供体的原代人肝细胞中中靶PCSK9位点和超过50个候选脱靶PCSK9位点处的净腺嘌呤编辑(LNP处理的细胞相对于未处理的细胞中具有一个或多个腺嘌呤碱基改变的测序读取的比例)。
图14描绘了2天之后在SpCas9处理或ABE8.8处理的肝细胞中评估的指导RNA非依赖性RNA编辑(n＝4个生物重复)。将每个重复与四个未处理的肝细胞样品中的每一个进行比较，以消除任何具有两种情况都常见的编辑的位置。抖动图描绘出经处理的样品中具有编辑的转录组基因座(数字指示经处理的样品中鉴定的总计经编辑的基因座，盒形图指示样品中所有经编辑的基因座中经编辑的读取的比例的中位数±四分位距)。在此研究中使用gRNA GA097、SpCas9mRNA MS010和ABE8.8 mRNA MA004，如实施例4所述。
图15示出了原代人肝细胞和原代非人灵长类动物(NHP)肝细胞中用碱基编辑器系统的实施方案ABE mRNA和指导RNA配制的脂质纳米颗粒(LNP)进行的PCSK9和ANGPTL3碱基编辑。人特异性ANGPTL3指导RNA在所评价的浓度范围内在NHP肝细胞中显示低编辑效率，而与人和NHP均具有交叉反应性的PCSK9指导RNA在两种细胞系中均显示高编辑效率。
图16示出了经由含有1:1重量比的SpCas9 mRNA MS002(TriLinkBiotechnologies)和具有不同tracr设计(GA052、GA053、GA054和GA055)的小鼠Pcsk9靶向gRNA的LNP在小鼠(n＝2-5只小鼠)中进行的Pcsk9基因编辑。向野生型C57BL/6小鼠给药2mg/kg的LNP测试制品。mg/kg剂量是基于总RNA计算的，并且总RNA是配制之后LNP中存在的mRNA和gRNA的定量总和。在给药之后7天，对小鼠进行安乐死，并且从小鼠肝脏中收获基因组DNA，然后用下一代测序评估靶位点的碱基编辑。所有评价的四个指导RNA在5’末端的前20个核苷酸内携带相同的间隔子和相同的化学修饰模式，但所有四个在100聚体指导RNA的位置21和位置100处的核苷酸之间tracr内的化学修饰模式都不同。
图17示出了经由具有碱基编辑器系统的实施方案ABE mRNA MA004和PCSK9指导RNA GA256(靶向小鼠内含子1剪接供体)的LNP在小鼠(n＝5)中进行的PCSK9碱基编辑。向野生型C57BL/6小鼠给药2mg/kg总RNA的LNP测试制品。在给药之后7天，对小鼠进行安乐死，并且从小鼠肝脏中收获基因组DNA，然后用下一代测序评估靶位点的碱基编辑。
图18描绘了在用不同剂量的具有ABE8.8 mRNA MA004和Pcsk9 gRNA GA256的相同LNP配制品处理后1周评估的野生型小鼠肝脏中Pcsk9外显子1剪接供体腺嘌呤碱基的编辑(n＝4至5只小鼠/给药组，条指示组的平均编辑)。
图19描绘了在以0.05mg/kg总RNA剂量用含有不同比率的gRNA GA256和mRNAMA002的LNP给药之后野生型小鼠肝脏中Pcsk9外显子1剪接供体腺嘌呤碱基的编辑。还在mRNA与gRNA的1:1wt比下评估具有不同化学修饰的另外的指导物GA255和GA257的碱基编辑效率。
图20示出了以0.05mg/kg总RNA剂量在1:1重量比下向小鼠给药含有ABE8.8 mRNA和小鼠Angptl3靶向gRNA(GA258、GA259、GA260、GA349、GA353)的LNP的结果。GA258、GA259和GA260含有三种不同的结构指导的tracr设计。GA349和GA353 tracr设计来自公布的文献(Cell Reports,2018 22,2227-2235)。之后对小鼠进行安乐死，并且从小鼠肝脏中收获基因组DNA，然后用下一代测序评估靶剪接位点的碱基编辑。
图21是示出了经由用碱基编辑器系统的实施方案ABE mRNA和指导RNA配制的LNP在NHP中引入靶基因的腺嘌呤碱基编辑的一般给药策略并在2周之后进行后续分析的示意图。
图22示出了经由静脉内输注以1mg/kg和3mg/kg总RNA剂量向食蟹猴施用用碱基编辑器系统的实施方案ABE mRNA MA002和PCSK9指导RNA GA066配制的LNP在食蟹猴的肝脏中的PCSK9靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑。
图23示出了经由静脉内输注向食蟹猴施用用碱基编辑器系统的实施方案ABEmRNA MA004和PCSK9指导RNA GA066配制的LNP导致在给药之后2周处与给药前水平相比血液PCSK9蛋白水平降低。
图24示出了经由静脉内输注以3mg/kg向食蟹猴施用用碱基编辑器系统的实施方案ABE mRNA MA002和PCSK9指导RNA GA066配制的LNP导致在给药之后1周和2周处与给药前水平相比血液低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平降低。
图25A-图25C示出了非人灵长类动物中PCSK9的短期腺嘌呤碱基编辑。图25A描绘了在处理后2周(三只动物)或24小时(两只动物)处通过尸检观察的接受1mg/kg剂量的具有ABE8.8 mRNA MA004和PCSK9 gRNA GA097的LNP配制品的静脉内输注的食蟹猴的肝脏中PCSK9外显子1剪接供体腺嘌呤碱基的编辑。对于每只动物，在从分布在整个肝脏的部位中收集的样品中评估编辑(n＝8个样品；条指示动物的平均编辑)。示出了在处理后2周处经受尸检的三只动物中血液PCSK9蛋白水平(图25B)或血液LDL-C水平(图25C)的降低，比较了2周处的水平相对于基线处理前水平(n＝1个血液样品/动物)。
图26A-图26C示出了非人灵长类动物中PCSK9的腺嘌呤碱基编辑。图26A描绘了接受0.5、1.0或1.5mg/kg剂量的具有ABE8.8mRNA MA004和PCSK9 gRNA GA346的LNP配制品的静脉内输注的食蟹猴的肝脏中PCSK9外显子1剪接供体腺嘌呤碱基的编辑。示出了动物的血液PCSK9蛋白水平(图26B)或血液LDL-C水平(图26C)的降低。
图27描绘了在治疗后2周处经受尸检的三只动物中PCSK9外显子1剪接供体腺嘌呤碱基的组织分布(对于除肝脏之外的每个指示器官，n＝1个样品/动物；肝脏数据各自表示从八个肝脏样品计算的平均值)。在此研究中使用由ABE mRNA MA004和指导RNA GA346构成的LNP，并且施用的剂量是0.5mg/kg。
图28说明了在静脉内输注由ABE mRNA MA004和具有相同间隔子但具有不同tracer修饰的不同指导RNA构成的单个脂质纳米颗粒(LNP)后食蟹猴的肝脏中PCSK9外显子1剪接供体腺嘌呤碱基编辑的编辑。在此研究中使用的指导RNA是GA066、GA096、GA097和GA346。在此研究中使用来自两个不同来源的gRNA GA097，并且所述来源被鉴定为(1)和(2)。对于tracr比较研究，以1mg/kg总RNA剂量给药LNP，其中指导RNA和mRNA以1:1重量比混合。在相同的实验条件下，与所有其他tracr设计(图7，GA095、GA097和GA346)相比，具有公布的tracr设计(Cell Reports,2018 22,2227-2235)的GA066在猴中产生较低的碱基编辑。
图29示出了非人灵长类动物中PCSK9的SpCas9核酸酶相对于腺嘌呤碱基编辑。在食蟹猴中静脉内输注含有SpCas9 mRNA和PCSK9 gRNA(MS010/GA097)或ABE8.8 mRNA和PCSK9 gRNA(MA004/GA097)的LNP。MS010/GA097 LNP以0.75和1.5mg/kg给药，并且MA004/GA097 LNP以1mg/kg总RNA剂量给药。1.5mg/kg的MS010/GA097 LNP测试制品在NHP中产生低个位数基因编辑，而ABE/GA097测试制品在1mg/kg下产生约40％的腺嘌呤碱基编辑，从而显示ABE碱基编辑器优于SpCas9系统的稳健性。在此研究中使用的所有LNP使用相同的赋形剂和组成制备。
图30示出了非人灵长类动物中PCSK9的腺嘌呤碱基编辑。此图描绘了接受0.5、1.0、1.5或3mg/kg总RNA剂量的LNP#1的静脉内输注的食蟹猴(每个条是单个动物，记录多个采样区域的编辑)的肝脏中PCSK9外显子1剪接供体腺嘌呤碱基的编辑。LNP#2以3mg/kg总RNA给药来作为先前研究的基准。两种LNP配制品含有ABE8.8 mRNA MA004和PCSK9 gRNAGA346。
图31示出了第15天PCSK9蛋白水平相对于基础的降低，来自图30中描述的相同实验。
图32描绘了接受3mg/kg总RNA剂量的具有ABE8.8 mRNA MA004和PCSK9 gRNAGA066的LNP配制品的静脉内输注的四只食蟹猴的肝脏中PCSK9外显子1剪接供体腺嘌呤碱基的编辑。对于每只动物，在处理后2周处在肝脏活检样品中评估编辑(n＝1个样品/动物)。
图33描绘了来自图32的四只动物(接受3mg/kg总RNA剂量的具有ABE8.8 mRNAMA004和PCSK9 gRNA GA066的LNP配制品的动物)和接受磷酸盐缓冲盐水的两只同时期对照动物中血液PCSK9蛋白水平的降低，比较了不同时间点处的水平相对于基线处理前水平(每个组的平均值±标准偏差，在每个时间点处，n＝4或n＝2)。虚线分别指示基线水平的100％和10％。
图34描绘了来自图32的四只动物(接受3mg/kg总RNA剂量的具有ABE8.8 mRNAMA004和PCSK9 gRNA GA066的LNP配制品的动物)和接受磷酸盐缓冲盐水的两只同时期对照动物中血液LDL-C蛋白水平的降低，比较了不同时间点处的水平相对于基线处理前水平(每个组的平均值±标准偏差，在每个时间点处，n＝4或n＝2)。虚线分别指示基线水平的100％和40％(上图)。单个动物的绝对值在下图中示出。
图35描绘了来自图32的四只动物和接受磷酸盐缓冲盐水的两只同时期对照动物中脂蛋白(a)的降低，比较了不同时间点处的水平相对于基线处理前水平(每个组的平均值±标准偏差，在每个时间点处，n＝4或n＝2)。
图36示出了非人灵长类动物中肝脏PCSK9碱基编辑的长期表型效应。处理后不同时间点处单个动物中天冬氨酸氨基转移酶(AST)(上图)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)(下图)的绝对值在图32中描绘出(n＝4只用3mg/kg剂量的具有ABE8.8 mRNA和PCSK9-gRNA的LNP配制品处理的动物，并且n＝2只用磷酸盐缓冲盐水处理的动物)。
图37A-图37G示出了单个动物的肝功能标记物。来自接受0.5、1.0或1.5mg/kg剂量的具有ABE8.8 mRNA和PCSK9 gRNA的LNP配制品的静脉内输注的食蟹猴在剂量后长达15天的AST(图37A，图37B)、ALT(图37A，图37C)、碱性磷酸盐(图37A，图37D)、γ-谷氨酰基转移酶(图37A，图37E)、总胆红素(图37A，图37F)和白蛋白(图37A，图37G)。
图38是使用针对食蟹猴基因组设计的特定文库的代表性候选ONE-seq位点的示意图。在顶部描绘了PCSK9原间隔子，其中ONE-seq分数为1.00。列出的所有位点通过降低的ONE-seq分数进行排名，鉴定了与原间隔子序列的错配。图38按出现顺序分别公开了SEQ IDNO:80、2193-2196、566、2197-2205、675、2206-2220、564、2221-224、638、644、506、621、2225-2226、681和2227-2230。
图39示出了对图38中鉴定的位点进行的gRNA依赖性DNA脱靶分析。评估来自食蟹猴原代肝细胞(上图)或食蟹猴肝脏(下图)的样品的净A>G碱基编辑(n＝3个经处理的样品，n＝3个未处理的样品)。
图40示出了来自接受0.5、1.0或1.5mg/kg LNP的NHP的肝脏的在图39中鉴定的一个脱靶位点(C5)处的净A>G编辑编辑％。
图41示出了经由用碱基编辑器系统的实施方案ABE mRNA MA004和ANGPTL3指导RNA GA067配制的LNP在NHP中进行的ANGPTL3碱基编辑。示出了三个NHP的肝脏编辑(左图)、ANGPTL3蛋白水平(中间图)和甘油三酯水平(右图)。
图42示出了在人原代肝细胞中以范围为0-2500ng/测试制品/mL的浓度通过用由碱基编辑器系统的实施方案ABE mRNA MA002和双指导RNA GA095(hcPCSK9)和GA098(hANGPTL3)配制的脂质纳米颗粒(LNP)进行的同时ANGPTL3和PCSK9碱基编辑。
图43示出了第15天和第44天肝脏活检腺苷碱基编辑结果。以范围为0.5-2mg/kg的总RNA剂量经由静脉内输注向NHP给药用ABE8.8 mRNA MA004和靶向PCSK9的gRNA(GA346)或靶向ANGPTL3的gRNA(GA347)配制的LNP。在施用测试制品之后两周，进行活检以评估碱基编辑。在从研究开始30天之后，施用相反的LNP。再过2周之后进行第二次活检后，提取gDNA，并且使用下一代测序评估碱基编辑。示出了PCSK9碱基编辑(上图)和ANGPTL3碱基编辑(下图)的结果。2mg/kg总RNA剂量的封装1:0.5:0.5重量比的ABE8.8 mRNA、PCSK9 gRNA GA346和ANGPTL3 gRNA GA347的LNP产生稳健的同步PCSK9和ANGPTL3基因编辑(实施例10)。
图44说明了图43所述的来自NHP的PCSK9(上图)和ANGPTL3(下图)蛋白水平的对应％变化。
图45说明了在NHP中进行重复LNP给药在第14天、第46天和第75天肝脏活检后在肝脏中导致相加腺苷碱基编辑。以0.5mg/kg的总RNA剂量经由静脉内输注向NHP给药用ABE8.8mRNA MA004和靶向PCSK9的gRNA(GA097)配制的LNP#1或LNP#2(关于给药间隔的细节和相关细节，参见实施例10)。
图46说明了在NHP中进行重复LNP给药导致肝脏中的相加碱基编辑，并转化为90天内血浆PCSK9蛋白水平的剂量依赖性相加降低。如图45所述，向NHP重复给药用ABE8.8 mRNAMA004和靶向PCSK9的gRNA(GA097)配制的LNP。在第0天、第30天和第60天以0.5mg/kg的总RNA剂量经由静脉内输注向NHP给药(图上示出了箭头来描绘给药)。关于PCSK9蛋白水平的分析描述，参见详细方法部分。
图47说明了在NHP中进行重复LNP给药导致肝脏中的相加碱基编辑，仅具有短暂肝脏标记物增加，并且所述短暂肝脏标记物增加与施用每个剂量的当天紧密相关。数据示出了第一剂量后71天的ALT、AST、总胆红素和肌酸激酶的肝脏标记物水平(关于细节，参见实施例10，图45)。
图48说明了在NHP中进行重复LNP给药导致肝脏中的相加碱基编辑，仅具有短暂肝脏标记物增加，从而示出了NHP中剂量后71天的LDH、GLDH、GGT和ALP的肝脏酶水平(关于细节，参见实施例10，图45)。
图49A和图49B说明了在单剂量的由ABE8.8 mRNA MA004和ANGPTL3 gRNA GA067构成的LNP之后，ANGPTL3碱基编辑导致长期ANGPTL3蛋白和甘油三酯水平降低。结果说明了ANGPTL3的长期腺嘌呤碱基编辑在6个月内对于非人灵长类动物中ANGPTL3蛋白(图49A)和甘油三酯(图49B)的影响。在施用单剂量的LNP后，ANGPTL3蛋白(降低96％)和甘油三酯水平明显降低，并且保持稳定地降低超过170天(关于细节，参见实施例10)。
图50A-图50E说明了在NHP中进行LNP给药对于细胞因子激活和免疫应答的影响。食蟹猴在指定时间点处(图50A和图50B)接受0.5mg/kg剂量的具有ABE8.8 mRNA MA004和PCSK9 gRNA GA346的LNP配制品的静脉内输注。在指定时间点处收集血液，并且分析了图以及IP-10和MCP-1。在另外的研究中，在不同时间点处分析来自从接受1.0mg/kg总RNA剂量的由MA004和PCSK9 gRNA GA346配制的LNP的静脉输注的NHP中收集的血液的IL-6、MCP-1和SC5b-9(分别为图50C、图50D和图50E)。
图51说明了在用含有SpCas9 mRNA/gRNA的LNP处理之后15天时NHP中的肝脏编辑。图51示出了来自非人灵长类动物中的ANGPTL3或PCSK9基因编辑的结果。食蟹猴接受1.5mg/kg剂量的具有SpCas9 mRNA MS004和一种靶向ANGPTL3(GA261-GA263)或PCSK9(GA266-GA271)的gRNA的LNP配制品的静脉内输注。在2周之后进行尸检时，从每个肝叶中分离两片(总计8片)并提取gDNA。如详细方法部分中所述对样品进行加工。分析每个单片的插缺失入％并且作为单个点作图。在大多数NHP肝脏中观察到高编辑效率。
图52说明了在用SpCas9/gRNA处理之后15天时NHP中的LDL-C水平。图52示出了来自非人灵长类动物中的ANGPTL3或PCSK9基因编辑的LDL-C降低。食蟹猴接受1.5mg/kg剂量的具有SpCas9 mRNA MS004和一种靶向ANGPTL3(GA261-GA263)或PCSK9(GA266-GA271)的gRNA的LNP配制品的静脉内输注。如详细方法部分中所述对样品进行加工。接受具有SpCas9mRNA/PCSK9 gRNA的LNP的所有NHP的循环LDL-C水平降低至少35％。虽然更中度，但具有SpCas9 mRNA/ANGPTL3 gRNA的LNP使循环LDL-C水平降低10％-25％。
图53说明了在用SpCas9/gRNA处理之后15天时NHP中的甘油三酯水平。图53示出了由非人灵长类动物中的ANGPTL3或PCSK9基因编辑产生的甘油三酯水平。食蟹猴接受1.5mg/kg剂量的具有SpCas9 mRNA MS004和一种靶向ANGPTL3(GA261-GA263)或PCSK9(GA266-GA271)的gRNA的LNP配制品的静脉内输注。如详细方法部分中所述对样品进行加工。接受具有SpCas9 mRNA/ANGPTL3 gRNA的LNP的NHP的甘油三酯水平降低约10％-50％。接受具有SpCas9 mRNA/PCSK9 gRNA的LNP的NHP没有显示显著的甘油三酯水平降低。
图54A和54B说明了对gRNA进行PACE修饰降低脱靶编辑效率。将人原代肝细胞以2500、1250、500和250ng/测试制品/mL用SpCas9 mRNA(从Trilink商购)和具有对tracr的修饰的靶向PCSK9的gRNA转染。如详细方法部分中所述处理、测序并分析基因组DNA。对GA156进行转染以充当阳性对照。GA248和GA249含有对gRNA的PACE修饰，所述修饰先前已被证明会降低脱靶编辑效率。实际上，虽然与未修饰的gRNA相比，GA248和GA249具有更低的中靶编辑，但GA156(图54A)、GA248和GA249在鉴定的脱靶位点处显示降低的脱靶编辑(图54B)。
图55A说明了ABE编码核苷酸MA004、MA019、MA020、MA021和ABE8.8m的GC比较(表23)以及MA004的更详细概述(图55A，下图)。图55B说明了使用ABE编码核苷酸MA004、MA019、MA020和MA021获得的编辑％(表23)。
具体实施方式
出了此描述的某些具体细节以便提供对各种实施方案的透彻理解。然而，本领域技术人员将理解，本公开内容可以在没有这些细节的情况下实践。在其他情况下，并未示出或详细描述熟知的结构，以避免不必要地模糊实施方案的描述。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。尽管可以在本公开内容的实践或测试中使用类似于或等效于本文所述的方法和材料的方法和材料，但合适的方法和材料描述如下。此外，本文提供的标题仅是为了方便，并且不解释所要求保护的公开内容的范围或含义。预期本说明书中讨论的任何实施方案可以关于本公开内容的任何方法或组合物来实施，并且反之亦然。此外，本公开内容的组合物可以用于实现本公开内容的方法。
定义
为了有助于理解本公开内容，在下文中定义一些术语和短语。
如在本说明书和所附权利要求中所用，除非内容另外明确规定，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数指示物。
还应注意，除非内容另外明确规定，否则术语“或”通常以其包括“和/或”的含义使用。如本文所用，术语“和/或”和“其任何组合”及其语法等效物可以互换使用。这些术语可以表示具体设想的任何组合。仅出于说明目的，以下短语“A、B和/或C”或“A、B、C或其任何组合”可以意指“A单独；B单独；C单独；A和B；B和C；A和C；以及A、B和C”。除非上下文特别提到分离使用，否则术语“或”可以结合或分离使用。
术语“约”或“大约”可以意指由本领域的普通技术人员确定的具体值处于可接受的误差范围内，这将部分取决于所述值的测量或确定方式，即，测量系统的限制性。例如，根据本领域的实践，“约”可以意指在1个或多于1个标准偏差内。可替代地，“约”可以意指给定值的至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的范围。可替代地，特别是关于生物系统或过程，所述术语可以意指在值的一个数量级以内、在值的5倍以内及更优选地在值的2倍以内。在本申请和权利要求书中描述特定值的情况下，除非另外说明，否则应假设术语“约”意指所述特定值在可接受的误差范围内。
如本说明书和权利要求中所用，词语“包含(comprising)”(以及包含(comprising)的任何形式诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(以及具有(having)的任何形式诸如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(以及包括(including)的任何形式诸如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(以及含有(containing)的任何形式诸如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包含性的或开放式的，并且不排除另外的未陈述的元素或方法步骤。
如本文所用，“一些实施方案”、“一个实施方案(an embodiment)”、“一个实施方案(one embodiment)”、“实施方案”或“其他实施方案”意指结合实施方案描述的具体特征、结构或特性包括在本公开内容的至少一些实施方案中，但不一定包括在本公开内容的所有实施方案中。
如本文所用，术语“核酸”是指含有至少两种核苷酸(即，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)的呈单链或双链形式的聚合物，并且包括DNA和RNA。“核苷酸”含有糖脱氧核糖(DNA)或核糖(RNA)、碱基和磷酸酯基团。核苷酸通过磷酸酯基团连接在一起。“碱基”包括嘌呤类和嘧啶类，其还包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷和天然类似物，以及嘌呤和嘧啶的合成衍生物，所述合成衍生物包括但不限于放置新反应性基团的修饰，诸如但不限于胺、醇、硫醇、羧酸盐和烷基卤化物。核酸包括任何寡核苷酸或多核苷酸，其中含有最多60个核苷酸的片段通常被称为寡核苷酸，并且较长的片段被称为多核苷酸。脱氧核糖核苷酸由一种被称为脱氧核糖的5碳糖组成，所述糖在此糖的5’和3’碳处与磷酸酯共价接合，形成交替的无支链的聚合物。DNA可以是呈例如反义分子、质粒DNA、预缩合DNA、PCR产物、载体、表达盒、嵌合序列、染色体DNA或这些基团的衍生物和组合的形式。核糖寡核苷酸由类似的重复结构组成，其中5碳糖是核糖。因此，术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可以指由天然存在的碱基、糖和糖间(骨架)键组成的核苷酸或核苷单体的聚合物或低聚物。另外，核酸包括含有已知核苷酸类似物或经修饰的骨架残基或键的核酸，其是合成的、非标准的和/或非天然存在的，并且具有与参考核酸类似的结合特性。核酸可以在碱基部分(例如，通常可用于与互补核苷酸形成氢键的一个或多个原子和/或通常不能与互补核苷酸形成氢键的一个或多个原子)、糖部分或磷酸酯骨架处被修饰。骨架修饰可以包括但不限于硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺基磷酸酯、氨基磷酸酯和二氨基磷酸酯键。硫代磷酸酯键用硫原子取代磷酸酯骨架中的非桥接氧，并延迟寡核苷酸的核酸酶降解。二氨基磷酸酯键(N3’→P5’)允许防止核酸酶识别和降解。骨架修饰还可以包括在骨架结构中具有肽键而不是磷(例如，由肽核酸中的肽键连接的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元)，或连接基团，包括氨基甲酸酯、酰胺和线性和环状烃基。具有经修饰的骨架的寡核苷酸在以下中审查：Micklefield,Backbone modification of nucleic acids:synthesis,structure andtherapeutic applications,Curr.Med.Chem.,8(10):1157-79,2001和Lyer等人,Modifiedoligonucleotides-synthesis,properties and applications,Curr.Opin.Mol.Ther.,1(3):344-358,1999。本文所述的核酸分子可以含有糖部分，其包含核糖或脱氧核糖，如天然存在的核苷酸中存在的，或经修饰的糖部分或糖类似物。经修饰的糖部分的实例包括但不限于2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基、2’-O-氨基乙基、2’-氟、N3’→P5’氨基磷酸酯、2’二甲基氨基氧基乙氧基、2’2’二甲基氨基乙氧基乙氧基、2’-胍、2’-O-乙基胍、氨基甲酸酯修饰的糖和双环修饰糖。2’-O-甲基或2’-O-甲氧基乙基修饰促进寡核苷酸中的A型或RNA样构象，增加与RNA的结合亲和力，并具有增强的核酸酶抗性。经修饰的糖部分还可以包括具有额外桥键(例如，在锁核酸中接合核糖的2’-O和4’-C原子的亚甲桥)或糖类似物，诸如吗啉环(例如，如在磷酰二胺吗啉中)。此类类似物和/或经修饰的残基的实例包括但不限于二氨基嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷(beta-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫脲嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷(beta-D-mannosylqueosine)、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、怀丁苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w、2,6-二氨基嘌呤、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2’-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)等。在一些情况下，核苷酸可以包括其磷酸酯部分的修饰，包括对三磷酸酯部分的修饰。此类修饰的非限制性实例包括长度更长的磷酸酯链(例如，具有4、5、6、7、8、9、10或更多个磷酸酯部分的磷酸酯链)和用硫醇部分的修饰(例如，α-硫代三磷酸酯和β-硫代三磷酸酯)。由于例如像增强的细胞摄取、降低的免疫原性以及在核酸酶存在下增加的稳定性的特性，此类经修饰或取代的寡核苷酸相对于天然形式经常是优选的。因此，术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”还可以包括包含非天然存在的单体的聚合物或低聚物或其功能类似的部分。
除非另外指示，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指示的序列。具体地，简并密码子取代可以通过生成如下序列而实现，在所述序列中，一个或多个所选择的(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.,19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.,260:2605-2608(1985)；Rossolini等人,Mol.Cell.Probes,8:91-98(1994))。
本公开内容涵盖分离的或基本上纯化的核酸分子和含有这些分子的组合物。如本文所用，“分离的”或“纯化的”DNA分子或RNA分子是与其天然环境分开存在的DNA分子或RNA分子。分离的DNA分子或RNA分子可以以纯化形式存在或可以存在于非天然环境(例如像转基因宿主细胞)中。例如，“分离的”或“纯化的”核酸分子或其生物活性部分当通过重组技术产生时基本上不含其他细胞物质或培养基，或者当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品。在一个实施方案中，“分离的”核酸不含在从其衍生出所述核酸的生物体的基因组DNA中天然地在所述核酸侧翼的序列(即，位于所述核酸的5’和3’末端的序列)。例如，在一些实施方案中，所述分离的核酸分子可以含有小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，在从其衍生出所述核酸的细胞的基因组DNA中，所述核苷酸序列天然地在所述核酸分子的侧翼。
如本文所用，术语“载体”是指能够转运已经与其连接的另一核酸的核酸分子。在一些实例中，载体是表达载体，其能够指导它们所可操作地连接的核酸的表达。如本文所用，术语“可操作地连接”意指目的核苷酸序列以允许该核苷酸序列表达的方式与一个或多个调控序列连接。如本文所用，术语“调控序列”包括但不限于启动子、增强子和其他表达控制元件。此类调控序列是本领域熟知的，并且例如描述于Goeddel；Gene ExpressionTechnology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990)中。表达载体的实例包括但不限于质粒载体、基于痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、腺相关病毒、SV40、单纯疱疹病毒、人免疫缺陷病毒、逆转录病毒(例如，鼠白血病病毒、脾坏死病毒以及衍生自逆转录病毒(诸如劳氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)、哈维肉瘤病毒(HarveySarcoma Virus)、禽类白血病病毒、慢病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增生肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒)的载体)的病毒载体和其他重组载体。
如本文所用，术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”可互换使用，并且是指经由肽键连接并且可以由两个或更多个多肽链构成的氨基酸残基的聚合物。术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”是指通过酰胺键接合在一起的至少两个氨基酸单体的聚合物。氨基酸可以是L-光学异构体或D-光学异构体。更具体地，术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”是指由两个或多个氨基酸以特定顺序，例如由编码蛋白质的基因或RNA中核苷酸的碱基序列确定的顺序构成的分子。蛋白质对于人体细胞、组织和器官的结构、功能和调节至关重要，并且每种蛋白质具有独特的功能。实例是激素、酶、抗体及其任何片段。在一些情况下，蛋白质可以是蛋白质的一部分，例如，蛋白质的结构域、子结构域或基序。在一些情况下，蛋白质可以是蛋白质的变体(或突变)，其中一个或多个氨基酸残基被插入到蛋白质的天然存在的(或至少已知的)氨基酸序列中、从其中缺失和/或取代其中。蛋白质或其变体可以是天然存在的或重组的。用于检测和/或测量生物材料中的多肽的方法是本领域熟知的，并且包括但不限于蛋白质印迹、流式细胞术、ELISA、RIA和各种蛋白质组学技术。测量或检测多肽的示例性方法是免疫测定，诸如ELISA。这种类型的蛋白质定量可以是基于能够捕获特定抗原的抗体，以及能够检测捕获的抗原的第二抗体。用于测量或检测多肽的示例性测定描述于Harlow,E.and Lane,D.Antibodies:A Laboratory Manual,(1988),Cold Spring Harbor Laboratory Press中。
如本文所用，术语“序列同一性”是指在两个不同序列之间精确匹配的核苷酸的量。当比较RNA和DNA序列时，尿嘧啶和胸腺嘧啶碱基被认为是相同的碱基。空隙不计算在内，并且测量通常与两个序列中的较短序列相关。
例如：
A：AAGGCTT
B：AAGGC
C：AAGGCAT
在此同一性(A,B)＝100％(5个相同核苷酸/min(长度(A),长度(B)))。
同一性(B,C)＝100％，但是同一性(A,C)＝85％((6个相同核苷酸/7)。因此，100％同一性并不意味着两个序列是相同的。
如本文所用，术语“序列相似性”可以被描述为一个最佳匹配问题，它找到最小数量的编辑操作(插入、缺失和取代)，以便将一个序列转换为另一个比对序列的精确拷贝(编辑距离)。使用这个方法，以上实例的百分比序列相似性是sim(A,B)＝60％，sim(B,C)＝60％，sim(A,C)＝86％(半全局，sim＝1-(编辑距离/较短序列的未比对长度))。
有需要的“对象”是指具有疾病、疾病的症状或向疾病的倾向的个体，目的是治愈、痊愈、缓和、缓解、改变、补救、减轻、改善或影响疾病、疾病的症状或向疾病的倾向。在一些实施方案中，对象患有高胆固醇血症。在一些实施方案中，对象患有动脉粥样硬化性血管疾病。在一些实施方案中，对象患有高甘油三酯血症。在一些实施方案中，对象患有糖尿病。术语“对象”或“患者”涵盖哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于哺乳动物类的任何成员：人、非人灵长类动物，诸如黑猩猩和其他猿类和猴物种；农场动物，诸如牛、马、绵羊、山羊、猪；家养动物，诸如兔、狗和猫；实验室动物，包括啮齿动物，诸如大鼠、小鼠和豚鼠等。
如本文所用，术语“病症”包括疾病、病症和易感性。在一些实施方案中，所述病症是动脉粥样硬化性血管疾病。在一些实施方案中，所述病症是高甘油三酯血症。在一些实施方案中，所述病症是糖尿病。
如本文所用，术语“动脉粥样硬化”或“动脉粥样硬化性血管疾病”是指由于斑块的积聚而使动脉内部变窄的疾病。在一些实施方案中，它可能导致冠状动脉疾病、中风、外周动脉疾病或肾脏问题。
如本文所用，术语“高甘油三酯血症”指甘油三酯的高(高)血液水平(血症)，甘油三酯是大多数生物体中最丰富的脂肪分子。在一些实施方案中，升高水平的甘油三酯与动脉粥样硬化相关联，即使在高胆固醇血症(高胆固醇水平)不存在的情况下也是如此，并且易患心血管疾病。在一些实施方案中，非常高的甘油三酯水平增加急性胰腺炎的风险。在一些实施方案中，高甘油三酯血症与以下相关联：暴饮暴食、肥胖症、糖尿病和胰岛素抗性、过量饮酒、肾衰竭、肾病综合征、遗传倾向性(例如，家族性混合型高脂血症，即II型高脂血症)、脂蛋白脂酶缺陷症、溶酶体酸脂酶缺陷症、胆固醇酯贮积病、某些药物(例如，异维A酸、氢氯噻嗪利尿剂、β受体阻滞剂、蛋白酶抑制剂)、甲状腺功能减退症(甲状腺功能低下)、系统性红斑狼疮和相关联的自身免疫应答、糖原贮积症1型、丙泊酚或HIV药物。
如本文所用，术语“糖尿病”是指特征为长时间段内高血糖水平的一组代谢紊乱。在一些实施方案中，糖尿病是1型糖尿病，其由胰腺由于β细胞损失而未能产生足够的胰岛素而产生。在一些实施方案中，糖尿病是特征为胰岛素抗性的2型糖尿病，在所述病症中细胞不能对胰岛素产生适当应答。在一些实施方案中，糖尿病是妊娠期糖尿病，它在没有糖尿病既往史的孕妇发展高血糖水平时发生。
如本文所用，术语“低密度脂蛋白(LDL)”是指由脂蛋白外缘和胆固醇中心组成的微观团。在一些实施方案中，LDL具有由被称为亚油酸酯的多不饱和脂肪酸和数百至数千个酯化和未酯化的胆固醇分子组成的高度疏水性核心。在一些实施方案中，LDL的核心还携带甘油三酯和其他脂肪，并且被磷脂和未酯化的胆固醇的壳包围。
如本文所用，术语“高密度脂蛋白(HDL)”是指最小的脂蛋白颗粒。在实施方案中，血浆酶卵磷脂-胆固醇酰基转移酶(LCAT)将游离胆固醇转化为胆固醇基，其然后螯合到脂蛋白颗粒的核心中，最终导致新合成的HDL呈球形形状。在实施方案中，HDL颗粒的大小随着它们在血液中循环而增加，并且并入来自细胞和其他脂蛋白的更多胆固醇和磷脂分子。
如本文所用，术语“胆固醇”是指具有独特结构的脂质，其由形成大体积类固醇结构的四个连接的烃环构成。如本文所用，术语“甘油三酯”是指由与三个脂肪酸分子结合的甘油构成的三酯。在一些实施方案中，所述脂肪酸是饱和或不饱和脂肪酸。
如本文所用，术语“治疗(treat、treating或treatment)”及其语法等效物可以包括缓和、减弱或减轻疾病或病症的至少一种症状、预防另外的症状、抑制疾病或病症，例如延迟、降低、抑制、减弱、削弱、遏制或稳定疾病或病症的发展或进展、缓解疾病或病症、引起疾病或病症的消退、缓解由疾病或病症引起的病症、降低疾病严重性或预防性和/或治疗性地停止疾病或病症的症状。“治疗”还包括减轻与疾病或病症相关的任何症状或其他不良作用和/或与疾病或病症相关联的副作用的发生或复发频率或严重性。“治疗”不一定需要治愈结果。应理解，尽管没有排除，但治疗病症或病症也不需要完全消除病症、病症或与其相关联的症状。术语“治疗”涵盖“管理”的概念，其是指降低患者中特定疾病或病症的严重性或延迟其复发，例如延长已经罹患疾病的患者的缓解期。“治疗”可以指在疾病或病症发作或疑似发作之后向对象施加或施用组合物。
术语“治疗”还涵盖“预防(prevent)”、“预防(preventing)”和“预防(prevention)”的概念。如本文所用，术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”和“预防(prevention)”是指减少对象的病症病理学发生，所述对象没有发展疾病或病症，但有发展疾病或病症的风险或易于发展疾病或病症。预防可以是完全的，例如，对象的病症病理学完全不存在。预防也可以是部分的，使得对象的病症病理学的发生少于没有本公开内容时可能出现的发生。
例如，通过“治疗或预防病症”，与等效的未经治疗的对照相比，缓和病症的症状可以涉及至少3％、5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％的减少或预防程度，如通过任何标准技术测量。在一些实施方案中，缓和病症的症状可以涉及与等效的未经治疗的对照相比减少到至少1/2、1/3、1/4、1/5、1/10、1/20、1/25、1/30、1/40、1/50、1/60、1/70、1/80、1/90、1/100、1/200、1/300、1/400、1/500、1/600、1/700、1/800、1/900、1/1000、1/2000、1/3000、1/4000、1/5000、1/6000、1/7000、1/8000、1/9000或1/10000的减少或至少2、3、4、5、10、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000倍的预防程度。
如本文所用，“延迟”疾病的发展意指推迟、阻碍、减缓、减慢、稳定和/或延缓疾病的进展。这种延迟可以具有不同的时间长度，其取决于疾病的历史和/或被治疗的个体。与不使用所述方法相比，“延迟”或缓和疾病的发展或延迟疾病的发作的方法是在给定的时间范围内降低发展疾病的一种或多种症状的可能性和/或在给定的时间范围内降低症状程度的方法。这种比较通常是基于临床研究，使用多个足以给出统计上显著结果的对象。
疾病的“发展”或“进展”意指疾病的初始表现和/或随后的进展。疾病的发展可以使用本领域熟知的标准临床技术来检测和评估。然而，发展也是指可能不可检测的进展。出于本公开内容的目的，发展或进展是指症状的生物学过程。“发展”包括发生、复发和发作。
如本文所用，疾病的“发作”或“发生”包括初始发作和/或复发。
如本文所用，“施用”及其语法等效物可以指向对象或患者提供本文所述的药物组合物。可以使用医学领域的普通技术人员已知的常规方法来将组合物施用于对象，这取决于待治疗的疾病的类型或疾病的部位。例如，组合物可以例如口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻、颊、阴道或、经由植入型贮库或经由输注的方式施用。可以采用一种或多种此类途径。
如本文所用，术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、腹膜内、皮层内、动脉内、滑膜内、胸骨内(intrastemal)、鞘内、血管内、病灶内以及颅内注射或输注技术。另外，它可以经由可注射仓库施用途径施用于对象，诸如使用1个月、3个月或6个月的仓库可注射或可生物降解材料和方法。
“共施用”意指在足够接近的时间内施用一种或多种另外的治疗方案或治疗剂或治疗以及本公开内容的组合物，以增强一种或多种另外的治疗剂的作用，或者反之亦然。在这方面，本文所述的本公开内容的组合物可以与一种或多种另外的治疗方案或治疗剂或治疗在不同的时间，或以完全不同的治疗时间表(例如，第一治疗可以是每天一次，而另外的治疗是每周一次)同时施用。例如，在实施方案中，二级治疗方案或治疗剂或治疗与本公开内容的组合物同时施用、在其之前施用或在其之后施用。
如本文所用，术语“药物组合物”及其语法等效物可以指包含治疗有效量的活性药物成分以及一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体和/或待向对象(例如，有需要的人)施用的治疗剂的混合物或溶液。
如本文所用，术语“药学上可接受的”及其语法等效物可以指材料的属性，所述材料可用于制备通常安全、无毒、并且在生物学上和其他方面均不是不希望的药物组合物，并且对于兽医以及人药物用途是可接受的。“药学上可接受的”可以指一种材料，诸如载体或或稀释剂，其不会消除化合物的生物活性或特性，并且是相对无毒的，即所述材料可以施用于对象而不会引起不希望的生物效应或以有害的方式与包含它的药物组合物的任何组分相互作用。
“药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂”是指可以与药剂一起施用于对象并且在以足以递送治疗量的药剂的剂量施用时不破坏其药理学活性且无毒的赋形剂、载体或稀释剂。
“药学上可接受的盐”可以是通常在本领域中被认为适合与人类或动物的组织接触使用而没有过度毒性、刺激、变应性应答或其他问题或并发症的酸盐或碱盐。此类盐包括碱性残基(诸如胺)的矿物盐和有机酸盐以及酸性残基(诸如羧酸)的碱金属盐或有机盐。具体的药用盐包括但不限于诸如以下的酸的盐：盐酸、磷酸、氢溴酸、苹果酸、乙醇酸、富马酸、硫酸、氨基磺酸、磺胺酸、甲酸、甲苯磺酸、甲磺酸、苯磺酸、乙烷二磺酸、2-羟乙基磺酸、硝酸、苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、硬脂酸、水杨酸、谷氨酸、抗坏血酸、扑酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、丙酸、羟基马来酸、氢碘酸、苯乙酸、链烷酸诸如乙酸、HOOC-(CH2)n-COOH(其中n是0-4)等。类似地，药学上可接受的阳离子包括但不限于钠、钾、钙、铝、锂和铵。本领域的普通技术人员应从本公开内容和本领域知识中认识到另外药学上可接受的盐包括由Remington’s Pharmaceutical Sciences,第17版,Mack Publishing Company,Easton,PA,第1418页(1985)列出的那些。通常，药学上可接受的酸或碱盐可以通过任何常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。简而言之，可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量量的合适的碱或酸在合适的溶剂中反应来制备此类盐。
术语“治疗剂”可以指当施用于对象时具有治疗、诊断和/或预防作用和/或引发所需生物学和/或药理学作用的任何药剂。治疗剂也可以被称为“活性物”或“活性剂”。此类药剂包括但不限于细胞毒素、放射性离子、化疗剂、小分子药物、蛋白质和核酸。
如本文所用，“治疗有效量”是指本公开内容的每种组合物向对象赋予治疗作用所需的量，无论是单独使用还是与一种或多种其他治疗剂组合使用。因此，如本文所用，术语“治疗有效量”意指当施用于罹患或易感于疾病、病症和/或病症的对象时足以治疗所述疾病、病症和/或病症，改善其症状，诊断、预防和/或延迟其发作的待递送药剂(例如，核酸、组合物、治疗剂、预防剂等)的量。就治疗而言，“治疗有效量”是足以缓解、减轻、稳定、逆转或减缓疾病或病症(例如，动脉粥样硬化性血管疾病、高甘油三酯血症或糖尿病)的进展的量。如本领域技术人员所认识到的，“治疗有效量”取决于所治疗的特定病症、病症的严重性、个体对象参数(包括年龄、身体情况、大小、性别和体重)、治疗持续时间、并行疗法(如果有的话)的性质、具体的施用途径和健康从业者的知识和专业技能范围内的类似因素而变化。这些因素是本领域的普通技术人员熟知的，并且只需常规实验即可解决。通常优选使用单个组分或其组合的最大剂量，即根据合理的医学判断的最高安全剂量。然而，本领域普通技术人员将理解，对象可能出于医学原因、心理原因或几乎任何其他原因而坚持较低剂量或可耐受剂量。另外，患者可能正在接受的其他药物将影响所施用的治疗剂的治疗有效量的确定。经验性考虑，诸如半衰期，通常将有助于确定剂量。“治疗有效量”可以是单独使用或与一种或多种用于治疗病症的药剂组合使用的任何本公开内容的组合物。可以将治疗有效量在一次或多次施用中施用。
确定“治疗有效量”的有效初始方法可以是通过进行细胞培养测定(例如，使用神经元细胞)或使用动物模型(例如，小鼠、大鼠、兔、狗或猪)。可以在动物模型中配制剂量以实现一定的浓度范围，包括如在细胞培养中确定的IC50(即，实现症状的半最大抑制的组合物的浓度)。此类信息可以用来更准确地确定用于人中的剂量。除了确定使本公开内容组合物治疗有效的适当浓度范围外，动物模型还可以产生其他相关信息，诸如将提供最大有效性的优选施用途径。基于以上所述的方法和其他方法调整剂量以在人类中实现最大功效完全在普通技术人员的能力范围内。
本文提供的范围应理解为所述范围内所有值的简写。例如，范围1至50应理解为包括由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50组成的组中的任何数值、数值组合或子范围，以及上述整数之间的所有中间小数值，例如像1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8和1.9。关于子范围，具体地考虑从范围任一端点延伸的“嵌套(nested)子范围”。例如，1至50的示例性范围的嵌套子范围可以包括在一个方向上的1至10、1至20、1至30和1至40，或在另一个方向上的50至40、50至30、50至20和50至10。
如本文所用，术语“原间隔子”或“靶序列”及其语法等效物可以指靶基因的DNA序列。在天然状态下，原间隔子与PAM(原间隔子相邻基序)相邻。术语“间隔子”可以是与原间隔子的互补链结合的原间隔子的RNA版本。间隔子可以在指导RNA(gRNA)内。RNA指导的核酸酶的切割位点在原间隔子序列内。关于说明请参见图1A。
如本文所用，术语“碱基编辑”、“基因编辑”或“基因修饰”及其语法等效物可以指从基因组中插入、替换或去除一个或多个核苷酸的基因工程化。基因编辑可以使用核酸酶(例如，天然存在的核酸酶或人工工程化的核酸酶)进行。基因修饰可以包括引入双链断裂、无义突变、移码突变、剪接位点改变或多核苷酸序列(例如，靶多核苷酸序列)中的倒置。
如本文所用，术语“碱基编辑器(BE)”或“核碱基编辑器(NBE)”可以指结合多核苷酸并具有核碱基修饰活性的药剂。在各种实施方案中，碱基编辑器包含核碱基修饰多肽(例如，脱氨酶)和核酸可编程核苷酸结合结构域以及指导多核苷酸(例如，指导RNA)，或编码可编程核苷酸结合结构域和脱氨酶的核酸。在各种实施方案中，所述药剂是一种生物分子复合物，其包含具有碱基编辑活性的蛋白质结构域，即能够修饰核酸分子(例如，DNA)内的碱基(例如，A、T、C、G或U)的结构域，或编码其的核酸。在一些实施方案中，多核苷酸可编程DNA结合结构域与脱氨酶结构域融合或连接，从而产生碱基编辑器融合蛋白。在一些实施方案中，碱基编辑器包含编码碱基编辑器融合蛋白的核酸，例如编码碱基编辑器融合蛋白的mRNA。碱基编辑器融合蛋白可以包含一个或多个接头，例如肽接头。在一个实施方案中，融合蛋白是包含具有碱基编辑活性的结构域的融合蛋白。在另一个实施方案中，具有碱基编辑活性的蛋白质结构域与指导RNA连接(例如，经由指导RNA上的RNA结合基序和与脱氨酶融合的RNA结合结构域)。在一些实施方案中，具有碱基编辑活性的结构域能够使核酸分子内的碱基脱氨。在一些实施方案中，碱基编辑器能够使DNA分子内的一个或多个碱基脱氨。在一些实施方案中，碱基编辑器能够使DNA内的腺苷(A)脱氨。在一些实施方案中，碱基编辑器是腺苷碱基编辑器(ABE)。在一些实施方案中，碱基编辑器能够使DNA内的胞嘧啶(C)脱氨。在一些实施方案中，碱基编辑器是胞嘧啶碱基编辑器(CBE)。
术语“碱基编辑器系统”是指用于编辑靶核苷酸序列的核碱基的系统。在各种实施方案中，碱基编辑器系统包含(1)多核苷酸可编程核苷酸结合结构域(例如，Cas9)；(2)用于使所述核碱基脱氨的脱氨酶结构域(例如，腺苷脱氨酶或胞苷脱氨酶)；以及(3)一个或多个指导多核苷酸(例如，指导RNA)。在一些实施方案中，碱基编辑器系统包含具有(1)和(2)的碱基编辑器融合蛋白。在一些实施方案中，多核苷酸可编程核苷酸结合结构域是多核苷酸可编程DNA结合结构域。在一些实施方案中，碱基编辑器是腺嘌呤或腺苷碱基编辑器(ABE)。在一些实施方案中，碱基编辑器是胞嘧啶碱基编辑器(CBE)。
核碱基编辑器系统
在一些方面，本文提供了能够进行核碱基修饰的碱基编辑器系统。在一些实施方案中，碱基编辑器系统包含(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，以及(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸。在一些实施方案中，碱基编辑器系统包含指导多核苷酸。在一些实施方案中，碱基编辑器系统包含编码指导多核苷酸的核酸。在一些实施方案中，碱基编辑器系统包含具有可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白。在一些实施方案中，碱基编辑器系统包含核酸，所述核酸编码包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白。
在一些实施方案中，在施用于对象时，指导多核苷酸指导碱基编辑器系统在PCSK9或ANGPTL3基因中体内实现核碱基改变。
在一些实施方案中，碱基改变在对象的全部肝脏细胞的至少35％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
在一些实施方案中，碱基改变在对象的全部肝脏细胞的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.3％、99.5％、99.7％、99.8％或99.9％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。在一些实施方案中，碱基改变在对象的全部肝脏细胞的至多1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.3％、99.5％、99.7％、99.8％或99.9％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。在一些实施方案中，碱基改变在对象的全部肝脏细胞的1％-99.9％、2％-99.9％、3％-99.9％、4％-99.9％、5％-99.9％、6％-99.9％、7％-99.9％、8％-99.9％、9％-99.9％、10％-99.9％、15％-99.9％、20％-99.9％、25％-99.9％、30％-99.9％、35％-99.9％、40％-99.9％、45％-99.9％、50％-99.9％、55％-99.9％、60％-99.9％、65％-99.9％、70％-99.9％、75％-99.9％、80％-99.9％、85％-99.9％、90％-99.9％或95-99.9％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。在一些实施方案中，碱基改变在对象的全部肝脏细胞的1％-99.5％、1％-99％、1％-98％、1％-97％、1％-96％、1％-95％、1％-90％、1％-85％、1％-80％、1％-75％、1％-70％、1％-65％、1％-60％、1％-55％、1％-50％、1％-45％、1％-40％、1％-35％、1％-30％、1％-25％、1％-20％、1％-15％、1％-10％、1％-9％、1％-8％、1％-7％、1％-6％、1％-5％、1％-4％、1％-3％或1％-2％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。在一些实施方案中，碱基改变在对象的全部肝脏细胞的1％-90％、5％-85％、10％-80％、15％-75％、20％-70％、25％-65％、30％-60％、35％-55％或40％-50％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。在一些实施方案中，碱基改变在对象的全部肝脏细胞的100％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
在一些实施方案中，碱基改变在对象的肝细胞中发生。在一些实施方案中，碱基改变在对象的肝细胞的至少30％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。在一些实施方案中，碱基改变在对象的肝细胞中发生。在一些实施方案中，碱基改变在对象的肝细胞的至少％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。在一些实施方案中，碱基改变在对象的肝细胞的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.3％、99.5％、99.7％、99.8％或99.9％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。在一些实施方案中，碱基改变在对象的肝细胞的至多1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.3％、99.5％、99.7％、99.8％或99.9％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。在一些实施方案中，碱基改变在对象的肝细胞的1％-99.9％、2％-99.9％、3％-99.9％、4％-99.9％、5％-99.9％、6％-99.9％、7％-99.9％、8％-99.9％、9％-99.9％、10％-99.9％、15％-99.9％、20％-99.9％、25％-99.9％、30％-99.9％、35％-99.9％、40％-99.9％、45％-99.9％、50％-99.9％、55％-99.9％、60％-99.9％、65％-99.9％、70％-99.9％、75％-99.9％、80％-99.9％、85％-99.9％、90％-99.9％或95-99.9％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。在一些实施方案中，碱基改变在对象的肝细胞的1％-99.5％、1％-99％、1％-98％、1％-97％、1％-96％、1％-95％、1％-90％、1％-85％、1％-80％、1％-75％、1％-70％、1％-65％、1％-60％、1％-55％、1％-50％、1％-45％、1％-40％、1％-35％、1％-30％、1％-25％、1％-20％、1％-15％、1％-10％、1％-9％、1％-8％、1％-7％、1％-6％、1％-5％、1％-4％、1％-3％或1％-2％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。在一些实施方案中，碱基改变在对象的肝细胞的1％-90％、5％-85％、10％-80％、15％-75％、20％-70％、25％-65％、30％-60％、35％-55％或40％-50％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。在一些实施方案中，碱基改变在对象的肝细胞的100％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
在一些实施方案中，在对象的全部肝脏细胞中发生的碱基改变通过下一代测序测量。在一些实施方案中，在对象的全部肝脏细胞中发生的碱基改变通过桑格测序所测量。在一些实施方案中，在对象的肝细胞中发生的碱基改变通过下一代测序测量。在一些实施方案中，在对象的肝细胞中发生的碱基改变通过桑格测序所测量。
在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液PCSK9蛋白水平降低至少35％，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液ANGPTL3蛋白水平降低至少35％，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。
在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液PCSK9蛋白水平降低至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液PCSK9蛋白水平降低至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、90％、95％、97％、98％、99％、99.3％、99.5％、99.7％、99.8％或99.9％，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液PCSK9蛋白水平降低至多1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、90％、95％、97％、98％、99％、99.3％、99.5％、99.7％、99.8％或99.9％，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液PCSK9蛋白水平降低1％-99.9％、2％-99.9％、3％-99.9％、4％-99.9％、5％-99.9％、6％-99.9％、7％-99.9％、8％-99.9％、9％-99.9％、10％-99.9％、15％-99.9％、20％-99.9％、25％-99.9％、30％-99.9％、31％-99.9％、32％-99.9％、33％-99.9％、34％-99.9％、35％-99.9％、36％-99.9％、37％-99.9％、38％-99.9％、39％-99.9％、40％-99.9％、45％-99.9％、50％-99.9％、55％-99.9％、60％-99.9％、65％-99.9％、70％-99.9％、75％-99.9％、80％-99.9％、85％-99.9％、90％-99.9％或95-99.9％，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液PCSK9蛋白水平降低1％-99.5％、1％-99％、1％-98％、1％-97％、1％-96％、1％-95％、1％-90％、1％-85％、1％-80％、1％-79％、1％-78％、1％-77％、1％-76％、1％-75％、1％-74％、1％-73％、1％-72％、1％-71％、1％-70％、1％-65％、1％-60％、1％-55％、1％-50％、1％-45％、1％-40％、1％-39％、1％-38％、1％-37％、1％-36％、1％-35％、1％-34％、1％-33％、1％-32％、1％-31％、1％-30％、1％-25％、1％-20％、1％-15％、1％-10％、1％-9％、1％-8％、1％-7％、1％-6％、1％-5％、1％-4％、1％-3％或1％-2％，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液PCSK9蛋白水平降低1％-99.9％、5％-99.5％、10％-99％、15％-97％、20％-95％、25％-90％、30％-85％、31％-80％、32％-79％、33％-78％、34％-77％、35％-76％、36％-76％、37％-75％、38％-74％、39％-73％、40％-72％、45％-71％、50％-70％或55％-65％，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液PCSK9蛋白水平降低100％，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。
在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液PCSK9蛋白水平为至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、75％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％更少，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液PCSK9蛋白水平减少到至少1/1.1、1/1.2、1/1.3、1/1.4、1/1.5、1/1.6、1/1.7、1/1.8、1/1.9、1/2、1/2.5、1/3、1/3.5、1/4、1/4.5、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10或超过1/10，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。
在一些实施方案中，与施用之前相比对象的血液PCSK9蛋白水平的降低或血液PCSK9蛋白水平通过ELISA(酶联免疫吸附测定)测量。在一些实施方案中，与施用之前相比对象的血液PCSK9蛋白水平的降低或血液PCSK9蛋白水平通过蛋白质印迹分析测量。在一些实施方案中，与施用之前相比对象的血液PCSK9蛋白水平的降低或血液PCSK9蛋白水平通过LC-MS/MS(液相色谱-串联质谱法)测量。
在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液ANGPTL3蛋白水平降低至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液ANGPTL3蛋白水平降低至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、90％、95％、97％、98％、99％、99.3％、99.5％、99.7％、99.8％或99.9％，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液ANGPTL3蛋白水平降低至多1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、90％、95％、97％、98％、99％、99.3％、99.5％、99.7％、99.8％或99.9％，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液ANGPTL3蛋白水平降低1％-99.9％、2％-99.9％、3％-99.9％、4％-99.9％、5％-99.9％、6％-99.9％、7％-99.9％、8％-99.9％、9％-99.9％、10％-99.9％、15％-99.9％、20％-99.9％、25％-99.9％、30％-99.9％、31％-99.9％、32％-99.9％、33％-99.9％、34％-99.9％、35％-99.9％、36％-99.9％、37％-99.9％、38％-99.9％、39％-99.9％、40％-99.9％、45％-99.9％、50％-99.9％、55％-99.9％、60％-99.9％、65％-99.9％、70％-99.9％、75％-99.9％、80％-99.9％、85％-99.9％、90％-99.9％或95-99.9％，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液ANGPTL3蛋白水平降低1％-99.5％、1％-99％、1％-98％、1％-97％、1％-96％、1％-95％、1％-90％、1％-85％、1％-80％、1％-79％、1％-78％、1％-77％、1％-76％、1％-75％、1％-74％、1％-73％、1％-72％、1％-71％、1％-70％、1％-65％、1％-60％、1％-55％、1％-50％、1％-45％、1％-40％、1％-39％、1％-38％、1％-37％、1％-36％、1％-35％、1％-34％、1％-33％、1％-32％、1％-31％、1％-30％、1％-25％、1％-20％、1％-15％、1％-10％、1％-9％、1％-8％、1％-7％、1％-6％、1％-5％、1％-4％、1％-3％或1％-2％，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液ANGPTL3蛋白水平降低1％-99.9％、5％-99.5％、10％-99％、15％-97％、20％-95％、25％-90％、30％-85％、31％-80％、32％-79％、33％-78％、34％-77％、35％-76％、36％-76％、37％-75％、38％-74％、39％-73％、40％-72％、45％-71％、50％-70％或55％-65％，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液ANGPTL3蛋白水平降低100％，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。
在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液ANGPTL3蛋白水平为至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、75％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％更少，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液ANGPTL3蛋白水平减少到至少1/1.1、1/1.2、1/1.3、1/1.4、1/1.5、1/1.6、1/1.7、1/1.8、1/1.9、1/2、1/2.5、1/3、1/3.5、1/4、1/4.5、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10或超过1/10，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。
在一些实施方案中，与施用之前相比对象的血液ANGPTL3蛋白水平的降低或血液ANGPTL3蛋白水平通过ELISA(酶联免疫吸附测定)测量。在一些实施方案中，与施用之前相比对象的血液ANGPTL3蛋白水平的降低或血液ANGPTL3蛋白水平通过蛋白质印迹分析测量。在一些实施方案中，与施用之前相比对象的血液ANGPTL3蛋白水平的降低或血液ANGPTL3蛋白水平通过LC-MS/MS(液相色谱-串联质谱法)测量。
在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平降低至少35％。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平降低至少35％、40％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平降低至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.3％、99.5％、99.7％、99.8％或99.9％。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平降低至多1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.3％、99.5％、99.7％、99.8％或99.9％。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平降低1％-99.9％、2％-99.9％、3％-99.9％、4％-99.9％、5％-99.9％、6％-99.9％、7％-99.9％、8％-99.9％、9％-99.9％、10％-99.9％、15％-99.9％、20％-99.9％、25％-99.9％、30％-99.9％、35％-99.9％、40％-99.9％、45％-99.9％、50％-99.9％、55％-99.9％、60％-99.9％、65％-99.9％、70％-99.9％、75％-99.9％、80％-99.9％、85％-99.9％、90％-99.9％或95-99.9％。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平降低1％-99.5％、1％-99％、1％-98％、1％-97％、1％-96％、1％-95％、1％-90％、1％-85％、1％-80％、1％-75％、1％-70％、1％-65％、1％-60％、1％-55％、1％-50％、1％-45％、1％-40％、1％-35％、1％-30％、1％-25％、1％-20％、1％-15％、1％-10％、1％-9％、1％-8％、1％-7％、1％-6％、1％-5％、1％-4％、1％-3％或1％-2％。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平降低1％-99.9％、5％-99.5％、10％-99％、15％-97％、20％-95％、25％-90％、30％-85％、35％-80％、40％-75％、45％-70％、50％-65％或55％-60％。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平降低100％。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平为至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、75％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％更少。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平减少到至少1/1.1、1/1.2、1/1.3、1/1.4、1/1.5、1/1.6、1/1.7、1/1.8、1/1.9、1/2、1/2.5、1/3、1/3.5、1/4、1/4.5、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10或超过1/10。
在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液甘油三酯水平降低至少35％。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液甘油三酯水平降低至少30％、35％、40％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液甘油三酯水平降低至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.3％、99.5％、99.7％、99.8％或99.9％。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液甘油三酯水平降低至多1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.3％、99.5％、99.7％、99.8％或99.9％。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液甘油三酯水平降低1％-99.9％、2％-99.9％、3％-99.9％、4％-99.9％、5％-99.9％、6％-99.9％、7％-99.9％、8％-99.9％、9％-99.9％、10％-99.9％、15％-99.9％、20％-99.9％、25％-99.9％、30％-99.9％、35％-99.9％、40％-99.9％、45％-99.9％、50％-99.9％、55％-99.9％、60％-99.9％、65％-99.9％、70％-99.9％、75％-99.9％、80％-99.9％、85％-99.9％、90％-99.9％或95-99.9％。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液甘油三酯水平降低1％-99.5％、1％-99％、1％-98％、1％-97％、1％-96％、1％-95％、1％-90％、1％-85％、1％-80％、1％-75％、1％-70％、1％-65％、1％-60％、1％-55％、1％-50％、1％-45％、1％-40％、1％-35％、1％-30％、1％-25％、1％-20％、1％-15％、1％-10％、1％-9％、1％-8％、1％-7％、1％-6％、1％-5％、1％-4％、1％-3％或1％-2％。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液甘油三酯水平降低1％-99.9％、5％-99.5％、10％-99％、15％-97％、20％-95％、25％-90％、30％-85％、35％-80％、40％-75％、45％-70％、50％-65％或55％-60％。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液甘油三酯水平降低100％。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液甘油三酯水平为至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、75％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％更少。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液甘油三酯水平减少到至少1/1.1、1/1.2、1/1.3、1/1.4、1/1.5、1/1.6、1/1.7、1/1.8、1/1.9、1/2、1/2.5、1/3、1/3.5、1/4、1/4.5、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10或超过1/10。
在一些实施方案中，与施用之前相比对象的血液甘油三酯水平或血液甘油三酯水平的降低通过任何标准技术测量。在一些实施方案中，与施用之前相比对象的血液低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平或血液低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平的降低通过任何标准技术测量。例如，临床分析仪仪器可以用于测量血清样品中的‘脂质组组(lipid panel)’，这需要通过酶直接测量胆固醇(总C)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。针对每种分析物的特定试剂盒含有缓冲液、校准物、空白和对照。如本公开内容所用，胆固醇、甘油三酯和HDL-C可以使用特定酶促反应产物的吸光度测量进行定量。LDL-C可以间接地确定。在一些情况下，大多数循环胆固醇可以在三种主要的脂蛋白级分中找到：极低密度脂蛋白(VLDL)、LDL和HDL。在一些实施方案中，总循环胆固醇可以通过下式估计：[总C]＝[VLDL-C]+[LDL-C]+[HDL-C]。因此，LDL-C可以由总胆固醇、甘油三酯和HDL-C的测量值根据以下关系计算：[LDL-C]＝[总C]-[HDL-C]-[TG]/5，其中[TG]/5是VLDL-胆固醇的估计值。可以使用针对甘油三酯的含有缓冲液、校准物、空白和对照的特定试剂盒。如本文所用，使用一系列偶联酶促反应可以分析来自研究的血清样品，并且可以测量甘油三酯。在一些实施方案中，H2O2作为分析物的最终产物可以用于定量分析物，并且它在500nm处的吸光度和颜色强度与甘油三酯浓度成比例。
在一些实施方案中，指导多核苷酸是指导RNA，其中所述指导RNA包含与PCSK9基因的原间隔子序列的互补链结合且具有0、1或2个错配的间隔子序列。在一些实施方案中，所述指导RNA包含与PCSK9基因的原间隔子序列的互补链结合且具没有错配的间隔子序列。在一些实施方案中，所述指导RNA包含与PCSK9基因的原间隔子序列的互补链结合且具有1个错配的间隔子序列。在一些实施方案中，所述指导RNA包含与PCSK9基因的原间隔子序列的互补链结合且具有2个错配的间隔子序列。在一些实施方案中，所述指导RNA包含与PCSK9基因的原间隔子序列的互补链结合且具有3个错配的间隔子序列。在一些实施方案中，所述指导RNA包含与PCSK9基因的原间隔子序列的互补链结合且具有4个错配的间隔子序列。在一些实施方案中，所述指导RNA包含与PCSK9基因的原间隔子序列的互补链结合且具有5个错配的间隔子序列。
在一些实施方案中，指导多核苷酸是指导RNA，其中所述指导RNA包含与ANGPTL3基因的原间隔子序列的互补链结合且具有0、1或2个错配的间隔子序列。在一些实施方案中，所述指导RNA包含与ANGPTL3基因的原间隔子序列的互补链结合且具没有错配的间隔子序列。在一些实施方案中，所述指导RNA包含与ANGPTL3基因的原间隔子序列的互补链结合且具有1个错配的间隔子序列。在一些实施方案中，所述指导RNA包含与ANGPTL3基因的原间隔子序列的互补链结合且具有2个错配的间隔子序列。在一些实施方案中，所述指导RNA包含与ANGPTL3基因的原间隔子序列的互补链结合且具有3个错配的间隔子序列。在一些实施方案中，所述指导RNA包含与ANGPTL3基因的原间隔子序列的互补链结合且具有4个错配的间隔子序列。在一些实施方案中，所述指导RNA包含与ANGPTL3基因的原间隔子序列的互补链结合且具有5个错配的间隔子序列。
在一些实施方案中，核碱基改变位于对象的小于1％的全部肝脏细胞中的原间隔子序列之外，如通过净核碱基编辑测量。在一些实施方案中，核碱基改变位于对象的小于1％的肝细胞中的原间隔子序列之外，如通过净核碱基编辑测量。在一些实施方案中，核碱基改变仅位于原间隔子序列之内，如通过净核碱基编辑测量。
在一些实施方案中，核碱基改变位于对象的小于0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％、6.0％、7.0％、8.0％、9.0％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、65％、80％、85％、90％的全部肝脏细胞中的原间隔子序列之外，如通过净核碱基编辑测量。在一些实施方案中，核碱基改变位于对象的小于0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％、6.0％、7.0％、8.0％、9.0％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、65％、80％、85％、90％的肝细胞中的原间隔子序列之外，如通过净核碱基编辑测量。在一些实施方案中，核碱基改变位于对象的小于0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％、6.0％、7.0％、8.0％、9.0％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、65％、80％、85％、90％的细胞中的原间隔子序列之外，如通过净核碱基编辑测量。
在一些实施方案中，脱氨酶是腺嘌呤脱氨酶。在一些实施方案中，核碱基改变是A·T至G·C改变。在一些实施方案中，脱氨酶是腺嘌呤脱氨酶，并且核碱基改变是A·T至G·C改变。在一些实施方案中，所述可编程DNA结合结构域包含核酸酶活性丧失的Cas9或Cas9切口酶。在一些实施方案中，所述可编程DNA结合结构域包含Cas9。
在一些实施方案中，所述核碱基改变是在所述PCSK9基因的剪接位点处。在一些实施方案中，所述核碱基改变是在所述PCSK9基因的剪接供体位点处。在一些实施方案中，所述剪接供体位点是在PCSK9内含子1的5’末端处，如SEQ ID NO:5中所引用。在一些实施方案中，所述核碱基改变是在所述PCSK9基因的剪接受体位点处。在一些实施方案中，所述核碱基改变在由所述PCSK9基因编码的转录物中产生移码、提前终止密码子、插入或缺失。在一些实施方案中，所述核碱基改变产生由所述PCSK9基因编码的异常转录物。在一些实施方案中，所述指导多核苷酸是指导RNA。在一些实施方案中，所述指导RNA是经化学修饰的。在一些实施方案中，所述指导RNA包含tracrRNA序列。在一些实施方案中，所述指导RNA包含如表1或表24中列出的化学修饰。
在一些实施方案中，所述核碱基改变是在所述ANGPTL3基因的剪接位点处。在一些实施方案中，所述核碱基改变是在所述ANGPTL3基因的剪接供体位点处。在一些实施方案中，所述剪接供体位点是在ANGPTL3内含子6的5’末端处，如SEQ ID NO:7中所引用。在一些实施方案中，所述核碱基改变是在所述ANGPTL3基因的剪接受体位点处。在一些实施方案中，所述核碱基改变在由所述ANGPTL3基因编码的转录物中产生移码、提前终止密码子、插入或缺失。在一些实施方案中，所述核碱基改变产生由所述ANGPTL3基因编码的异常转录物。在一些实施方案中，所述指导多核苷酸是指导RNA。在一些实施方案中，所述指导RNA是经化学修饰的。在一些实施方案中，所述指导RNA包含tracrRNA序列。在一些实施方案中，所述指导RNA包含如表1或表24中列出的化学修饰。
在一些实施方案中，所述指导RNA包含如表1或表24中列出的指导RNA序列。在一些实施方案中，所述指导RNA包含序列5’-5’-cscscsGCACCUUGGCGCAGCGGgUUUUAGagcuaGaaauagcaaGUUaAaAuAaggCUaGUCcGUUAucAAcuuGaaaaaguGgcaccgAgUCggugcusususu-3’(SEQ IDNO:9),5’-cscscsGCACCUUGGCGCAGCGGgUUUUAGagcuagaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuugaaaaagugGcaccgagucggugcusususu-3’(SEQ ID NO:9),5’-cscscsGCACCUUGGCGCAGCGGgUUUUAGagcuaGaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuuGaaaaagugGcaccgagucggugcusususu-3’(SEQ ID NO:9)(GA346),5’-cscscsGCACCUUGGCGCAGCGGgUUUUAGagcuagaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAacAAcuugaaaaagugGcaccgagucggugcusususu-3’(SEQ ID NO:10)(GA374),5’-cscscsGCACCUUGGCGCAGCGGgUUUUAGagcuagaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuugaaaaagugGcaccgagucggugcusususuuuu-3’(SEQ ID NO:11)(GA385),5’-cscscsGCACCUUGGCGCAGCGGgUUUUAGagcuagaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuugaaaaagugGcaccgagucggugcusususuuUu-3’(SEQ ID NO:11)(GA386)or 5’-cscscsGCACCUUGGCGCAGCGgUUUUAGagcuaGaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuuGaaaaagugGcaccgagucggugcuususuuuu-3’(SEQ ID NO:12)(GA387).
在一些实施方案中，所述原间隔子序列包括表1或表24中列出的原间隔子序列。在一些实施方案中，所述原间隔子包含序列5’-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3’(SEQ ID NO:13),AAGATACCTGAATAACTCTC-3’(SEQ ID NO:14),and 5’-AAGATACCTGAATAACCCTC-3’(SEQ IDNO:15).
在一些实施方案中，所述碱基编辑器融合蛋白包含SEQ ID NO:3的序列。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含与SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列或与本文提供的腺苷脱氨酶中的任一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。应理解，本文提供的腺苷脱氨酶可以包含一个或多个突变(例如，本文提供的突变中的任一种)。本公开内容提供了具有某一同一性百分比加上本文所述的突变中的任一种或其组合的任何脱氨酶结构域。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含与
SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列或本文提供的腺苷脱氨酶中的任一种相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、21、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多个突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含与SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列或本文提供的腺苷脱氨酶中的任一种相比具有至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少110个、至少120个、至少130个、至少140个、至少150个、至少160个或至少170个相同的连续氨基酸残基的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码碱基编辑器融合蛋白的核酸是mRNA。mRNA可以包含修饰，例如，在mRNA的3’或5’末端处的修饰。在一些实施方案中，mRNA包含帽类似物。
在一些实施方案中，mRNA在5’末端处包含至少1、2或3个核苷酸，所述核苷酸包含2’-羟基基团、2’-O-甲基基团或另外的2’化学修饰或其组合。在一些实施方案中，mRNA在5’末端处包含至少1、2或3个核苷酸，所述核苷酸包含2’-羟基基团、2’-O-甲基基团或另外的2’化学修饰或其组合。在一些实施方案中，mRNA在5’末端处包含至少1个核苷酸，所述核苷酸包含2’-羟基基团、2’-O-甲基基团或另外的2’化学修饰或其组合。在一些实施方案中，mRNA在5’末端处包含至少2个核苷酸，所述核苷酸包含2’-羟基基团、2’-O-甲基基团或另外的2’化学修饰或其组合。在一些实施方案中，mRNA在5’末端处包含至少3个核苷酸，所述核苷酸包含2’-羟基基团、2’-O-甲基基团或另外的2’化学修饰或其组合。在一些实施方案中，mRNA在5’末端处包含至少4个核苷酸，所述核苷酸包含2’-羟基基团、2’-O-甲基基团或另外的2’化学修饰或其组合。在一些实施方案中，mRNA在5’末端处包含至少5个核苷酸，所述核苷酸包含2’-羟基基团、2’-O-甲基基团或另外的2’化学修饰或其组合。在一些实施方案中，mRNA在5’末端处包含至少6个核苷酸，所述核苷酸包含2’-羟基基团、2’-O-甲基基团或另外的2’化学修饰或其组合。在一些实施方案中，mRNA在5’末端处包含至少7个核苷酸，所述核苷酸包含2’-羟基基团、2’-O-甲基基团或另外的2’化学修饰或其组合。在一些实施方案中，mRNA在5’末端处包含至少8个核苷酸，所述核苷酸包含2’-羟基基团、2’-O-甲基基团或另外的2’化学修饰或其组合。在一些实施方案中，mRNA在5’末端处包含至少9个核苷酸，所述核苷酸包含2’-羟基基团、2’-O-甲基基团或另外的2’化学修饰或其组合。在一些实施方案中，mRNA在5’末端处包含至少10个核苷酸，所述核苷酸包含2’-羟基基团、2’-O-甲基基团或另外的2’化学修饰或其组合。
在一些实施方案中，mRNA包含多聚A尾。多聚A尾可以在mRNA的3’末端处。
在一些实施方案中，mRNA序列的GC％含量大于或等于40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％。在一些实施方案中，mRNA序列的GC％含量大于或等于40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％。
在一些实施方案中，mRNA序列包含腺嘌呤tTNA脱氨酶(TadA)区。在一些实施方案中，TadA区的GC％大于或等于40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％。在一些实施方案中，TadA区的GC％含量大于或等于40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％。
在一些实施方案中，mRNA序列包含Cas9区。在一些实施方案中，Cas9区的GC％大于或等于40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％。在一些实施方案中，Cas9区的GC％含量大于或等于40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％。
在一些实施方案中，mRNA序列包含NLS区。在一些实施方案中，NLS区的GC％大于或等于40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％。在一些实施方案中，NLS区的GC％含量大于或等于40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％。
在一些实施方案中，mRNA序列包含连接TadA区和Cas9区的第一接头区。在一些实施方案中，第一接头区的GC％大于或等于40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％。在一些实施方案中，第一接头区的GC％含量大于或等于40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％。
在一些实施方案中，mRNA序列包含连接Cas9区和NLS区的第二接头区。在一些实施方案中，第二接头区的GC％大于或等于40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％。在一些实施方案中，第二接头区的GC％含量大于或等于40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％。
在一些实施方案中，如本文提供的碱基编辑器系统还包含脂质纳米颗粒(LNP)，所述脂质纳米颗粒包封指导多核苷酸或编码指导多核苷酸的核酸(i)。在一些实施方案中，所述LNP还包封包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸(ii)。在一些实施方案中，碱基编辑器系统还包含第二LNP，所述第二LNP包封包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸(ii)。
如本文提供的碱基编辑器系统可以包含一个或多个LNP。例如，碱基编辑器系统可以包含LNP，所述LNP包封指导多核苷酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸(例如，编码碱基编辑器融合蛋白的mRNA)两者。在另一个实例中，碱基编辑器系统可以包含包封指导多核苷酸(例如，指导RNA)的LNP和包封编码碱基编辑器融合蛋白的核酸(例如，mRNA)的LNP。单独包封指导多核苷酸和碱基编辑器融合蛋白或编码碱基编辑器融合蛋白的mRNA的LNP可以允许进行碱基编辑器系统的灵活给药和施用。例如，可以首先施用包封指导RNA的LNP，接着施用包封编码碱基编辑器融合蛋白的mRNA的LNP。在一些实施方案中，可以向对象同时施用包封指导RNA的LNP和包封编码碱基编辑器融合蛋白的mRNA的第二LNP。在一些实施方案中，可以向对象顺序施用包封指导RNA的LNP和包封编码碱基编辑器蛋白的mRNA的LNP。在一些实施方案中，向对象施用包封编码碱基编辑器融合蛋白的mRNA的LNP，接着在1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周或12周或更长时间之后多次施用或施用多个剂量的包封指导RNA的LNP。多个剂量的第二LNP可以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或更长时间的间隔施用。
在一些实施方案中，指导多核苷酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的比率是按重量计约1:10至约10:1。在一些实施方案中，指导多核苷酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的比率是按重量计约1:1、1.5:1、2:1、3:1、4:1、1:1.5、1:2、1:3、1:4或4:1或1:4之间的任何比率。在一些实施方案中，指导多核苷酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的比率可以通过指导多核苷酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的滴定来确定。
在一些实施方案中，指导多核苷酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的摩尔比是约500:1至约1:500。
在一些实施方案中，指导多核苷酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的比率是按重量计约1000:1至约1:1000。在一些实施方案中，指导多核苷酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的比率是按重量计约1000:1、950:1、900:1、850:1、800:1、750:1、700:1、650:1、600:1、550:1、500:1、450:1、400:1、350:1、300:1、250:1、200:1、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、19:1、18:1、17:1、17:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2；1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1.0:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0.2:1或0.1。在一些实施方案中，指导多核苷酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的比率是按重量计约1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100、1:150、1:200、1:250、1:300、1:350、1:400、1:450、1:500、1:550、1:600、1:650、1:700、1:750、1:800、1:850、1:900、1:950或1:1000。在一些实施方案中，指导多核苷酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的比率是按重量计至少约1000:1、950:1、900:1、850:1、800:1、750:1、700:1、650:1、600:1、550:1、500:1、450:1、400:1、350:1、300:1、250:1、200:1、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、19:1、18:1、17:1、17:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2；1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1.0:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0.2:1或0.1。在一些实施方案中，指导多核苷酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的比率是按重量计至少约1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100、1:150、1:200、1:250、1:300、1:350、1:400、1:450、1:500、1:550、1:600、1:650、1:700、1:750、1:800、1:850、1:900、1:950或1:1000。在一些实施方案中，指导多核苷酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的比率是按重量计至多约1000:1、950:1、900:1、850:1、800:1、750:1、700:1、650:1、600:1、550:1、500:1、450:1、400:1、350:1、300:1、250:1、200:1、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、19:1、18:1、17:1、17:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2；1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1.0:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0.2:1或0.1。在一些实施方案中，指导多核苷酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的比率是按重量计至多约1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100、1:150、1:200、1:250、1:300、1:350、1:400、1:450、1:500、1:550、1:600、1:650、1:700、1:750、1:800、1:850、1:900、1:950或1:1000。
在一些实施方案中，指导多核苷酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的摩尔比是约10000:1至约1:10000。在一些实施方案中，指导多核苷酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的摩尔比是约10000:1、9500:1、9000:1、8500:1、8000:1、7500:1、7000:1、6500:1、6000:1、5500:1、5000:1、4500:1、4000:1、3500:1、3000:1、2500:1、2000:1、1500:1、1000:1、950:1、900:1、850:1、800:1、750:1、700:1、650:1、600:1、550:1、500:1、450:1、400:1、350:1、300:1、250:1、200:1、190:1、180:1、170:1、160:1、150:1、140:1、130:1、120:1、110:1、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、69:1、68:1、67:1、66:1、65:1、64:1、63:1、62:1、61:1、60:1、59:1、58:1、57:1、56:1、55:1、54:1、53:1、52:1、51:1、50:1、49:1、48:1、47:1、46:1、45:1、44:1、43:1、42:1、41:1、40:1、39:1、38:1、37:1、36:1、35:1、34:1、33:1、32:1、31:1、30:1、29:1、28:1、27:1、26:1、25:1、24:1、23:1、22:1、21:1、20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0.2:1或0.1:1。在一些实施方案中，指导多核苷酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的摩尔比是至少约1:10000、1:9500、1:9000、1:8500、1:8000、1:7500、1:7000、1:6500、1:6000、1:5500、1:5000、1:4500、1:4000、1:3500、1:3000、1:2500、1:2000、1:1500、1:1000、1:950、1:900、1:850、1:800、1:750、1:700、1:650、1:600、1:550、1:500、1:450、1:400、1:350、1:300、1:250、1:200、1:190、1:180、1:170、1:160、1:150、1:140、1:130、1:120、1:110、1:100、1:95、1:90、1:85、1:80、1:75、1:70、1:69、1:68、1:67、1:66、1:65、1:64、1:63、1:62、1:61、1:60、1:59、1:58、1:57、1:56、1:55、1:54、1:53、1:52、1:51、1:50、1:49、1:48、1:47、1:46、1:45、1:44、1:43、1:42、1:41、1:40、1:39、1:38、1:37、1:36、1:35、1:34、1:33、1:32、1:31、1:30、1:29、1:28、1:27、1:26、1:25、1:24、1:23、1:22、1:21、1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、1:0.9、1:0.8、1:0.7、1:0.6、1:0.5、1:0.4、1:0.3、1:0.2或1:0.1。在一些实施方案中，指导多核苷酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的摩尔比是至少约10000:1、9500:1、9000:1、8500:1、8000:1、7500:1、7000:1、6500:1、6000:1、5500:1、5000:1、4500:1、4000:1、3500:1、3000:1、2500:1、2000:1、1500:1、1000:1、950:1、900:1、850:1、800:1、750:1、700:1、650:1、600:1、550:1、500:1、450:1、400:1、350:1、300:1、250:1、200:1、190:1、180:1、170:1、160:1、150:1、140:1、130:1、120:1、110:1、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、69:1、68:1、67:1、66:1、65:1、64:1、63:1、62:1、61:1、60:1、59:1、58:1、57:1、56:1、55:1、54:1、53:1、52:1、51:1、50:1、49:1、48:1、47:1、46:1、45:1、44:1、43:1、42:1、41:1、40:1、39:1、38:1、37:1、36:1、35:1、34:1、33:1、32:1、31:1、30:1、29:1、28:1、27:1、26:1、25:1、24:1、23:1、22:1、21:1、20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0.2:1或0.1:1。在一些实施方案中，指导多核苷酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的摩尔比是至少约1:10000、1:9500、1:9000、1:8500、1:8000、1:7500、1:7000、1:6500、1:6000、1:5500、1:5000、1:4500、1:4000、1:3500、1:3000、1:2500、1:2000、1:1500、1:1000、1:950、1:900、1:850、1:800、1:750、1:700、1:650、1:600、1:550、1:500、1:450、1:400、1:350、1:300、1:250、1:200、1:190、1:180、1:170、1:160、1:150、1:140、1:130、1:120、1:110、1:100、1:95、1:90、1:85、1:80、1:75、1:70、1:69、1:68、1:67、1:66、1:65、1:64、1:63、1:62、1:61、1:60、1:59、1:58、1:57、1:56、1:55、1:54、1:53、1:52、1:51、1:50、1:49、1:48、1:47、1:46、1:45、1:44、1:43、1:42、1:41、1:40、1:39、1:38、1:37、1:36、1:35、1:34、1:33、1:32、1:31、1:30、1:29、1:28、1:27、1:26、1:25、1:24、1:23、1:22、1:21、1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、1:0.9、1:0.8、1:0.7、1:0.6、1:0.5、1:0.4、1:0.3、1:0.2或1:0.1。在一些实施方案中，指导多核苷酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的摩尔比是至多约10000:1、9500:1、9000:1、8500:1、8000:1、7500:1、7000:1、6500:1、6000:1、5500:1、5000:1、4500:1、4000:1、3500:1、3000:1、2500:1、2000:1、1500:1、1000:1、950:1、900:1、850:1、800:1、750:1、700:1、650:1、600:1、550:1、500:1、450:1、400:1、350:1、300:1、250:1、200:1、190:1、180:1、170:1、160:1、150:1、140:1、130:1、120:1、110:1、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、69:1、68:1、67:1、66:1、65:1、64:1、63:1、62:1、61:1、60:1、59:1、58:1、57:1、56:1、55:1、54:1、53:1、52:1、51:1、50:1、49:1、48:1、47:1、46:1、45:1、44:1、43:1、42:1、41:1、40:1、39:1、38:1、37:1、36:1、35:1、34:1、33:1、32:1、31:1、30:1、29:1、28:1、27:1、26:1、25:1、24:1、23:1、22:1、21:1、20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0.2:1或0.1:1。在一些实施方案中，指导多核苷酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的摩尔比是至多约1:10000、1:9500、1:9000、1:8500、1:8000、1:7500、1:7000、1:6500、1:6000、1:5500、1:5000、1:4500、1:4000、1:3500、1:3000、1:2500、1:2000、1:1500、1:1000、1:950、1:900、1:850、1:800、1:750、1:700、1:650、1:600、1:550、1:500、1:450、1:400、1:350、1:300、1:250、1:200、1:190、1:180、1:170、1:160、1:150、1:140、1:130、1:120、1:110、1:100、1:95、1:90、1:85、1:80、1:75、1:70、1:69、1:68、1:67、1:66、1:65、1:64、1:63、1:62、1:61、1:60、1:59、1:58、1:57、1:56、1:55、1:54、1:53、1:52、1:51、1:50、1:49、1:48、1:47、1:46、1:45、1:44、1:43、1:42、1:41、1:40、1:39、1:38、1:37、1:36、1:35、1:34、1:33、1:32、1:31、1:30、1:29、1:28、1:27、1:26、1:25、1:24、1:23、1:22、1:21、1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、1:0.9、1:0.8、1:0.7、1:0.6、1:0.5、1:0.4、1:0.3、1:0.2或1:0.1。
在一些实施方案中，编码指导多核苷酸的核酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的比率是按重量计约10:1至约1:10。在一些实施方案中，编码指导多核苷酸的核酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的比率是按重量计约4:1、3:1、2:1、1.5:1、1:1、1:1.5、1:2、1:3或1:4。在一些实施方案中，编码指导多核苷酸的核酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的摩尔比是约500:1至约1:500。
在一些实施方案中，编码指导多核苷酸的核酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的比率是按重量计约1000:1至约1:1000。在一些实施方案中，编码指导多核苷酸的核酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的比率是按重量计约1000:1、950:1、900:1、850:1、800:1、750:1、700:1、650:1、600:1、550:1、500:1、450:1、400:1、350:1、300:1、250:1、200:1、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、19:1、18:1、17:1、17:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2；1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1.0:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0.2:1或0.1。在一些实施方案中，编码指导多核苷酸的核酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的比率是按重量计约1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100、1:150、1:200、1:250、1:300、1:350、1:400、1:450、1:500、1:550、1:600、1:650、1:700、1:750、1:800、1:850、1:900、1:950或1:1000。在一些实施方案中，编码指导多核苷酸的核酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的比率是按重量计至少约1000:1、950:1、900:1、850:1、800:1、750:1、700:1、650:1、600:1、550:1、500:1、450:1、400:1、350:1、300:1、250:1、200:1、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、19:1、18:1、17:1、17:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2；1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1.0:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0.2:1或0.1。在一些实施方案中，编码指导多核苷酸的核酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的比率是按重量计至少约1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100、1:150、1:200、1:250、1:300、1:350、1:400、1:450、1:500、1:550、1:600、1:650、1:700、1:750、1:800、1:850、1:900、1:950或1:1000。在一些实施方案中，编码指导多核苷酸的核酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的比率是按重量计至多约1000:1、950:1、900:1、850:1、800:1、750:1、700:1、650:1、600:1、550:1、500:1、450:1、400:1、350:1、300:1、250:1、200:1、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、19:1、18:1、17:1、17:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2；1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1.0:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0.2:1或0.1。在一些实施方案中，编码指导多核苷酸的核酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的比率是按重量计至多约1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100、1:150、1:200、1:250、1:300、1:350、1:400、1:450、1:500、1:550、1:600、1:650、1:700、1:750、1:800、1:850、1:900、1:950或1:1000。
在一些实施方案中，编码指导多核苷酸的核酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的摩尔比是约10000:1至约1:10000。在一些实施方案中，编码指导多核苷酸的核酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的摩尔比是约10000:1、9500:1、9000:1、8500:1、8000:1、7500:1、7000:1、6500:1、6000:1、5500:1、5000:1、4500:1、4000:1、3500:1、3000:1、2500:1、2000:1、1500:1、1000:1、950:1、900:1、850:1、800:1、750:1、700:1、650:1、600:1、550:1、500:1、450:1、400:1、350:1、300:1、250:1、200:1、190:1、180:1、170:1、160:1、150:1、140:1、130:1、120:1、110:1、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、69:1、68:1、67:1、66:1、65:1、64:1、63:1、62:1、61:1、60:1、59:1、58:1、57:1、56:1、55:1、54:1、53:1、52:1、51:1、50:1、49:1、48:1、47:1、46:1、45:1、44:1、43:1、42:1、41:1、40:1、39:1、38:1、37:1、36:1、35:1、34:1、33:1、32:1、31:1、30:1、29:1、28:1、27:1、26:1、25:1、24:1、23:1、22:1、21:1、20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0.2:1或0.1:1。在一些实施方案中，编码指导多核苷酸的核酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的摩尔比是至少约1:10000、1:9500、1:9000、1:8500、1:8000、1:7500、1:7000、1:6500、1:6000、1:5500、1:5000、1:4500、1:4000、1:3500、1:3000、1:2500、1:2000、1:1500、1:1000、1:950、1:900、1:850、1:800、1:750、1:700、1:650、1:600、1:550、1:500、1:450、1:400、1:350、1:300、1:250、1:200、1:190、1:180、1:170、1:160、1:150、1:140、1:130、1:120、1:110、1:100、1:95、1:90、1:85、1:80、1:75、1:70、1:69、1:68、1:67、1:66、1:65、1:64、1:63、1:62、1:61、1:60、1:59、1:58、1:57、1:56、1:55、1:54、1:53、1:52、1:51、1:50、1:49、1:48、1:47、1:46、1:45、1:44、1:43、1:42、1:41、1:40、1:39、1:38、1:37、1:36、1:35、1:34、1:33、1:32、1:31、1:30、1:29、1:28、1:27、1:26、1:25、1:24、1:23、1:22、1:21、1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、1:0.9、1:0.8、1:0.7、1:0.6、1:0.5、1:0.4、1:0.3、1:0.2或1:0.1。在一些实施方案中，编码指导多核苷酸的核酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的摩尔比是至少约10000:1、9500:1、9000:1、8500:1、8000:1、7500:1、7000:1、6500:1、6000:1、5500:1、5000:1、4500:1、4000:1、3500:1、3000:1、2500:1、2000:1、1500:1、1000:1、950:1、900:1、850:1、800:1、750:1、700:1、650:1、600:1、550:1、500:1、450:1、400:1、350:1、300:1、250:1、200:1、190:1、180:1、170:1、160:1、150:1、140:1、130:1、120:1、110:1、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、69:1、68:1、67:1、66:1、65:1、64:1、63:1、62:1、61:1、60:1、59:1、58:1、57:1、56:1、55:1、54:1、53:1、52:1、51:1、50:1、49:1、48:1、47:1、46:1、45:1、44:1、43:1、42:1、41:1、40:1、39:1、38:1、37:1、36:1、35:1、34:1、33:1、32:1、31:1、30:1、29:1、28:1、27:1、26:1、25:1、24:1、23:1、22:1、21:1、20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0.2:1或0.1:1。在一些实施方案中，编码指导多核苷酸的核酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的摩尔比是至少约1:10000、1:9500、1:9000、1:8500、1:8000、1:7500、1:7000、1:6500、1:6000、1:5500、1:5000、1:4500、1:4000、1:3500、1:3000、1:2500、1:2000、1:1500、1:1000、1:950、1:900、1:850、1:800、1:750、1:700、1:650、1:600、1:550、1:500、1:450、1:400、1:350、1:300、1:250、1:200、1:190、1:180、1:170、1:160、1:150、1:140、1:130、1:120、1:110、1:100、1:95、1:90、1:85、1:80、1:75、1:70、1:69、1:68、1:67、1:66、1:65、1:64、1:63、1:62、1:61、1:60、1:59、1:58、1:57、1:56、1:55、1:54、1:53、1:52、1:51、1:50、1:49、1:48、1:47、1:46、1:45、1:44、1:43、1:42、1:41、1:40、1:39、1:38、1:37、1:36、1:35、1:34、1:33、1:32、1:31、1:30、1:29、1:28、1:27、1:26、1:25、1:24、1:23、1:22、1:21、1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、1:0.9、1:0.8、1:0.7、1:0.6、1:0.5、1:0.4、1:0.3、1:0.2或1:0.1。在一些实施方案中，编码指导多核苷酸的核酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的摩尔比是至多约10000:1、9500:1、9000:1、8500:1、8000:1、7500:1、7000:1、6500:1、6000:1、5500:1、5000:1、4500:1、4000:1、3500:1、3000:1、2500:1、2000:1、1500:1、1000:1、950:1、900:1、850:1、800:1、750:1、700:1、650:1、600:1、550:1、500:1、450:1、400:1、350:1、300:1、250:1、200:1、190:1、180:1、170:1、160:1、150:1、140:1、130:1、120:1、110:1、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、69:1、68:1、67:1、66:1、65:1、64:1、63:1、62:1、61:1、60:1、59:1、58:1、57:1、56:1、55:1、54:1、53:1、52:1、51:1、50:1、49:1、48:1、47:1、46:1、45:1、44:1、43:1、42:1、41:1、40:1、39:1、38:1、37:1、36:1、35:1、34:1、33:1、32:1、31:1、30:1、29:1、28:1、27:1、26:1、25:1、24:1、23:1、22:1、21:1、20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0.2:1或0.1:1。在一些实施方案中，编码指导多核苷酸的核酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的摩尔比是至多约1:10000、1:9500、1:9000、1:8500、1:8000、1:7500、1:7000、1:6500、1:6000、1:5500、1:5000、1:4500、1:4000、1:3500、1:3000、1:2500、1:2000、1:1500、1:1000、1:950、1:900、1:850、1:800、1:750、1:700、1:650、1:600、1:550、1:500、1:450、1:400、1:350、1:300、1:250、1:200、1:190、1:180、1:170、1:160、1:150、1:140、1:130、1:120、1:110、1:100、1:95、1:90、1:85、1:80、1:75、1:70、1:69、1:68、1:67、1:66、1:65、1:64、1:63、1:62、1:61、1:60、1:59、1:58、1:57、1:56、1:55、1:54、1:53、1:52、1:51、1:50、1:49、1:48、1:47、1:46、1:45、1:44、1:43、1:42、1:41、1:40、1:39、1:38、1:37、1:36、1:35、1:34、1:33、1:32、1:31、1:30、1:29、1:28、1:27、1:26、1:25、1:24、1:23、1:22、1:21、1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、1:0.9、1:0.8、1:0.7、1:0.6、1:0.5、1:0.4、1:0.3、1:0.2或1:0.1。
精确基因组编辑是一个具有工业、农业和生物医学应用的不断发展的领域。目前可用的主要基因组编辑系统之一是规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关基因9(Cas9)。通过使用具有与靶基因组(被称为原间隔子，与包含DNA中的序列NGG(N是任何标准碱基)的特定原间隔子相邻基序(PAM)相邻)中的DNA序列同源的序列的指导RNA(gRNA)，Cas9可以用于在靶向序列处创建双链断裂(DSB)。DSB处的非同源末端接合(NHEJ)可以用于在遗传基因座处产生插入缺失并敲除基因；同样，同源定向修复(HDR)可以与引入的模板DNA一起用于插入基因或修改靶向序列。近年来已经开发了各种基于Cas9的工具，包括使DNA甲基化、识别更广泛的序列空间或创建单链切口的工具。在2016,Komor等人中描述了使用CRISPR-Cas9将胞嘧啶碱基转化为胸腺嘧啶碱基而不引入模板DNA链也不需要DSB(Komor AC,Kim YB,Packer MS等人Programmable editing of a target base ingenomic DNA without double-stranded DNA cleavage.Nature,2016,533:420-4，通过引用以其全文并入本文)。在使用接头XTEN将大鼠APOBEC1的胞苷脱氨酶结构域与催化失活Cas9(dCas9)的N末端融合(从而产生被称为碱基编辑器1或BE1的融合蛋白)之后，在DNA的20-nt原间隔子区内的位置4与位置8(或者以另一种方式表达，PAM上游的13至17核苷酸)之间观察到胞嘧啶转化为尿嘧啶。值得注意的是，此“窗口”内的任何胞嘧啶碱基都适于进行编辑，从而导致不同的结果，这取决于有多少和哪些胞嘧啶被编辑。在DNA复制或修复之后，每个尿嘧啶被胸腺嘧啶替换，从而完成C至T碱基编辑。下一版本的碱基编辑器(BE2)并入了与dCas9的C末端融合的尿嘧啶糖基化酶抑制剂，以帮助抑制由胞苷脱氨酶活性引起的尿嘧啶碱基的碱基切除修复(否则将导致恢复原始胞嘧啶碱基)；这提高了C至T碱基编辑的效率。最终版本BE3使用Cas9切口酶而不是dCas9；切口酶切割与经编辑的C至T碱基相反的未编辑链，从而通过真核错配修复刺激相反的胍去除。在人和鼠细胞系中均观察到BE2和BE3碱基编辑。通过在Cas9切口酶中添加突变，碱基编辑的特异性得到了进一步提高；以类似的方式，Cas9已经发生突变，将编辑窗口的宽度从大约5个核苷酸缩小到1-2个核苷酸(ReesHA,Komor AC,Yeh WH等人Improving the DNA specificity and applicability of baseediting through protein engineering and protein delivery.Nat Commun,2017,8:15790,Kim YB,Komor AC,Levy JM等人Increasing the genome-targeting scope andprecision of base editing with engineered Cas9-cytidine deaminase fusions.NatBiotechnol,2017,35:371-6，其中的每一个通过引用以其全文并入本文)。
替代性胞嘧啶碱基编辑平台是通过将激活诱导的胞嘧啶脱氨酶结构域PmCDA1与dCas9(Target-AID)连接，它们能够在酵母中展示靶向C至T碱基编辑。此外，还展示了替代性C至T编辑策略，而无需将脱氨酶结构域与Cas9融合；相反，将SH3(Src 3同源性)结构域添加到dCas9的C末端，同时将SHL(SH3相互作用配体)添加到PmCDA1.6中。通过使用Cas9切口酶而不是dCas9实现了效率优化。此外，添加尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂以增强哺乳动物CHO细胞系中的碱基编辑。所得的平台能够一致地编辑PAM序列上游第18个核苷酸的3至5个碱基内的碱基(Nishida K,Arazoe T,Yachie N等人Targeted nucleotide editing usinghybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems.Science,2016,353:aaf8729，通过引用以其全文并入本文)。
一个不同的胞嘧啶碱基编辑平台使用Cpf1(也称为Cas12a)而不是Cas9作为RNA指导核酸内切酶。催化活性丧失的Cpf1与APOBEC1(dLbCpf1-BE0)融合，导致人细胞系中的C至T转化。虽然Cas9碱基编辑器变体BE3和Target-AID识别PAM序列NGG，但dLbCpf1-BE0识别富含T的PAM序列TTTV。尽管使用dLbCpf1-BE0在原间隔子序列的位置8与位置13之间观察到碱基编辑，但将另外的突变引入到Cpf1中能够将窗口减少到位置10至位置12。然而，碱基编辑窗口的变窄与编辑效率的降低相关(Li X,Wang Y,Liu Y等人Base editing with a Cpf1-cytidine deaminase fusion.Nat Biotechnol,2018,36:324-7，通过引用以其全文并入本文)。
胞嘧啶碱基编辑并非完全可预测；插入缺失可能发生在靶位点处，尽管频率低于针对C至T编辑编辑器观察到的频率。此外，胞嘧啶碱基编辑器可能偶尔导致C至A或C至G编辑，而不是预期的C至T编辑。将Cas9切口酶与大鼠APOBEC1胞嘧啶脱氨酶结构域之间的接头长度从16个氨基酸增加到32个氨基酸，将Cas9切口酶与尿嘧啶糖基化酶抑制剂之间的接头从4个氨基酸增加到9个氨基酸，并且使用第二尿嘧啶糖基化酶抑制剂附加到新的胞嘧啶碱基编辑器的C末端，使用另一种9个氨基酸接头改善被称为“BE4”的胞嘧啶碱基编辑器(Komor AC,Zhao KT,Packer MS等人Improved base excision repair inhibition andbacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higherefficiency and product purity.Sci Adv,2017,3:eaao4774。通过引用以其全文并入本文)。
通过将大肠杆菌腺嘌呤tTNA脱氨酶TadA(ecTadA)与dCas9融合和ecTadA结构域的诱变结合编辑活性的选择，揭示了A106V和D108N突变产生能够在DNA中将腺嘌呤编辑为鸟嘌呤的碱基编辑器，被称为ABE7.10(Gaudelli NM,Komor AC,Rees HA等人Programmablebase editing of A·T to G·C in genomic DNA without DNA cleavage.Nature,2017,551:464-71。通过引用以其全文并入本文)。Koblan等人通过改变核定位信号和密码子优化提高了ABE7.10的效率，产生了被称为ABEmax的版本；类似的方法提高了胞嘧啶碱基编辑器BE4.10的效率。Huang等人进一步开发了腺嘌呤和胞嘧啶碱基编辑器两者，以使用替代性PAM并扩展其编辑窗口，从而增加其靶向范围(Improving cytidine and adenine baseeditors by expressionoptimization and ancestral reconstruction.NatBiotechnol,2018,36:843-6，通过引用以其全文并入本文)。
碱基编辑器12-14被证明也是如此，尽管使用相同gRNA的Cas9、胞嘧啶碱基编辑器和腺嘌呤碱基编辑器的比较显示不同的脱靶谱。
各种研究引起了对gRNA非依赖性脱靶碱基编辑的关注，这是由脱氨酶结构域单独作用引起的(不需要Cas9-gRNA复合物与DNA的接合)。另外的研究显示，碱基编辑器的gRNA非依赖性脱靶效应并不限于DNA。用胞嘧啶碱基编辑器或腺嘌呤碱基编辑器处理的细胞的RNA测序揭示了RNA的全转录组脱靶编辑，并且在腺嘌呤碱基(例如，R106W)的脱氨酶结构域中引入氨基酸取代减少了RNA的脱靶编辑，而不会明显降低中靶DNA碱基编辑效率。Zuo E,Sun Y,Wei W等人Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos.Science,2019,364:289-92；Jin S,Zong Y,GaoQ等人Cytosine,but not adenine,base editors induce genome-wide off-targetmutations in rice.Science,2019,364:292-5；Grünewald J,Zhou R,Garcia SP等人Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA baseeditors.Nature,2019,569:433-7；Grünewald J,Zhou R,Iyer S等人CRISPR DNA baseeditors with reduced RNA off-target and self-editing activities.NatBiotechnol,2019,37:1041-8；Zhou C,Sun Y,Yan R等人Off-target RNA mutationinduced by DNA base editing and its elimination by mutagenesis.Nature,2019,571:275-8；Rees HA,Wilson C,Doman JL等人Analysis and minimization of cellularRNA editing by DNA adenine base editors.Sci Adv,2019,5:eaax5717，其中的每一个通过引用以其全文并入本文)。
经由使用标准Cas9基因组编辑进行精确编辑来校正致病导致的突变在很大程度上需要HDR。由于HDR仅限于有丝分裂的S期或G2期细胞，因此很难对非有丝分裂细胞进行精确编辑。然而，碱基编辑器不依赖于HDR；使用胞嘧啶碱基编辑器BE3对小鼠的有丝分裂后耳蜗细胞进行编辑是可行的。经由阳离子脂质体注射BE3和呈预组装的核糖核蛋白形式的gRNA，β-连环蛋白中的丝氨酸-33被编辑为苯丙氨酸(TCT密码子被编辑为TTT)，从而允许支持细胞转分化为毛细胞。经由测序确认耳蜗组织的碱基编辑，根据耳蜗区域的不同，编辑率在0.7％与3.0％之间。相比之下，经由HDR进行的标准Cas9编辑在耳蜗细胞中显示的功效迹象可忽略不计。据报道，经由腺相关病毒(AAV)载体递送到肝脏中的SaBE3变体直接校正Pah基因中的致病性T至C突变，编辑率高达29％，从而治疗成年小鼠的苯丙酮尿症疾病。腺嘌呤碱基编辑也被证明在小鼠中生成突变。Yeh WH,Chiang H,Rees HA等人In vivo baseediting of post-mitotic sensory cells.Nat Commun,2018,9:2184；Villiger L,Grisch-Chan HM,Lindsay H等人Treatment of a metabolic liver disease by in vivogenome base editing in adult mice.Nat Med,2018,24:1519-25；Ryu SM,Koo T,Kim K等人Adenine base editing in mouse embryos and an adult mouse model ofDuchenne muscular dystrophy.Nat Biotechnol,2018,36:536-9；Song CQ,Jiang T,Richter M等人Adenine base editing in an adult mouse model of tyrosinaemia.NatBiomed Eng,2020,4:125-30；Pisciotta L,Favari E,Magnolo L等人Characterizationof three kindreds with familial combined hypolipidemia caused by loss-of-function mutations of ANGPTL3.Circ Cardiovasc Genet,2012,5:42-50。其中的每一个通过引用以其全文并入本文。
本文提供了核碱基编辑器系统的组合物，其包含能够对靶核苷酸序列内的核碱基((例如，A、T、C、G或U))进行修饰或转化的核碱基编辑器蛋白、复合物或化合物。
核碱基编辑器或碱基编辑器(BE)是指包含多肽的药剂，所述多肽能够对核酸序列((例如，DNA或RNA))内的碱基((例如，A、T、C、G或U))进行修饰。在一些实施方案中，碱基编辑器能够使核酸内的碱基脱氨。在一些实施方案中，碱基编辑器能够使DNA分子内的碱基脱氨。在一些实施方案中，碱基编辑器能够使DNA中的腺嘌呤(A)脱氨。
在一些实施方案中，碱基编辑器包含具有与腺苷脱氨酶融合的可编程DNA结合蛋白的融合蛋白。在一些实施方案中，碱基编辑器包含具有Cas9蛋白和腺苷脱氨酶的融合蛋白。在一些实施方案中，碱基编辑器是与腺苷脱氨酶融合的Cas9切口酶(nCas9)。在一些实施方案中，碱基编辑器是与腺苷脱氨酶融合的核酸酶活性丧失的Cas9(dCas9)。在一些实施方案中，碱基编辑器包含具有与胞苷脱氨酶融合的可编程DNA结合蛋白的融合蛋白。在一些实施方案中，碱基编辑器包含具有Cas9蛋白和胞苷脱氨酶的融合蛋白。在一些实施方案中，碱基编辑器是与胞苷脱氨酶融合的Cas9切口酶(nCas9)。在一些实施方案中，碱基编辑器是与胞苷脱氨酶融合的核酸酶活性丧失的Cas9(dCas9)。在一些实施方案中，碱基编辑器还包含碱基切除修复抑制剂，例如UGI结构域。在一些实施方案中，融合蛋白包含与脱氨酶融合的Cas9切口酶和碱基切除修复抑制剂，诸如UGI或dISN结构域。在一些实施方案中，融合蛋白的dCas9结构域包含D10A和H840A突变，如在野生型SpCas9氨基酸序列中编号。在一些实施方案中，UGI包含以下氨基酸序列：
>splP14739IUNGI_BPPB2尿嘧啶-DNA糖基化酶抑制剂MTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLT S D APE YKPW ALVIQDS NGENKIKML(SEQ IDNO:16)
在一些实施方案中，本文提供的碱基编辑器系统包含碱基编辑器融合蛋白。例如，碱基编辑器融合蛋白可以包含可编程DNA结合蛋白和脱氨酶，例如腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，本文提供的融合蛋白中的任一种都是碱基编辑器。在一些实施方案中，可编程DNA结合蛋白是Cas9结构域、Cpf1结构域、CasX结构域、CasY结构域、Cas12b结构域、C2c2结构域、C2c3结构域或Argonaute结构域。在一些实施方案中，可编程DNA结合蛋白是Cas9结构域。Cas9结构域可以是本文提供的Cas9结构域或Cas9蛋白中的任一种(例如，核酸酶活性丧失的Cas9或Cas9切口酶，或来自任何物种的Cas9变体)。在一些实施方案中，本文提供的Cas9结构域或Cas9蛋白中的任一种可以与本文提供的脱氨酶中的任一种融合。在一些实施方案中，碱基编辑器包含脱氨酶，例如腺苷脱氨酶和可编程DNA结合蛋白，例如经由接头接合的Cas9结构域。在一些实施方案中，碱基编辑器包含融合蛋白，所述融合蛋白包含脱氨酶，例如腺苷脱氨酶和可编程DNA结合蛋白，例如经由接头接合的Cas9结构域。在一些实施方案中，接头是肽接头。在一些实施方案中，接头存在于脱氨酶结构域与Cas9结构域之间。在一些实施方案中，脱氨酶和可编程DNA结合蛋白经由本文提供的肽接头中的任一种融合。例如，腺苷脱氨酶和Cas9结构域可以经由包含1至200个氨基酸的接头融合。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶和可编程DNA结合蛋白经由具有1至5、1至10、1至20、1至30、1至40、1至50、1至60、1至80、1至100、1至150、1至200、5至10、5至20、5至30、5至40、5至60、5至80、5至100、5至150、5至200、10至20、10至30、10至40、10至50、10至60、10至80、10至100、10至150、10至200、20至30、20至40、20至50、20至60、20至80、20至100、20至150、20至200、30至40、30至50、30至60、30至80、30至100、30至150、30至200、40至50、40至60、40至80、40至100、40至150、40至200、50至60 50至80、50至100、50至150、50至200、60至80、60至100、60至150、60至200、80至100、80至150、80至200、100至150、100至200或150至200个氨基酸长度的接头融合。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶和可编程DNA结合蛋白经由包含4、16、32或104个氨基酸长度的接头融合。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶和可编程DNA结合蛋白经由包含SGSETPGTSESATPES(SEQ ID NO:17)、SGGS(SEQ ID NO:18)、SGGSSGSETPGTSESATPESSGGS(SEQ ID NO:19)、SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS(SEQ ID NO:20)或GGSGGSPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGGSGGS(SEQID NO:21)的氨基酸序列的接头融合。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶和可编程DNA结合蛋白经由包含氨基酸序列SGSETPGTSESATPES(SEQ ID NO:17)的接头融合，所述接头也可以被称为XTEN接头。在一些实施方案中，接头的长度是24个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列SGGSSGGSSGSETPGTSESATPES(SEQ ID NO:23)。在一些实施方案中，接头的长度是40个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSGGSSGGS(SEQ ID NO:24)。在一些实施方案中，接头的长度是64个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS(SEQ ID NO:25)。在一些实施方案中，接头的长度是92个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列PGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATS(SEQ ID NO:26)。
在一些实施方案中，本文提供的碱基编辑器系统包含具有融合蛋白的碱基编辑器，所述融合蛋白包含碱基修复抑制剂。在一些实施方案中，碱基编辑器包含融合蛋白，所述融合蛋白包含胞苷脱氨酶和可编程DNA结合结构域，例如Cas9结构域。在一些实施方案中，碱基编辑器包含融合蛋白，所述融合蛋白包含腺苷脱氨酶和可编程DNA结合结构域，例如Cas9结构域。在一些实施方案中，碱基编辑器或融合蛋白还包含碱基修复抑制剂(IBR)。在一些实施方案中，IBR包括肌苷碱基修复抑制剂。在一些实施方案中，IBR是肌苷碱基切除修复抑制剂。在一些实施方案中，肌苷碱基切除修复抑制剂是催化活性丧失的肌苷特异性核酸酶(dISN)。在一些实施方案中，dISN可以抑制(例如，通过空间位阻)肌苷去除酶从DNA中切除肌苷残基。例如，催化失活的肌苷糖基化酶(例如，烷基腺嘌呤糖基化酶[AAG])将结合肌苷，但不产生无碱基位点或去除肌苷，从而空间阻断新形成的肌苷部分而免受潜在DNA损伤/修复机制影响。因此，本公开内容设想了一种融合蛋白，其包含可编程DNA结合蛋白和进一步与dISN融合的腺苷脱氨酶。本公开内容设想了一种融合蛋白，其包含任何Cas9结构域，例如Cas9切口酶(nCas9)结构域、催化活性丧失的Cas9(dCas9)结构域、高保真Cas9结构域或具有降低的PAM排他性的Cas9结构域应理解，使用dISN可以增加能够催化A至I变化的腺苷脱氨酶的编辑效率。例如，包含dISN结构域的融合蛋白在使A残基脱氨方面可能更有效。
在一些实施方案中，本文提供的碱基编辑器包含融合蛋白，所述融合蛋白还包含一个或多个核靶向序列，例如核定位序列(NLS)。在一些实施方案中，融合蛋白包含多个NLS。在一些实施方案中，融合蛋白在融合蛋白的N末端和C末端处包含NLS。在一些实施方案中，NLS包含有利于将包含NLS的蛋白质输入细胞核中的氨基酸序列。在一些实施方案中，NLS与融合蛋白的N末端融合。在一些实施方案中，NLS与融合蛋白的C末端融合。在一些实施方案中，NLS与可编程DNA结合蛋白(例如，Cas9)的N末端融合。在一些实施方案中，NLS与可编程DNA结合蛋白的C末端融合。在一些实施方案中，NLS与腺苷脱氨酶的N末端融合。在一些实施方案中，NLS与腺苷脱氨酶的C末端融合。在一些实施方案中，NLS经由一个或多个接头与融合蛋白融合。在一些实施方案中，NLS在没有接头的情况下与融合蛋白融合。在一些实施方案中，NLS包含本文提供或参考的任一个NLS序列的氨基酸序列。在一些实施方案中，NLS包含氨基酸序列PKKKRKV(SEQ ID NO:27)或MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLC(SEQ IDNO:28)。另外的核定位序列是本领域已知的，并且对于技术人员而言是显而易见的。例如，NLS序列描述于Plank et ah,PCT/EP2000/011690中，其内容通过引用并入本文以用于示例性核定位序列的公开。
在一些实施方案中，本文提供的融合蛋白不包含接头。在一些实施方案中，接头存在于一个或多个结构域或蛋白质(例如，腺苷脱氨酶、napDNAbp、NLS和/或IBR)之间。在一些实施方案中，以上一般架构中使用的“-”指示存在任选的接头。
本公开内容的一些方面提供了碱基编辑器或融合蛋白，其包含可编程DNA结合蛋白和至少两个腺苷脱氨酶结构域。不希望受任何特定理论的约束，腺苷脱氨酶的二聚化(例如，呈顺式或反式)可以改善融合蛋白修饰核酸碱基，例如使腺嘌呤脱氨的能力(例如，效率)。在一些实施方案中，所述融合蛋白中的任一种可以包含2、3、4或5个腺苷脱氨酶结构域。在一些实施方案中，本文提供的融合蛋白中的任一种包含两种腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，本文提供的融合蛋白中的任一种仅含有两种腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶是相同的。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶是本文提供的腺苷脱氨酶中的任一种。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶是不同的。在一些实施方案中，第一腺苷脱氨酶是本文提供的腺苷脱氨酶中的任一种，并且第二腺苷是本文提供的腺苷脱氨酶中的任一种，但与第一腺苷脱氨酶不同。在一些实施方案中，第一腺苷脱氨酶包含本文提供的突变中的任一种，如在SEQ ID NO:1中编号。在一些实施方案中，第二腺苷脱氨酶包含本文提供的突变中的任一种，如在SEQ ID NO:1中编号。在一些实施方案中，第一腺苷脱氨酶包含本文提供的突变中的任一种，如在SEQ ID NO:1中编号，并且第二腺苷脱氨酶包含野生型腺苷脱氨酶序列。在一些实施方案中，第二腺苷脱氨酶包含本文提供的突变中的任一种，如在SEQ ID NO:1中编号，并且第一腺苷脱氨酶包含野生型腺苷脱氨酶序列。作为一个实例，融合蛋白可以包含第一腺苷脱氨酶和第二腺苷脱氨酶，两者均包含来自ecTadA的A106V、D108N、D147Y和E155V突变(SEQ ID NO:1)。作为另一个实例，融合蛋白可以包含第一腺苷脱氨酶结构域，其包含来自ecTadA的A106V、D108N、D147Y和E155V突变(SEQ ID NO:1)；和第二腺苷脱氨酶，其包含来自ecTadA的L84F、A106V、D108N、H123Y、D147Y、E155V和I156F突变(SEQ ID NO:1)。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含氨基酸序列：
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTD(SEQ ID NO:1)
在一些实施方案中，融合蛋白包含两种腺苷脱氨酶(例如，第一腺苷脱氨酶和第二腺苷脱氨酶)。在一些实施方案中，第一腺苷脱氨酶是在融合蛋白中的第二腺苷脱氨酶的N末端。在一些实施方案中，第一腺苷脱氨酶是在融合蛋白中的第二腺苷脱氨酶的C末端。在一些实施方案中，第一腺苷脱氨酶和第二脱氨酶直接或经由接头融合。在一些实施方案中，接头是本文提供的接头中的任一种，例如，在“接头”部分中描述的接头中的任一种。在一些实施方案中，第一腺苷脱氨酶与第二腺苷脱氨酶是相同的。在一些实施方案中，第一腺苷脱氨酶和第二脱氨酶是本文所述的腺苷脱氨酶中到的任一种。在一些实施方案中，第一腺苷脱氨酶和第二腺苷脱氨酶是不同的。在一些实施方案中，第一腺苷脱氨酶是本文提供的腺苷脱氨酶中的任一种。在一些实施方案中，第二腺苷脱氨酶是本文提供的腺苷脱氨酶中的任一种，但与第一腺苷脱氨酶不同。在一些实施方案中，第一腺苷脱氨酶是ecTadA腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，第一腺苷脱氨酶包含与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列或与本文提供的腺苷脱氨酶中的任一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二腺苷脱氨酶包含与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列或与本文提供的腺苷脱氨酶中的任一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文提供的融合蛋白不包含接头。在一些实施方案中，接头存在于一个或多个结构域或蛋白质(例如，第一腺苷脱氨酶、第二腺苷脱氨酶、可编程DNA结合蛋白和/或NLS)之间。
应理解，本公开内容的融合蛋白可以具有一种或多种另外特征。例如，在一些实施方案中，融合蛋白可以包含细胞质定位序列、输出序列(诸如核输出序列)或其他定位序列，以及可用于溶解、纯化或检测融合蛋白的序列标签。本文提供的合适的蛋白质标签包括但不限于生物素羧化酶载体蛋白(BCCP)标签、myc-标签、钙调蛋白-标签、FLAG-标签、血凝素(HA)-标签、聚组氨酸标签(也被称为组氨酸标签或His-标签)、麦芽糖结合蛋白(MBP)-标签、nus-标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-标签、绿色荧光蛋白(GFP)-标签、硫氧还蛋白-标签、S-标签、Softag(例如，Softag 1、Softag 3)、strep-tag、生物素连接酶标签、FlAsH标签、V5标签和SBP-标签。另外合适的序列对于本领域技术人员而言是显而易见的。在一些实施方案中，融合蛋白包含一个或多个His标签。
在一些实施方案中，融合蛋白包含与表23中列出的氨基酸序列中的任一个具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或至少99.9％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含表23中列出的氨基酸序列中的任一个。在一些实施方案中，融合蛋白的序列是表23中列出的氨基酸序列中的任一个。在一些实施方案中，融合蛋白包含与SEQ ID NO:2137、2149、2154、2158、2188、2140、40、2146、2152、2156和2160的氨基酸序列中的任一个具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或至少99.9％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO:2137、2149、2154、2158、2188、2140、40、2146、2152、2156和2160的氨基酸序列中的任一个。在一些实施方案中，融合蛋白的序列是SEQ ID NO:2137、2149、2154、2158和2188的氨基酸序列中的任一个。
在一些实施方案中，融合蛋白由与表23中列出的多核苷酸序列中的任一个具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或至少99.9％同一性的多核苷酸序列编码。在一些实施方案中，融合蛋白由表23中列出的多核苷酸序列中的任一个编码。在一些实施方案中，融合蛋白由与表23中列出的多核苷酸序列中的任一个具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或至少99.9％同一性的多核苷酸序列表达。在一些实施方案中，融合蛋白由表23中列出的多核苷酸序列中的任一个表达。在一些实施方案中，融合蛋白由与SEQ ID NO:2192、2148、2153、2157、2161、2168、2174、2180、2186、2189、2139、2142、2145、2151、2155、2159、2162、2164、2167、2169、2171、2173、2175、2177、2179、2181、2183、2185、2187和2190的多核苷酸序列中的任一个具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或至少99.9％同一性的多核苷酸序列编码。在一些实施方案中，融合蛋白由包含SEQ ID NO:2192、2148、2153、2157、2161、2168、2174、2180、2186、2189、2139、2142、2145、2151、2155、2159、2162、2164、2167、2169、2171、2173、2175、2177、2179、2181、2183、2185、2187和2190的多核苷酸序列中的任一个的多核苷酸序列编码。在一些实施方案中，融合蛋白由SEQ ID NO:2192、2148、2153、2157、2161、2168、2174、2180、2186和2189的多核苷酸序列中的任一个编码。在一些实施方案中，融合蛋白由与SEQ ID NO:2192、2148、2153、2157、2161、2168、2174、2180、2186、2189、2139、2142、2145、2151、2155、2159、2162、2164、2167、2169、2171、2173、2175、2177、2179、2181、2183、2185、2187、2190、2138、2147、2158或其组合的多核苷酸序列中的任一个具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或至少99.9％同一性的多核苷酸序列表达：在一些实施方案中，融合蛋白由包含SEQ ID NO:2192、2148、2153、2157、2161、2168、2174、2180、2186、2189、2139、2142、2145、2151、2155、2159、2162、2164、2167、2169、2171、2173、2175、2177、2179、2181、2183、2185、2187、2190、2138、2147、2158或其组合的多核苷酸序列中的任一个的多核苷酸序列编码。在一些实施方案中，融合蛋白由SEQ ID NO:2192、2148、2153、2157、2161、2168、2174、2180、2186和2189的多核苷酸序列中的任一个表达。在一些实施方案中，多核苷酸序列还包含与SEQ ID NO:2138、2147、2158或其组合的多核苷酸序列中的任一个具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或至少99.9％同一性的多核苷酸序列中的任一个。在一些实施方案中，多核苷酸序列还包含SEQ ID NO:2138、2147、2158或其组合的多核苷酸序列中的任一个。
在一些实施方案中，核碱基编辑器ABE8.8包含融合蛋白，所述融合蛋白包含如下提供的序列：
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLCRFFRMPRRVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD(SEQ ID NO:3)
在一些实施方案中，核碱基编辑器包含融合蛋白，所述融合蛋白包含由如下提供的多核苷酸(在本文中还被称为MA002)序列编码的多肽：
ATGAGCGAGGTCGAGTTCTCTCACGAATATTGGATGAGACACGCTCTCACCCTGGCTAAGAGAGCCAGGGACGAAAGAGAGGTGCCAGTTGGCGCTGTCCTGGTGTTGAACAATCGCGTCATCGGAGAAGGATGGAATCGCGCCATTGGCCTGCACGATCCAACCGCACATGCCGAAATTATGGCTCTGCGGCAAGGCGGCCTCGTGATGCAAAATTACAGACTGATCGATGCTACCCTCTACGTCACCTTCGAGCCCTGTGTCATGTGTGCTGGGGCAATGATTCACTCCCGGATTGGCCGCGTGGTGTTTGGAGTGCGGAATGCCAAGACTGGCGCCGCTGGATCTCTGATGGACGTCCTGCACcatCCTGGGATGAACCACCGGGTCGAGATCACAGAGGGAATTCTGGCTGACGAGTGCGCTGCCCTGCTGTGCaggTTCTTTAGAATGCCtAGAaggGTGTTCAACGCCCAGAAAAAAGCTCAGAGCAGCACCGATTCCGGCGGAAGCAGCGGAGGATCTTCTGGAAGCGAAACCCCAGGCACCAGCGAGTCTGCCACACCAGAATCATCTGGCGGTAGCTCCGGCGGCAGCGACAAGAAGTATTCTATCGGACTGGCCATCGGCACCAACTCTGTTGGATGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACAGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCACTGCTGTTCGACTCTGGCGAAACAGCCGAGGCCACCAGACTGAAGAGAACAGCCCGCAGACGGTACACCAGAAGAAAGAACCGGATCTGCTACCTCCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGACAAGAAGCACGAGAGACACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGAGACTGATCTATCTGGCCCTGGCTCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAATCCTGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGAGTGGATGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCTGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGCAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACACCTAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAATCTGCTGGCCCAGATCGGCGATCAGTACGCCGACTTGTTTCTGGCCGCCAAGAATCTGAGCGACGCCATCCTGCTGTCCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCACCTCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGATCTGACCCTGCTGAAGGCCCTCGTTAGACAGCAGCTGCCAGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGATGGCGGAGCCAGCCAAGAGGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTCGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACCTTCGACAACGGCAGCATCCCTCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCCATTCTGCGGAGACAAGAGGACTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAAATCCTGACCTTCAGGATCCCCTACTACGTGGGACCACTGGCCAGAGGCAATAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACTCCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCCAGCGCTCAGTCCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCTAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTTCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATCGTGGATCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACAGCGTCGAGATCTCCGGCGTGGAAGATCGGTTCAATGCCAGCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAGAACGAGGACATCCTTGAGGACATCGTGCTGACACTGACCCTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACATACGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAACTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCAGACTGTCTCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGATAAGCAGTCCGGCAAGACCATCCTGGACTTTCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATTCACGACGACAGCCTCACCTTCAAAGAGGATATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGATTCTCTGCATGAGCACATTGCCAACCTGGCCGGCTCTCCCGCCATTAAGAAAGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTTGTGAAAGTGATGGGCAGACACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGACGGGATATGTACGTGGACCAAGAGCTGGACATCAACAGACTGTCCGACTACGATGTGGACCATATCGTGCCCCAGTCTTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTCCTGACCAGATCCGACAAGAATCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTGGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGACAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGCGGAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCGAAAGAGGCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGCACAGATTCTGGACTCTCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAACGACAAACTGATCCGCGAAGTGAAAGTCATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTCTACAAAGTGCGCGAGATCAACAACTACCATCACGCCCACGACGCCTACCTGAATGCCGTTGTTGGAACAGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAAGAGATTGGCAAGGCAACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACAGAGATCACCCTCGCCAACGGCGAGATCAGAAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGCGAGATTGTGTGGGATAAGGGCAGAGACTTTGCCACAGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAAGAAAACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCTAAGCGGAACTCCGACAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGATTCTCCTACCGTGGCCTATAGCGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAGAAACTCAAGAGCGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGAATCCGATCGATTTCCTCGAGGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTCCCCAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCTGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCTAGCAAATATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCAGCCCCGAGGACAATGAGCAAAAGCAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTTAGCAAGAGAGTGATTCTGGCCGACGCCAATCTGGACAAAGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGACAAGCCTATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACCTGTTTACCCTGACCAACCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTTGACACCACCATCGACCGGAAGCGGTACACCTCCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACTCTGATCCACCAGTCTATCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTCTCAACTCGGAGGCGACGAAGGCGCCGATAAGAGAACCGCCGATGGCTCTGAGTTCGAGAGCCCCAAGAAAAAGCGCAAAGTG(SEQ ID NO:4)
在一方面，本文提供的核碱基编辑器系统包含指导多核苷酸。在一些实施方案中，指导多核苷酸与碱基编辑器融合蛋白结合并形成复合物。在一些实施方案中，指导多核苷酸指导碱基编辑器融合蛋白在靶序列处实现修饰。指导多核苷酸可以包含单个核酸序列或两个单独的核酸序列。在一些实施方案中，指导多核苷酸是单指导物，例如单指导RNA。在一些实施方案中，单指导RNA包含能够与靶序列杂交的间隔子序列。在一些实施方案中，单指导RNA包含结合可编程DNA结合蛋白(例如，碱基编辑器融合蛋白的Cas9蛋白)的tracrRNA序列。在一些实施方案中，单指导RNA包含茎环结构、tracrRNA序列、crRNA序列、直接重复序列和/或反重复序列。在一些实施方案中，单指导RNA包含化学修饰。在一些实施方案中，指导多核苷酸是本文提供的指导多核苷酸中的任一种，如“指导多核苷酸”部分中所述。
脱氨酶结构域
本文公开了用于编辑、修改或改变多核苷酸的靶核苷酸序列的碱基编辑器系统。
本文提供的碱基编辑器系统可以包含可编程DNA结合蛋白和脱氨酶。如本文所用，脱氨酶可以指催化从分子中去除胺基团或脱氨(例如，通过水解)的酶。在一些实施方案中，脱氨酶是胞苷脱氨酶，其分别催化胞苷(C)脱氨为尿苷(U)、脱氧胞苷(dC)脱氨为脱氧尿苷(dU)或5-甲基-胞苷脱氨为胸苷(T，5-甲基-U)。随后的DNA修复机制确保dU被T替换，如以下中所述：Komor等人,Nature,Programmable editing of a target base in genomic DNAwithout double-stranded DNA cleavage,533,420-424(2016)，其通过引用以其全文并入本文。在一些实施方案中，脱氨酶是胞嘧啶脱氨酶，其催化和促进胞嘧啶转化为尿嘧啶(例如，在RNA中)或胸腺嘧啶(例如，在DNA中)。在一些实施方案中，脱氨酶是腺苷脱氨酶，其催化和促进腺嘌呤转化为鸟嘌呤。在一些实施方案中，脱氨酶是来自生物体(诸如人、黑猩猩、大猩猩、猴、牛、狗、大鼠或小鼠)的天然存在的脱氨酶。在一些实施方案中，脱氨酶是来自生物体的天然存在的脱氨酶的变体，并且所述变体在自然界中不发生。例如，在一些实施方案中，脱氨酶或脱氨酶结构域与来自生物体的天然存在的脱氨酶具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性。
胞苷脱氨酶(或胞嘧啶脱氨酶)包含催化化学反应“胞嘧啶+H20->尿嘧啶+NH3”或“5-甲基-胞嘧啶+H20->胸腺嘧啶+NH3”的酶。在基因的情况下，这种核苷酸变化或突变可能反过来导致蛋白质中的氨基酸变化，这可能影响蛋白质的功能，例如功能丧失或功能获得。随后的DNA修复机制确保DNA中的尿嘧啶碱基被T替换，如以下中所述：Komor等人(Nature,Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-strandedDNA cleavage,533,420-424(2016)，其通过引用以其全文并入本文)。
一类示例性的合适胞嘧啶脱氨酶是载脂蛋白B mRNA编辑复合物(APOBEC)家族的胞嘧啶脱氨酶，其涵盖11种用于以受控和有益的方式启动诱变的蛋白质。载脂蛋白B编辑复合物3(APOBEC3)酶经由逆转录病毒ssDNA中胞嘧啶的脱氨作用，为人体细胞提供针对某种HIV-1菌株的保护。这些胞嘧啶脱氨酶都需要Zn配位基序(His-X-Glu-X23_26-Pro-Cys-X2_4-Cys(SEQ ID NO:29))和结合的水分子以发挥催化活性。谷氨酸残基的作用是为氢氧化锌激活水分子，以在脱氨反应中进行亲核攻击。每个家族成员优先在自己特定的“热点”，例如，hAID的WRC(W是A或T，R是A或G)，或hAPOBEC3F的TTC处脱氨。APOBEC3G催化结构域的最近晶体结构揭示了包含五链β片核心的二级结构的侧翼是六个α螺旋，据信其在整个家族中都是保守的。已经显示活性中心环负责ssDNA结合和确定“热点”身份。这些酶的过表达与基因组不稳定和癌症有关，因此突出显示了序列特异性靶向的重要性。另一种合适的胞嘧啶脱氨酶是激活诱导的胞苷脱氨酶(AID)，其负责通过以转录依赖性、链偏向的方式将ssDNA中的胞嘧啶转化为尿嘧啶来使抗体成熟。
腺苷脱氨酶(或腺嘌呤脱氨酶)包含催化腺苷或脱氧腺苷分别水解脱氨为肌苷或脱氧肌苷的酶。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶催化脱氧核糖核酸(DNA)中腺嘌呤或腺苷的水解脱氨。本文提供的腺苷脱氨酶(例如，工程化的腺苷脱氨酶、进化的腺苷脱氨酶)可以来自任何生物体，诸如细菌。在一些实施方案中，脱氨酶或脱氨酶结构域是来自生物体的天然存在的脱氨酶的变体。在一些实施方案中，脱氨酶或脱氨酶结构域在自然界中不发生。例如，在一些实施方案中，脱氨酶或脱氨酶结构域与天然存在的脱氨酶具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶来自细菌，诸如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、腐败希瓦氏菌(S.putrefaciens)、流感嗜血杆菌或新月柄杆菌(C.crescentus)。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶是TadA脱氨酶。在一些实施方案中，TadA脱氨酶是大肠杆菌TadA脱氨酶。在一些实施方案中，TadA脱氨酶是截短的大肠杆菌TadA脱氨酶。例如，截短的ecTadA相对于全长ecTadA可能缺少一个或多个N末端氨基酸。在一些实施方案中，截短的ecTadA相对于全长ecTadA可能缺少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、6、17、18、19或20个N末端氨基酸残基。在一些实施方案中，截短的ecTadA相对于全长ecTadA可能缺少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、6、17、18、19或20个C末端氨基酸残基。在一些实施方案中，ecTadA脱氨酶不包含N末端甲硫氨酸。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列或与本文提供的腺苷脱氨酶中的任一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。应理解，本文提供的腺苷脱氨酶可以包含一个或多个突变(例如，本文提供的突变中的任一种)。本公开内容提供了具有某一同一性百分比加上本文所述的突变中的任一种或其组合的任何脱氨酶结构域。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含与SEQ IDNO:1中列出的氨基酸序列或本文提供的腺苷脱氨酶中的任一种相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、21、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多个突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列或本文提供的腺苷脱氨酶中的任一种相比具有至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少110个、至少120个、至少130个、至少140个、至少150个、至少160个或至少170个相同的连续氨基酸残基的氨基酸序列。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含ecTadA SEQ ID NO:1中的D108X突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变，其中X指示除野生型腺苷脱氨酶中的对应氨基酸以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的D108G、D108N、D108V、D108A或D108Y突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变。然而，应理解，另外的脱氨酶可以类似地比对以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含ecTadA SEQ ID NO:1中的A106X突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变，其中X指示除野生型腺苷脱氨酶中的对应氨基酸以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的A106V突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的E155X突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变，其中X的存在指示除野生型腺苷脱氨酶中的对应氨基酸以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的E155D、E155G或E155V突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的D147X突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变，其中X的存在指示除野生型腺苷脱氨酶中的对应氨基酸以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的D147Y突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变。
应理解，本文提供的任何突变(例如，基于SEQ ID NO:1的ecTadA氨基酸序列)可以引入到其他腺苷脱氨酶中，诸如金黄色葡萄球菌TadA(saTadA)，或其他腺苷脱氨酶(例如，细菌腺苷脱氨酶)。对于技术人员而言，如何与ecTadA中的突变残基同源是显而易见的。因此，可以在具有同源氨基酸残基的其他腺苷脱氨酶中产生在ecTadA中鉴定的任何突变。还应理解，可以在ecTadA或另一种腺苷脱氨酶中单独或以任何组合产生本文提供的任何突变。例如，腺苷脱氨酶可以含有ecTadA SEQ ID NO:1中的D108N、A106V、E155V和/或D147Y突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含ecTadA SEQ IDNO:1中的以下突变组(突变组通过“；”分开)或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变：D108N和A106V；D108N和E155V；D108N和D147Y；A106V和E155V；A106V和D147Y；E155V和D147Y；D108N、A106V和E55V；D108N、A106V和D147Y；D108N、E55V和D147Y；A106V、E55V和D 147Y；和D108N、A106V、E55V和D147Y。然而，应理解，可以在腺苷脱氨酶(例如，ecTadA)中产生本文提供的对应突变的任何组合
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的H8X、T17X、L18X、W23X、L34X、W45X、R51X、A56X、E59X、E85X、M94X、I95X、V102X、F104X、A106X、R107X、D108X、K110X、M118X、N127X、A138X、F149X、M151X、R153X、Q154X、I156X和/或K157X突变中的一个或多个或另一种腺苷脱氨酶中的一个或多个对应突变，其中X的存在指示除野生型腺苷脱氨酶中的对应氨基酸以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的H8Y、T17S、L18E、W23L、L34S、W45L、R51H、A56E、或A56S、E59G、E85K、或E85G、M94L、1951、V102A、F104L、A106V、R107C、或R107H、或R107P、D108G、或D108N、或D108V、或D108A、或D108Y、K110l、M118K、N127S、A138V、F149Y、M151V、R153C、Q154L、I156D和/或K157R突变中的一个或多个或另一种腺苷脱氨酶中的一个或多个对应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含对应于SEQ ID NO:1的突变中的一个或多个或另一种腺苷脱氨酶中的一个或多个对应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含表23中所示的任何构建体中对应于SEQ ID NO:1的一个或多个突变或另一种腺苷脱氨酶中的一个或多个对应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的H8X、D108X和/或N127X突变中的一个或多个或另一种腺苷脱氨酶中的一个或多个对应突变，其中X指示任何氨基酸的存在。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的H8Y、D108N和/或N127S突变中的一个或多个或另一种腺苷脱氨酶中的一个或多个对应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的H8X、R26X、M61X、L68X、M70X、A106X、D108X、A109X、N127X、D147X、R152X、Q154X、E155X、K161X、Q163X和/或T166X突变中的一个或多个或另一种腺苷脱氨酶中的一个或多个对应突变，其中X指示除野生型腺苷脱氨酶中的对应氨基酸以外的任何氨基酸的存在。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的H8Y、R26W、M61I、L68Q、M70V、A106T、D108N、A109T、N127S、D147Y、R152C、Q154H、或Q154R、E155G、或E155V、或E155D、K161Q、Q163H和/或T166P突变中的一个或多个或另一种腺苷脱氨酶中的一个或多个对应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含一个、两个、三个、四个、五个或六个SEQ IDNO:1中的选自H8X、D108X、N127X、D147X、R152X和Q154X的突变或另一种腺苷脱氨酶中的一个或多个对应突变，其中X指示除野生型腺苷脱氨酶中的对应氨基酸以外的任何氨基酸的存在。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个SEQ ID NO:1中的选自H8X、M61X、M70X、D108X、N127X、Q154X、E155X和Q163X的突变或另一种腺苷脱氨酶中的一个或多个对应突变，其中X指示除野生型腺苷脱氨酶中的对应氨基酸以外的任何氨基酸的存在。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含一个、两个、三个、四个或五个SEQ ID NO:1中的选自H8X、D108X、N127X、E155X和T166X的突变或另一种腺苷脱氨酶中的一个或多个对应突变，其中X指示除野生型腺苷脱氨酶中的对应氨基酸以外的任何氨基酸的存在。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含一个、两个、三个、四个、五个或六个选自H8X、A106X、D108X的突变或另一种腺苷脱氨酶中的一个或多个突变，其中X指示除野生型腺苷脱氨酶中的对应氨基酸以外的任何氨基酸的存在。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个SEQ ID NO:1中的选自H8X、R126X、L68X、D108X、N127X、D147X和E155X的突变或另一种腺苷脱氨酶中的一个或多个对应突变，其中X指示除野生型腺苷脱氨酶中的对应氨基酸以外的任何氨基酸的存在。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含一个、两个、三个、四个或五个SEQ ID NO:1中的选自H8X、D108X、A109X、N127X和E155X的突变或另一种腺苷脱氨酶中的一个或多个对应突变，其中X指示除野生型腺苷脱氨酶中的对应氨基酸以外的任何氨基酸的存在。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含一个、两个、三个、四个、五个或六个SEQ IDNO:1中的选自H8Y、D108N、N127S、D147Y、R152C和Q154H的突变或另一种腺苷脱氨酶中的一个或多个对应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个SEQ ID NO:1中的选自H8Y、M61I、M70V、D108N、N127S、Q154R、E155G和Q163H的突变或另一种腺苷脱氨酶中的一个或多个对应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含一个、两个、三个、四个或五个SEQ ID NO:1中的选自H8Y、D108N、N127S、E155V和T166P的突变或另一种腺苷脱氨酶中的一个或多个对应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含一个、两个、三个、四个、五个或六个SEQ ID NO:1中的选自H8Y、A106T、D108N、N127S、E155D和K161Q的突变或另一种腺苷脱氨酶中的一个或多个对应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个SEQ ID NO:1中的选自H8Y、R126W、L68Q、D108N、N127S、D147Y和E155V的突变或另一种腺苷脱氨酶中的一个或多个对应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含一个、两个、三个、四个或五个SEQ ID NO:1中的选自H8Y、D108N、A109T、N127S和E155G的突变或另一种腺苷脱氨酶中的一个或多个对应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的D108N、D108G或D108V突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的A106V和D108N突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的R107C和D108N突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的H8Y、D108N、N127S、D147Y和Q154H突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的H8Y、R24W、D108N、N127S、D147Y和E155V突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的D108N、D147Y和E155V突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的H8Y、D108N和S 127S突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的A106V、D108N、D147Y和E155V突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的S2X、H8X、I49X、L84X、H123X、N127X、I156X和/或K160X突变中的一个或多个或另一种腺苷脱氨酶中的一个或多个对应突变，其中X的存在指示除野生型腺苷脱氨酶中的对应氨基酸以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的S2A、H8Y、I49F、L84F、H123Y、N127S、I156F和/或K160S突变中的一个或多个或另一种腺苷脱氨酶中的一个或多个对应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的突变中的一个或多个或另一种腺苷脱氨酶中的一个或多个对应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含任一个克隆的对应于SEQ IDNO:1的一个或多个突变或另一种腺苷脱氨酶中的一个或多个对应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包括L84X突变腺苷脱氨酶，其中X指示除野生型腺苷脱氨酶中的对应氨基酸以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ IDNO:1中的L84F突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含ecTadA SEQ ID NO:1中的H123X突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变，其中X指示除野生型腺苷脱氨酶中的对应氨基酸以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的H123Y突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含ecTadA SEQ ID NO:1中的I157X突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变，其中X指示除野生型腺苷脱氨酶中的对应氨基酸以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的I157F突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个SEQID NO:1中的选自L84X、A106X、D108X、H123X、D147X、E155X和I156X的突变或另一种腺苷脱氨酶中的一个或多个对应突变，其中X指示除野生型腺苷脱氨酶中的对应氨基酸以外的任何氨基酸的存在。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含一个、两个、三个、四个、五个或六个SEQ ID NO:1中的选自S2X、I49X、A106X、D108X、D147X和E155X的突变或另一种腺苷脱氨酶中的一个或多个对应突变，其中X指示除野生型腺苷脱氨酶中的对应氨基酸以外的任何氨基酸的存在。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含一个、两个、三个、四个或五个SEQ ID NO:1中的选自H8X、A106X、D108X、N127X和K160X的突变或另一种腺苷脱氨酶中的一个或多个对应突变，其中X指示除野生型腺苷脱氨酶中的对应氨基酸以外的任何氨基酸的存在。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个SEQID NO:1中的选自L84F、A106V、D108N、H123Y、D147Y、E155V和I156F的突变或另一种腺苷脱氨酶中的一个或多个对应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含一个、两个、三个、四个、五个或六个SEQ ID NO:1中的选自S2A、I49F、A106V、D108N、D147Y和E155V的突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含一个、两个、三个、四个或五个SEQ ID NO:1中的选自H8Y、A106T、D108N、N127S和K160S的突变或另一种腺苷脱氨酶中的一个或多个对应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的E25X、R26X、R107X、A142X和/或A143X突变中的一个或多个或另一种腺苷脱氨酶中的一个或多个对应突变，其中X的存在指示除野生型腺苷脱氨酶中的对应氨基酸以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的E25M、E25D、E25A、E25R、E25V、E25S、E25Y、R26G、R26N、R26Q、R26C、R26L、R26K、R107P、R07K、R107A、R107N、R107W、R107H、R107S、A142N、A142D、A142G、A143D、A143G、A143E、A143L、A143W、A143M、A143S、A143Q和/或A143R突变中的一个或多个或另一种腺苷脱氨酶中的一个或多个对应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含表23中提供的对应于SEQ ID NO:1的突变中的一个或多个或另一种腺苷脱氨酶中的一个或多个对应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含表23中所示的任一个的对应于SEQ ID NO:1的一个或多个突变或另一种腺苷脱氨酶中的一个或多个对应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含ecTadA SEQ ID NO:1中的E25X突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变，其中X指示除野生型腺苷脱氨酶中的对应氨基酸以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的E25M、E25D、E25A、E25R、E25V、E25S或E25Y突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含ecTadA SEQ ID NO:1中的R26X突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变，其中X指示除野生型腺苷脱氨酶中的对应氨基酸以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的R26G、R26N、R26Q、R26C、R26L或R26K突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含ecTadA SEQ ID NO:1中的R107X突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变，其中X指示除野生型腺苷脱氨酶中的对应氨基酸以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的R107P、R07K、R107A、R107N、R107W、R107H或R107S突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含ecTadA SEQ ID NO:1中的A142X突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变，其中X指示除野生型腺苷脱氨酶中的对应氨基酸以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的A142N、A142D、A142G突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含ecTadA SEQ ID NO:1中的A143X突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变，其中X指示除野生型腺苷脱氨酶中的对应氨基酸以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的A143D、A143G、A143E、A143L、A143W、A143M、A143S、A143Q和/或A143R突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的H36X、N37X、P48X、I49X、R51X、M70X、N72X、D77X、E134X、S 146X、Q154X、K157X和/或K161X突变中的一个或多个或另一种腺苷脱氨酶中的一个或多个对应突变，其中X的存在指示除野生型腺苷脱氨酶中的对应氨基酸以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的H36L、N37T、N37S、P48T、P48L、I49V、R51H、R51L、M70L、N72S、D77G、E134G、S 146R、S 146C、Q154H、K157N和/或K161T突变中的一个或多个或另一种腺苷脱氨酶中的一个或多个对应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含ecTadA SEQ ID NO:1中的H36X突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变，其中X指示除野生型腺苷脱氨酶中的对应氨基酸以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的H36L突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含ecTadA SEQ ID NO:1中的N37X突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变，其中X指示除野生型腺苷脱氨酶中的对应氨基酸以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的N37T或N37S突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含ecTadA SEQ ID NO:1中的P48X突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变，其中X指示除野生型腺苷脱氨酶中的对应氨基酸以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的P48T或P48L突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含ecTadA SEQ ID NO:1中的R51X突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变，其中X指示除野生型腺苷脱氨酶中的对应氨基酸以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的R51H或R51L突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含ecTadA SEQ ID NO:1中的S 146X突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变，其中X指示除野生型腺苷脱氨酶中的对应氨基酸以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的S 146R或S 146C突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含ecTadA SEQ ID NO:1中的K157X突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变，其中X指示除野生型腺苷脱氨酶中的对应氨基酸以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的K157N突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含ecTadA SEQ ID NO:1中的P48X突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变，其中X指示除野生型腺苷脱氨酶中的对应氨基酸以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的P48S、P48T或P48A突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含ecTadA SEQ ID NO:1中的A142X突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变，其中X指示除野生型腺苷脱氨酶中的对应氨基酸以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的A142N突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含ecTadA SEQ ID NO:1中的W23X突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变，其中X指示除野生型腺苷脱氨酶中的对应氨基酸以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的W23R或W23L突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含ecTadA SEQ ID NO:1中的R152X突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变，其中X指示除野生型腺苷脱氨酶中的对应氨基酸以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ ID NO:1中的R152P或R52H突变或另一种腺苷脱氨酶中的对应突变。
另外的腺苷脱氨酶突变和变体描述于专利申请WO2018119354中，所述专利申请通过引用以其全文并入本文。
可用于本申请的另外的腺苷脱氨酶对于技术人员而言是显而易见的并且在本公开内容的范围内。例如，腺苷脱氨酶可以是AD AT的同源物。示例性AD AT同源物包括但不限于：
金黄色葡萄球菌TadA：
MGSHMTNDIYFMTLAIEEAKKAAQLGEVPIGAIITKDDEVIARAHNLRETLQQPTAH
AEHIAIERAAKVLGSWRLEGCTLYVTLEPCVMCAGTIVMSRIPRVVYGADDPKGGCS GS LMNLLQQSNFNHRAIVDKG VLKE AC S TLLTTFFKNLRANKKS TN(SEQ ID NO:30)
枯草芽孢杆菌TadA：
MTQDELYMKEAIKEAKKAEEKGEVPIGAVLVINGEIIARAHNLRETEQRSIAHAEML VIDE ACKALGT WRLEG ATLY VTLEPCPMC AG A V VLS R VEK V VFG AFDPKGGC S GTLMN LLQEERFNHQAE V VS G VLEEEC GGMLS AFFRELRKKKK A ARKNLS E(SEQ ID NO:31)
鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)TadA：
MPPAFITGVTSLSDVELDHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNHRVIGEG
WNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVLQNYRLLDTTLYVTLEPCVMCAGAMVHSRIG
RVVFGARDAKTGAAGSLIDVLHHPGMNHRVEIIEGVLRDECATLLSDFFRMRRQEIKALKKADRAEGAGPAV(SEQ ID NO:32)
腐败希瓦氏菌(S.putrefaciens)TadA：
MDEYWMQVAMQMAEKAEAAGEVPVGAVLVKDGQQIATGYNLSISQHDPTAHAEILCLRSAGKKLENYRLLDATLYITLEPCAMCAGAMVHSRIARVVYGARDEKTGAAGTVVNLLQHPAFNHQVEVTSGVLAEACSAQLSRFFKRRRDEKKALKLAQRAQQGIE(SEQ ID NO:33)
流感嗜血杆菌F3031(H.influenzae)TadA：
MDAAKVRSEFDEKMMRYALELADKAEALGEIPVGAVLVDDARNIIGEGWNLSIVQSDPTΑΗ
AEIIALRNGAKNIQNYRLLNSTLYVTLEPCTMCAGAILHSRIKRLVFGASDYKTGAIGSRFHFFDDYKMNHTLEITSGVLAEECSQKLSTFFQKRREEKKIEKALLKSLSDK(SEQ ID NO:34)
新月柄杆菌(C.crescentus)TadA：
MRTDESEDQDHRMMRLALDAARAAAEAGETPVGAVILDPSTGEVIATAGNGPIAAHDPTAHAEIAAMRAAAAKLGNYRLTDLTLVVTLEPCAMCAGAISHARIGRVVFGADDPKGGAVVHGPKFFAQPTCHWRPEVTGGVLADESADLLRGFFRARRKAKI(SEQ ID NO:35)
硫还原地杆菌(G.sulfurreducens)TadA：
MSSLKKTPIRDDAYWMGKAIREAAKAAARDEVPIGAVIVRDGAVIGRGHNLREGSNDPSAHAEMIAIRQAARRSANWRLTGATLYVTLEPCLMCMGAIILARLERVVFGCYDPKGGAAGSLYDLSADPRLNHQVRLSPGVCQEECGTMLSDFFRDLRRRKKAKATPALF IDERKVPPEP(SEQ ID NO:36)
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含与表23中列出的氨基酸序列中的任一个具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或至少99.9％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含表23中列出的氨基酸序列中的任一个。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶的序列是表23中列出的氨基酸序列中的任一个。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含与SEQ ID NO:2137、2149、2154、2158、2188、2140、40、2146、2152、2156和2160的氨基酸序列中的任一个具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或至少99.9％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含SEQ IDNO:2137、2149、2154、2158、2188、2140、40、2146、2152、2156和2160的氨基酸序列中的任一个。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶的序列是SEQ ID NO:2137、2149、2154、2158和2188的氨基酸序列中的任一个。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶由与表23中列出的多核苷酸序列中的任一个具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或至少99.9％同一性的多核苷酸序列编码。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶由表23中列出的多核苷酸序列中的任一个编码。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶由与表23中列出的多核苷酸序列中的任一个具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或至少99.9％同一性的多核苷酸序列表达。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶由表23中列出的多核苷酸序列中的任一个表达。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶由与SEQ ID NO:2192、2148、2153、2157、2161、2168、2174、2180、2186、2189、2139、2142、2145、2151、2155、2159、2162、2164、2167、2169、2171、2173、2175、2177、2179、2181、2183、2185、2187和2190的多核苷酸序列中的任一个具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或至少99.9％同一性的多核苷酸序列编码。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶由包含SEQ ID NO:2192、2148、2153、2157、2161、2168、2174、2180、2186、2189、2139、2142、2145、2151、2155、2159、2162、2164、2167、2169、2171、2173、2175、2177、2179、2181、2183、2185、2187和2190的多核苷酸序列中的任一个的多核苷酸序列编码。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶由SEQ ID NO:2192、2148、2153、2157、2161、2168、2174、2180、2186和2189的多核苷酸序列中的任一个编码。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶由与SEQ ID NO:2192、2148、2153、2157、2161、2168、2174、2180、2186、2189、2139、2142、2145、2151、2155、2159、2162、2164、2167、2169、2171、2173、2175、2177、2179、2181、2183、2185、2187、2190、2138、2147、2158或其组合的多核苷酸序列中的任一个具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或至少99.9％同一性的多核苷酸序列表达：在一些实施方案中，腺苷脱氨酶由包含SEQ ID NO:2192、2148、2153、2157、2161、2168、2174、2180、2186、2189、2139、2142、2145、2151、2155、2159、2162、2164、2167、2169、2171、2173、2175、2177、2179、2181、2183、2185、2187、2190、2138、2147、2158或其组合的多核苷酸序列中的任一个的多核苷酸序列编码。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶由SEQID NO:2192、2148、2153、2157、2161、2168、2174、2180、2186和2189的多核苷酸序列中的任一个表达。在一些实施方案中，多核苷酸序列还包含与SEQ ID NO:2138、2147、2158或其组合的多核苷酸序列中的任一个具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或至少99.9％同一性的多核苷酸序列中的任一个。在一些实施方案中，多核苷酸序列还包含SEQ ID NO:2138、2147、2158或其组合的多核苷酸序列中的任一个。
可编程DNA结合蛋白
本文提供了可编程DNA结合蛋白，其可以被编程为靶向结合基因组内任何所需核苷酸序列中的DNA序列。为了对DNA结合蛋白进行编程以结合所需的核苷酸序列，可以对DNA结合蛋白进行修饰以改变其结合特异性，例如锌指DNA结合结构域、锌指核酸酶(ZFN)、CRISPR-Cas9蛋白或转录激活因子样效应蛋白(TALE)。ZFN是通过将锌指DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而生成的人工限制性酶。锌指结构域可以被工程化以靶向特定的所需DNA序列，并且这使得锌指能够结合复杂基因组内的独特序列。转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)是可以被工程化以切割特定DNA序列的工程化限制性酶。它们是通过将TAL效应子DNA结合结构域与核酸酶结构域(例如，Fokl)融合而制成。转录激活因子样效应子(TALE)可以被工程化以结合任何所需DNA序列。用于对ZFN和TALE进行编程的方法是本领域技术人员熟悉的。例如，此类方法描述于以下中：Maeder等人,Mol.Cell 31(2):294-301,2008；Carroll等人,Genetics Society of America,188(4):773-782,2011；Miller等人,NatureBiotechnology 25(7):778-785,2007；Christian等人,Genetics 186(2):757-61,2008；Li等人,Nucleic Acids Res.39(1):359-372,2010；以及Moscou等人,Science 326(5959):1501,2009，其中的每一个通过引用并入本文。
CRISPR/Cas系统或本文提供的碱基编辑器系统中的Cas蛋白可以包含1类或2类系统组分，包括核糖核酸蛋白复合物。2类Cas核酸酶家族的蛋白质是具有DNA核酸内切酶活性的酶，并且可以通过设计适当的指导RNA来指导它们以切割所需的核酸靶，如本文进一步所述。2类CRISPR/Cas系统组分可以来自II型、IIA型、IIB型、IIC型、V型或VI型系统。2类Cas核酸酶包括例如Cas9(还被称为Csn1或Csx12)、Csn2、Cas4、Cas12a(Cpf1)、Cas12b(C2c1)、Cas12c(C2c3)、Cas13a(C2c2)、Cas13b、Cas13c和Cas13d蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白来自II型CRISPR/Cas系统(即，来自CRISPR/Cas9系统的Cas9蛋白)，或V型CRISPR/Cas系统(例如，Cas12a蛋白)。在一些实施方案中，Cas蛋白来自2类CRISPR/Cas系统，即单蛋白Cas核酸酶诸如Cas9蛋白或Cas12a蛋白。
Cas蛋白的其他非限制性实例可以包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、Cas9HiFi、其同源物或其修饰版本。
在一些实施方案中，本文提供了指导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白或能够结合DNA的RNA指导的可编程DNA结合蛋白，并且与其靶DNA序列的结合由指导核苷酸序列介导。因此，应理解，指导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白与指导核苷酸序列结合。指导核苷酸可以是与靶序列互补的RNA或DNA分子(例如，单链DNA或ssDNA分子)，并且可以将DNA结合蛋白指引至靶序列。由此，指导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白可以是RNA-可编程DNA结合蛋白(例如，Cas9蛋白)，或ssDNA-可编程DNA结合蛋白(例如，Argonaute蛋白)。“可编程”意指DNA结合蛋白可以被编程以结合指导核苷酸靶向的任何DNA序列。示例性指导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白包括但不限于Cas9(例如，dCas9和nCas9)、saCas9(例如，saCas9d、saCas9d、saKKH Cas9)、CasX、CasY、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、Argonaute和本文所述的任何其他合适的蛋白质或其变体。
在一些实施方案中，指导核苷酸序列作为单核苷酸分子存在，并且包含两个结构域：(1)与靶核酸共享同源性(例如，并且引导指导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白与靶标结合)的结构域；和(2)结合指导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白的结构域。在一些实施方案中，结构域(1)包含间隔子序列。在一些实施方案中，结构域(2)被称为tracrRNA序列。在一些实施方案中，结构域(2)对应于被称为tracrRNA的序列，并且包含茎环结构。例如，在一些实施方案中，结构域(2)与如Jinek等人,Science 337:816-821(2012)中提供的tracrRNA是相同的或同源的，所述文献通过引用并入本文。gRNA的其他实例(例如，包含结构域2的那些)可以在美国专利申请公布US20160208288和美国专利申请公布US20160200779中找到，所述专利申请中的每一个通过引用以其全文并入本文。
使用指导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白(诸如Cas9)进行位点特异性切割(例如，修饰基因组)的方法是本领域已知的(参见例如，Cong,L.等人Multiplex genomeengineering using CRISPR/Cas systems.Science 339,819-823(2013)；Mali,P.等人RNA-guided human genome engineering via Cas9.Science 339,823-826(2013)；Hwang,W.Y.等人Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cassystem.Nature biotechnology 31,227-229(2013)；Jinek,M.等人RNA-programmedgenome editing in human cells.eLife 2,e00471(2013)；Dicarlo,J.E.等人Genomeengineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.Nucleicacids research(2013)；Jiang,W.等人RNA-guided editing of bacterial genomesusing CRISPR-Cas systems.Nature biotechnology 31,233-239(2013)；其中的每一个通过引用并入本文)。
CRISPR是一种适应性免疫系统，其提供针对可移动遗传元件(病毒、转座元件和接合型质粒)的保护。CRISPR簇含有间隔子、与先前可移动元件互补的序列和靶入侵核酸。CRISPR/Cas系统包含与DNA(例如，靶DNA序列)结合的非编码RNA分子(例如，指导RNA)和具有核酸酶功能(例如，两个核酸酶结构域)的Cas蛋白(例如，Cas9)。参见例如，Sander等人,Nature Biotechnology,32:347-355(2014)，还参见例如，Hsu等人,Cell 157(6):1262-1278(2014)。CRISPR的一般机制和最新进展在以下中讨论：Cong等人,Science,339(6121):819-823(2013)；Fu等人,Nature Biotechnology,31,822-826(2013)；Chu等人,NatureBiotechnology 33,543-548(2015)；Shmakov等人,Molecular Cell,60,1-13(2015)；Makarova等人,Nature Reviews Microbiology,13,1-15(2015)。CRISPR/Cas系统可以用于引入靶DNA的位点特异性切割。位点特异性切割的位置由1)指导RNA(gRNA)与靶DNA(原间隔子)之间的碱基配对互补性和2)靶DNA中的短基序(被称为原间隔子相邻基序(PAM))决定。CRISPR/Cas系统(例如，II型CRISPR/Cas系统)可以用于生成例如靶基因被破坏或突变的工程化细胞。Cas酶(例如，Cas9)可以用于催化DNA切割。Cas9蛋白(例如，酿脓链球菌(Streptococcus pyogene)Cas9或任何密切相关的Cas9)可以衍生酶促作用，以在靶位点序列处生成双链断裂，所述靶位点序列与约20个核苷酸的指导序列(例如，gRNA)杂交，并且在靶序列之后具有原间隔子相邻基序(PAM)。
CRISPR/Cas系统包含1类或2类系统组分，包括核糖核酸蛋白复合物。2类Cas核酸酶家族的蛋白质是具有DNA核酸内切酶活性的酶，并且可以通过设计适当的指导RNA来指导它们以切割所需的核酸靶，如本文进一步所述。2类CRISPR/Cas系统组分可以来自II型、IIA型、IIB型、IIC型、V型或VI型系统。2类Cas核酸酶包括例如Cas9(还被称为Csn1或Csx12)、Csn2、Cas4、Cas12a(Cpf1)、Cas12b(C2c1)、Cas12c(C2c3)、Cas13a(C2c2)、Cas13b、Cas13c和Cas13d蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白来自II型CRISPR/Cas系统(即，来自CRISPR/Cas9系统的Cas9蛋白)，或V型CRISPR/Cas系统(例如，Cas12a蛋白)。在一些实施方案中，Cas蛋白来自2类CRISPR/Cas系统，即单蛋白Cas核酸酶诸如Cas9蛋白或Cas12a蛋白。
Cas蛋白的其他非限制性实例可以包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、Cas9HiFi、其同源物或其修饰版本。
本文提供的碱基编辑器系统可以包含Cas9或Cas9核酸酶。Cas9蛋白或Cas9核酸酶是指包含Cas9蛋白、其片段或变体的RNA指导的核酸酶。Cas9核酸酶有时还被称为casnl核酸酶或CRISPR(规律成簇间隔短回文重复序列)相关核酸酶。CRISPR是一种适应性免疫系统，其提供针对可移动遗传元件(病毒、转座元件和接合型质粒)的保护。CRISPR簇含有间隔子、与先前可移动元件互补的序列和靶入侵核酸。CRISPR簇被转录并加工成CRISPR RNA(crRNA)。在II型CRISPR系统中，前crRNA的正确加工需要反编码的小RNA(tracrRNA)、内源性核糖核酸酶3(rnc)和Cas9蛋白。tracrRNA充当前crRNA的核糖核酸酶3辅助加工的指导物。因此，Cas9/crRNA/tracrRNA核内溶解性地切割与间隔子互补的线性或环状dsDNA靶标。首先核内溶解性地切割与crRNA不互补的靶链，然后核外溶解性地剪切3’-5’。在自然界中，DNA结合和切割通常需要蛋白质和两种RNA。然而，单指导RNA(“sgRNA”或简称为“gRNA”)可以被工程化，以便将crRNA和tracrRNA两者的各方面并入到单个RNA物种中。参见例如，Jinek等人,Science 337:816-821(2012)，其通过引用以其全文并入本文。
术语“Cas9”是指包含Cas9蛋白或其片段(例如，包含Cas9的活性、活性丧失或部分活性DNA切割结构域和/或Cas9的gRNA结合结构域的蛋白质)的RNA指导的核酸酶。Cas9核酸酶还被称为casnl核酸酶或CRISPR(规律成簇间隔短回文重复序列)相关核酸酶。Cas9可以指与野生型示例性Cas9多肽(例如，来自酿脓链球菌的Cas9)具有至少或至少约50％、60％、70％、80％、90％、100％序列同一性和/或序列相似性的多肽。Cas9可以指与野生型示例性Cas9多肽(例如，来自酿脓链球菌)具有至多或至多约50％、60％、70％、80％、90％、100％序列同一性和/或序列相似性的多肽。Cas9可以指Cas9蛋白的野生型或修饰形式，其可以包含氨基酸变化，诸如缺失、插入、取代、变体、突变、融合、嵌合体或其任何组合。
Cas9核酸酶序列和变体Cas9直系同源物的结构已在各种物种中得到描述。Cas9蛋白或其他组分可以来自的示例性物种包括但不限于酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、链球菌属物种(Streptococcussp.)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、无害李斯特氏菌(Listeria innocua)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、新凶手弗朗西斯菌(Francisella novicida)、产琥珀酸沃廉菌(Wolinella succinogenes)、华德萨特菌(Sutterella wadsworthensis)、γ变形杆菌(Gamma proteobacterium)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、多杀巴斯德杆菌(Pasteurella multocida)、产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogene)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、达氏拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)、始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)、产绿色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)、产绿色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)、玫瑰链孢囊菌(Streptosporangium roseum)、酸热脂环酸芽胞杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)、硒还原芽孢杆菌(Bacillus selenitireducens)、西伯利亚微小杆菌(Exiguobacteriumsibiricum)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、齿垢密螺旋体(Treponemadenticola)、海洋微颤菌(Microscilla marina)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderialesbacterium)、食萘极地单胞菌(Polar omonas naphthalenivorans)、极地单胞菌属物种(Polar omonas sp.)、海洋固氮蓝藻(Crocosphaera watsonii)、蓝杆藻属物种(Cyanothece sp.)、铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)、聚球藻属物种(Synechococcus sp.)、阿拉伯糖醋盐杆菌(Acetohalobium arabaticum)、丹氏制氨菌(Ammonifex degensii)、热解纤维素菌(Caldicelulosiruptor becscii)、脱硫菌候选种(Candidatus Desulforudis)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、嗜热盐碱厌氧菌(Natranaerobius thermophilus)、嗜热丙酸厌氧肠状菌(Pelotomaculumthermopropionium)、嗜温嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)、嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、Allochromatium vinosum、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)、嗜盐亚硝化球菌(Nitrosococcus halophilus)、瓦氏亚硝化球菌(Nitrosococcus watsoni)、游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)、消旋纤线杆菌(Ktedonobacter racemifer)、调查甲烷喜盐菌(Methanohalobiumevestigatum)、多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)、泡沫节球藻(Nodularia spumigena)、念珠藻属物种(Nostoc sp.)、极大节螺藻(Arthrospira maxima)、钝顶节螺藻(Arthrospira platensis)、节螺藻属物种(Arthrospira sp.)、鞘丝藻属物种(Lyngbyasp.)、原型微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)、颤藻属物种(Oscillator ia sp.)、运动石孢菌(Petrotoga mobilis)、非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)、巴氏链球菌(Streptococcus pasteurianus)、灰色奈瑟氏菌(Neisseria cinerea)、海鸥弯曲菌(Campylobacter lari)、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)、白喉棒状杆菌(Coryne bacterium diphtheria)或海洋蓝藻菌(Acaryochloris marina)。在一些实施方案中，Cas9蛋白来自酿脓链球菌。在一些实施方案中，Cas9蛋白可以来自嗜热链球菌。在一些实施方案中，Cas9蛋白来自金黄色葡萄球菌。
基于本公开内容，另外合适的Cas9核酸酶和序列对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并且此类Cas9核酸酶和序列包括来自在Chylinski等人,(2013)RNA Biology10:5,726-737中公开的生物体和基因组的Cas9序列；所述文献通过引用并入本文。
在一些实施方案中，野生型Cas9对应于来自酿脓链球菌的Cas9(NCBI参考序列：NC_002737.2(核苷酸序列如下)；和Uniprot参考序列：Q99ZW2(氨基酸序列如下)
ATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGATATCGGCACAAATAGCGTCGGATGGGCGGTGATCACTGATGAATATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGGTTCTGGGAAATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGACAGTGGAGAGACAGCGGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCGGAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTTTTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGATGATAGTTTCTTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCATGAACGTCATCCTATTTTTGGAAATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATATCCAACTATCTATCATCTGCGAAAAAAATTGGTAGATTCTACTGATAAAGCGGATTTGCGCTTAATCTATTTGGCCTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATCCTGATAATAGTGATGTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGTACAAACCTACAATCAATTATTTGAAGAAAACCCTATTAACGCAAGTGGAGTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTAAATCAAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAAAAATGGCTTATTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCATTGGGTTTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGATTTGGCAGAAGATGCTAAATTACAGCTTTCAAAAGATACTTACGATGATGATTTAGATAATTTATTGGCGCAAATTGGAGATCAATATGCTGATTTGTTTTTGGCAGCTAAGAATTTATCAGATGCTATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATACTGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAATGATTAAACGCTACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAGTTCGACAACAACTTCCAGAAAAGTATAAAGAAATCTTTTTTGATCAATCAAAAAACGGATATGCAGGTTATATTGATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAAACCAATTTTAGAAAAAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGTGAAACTAAATCGTGAAGATTTGCTGCGCAAGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTCCCCATCAAATTCACTTGGGTGAGCTGCATGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTTATCCATTTTTAAAAGACAATCGTGAGAAGATTGAAAAAATCTTGACTTTTCGAATTCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGCGTGGCAATAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAGAAACAATTACCCCATGGAATTTTGAAGAAGTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAACTTTGATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGTTTGCTTTATGAGTATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAAGGAATGCGAAAACCAGCATTTCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAATCGAAAAGTAACCGTTAAGCAATTAAAAGAAGATTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATTTCAGGAGTTGAAGATAGATTTAATGCTTCATTAGGTACCTACCATGATTTGCTAAAAATTATTAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATCTTAGAGGATATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGAGATGATTGAGGAAAGACTTAAAACATATGCTCACCTCTTTGATGATAAGGTGATGAAACAGCTTAAACGTCGCCGTTATACTGGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAGGGATAAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCCAATCGCAATTTTATGCAGCTGATCCATGATGATAGTTTGACATTTAAAGAAGACATTCAAAAAGCACAAGTGTCTGGACAAGGCGATAGTTTACATGAACATATTGCAAATTTAGCTGGTAGCCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTACAGACTGTAAAAGTTGTTGATGAATTGGTCAAAGTAATGGGGCGGCATAAGCCAGAAAATATCGTTATTGAAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATTCGCGAGAGCGTATGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTTAAAGAGCATCCTGTTGAAAATACTCAATTGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTCCAAAATGGAAGAGACATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTATGATGTCGATCACATTGTTCCACAAAGTTTCCTTAAAGACGATTCAATAGACAATAAGGTCTTAACGCGTTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAAAAGATGAAAAACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGTGAACTTGATAAAGCTGGTTTTATCAAACGCCAATTGGTTGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAATTTTGGATAGTCGCATGAATACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAATCTAAATTAGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTGCTTTGATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTATGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAATATTTCTTTTACTCTAATATCATGAACTTCTTCAAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGAGATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAAACAGAAGTACAGACAGGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAAATTCGGACAAGCTTATTGCTCGTAAAAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTTGATAGTCCAACGGTAGCTTATTCAGTCCTAGTGGTTGCTAAGGTGGAAAAAGGGAAATCGAAGAAGTTAAAATCCGTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCCTTTGAAAAAAATCCGATTGACTTTTTAGAAGCTAAAGGATATAAGGAAGTTAAAAAAGACTTAATCATTAAACTACCTAAATATAGTCTTTTTGAGTTAGAAAACGGTCGTAAACGGATGCTGGCTAGTGCCGGAGAATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGCTCTGCCAAGCAAATATGTGAATTTTTTATATTTAGCTAGTCATTATGAAAAGTTGAAGGGTAGTCCAGAAGATAACGAACAAAAACAATTGTTTGTGGAGCAGCATAAGCATTATTTAGATGAGATTATTGAGCAAATCAGTGAATTTTCTAAGCGTGTTATTTTAGCAGATGCCAATTTAGATAAAGTTCTTAGTGCATATAACAAACATAGAGACAAACCAATACGTGAACAAGCAGAAAATATTATTCATTTATTTACGTTGACGAATCTTGGAGCTCCCGCTGCTTTTAAATATTTTGATACAACAATTGATCGTAAACGATATACGTCTACAAAAGAAGTTTTAGATGCCACTCTTATCCATCAATCCATCACTGGTCTTTATGAAACACGCATTGATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACTGA(SEQ ID NO:37)
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD(SEQ ID NO:38)
在一些实施方案中，Cas9是来自以下物种的Cas9蛋白：溃疡棒状杆菌(Corynebacterium ulcerans，NCBI参考文献：NC_015683.1，NC_017317.1)；白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria，NCBI参考文献NC 016782.1，NC_016786.1)；食蚜螺菌(Spiroplasmasyrphidicola，NCBI参考文献：NC_021284.1)；中间普雷沃氏菌(Prevotellaintermedia，NCBI参考文献：NC_017861.1)；台湾螺原体(Spiroplasma taiwanense，NCBI参考文献：NC_021846.1)；海豚链球菌(Streptococcus iniae，NCBI参考文献：NC_021314.1)；波罗的海贝尔氏菌(Belliella baltica，NCBI文献：NC_018010.1)；扭曲冷弯曲菌(Psychroflexus torquisl，NCBI参考文献：NC_018721.1)；无害李斯特氏菌(NCBI参考文献：NP_472073.1)，空肠弯曲菌(NCBI参考文献：YP_002344900.1)或脑膜炎奈瑟氏菌(NCBI参考文献：YP_002342100.1)。
在一些实施方案中，本文提供的碱基编辑器包含可编程DNA结合蛋白，例如Cas核酸酶，具有降低或消除的核酸酶活性。例如，Ca9蛋白可以是核酸酶活性丧失的，或者可以是是Cas9切口酶。用于生成具有活性丧失的DNA切割结构域的Cas9蛋白(或其片段)的方法是已知的(参见例如，Jinek等人,Science.337:816-821(2012)；Qi等人,(2013)Cell.28；152(5):1173-83，其中的每一个通过引用以其全文并入本文)。例如，已知Cas9的DNA切割结构域包括两个亚结构域，即HNH核酸酶亚结构域和RuvC1亚结构域。HNH亚结构域切割与gRNA互补的链，而RuvC1亚结构域切割非互补链。这些亚结构域内的突变可以使Cas9的核酸酶活性沉默。例如，突变D10A和H840A使酿脓链球菌Cas9的核酸酶活性完全失活(Jinek等人,Science.337:816-821(2012)；Qi等人,Cell.28；152(5):1173-83(2013))。根据本公开内容适于使用的Cas9切口酶具有活性HNH结构域和活性丧失的RuvC结构域，并且能够仅切割由sgRNA结合的靶DNA链(所述链是经由胞苷脱氨编辑的链的相反链)。本公开内容的Cas9切口酶可以包含使RuvC结构域失活的突变，例如D10A突变。应理解，使RuvC结构域失活的任何突变都可以包含在Cas9切口酶中，例如，在RuvC结构域中包含插入、缺失或一个或多个氨基酸取代。在本文所述的Cas9切口酶中，当RuvC结构域失活时，HNH结构域保持具有活性。因此，虽然Cas9切口酶可以包含除使RuvC结构域失活的突变(例如，D10A)以外的突变，但这些突变不影响HNH结构域的活性。在非限制性Cas9切口酶实例中，位置840处的组氨酸保持不变。
在一些实施方案中，核酸酶活性丧失的Cas9包含如下提供的dCas9(D10A和H840A)的氨基酸序列：
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD(SEQ ID NO:39)
在一些实施方案中，Cas9切口酶包含示例性催化Cas9切口酶(nCas9)的氨基酸序列，如下：
DKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD(SEQ ID NO:40)
基于本公开内容和本领域的知识，使Cas9失活的另外合适的突变对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且在本公开内容的范围内。此类另外的示例性合适的核酸酶活性丧失的Cas9结构域包括但不限于D839A和/或N863A(参见例如，Prashant等人,NatureBiotechnology.2013；31(9):833-838，其通过引用并入本文)或K603R{参见例如，Chavez等人,Nature Methods 12,326-328,2015，其通过引用并入本文)。Cas9、dCas9或Cas9变体还涵盖来自任何生物体的Cas9、dCas9或Cas9变体。还应理解，dCas9、Cas9切口酶或来自任何生物体的其他适当的Cas9变体可以根据本公开内容使用。
在一些实施方案中，Cas9是指来自古细菌(例如，纳米古细菌)的Cas9，其构成单细胞原核微生物的域和界。
在一些实施方案中，可编程DNA结合蛋白包含CasX或CasY或其变体，其描述于以下中：例如Burstein等人,"New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes."CellRes.2017年2月21日.doi:10.1038/cr.2017.21，其全部内容特此通过引用并入。使用基因组解析的宏基因组学，鉴定了许多CRISPR-Cas系统，包括生命古细菌菌领域中首次报道的Cas9。作为活性CRISPR-Cas系统的一部分，这种不同的Cas9蛋白是在很少研究的纳米古细菌中发现的。在细菌中，发现了两个先前未知的系统，CRISPR-CasX和CRISPR-CasY，它们是迄今为止发现的最紧凑的系统之一。
本公开内容的一些方面提供了本文提供的核碱基编辑器的高保真Cas9结构域。在一些实施方案中，高保真Cas9结构域是工程化的Cas9结构域，与对应的野生型Cas9结构域相比，所述结构域包含减少Cas9结构域与DNA的糖磷酸酯骨架之间的静电相互作用的一个或多个突变。不希望受任何特定理论的约束，减少与DNA的糖磷酸酯骨架的静电相互作用的高保真Cas9结构域可能具有较少的脱靶效应。在一些实施方案中，Cas9结构域包含减少Cas9结构域与DNA的糖磷酸酯骨架之间的缔合的一个或多个突变。在一些实施方案中，Cas9结构域包含使Cas9结构域与DNA的糖磷酸酯骨架之间的缔合减少至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少l0％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或更多的一个或多个突变。在一些实施方案中，本文提供的Cas9融合蛋白中的任一种包含N497X、R661X、Q695X和/或Q926X中的一个或多个，如在野生型Cas9氨基酸序列或另一种Cas9中的对应氨基酸中编号，其中X是任何氨基酸。在一些实施方案中，本文提供的Cas9或Cas9融合蛋白中的任一种包含野生型Cas9序列中提供的氨基酸序列的N497A、R661A、Q695A和/或Q926A突变中的一个或多个或对应突变，如在野生型Cas9氨基酸序列或另一种Cas9中的对应氨基酸中编号。高保真Cas9结构域描述于以下中：Kleinstiver,B.P.等人"High-fidelity CRISPR-Cas9nucleases with no detectable genome-wide off-target effects."Nature 529,490-495(2016)；和Slaymaker,I.M.等人"Rationally engineered Cas9 nucleases withimproved specificity."Science 351,84-88(2015)；每一个的全部内容通过引用并入本文。
应理解，本文提供的任何碱基编辑器，例如本文提供的任何腺苷脱氨酶碱基编辑器，可以通过修饰如本文所述的Cas9结构域来转化为高保真碱基编辑器，以生成高保真碱基编辑器，例如高保真腺苷碱基编辑器。在一些实施方案中，高保真Cas9结构域是核酸酶活性丧失的Cas9结构域。在一些实施方案中，高保真Cas9结构域是Cas9切口酶结构域。
在一些实施方案中，Cas蛋白包含CasX或CasY或其变体，其描述于以下中：例如Burstein等人,"New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes."CellRes.2017年2月21日.doi:10.1038/cr.2017.21，其全部内容特此通过引用并入。使用基因组解析的宏基因组学，鉴定了许多CRISPR-Cas系统，包括生命古细菌菌领域中首次报道的Cas9。作为活性CRISPR-Cas系统的一部分，这种不同的Cas9蛋白是在很少研究的纳米古细菌中发现的。在细菌中，发现了两个先前未知的系统，CRISPR-CasX和CRISPR-CasY，它们是迄今为止发现的最紧凑的系统之一。
酿脓链球菌Cas9的替代物可以包含来自Cpf1家族的RNA指导的核酸内切酶，其在哺乳动物细胞中表现出切割活性。Cpf1介导的DNA切割是具有短3’突出的双链断裂，这与Cas9介导的DNA切割不同。Cpf1的交错切割模式可能开辟定向基因转移的可能性，类似于传统的限制性酶克隆，这可能增加基因编辑的效率。与以上所述的Cas9变体和直系同源物一样，Cpf1也可以将CRISPR可以靶向的位点数量扩展到缺乏SpCas9所青睐的NGG PAM位点的富含AT的区域或富含AT的基因组。
在一些实施方案中，Cas9蛋白包含与表23中列出的氨基酸序列中的任一个具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或至少99.9％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含表23中列出的氨基酸序列中的任一个。在一些实施方案中，Cas9蛋白的序列是表23中列出的氨基酸序列中的任一个。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含与SEQ ID NO:2137、2149、2154、2158、2188、2140、40、2146、2152、2156和2160的氨基酸序列中的任一个具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或至少99.9％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含SEQ ID NO:2137、2149、2154、2158、2188、2140、40、2146、2152、2156和2160的氨基酸序列中的任一个。在一些实施方案中，Cas9蛋白的序列是SEQ ID NO:2137、2149、2154、2158和2188的氨基酸序列中的任一个。
在一些实施方案中，Cas9蛋白由与表23中列出的多核苷酸序列中的任一个具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或至少99.9％同一性的多核苷酸序列编码。在一些实施方案中，Cas9蛋白由表23中列出的多核苷酸序列中的任一个编码。在一些实施方案中，Cas9蛋白由与表23中列出的多核苷酸序列中的任一个具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或至少99.9％同一性的多核苷酸序列表达。在一些实施方案中，Cas9蛋白由表23中列出的多核苷酸序列中的任一个表达。在一些实施方案中，Cas9蛋白由多核苷酸序列编码。在一些实施方案中，Cas9蛋白由与SEQ IDNO:2192、2148、2153、2157、2161、2168、2174、2180、2186、2189、2139、2142、2145、2151、2155、2159、2162、2164、2167、2169、2171、2173、2175、2177、2179、2181、2183、2185、2187和2190的多核苷酸序列中的任一个具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或至少99.9％同一性的多核苷酸序列编码。在一些实施方案中，Cas9蛋白由包含SEQ ID NO:2192、2148、2153、2157、2161、2168、2174、2180、2186、2189、2139、2142、2145、2151、2155、2159、2162、2164、2167、2169、2171、2173、2175、2177、2179、2181、2183、2185、2187和2190的多核苷酸序列中的任一个的多核苷酸序列编码。在一些实施方案中，Cas9蛋白由SEQ ID NO:2192、2148、2153、2157、2161、2168、2174、2180、2186和2189的多核苷酸序列中的任一个编码。在一些实施方案中，Cas9蛋白由与SEQ ID NO:2192、2148、2153、2157、2161、2168、2174、2180、2186、2189、2139、2142、2145、2151、2155、2159、2162、2164、2167、2169、2171、2173、2175、2177、2179、2181、2183、2185、2187、2190、2138、2147、2158或其组合的多核苷酸序列中的任一个具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或至少99.9％同一性的多核苷酸序列表达：在一些实施方案中，Cas9蛋白由包含SEQID NO:2192、2148、2153、2157、2161、2168、2174、2180、2186、2189、2139、2142、2145、2151、2155、2159、2162、2164、2167、2169、2171、2173、2175、2177、2179、2181、2183、2185、2187、2190、2138、2147、2158或其组合的多核苷酸序列中的任一个的多核苷酸序列编码。在一些实施方案中，Cas9蛋白由SEQ ID NO:2192、2148、2153、2157、2161、2168、2174、2180、2186和2189的多核苷酸序列中的任一个表达。在一些实施方案中，多核苷酸序列还包含与SEQ IDNO:2138、2147、2158或其组合的多核苷酸序列中的任一个具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或至少99.9％同一性的多核苷酸序列中的任一个。在一些实施方案中，多核苷酸序列还包含SEQ ID NO:2138、2147、2158或其组合的多核苷酸序列中的任一个。
接头
本文提供的碱基编辑器可以包括连接碱基编辑器的一个或多个组分的接头。在某些实施方案中，接头可以用于连接本文所述的任何蛋白质或蛋白质结构域。接头可以简单地是共价键，或者它可以是许多原子长度的聚合物接头。在某些实施方案中，接头是多肽或基于氨基酸。在其他实施方案中，接头不是类似于肽的。在一些实施方案中，接头是碳键、二硫键、碳杂原子键等。在某些实施方案中，接头是酰胺键的碳氮键。在某些实施方案中，接头是环状的或非环状的、取代的或未取代的、支化的或非支化的脂肪族或杂脂族的接头。在某些实施方案中，接头是聚合物(例如，聚乙烯、聚乙二醇、聚酰胺、聚酯等)。在某些实施方案中，接头包括氨基链烷酸的单体、二聚体或聚合物。在某些实施方案中，接头包括氨基链烷酸(例如，甘氨酸、乙醇酸、丙氨酸、β-丙氨酸、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸、5-戊酸等)。在某些实施方案中，接头包括氨基己酸(Ahx)的单体、二聚体或聚合物。在某些实施方案中，接头是基于碳环部分(例如，环戊烷、环己烷)。在其他实施方案中，接头包括聚乙二醇(PEG)。在其他实施方案中，接头包括氨基酸。在某些实施方案中，接头包括肽。在一些实施方案中，接头包括芳基或杂芳基部分。在某些实施方案中，接头是基于苯基环。接头可以包括功能化的部分，以促进来自肽的亲核试剂(例如硫醇、氨基)附接到接头。任何亲电子试剂都可以用作接头的一部分。示例性亲电子试剂包括但不限于活化酯、活化酰胺、烷基卤化物、芳基卤化物、酰基卤化物和异硫氰酸酯。
在一些实施方案中，接头是氨基酸或多个氨基酸(例如，肽或蛋白质)。在一些实施方案中，接头是键(例如，共价键)、有机分子、基团、聚合物或化学部分。在一个实施方案中，接头的长度是5-100个氨基酸，例如长度是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、110-120、120-130、130-140、140-150或150-200个氨基酸。还设想更长或更短的接头。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列SGSETPGTSESATPES(SEQ IDNO:17)，所述接头也可以被称为XTEN接头。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列SGGS。在一些实施方案中，接头包含(SGGS)n(SEQ ID NO:41)、(GGGS)n(SEQ ID NO:42)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:43)、(G)n(SEQ ID NO:44)、(EAAAK)n(SEQ ID NO:45)、(GGS)n(SEQ ID NO:46)、SGSETPGTSESATPES(SEQ ID NO:17)或(XP)n(SEQ ID NO:47)基序或这些中的任一个的组合，其中n独立地是1与30之间的整数，并且其中X是任何氨基酸。在一些实施方案中，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在一些实施方案中，接头包含SGSETPGTSESATPES(SEQ ID NO:17)、SGGSSGSETPGTSESATPESSGGS(SEQ ID NO:19)。在一些实施方案中，接头包含SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS(SEQ ID NO:20)。在一些实施方案中，接头包含GGSGGSPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGGSGGS(SEQ ID NO:21)。在一些实施方案中，接头的长度是24个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列SGGSSGGSSGSETPGTSESATPES(SEQ ID NO:23)。在一些实施方案中，接头的长度是40个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSGGSSGGS(SEQ ID NO:24)。在一些实施方案中，接头的长度是64个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS(SEQ ID NO:25)。在一些实施方案中，接头的长度是92个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列PGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATS(SEQ ID NO:26)。应理解，本文提供的任何接头都可以用于连接第一腺苷脱氨酶和第二腺苷脱氨酶；脱氨酶(例如，第一或第二腺苷脱氨酶)和RNA指导的可编程DNA结合蛋白；RNA指导的可编程DNA结合蛋白和NLS；或脱氨酶(例如，第一或第二腺苷脱氨酶)和NLS。
可以采用脱氨酶(例如，工程化的ecTadA)与RNA指导的可编程DNA结合蛋白(例如，Cas9结构域)之间和/或第一腺苷脱氨酶与第二腺苷脱氨酶之间的各种接头长度和柔性(例如，范围为非常柔性的接头形式(GGGGS)n(SEQ ID NO:22)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:22)和(G)n至更具刚性的接头形式(EAAAK)n(SEQ ID NO:48)、(SGGS)n(SEQ ID NO:49)和(XP)n)，以便实现用于特定应用的脱氨酶活性的最佳长度。在一些实施方案中，n是3与30之间的任何整数。在一些实施方案中，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在一些实施方案中，接头包含(GGS)n(SEQ ID NO:51)基序，其中n是1、3或7。
原间隔子相邻基序
CRISPR簇含有间隔子、与先前可移动元件互补的序列和靶入侵核酸。CRISPR簇被转录并加工成CRISPR RNA(crRNA)。例如，在II型CRISPR系统中，前crRNA的正确加工需要反编码的小RNA(tracrRNA)、内源性核糖核酸酶3(rnc)和Cas9蛋白。tracrRNA充当前crRNA的核糖核酸酶3辅助加工的指导物。Cas9识别CRISPR重复序列中的短基序(PAM或原间隔子相邻基序)(参见例如，“Complete genome sequence of an Ml strain of Streptococcuspyogenes.”Ferretti et ah,J.J.,McShan W.M.,Ajdic D.J.,Savic D.J.,Savic G.,LyonK.,Primeaux C,Sezate S.,Suvorov A.N.,Kenton S.,Lai H.S.,Lin S.P.,Qian Y.,JiaH.G.,Najar F.Z.,Ren Q.,Zhu H.,Song L.,Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:4658-4663(2001)；"CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factorRNase III."Deltcheva E.,Chylinski K.,Sharma CM.,Gonzales K.,Chao Y.,PirzadaZ.A.,Eckert M.R.,Vogel J.,Charpentier E.,Nature 471:602-607(2011)；以及"Aprogrammable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterialimmunity."Jinek M.,Chylinski K.,Fonfara I.,Hauer M.,Doudna J.A.,CharpentierE.Science 337:816-821(2012)，其中的每一个的全部内容通过引用并入本文)。Cas9直系同源物已在各种物种中描述，包括但不限于酿脓链球菌和嗜热链球菌。
本公开内容的一些方面提供了经编程的DNA结合蛋白结构域，例如改变PAM特异性的Cas9结构域。在一些实施方案中，来源于酿脓链球菌(spCas9)的Cas9识别典型NGG PAM序列，其中“NGG”中的“N”是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)或胞嘧啶(C)，并且G是鸟嘌呤。在一些实施方案中，本文提供的碱基编辑融合蛋白通过在PAM上游大约15个碱基处的4个碱基区域内对靶核碱基进行脱氨(例如，“脱氨窗口”)来起作用。在一些实施方案中，脱氨窗口在PAM上游5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个碱基处。因此，在一些实施方案中，本文提供的任何融合蛋白都可以含有Cas9结构域，所述结构域能够结合不含典型(例如，NGG)PAM序列的核苷酸序列。与非典型PAM序列结合的Cas9结构域已在本领域中描述并且对于技术人员而言将是显而易见的。例如，结合非典型PAM序列的Cas9结构域描述于以下中：Kleinstiver,B.P.等人,"Engineered CRISPR-Cas9 nucleaseswith altered PAM specificities"Nature 523,481-485(2015)；和Kleinstiver,B.P.,etah,"Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 bymodifying PAM recognition"Nature Biotechnology 33,1293-1298(2015)；每个的全部内容特此通过引用并入。在一些实施方案中，Cas9结构域是来自金黄色葡萄球菌的Cas9结构域(SaCas9)。在一些实施方案中，SaCas9结构域是核酸酶活性SaCas9、核酸酶活性丧失的SaCas9(SaCas9d)或SaCas9切口酶(SaCas9n)。以下提供了野生型SaCas9氨基酸序列：
KRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG(SEQID NO:52)
在一些实施方案中，SaCas9包含N579X突变或在任何氨基酸序列中的对应突变，如在野生型SaCas9序列中编号，其中X是除N之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，SaCas9包含N579A突变，如在野生型SaCas9序列中编号，或另一种SaCas9蛋白中的对应突变。
在一些实施方案中，SaCas9结构域、核酸酶活性丧失的SaCas9结构域或SaCas9切口酶结构域可以与具有非典型PAM的核酸序列结合。在一些实施方案中，SaCas9结构域、SaCas9d结构域或SaCas9n结构域可以与具有NNGRRT PAM序列的核酸序列结合，其中N＝A、T、C或G，并且R＝A或G。在一些实施方案中，SaCas9结构域包含E781X、N967X和R1014X中的一个或多个，如在野生型SaCas9序列中编号，或另一种SaCas9蛋白中的对应突变，其中X是任何氨基酸。在一些实施方案中，SaCas9结构域包含E781K、N967K和R1014H突变中的一个或多个，如在野生型SaCas9序列中编号，或另一种SaCas9蛋白中的对应突变。在一些实施方案中，SaCas9结构域包含E781K、N967K或R1014H突变，如在野生型SaCas9序列中编号，或另一种SaCas9蛋白中的对应突变。
在一些实施方案中，Cas9结构域是来自酿脓链球菌的Cas9结构域(SpCas9)。在一些实施方案中，SpCas9结构域是核酸酶活性SpCas9、核酸酶活性丧失的SpCas9(SpCas9d)或SpCas9切口酶(SpCas9n)。在一些实施方案中，SpCas9包含D10X突变，如在野生型SpCas9氨基酸序列中编号，或另一种SapCas9蛋白中的对应突变，其中X是除D之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，SpCas9包含D10A突变，如在野生型SpCas9氨基酸序列中编号，或另一种SpCas9蛋白中的对应突变。在一些实施方案中，SpCas9结构域、核酸酶活性丧失的SpCas9结构域或SpCas9切口酶结构域可以与具有非NGG PAM的核酸序列结合。在一些实施方案中，SpCas9结构域、SpCas9结构域、核酸酶活性丧失的SpCas9结构域或SpCas9切口酶结构域可以与具有NGG、NGA或NGCG PAM序列的核酸序列结合。在一些实施方案中，SpCas9结构域包含D1135X、R1335X和T1337X突变中的一个或多个，如在野生型SpCas9氨基酸序列中编号，或另一种SpCas9蛋白中的对应突变，其中X是任何氨基酸。在一些实施方案中，SpCas9结构域包含D1135E、R1335Q和T1337R突变中的一个或多个，如在野生型SpCas9氨基酸序列中编号，或另一种SpCas9蛋白中的对应突变。在一些实施方案中，SpCas9结构域包含Dl 134V、R1334Q和T1336R突变中的一个或多个，如在野生型Cas9氨基酸序列中编号，或其对应突变。在一些实施方案中，SpCas9结构域包含D1135V、R1335Q和T1337R突变，如在野生型SpCas9氨基酸序列中编号，或另一种SpCas9蛋白中的对应突变。在一些实施方案中，SpCas9结构域包含D1135X、G1218X、R1335X和T1337X突变中的一个或多个，如在野生型SpCas9氨基酸序列中编号，或另一种SpCas9蛋白中的对应突变，其中X是任何氨基酸。在一些实施方案中，SpCas9结构域包含D1135V、G1218R、R1335Q和T1337R突变中的一个或多个，如在野生型SpCas9氨基酸序列中编号，或另一种SpCas9蛋白中的对应突变。在一些实施方案中，SpCas9结构域包含D1135V、G1218R、R1335Q和T1337R突变，如在野生型SpCas9氨基酸序列中编号，或另一种SpCas9蛋白中的对应突变。
在一些实施方案中，本文提供的任何融合蛋白的Cas9结构域包含与本文提供的Cas9序列中的任一个具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文提供的碱基编辑器包含RNA指导的可编程DNA结合蛋白，其可以用于靶向和修饰特定核酸(例如，DNA或RNA)序列。核酸可编程DNA结合蛋白包括但不限于Cas9(例如，核酸酶活性丧失的Cas9和Cas9切口酶)、CasX、CasY、Cas12a(Cpf1)、Cas12b、C2c1、C2c2、C2C3和Argonaute。具有与Cas9不同的PAM特异性的核酸可编程DNA结合蛋白的一个实例是来自普雷沃氏菌属和弗朗西斯菌属1(Cpf1)的规律成簇间隔短回文重复序列。与Cas9类似，Cpf1也是2类CRISPR效应子。已经显示，Cpf1介导具有与Cas9不同的特征的稳健DNA干扰。Cpf1是缺乏tracrRNA的单RNA指导的核酸内切酶，并且它利用富含T的原间隔子相邻基序(TTN、TTTN或YTN)。Cpf1蛋白描述于以下中：Yamano et ah,“Crystalstructure of Cpf1 in complex with guide RNA and target DNA.”Cell(165)2016,第949-962页；其全部内容特此通过引用并入。
在一些实施方案中，本文提供的碱基编辑器包含核酸酶活性丧失的Cpf1蛋白或其变体。Cpf1蛋白具有与Cas9的RuvC结构域类似的RuvC样核酸内切酶结构域，但没有HNH核酸内切酶结构域，并且Cpf1的N末端没有Cas9的α-螺旋识别叶。在一些实施方案中，Cpf1切口酶包含对应于D917A、E1006A或D1255A的一个或多个突变，如在新凶手弗朗西斯菌Cpf1蛋白中编号。
以下提供了野生型新凶手弗朗西斯菌Cpf1氨基酸序列：
MSIYQEFVNKYSLSKTLRFELIPQGKTLENIKARGLILDDEKRAKDYKKAKQIIDKYHQFFIEEILSSVCISEDLLQNYSDVYFKLKKSDDDNLQKDFKSAKDTIKKQISEYIKDSEKFKNLFNQNLIDAKKGQESDLILWLKQSKDNGIELFKANSDITDIDEALEIIKSFKGWTTYFKGFHENRKNVYSSNDIPTSIIYRIVDDNLPKFLENKAKYESLKDKAPEAINYEQIKKDLAEELTFDIDYKTSEVNQRVFSLDEVFEIANFNNYLNQSGITKFNTIIGGKFVNGENTKRKGINEYINLYSQQINDKTLKKYKMSVLFKQILSDTESKSFVIDKLEDDSDVVTTMQSFYEQIAAFKTVEEKSIKETLSLLFDDLKAQKLDLSKIYFKNDKSLTDLSQQVFDDYSVIGTAVLEYITQQIAPKNLDNPSKKEQELIAKKTEKAKYLSLETIKLALEEFNKHRDIDKQCRFEEILANFAAIPMIFDEIAQNKDNLAQISIKYQNQGKKDLLQASAEDDVKAIKDLLDQTNNLLHKLKIFHISQSEDKANILDKDEHFYLVFEECYFELANIVPLYNKIRNYITQKPYSDEKFKLNFENSTLANGWDKNKEPDNTAILFIKDDKYYLGVMNKKNNKIFDDKAIKENKGEGYKKIVYKLLPGANKMLPKVFFSAKSIKFYNPSEDILRIRNHSTHTKNGSPQKGYEKFEFNIEDCRKFIDFYKQSISKHPEWKDFGFRFSDTQRYNSIDEFYREVENQGYKLTFENISESYIDSVVNQGKLYLFQIYNKDFSAYSKGRPNLHTLYWKALFDERNLQDVVYKLNGEAELFYRKQSIPKKITHPAKEAIANKNKDNPKKESVFEYDLIKDKRFTEDKFFFHCPITINFKSSGANKFNDEINLLLKEKANDVHILSIDRGERHLAYYTLVDGKGNIIKQDTFNIIGNDRMKTNYHDKLAAIEKDRDSARKDWKKINNIKEMKEGYLSQVVHEIAKLVIEYNAIVVFEDLNFGFKRGRFKVEKQVYQKLEKMLIEKLNYLVFKDNEFDKTGGVLRAYQLTAPFETFKKMGKQTGIIYYVPAGFTSKICPVTGFVNQLYPKYESVSKSQEFFSKFDKICYNLDKGYFEFSFDYKNFGDKAAKGKWTIASFGSRLINFRNSDKNHNWDTREVYPTKELEKLLKDYSIEYGHGECIKAAICGESDKKFFAKLTSVLNTILQMRNSKTGTELDYLISPVADVNGNFFDSRQAPKNMPQDADANGAYHIGLKGLMLLGRIKNNQEGKKLNLVIKNEEYFEFVQNRNN(SEQ ID NO:53)
在一些实施方案中，碱基编辑器包含Cpf1蛋白。在一些实施方案中，Cpf1蛋白是Cpf1切口酶。在一些实施方案中，Cpf1蛋白是核酸酶活性丧失的Cpf1。在一些实施方案中，Cpf1蛋白包含与本文提供的FnCpf1序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Cpf1蛋白包含对应于D917A、E1006A、D1255A、D917A/E1006A、D917A/D1255A、E1006A/D1255A或D917A/E1006A/D1255A的突变，如在本文提供的野生型FnCpf1序列中编号。应理解，根据本公开内容，也可以使用来自其他细菌物种的Cpf1。
在一些实施方案中，核酸可编程DNA结合蛋白包括Cas12b(C2c1)、C2c2或C2c3蛋白或其变体。2类CRISPR-Cas系统中Cas蛋白的另外的特征描述于以下中：Shmakov等人,"Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2CRISPR CasSystems",Mol.Cell,2015年11月5日；60(3):385-397，其全部内容特此通过引用并入。两种系统C2c1和C2c3的效应子含有与Cpf1相关的RuvC样核酸内切酶结构域。第三种系统C2c2含有具有两个预测的HEPN RNA酶结构域的效应子。成熟CRISPR RNA的产生是tracrRNA非依赖性的，这与通过C2c1产生CRISPR RNA不同。C2c1依赖于CRISPR RNA和tracrRNA两者进行DNA切割。酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobaccillus acidoterrastris)C2c1(AacC2c1)与嵌合单分子指导RNA(sgRNA)的复合物的晶体结构描述于以下中：Liu等人,"C2c1-sgRNAComplex Structure Reveals RNA-Guided DNA Cleavage Mechanism",Mol.Cell,2017年1月19日；65(2):310-322；Yang等人,"PAM-dependent Target DNA Recognition andCleavage by C2C1CRISPR-Cas，其全部内容特此通过引用并入。
以下提供了示例性Cas12b氨基酸序列(外村尚芽孢杆菌(Bacillus hisashii)Cas12b)：
BhCas12b(外村尚芽孢杆菌)NCBI参考序列：WP_095142515
MAPKKKRKVGIHGVPAAATRSFILKIEPNEEVKKGLWKTHEVLNHGIAYYMNILKLIRQEAIYEHHEQDPKNPKKVSKAEIQAELWDFVLKMQKCNSFTHEVDKDEVFNILRELYEELVPSSVEKKGEANQLSNKFLYPLVDPNSQSGKGTASSGRKPRWYNLKIAGDPSWEEEKKKWEEDKKKDPLAKILGKLAEYGLIPLFIPYTDSNEPIVKEIKWMEKSRNQSVRRLDKDMFIQALERFLSWESWNLKVKEEYEKVEKEYKTLEERIKEDIQALKALEQYEKERQEQLLRDTLNTNEYRLSKRGLRGWREIIQKWLKMDENEPSEKYLEVFKDYQRKHPREAGDYSVYEFLSKKENHFIWRNHPEYPYLYATFCEIDKKKKDAKQQATFTLADPINHPLWVRFEERSGSNLNKYRILTEQLHTEKLKKKLTVQLDRLIYPTESGGWEEKGKVDIVLLPSRQFYNQIFLDIEEKGKHAFTYKDESIKFPLKGTLGGARVQFDRDHLRRYPHKVESGNVGRIYFNMTVNIEPTESPVSKSLKIHRDDFPKVVNFKPKELTEWIKDSKGKKLKSGIESLEIGLRVMSIDLGQRQAAAASIFEVVDQKPDIEGKLFFPIKGTELYAVHRASFNIKLPGETLVKSREVLRKAREDNLKLMNQKLNFLRNVLHFQQFEDITEREKRVTKWISRQENSDVPLVYQDELIQIRELMYKPYKDWVAFLKQLHKRLEVEIGKEVKHWRKSLSDGRKGLYGISLKNIDEIDRTRKFLLRWSLRPTEPGEVRRLEPGQRFAIDQLNHLNALKEDRLKKMANTIIMHALGYCYDVRKKKWQAKNPACQIILFEDLSNYNPYEERSRFENSKLMKWSRREIPRQVALQGEIYGLQVGEVGAQFSSRFHAKTGSPGIRCSVVTKEKLQDNRFFKNLQREGRLTLDKIAVLKEGDLYPDKGGEKFISLSKDRKCVTTHADINAAQNLQKRFWTRTHGFYKVYCKAYQVDGQTVYIPESKDQKQKIIEEFGEGYFILKDGVYEWVNAGKLKIKKGSSKQSSSELVDSDILKDSFDLASELKGEKLMLYRDPSGNVFPSDKWMAAGVFFGKLERILISKLTNQYSISTIEDDSSKQSMKRPAATKKAGQAKKKK(SEQ ID NO:54)
在一些实施方案中，可编程DNA结合蛋白包括argonaute蛋白。这种核酸可编程DNA结合蛋白的一个实例是来自格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)的Argonaute蛋白(NgAgo)。NgAgo是ssDNA指导的核酸内切酶。NgAgo结合-24个核苷酸的5’磷酸化ssDNA(gDNA)，以指引其到达其靶位点，并将在gDNA位点处进行DNA双链断裂。与Cas9相比，NgAgo-gDNA系统不需要原间隔子相邻基序(PAM)。使用核酸酶活性丧失的NgAgo(dNgAgo)可以极大地扩展可能靶向的碱基。NgAgo的表征和使用描述于以下中：Gao等人,Nat Biotechnol.,2016年7月；34(7):768-73.PubMed PMID:27136078；Swarts等人,Nature.507(7491)(2014):258-61；以及Swarts等人,Nucleic Acids Res.43(10)(2015):5120-9，其中的每一个通过引用并入本文。
在一些实施方案中，原间隔子序列包括与表1或表24中列出的原间隔子序列中的任一个具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或至少99.9％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，原间隔子序列包括表1或表24中列出的原间隔子序列中的任一个。在一些实施方案中，原间隔子序列是表1或表24中列出的原间隔子序列中的任一个。在一些实施方案中，原间隔子序列包括与SEQ ID NO:13-15、50、66-69、81-252和1594-1617的序列中的任一个具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或至少99.9％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，原间隔子序列包括SEQ IDNO:13-15、50、66-69、81-252和1594-1617的序列中的任一个。在一些实施方案中，原间隔子序列是SEQ ID NO:13-15、50、66-69、81-252和1594-1617的序列中的任一个。
指导多核苷酸
本公开内容的一些方面提供了复合物，其包含本文提供的融合蛋白中的任一种和与可编程DNA结合蛋白(例如，碱基编辑器或融合蛋白的Cas9结构域)结合的指导多核苷酸。
在一些实施方案中，指导多核苷酸是指导多核苷酸、指导RNA(gRNA)或编码其的核酸。
在一些实施方案中，指导多核苷酸包含单个核酸序列。在一些实施方案中，指导多核苷酸包含两个核酸序列。在一些实施方案中，指导核酸(例如，指导RNA)的长度是15-100个核苷酸，并且包含与靶序列互补的具有至少10个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，指导RNA的长度是15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在一些实施方案中，指导RNA包含与靶序列互补的具有15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，靶序列是DNA序列。在一些实施方案中，靶序列是哺乳动物的基因组中的序列。在一些实施方案中，靶序列是人的基因组中的序列。在一些实施方案中，靶序列的3’末端与典型PAM序列(NGG)紧密相邻。在一些实施方案中，指导核酸(例如，指导RNA)与和疾病或病症相关联的序列互补。在一些实施方案中，指导核酸(例如，指导RNA)与和疾病或病症相关联的序列互补，所述疾病或病症具有PCSK9基因、ANGPTL3基因或APOC3基因中的突变。
本公开内容的一些方面提供了使用融合蛋白或包含本文提供的指导核酸(例如，gRNA)和核碱基编辑器的复合物的方法。例如，本公开内容的一些方面提供了包括将DNA或RNA分子与本文提供的融合蛋白中的任一种以及与至少一种指导核酸(例如，指导RNA)接触的方法，其中指导核酸(例如，指导RNA)的长度是约15-100个核苷酸，并且包含与靶序列互补的至少10个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，靶序列的3’末端与典型PAM序列(NGG)紧密相邻。在一些实施方案中，靶序列的3’末端不与典型PAM序列(NGG)紧密相邻。在一些实施方案中，靶序列的3’末端与AGC、GAG、TTT、GTG或CAA序列紧密相邻。
在一些实施方案中，指导多核苷酸是DNA。在一些实施方案中，指导多核苷酸是RNA。在一些实施方案中，指导多核苷酸是经修饰的人工多核苷酸。在一些实施方案中，指导多核苷酸是单分子或单分子多核苷酸。在一些实施方案中，指导多核苷酸包括双重多核苷酸。在一些实施方案中，指导多核苷酸是通过接头连接的双重多核苷酸。在一些实施方案中，指导多核苷酸是通过非核酸接头连接的双重多核苷酸。在一些实施方案中，指导多核苷酸是通过肽接头或化学接头连接的双重多核苷酸。在一些实施方案中，指导多核苷酸是单指导RNA。指导RNA(gRNA)可以将可编程DNA结合蛋白(例如，2类Cas核酸酶，例如Cas9)指引至靶核酸分子上的靶序列，其中gRNA与可编程DNA结合蛋白杂交并修饰靶序列。在一些实施方案中，gRNA和碱基编辑器融合蛋白可以形成核糖核蛋白(RNP)，例如CRISPR/Cas复合物。在一些实施方案中，CRISPR复合物可以是II型CRISPR/Cas9复合物。在一些实施方案中，CRISPR/Cas复合物可以是V型CRISPR/Cas复合物，诸如Cpf1/指导RNA复合物。
gRNA可以包含至少三个区域：5’末端处的第一区域，其可以与染色体序列(间隔子区)中靶位点的互补链结合；第二内部区域，其可以形成茎环结构；和第三3’区域，其可以是单链的。每个指导RNA的第一区域也可以是不同的，使得每个gRNA将蛋白质(例如，Cas9)指引至特定靶位点。此外，每个gRNA的第二区域和第三区域在所有gRNA中可以是相同的。gRNA的第二区域可以形成二级结构。在一些实施方案中，由gRNA形成的二级结构可以包含茎(或发夹)和环。环和茎的长度可以变化。在一些实施方案中，环的长度范围可以是约3至约10个核苷酸。在一些实施方案中，茎的长度范围可以是约6至约20个核苷酸。茎可以包含一个或多个1至10个核苷酸或约10个核苷酸的凸起。在一些实施方案中，第二区域的总体长度范围可以是约16至60个核苷酸。在一些实施方案中，环的长度可以是约4个核苷酸。在一些实施方案中，茎的长度可以是约12个核苷酸。3’末端处的gRNA的第三区域可以是基本上单链的。在一些实施方案中，第三区域有时不与感兴趣的细胞中的任何染色体序列互补，并且有时不与gRNA的其余部分互补。另外，第三区域的长度可以变化。在一些实施方案中，第三区域的长度可以是超过3个或超过4个核苷酸。例如，第三区域的长度范围可以是约5至60个核苷酸。
碱基编辑器系统的gRNA可以包含CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。在一些实施方案中，crRNA可以包含与靶核酸分子上靶序列的互补链杂交的靶向序列(或间隔子序列)。crRNA还可以包含与tracrRNA的一部分互补并杂交的旗杆(flagpole)。在一些实施方案中，crRNA可以平行于由细菌的CRISPR基因座转录的天然存在的crRNA的结构，其中靶向序列充当碱基编辑器系统中Cas9的原间隔子。gRNA可以经由crRNA的靶向序列靶向任何感兴趣的序列。在一些实施方案中，gRNA的靶向序列与靶核酸分子上的靶序列之间的互补程度是至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，gRNA的靶向序列和靶核酸分子上的靶序列可以是100％互补的。在其他实施方案中，gRNA的靶向序列和靶核酸分子上的靶序列可以含有至少一个错配。例如，gRNA的靶向序列和靶核酸分子上的靶序列可以含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个错配。
在一些实施方案中，靶向序列的长度取决于碱基编辑器系统的CRISPR/Cas组分和所使用的组分。例如，来自不同细菌物种的不同Cas蛋白具有不同的最佳靶向序列长度。因此，靶向序列可以具有5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或超过50个核苷酸的长度。在一些实施方案中，靶向序列具有18-24个核苷酸的长度。在一些实施方案中，靶向序列具有19-21个核苷酸的长度。在一些实施方案中，靶向序列具有20个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，指导RNA是“双指导RNA”或“dgRNA”。在一些实施方案中，dgRNA包含含有crRNA的第一RNA分子和含有tracrRNA的第二RNA分子。第一RNA分子和第二RNA分子可以经由crRNA与tracrRNA(例如，重复序列和反重复序列)之间的碱基配对形成RNA双链体。在一些实施方案中，指导RNA是“单指导RNA”或“sgRNA”。在一些实施方案中，sgRNA可以包含与tracrRNA共价连接的crRNA。在一些实施方案中，crRNA和tracrRNA经由接头共价连接。在一些实施方案中，单分子指导RNA可以经由crRNA与tracrRNA之间的碱基配对包含茎-环结构。在一些实施方案中，sgRNA是能够指导Cas9蛋白的“Cas9sgRNA”。在某些实施方案中，指导RNA包含足以与Cas9蛋白形成活性复合物并介导RNA指导的DNA修饰的crRNA和tracrRNA。术语“gRNA”和“sgRNA”在整个本申请中可互换使用。在一些实施方案中，可以使用多于一个指导RNA；每个指导RNA包含不同的靶向序列，使得碱基编辑器系统修饰多于一个靶序列。在一些实施方案中，一种或多种指导RNA可以在碱基编辑器复合物内具有相同或不同的特性，诸如活性或稳定性。当使用多于一种指导RNA时，每种指导RNA可以在相同或不同的表达盒上编码。用于驱动多于一种指导RNA表达的启动子是相同或不同的。
在一些实施方案中，编码Cas蛋白的gRNA或mRNA是经修饰的。修饰可以包括化学改变、合成修饰、核苷酸添加和/或核苷酸减去，并且经修饰的核苷或核苷酸可以存在于gRNA中。包含一个或多个经修饰的核苷或核苷酸的gRNA或Cas蛋白编码mRNA被称为“经修饰的”RNA，用于描述存在一种或多种非天然和/或天然存在的组分或构型，所述组分或构型用于代替或补充典型A、G、C和U残基。在一些实施方案中，经修饰的RNA是用非典型核苷或核苷酸合成的。经修饰的核苷或核苷酸可以包含以下中的一种或多种：(i)改变(例如替换)磷酸二酯骨架键中的一种或两种非连接磷酸酯氧和/或一种或多种连接磷酸酯氧(示例性骨架修饰)；(ii)改变(例如替换)核糖的成分，例如核糖上的2’羟基(示例性糖修饰)；(iii)用“脱磷酸”接头批量替换磷酸酯部分(示例性骨架修饰)；(iv)修饰或替换天然存在的核碱基，包括使用非典型核碱基(示例性碱基修饰)；(v)替换或修饰核糖-磷酸酯骨架(示例性骨架修饰)；(vi)修饰寡核苷酸的3’末端或5’末端，例如，去除、添加、修饰或替换末端磷酸酯基团，或缀合部分、帽或接头(此类3’或5’帽修饰可以包括糖和/或骨架修饰)；以及(vii)修饰或替换糖(示例性糖修饰)。修饰可以增强通过CRISPR/Cas进行的基因组编辑。修饰可以改变gRNA的手性。在一些情况下，修饰之后的手性可以是一致的或立体纯的。指导RNA也可以是截短的。截短可以用于减少不需要的脱靶诱变。截短可以包括任何数量的核苷酸缺失。例如，截短可以包括1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50或更多个核苷酸。在一些实施方案中，如本文所用，术语“帽”可以用于指一种或多种特殊改变或修饰的核苷酸，例如，mRNA的5’末端上的特殊改变或修饰的核苷酸。在一些实施方案中，帽是指经修饰的鸟嘌呤(G)核苷酸。在一些实施方案中，帽是指通过添加7-甲基鸟苷(N7-甲基鸟苷或m7G)对mRNA进行5’末端修饰。在一些实施方案中，mRNA结构的“加帽”在包括翻译起始、剪接、细胞内转运和周转在内的各种细胞过程中起着至关重要的作用。在一些实施方案中，5’帽增强mRNA稳定性以及翻译效率。示例性帽类似物包括但不限于标准帽模拟物m7G(5’)ppp(5’)G、抗反向帽类似物(ARCA)m7,3’-OGpppG(或3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G)、未甲基化帽类似物G(5’)ppp(5’)G、用于A+1个位点的甲基化帽类似物m7G(5’)ppp(5’)A以及用于A+1个位点的未甲基化帽类似物G(5’)ppp(5’)A。获得mRNA帽类似物的另外方法描述于Kowalska等人，RNA 2008 14(6):1119-1131中，所述文献以其全文并入本文。
在一些实施方案中，指导RNA序列包括与表1或表24中列出的指导序列中的任一个具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或至少99.9％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，指导RNA序列包括表1或表24中列出的指导RNA序列中的任一个。在一些实施方案中，指导RNA序列是表1或表24中列出的指导RNA序列中的任一个。在一些实施方案中，指导RNA序列包括与SEQ ID NO:9-11、55、59、253-452、1618-1635、1637-1800、1802-2135和2191的序列中的任一个具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或至少99.9％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，指导RNA序列包括SEQ ID NO:9-11、55、59、253-452、1618-1635、1637-1800、1802-2135和2191的序列中的任一个。在一些实施方案中，指导RNA序列是SEQ ID NO:9-11、55、59、253-452、1618-1635、1637-1800、1802-2135和2191的序列中的任一个。
脱靶效应
通过标准CRISPR-Cas9基因组编辑，脱靶诱变(即在预期靶位点以外的基因组位点处进行编辑)可能发生在与gRNA中编码的原间隔子序列具有高度序列相似性的位点处。
如本文所用，脱靶效应可以用于指在预期靶位点以外的基因组位点，例如由指导RNA序列识别的原间隔子序列处的修饰，包括插入缺失。在碱基编辑的情况下，脱靶编辑可能发生在远离预期靶位点或靠近预期靶位点的基因组位点处。例如，可以在碱基编辑窗口中编辑除靶核碱基之外的一个或多个碱基(“旁观者编辑”)。在某些实施方案中，脱靶碱基编辑，例如旁观者编辑不影响靶基因的表达或功能。
基因组中潜在的脱靶序列候选物可以通过使用例如MIT特异性分数(通过http://crispor.tefor.net/计算；最小分数为50)对人基因组进行生物信息学分析或通过体外生物化学测定，例如ONE-seq来预测。
脱靶编辑可以通过测序分析来确定。在一些实施方案中，使用基因组中潜在脱靶位点处的净核碱基编辑来计算脱靶编辑。例如，净核碱基编辑效率可以使用无碱基编辑器或无指导RNA作为对照来确定，其中净核碱基编辑效率通过将在与包封碱基编辑器mRNA和指导RNA的LNP接触的细胞中观察到的编辑率减去在对照细胞中预测的脱靶位点处观察到的编辑率来获得。用于估计和减少脱靶编辑的另外的方法描述于Rees等人,Nat.Rev.Genet.2018 19(12):770-788中，所述文献通过引用以其全文并入本文。
本文描述了用于选择、设计和验证gRNA和靶向序列(或间隔子序列)的方法并且是本领域技术人员已知的。软件工具可以用于优化对应于靶核酸序列的gRNA，例如，以最小化整个基因组的总脱靶活性。例如，对于使用酿脓链球菌Cas9的每个可能的靶向结构域选择，可以在含有多达一定数量(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)的错配碱基对的基因组中鉴定所有的脱靶序列(先前选择的PAM，例如NAG或NGG)。可以鉴定与靶位点互补的gRNA的第一区域，并且可以根据其预测的总脱靶分数对所有第一区域(例如，crRNA)进行排名；排名靠前的靶向结构域代表可能具有最大中靶和最少脱靶活动的那些结构域。在一些实施方案中，DNA序列搜索算法可以用于鉴定gRNA的crRNA中的靶序列，以便与Cas9一起使用。基于公共工具cas-offinder的定制gRNA设计软件(其在计算其全基因组脱靶倾向之后对指导物进行评分)也可以用于设计gRNA(Bae等人,Cas-OFFinder:A fast and versatile algorithmthat searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guidedendonucleases.Bioinformatics 30,1473-1475(2014))。在一些实施方案中，RepeatMasker程序可以用于筛选输入DNA序列中复杂度低的重复元件和区域。另外，可以最小化可能无意地被靶向的残基数量(例如，可能潜在地驻留在靶核酸基因座内的ssDNA上的脱靶残基)，以减少核碱基编辑器系统中脱氨酶结构域的潜在底物混杂性的影响。候选gRNA可以通过使用本领域已知和/或本文列出的方法进行功能评价。
在一些实施方案中，碱基编辑器系统中Cas9蛋白的靶序列可以基于一个或多个物种中感兴趣的基因的靶序列的存在来选择。例如，如果一个序列与感兴趣的基因的人和食蟹猴直系同源物中的靶序列匹配，则可以选择所述序列作为靶序列。在一些实施方案中，Cas9核酸酶的靶序列可以基于预测的脱靶谱来选择，如通过MIT特异性分数(通过http://crispor.tefor.net/计算)判断。例如，如果一个序列具有有利的预测脱靶谱(例如，当通过MIT特异性分数判断时，最小分数为50)，则可以选择所述序列作为靶序列。在一些实施方案中，腺嘌呤碱基编辑器(ABE)的靶序列可以基于编辑剪接供体位点内的腺嘌呤碱基或靶基因中的剪接受体位点的能力来选择。在一些实施方案中，ABE的靶序列可以基于腺嘌呤的位置来选择，例如，如果腺嘌呤位于ABE的编辑窗口内。
本文所述的gRNA可以通过化学、酶促或其组合来合成。例如，gRNA可以使用标准的基于亚磷酰胺的固相合成方法来合成。可替代地，gRNA可以通过可操作地将编码gRNA的DNA连接到噬菌体RNA聚合酶识别的启动子控制序列来体外合成。合适的噬菌体启动子序列的实例包括但不限于T7、T3、SP6启动子序列或其变体。在一些实施方案中，gRNA包含两个单独的分子(例如，crRNA和tracrRNA)，并且一个分子(例如，crRNA)可以化学合成，并且另一个分子(例如，tracrRNA)可以酶促合成。
在一些方面，本文提供了一种用于基因修饰的组合物，其包含本文所述的单指导RNA(sgRNA)和碱基编辑器融合蛋白或编码碱基编辑器融合蛋白的核酸序列。在一些实施方案中，所述组合物还包含载体，所述载体包含编码碱基编辑器融合蛋白的核酸序列。在一些实施方案中，碱基编辑器融合蛋白包含Cas9蛋白。在一些实施方案中，Cas9蛋白是酿脓链球菌Cas9。在一些实施方案中，所述组合物还包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体的非限制性实例在本申请的“药物组合物和治疗方法”部分中列出。在一些实施方案中，本文所述的组合物可以在脂质纳米颗粒中提供。
经化学修饰的指导RNAs(gRNA)
本文提供的本公开内容涉及一种经化学修饰的CRISPR指导RNA(gRNA)，其可以与任何一般CRISPR/Cas系统(例如，如本文所述的碱基编辑器系统)结合使用。gRNA(例如，sgRNA、短sgRNA、crRNA、tracrRNA或dgRNA)可以包含在不同核苷酸位置处的修饰。在一些方面，本文提供了一种指导RNA(gRNA)或单指导RNA(sgRNA)，其包含(i)在核苷酸处的化学修饰和(ii)未修饰的核苷酸。在一些实施方案中，gRNA或sgRNA可以包含在特定核苷酸位置处的修饰。在一些实施方案中，gRNA或sgRNA可以包含在一个或多个特定位置处的一个或多个修饰。
在一方面，本文提供的经化学修饰的CRISPR指导RNA包含基于晶体结构的修饰。不希望受特定理论的约束，基于X射线晶体结构的指导物设计可以用于优化与Cas蛋白(例如，Cas9)的复合物中的gRNA修饰。在一些实施方案中，2’-OH靠近Cas9-gRNA复合物中的Cas9蛋白的核苷酸是未修饰的。在一些实施方案中，2’-OH与Cas9-gRNA复合物中的Cas9蛋白接触的核苷酸是未修饰的。在一些实施方案中，2’-OH与Cas9-gRNA复合物中的Cas9蛋白和氢键接触的核苷酸是未修饰的。在一些实施方案中，Cas9-gRNA复合物是催化前三元复合物。在一些实施方案中，2’-OH靠近Cas9-gRNA复合物中的gRNA的另一部分的核苷酸是未修饰的。在一些实施方案中，2’-OH与Cas9-gRNA复合物中的gRNA的另一部分接触的核苷酸是未修饰的。在一些实施方案中，2’-OH与Cas9-gRNA复合物中的gRNA的另一部分和氢键接触的核苷酸是未修饰的。在一些实施方案中，Cas9-gRNA复合物是催化前三元复合物。如本领域技术人员将理解，如本文所用的术语“位阻”是指结构中物理上不太可能重叠的原子体积。在这些情况下并入2’O-Me修饰将潜在地导致一个或多个结构重排，这对于RNP功能可能是有害的。如本领域技术人员将理解，如本文所用的术语“接触”意指两个官能团(例如，氢键)之间的稳定非共价相互作用。在一些实施方案中，如果在Cas9-gRNA复合物中2’-OH被2’-OMe替换，则预测与gRNA的另一部分发生位阻的核苷酸是未修饰的。在一些实施方案中，如果在Cas9-gRNA复合物中2’-OH被2’-OMe替换，预测与gRNA中的另一个2’-OH发生位阻的核苷酸是未修饰的。在一些实施方案中，Cas9-gRNA复合物是催化前三元复合物。在一些实施方案中，溶剂暴露或以其他方式远离Cas9-gRNA复合物中的Cas蛋白残基的核苷酸包含化学修饰。在一些实施方案中，溶剂暴露或以其他方式远离Cas9-gRNA复合物中gRNA中的另一个核苷酸的核苷酸包含化学修饰。在一些实施方案中，化学修饰是2’-OMe修饰。Cas9-gRNA晶体结构的另外描述包括在以下中：Jiang F,Taylor DW,Chen JS,Kornfeld JE,Zhou K,Thompson AJ,Nogales E,Doudna JA.Structures of a CRISPR-Cas9 R-loop complexprimed for DNA cleavage.Science.2016年2月19日；351(6275):867-71，其通过引用以其全文并入本文。
对指导RNA核苷酸的修饰可以包括但不限于2’-O-甲基修饰、2’-O-(2-甲氧基乙基)修饰、2’-氟修饰、硫代磷酸酯修饰、倒置无碱基修饰、脱氧核糖核苷酸、双环核糖类似物(例如，锁核酸(LNA)、C-乙烯-桥接核酸(ENA)、桥接核酸(BNA)、解锁核酸(UNA))、碱基或核碱基修饰、核苷间键修饰、核糖水粉蕈素、2’-O-甲基水粉蕈素或2’-脱氧水粉蕈素。修饰的其他实例包括但不限于5’腺苷酸酯、5’鸟苷-三磷酸酯帽、5’N7-甲基鸟苷-三磷酸酯帽、5’三磷酸酯帽、3’磷酸酯、3’硫代磷酸酯、5’磷酸酯、5’硫代磷酸酯、Cis-Syn胸苷二聚体、三聚体、C12间隔子、C3间隔子、C6间隔子、dSpacer、PC间隔子、rSpacer、间隔子18、间隔子9、3’-3’修饰、5’-5’修饰、无碱基、吖啶、偶氮苯、生物素、生物素BB、生物素TEG、胆固醇基TEG、脱硫生物素TEG、DNP TEG、DNP-X、DOTA、dT-生物素、双重生物素、PC生物素、补骨脂素C2、补骨脂素C6、TINA、3’DABCYL、黑洞淬灭剂1、黑洞淬灭剂2、DABCYL SE、dT-DABCYL、IRDye QC-1、QSY-21、QSY-35、QSY-7、QSY-9、羧基接头、硫醇接头、2’脱氧核糖核苷类似物嘌呤、2’脱氧核糖核苷类似物嘧啶、核糖核苷类似物、2’-0-甲基核糖核苷类似物、糖改性类似物、摆动/通用碱基、荧光染料标记、2’氟RNA、2’O-甲基RNA、甲基膦酸酯、磷酸二酯DNA、磷酸二酯RNA、硫代磷酸酯DNA、硫代磷酸酯RNA、UNA、假尿苷-5’-三磷酸酯、5-甲基胞苷-5’-三磷酸酯、2-O-甲基3硫代磷酸酯或其任何组合。
在一些实施方案中，核糖基团(或糖)可以是经修饰的。在一些实施方案中，经修饰的核糖基团可以控制寡核苷酸对互补链的结合亲和力、双链体形成或与核酸酶的相互作用。对核糖基团的化学修饰的实例包括但不限于2’-O甲基(2’-OMe)、2’-氟(2’-F)、2’-脱氧、2’-O-(2-甲氧基乙基)(2’-MOE)、2’-NH2、2’-O-烯丙基、2’-O-乙胺、2’-O-氰乙基、2’-O-乙缩醛酯或双环核苷酸诸如锁核酸(LNA)、2’-(5-约束乙基(S-cEt))、约束MOE或2’-0,4’-C-氨基亚甲基桥接核酸(2’,4’-BNANC)。在一些实施方案中，2’-O-甲基修饰可以增加寡核苷酸的结合亲和力。在一些实施方案中，2’-O-甲基修饰可以增强寡核苷酸的核酸酶稳定性。在一些实施方案中，2’-氟修饰可以增加寡核苷酸结合亲和力和核酸酶稳定性。在本申请中，gRNA序列中小写的核糖核苷酸描绘了2’-OMe修饰(例如，表1或表24)(小写字母s指示硫代磷酸酯键)。
在一些实施方案中，磷酸酯基团可以是经修饰的。对磷酸酯基团的化学修饰的实例包括但不限于硫代磷酸酯(PS)、膦酰基乙酸酯(PACE)、硫代膦酰基乙酸酯(硫代PACE)、酰胺、三唑、膦酸酯或磷酸三酯修饰。在一些实施方案中，PS键可以指硫取代磷酸二酯键中，例如核苷酸之间的一个非桥接磷酸酯氧的键。在本申请中，“s”可以用于描绘gRNA序列中的PS修饰(例如，表1或表24)。在一些实施方案中，gRNA或sgRNA可以在5’末端或3’末端处包含硫代磷酸酯(PS)键。在一些实施方案中，gRNA或sgRNA可以在5’末端处包含硫代磷酸酯(PS)键。在一些实施方案中，gRNA或sgRNA可以在3’末端处包含硫代磷酸酯(PS)键。在一些实施方案中，gRNA或sgRNA可以在5’末端处和3’末端处包含硫代磷酸酯(PS)键。在一些实施方案中，gRNA或sgRNA可以在5’末端或3’末端处包含一个、两个、或三个或多于三个硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，gRNA或sgRNA可以在5’末端或3’末端处包含三个硫代磷酸酯(PS)键。在一些实施方案中，gRNA或sgRNA可以在3’末端处包含三个硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，gRNA或sgRNA可以在5’末端或3’末端处包含两个且不多于两个(即，仅两个)连续硫代磷酸酯(PS)键。在一些实施方案中，gRNA或sgRNA可以在5’末端或3’末端处包含三个连续硫代磷酸酯(PS)键。在一些实施方案中，gRNA或sgRNA可以在3’末端或5’末端处包含序列5’-UsUsU-3’，其中U指示尿苷，并且其中s指示硫代磷酸酯(PS)键。在一些实施方案中，gRNA或sgRNA可以在3’末端或5’末端处包含序列5’-ususu-3’，其中U指2’-O-甲基示尿苷，并且其中s指示硫代磷酸酯(PS)键。在一些实施方案中，gRNA或sgRNA可以在3’末端或5’末端处包含序列5’-ususuUUU-3’，其中U和u分别指示尿苷和2’-O-甲基尿苷，并且其中s指示硫代磷酸酯(PS)键。在一些实施方案中，gRNA或sgRNA可以在3’末端或5’末端处包含序列5’-ususuUuU-3’，其中U和u分别指示尿苷和2’-O-甲基尿苷，并且其中s指示硫代磷酸酯(PS)键。在一些实施方案中，gRNA或sgRNA可以在3’末端处包含序列5’-usususuUuU-3’，其中U和u分别指示尿苷和2’-O-甲基尿苷，并且其中s指示硫代磷酸酯(PS)键。在一些实施方案中，gRNA或sgRNA可以在3’末端处包含序列5’-ususuuuu-3’，其中u指示2’-O-甲基尿苷，并且其中s指示硫代磷酸酯(PS)键。
在一些实施方案中，核碱基可以是经修饰的。对核碱基的化学修饰的实例包括但不限于2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、N6-甲基腺苷、假尿苷、2,6-二氨基嘌呤、肌苷、胸苷、5-甲基胞嘧啶、5-取代嘧啶、异鸟嘌呤、异胞嘧啶或卤代芳族基团。
在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA包含水粉蕈素。水粉蕈素是一种嘌呤核糖核苷，其来源于β-D-核糖，并且是经由糖苷(N-糖基)键在位置9处附接到β-D-核呋喃糖基残基的9H-嘌呤。水粉蕈素是一种嘌呤核糖核苷，其没有环外功能部分或取代。在一些实施方案中，它是嘌呤核糖核苷。在一些实施方案中，它是嘌呤D-核糖核苷。在一些实施方案中，水粉蕈素是进一步经化学修饰的。在本申请中，“X”、“x”和“dX”可以用于分别描绘gRNA序列中的核糖水粉蕈素修饰、2’-O-甲基水粉蕈素修饰和2’-脱氧水粉蕈素修饰(例如，表1或表24)。在一些实施方案中，用水粉蕈素取代gRNA序列(例如，间隔子区或tracr区)的核苷酸(例如，A)可以减少脱靶效应而不影响gRNA活性。在一些实施方案中，水粉蕈素、脱氧水粉蕈素或2’-O-甲基水粉蕈素替换未修饰的gRNA或sgRNA中的腺嘌呤。在一些实施方案中，水粉蕈素、脱氧水粉蕈素或2’-O-甲基水粉蕈素是在间隔子序列中。在一些实施方案中，水粉蕈素、脱氧水粉蕈素或2’-O-甲基水粉蕈素是在tracrRNA序列中。在一些实施方案中，水粉蕈素、脱氧水粉蕈素或2’-O-甲基水粉蕈素是在tracrRNA序列中的tracrRNA序列中。在一些实施方案中，水粉蕈素、脱氧水粉蕈素或2’-O-甲基水粉蕈素是在tracrRNA序列中的crRNA序列中。在一些实施方案中，水粉蕈素、脱氧水粉蕈素或2’-O-甲基水粉蕈素是在tracrRNA序列中的茎环结构中。
在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA可以具有总计50-150个碱基对的长度。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA可以具有总计50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150个碱基对的长度。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA可以具有总计约50至约140个碱基对的长度。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA可以具有总计约50至约60、约50至约70、约50至约80、约50至约90、约50至约100、约50至约110、约50至约120、约50至约130、约50至约140、约60至约70、约60至约80、约60至约90、约60至约100、约60至约110、约60至约120、约60至约130、约60至约140、约70至约80、约70至约90、约70至约100、约70至约110、约70至约120、约70至约130、约70至约140、约80至约90、约80至约100、约80至约110、约80至约120、约80至约130、约80至约140、约90至约100、约90至约110、约90至约120、约90至约130、约90至约140、约100至约110、约100至约120、约100至约130、约100至约140、约110至约120、约110至约130、约110至约140、约120至约130、约120至约140、或约130至约140个碱基对的长度。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA可以具有总计约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130或约140个碱基对的长度。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA可以具有总计至少约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120或约130个碱基对的长度。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA可以具有总计至多约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130或约140个碱基对的长度。在一个实施方案中，经化学修饰的gRNA可以具有总计100个碱基对的长度。在另一个实施方案中，经化学修饰的gRNA可以具有总计103个碱基对的长度。
在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA可以包含1至150个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA可以包含总计1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA可以包含总计约1至约45个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA可以包含总计约1至约3、约1至约5、约1至约10、约1至约15、约1至约20、约1至约25、约1至约30、约1至约35、约1至约40、约1至约45、约3至约5、约3至约10、约3至约15、约3至约20、约3至约25、约3至约30、约3至约35、约3至约40、约3至约45、约5至约10、约5至约15、约5至约20、约5至约25、约5至约30、约5至约35、约5至约40、约5至约45、约10至约15、约10至约20、约10至约25、约10至约30、约10至约35、约10至约40、约10至约45、约15至约20、约15至约25、约15至约30、约15至约35、约15至约40、约15至约45、约20至约25、约20至约30、约20至约35、约20至约40、约20至约45、约25至约30、约25至约35、约25至约40、约25至约45、约30至约35、约30至约40、约30至约45、约35至约40、约35至约45、约40至约45、或约45至约50个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA可以包含总计约1、约3、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45或约50个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA可以包含总计至少约1、约3、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45或约50个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA可以包含总计至多约3、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45或约50个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA可以包含总计约50至约140个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA可以包含总计约50至约60、约50至约70、约50至约80、约50至约90、约50至约100、约50至约110、约50至约120、约50至约130、约50至约140、约60至约70、约60至约80、约60至约90、约60至约100、约60至约110、约60至约120、约60至约130、约60至约140、约70至约80、约70至约90、约70至约100、约70至约110、约70至约120、约70至约130、约70至约140、约80至约90、约80至约100、约80至约110、约80至约120、约80至约130、约80至约140、约90至约100、约90至约110、约90至约120、约90至约130、约90至约140、约100至约110、约100至约120、约100至约130、约100至约140、约110至约120、约110至约130、约110至约140、约120至约130、约120至约140、或约130至约140个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA可以包含总计约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130或约140个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA可以包含总计至少约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120或约130个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA可以包含总计至多约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130或约140个经化学修饰的核苷酸。在一个实施方案中，经化学修饰的gRNA可以包含总计54个经化学修饰的核苷酸。在另一个实施方案中，经化学修饰的gRNA可以包含总计62个经化学修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA可以包含约1％至100％的经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA可以包含约1％至约10％、约1％至约20％、约1％至约30％、约1％至约40％、约1％至约50％、约1％至约60％、约1％至约70％、约1％至约80％、约1％至约90％、约1％至约95％、约1％至约100％、约10％至约20％、约10％至约30％、约10％至约40％、约10％至约50％、约10％至约60％、约10％至约70％、约10％至约80％、约10％至约90％、约10％至约95％、约10％至约100％、约20％至约30％、约20％至约40％、约20％至约50％、约20％至约60％、约20％至约70％、约20％至约80％、约20％至约90％、约20％至约95％、约20％至约100％、约30％至约40％、约30％至约50％、约30％至约60％、约30％至约70％、约30％至约80％、约30％至约90％、约30％至约95％、约30％至约100％、约40％至约50％、约40％至约60％、约40％至约70％、约40％至约80％、约40％至约90％、约40％至约95％、约40％至约100％、约50％至约60％、约50％至约70％、约50％至约80％、约50％至约90％、约50％至约95％、约50％至约100％、约60％至约70％、约60％至约80％、约60％至约90％、约60％至约95％、约60％至约100％、约70％至约80％、约70％至约90％、约70％至约95％、约70％至约100％、约80％至约90％、约80％至约95％、约80％至约100％、约90％至约95％、约90％至约100％、或约95％至约100％的经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA可以包含约1％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约100％的经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA可以包含至少约1％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％的经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA可以包含至多约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约100％的经化学修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA可以在gRNA序列中在5’-3’方向上在位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150中的一个或多个上具有经化学修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA可以在距离gRNA序列的5’末端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148或149个碱基对的一个或多个位置上具有经化学修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA可以在距离gRNA序列的3’末端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148或149个碱基对的一个或多个位置上具有经化学修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA可以是sgRNA。术语“gRNA”和“sgRNA”在本申请中可互换使用。在一些实施方案中，sgRNA可以包含一个或多个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的sgRNA可以具有总计50-150个碱基对的长度。在一些实施方案中，经化学修饰的sgRNA可以具有总计50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150个碱基对的长度。在一些实施方案中，经化学修饰的sgRNA可以具有总计约50至约140个碱基对的长度。在一些实施方案中，经化学修饰的sgRNA可以具有总计约50至约60、约50至约70、约50至约80、约50至约90、约50至约100、约50至约110、约50至约120、约50至约130、约50至约140、约60至约70、约60至约80、约60至约90、约60至约100、约60至约110、约60至约120、约60至约130、约60至约140、约70至约80、约70至约90、约70至约100、约70至约110、约70至约120、约70至约130、约70至约140、约80至约90、约80至约100、约80至约110、约80至约120、约80至约130、约80至约140、约90至约100、约90至约110、约90至约120、约90至约130、约90至约140、约100至约110、约100至约120、约100至约130、约100至约140、约110至约120、约110至约130、约110至约140、约120至约130、约120至约140、或约130至约140个碱基对的长度。在一些实施方案中，经化学修饰的sgRNA可以具有总计约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130或约140个碱基对的长度。在一些实施方案中，经化学修饰的sgRNA可以具有总计至少约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120或约130个碱基对的长度。在一些实施方案中，经化学修饰的sgRNA可以具有总计至多约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130或约140个碱基对的长度。在一个实施方案中，经化学修饰的sgRNA可以具有总计100个碱基对的长度。在另一个实施方案中，经化学修饰的sgRNA可以具有总计103个碱基对的长度。
在一些实施方案中，经化学修饰的sgRNA可以包含总计1至150个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的sgRNA可以包含总计1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的sgRNA可以包含总计约1至约45个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的sgRNA可以包含总计约1至约3、约1至约5、约1至约10、约1至约15、约1至约20、约1至约25、约1至约30、约1至约35、约1至约40、约1至约45、约3至约5、约3至约10、约3至约15、约3至约20、约3至约25、约3至约30、约3至约35、约3至约40、约3至约45、约5至约10、约5至约15、约5至约20、约5至约25、约5至约30、约5至约35、约5至约40、约5至约45、约10至约15、约10至约20、约10至约25、约10至约30、约10至约35、约10至约40、约10至约45、约15至约20、约15至约25、约15至约30、约15至约35、约15至约40、约15至约45、约20至约25、约20至约30、约20至约35、约20至约40、约20至约45、约25至约30、约25至约35、约25至约40、约25至约45、约30至约35、约30至约40、约30至约45、约35至约40、约35至约45、约40至约45、或约45至约50个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的sgRNA可以包含总计约1、约3、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45或约50个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的sgRNA可以包含总计至少约1、约3、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45或约50个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的sgRNA可以包含总计至多约3、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45或约50个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的sgRNA可以包含总计约50至约140个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的sgRNA可以包含总计约50至约60、约50至约70、约50至约80、约50至约90、约50至约100、约50至约110、约50至约120、约50至约130、约50至约140、约60至约70、约60至约80、约60至约90、约60至约100、约60至约110、约60至约120、约60至约130、约60至约140、约70至约80、约70至约90、约70至约100、约70至约110、约70至约120、约70至约130、约70至约140、约80至约90、约80至约100、约80至约110、约80至约120、约80至约130、约80至约140、约90至约100、约90至约110、约90至约120、约90至约130、约90至约140、约100至约110、约100至约120、约100至约130、约100至约140、约110至约120、约110至约130、约110至约140、约120至约130、约120至约140、或约130至约140个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的sgRNA可以包含总计约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130或约140个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的sgRNA可以包含总计至少约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120或约130个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的sgRNA可以包含总计至多约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130或约140个经化学修饰的核苷酸。在一个实施方案中，经化学修饰的sgRNA可以包含总计54个经化学修饰的核苷酸。在另一个实施方案中，经化学修饰的sgRNA可以包含总计62个经化学修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，经化学修饰的sgRNA可以包含约1％至100％的经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的sgRNA可以包含约1％至约10％、约1％至约20％、约1％至约30％、约1％至约40％、约1％至约50％、约1％至约60％、约1％至约70％、约1％至约80％、约1％至约90％、约1％至约95％、约1％至约100％、约10％至约20％、约10％至约30％、约10％至约40％、约10％至约50％、约10％至约60％、约10％至约70％、约10％至约80％、约10％至约90％、约10％至约95％、约10％至约100％、约20％至约30％、约20％至约40％、约20％至约50％、约20％至约60％、约20％至约70％、约20％至约80％、约20％至约90％、约20％至约95％、约20％至约100％、约30％至约40％、约30％至约50％、约30％至约60％、约30％至约70％、约30％至约80％、约30％至约90％、约30％至约95％、约30％至约100％、约40％至约50％、约40％至约60％、约40％至约70％、约40％至约80％、约40％至约90％、约40％至约95％、约40％至约100％、约50％至约60％、约50％至约70％、约50％至约80％、约50％至约90％、约50％至约95％、约50％至约100％、约60％至约70％、约60％至约80％、约60％至约90％、约60％至约95％、约60％至约100％、约70％至约80％、约70％至约90％、约70％至约95％、约70％至约100％、约80％至约90％、约80％至约95％、约80％至约100％、约90％至约95％、约90％至约100％、或约95％至约100％的经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的sgRNA可以包含约1％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约100％的经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的sgRNA可以包含至少约1％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％的经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的sgRNA可以包含至多约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约100％的经化学修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，经化学修饰的sgRNA可以在sgRNA序列中在5’-3’方向上在位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150中的一个或多个上具有经化学修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，经化学修饰的sgRNA可以在距离sgRNA序列的5’末端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148或149个碱基对的一个或多个位置上具有经化学修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，经化学修饰的sgRNA可以在距离sgRNA序列的3’末端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148或149个碱基对的一个或多个位置上具有经化学修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以在间隔子区或原间隔子区，即靶序列中具有一个或多个化学修饰。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含具有10至30个碱基对长度的间隔子序列。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基对长度的间隔子序列。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含具有约10至约30个碱基对长度的间隔子序列。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含具有约10至约15、约10至约20、约10至约25、约10至约30、约15至约20、约15至约25、约15至约30、约20至约25、约20至约30、或约25至约30个碱基对长度的间隔子序列。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含具有约10、约15、约20、约25或约30个碱基对长度的间隔子序列。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含具有至少约10、约15、约20或约25个碱基对长度的间隔子序列。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含具有至多约15、约20、约25或约30个碱基对长度的间隔子序列。在一个实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含具有18个碱基对长度的间隔子序列。在另一个实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含具有22个碱基对长度的间隔子序列。在一个优选实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含具有20个碱基对长度的间隔子序列。
在一些实施方案中，间隔子序列可以包含总计1至30个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，间隔子序列可以包含总计1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，间隔子序列可以包含总计约1至约10个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，间隔子序列可以包含总计约1至约2、约1至约3、约1至约4、约1至约5、约1至约6、约1至约7、约1至约8、约1至约9、约1至约10、约2至约3、约2至约4、约2至约5、约2至约6、约2至约7、约2至约8、约2至约9、约2至约10、约3至约4、约3至约5、约3至约6、约3至约7、约3至约8、约3至约9、约3至约10、约4至约5、约4至约6、约4至约7、约4至约8、约4至约9、约4至约10、约5至约6、约5至约7、约5至约8、约5至约9、约5至约10、约6至约7、约6至约8、约6至约9、约6至约10、约7至约8、约7至约9、约7至约10、约8至约9、约8至约10、或约9至约10个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，间隔子序列可以包含总计约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，间隔子序列可以包含总计至少约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8或约9个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，间隔子序列可以包含总计至多约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，间隔子序列可以包含总计约10至约30个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，间隔子序列可以包含总计约10至约15、约10至约20、约10至约25、约10至约30、约15至约20、约15至约25、约15至约30、约20至约25、约20至约30、或约25至约30个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，间隔子序列可以包含总计约10、约15、约20、约25或约30个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，间隔子序列可以包含总计至少约10、约15、约20或约25个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，间隔子序列可以包含总计至多约15、约20、约25或约30个经化学修饰的核苷酸。在一个实施方案中，间隔子序列可以包含总计3个经化学修饰的核苷酸。在另一个实施方案中，间隔子序列可以包含总计5个经化学修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，间隔子序列可以包含1％至100％的经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，间隔子序列可以包含约1％至约100％的经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，间隔子序列可以包含约1％至约10％、约1％至约20％、约1％至约30％、约1％至约40％、约1％至约50％、约1％至约60％、约1％至约70％、约1％至约80％、约1％至约90％、约1％至约95％、约1％至约100％、约10％至约20％、约10％至约30％、约10％至约40％、约10％至约50％、约10％至约60％、约10％至约70％、约10％至约80％、约10％至约90％、约10％至约95％、约10％至约100％、约20％至约30％、约20％至约40％、约20％至约50％、约20％至约60％、约20％至约70％、约20％至约80％、约20％至约90％、约20％至约95％、约20％至约100％、约30％至约40％、约30％至约50％、约30％至约60％、约30％至约70％、约30％至约80％、约30％至约90％、约30％至约95％、约30％至约100％、约40％至约50％、约40％至约60％、约40％至约70％、约40％至约80％、约40％至约90％、约40％至约95％、约40％至约100％、约50％至约60％、约50％至约70％、约50％至约80％、约50％至约90％、约50％至约95％、约50％至约100％、约60％至约70％、约60％至约80％、约60％至约90％、约60％至约95％、约60％至约100％、约70％至约80％、约70％至约90％、约70％至约95％、约70％至约100％、约80％至约90％、约80％至约95％、约80％至约100％、约90％至约95％、约90％至约100％、或约95％至约100％的经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，间隔子序列可以包含约1％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约100％的经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，间隔子序列可以包含至少约1％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％的经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，间隔子序列可以包含至多约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约100％的经化学修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，经化学修饰的间隔子序列可以在间隔子序列中在5’-3’方向上在位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30中的一个或多个上具有经化学修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，经化学修饰的间隔子区可以在距离间隔子序列的5’末端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个碱基对的一个或多个位置上具有经化学修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，经化学修饰的间隔子区可以在距离间隔子序列的3’末端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个碱基对的一个或多个位置上具有经化学修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以在tracrRNA序列中具有一个或多个化学修饰。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含具有30至100个碱基对长度的tracrRNA序列。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含具有30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129或130个碱基对长度的tracrRNA序列。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含具有约30至约130个碱基对长度的tracrRNA序列。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含具有约30至约40、约30至约50、约30至约60、约30至约70、约30至约75、约30至约80、约30至约90、约30至约100、约30至约110、约30至约120、约30至约130、约40至约50、约40至约60、约40至约70、约40至约75、约40至约80、约40至约90、约40至约100、约40至约110、约40至约120、约40至约130、约50至约60、约50至约70、约50至约75、约50至约80、约50至约90、约50至约100、约50至约110、约50至约120、约50至约130、约60至约70、约60至约75、约60至约80、约60至约90、约60至约100、约60至约110、约60至约120、约60至约130、约70至约75、约70至约80、约70至约90、约70至约100、约70至约110、约70至约120、约70至约130、约75至约80、约75至约90、约75至约100、约75至约110、约75至约120、约75至约130、约80至约90、约80至约100、约80至约110、约80至约120、约80至约130、约90至约100、约90至约110、约90至约120、约90至约130、约100至约110、约100至约120、约100至约130、约110至约120、约110至约130、或约120至约130个碱基对长度的tracrRNA序列。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含具有约30、约40、约50、约60、约70、约75、约80、约90、约100、约110、约120或约130个碱基对长度的tracrRNA序列。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含具有至少约30、约40、约50、约60、约70、约75、约80、约90、约100、约110或约120个碱基对长度的tracrRNA序列。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含具有至多约40、约50、约60、约70、约75、约80、约90、约100、约110、约120或约130个碱基对长度的tracrRNA序列。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含具有70个碱基对长度的tracrRNA序列。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含具有73个碱基对长度的tracrRNA序列。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含具有68个碱基对长度的tracrRNA序列。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含具有71个碱基对长度的tracrRNA序列。
在一些实施方案中，tracrRNA序列可以包含总计1至130个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129或130个经化学修饰的核苷酸的tracrRNA序列。在一些实施方案中，tracrRNA序列可以包含总计约1至约10个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，tracrRNA序列可以包含总计约1至约2、约1至约3、约1至约4、约1至约5、约1至约6、约1至约7、约1至约8、约1至约9、约1至约10、约2至约3、约2至约4、约2至约5、约2至约6、约2至约7、约2至约8、约2至约9、约2至约10、约3至约4、约3至约5、约3至约6、约3至约7、约3至约8、约3至约9、约3至约10、约4至约5、约4至约6、约4至约7、约4至约8、约4至约9、约4至约10、约5至约6、约5至约7、约5至约8、约5至约9、约5至约10、约6至约7、约6至约8、约6至约9、约6至约10、约7至约8、约7至约9、约7至约10、约8至约9、约8至约10、或约9至约10个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，tracrRNA序列可以包含总计约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，tracrRNA序列可以包含总计至少约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8或约9个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，tracrRNA序列可以包含总计至多约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，tracrRNA序列可以包含总计约10至约30个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，tracrRNA序列可以包含总计约10至约15、约10至约20、约10至约25、约10至约30、约15至约20、约15至约25、约15至约30、约20至约25、约20至约30、或约25至约30个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，tracrRNA序列可以包含总计约10、约15、约20、约25或约30个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，tracrRNA序列可以包含总计至少约10、约15、约20或约25个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，间隔子区可以包含总计至多约15、约20、约25或约30个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，tracrRNA序列可以包含总计约30至约130个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，tracrRNA序列可以包含总计约30至约40、约30至约50、约30至约60、约30至约70、约30至约75、约30至约80、约30至约90、约30至约100、约30至约110、约30至约120、约30至约130、约40至约50、约40至约60、约40至约70、约40至约75、约40至约80、约40至约90、约40至约100、约40至约110、约40至约120、约40至约130、约50至约60、约50至约70、约50至约75、约50至约80、约50至约90、约50至约100、约50至约110、约50至约120、约50至约130、约60至约70、约60至约75、约60至约80、约60至约90、约60至约100、约60至约110、约60至约120、约60至约130、约70至约75、约70至约80、约70至约90、约70至约100、约70至约110、约70至约120、约70至约130、约75至约80、约75至约90、约75至约100、约75至约110、约75至约120、约75至约130、约80至约90、约80至约100、约80至约110、约80至约120、约80至约130、约90至约100、约90至约110、约90至约120、约90至约130、约100至约110、约100至约120、约100至约130、约110至约120、约110至约130、或约120至约130个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，tracrRNA序列可以包含总计约30、约40、约50、约60、约70、约75、约80、约90、约100、约110、约120或约130个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，tracrRNA序列可以包含总计至少约30、约40、约50、约60、约70、约75、约80、约90、约100、约110或约120个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，tracrRNA序列可以包含总计至多约40、约50、约60、约70、约75、约80、约90、约100、约110、约120或约130个经化学修饰的核苷酸。在一个实施方案中，tracrRNA序列可以包含总计51个经化学修饰的核苷酸。在另一个实施方案中，tracrRNA序列可以包含总计59个经化学修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，tracrRNA序列可以包含1％至100％的经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，tracrRNA序列可以包含约1％至约100％的经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，tracrRNA序列可以包含约1％至约10％、约1％至约20％、约1％至约30％、约1％至约40％、约1％至约50％、约1％至约60％、约1％至约70％、约1％至约80％、约1％至约90％、约1％至约95％、约1％至约100％、约10％至约20％、约10％至约30％、约10％至约40％、约10％至约50％、约10％至约60％、约10％至约70％、约10％至约80％、约10％至约90％、约10％至约95％、约10％至约100％、约20％至约30％、约20％至约40％、约20％至约50％、约20％至约60％、约20％至约70％、约20％至约80％、约20％至约90％、约20％至约95％、约20％至约100％、约30％至约40％、约30％至约50％、约30％至约60％、约30％至约70％、约30％至约80％、约30％至约90％、约30％至约95％、约30％至约100％、约40％至约50％、约40％至约60％、约40％至约70％、约40％至约80％、约40％至约90％、约40％至约95％、约40％至约100％、约50％至约60％、约50％至约70％、约50％至约80％、约50％至约90％、约50％至约95％、约50％至约100％、约60％至约70％、约60％至约80％、约60％至约90％、约60％至约95％、约60％至约100％、约70％至约80％、约70％至约90％、约70％至约95％、约70％至约100％、约80％至约90％、约80％至约95％、约80％至约100％、约90％至约95％、约90％至约100％、或约95％至约100％的经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，tracrRNA序列可以包含约1％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约100％的经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，tracrRNA序列可以包含至少约1％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％的经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，tracrRNA序列可以包含至多约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约100％的经化学修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，经化学修饰的tracrRNA序列可以在tracrRNA序列中在5’-3’方向上在位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129或130中的一个或多个上具有经化学修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，经化学修饰的tracr区可以在距离tracrRNA序列的5’末端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128或129个碱基对的一个或多个位置上具有经化学修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，经化学修饰的tracr区可以在距离tracrRNA序列的3’末端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128或129个碱基对的一个或多个位置上具有经化学修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA可以在gRNA序列的5’末端中具有一个或多个化学修饰。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA可以在gRNA序列的5’末端中包含一个或多个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA可以在gRNA序列的3’末端中具有一个或多个化学修饰。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA可以在gRNA序列的3’末端中包含一个或多个经化学修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA可以包括crRNA。在一些实施方案中，crRNA可以包含一个或多个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的crRNA可以具有30至50个碱基对的长度。在一些实施方案中，经化学修饰的crRNA可以具有30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个碱基对的长度。在一些实施方案中，经化学修饰的crRNA可以具有约30至约50个碱基对的长度。在一些实施方案中，经化学修饰的crRNA可以具有约30至约32、约30至约34、约30至约36、约30至约38、约30至约40、约30至约42、约30至约44、约30至约46、约30至约48、约30至约50、约32至约34、约32至约36、约32至约38、约32至约40、约32至约42、约32至约44、约32至约46、约32至约48、约32至约50、约34至约36、约34至约38、约34至约40、约34至约42、约34至约44、约34至约46、约34至约48、约34至约50、约36至约38、约36至约40、约36至约42、约36至约44、约36至约46、约36至约48、约36至约50、约38至约40、约38至约42、约38至约44、约38至约46、约38至约48、约38至约50、约40至约42、约40至约44、约40至约46、约40至约48、约40至约50、约42至约44、约42至约46、约42至约48、约42至约50、约44至约46、约44至约48、约44至约50、约46至约48、约46至约50、或约48至约50个碱基对的长度。在一些实施方案中，经化学修饰的crRNA可以具有约30、约32、约34、约36、约38、约40、约42、约44、约46、约48或约50个碱基对的长度。在一些实施方案中，经化学修饰的crRNA可以具有至少约30、约32、约34、约36、约38、约40、约42、约44、约46或约48个碱基对的长度。在一些实施方案中，经化学修饰的crRNA可以具有至多约32、约34、约36、约38、约40、约42、约44、约46、约48或约50个碱基对的长度。
在一些实施方案中，crRNA可以包含总计1至50个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的crRNA可以包含总计1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的crRNA可以包含总计约1至约10个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的crRNA可以包含总计约1至约2、约1至约3、约1至约4、约1至约5、约1至约6、约1至约7、约1至约8、约1至约9、约1至约10、约2至约3、约2至约4、约2至约5、约2至约6、约2至约7、约2至约8、约2至约9、约2至约10、约3至约4、约3至约5、约3至约6、约3至约7、约3至约8、约3至约9、约3至约10、约4至约5、约4至约6、约4至约7、约4至约8、约4至约9、约4至约10、约5至约6、约5至约7、约5至约8、约5至约9、约5至约10、约6至约7、约6至约8、约6至约9、约6至约10、约7至约8、约7至约9、约7至约10、约8至约9、约8至约10、或约9至约10个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的crRNA可以包含总计约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的crRNA可以包含总计至少约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8或约9个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的crRNA可以包含总计至多约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的crRNA可以包含总计约10至约30个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的crRNA可以包含总计约10至约15、约10至约20、约10至约25、约10至约30、约15至约20、约15至约25、约15至约30、约20至约25、约20至约30、或约25至约30个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的crRNA可以包含总计约10、约15、约20、约25或约30个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的crRNA可以包含总计至少约10、约15、约20或约25个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的crRNA可以包含总计至多约15、约20、约25或约30个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的crRNA可以包含总计约30至约50个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的crRNA可以包含总计约30至约32、约30至约34、约30至约36、约30至约38、约30至约40、约30至约42、约30至约44、约30至约46、约30至约48、约30至约50、约32至约34、约32至约36、约32至约38、约32至约40、约32至约42、约32至约44、约32至约46、约32至约48、约32至约50、约34至约36、约34至约38、约34至约40、约34至约42、约34至约44、约34至约46、约34至约48、约34至约50、约36至约38、约36至约40、约36至约42、约36至约44、约36至约46、约36至约48、约36至约50、约38至约40、约38至约42、约38至约44、约38至约46、约38至约48、约38至约50、约40至约42、约40至约44、约40至约46、约40至约48、约40至约50、约42至约44、约42至约46、约42至约48、约42至约50、约44至约46、约44至约48、约44至约50、约46至约48、约46至约50、或约48至约50个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的crRNA可以包含总计约30、约32、约34、约36、约38、约40、约42、约44、约46、约48或约50个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的crRNA可以包含总计至少约30、约32、约34、约36、约38、约40、约42、约44、约46或约48个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的crRNA可以包含总计至多约32、约34、约36、约38、约40、约42、约44、约46、约48或约50个经化学修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，crRNA可以包含1％至100％的经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，crRNA可以包含约1％至约100％的经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，crRNA可以包含约1％至约10％、约1％至约20％、约1％至约30％、约1％至约40％、约1％至约50％、约1％至约60％、约1％至约70％、约1％至约80％、约1％至约90％、约1％至约95％、约1％至约100％、约10％至约20％、约10％至约30％、约10％至约40％、约10％至约50％、约10％至约60％、约10％至约70％、约10％至约80％、约10％至约90％、约10％至约95％、约10％至约100％、约20％至约30％、约20％至约40％、约20％至约50％、约20％至约60％、约20％至约70％、约20％至约80％、约20％至约90％、约20％至约95％、约20％至约100％、约30％至约40％、约30％至约50％、约30％至约60％、约30％至约70％、约30％至约80％、约30％至约90％、约30％至约95％、约30％至约100％、约40％至约50％、约40％至约60％、约40％至约70％、约40％至约80％、约40％至约90％、约40％至约95％、约40％至约100％、约50％至约60％、约50％至约70％、约50％至约80％、约50％至约90％、约50％至约95％、约50％至约100％、约60％至约70％、约60％至约80％、约60％至约90％、约60％至约95％、约60％至约100％、约70％至约80％、约70％至约90％、约70％至约95％、约70％至约100％、约80％至约90％、约80％至约95％、约80％至约100％、约90％至约95％、约90％至约100％、或约95％至约100％的经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，crRNA可以包含约1％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约100％的经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，crRNA可以包含至少约1％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％的经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，crRNA可以包含至多约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约100％的经化学修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，经化学修饰的crRNA可以在crRNA序列中在5’-3’方向上在位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50中的一个或多个上具有经化学修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，经化学修饰的crRNA可以在距离crRNA序列的5’末端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49个碱基对的一个或多个位置上具有经化学修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，经化学修饰的crRNA可以在距离crRNA序列的3’末端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49个碱基对的一个或多个位置上具有经化学修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA可以包括tracrRNA。在一些实施方案中，tracrRNA可以包含一个或多个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的tracrRNA可以具有总计50至130个碱基对的长度。在一些实施方案中，经化学修饰的tracrRNA可以具有总计30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129或130个碱基对的长度。在一些实施方案中，经化学修饰的tracrRNA可以具有总计约30至约130个碱基对的长度。在一些实施方案中，经化学修饰的tracrRNA可以具有总计约30至约40、约30至约50、约30至约60、约30至约70、约30至约75、约30至约80、约30至约90、约30至约100、约30至约110、约30至约120、约30至约130、约40至约50、约40至约60、约40至约70、约40至约75、约40至约80、约40至约90、约40至约100、约40至约110、约40至约120、约40至约130、约50至约60、约50至约70、约50至约75、约50至约80、约50至约90、约50至约100、约50至约110、约50至约120、约50至约130、约60至约70、约60至约75、约60至约80、约60至约90、约60至约100、约60至约110、约60至约120、约60至约130、约70至约75、约70至约80、约70至约90、约70至约100、约70至约110、约70至约120、约70至约130、约75至约80、约75至约90、约75至约100、约75至约110、约75至约120、约75至约130、约80至约90、约80至约100、约80至约110、约80至约120、约80至约130、约90至约100、约90至约110、约90至约120、约90至约130、约100至约110、约100至约120、约100至约130、约110至约120、约110至约130、或约120至约130个碱基对的长度。在一些实施方案中，经化学修饰的tracrRNA可以具有总计约30、约40、约50、约60、约70、约75、约80、约90、约100、约110、约120或约130个碱基对的长度。在一些实施方案中，经化学修饰的tracrRNA可以具有总计至少约30、约40、约50、约60、约70、约75、约80、约90、约100、约110或约120个碱基对的长度。在一些实施方案中，经化学修饰的tracrRNA可以具有总计至多约40、约50、约60、约70、约75、约80、约90、约100、约110、约120或约130个碱基对的长度。
在一些实施方案中，经化学修饰的tracrRNA可以包含总计1至130个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的tracrRNA可以包含总计1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129或130个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的tracrRNA可以包含总计约1至约10个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的tracrRNA可以包含总计约1至约2、约1至约3、约1至约4、约1至约5、约1至约6、约1至约7、约1至约8、约1至约9、约1至约10、约2至约3、约2至约4、约2至约5、约2至约6、约2至约7、约2至约8、约2至约9、约2至约10、约3至约4、约3至约5、约3至约6、约3至约7、约3至约8、约3至约9、约3至约10、约4至约5、约4至约6、约4至约7、约4至约8、约4至约9、约4至约10、约5至约6、约5至约7、约5至约8、约5至约9、约5至约10、约6至约7、约6至约8、约6至约9、约6至约10、约7至约8、约7至约9、约7至约10、约8至约9、约8至约10、或约9至约10个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的tracrRNA可以包含总计约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的tracrRNA可以包含总计至少约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8或约9个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的tracrRNA可以包含总计至多约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的tracrRNA可以包含总计约10至约30个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的tracrRNA可以包含总计约10至约15、约10至约20、约10至约25、约10至约30、约15至约20、约15至约25、约15至约30、约20至约25、约20至约30、或约25至约30个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的tracrRNA可以包含总计约10、约15、约20、约25或约30个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的tracrRNA可以包含总计至少约10、约15、约20或约25个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，间隔子区可以包含总计至多约15、约20、约25或约30个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的tracrRNA可以包含总计约30至约130个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的tracrRNA可以包含总计约30至约40、约30至约50、约30至约60、约30至约70、约30至约75、约30至约80、约30至约90、约30至约100、约30至约110、约30至约120、约30至约130、约40至约50、约40至约60、约40至约70、约40至约75、约40至约80、约40至约90、约40至约100、约40至约110、约40至约120、约40至约130、约50至约60、约50至约70、约50至约75、约50至约80、约50至约90、约50至约100、约50至约110、约50至约120、约50至约130、约60至约70、约60至约75、约60至约80、约60至约90、约60至约100、约60至约110、约60至约120、约60至约130、约70至约75、约70至约80、约70至约90、约70至约100、约70至约110、约70至约120、约70至约130、约75至约80、约75至约90、约75至约100、约75至约110、约75至约120、约75至约130、约80至约90、约80至约100、约80至约110、约80至约120、约80至约130、约90至约100、约90至约110、约90至约120、约90至约130、约100至约110、约100至约120、约100至约130、约110至约120、约110至约130、或约120至约130个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的tracrRNA可以包含总计约30、约40、约50、约60、约70、约75、约80、约90、约100、约110、约120或约130个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的tracrRNA可以包含总计至少约30、约40、约50、约60、约70、约75、约80、约90、约100、约110或约120个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的tracrRNA可以包含总计至多约40、约50、约60、约70、约75、约80、约90、约100、约110、约120或约130个经化学修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，经化学修饰的tracrRNA可以包含约1％至100％的经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的tracrRNA可以包含约1％至约10％、约1％至约20％、约1％至约30％、约1％至约40％、约1％至约50％、约1％至约60％、约1％至约70％、约1％至约80％、约1％至约90％、约1％至约95％、约1％至约100％、约10％至约20％、约10％至约30％、约10％至约40％、约10％至约50％、约10％至约60％、约10％至约70％、约10％至约80％、约10％至约90％、约10％至约95％、约10％至约100％、约20％至约30％、约20％至约40％、约20％至约50％、约20％至约60％、约20％至约70％、约20％至约80％、约20％至约90％、约20％至约95％、约20％至约100％、约30％至约40％、约30％至约50％、约30％至约60％、约30％至约70％、约30％至约80％、约30％至约90％、约30％至约95％、约30％至约100％、约40％至约50％、约40％至约60％、约40％至约70％、约40％至约80％、约40％至约90％、约40％至约95％、约40％至约100％、约50％至约60％、约50％至约70％、约50％至约80％、约50％至约90％、约50％至约95％、约50％至约100％、约60％至约70％、约60％至约80％、约60％至约90％、约60％至约95％、约60％至约100％、约70％至约80％、约70％至约90％、约70％至约95％、约70％至约100％、约80％至约90％、约80％至约95％、约80％至约100％、约90％至约95％、约90％至约100％、或约95％至约100％的经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的tracrRNA可以包含约1％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约100％的经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的tracrRNA可以包含至少约1％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％的经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的tracrRNA可以包含至多约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约100％的经化学修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，经化学修饰的tracrRNA可以在tracrRNA序列中在5’-3’方向上在位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129或130中的一个或多个上具有经化学修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，经化学修饰的tracrRNA区可以在距离tracrRNA序列的5’末端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128或129个碱基对的一个或多个位置上具有经化学修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，经化学修饰的tracrRNA区可以在距离tracrRNA序列的3’末端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128或129个碱基对的一个或多个位置上具有经化学修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA序列的5’或3’末端处包含硫代磷酸酯(PS)键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含0、1、2、3、4或5个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的3’末端处包含0、1、2、3、4或5个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’和3’末端中的每一个处包含0、1、2、3、4或5个PS键或其任何组合。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’和3’末端中的每一个处包含0、1、2或3个PS键或其任何组合。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’和3’末端中的每一个处包含1个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’和3’末端中的每一个处包含2个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’和3’末端中的每一个处包含3个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’和3’末端中的每一个处包含4个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’和3’末端中的每一个处包含5个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含3个PS键并在3’末端处包含0个PS键(即，没有修饰)。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含3个PS键并在3’末端处包含1个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含3个PS键并在3’末端处包含2个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含3个PS键并在3’末端处包含4个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含3个PS键并在3’末端处包含5个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含2个PS键并在3’末端处包含0个PS键(即，没有修饰)。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含2个PS键并在3’末端处包含1个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含2个PS键并在3’末端处包含3个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含2个PS键并在3’末端处包含4个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含2个PS键并在3’末端处包含5个PS键。
在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在5’末端处包含2个且不超过2个连续硫代磷酸酯(PS)键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在3’末端处包含2个且不超过2个连续硫代磷酸酯(PS)键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在5’末端处包含3个连续硫代磷酸酯(PS)键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在3’末端处包含3个连续硫代磷酸酯(PS)键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在3’末端或5’末端处包含序列5’-UsUsU-3’，其中U指示尿苷，并且其中s指示硫代磷酸酯(PS)键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在5’末端处包含3个硫代磷酸酯(PS)键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在3’末端处包含3个硫代磷酸酯(PS)键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在5’末端处包含两个硫代磷酸酯键，其中所述两个硫代磷酸酯(PS)键是在5’末端的前两个核苷酸位置处的两个连续硫代磷酸酯(PS)键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在5’末端处包含两个硫代磷酸酯键，其中所述两个硫代磷酸酯(PS)键是在5’末端的前3-10个核苷酸位置内。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在3’末端处包含两个硫代磷酸酯(PS)键，其中所述两个硫代磷酸酯(PS)键是在3’末端的前两个核苷酸位置处的两个连续硫代磷酸酯(PS)键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在3’末端处包含两个硫代磷酸酯(PS)键，其中所述两个硫代磷酸酯(PS)键是在3’末端的前3-10个核苷酸位置内。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在3’末端处包含序列5’-UsUsUs-3’，其中U指示尿苷，并且s指示硫代磷酸酯(PS)键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在3’末端处包含序列5’-UsUsU-3’，其中U指示尿苷，并且s指示硫代磷酸酯(PS)键。
在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的内部位置处包含PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的内部位置处包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的内部位置处包含1个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的内部位置处包含2个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的内部位置处包含3个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的内部位置处包含4个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的内部位置处包含5个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的内部位置处包含6个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的内部位置处包含7个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的内部位置处包含8个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的内部位置处包含9个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的内部位置处包含10个PS键。
在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端、3’末端、或内部位置或其任何组合处包含PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端、3’末端、或内部位置或其任何组合处包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个PS键。
在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含2个PS键，在3’末端处包含3个PS键并在内部位置处包含0个PS键(即，没有修饰)。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含2个PS键，在3’末端处包含3个PS键并在内部位置处包含1个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含2个PS键，在3’末端处包含3个PS键并在内部位置处包含2个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含2个PS键，在3’末端处包含3个PS键并在内部位置处包含3个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含2个PS键，在3’末端处包含3个PS键并在内部位置处包含4个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含2个PS键，在3’末端处包含3个PS键并在内部位置处包含5个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含2个PS键，在3’末端处包含3个PS键并在内部位置处包含6个PS键。
在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含3个PS键，在3’末端处包含2个PS键并在内部位置处包含0个PS键(即，没有修饰)。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含3个PS键，在3’末端处包含2个PS键并在内部位置处包含1个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含3个PS键，在3’末端处包含2个PS键并在内部位置处包含2个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含3个PS键，在3’末端处包含2个PS键并在内部位置处包含3个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含3个PS键，在3’末端处包含2个PS键并在内部位置处包含4个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含3个PS键，在3’末端处包含2个PS键并在内部位置处包含5个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含3个PS键，在3’末端处包含2个PS键并在内部位置处包含6个PS键。
在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含2个PS键，在3’末端处包含2个PS键并在内部位置处包含0个PS键(即，没有修饰)。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含2个PS键，并在3’末端处包含2个PS键并且在内部位置处包含1个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含2个PS键，并在3’末端处包含2个PS键并且在内部位置处包含2个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含2个PS键，并在3’末端处包含2个PS键并且在内部位置处包含3个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含2个PS键，并在3’末端处包含2个PS键并且在内部位置处包含4个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含2个PS键，并在3’末端处包含2个PS键并且在内部位置处包含5个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含2个PS键，并在3’末端处包含2个PS键并且在内部位置处包含6个PS键。
在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含3个PS键，在3’末端处包含3个PS键并在内部位置处包含0个PS键(即，没有修饰)。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含3个PS键，并在3’末端处包含3个PS键并且在内部位置处包含1个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含3个PS键，并在3’末端处包含3个PS键并且在内部位置处包含2个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含3个PS键，并在3’末端处包含3个PS键并且在内部位置处包含3个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含3个PS键，并在3’末端处包含3个PS键并且在内部位置处包含4个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含3个PS键，并在3’末端处包含3个PS键并且在内部位置处包含5个PS键。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含3个PS键，并在3’末端处包含3个PS键并且在内部位置处包含6个PS键。
在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含额外的具有磷酸二酯键的经修饰或未修饰的核苷酸(N)，其中N是A、C、G、U、dA(脱氧A)、dC(脱氧C)、dG(脱氧G)或T及其任何组合。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含1、2、3、4或5个额外的具有磷酸二酯键的N，其中N是A、G、U、dA、dG、dC或T及其任何组合。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在5’或3’末端处包含1、2、3、4或5个额外的具有磷酸二酯键的N。在一个实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在5’末端处包含1、2、3、4或5个额外的具有磷酸二酯键的N。在一个优选实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在3’末端处包含1、2、3、4或5个额外的具有磷酸二酯键的N。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含1、2、3、4或5个额外的具有磷酸二酯键的N，并且每个N是相同的经修饰或未修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含4个额外的具有磷酸二酯键的N，并且4个额外的N中的每个N是A、C、G、U、dA、dC、dG或T。例如，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含4个额外的具有磷酸二酯键的N，并且4个额外的N中的每个N是A。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含3个额外的具有磷酸二酯键的N，并且3个额外的N中的每个N是A、C、G、U、dA、dC、dG或T。例如，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含3个额外的具有磷酸二酯键的N，并且3个额外的N中的每个N是A。例如，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含3个额外的具有磷酸二酯键的N，并且3个额外的N中的每个N是C。例如，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含3个额外的具有磷酸二酯键的N，并且3个额外的N中的每个N是G。例如，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含3个额外的具有磷酸二酯键的N，并且3个额外的N中的每个N是U。例如，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含3个额外的具有磷酸二酯键的N，并且3个额外的N中的每个N是dA。例如，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含3个额外的具有磷酸二酯键的N，并且3个额外的N中的每个N是dC。例如，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含3个额外的具有磷酸二酯键的N，并且3个额外的N中的每个N是dG。例如，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含3个额外的具有磷酸二酯键的N，并且3个额外的N中的每个N是T。
在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在5’或3’末端处包含额外的具有磷酸二酯键的尿嘧啶(U)。在一个实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在5’末端处包含额外的具有磷酸二酯键的U。在一个优选实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在3’末端处包含额外的具有磷酸二酯键的U。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在5’或3’末端处包含1、2、3、4或5个额外的具有磷酸二酯键的U。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在5’末端处包含1个额外的具有磷酸二酯键的U。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在3’末端处包含1个额外的具有磷酸二酯键的U。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在5’末端处包含2个额外的具有磷酸二酯键的U。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在3’末端处包含2个额外的具有磷酸二酯键的U。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在5’末端处包含3个额外的具有磷酸二酯键的U。在一个优选实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在3’末端处包含3个额外的具有磷酸二酯键的U。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在5’末端处包含4个额外的具有磷酸二酯键的U。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在3’末端处包含4个额外的具有磷酸二酯键的U。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在5’末端处包含5个额外的具有磷酸二酯键的U。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在3’末端处包含5个额外的具有磷酸二酯键的U。
在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含核糖水粉蕈素(在本申请中描绘为“X”，例如在表1或表24中)。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核糖水粉蕈素。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA不包含核糖水粉蕈素。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含1个核糖水粉蕈素。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含2个核糖水粉蕈素。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含3个核糖水粉蕈素。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含4个核糖水粉蕈素。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含5个核糖水粉蕈素。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含6个核糖水粉蕈素。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含7个核糖水粉蕈素。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含8个核糖水粉蕈素。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含9个核糖水粉蕈素。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含10个核糖水粉蕈素。在一些实施方案中，水粉蕈素替换未修饰的gRNA或sgRNA或sgRNA或sgRNA中的腺嘌呤。在一些实施方案中，水粉蕈素是在间隔子序列中。在一些实施方案中，水粉蕈素是在tracrRNA序列中。在一些实施方案中，水粉蕈素是在tracrRNA序列中的crRNA序列中。在一些实施方案中，水粉蕈素是在tracrRNA序列中的茎环结构中。
在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含2’-O-甲基水粉蕈素(在本申请中描绘为“x”，例如在表1或表24中)。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个2’-O-甲基水粉蕈素。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA不包含2’-O-甲基水粉蕈素。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含1个2’-O-甲基水粉蕈素。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含2个2’-O-甲基水粉蕈素。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含3个2’-O-甲基水粉蕈素。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含4个2’-O-甲基水粉蕈素。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含5个2’-O-甲基水粉蕈素。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含6个2’-O-甲基水粉蕈素。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含7个2’-O-甲基水粉蕈素。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含8个2’-O-甲基水粉蕈素。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含9个2’-O-甲基水粉蕈素。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含10个2’-O-甲基水粉蕈素。在一些实施方案中，2’-O-甲基水粉蕈素替换未修饰的gRNA或sgRNA或sgRNA或sgRNA中的腺嘌呤。在一些实施方案中，2’-O-甲基水粉蕈素是在间隔子序列中。在一些实施方案中，2’-O-甲基水粉蕈素是在tracrRNA序列中。在一些实施方案中，2’-O-甲基水粉蕈素是在tracrRNA序列中的crRNA序列中。在一些实施方案中，2’-O-甲基水粉蕈素是在tracrRNA序列中的茎环结构中。
在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含2’-脱氧水粉蕈素(在本申请中描绘为“dX”，例如在表1或表24中)。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个2’-脱氧水粉蕈素。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA不包含2’-脱氧水粉蕈素。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含1个2’-脱氧水粉蕈素。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含2个2’-脱氧水粉蕈素。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含3个2’-脱氧水粉蕈素。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含4个2’-脱氧水粉蕈素。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含5个2’-脱氧水粉蕈素。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含6个2’-脱氧水粉蕈素。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含7个2’-脱氧水粉蕈素。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含8个2’-脱氧水粉蕈素。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含9个2’-脱氧水粉蕈素。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含10个2’-脱氧水粉蕈素。在一些实施方案中，2’-脱氧水粉蕈素替换未修饰的gRNA或sgRNA或sgRNA或sgRNA中的腺嘌呤。在一些实施方案中，2’-脱氧水粉蕈素是在间隔子序列中。在一些实施方案中，2’-脱氧水粉蕈素是在tracrRNA序列中。在一些实施方案中，2’-脱氧水粉蕈素是在tracrRNA序列中的crRNA序列中。在一些实施方案中，2’-脱氧水粉蕈素是在tracrRNA序列中的茎环结构中。
在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含2’-O-甲基核糖水粉蕈素(2’-OMe)。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含约0至约70个2’-OMe。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70个2’-OMe。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含约0至约70个2’-OMe。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含约0至约10、约0至约20、约0至约30、约0至约35、约0至约40、约0至约45、约0至约50、约0至约55、约0至约60、约0至约65、约0至约70、约10至约20、约10至约30、约10至约35、约10至约40、约10至约45、约10至约50、约10至约55、约10至约60、约10至约65、约10至约70、约20至约30、约20至约35、约20至约40、约20至约45、约20至约50、约20至约55、约20至约60、约20至约65、约20至约70、约30至约35、约30至约40、约30至约45、约30至约50、约30至约55、约30至约60、约30至约65、约30至约70、约35至约40、约35至约45、约35至约50、约35至约55、约35至约60、约35至约65、约35至约70、约40至约45、约40至约50、约40至约55、约40至约60、约40至约65、约40至约70、约45至约50、约45至约55、约45至约60、约45至约65、约45至约70、约50至约55、约50至约60、约50至约65、约50至约70、约55至约60、约55至约65、约55至约70、约60至约65、约60至约70、或约65至约70个2’-OMe。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含约0、约10、约20、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65或约70个2’-OMe。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含至少约0、约10、约20、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60或约65个2’-OMe。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA可以包含至多约10、约20、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65或约70个2’-OMe。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA不包含2’-OMe。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含62个2’-OMe。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA包含54个2’-OMe。
在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端处包含2’-OMe。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的3’末端处包含2’-OMe。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的内部位置处包含2’-OMe。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端、3’末端或内部位置处包含2’-OMe。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列的5’末端、3’末端和内部位置处包含2’-OMe。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列中在5’-3’方向上在位置含2、3、4、23、24、25、27、31或42或其任何组合处不包含2’-OMe。在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA在gRNA或sgRNA序列中在5’-3’方向上在位置含2、3、4、23、24、25、27、31或42处不包含2’-OMe。
以下示出了示例性的经化学修饰的gRNA或sgRNA序列：5’–csasgsGUUCCAUGGGAUGCUCUgUUUUAGagcuaGaaauagcaaGUUaAaAuAaggCUaGUCcGUUAucAAcuuGaaaaaguGgcaccgAgUCggugcusususu–3(SEQ ID NO:55)
其中大写的A、U、G或C代表核糖核苷酸腺苷、尿苷、鸟嘌呤或胞苷，小写的a、u、g和c指示2’-O-甲基-修饰的腺嘌呤、尿苷、鸟嘌呤和胞苷，并且“s”代表硫代磷酸酯(PS)键。
以下示出了示例性的经化学修饰的间隔子序列：
5’–csasgsGUUCCAUGGGAUGCUCU–3’(SEQ ID NO:56)
其中大写的A、U、G或C代表核糖核苷酸腺苷、尿苷、鸟嘌呤或胞苷，小写的a、u、g和c指示2’-O-甲基-修饰的腺嘌呤、尿苷、鸟嘌呤和胞苷，并且“s”代表硫代磷酸酯(PS)键。
以下示出了示例性的经化学修饰的tracrRNA序列：
5’–gUUUUAGagcuaGaaauagcaaGUUaAaAuAaggCUaGUCcGUUAucAAcuuGaaaaaguGgcaccgAgUCggugcusususu–3’(SEQ ID NO:57)
其中大写的A、U、G或C代表核糖核苷酸腺苷、尿苷、鸟嘌呤或胞苷，小写的a、u、g和c指示2’-O-甲基-修饰的腺嘌呤、尿苷、鸟嘌呤和胞苷，并且“s”代表硫代磷酸酯(PS)键。
以下示出了另一个示例性的经化学修饰的gRNA或sgRNA序列：
5’–csasgsGUUCCAUGGGAUGCUCUgUUUUAGagcuagaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuugaaaaagugGcaccgagucggugcusususu–3’(SEQ ID NO:55)
其中大写的A、U、G或C代表核糖核苷酸腺苷、尿苷、鸟嘌呤或胞苷，小写的a、u、g和c指示2’-O-甲基-修饰的腺嘌呤、尿苷、鸟嘌呤和胞苷，并且“s”代表硫代磷酸酯(PS)键。
以下示出了另一个示例性的经化学修饰的tracrRNA序列：
5’-gUUUUAGagcuagaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuugaaaaagugGcaccgagucggugcusususu-3’(SEQ ID NO:57)
以下示出了另一个示例性的经化学修饰的指导RNA序列：
5’–cscscsGCACCTTGGCGCAGCGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUsususu-3’(SEQ ID NO:58),其中大写的A、U、G或C代表核糖核苷酸腺苷、尿苷、鸟嘌呤或胞苷，小写的a、u、g和c指示2’-O-甲基-修饰的腺嘌呤、尿苷、鸟嘌呤和胞苷，并且“s”代表硫代磷酸酯(PS)键。
以下示出了另一个示例性的经化学修饰的指导RNA序列：
5’–asasgsAUACCUGAAUAACCCUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUsususu-3’(SEQ ID NO:59)(GA091)
以下示出了另一个示例性的经化学修饰的指导RNA序列：
5’–asasgsAUACCUGAAUAACCCUCGUUUUAGAgcuagaaauagcAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAacuugaaaaaguggcaccgagucggugcusususu 3’(SEQ ID NO:60)(GA098)
其中大写的A、U、G或C代表核糖核苷酸腺苷、尿苷、鸟嘌呤或胞苷，小写的a、u、g和c指示2’-O-甲基-修饰的腺嘌呤、尿苷、鸟嘌呤和胞苷，并且“s”代表硫代磷酸酯(PS)键。
以下示出了另一个示例性的经化学修饰的指导RNA序列：
5’–asasgsAUACCUGAAUAACCCUCgUUUUAGagcuaGaaauagcaaGUUaAaAuAaggCUaGUCcGUUAucAAcuuGaaaaaguGgcaccgAgUCggugcusususu-3’(SEQ ID NO:59)(GA099)
其中大写的A、U、G或C代表核糖核苷酸腺苷、尿苷、鸟嘌呤或胞苷，小写的a、u、g和c指示2’-O-甲基-修饰的腺嘌呤、尿苷、鸟嘌呤和胞苷，并且“s”代表硫代磷酸酯(PS)键。
以下示出了另一个示例性的经化学修饰的指导RNA序列：
5’–
asasgsAUACCUGAAUAACCCUCgUUUUAGagcuagaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuugaaaaagugGcaccgagucggugcusususu-3’(SEQ ID NO:59)(GA100)
其中大写的A、U、G或C代表核糖核苷酸腺苷、尿苷、鸟嘌呤或胞苷，小写的a、u、g和c指示2’-O-甲基-修饰的腺嘌呤、尿苷、鸟嘌呤和胞苷，并且“s”代表硫代磷酸酯(PS)键。
以下示出了另一个示例性的经化学修饰的指导RNA序列：
5’–cscscsGCACCUUGGCGCAGCGGgUUUUAGagcuagaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuugaaaaagugGcaccgagucggugcusususuuuu-3’(SEQ ID NO:11)(GA385)
其中大写的A、U、G或C代表核糖核苷酸腺苷、尿苷、鸟嘌呤或胞苷，小写的a、u、g和c指示2’-O-甲基-修饰的腺嘌呤、尿苷、鸟嘌呤和胞苷，并且“s”代表硫代磷酸酯(PS)键。以下示出了另一个示例性的经化学修饰的指导RNA序列：
5’–cscscsGCACCUUGGCGCAGCGGgUUUUAGagcuagaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuugaaaaagugGcaccgagucggugcusususuuUu-3’(SEQ ID NO:11)(GA386),
其中大写的A、U、G或C代表核糖核苷酸腺苷、尿苷、鸟嘌呤或胞苷，小写的a、u、g和c指示2’-O-甲基-修饰的腺嘌呤、尿苷、鸟嘌呤和胞苷，并且“s”代表硫代磷酸酯(PS)键。
以下示出了另一个示例性的经化学修饰的指导RNA序列：
5’–cscscsGCACCUUGGCGCAGCGgUUUUAGagcuaGaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuuGaaaaagugGcaccgagucggugcuususuuuu-3’(SEQ ID NO:12),(GA387)
其中大写的A、U、G或C代表核糖核苷酸腺苷、尿苷、鸟嘌呤或胞苷，小写的a、u、g和c指示2’-O-甲基-修饰的腺嘌呤、尿苷、鸟嘌呤和胞苷，并且“s”代表硫代磷酸酯(PS)键。
另外的经化学修饰的指导RNA序列和靶基因信息在表1或表24中提供。
在一些实施方案中，化学修饰包括硫代磷酸酯键(PS)。在一些实施方案中，sgRNA在5’末端或3’末端处包含硫代磷酸酯键(PS)。在一些实施方案中，sgRNA在5’末端或3’末端处包含两个且不超过两个连续硫代磷酸酯键(PS)。在一些实施方案中，sgRNA在5’末端或3’末端处包含三个连续硫代磷酸酯键(PS)。在一些实施方案中，sgRNA在3’末端或5’末端处包含序列5’-UsUsU-3’，其中U指示尿苷，并且其中s指示硫代磷酸酯键(PS)。
在一些方面，本文提供了一种sgRNA，其包含(i)间隔子序列和(ii)tracrRNA序列，其中在与PCSK9基因或ANGPTL3基因中的靶多核苷酸序列接触时，所述间隔子序列与所述靶多核苷酸序列杂交，其中在与碱基编辑器系统接触时，所述tracrRNA序列结合所述碱基编辑器系统中的Cas蛋白，并且其中所述sgRNA包含水粉蕈素或脱氧水粉蕈素。在一些实施方案中，水粉蕈素或脱氧水粉蕈素替换未修饰的sgRNA中的腺嘌呤。在一些实施方案中，水粉蕈素或脱氧水粉蕈素是在间隔子序列中。在一些实施方案中，其中水粉蕈素或脱氧水粉蕈素是在tracrRNA序列中。在一些实施方案中，水粉蕈素或脱氧水粉蕈素是在tracrRNA序列中。在一些实施方案中，水粉蕈素或脱氧水粉蕈素是在tracrRNA序列中的crRNA序列中。在一些实施方案中，水粉蕈素或脱氧水粉蕈素是在tracrRNA序列中的茎环结构中。
在一些方面，本文提供了一种单指导RNA，其包含选自表1或表24的序列，其中a、u、g和c指示2’-OMe修饰的腺嘌呤、尿苷、鸟嘌呤和胞苷，其中s指示硫代磷酸酯(PS)键。
在一些实施方案中，经化学修饰的指导RNA包含未修饰的tracrRNA序列GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQID NO:61)。在一些实施方案中，经化学修饰的指导RNA包含tracrRNA序列GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO:61)，其包含1个或多个修饰。
在一些实施方案中，经化学修饰的指导RNA包含与表1或表24中列出的经化学修饰的指导RNA中的任一个具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或至少99.9％同一性的寡核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的指导RNA包括表1或表24中列出的经化学修饰的指导RNA中的任一个。在一些实施方案中，经化学修饰的指导RNA是表1或表24中列出的经化学修饰的指导RNA中的任一个。在一些实施方案中，经化学修饰的指导RNA包含与SEQ ID NO:9-11、55、59、253-452、1618-1635、1637-1800、1802-2135和2191的经化学修饰的指导RNA中的任一个具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或至少99.9％同一性的寡核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的指导RNA包括SEQ ID NO:9-11、55、59、253-452、1618-1635、1637-1800、1802-2135和2191的经化学修饰的指导RNA中的任一个。在一些实施方案中，经化学修饰的指导RNA是SEQ ID NO:9-11、55、59、253-452、1618-1635、1637-1800、1802-2135和2191的经化学修饰的指导RNA中的任一个。
剪接位点处的碱基编辑
在一方面，本文提供了碱基编辑器系统及其使用方法，其用于通过在DNA序列中生成在靶基因的剪接位点处在外显子和内含子(剪接位点)的边界处发生的遗传改变来修饰靶基因。在一些实施方案中，碱基编辑器系统修饰靶基因的剪接受体位点处的核碱基。在一些实施方案中，碱基编辑器系统修饰靶基因的剪接供体位点处的核碱基。剪接供体或剪接受体位点处的修饰可能产生交替转录物。在一些实施方案中，剪接供体或剪接受体位点处的修饰产生异常转录物。在一些实施方案中，剪接供体或剪接受体位点处的修饰产生在转录时经受降解的不稳定转录物。在一些实施方案中，剪接供体或剪接受体位点处的修饰在转录物中产生提前终止密码子。在某些实施方案中，所述方法包括通过靶向剪接受体-剪接供体(SA-SD)位点或提前终止(pmSTOP)位点来敲除或敲低基因。对于此类方法，指导多核苷酸被设计来破坏靶核苷酸序列内的一个或多个剪接受体/供体位点。在一些实施方案中，指导多核苷酸(例如，单指导RNA)包含具有至少10个连续核苷酸的序列或具有17-23个连续核苷酸的序列，所述序列与生物体的基因组中的靶序列互补并且包含靶碱基对。
SA-SD位点处的破坏是特别有利的，因为人们可以敲除编码序列和非编码RNA(ncRNA)而无需通读终止密码子。碱基编辑的效率可以通过桑格测序迹线的EditR分析或通过下一代测序(NGS)在基因组水平上确定，也可以通过流式细胞术在蛋白质水平上确定。靶向剪接供体区和剪接受体区的剪接受体-剪接供体碱基编辑gRNA表现出至少5％并且在一些情况下至少80％或更大(例如，5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％)的碱基转化效率。在一些情况下，SA-SD gRNA在C至T转化方面比引入提前终止密码子破坏的gRNA显著更有效。
用于靶向SA-SD位点的指导RNA可以使用基于R的程序来设计，所述程序鉴定靶向所有ncRNA和蛋白质编码基因SA-SD位点的gRNA。在一些情况下，使用者提供参考基因组、参考序列的Ensembl转录物ID、原间隔子相邻基序(PAM)位点以及到外显子-内含子边界上游和下游子集的距离。所述程序提取外显子-内含子边界上游20个碱基对+PAM长度和下游15个碱基对的序列以及剪接位点基序。在一些实施方案中，指导分子的长度可以是20至120个碱基或更多。在某些实施方案中，指导分子的长度可以是20至60个碱基、或20至50个碱基、或30至50个碱基、或39至46个碱基。
在一些情况下，使用在转染到哺乳动物细胞中时具有增加稳定性的经化学修饰的gRNA是有利的。例如，可以对gRNA进行化学修饰，以在每个gRNA的至少一个5’核苷酸和至少一个3’核苷酸上包含2’-0-甲基硫代磷酸酯修饰。在一些情况下，对三个末端5’核苷酸和三个末端3’核苷酸进行化学修饰以包含2’-O-甲基硫代磷酸酯修饰。
在一方面，本文提供了碱基编辑系统和方法，其用于靶向疾病以进行碱基编辑破坏。靶序列可以是任何与疾病相关联的多核苷酸或基因，如本领域已经建立的。
不受特定理论的约束，在目标是破坏体内基因以用于治疗目的的情况下，胞嘧啶碱基编辑器可以用于通过改变谷氨酰胺(CAG-TAG，CAA-TAA)、精氨酸(CGA-TGA)和色氨酸(TGG-TAG/TAA/TGA，编辑反义链上的胞嘧啶)的特定密码子来将终止密码子直接引入基因的编码序列中(无义突变)。在某些实施方案中，腺嘌呤碱基编辑器可以用于通过修饰靶基因的剪接位点处的核碱基来破坏基因功能和/或表达。更有利的腺嘌呤碱基编辑器的脱靶谱，特别是在gRNA非依赖性脱靶DNA碱基编辑方面，建议在治疗目的中使用腺嘌呤碱基编辑器而不是胞嘧啶碱基编辑器。在一些实施方案中，碱基编辑器(例如，如本文所述的腺苷核碱基编辑器)可以用于破坏内含子5’末端处的剪接供体或内含子3’末端处的剪接受体。在一些实施方案中，剪接位点破坏使得在信使RNA(mRNA)中包含内含子序列—可能引入无义、移码或框内插入缺失突变，其产生破坏蛋白质活性的提前终止密码子或氨基酸插入/缺失—或排除外显子序列，这也可以引入无义、移码或框内插入缺失突变。
典型剪接供体在有义链上包含DNA序列GT，而典型剪接受体包含DNA序列AG。在一些实施方案中，碱基编辑器(例如，如本文所述的腺苷核碱基编辑器)可以用于生成破坏正常剪接的序列的改变。在一些实施方案中，腺苷碱基编辑器破坏反义链(GT-GC)中第二位置中的互补碱基。在一些实施方案中，腺苷碱基编辑器破坏有义链(AG-GG)中的第一位置。
内源性基因序列的突变或破坏的有用应用的实例，其减少或消除与疾病相关的靶基因的表达，显著降低了脱靶效应、插入缺失频率和/或与由传统CRISPR-Cas9核酸酶修饰导致的双链断裂相关的其他意外遗传中断。在一些实施方案中，靶基因是PCSK9基因。在一些实施方案中，靶基因是ANGPTL3基因。
本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以增强或增加碱基编辑器融合蛋白的可编程DNA结合组分，诸如Cas蛋白(例如，Cas9蛋白、核酸酶活性丧失的Cas9蛋白、Cas9切口酶)与指导RNA(例如gRNA或sgRNA)之间的结合亲和力。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以使Cas蛋白与gRNA或sgRNA之间的结合亲和力增强或增加至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、75％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以使Cas蛋白(例如，Cas9蛋白、核酸酶活性丧失的Cas9蛋白、Cas9切口酶)与gRNA或sgRNA之间的结合亲和力增强或增加约20％至约300％、约50％至约300％、约100％至约300％、约150％至约300％、约20％至约50％、约20％至约100％、约20％至约150％、约20％至约200％、约20％至约250％、约50％至约100％、约50％至约150％、约50％至约200％、约50％至约250％、约100％至约150％、约100％至约200％、约100％至约250％、约150％至约200％、约150％至约250％、约200％至约250％、至少约20％、至少约50％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％或至少约300％。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以使碱基编辑器融合蛋白或Cas蛋白与gRNA或sgRNA之间的结合亲和力增强或增加约20％至约300％、约50％至约300％、约100％至约300％、约150％至约300％、约20％至约50％、约20％至约100％、约20％至约150％、约20％至约200％、约20％至约250％、约50％至约100％、约50％至约150％、约50％至约200％、约50％至约250％、约100％至约150％、约100％至约200％、约100％至约250％、约150％至约200％、约150％至约250％、约200％至约250％、至少约20％、至少约50％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％或至少约300％。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以使Cas蛋白或碱基编辑器融合蛋白的组分与gRNA或sgRNA之间的结合亲和力增强或增加至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或超过10倍。
本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以增强或增加碱基编辑器融合蛋白的可编程DNA结合组分，诸如Cas蛋白(例如，Cas9蛋白、核酸酶活性丧失的Cas9蛋白、Cas9切口酶)与指导RNA(例如gRNA或sgRNA)的tracrRNA序列之间的结合亲和力。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以使碱基编辑器融合蛋白或Cas蛋白与gRNA或sgRNA的tracrRNA序列之间的结合亲和力增强或增加至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、75％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以使碱基编辑器融合蛋白或Cas蛋白与gRNA或sgRNA的tracrRNA序列之间的结合亲和力增强或增加约20％至约300％、约50％至约300％、约100％至约300％、约150％至约300％、约20％至约50％、约20％至约100％、约20％至约150％、约20％至约200％、约20％至约250％、约50％至约100％、约50％至约150％、约50％至约200％、约50％至约250％、约100％至约150％、约100％至约200％、约100％至约250％、约150％至约200％、约150％至约250％、约200％至约250％、至少约20％、至少约50％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％或至少约300％。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以使碱基编辑器融合蛋白或Cas蛋白与gRNA或sgRNA的tracrRNA序列之间的结合亲和力增强或增加约20％至约300％、约50％至约300％、约100％至约300％、约150％至约300％、约20％至约50％、约20％至约100％、约20％至约150％、约20％至约200％、约20％至约250％、约50％至约100％、约50％至约150％、约50％至约200％、约50％至约250％、约100％至约150％、约100％至约200％、约100％至约250％、约150％至约200％、约150％至约250％、约200％至约250％、至少约20％、至少约50％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％或至少约300％。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以使碱基编辑器融合蛋白或Cas蛋白与gRNA或sgRNA的tracrRNA序列之间的结合亲和力增强或增加至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或超过10倍。
在一些实施方案中，与未修饰的sgRNA中的tracrRNA序列相比，gRNA或sgRNA的tracrRNA序列可以以增加的结合亲和力结合碱基编辑器融合蛋白的可编程DNA结合组分，诸如Cas蛋白(，)。II型Cas蛋白可以用作如本文所述的系统或碱基编辑器。在一些实施方案中，与未修饰的sgRNA中的tracrRNA序列相比，gRNA或sgRNA的tracrRNA序列可以以至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、75％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％增加的结合亲和力结合II型Cas蛋白。在一些实施方案中，与未修饰的sgRNA中的tracrRNA序列相比，gRNA或sgRNA的tracrRNA序列可以以至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或超过10倍增加的结合亲和力结合包含II型Cas蛋白的碱基编辑器。在一些实施方案中，与未修饰的sgRNA中的tracrRNA序列相比，gRNA或sgRNA的tracrRNA序列可以以增加的结合亲和力结合包含Cas9蛋白的碱基编辑器融合蛋白。在一些实施方案中，与未修饰的sgRNA中的tracrRNA序列相比，gRNA或sgRNA的tracrRNA序列可以以至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、75％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％或300％增加的结合亲和力结合Cas9蛋白。在一些实施方案中，与未修饰的sgRNA中的tracrRNA序列相比，gRNA或sgRNA的tracrRNA序列可以以至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或超过10倍增加的结合亲和力结合包含Cas9蛋白的碱基编辑器融合蛋白。
本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以减少靶序列的基因修饰(例如，基因或基因组编辑)中的脱靶效应。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以使靶序列的基因修饰中的脱靶效应减少至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、75％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以使靶序列的基因修饰中的脱靶效应减少约20％至约300％、约50％至约300％、约100％至约300％、约150％至约300％、约20％至约50％、约20％至约100％、约20％至约150％、约20％至约200％、约20％至约250％、约50％至约100％、约50％至约150％、约50％至约200％、约50％至约250％、约100％至约150％、约100％至约200％、约100％至约250％、约150％至约200％、约150％至约250％、约200％至约250％、至少约20％、至少约50％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％或至少约300％。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以使靶序列的基因修饰中的脱靶效应减少约20％至约300％、约50％至约300％、约100％至约300％、约150％至约300％、约20％至约50％、约20％至约100％、约20％至约150％、约20％至约200％、约20％至约250％、约50％至约100％、约50％至约150％、约50％至约200％、约50％至约250％、约100％至约150％、约100％至约200％、约100％至约250％、约150％至约200％、约150％至约250％、约200％至约250％、至少约20％、至少约50％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％或至少约300％。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以使靶序列的基因修饰中的脱靶效应减少到至少1/1.1、1/1.2、1/1.3、1/1.4、1/1.5、1/1.6、1/1.7、1/1.8、1/1.9、1/2、1/2.5、1/3、1/3.5、1/4、1/4.5、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10或超过1/10。
在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是在基因组中，其中gRNA或sgRNA能够引导碱基编辑器融合蛋白的组分(例如，Cas9)以在靶多核苷酸序列中实现修饰，并且其中与未修饰的gRNA或sgRNA相比，所述修饰在基因组中产生更少的脱靶效应。在一些实施方案中，gRNA或sgRNA能够引导II型Cas蛋白以在靶多核苷酸序列中实现修饰，其中与未修饰的gRNA或sgRNA相比，所述修饰在基因组中产生至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、75％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％更少的脱靶效应。在一些实施方案中，gRNA或sgRNA能够引导碱基编辑器融合蛋白的II型Cas蛋白以在靶多核苷酸序列中实现修饰，其中与未修饰的gRNA或sgRNA相比，所述修饰在基因组中产生减少到至少1/1.1、1/1.2、1/1.3、1/1.4、1/1.5、1/1.6、1/1.7、1/1.8、1/1.9、1/2、1/2.5、1/3、1/3.5、1/4、1/4.5、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10或超过1/10的脱靶效应。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是在基因组中，其中gRNA或sgRNA能够引导Cas9蛋白以在靶多核苷酸序列中实现修饰，并且其中与未修饰的gRNA或sgRNA相比，所述修饰在基因组中产生更少的脱靶效应。在一些实施方案中，gRNA或sgRNA能够引导Cas9蛋白以在靶多核苷酸序列中实现修饰，其中与未修饰的gRNA或sgRNA相比，所述修饰在基因组中产生至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、75％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％更少的脱靶效应。在一些实施方案中，gRNA或sgRNA能够引导Cas9。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是在基因组中，其中gRNA或sgRNA能够引导碱基编辑器融合蛋白以在靶多核苷酸序列中实现修饰，并且其中与未修饰的gRNA或sgRNA相比，所述修饰在基因组中产生更少的脱靶效应。在一些实施方案中，gRNA或sgRNA能够引导碱基编辑器融合蛋白以在靶多核苷酸序列中实现修饰，其中与未修饰的gRNA或sgRNA相比，所述修饰在基因组中产生至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、75％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％更少的脱靶效应。在一些实施方案中，gRNA或sgRNA能够引导碱基编辑器融合蛋白以在靶多核苷酸序列中实现修饰，其中与未修饰的gRNA或sgRNA相比，所述修饰在基因组中产生减少到至少1/1.1、1/1.2、1/1.3、1/1.4、1/1.5、1/1.6、1/1.7、1/1.8、1/1.9、1/2、1/2.5、1/3、1/3.5、1/4、1/4.5、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10或超过1/10的脱靶效应。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，使用经化学修饰的gRNA或sgRNA的修饰在细胞中产生更少的脱靶效应。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，使用经化学修饰的gRNA或sgRNA的修饰在细胞中产生至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、75％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％更少的脱靶效应。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，使用经化学修饰的gRNA或sgRNA的修饰在细胞中产生减少到至少1/1.1、1/1.2、1/1.3、1/1.4、1/1.5、1/1.6、1/1.7、1/1.8、1/1.9、1/2、1/2.5、1/3、1/3.5、1/4、1/4.5、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10或超过1/10的脱靶效应。
本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以增强或增加基因修饰(例如，基因或基因组编辑)效率。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以使基因修饰(例如，基因或基因组编辑)效率增强或增加至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、75％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以使基因修饰(例如，基因或基因组编辑)效率增强或增加约20％至约300％、约50％至约300％、约100％至约300％、约150％至约300％、约20％至约50％、约20％至约100％、约20％至约150％、约20％至约200％、约20％至约250％、约50％至约100％、约50％至约150％、约50％至约200％、约50％至约250％、约100％至约150％、约100％至约200％、约100％至约250％、约150％至约200％、约150％至约250％、约200％至约250％、至少约20％、至少约50％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％或至少约300％。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以使基因修饰(例如，基因或基因组编辑)效率增强或增加约20％至约300％、约50％至约300％、约100％至约300％、约150％至约300％、约20％至约50％、约20％至约100％、约20％至约150％、约20％至约200％、约20％至约250％、约50％至约100％、约50％至约150％、约50％至约200％、约50％至约250％、约100％至约150％、约100％至约200％、约100％至约250％、约150％至约200％、约150％至约250％、约200％至约250％、至少约20％、至少约50％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％或至少约300％。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以使基因修饰(例如，基因或基因组编辑)效率增强或增加至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或超过10倍。
本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以增强或增加碱基编辑器蛋白或组分(例如，Cas9蛋白)和指导RNA(例如，gRNA或sgRNA)的复合物的稳定性，例如碱基编辑器复合物的稳定性。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以使Cas蛋白-gRNA复合物的稳定性增强或增加至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、75％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以使碱基编辑器融合蛋白或Cas蛋白-gRNA复合物的稳定性增强或增加约20％至约300％、约50％至约300％、约100％至约300％、约150％至约300％、约20％至约50％、约20％至约100％、约20％至约150％、约20％至约200％、约20％至约250％、约50％至约100％、约50％至约150％、约50％至约200％、约50％至约250％、约100％至约150％、约100％至约200％、约100％至约250％、约150％至约200％、约150％至约250％、约200％至约250％、至少约20％、至少约50％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％或至少约300％。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以使碱基编辑器融合蛋白或Cas蛋白-gRNA复合物的稳定性增强或增加约20％至约300％、约50％至约300％、约100％至约300％、约150％至约300％、约20％至约50％、约20％至约100％、约20％至约150％、约20％至约200％、约20％至约250％、约50％至约100％、约50％至约150％、约50％至约200％、约50％至约250％、约100％至约150％、约100％至约200％、约100％至约250％、约150％至约200％、约150％至约250％、约200％至约250％、至少约20％、至少约50％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％或至少约300％。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以使碱基编辑器融合蛋白或Cas蛋白-gRNA复合物的稳定性增强或增加至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或超过10倍。
在一些实施方案中，与未修饰的sgRNA相比，本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以使碱基编辑器复合物的稳定性增强或增加至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、75％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％。在一些实施方案中，与未修饰的sgRNA相比，本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以使碱基编辑器复合物的稳定性增强或增加约20％至约300％、约50％至约300％、约100％至约300％、约150％至约300％、约20％至约50％、约20％至约100％、约20％至约150％、约20％至约200％、约20％至约250％、约50％至约100％、约50％至约150％、约50％至约200％、约50％至约250％、约100％至约150％、约100％至约200％、约100％至约250％、约150％至约200％、约150％至约250％、约200％至约250％、至少约20％、至少约50％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％或至少约300％。在一些实施方案中，与未修饰的sgRNA相比，本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以使碱基编辑器复合物的稳定性增强或增加约20％至约300％、约50％至约300％、约100％至约300％、约150％至约300％、约20％至约50％、约20％至约100％、约20％至约150％、约20％至约200％、约20％至约250％、约50％至约100％、约50％至约150％、约50％至约200％、约50％至约250％、约100％至约150％、约100％至约200％、约100％至约250％、约150％至约200％、约150％至约250％、约200％至约250％、至少约20％、至少约50％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％或至少约300％。在一些实施方案中，与未修饰的sgRNA相比，本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以使碱基编辑器-sgRNA或Cas9-sgRNA复合物的稳定性增强或增加至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或超过10倍。
本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以增强或增加体外、体内和/或离体指导RNA(例如，gRNA或sgRNA)的稳定性。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以使体外、体内和/或离体gRNA或sgRNA的稳定性增强或增加至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、75％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以使体外、体内和/或离体gRNA或sgRNA的稳定性增强或增加约20％至约300％、约50％至约300％、约100％至约300％、约150％至约300％、约20％至约50％、约20％至约100％、约20％至约150％、约20％至约200％、约20％至约250％、约50％至约100％、约50％至约150％、约50％至约200％、约50％至约250％、约100％至约150％、约100％至约200％、约100％至约250％、约150％至约200％、约150％至约250％、约200％至约250％、至少约20％、至少约50％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％或至少约300％。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以使体外、体内和/或离体gRNA或sgRNA增强或增加约20％至约300％、约50％至约300％、约100％至约300％、约150％至约300％、约20％至约50％、约20％至约100％、约20％至约150％、约20％至约200％、约20％至约250％、约50％至约100％、约50％至约150％、约50％至约200％、约50％至约250％、约100％至约150％、约100％至约200％、约100％至约250％、约150％至约200％、约150％至约250％、约200％至约250％、至少约20％、至少约50％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％或至少约300％。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以使体外、体内和/或离体gRNA或sgRNA的稳定性增强或增加至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或超过10倍。
在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，经化学修饰的gRNA或sgRNA在细胞中表现出增加的稳定性。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，经化学修饰的gRNA或sgRNA在细胞中表现出至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、75％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％更高或增加的稳定性。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，经化学修饰的gRNA或sgRNA在细胞中表现出至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或超过10倍更高或增加的稳定性。
在一些实施方案中，经化学修饰的gRNA或sgRNA的稳定性通过gRNA或sgRNA在细胞中的半衰期来测量。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，经化学修饰的gRNA或sgRNA在细胞中表现出增加的半衰期。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，所述gRNA或sgRNA在细胞中表现出至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、75％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％增加的半衰期。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，所述gRNA或sgRNA在细胞中表现出约20％至约300％、约50％至约300％、约100％至约300％、约150％至约300％、约20％至约50％、约20％至约100％、约20％至约150％、约20％至约200％、约20％至约250％、约50％至约100％、约50％至约150％、约50％至约200％、约50％至约250％、约100％至约150％、约100％至约200％、约100％至约250％、约150％至约200％、约150％至约250％、约200％至约250％、至少约20％、至少约50％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％或至少约300％增加的半衰期。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，所述gRNA或sgRNA在细胞中表现出至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或超过10倍增加的半衰期。
与未修饰的gRNA或sgRNA相比，本公开内容的gRNA或sgRNA可以是更耐降解的。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以是至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、75％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％更耐降解的。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以是约20％至约300％、约50％至约300％、约100％至约300％、约150％至约300％、约20％至约50％、约20％至约100％、约20％至约150％、约20％至约200％、约20％至约250％、约50％至约100％、约50％至约150％、约50％至约200％、约50％至约250％、约100％至约150％、约100％至约200％、约100％至约250％、约150％至约200％、约150％至约250％、约200％至约250％、至少约20％、至少约50％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％或至少约300％更耐降解的。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以是约20％至约300％、约50％至约300％、约100％至约300％、约150％至约300％、约20％至约50％、约20％至约100％、约20％至约150％、约20％至约200％、约20％至约250％、约50％至约100％、约50％至约150％、约50％至约200％、约50％至约250％、约100％至约150％、约100％至约200％、约100％至约250％、约150％至约200％、约150％至约250％、约200％至约250％、至少约20％、至少约50％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％或至少约300％更耐降解的。在一些实施方案中，与未修饰的gRNA或sgRNA相比，本公开内容的经化学修饰的gRNA或sgRNA可以是至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或超过10倍更耐降解的。
靶基因修饰
在一些方面，本文提供了一种用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法，所述方法包括向所述对象施用包含本文所述的经化学修饰的gRNA或sgRNA的组合物或脂质纳米颗粒，其中所述gRNA或sgRNA引导碱基编辑器蛋白以在对象的细胞中的靶多核苷酸序列中实现修饰，从而治疗或预防所述病症。在一些实施方案中，所述靶多核苷酸是在PCSK9基因中。在一些实施方案中，所述靶多核苷酸是在ANGPTL3基因中。在一些实施方案中，所述修饰是在靶多核苷酸的剪接位点处。在一些实施方案中，所述修饰是在靶多核苷酸的剪接供体位点处。在一些实施方案中，所述修饰是在靶多核苷酸的剪接受体位点处。在一些实施方案中，所述修饰减少了对象中由PCSK9基因编码的功能性PCSK9蛋白的表达。在一些实施方案中，所述修饰减少了对象中由ANGPTL3基因编码的功能性ANGPTL3蛋白的表达。在一些实施方案中，所述病症是动脉粥样硬化性血管疾病。在一些实施方案中，所述病症是动脉粥样硬化性血管疾病、高甘油三酯血症或糖尿病。在一些实施方案中，与所述施用之前相比，对象表现出降低的血液LDL胆固醇水平和/或降低的血液甘油三酯水平。
在一些实施方案中，本公开内容提供了碱基编辑系统、组合物和方法，其用于编辑编码载脂蛋白C3(APOC3)蛋白及其变体的多核苷酸。在一些实施方案中，本文提供了基因组/碱基编辑系统、组合物和方法，其用于编辑编码前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)及其变体的多核苷酸。在一些实施方案中，本文提供了基因组/碱基编辑系统、组合物和方法，其用于编辑编码血管生成素样3(ANGPTL3)及其变体的多核苷酸。为了编辑靶基因，靶基因多核苷酸可以接触本文公开的包含sgRNA和腺苷碱基编辑器蛋白的组合物，其中所述sgRNA包含间隔子序列和tracrRNA序列，其中所述间隔子序列与PCSK9或ANGPTL3基因中的靶多核苷酸序列杂交，并且所述tracrRNA序列结合腺苷碱基编辑器蛋白(例如，腺苷碱基编辑器的Cas9组分)。因此，在一些实施方案中，sgRNA将碱基编辑器蛋白引导至靶多核苷酸序列，以在靶基因中产生a至G修饰。在一些实施方案中，靶基因或靶多核苷酸选自编码PCSK9、APOC3、LPA和ANGPTL3的基因。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是在PCSK9基因中。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是在ANGPTL3基因中。在一些实施方案中，所述修饰减少或消除了细胞中由PCSK9基因编码的功能性PCSK9蛋白的表达。在一些实施方案中，所述修饰减少或消除了细胞中由ANGPTL3基因编码的功能性ANGPTL3蛋白的表达。在一些实施方案中，所述引入经由包含组合物的脂质纳米颗粒进行。
例如，sgRNA和腺苷碱基编辑器蛋白可以在需要靶基因编辑的细胞(例如，肝脏细胞)中表达，从而允许靶基因与本文公开的组合物(例如，sgRNA和腺苷碱基编辑器蛋白)接触。在一些实施方案中，腺苷碱基编辑器蛋白与其在靶基因中的靶多核苷酸序列的结合由本文公开的单指导RNA(例如，包含(i)间隔子序列和(ii)tracrRNA序列的单指导RNA)引导，其中所述间隔子序列与靶基因中的靶多核苷酸序列杂交。因此，通过设计指导RNA序列，可以引导腺苷碱基编辑器蛋白以编辑靶基因(例如，编码PCSK9、APOC3和ANGPTL3的靶基因)中的任何靶多核苷酸序列。在一些实施方案中，指导RNA序列在需要编辑的细胞中与腺苷碱基编辑器蛋白共表达。
在一些实施方案中，设想包含超过一个本文所述的突变的靶基因。例如，编码变体蛋白的靶基因可以使用本文所述的方法产生，所述靶基因包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个突变。为了在靶基因中产生多个突变，可以使用多个指导RNA序列，每个指导RNA序列靶向靶基因中的一个靶多核苷酸序列。腺苷碱基编辑器蛋白能够编辑由指导RNA序列决定的每一个靶多核苷酸序列。例如，可以在基因编辑反应中使用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个指导RNA序列。在一些实施方案中，使用指导RNA序列(例如，gRNA)。在一些实施方案中，也可以使用编码指导RNA序列的DNA分子。
在一些实施方案中，本文还设想同时在超过一个靶基因(例如，在LDL介导的胆固醇清除途径中多于一个靶基因)中进行修饰。例如，在一些实施方案中，可以将修饰同时引入PCSK9和APOC3基因中。在一些实施方案中，可以将修饰同时引入PCSK9和LDL-R基因中。在一些实施方案中，可以将修饰同时引入PCSK9和IODL基因中。在一些实施方案中，可以将修饰同时引入PCSK9和LPA基因中。在一些实施方案中，可以将修饰同时引入APOC3和IODL基因中。在一些实施方案中，可以将修饰同时引入LDL-R和APOC3基因中。在一些实施方案中，可以将修饰同时引入LDL-R和IDOL基因中。在一些实施方案中，可以将修饰同时引入PCSK9、APOC3、LDL-R和IDOL基因中。在一些实施方案中，可以将修饰同时引入PCSK9和ANGPTL3基因中。为了将修饰同时引入多于一个靶基因中，使用了多个指导核苷酸序列。
为了编辑编码PCSK9或ANGPTL3蛋白的基因，将所述基因与本文所述的组合物接触。在一些实施方案中，将靶基因中的靶多核苷酸序列与本文公开的单指导RNA和腺苷碱基编辑器蛋白或编码腺苷碱基编辑器蛋白的核酸序列接触，其中所述单指导RNA引导腺苷碱基编辑器蛋白以在靶基因(例如，编码PCSK9、APOC3和ANGPTL3的靶基因)中实现修饰。在一些实施方案中，所述靶多核苷酸序列是细胞的基因组DNA中的基因基因组。在一些实施方案中，所述细胞是培养的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是体内细胞。在一些实施方案中，所述细胞是体外细胞。在一些实施方案中，所述细胞是离体细胞。
在一些实施方案中，所述细胞来自哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。在一些实施方案中，所述哺乳动物是啮齿动物。在一些实施方案中，所述啮齿动物是小鼠。在一些实施方案中，所述啮齿动物是大鼠。如本领域技术人员将理解的，靶多核苷酸序列可以是包含编码链和互补链的DNA分子，例如，基因组中的PCSK9或ANGPTL3基因基因座。由此，靶多核苷酸序列还可以包含编码区(例如，外显子)和非编码区(例如，内含子或剪接位点)。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列位于靶基因(例如，PCSK9或ANGPTL3基因基因座)的编码区(例如，外显子)中。由此，编码区中的修饰可以在由靶基因编码的蛋白质中产生氨基酸变化，即突变。在一些实施方案中，所述突变是功能丧失突变。在一些实施方案中，所述功能丧失突变是天然存在的功能丧失突变。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列位于靶基因的非编码区中，例如，在内含子或剪接位点中。在一些实施方案中，本文提供的碱基编辑器系统在PCSK9基因或ANGPTL3基因中的剪接位点处产生A·T至G·C改变。在一些实施方案中，所述A·T至G·C改变是在PCSK9基因的剪接受体位点处。在一些实施方案中，所述A·T至G·C改变产生由PCSK9基因编码的异常PCSK9转录物。在一些实施方案中，所述A·T至G·C改变产生在细胞中表达时由PCSK9基因编码的非功能PCSK9多肽。在一些实施方案中，所述A·T至G·C改变是在PCSK9基因的内含子1的剪接供体位点的5’末端处。在一些实施方案中，所述A·T至G·C改变是在PCSK9基因的内含子4的剪接供体位点的5’末端处。在一些实施方案中，本文提供的碱基编辑器系统在剪接位点ANGPTL3基因处产生A·T至G·C改变，或者第二A·T至G·C改变是在ANGPTL3基因的剪接供体位点处。在一些实施方案中，所述A·T至G·C改变或第二A·T至G·C改变是在ANTPTL3基因的剪接受体位点处。在一些实施方案中，所述A·T至G·C改变或第二A·T至G·C改变产生由ANGPTL3基因编码的异常ANGPTL3转录物。在一些实施方案中，所述A·T至G·C改变或第二A·T至G·C改变产生由ANGPTL3基因编码的非功能ANGPTL3多肽。在一些实施方案中，所述A·T至G·C改变或第二A·T至G·C改变是在ANGPLT3基因的内含子6的剪接供体位点的5’末端处。
在一些实施方案中，靶多核苷酸序列位于剪接位点中，并且这种序列的编辑导致靶基因的mRNA的选择性剪接。在一些实施方案中，选择性剪接导致功能丧失突变体。在一些实施方案中，选择性剪接导致在由靶基因编码的mRNA中引入提前终止密码子，从而产生截短和不稳定的蛋白质。在一些实施方案中，产生了有折叠缺陷的突变体。与由未修饰的靶基因编码的野生型蛋白相比，由使用本文公开的组合物和方法修饰的基因生成的功能丧失变体可以具有降低的活性。活性是指本领域中野生型蛋白的任何已知的生物活性。
在一些实施方案中，功能丧失变体的活性可以降低至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少99％或更多。在一些实施方案中，与野生型蛋白相比，功能丧失变体具有不超过50％、不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％、不超过5％、不超过1％或更少的活性。
在一些实施方案中，由靶基因编码的蛋白质的细胞活性可以通过降低适当折叠的活性蛋白的水平来降低。将去稳定突变引入野生型蛋白中可以导致蛋白质的错误折叠或失活。与由未修饰的靶基因编码的野生型蛋白相比，通过使用本文公开的组合物和方法修饰靶基因生成的变体包含一个或多个去稳定突变。例如，包含一个或多个去稳定突变的变体的活性可以降低至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或更多。
在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物减少或消除了由靶基因编码的蛋白质的表达和/或功能。例如，相对于对照，本文公开的方法和组合物使由靶基因编码的蛋白质的表达和/或功能减少到至少1/3、至少1/4、至少1/5、至少1/6、至少1/7、至少1/8、至少1/9倍或至少1/10倍。
在一些实施方案中，相对于对照，本文公开的方法和组合物使由靶基因编码的蛋白质的表达和/或功能减少或消除至少2倍。例如，相对于对照，本文公开的方法和组合物使由靶基因编码的蛋白质的表达和/或功能减少到或消除到至少1/3倍、至少1/4倍、至少1/5倍、至少1/6倍、至少1/7倍、至少1/8倍、至少1/9倍或至少1/10倍。
本公开内容的一些方面提供了编辑靶基因以减少正在产生的全长功能性蛋白的量的策略。在一些实施方案中，可以将终止密码子引入正常终止密码子上游的靶基因的编码序列中(被称为“提前终止密码子”)。提前终止密码子导致提前翻译终止，进而产生截短和非功能性的蛋白质，并且经由无义介导的mRNA衰变途径诱导mRNA的快速降解。参见例如，Baker等人,Current Opinion in Cell Biology 16(3):293-299,2004；Chang等人,AnnualReview of Biochemistry 76:51-74,2007；以及Behm-Ansmant et ah,Genes&Development20(4):391-398,2006，其中的每一个通过引用并入本文。
前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶-kexin 9型(PCSK9)
在一些实施方案中，使用本文公开的组合物和方法进行修饰的靶基因是编码PCSK9的基因。前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶-kexin 9型(PCSK9)，也被称为神经细胞凋亡调节转化酶1(NARC-I)，是一种蛋白酶K样枯草杆菌酶，其被鉴定为分泌型枯草杆菌酶家族的第9个成员。“前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)”是指由PCSK9基因编码的酶。PCSK9与低密度脂蛋白(LDL)颗粒的受体结合。在肝脏中，LDL受体通过内吞途径从血液中去除LDL颗粒。当PCSK9与LDL受体结合时，受体被引导向溶酶体途径并被蛋白水解酶分解，从而限制了给定LDL受体能够从血液中摄取LDL颗粒的次数。因此，阻断PCSK9活性可以产生更多的被回收并存在于肝脏细胞表面上的LDL受体，并且将从血液中去除更多的LDL胆固醇。
因此，阻断PCSK9可以降低血液胆固醇水平。PCSK9直系同源物存在于许多物种中。PCSK9在首次合成时是无活性的，这是一种前酶原，因为肽链的一部分阻断了其活性；前蛋白转化酶去除此部分以激活酶。Pro-PCSK9是一种分泌型球状丝氨酸蛋白酶，能够将其N末端前结构域蛋白水解自动加工成PCSK9的有效内源性抑制剂，所述抑制剂阻断其催化位点。PCSK9在胆固醇体内稳态中的作用已在医学上得到利用。阻断PCSK9的药物可以降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的血液水平。前两种PCSK9抑制剂阿莫罗布单抗(alirocumab)和依洛尤单抗(evolocumab)于2015年被美国食品药品监督管理局批准用于降低他汀类药物和其他药物不足的胆固醇。
PCSK9的人基因位于人染色体Ip33-p34.3上。PCSK9在能够增殖和分化的细胞中表达，包括例如肝细胞、肾间充质细胞、肠回肠和结肠上皮以及胚胎脑端脑神经元。参见例如，Seidah等人,2003PNAS 100:928-933，所述文献通过引用并入本文。
原始合成的PCSK9呈72-kDa的无活性酶前体或酶原的形式，其在内质网(ER)中经历自催化分子内加工以激活其功能。据报告，此内部加工事件发生在SSVFAQ jSIP基序处，并且已报告为从ER离开的要求。“j”指示切割位点。参见，Benjannet等人,2004J.Biol.Chem.279:48865-48875和Seidah等人,2003PNAS 100:928-933，其中的每一个通过引用并入本文。然后经切割的蛋白质被分泌。切割的肽保持与激活和分泌的酶缔合。
人PCSK9的基因序列的长度为～22-kb，具有12个编码692个氨基酸蛋白的外显子。人PCSK9的蛋白质序列可以在例如保藏号NP_777596.2中找到，所述序列以其整体并入本文。人、小鼠和大鼠PCSK9核酸序列已经被保藏；分别参见例如，GenBank登录号：AX127530(以及AX207686)、AX207688和AX207690，所述序列中的每一个以其整体并入本文。食蟹猕猴的基因序列可以公开地在例如NCBI基因ID：102142788中找到，所述序列以其整体并入本文。食蟹猕猴前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型同种型X2序列可以公开地在例如NCBI参考序列：XP_005543317.1中找到，所述序列以其整体并入本文。
翻译的蛋白质在NH2末端含有信号肽，并且在细胞和组织中在内质网中发现了约74kDa的全长蛋白的酶原(前体)形式。在细胞中的初始加工过程中，约14kDa的前结构域肽被自催化切割以产生成熟的约60kDa蛋白，所述蛋白质含有催化结构域和C末端结构域，经常被称为富含半胱氨酸-组氨酸的结构域(CHRD)。此约60kDa的PCSK9形式从肝脏细胞中分泌。分泌形式的PCSK9似乎是生理活性物种，尽管尚未排除约60kDa形式的细胞内功能作用。
多种PCSK9变体在若干专利公布中公开和/或要求保护，包括但不限于以下：PCT公布号WO2001031007、WO2001057081、WO2002014358、WO2001098468、WO2002102993、WO2002102994、WO2002046383、WO2002090526、WO2001077137和WO2001034768；美国公布号US 2004/0009553和US 2003/0119038，以及欧洲公布号EP 1 440 981、EP 1 067 182和EP1 471 152，其中的每一个通过引用并入本文。
良好地特征了PCSK9的若干突变体形式，包括S 127R、N157K、F216L、R218S和D374Y，其中S 127R、F216L和D374Y与常染色体显性遗传性高胆固醇血症(ADH)相关联。Benjannet等人(J.Biol.Chem.,279(47):48865-48875(2004))证明了S 127R和D374Y突变导致ER中加工的pro-PCSK9水平显著降低，以形成活性分泌型酶原。因此，据信野生型PCSK9增加LDL受体的周转率，从而导致LDL清除被抑制(Maxwell等人,PNAS,102(6):2069-2074(2005)；Benjannet等人，和Lalanne等人)，而PCSK9常染色体显性突变导致LDLR水平增加、循环LDL清除增加以及血浆胆固醇水平对应地降低。参见，Rashid等人,PNAS,102(15):5374-5379(2005)；Abifadel等人,2003Nature Genetics 34:154-156；Timms等人,2004Hum.Genet.114:349-353；以及Leren,2004Clin.Genet.65:419-422，其中的每一个通过引用并入本文。
据Abifadel等人后来公布的关于S127R突变的研究报告，携带这种突变的患者在血浆中表现出较高的总胆固醇和apoB 100，这是由于(1)含有apoB l00的脂蛋白的过量产生，诸如低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)和中密度脂蛋白(IDL)，以及(2)所述脂蛋白的清除或转化的相关减少。总之，以上引用的研究证明了PCSK9在LDL产生的调节中发挥作用的事实。PCSK9的表达或上调与血浆LDL胆固醇水平增加相关联，并且PCSK9表达的抑制或缺乏与低LDL胆固醇血浆水平相关联。重要的是，与PCSK9中的序列变化相关联的较低水平的LDL胆固醇可预防冠心病；Cohen等人,2006N.Engl.J.Med.354:1264-1272。
Lalanne等人证明了在PCSK9中携带S 127R突变的两名患者中，LDL分解代谢受损，并且含有载脂蛋白B的脂蛋白合成增强(J.Lipid Research,46:1312-1319(2005))。Sun等人还提供了证据，证明PCSK9的突变体形式也是异常严重的显性高胆固醇血症的原因，这是其增加载脂蛋白B分泌的作用的结果(Sun等人,Hum.Mol.Genet,14(9):1161-1169(2005))。这些结果与较早的结果一致，所述结果证明了腺病毒介导的PCSK9在小鼠中的过表达导致严重的高胆固醇血症，这是由于LDL受体量急剧减少，Dubuc等人,Thromb.Vase.Biol.,24:1454-1459(2004)，除此之外有结果证明了PCSK9的突变体形式也降低LDL受体的水平(Park等人,J.Biol.Chem.,279:50630-50638(2004)。PCSK9在小鼠的细胞系(包括肝源细胞)和肝脏中的体内过表达导致LDLR蛋白水平和LDLR功能活性明显降低，而LDLR mRNA水平没有变化(Maxwell等人,Proc.Nat.Amer.Set,101:7100-7105(2004)；Benjannet S.等人,J.Bio.Chem.279:48865-48875(2004))。
已经提出了抑制PSCK9的各种治疗方法，包括：通过基因沉默剂(例如，RNAi)抑制PSCK9合成；通过单克隆抗体、小肽或adnectin抑制PCSK9与LDLR的结合；以及通过小分子抑制剂抑制PCSK9自催化加工。这些策略描述于以下中：Hedrick等人,Curr Opin InvestigDrugs 2009；10:938-46；Hooper等人,Expert Opin Biol Ther,2013；13:429-35；Rhainds等人,Clin Lipid,2012；7:621-40；Seidah等人；,Expert Opin Ther Targets 2009；13:19-28；以及Seidah等人,Nat Rev Drug Discov 2012；11:367-83，其中的每一个通过引用并入本文。
在一些实施方案中，在PCSK9中诱导了功能丧失突变，例如G106R、L253F、A443T、R93C等。在一些实施方案中，功能丧失突变是工程化的(即，不是天然存在的)，例如G24D、S47F、R46H、S 153N、H193Y等。
可以用于本公开内容的PCSK9变体是功能丧失变体，其可以单独或与所述途径涉及的其他基因(例如，APOC3、LDL-R或Idol)结合来加强LDL受体介导的LDL胆固醇清除。在一些实施方案中，使用本公开内容的方法产生的PCSK9功能丧失变体在细胞中有效地表达。在一些实施方案中，使用本公开内容的方法产生的PCKS9功能丧失变体被激活并输出，以在旁分泌机制中与来自未修饰细胞的网格蛋白包被小窝接合，从而与野生型PCSK9蛋白竞争。在一些实施方案中，PCSK9功能丧失变体包含LDL-R键合区中与LDL-R蛋白直接接触的残基的突变。在一些实施方案中，LDL-R键合区中与LDL-R蛋白直接接触的残基选自R194、R237、F379、S372、D374、D375、D378、R46、R237和A443。
如本文所述，与野生型PCSK9蛋白相比，功能丧失PCSK9变体可以具有降低的活性。PCSK9活性是指本领域中PCSK9蛋白的任何已知的生物活性。例如，在一些实施方案中，PCSK9活性是指其蛋白酶活性。在一些实施方案中，PCSK9活性是指其通过细胞分泌途径分泌的能力。在一些实施方案中，PCSK9活性是指其在网格蛋白包被囊泡中充当蛋白质结合衔接子的能力。在一些实施方案中，PCSK9活性是指其与LDL受体相互作用的能力。在一些实施方案中，PCSK9活性是指其防止LDL受体循环的能力。这些实例并不意味着具有限制性。
在一些实施方案中，功能丧失PCSK9变体的活性可以降低至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少99％或更多。在一些实施方案中，与野生型PCSK9蛋白相比，功能丧失PCSK9变体具有不超过50％、不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％、不超过5％、不超过1％或更少的活性。用于确定PCSK9活性的非限制示例性测定已经描述于例如美国专利申请公布US20120082680中，所述专利申请通过引用并入本文。
在一些实施方案中，细胞PCSK9活性可以通过降低适当折叠的活性PCSK9蛋白的水平来降低。将去稳定突变引入野生型PCSK9蛋白中可以导致蛋白质的错误折叠或失活。与野生型PCSK9蛋白相比，包含本文所述的一个或多个去稳定突变的PCSK9变体可以具有降低的活性。例如，包含本文所述的一个或多个去稳定突变的PCSK9变体的活性可以降低至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或更多。
在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物减少或消除了由靶基因编码的蛋白质的表达和/或其功能。例如，相对于对照，本文公开的方法和组合物使由PCSK9基因编码的PCSK9蛋白的表达和/或功能减少到至少1/3、至少1/4、至少1/5、至少1/6、至少1/7、至少1/8、至少1/9或至少1/10。例如，相对于对照，本文公开的方法和组合物使由APOC3基因编码的APOC3蛋白的表达和/或功能减少到至少1/3、至少1/4、至少1/5、至少1/6、至少1/7、至少1/8、至少1/9或至少1/10。例如，相对于对照，本文公开的方法和组合物使由ANGPTL3基因编码的ANGPTL3蛋白的表达和/或功能减少到至少1/3、至少1/4、至少1/5、至少1/6、至少1/7、至少1/8、至少1/9或至少1/10。
在一些实施方案中，本文公开的基因修饰方法和组合物使细胞中由PCSK9基因编码的功能性PCSK9蛋白的表达减少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或100％。在一些实施方案中，所述修饰使细胞中由PCSK9基因编码的功能性PCSK9蛋白的表达减少到至少1/2、至少1/3、至少1/4、至少1/5、至少1/10、至少1/20、至少1/25、至少1/30、至少1/40、至少1/50、至少1/60、至少1/70、至少1/80、至少1/90、至少1/100、至少1/200、至少1/300、至少1/400、至少1/500、至少1/600、至少1/700、至少1/800、至少1/900、至少1/1000、至少1/2000、至少1/3000、至少1/4000、至少1/5000、至少1/6000、至少1/7000、至少1/8000、至少1/9000或至少1/10000。在一些实施方案中，所述修饰消除了细胞中由PCSK9基因编码的功能性PCSK9蛋白的表达。
本公开内容的一些方面提供了经由防止PCSK9 mRNA成熟和产生来降低细胞PCSK9活性的策略。在一些实施方案中，此类策略涉及改变PCSK9基因剪接位点。改变的剪接位点可以导致PCSK9mRNA的剪接和成熟改变。例如，在一些实施方案中，改变的剪接位点可以导致外显子的跳跃，进而产生截短的蛋白质产物或改变的阅读框。在一些实施方案中，当内含子中的翻译核糖体遇到框内终止密码子时，改变的剪接位点可以导致内含子序列的翻译和提前翻译终止。在一些实施方案中，起始密码子被编辑并且蛋白质翻译在下一个ATG密码子处启动，所述密码子可能不在正确的编码框中。
剪接位点通常包括内含子供体位点、套索分支点和内含子受体位点。剪接机制是本领域的技术人员熟悉的。作为非限制性实例，内含子供体位点具有GGGTRAGT的共有序列，并且内含子供体位点共有序列中与G碱基配对的C碱基可以通过本文所述的方法和组合物靶向，从而改变内含子供体位点。套索分支点也具有共有序列，例如YTRAC，其中Y是嘧啶并且R是嘌呤。套索分支点共有序列中的C碱基可以通过本文所述的核碱基编辑器靶向，从而导致以下外显子的跳跃。内含子受体位点具有YNCAGG的共有序列，其中Y是嘧啶并且N是任何核苷酸。内含子受体位点的共有序列的C碱基和内含子受体位点的共有序列中与G碱基配对的C碱基可以通过本文所述的核碱基编辑器靶向，从而改变内含子受体位点，进而导致外显子的跳跃。如本文所述，人PCSK9的基因序列的长度是-22-kb，并且含有12个外显子和11个内含子。每个外显子-内含子连接都可以被改变以破坏PCSK9 mRNA的加工和成熟。
在一些实施方案中，由本文公开的碱基编辑器系统生成的剪接位点破坏可以导致在由PCSK9基因编码的信使RNA(mRNA)中包含内含子序列。在一些实施方案中，剪接位点破坏生成无义、移码或框内插入缺失突变，其导致提前终止密码子或破坏蛋白质活性的氨基酸的插入/缺失。在一些实施方案中，剪接位点破坏导致排除外显子序列。在一些实施方案中，剪接位点破坏导致排除外显子序列，这在PCSK9转录物中产生无义、移码或框内插入缺失突变。典型剪接供体在有义链上包含DNA序列GT，而典型剪接受体包含DNA序列AG。改变所述序列破坏正常剪接。剪接供体可以通过反义链中第二位置的互补碱基的腺嘌呤碱基编辑(GT至GC)来破坏，并且剪接受体可以通过有义链中第一位置的腺嘌呤碱基编辑(AG至GG)来破坏。
此外，本公开内容还设想使用去稳定突变来抵消功能获得型PCSK9变体的影响。本领域已经描述了功能获得型PCSK9变体(例如，功能获得型变体)并且发现其与高胆固醇血症相关联(例如，在以下中：Peterson等人,J Lipid Res.2008年6月；49(6):1152-1156；Benjannet等人,J Biol Chem.2012年9月28日；287(40):33745-55；Abifadel等人,Atherosclerosis.2012年8月；223(2):394-400；以及Cameron等人,Hum.Mol.Genet.(2006年5月1日)15(9):1551-1558，其中的每一个通过引用并入本文)。将去稳定突变引入这些功能获得型PCSK9变体中可以导致这些功能获得型变体的错误折叠和失活，从而抵消由功能获得型突变导致的过度活性。此外，LDL-R介导的胆固醇清除途径中若干其他关键因子(例如，LDL-R、APOB或APOC)的功能获得型突变也已经在本领域中有所描述。因此，使用本文所述的组合物和方法在这些因子中产生去稳定突变以抵消功能获得型突变的有害影响，也在本公开内容的范围之内。由此，本公开内容还提供了导致PCSK9蛋白的错误折叠或PCSK9蛋白的结构去稳定的突变。
PCSK9和人类家族来源的其他成员以及许多动物的成员的多肽和编码核酸序列例如从NCBI网站或ENSEMBL网站是公开可用的。实例包括但不限于以下序列，所述序列中的每一个以其整体并入本文；
野生型PCSK9基因(NG_009061.1)，智人前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)，第1号染色体上的RefSeqGene(LRG_275)GTCCGATGGGGCTCTGGTGGCGTGATCTGCGCGCCCCAGGCGTCAAGCACCCACACCCTAGAAGGTTTCCGCAGCGACGTCGAGGCGCTCATGGTTGCAGGCGGGCGCCGCCGTTCAGTTCAGGGTCTGAGCCTGGAGGAGTGAGCCAGGCAGTGAGACTGGCTCGGGCGGGCCGGGACGCGTCGTTGCAGCAGCGGCTCCCAGCTCCCAGCCAGGATTCCGCGCGCCCCTTCACGCGCCCTGCTCCTGAACTTCAGCTCCTGCACAGTCCTCCCCACCGCAAGGCTCAAGGCGCCGCCGGCGTGGACCGCGCACGGCCTCTAGGTCTCCTCGCCAGGACAGCAACCTCTCCCCTGGCCCTCATGGGCACCGTCAGCTCCAGGCGGTCCTGGTGGCCGCTGCCACTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTCCTGGGTCCCGCGGGCGCCCGTGCGCAGGAGGACGAGGACGGCGACTACGAGGAGCTGGTGCTAGCCTTGCGTTCCGAGGAGGACGGCCTGGCCGAAGCACCCGAGCACGGAACCACAGCCACCTTCCACCGCTGCGCCAAGGTGCGGGTGTAGGGATGGGAGGCCGGGGCGAACCCGCAGCCGGGACGGTGCGGTGCTGTTTCCTCTCGGGCCTCAGTTTCCCCCCATGTAAGAGAGGAAGTGGAGTGCAGGTCGCCGAGGGCTCTTCGCTTGGCACGATCTTGGGGACTGCAGGCAAGGCGGCGGGGGAGGACGGGTAGTGGGGAGCACGGTGGAGAGCGGGGACGGCCGGCTCTTTGGGGACTTGCTGGGGCGTGCGGCTGCGCTATTCAGTGGGAAGGTTCGCGGGGTTGGGAGACCCGGAGGCCGAGGAAGGGCGAGCAGAGCACTGCCAGGATATCCTGCCCAGATTTCCCAGTTTCTGCCTCGCCGCGGCACAGGTGGGTGAAGGAGTGAATGCCTGGAACGTACTGGGAACTGCACCAGGCACAGAGAAAGCGGGCTTGCCATTATAGTGGGTTCCGATTTGGTTTGGAAAACATGGGCAGCGGAGGGTGGAGGGCCTGGAGAGAAGGCCCTACCCGAGACAGGGGCGGGGTGGGAAGGACGGCAGATGCTGGGAGCACGAGGCAATTTCTTTATGACACAGAACTCATGCTCTAGTATTCCATCTGTTTCAGCCGAAGAAAAGAACCAGCTGAAGGGGCAGGGGAGAAGGGGCGGAGGTATTCTCGAGGCCCATTGGCGTCCTTTAGGACTCAGGCAGGGAAGGGCCCTTGGTGCTCTGGAGCCGGAGGTGGTGCGCCTGGTACTGGGACCCCGGAGCTGAGCCCGGCGCCTCAGCCCACCTGGCTGTCTGCCGACCGTGTGCGGGGCGAGTTTGCTCAACAACTCTGCCAGCTTCTGGCCCTCAGGCTGTGGGAAGCTTCTTCCCGGGGCGAGACCACTAGCTTTTTCTAAGTATTACCAGCCCAGGACTTGGCTGAGGTTCTGTGTCCCCCAGCTTGGAGTCAGATGTGGGGTTGAATCTTGGCTTCCTCTCACTAGCTGTGGTGCTTGACAAGTCACTTATCCTTGAGCCTCCATTGCCTAATCTTTAAAAGGGAGGTGACAATCGTCCCTACGGCTCAGTGGCAGCAGATGGGGAGATGAAGGGAAAGTTCTGTTGACCATGAGTGAACTTACAATGCAAGCCCCGGGGGGATCACTTGCAGTTTTGTCCCTGTCTGCAGTGTGACCTGTTGGTGACATTGTCTTTGCTCCAAACCACAGCTCCTGGGGCAGAGGGGAAAATTCTGCCACTCACAGCTGCCTGCCCACGCTTCTGTCTGAGTGTGCTGGGTGGCAGGATGGCAAGTCCTTACTCAGCTCAGTATAGCCCTCTTCCTTGTTCCCTGAGCCTTTGACTTTCTCGAGGGATGTTGTGGGGTTGTGGCCAGGATAAGAAAGGGCATTTCAAGTTACCACTGCTCCAAAACAACTGTTCTGGAAATAGTGAGTACCCCATCCTGAGAGGTGAGTAAGCAGAGGCTGTATGACCACCTGAACCAAGCCCTTGAGGATGTTTCTTCTCTGGTGGAAGTTTGGAACAGGAGCCTCCTCAAGTTCATTTATTCATTCATTCAATGGTTATTTTGTGGGAATCGAATTTAGAATGAAAATATTTTTTGGCAAGCAGAAAATAATTTTTAGACCAATCCTTTTCTTTTAGTCATGAGAAACTGAGGCCCAGAGAGAGGAGGTCACCCCAGGTGCATTAGAACTGGGTTTCCAGAACTGACACTCCACTGCACAGAGTACTCTCCCAATTCATTCAATTTTTATTTAGCGGAAGGCATTTTCAGATGGGTCTTTGAAGCATTAGTAGGAGTTCAGCGATGATGGTGTCATGAGAATTTTATTCTAGGATTAGGAGGTACCATGAACAAAGATACAGAGCTGGGAAAACCAGAGGTGGAAGATAAGGAGCACATGTCCACAGTTCTTTTTCTTTTTTTTTTGAGATGGAGTTTCGCTCTTGTTGCCCAGGCTGGAGTGCAATGGTGCAGTCTCAGCTCACTGCAACATCTGTCTCCCGGGTTCAAGTGGTTCTCCTGCCTCAGCCTCCCAAGAAGCTGGGATTACAGGTACCTGCCACCACGCCCGGCTAATTTTTGTATTTTTAGTAGAGAAGGGGTTTCACCACGTTGGCCAGGCTAGTCGCAAACTCCTGACCTCCTCAGTGGATCCGAGGAGGTGATCCTCCCGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTCGAATTACAGGTGTGAGCCACCACGCCTGGCCTCCACAGTTCTTTATCCACCGTCTGAAATGTAAAATGTTACGAAAACCAAAAGTTTTTTTTGTGATTTATTTGATGGTAGCACCTGACGTGAACTGACATGAGATTATTTTTAATTTAGTTGTGTGAATATGCATATTCATATATTTTGCTGCATAGATTACAGTATGCAGCTCCAGATTCTTCCAAGCAGACTCTGATTGCCCATTACTGCCTTTCTAAAATCCAAACAAGTTCTGAGGTTCAAAACCGTTTTGGCCCTAAGGCTTTGGGTAAAGGGGGTGGACTCTGTTCTACTCTGACTGGAGTCCAAGATGCATATATACAGAGATATGGGTGATGGGGCTGCAAGGTAGGTTGAGGTAGGGGCCAAGGAGGAGCATGGAGTTTGGACTTGATTCATGAGGCTGTGGGGAGCCAGTGAAGGTTCTTAAGCAGGTATGTCTGCCTGAGAGCAGTTGGAGCAGACAAGAGCTAAAAACCAAACAAATCACCATAGATAGTGGCTGCTATAATTTGTTTGTCCCCTCCAAATCTCATGTGGAAATTTGGTCCTCAGTGTTGGAAGTGGGGCCTAATGGGAGGTGTTTGGGTCATGGGGGAGGAACCCCTGTGAAAGGCTTGGTGCCGTCCTTGTGATAATGAGTAAGTTCTCCCGCTATGATTTCCCTTGAAGGCTGATTATTAAAAAGAGCTTGGCACCTCCCTCTCTTCTCTCTTGCTTCTTCTCTTGCCATGTGATTGATCTCTGCACATGTAGGCTCCCCTTCACCTTCTGCCATCAGTGAAAGCAGCTTAAGGCCCTCACCAGAAGCAGATGCTGGTGCCATGCTTCCTGGAGAGCTTGCAGAATCATGAGCTGAATAAATCCCTTTTCCTTGTAAATTACTCACCTTCAGGTATTCCTTTATATAGCAACACAAAAGGACTAAGACAGTGGCCTTGACTTTTCTCTCTCTTTAAGAAGTGTTGCCTTTGCTCACTTAGTCATCCCTTCTGCCTGCATTTGTAGAGCATCTGGATGGGAGATTTATATAACCGTCACTCTTGACTTTCCCAGCAGGCCTATGTCATAGGTACTGTGGTCTCTACAATACAGCAGAGGTATCTGAGGCTCCGAGAGGTTGAGTGACTTGCTCATGGCTGCACAACCAGTAAATATTGGAGCTGGAATTCAGGTCCACGGTTTCCTGGCTCCAAAGCCCATGATTTTTTCCCTCAATTTATTCTGACTGGGGCATGGGGGAGGGGGTGGCCTTTGGGCAGGGCCACCAGGAGCGACCAGGCCCGTAGAGAGCTGGGTGCAGGTACAGAGGAAAACCTGTTGTCGAGTGTGGCCCGTAGTTCCCATTTTTGCCTGAATGGCACATTTGAAAGTGTTATATAACCATGTGAATAATAATAGTTGGCCTATATGAGTTCTTTAATTTGCTTTTTGGTCCGCATTTGGTAACTTCTTTATCATCTACTATACTCTGTTGTGTCTCTTTTGTTGTAATTTGTAAGTAGGGGTGAGATAAAGTACACCTAGGGTTTGCTGGGTTTCTTCCATGTCATCATGTTCCTCCTTGCATGGGGCCAGGATCCGTGGAGGTTGCCTGGCACCTACGTGGTGGTGCTGAAGGAGGAGACCCACCTCTCGCAGTCAGAGCGCACTGCCCGCCGCCTGCAGGCCCAGGCTGCCCGCCGGGGATACCTCACCAAGATCCTGCATGTCTTCCATGGCCTTCTTCCTGGCTTCCTGGTGAAGATGAGTGGCGACCTGCTGGAGCTGGTGAGCCACCCTTTTTGGGAATGGCACTTCCTGATAGGGCTGGGCCACTGCATATACACTGGGGACTGTGCTTAGTAGGCCCATTGCTGAAAATCAGAAGGGGACAGCAAGTATGTATTGAGCACTTATCGGGTACCAAGCACAGTAACTACTGGCTTTCTGTATAGAATTCCCTTTAAGCCTGGCCATGCCCCAGTGGTACGTCTATCTTCATTTGAAAGACGAGGAGACTGAAGTTCAGAGGGGACCACACAGACAGCTAGGGGTAGAGCCTGGATCAAACCCATTGGTCTGCCTGCCAGCCATTCTTGTGCCAATGCATCTGCTGCCTACGGAAACCTGTAGGGACAAGGCCCTGGGATGTTCAGTGGAGCCTGAGTCATTTTATAAAAAAGCATGACTCT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CAAAGCCCATTCTAAAGCAGATTCCCATTTCCGTCTTTGACTCTAAGGCCCAAGGGGGCAAGCTGGTCTGCCGGGCCCACAACGCTTTTGGGGGTGAGGGTGTCTACGCCATTGCCAGGTGCTGCCTGCTACCCCAGGCCAACTGCAGCGTCCACACAGCTCCACCAGCTGAGGCCAGCATGGGGACCCGTGTCCACTGCCACCAACAGGGCCACGTCCTCACAGGTAGGAGGCTGGGCTTGCCCTGGGGTGAGGAGGGGTCTCTTTCTCCTTATGCACCCACTGCCCGCGAGGCTTGGTCCTCACAAGTGTGATCCATGAGACTCAAGCCTGACTTGCAGTTCCATACTCTGGTTCTGCCACTTCCATGCCCTTTGAGCCTGGGCAGGTGACCTTACTTCTCCTCATCTCAGCTTCCTCCTCCATAAGAGGGAAAAAGGTATTACCTGCCTCATTGTGTTGCAAGGAGATGGGCAGCATCTAGGGCACTGGCCTGGAGTATCGCAGGTGCTTTGCCTAAGGTGGTGCAGTCCAGGAGAGGCAGCTCCAGAGAGAGGCCCCCGGCTGGGGCTGAAAGGAGGGCAGACCTCGGTTTGAATTTCACCCTGCCGCTCTATAGCTGTGTGACTTGGGCAAATTACTTAACATCTCTGTATGAGGAAATGATGAGTGCTAAGCACTTAGCTTAGTGCCGGGACAATATAAATTCTAGCTATCGTTACTATTGTTTTCATCACCCGTTGCTTTAAAATCCAGCCTCTGGTATAGGCAACTATTGACGGGCTACCCTGTGTCGAAAACATGCCCAGGCAGGTAGCAGGAAGTCACAGATGGGGACCTCTTGGGGCATCAAGGGATGGTGCCCTGAGGCTGAGCTGTTCTGGTTGGGTGGAGCATGAGAGGTCTGGGAAGACAGTGGGACTCCAGCCTGGAATAAGAGGCTCAGAGTTGATTCTCGTCTGAGCACGTCCAGGGGAACCACTGAGGGTTTGGGAACAGGAGAGTGAGGGTGAGAACCTGGTTCTGGGCACAGCAGGCTGGCATGTAGGATGGATGTTCAGGAAAGATGAGCATAGTCAGGTGGCTGGTGCCCTTGTCCAGGGGAGAGGCTCCGTCAGGTTCAGGGGTCCTGGCTTGGAGGGAAGTCCGCCATGCTCTAATCACGCTCCCCTTTGGAAGTGCTCAGCCGATGAGCTCACAGGCACATGTCAGTTTGAAGTCATGGAATCTGACTCCATGAAGCGCACCTCAAAGAGCACCATTTTGCAGCTAAGGGAACTGCAGGCTGGACATGCTGAGTGGCTGCCCCGAGCCCTTGCAGCTAGGACATAGAGAATGCTAGTAACCACAACCCTACCATGTTCAGAGCACATGCCAGGCTCCATGCTGGGGCTTCGCACGTGTCATCTTCACAGTGTCCCTGTGAGTAGGTGTGGTTTCTCTTTCCATCTTACAAATGAGTAAACAGAGCCTCAGTGTAGCTAAGTAACCACTATTTTAGGTTTCTTAGCCAATGGGTGTGTCTGACTCCTAAGCCCATGGAGGGCATTCTGAGGTGGTTCAGACAGACCCCGGCTTACCCTTGAACTTCTGCCTGCTGGCTGCATAGGGAGGGGCTGGGGGGAGTTTGAGCATCTCAGGCCATAGAGCCCCTGCCTCACTGTCTCCATCTCTGGGTGGAAAGATGGTGTTTTCCCTGAGAAACTAAGGCTCAGAGAGGTTGAATGGCTCTCCCAAGGTCACACAGCTGGTCAGCTGCAGAGTTGAGAACACAGGAGTCCTGGTGCTCAGGCCAGCATCTCTTTTTTTCTTTGAGTTGTTTCTAGGTTTCCTAGCTCTTGCCTCAGACCTTAAAGAGAGAGGGTCTGATGGGGATGGGCACTGGAGACGGAGCATCCCAGCATTTCACATCTGAGCTGGCTTTCCTCTGCCCCAGGCTGCAGCTCCCACTGGGAGGTGGAGGACCTTGGCACCCACAAGCCGCCTGTGCTGAGGCCACGAGGTCAGCCCAACCAGTGCGTGGGCCACAGGGAGGCCAGCATCCACGCTTCCTGCTGCCATGCCCCAGGTCTGGAATGCAAAGTCAAGGAGCATGGAATCCCGGCCCCTCAGGAGCAGGTGAAGAGGCCCGTGAGGCCGGGTGGGTGGGGTGCTGCGTGTCTCTCCTGCACAGCTTTTCTGTGTCAGTTTGTGCCACCACCATACCGCCATGCATCAGGGTGGCGGTTTGCCAGGTAGATGCTGTGGGCAGCTTCCGCCATTGTGTGGACAGCATGTATATGTGTCTCTGTGTGGCTGGGTCTGTTTTTGCTTTTGTCCAGATCAGTAAGGTTTGCTACCTGGGTACCCCACTCCACTTGGAGTAGAATGTGCATAAATATGGCATAAAGAAATGCAATATGCATGCATTTATTGATTGATCTATTTTTTTCTGAGATGGGGTCTTGCTGTGTTGCCCAGGCTGGTCTCAAATTCCTGGGCTCAAGCAATCCTCTGGTCTCAGCCTCCCCAAGTGTTGGGATTATAGGCATGAGCCGCTGCACCTGGCCTCTCTGATCTATTTAACAAACCTGCTGGGAGGGTCTCAGGGTCAGGAGCAGCACTGGGCTCTGAGGACACAGAGCTCACTCAGCCGTGACCCAGAGGGGGTGCCTGAGCTGCATGCTGAAGGTTGTTAGCATGACCAGCAAGGCAAGAAAAGGCCCTGCCGAGATTAGCAAGGCATGTGCCAAGCCCTGGAATGTGACAGCCGGGCCTTCTAGAAACCTGAGTGTATAACTCTCCTTAAAAGCCAGTAGGAGCTCCTCAAAAGGCAGCCCTAAGGAGTCCACTCTTAAATGAACTCAGAGTCAGTTTTAAAATGCAAGTCTGTGTTGATTCTGGTCTGGATGGTGCATTCCTCGAGAGCAAAAGACAGTCTTGGTCTTGGATCCACTTGCCCTGGGTACACTGAGGGCTGCTAGGTTCCAGGTGCTCTTCCTGGCACTGGGGAGGGATACAGGCCCAAGAGACATGCTGTTCTCCCTCCTGGAGCATCTATTTTAGTGGAGGAAGACAGAAAACAAACCATTAATATAGAGTACTGAAAAGATGCGATGGAGAAAACTATAGCAAGGAAGGGAATGGGGTGGGAGAGAGGTCAGGAGAGGTCTCGCTGACAAGGTGGACGAAACAGGCCATGAGGCAGAGAACATGTTCCAGGCAAAGCAAAGGCCCCCAGGTGGGGATGTGCAGGGAGTACCAGGAAACCAGAGAGGTGGGAATAGTTATGAGATGGGGGGTGCCTCAGAGGGGACAGGGCCAAGTCAGGTGAGACCTGAGGGTCACAGTCAGCAGTGAGCTGGGGCCATGCAGGGGTCTGGCCTCAGAGGAGTGTGGTCTGGCCTGGATCTGAACCTCTCACTGTGGCCTAGCTGCTGAGCTGAGAAGAGATGACAAGGACCTTGGGCAGAAGCAGGGAGACTGGAGGGAGGCGGTGGAGGGTCCAGGCGTTGGGGCGGGGCTCAGGCTGGAGTCTGAAGGGAGCCTGCAGGCCTGGTGGGTGGATGTGGGTGGGAGAGGGGGAGGATGGCACCAAGGCTCGGGCCCCTGGACAGATGGAGTTGCCATTAAGTGGGATGGGGCAGGCTATGGGGCCATCAGTTTCAGAGGGATGAGTTTGGCACTGGCATGGTAGGCATCTGTCTATCTCCACGGCCCTCAAACCAGGCATGAAGCAGGAGCTCACGTGTTTGGTCAGCCATGGTGCAGAACCGCCTGGGTGGGAGGTGCGGGGTGGGAGATACACGGTTGTGTCCCAAATGGGCTCTGAGCCAGCGAGGGCCGTCTGCACTTTGGCCTCACAGAAGGATGTCGGAGGGAGAAATGAAGTGTGGGTGGGGGTCCCGGGCCACGCTAGACATGTGCTTTCTTTTCCTCGGGCTCTGGCAGGTGACCGTGGCCTGCGAGGAGGGCTGGACCCTGACTGGCTGCAGTGCCCTCCCTGGGACCTCCCACGTCCTGGGGGCCTACGCCGTAGACAACACGTGTGTAGTCAGGAGCCGGGACGTCAGCACTACAGGCAGCACCAGCGAAGGGGCCGTGACAGCCGTTGCCATCTGCTGCCGGAGCCGGCACCTGGCGCAGGCCTCCCAGGAGCTCCAGTGACAGCCCCATCCCAGGATGGGTGTCTGGGGAGGGTCAAGGGCTGGGGCTGAGCTTTAAAATGGTTCCGACTTGTCCCTCTCTCAGCCCTCCATGGCCTGGCACGAGGGGATGGGGATGCTTCCGCCTTTCCGGGGCTGCTGGCCTGGCCCTTGAGTGGGGCAGCCTCCTTGCCTGGAACTCACTCACTCTGGGTGCCTCCTCCCCAGGTGGAGGTGCCAGGAAGCTCCCTCCCTCACTGTGGGGCATTTCACCATTCAAACAGGTCGAGCTGTGCTCGGGTGCTGCCAGCTGCTCCCAATGTGCCGATGTCCGTGGGCAGAATGACTTTTATTGAGCTCTTGTTCCGTGCCAGGCATTCAATCCTCAGGTCTCCACCAAGGAGGCAGGATTCTTCCCATGGATAGGGGAGGGGGCGGTAGGGGCTGCAGGGACAAACATCGTTGGGGGGTGAGTGTGAAAGGTGCTGATGGCCCTCATCTCCAGCTAACTGTGGAGAAGCCCCTGGGGGCTCCCTGATTAATGGAGGCTTAGCTTTCTGGATGGCATCTAGCCAGAGGCTGGAGACAGGTGCGCCCCTGGTGGTCACAGGCTGTGCCTTGGTTTCCTGAGCCACCTTTACTCTGCTCTATGCCAGGCTGTGCTAGCAACACCCAAAGGTGGCCTGCGGGGAGCCATCACCTAGGACTGACTCGGCAGTGTGCAGTGGTGCATGCACTGTCTCAGCCAACCCGCTCCACTACCCGGCAGGGTACACATTCGCACCCCTACTTCACAGAGGAAGAAACCTGGAACCAGAGGGGGCGTGCCTGCCAAGCTCACACAGCAGGAACTGAGCCAGAAACGCAGATTGGGCTGGCTCTGAAGCCAAGCCTCTTCTTACTTCACCCGGCTGGGCTCCTCATTTTTACGGGTAACAGTGAGGCTGGGAAGGGGAACACAGACCAGGAAGCTCGGTGAGTGATGGCAGAACGATGCCTGCAGGCATGGAACTTTTTCCGTTATCACCCAGGCCTGATTCACTGGCCTGGCGGAGATGCTTCTAAGGCATGGTCGGGGGAGAGGGCCAACAACTGTCCCTCCTTGAGCACCAGCCCCACCCAAGCAAGCAGACATTTATCTTTTGGGTCTGTCCTCTCTGTTGCCTTTTTACAGCCAACTTTTCTAGACCTGTTTTGCTTTTGTAACTTGAAGATATTTATTCTGGGTTTTGTAGCATTTTTATTAATATGGTGACTTTTTAAAATAAAAACAAACAAACGTTGTCCTAAC(SEQ ID NO:5)
人PCSK9氨基酸序列(NP_777596.2)
MGTVSSRRSWWPLPLLLLLLLLLGPAGARAQEDEDGDYEELVLALRSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHLSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFENVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLLPLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSDCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHGAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAVARCAPDEELLSCSSFSRSGKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVTVACEEGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSEGAVTAVAICCRSRHLAQASQELQ(SEQ ID NO:6)
载脂蛋白C3(APOC3)
在一些实施方案中，使用本文公开的组合物和方法进行修饰的靶基因是编码APOC3的基因。LDL-R介导的胆固醇清除途径涉及多个参与者。此途径中涉及的蛋白质因子的非限制性实例包括：载脂蛋白C3(APOC3)、LDL受体(LDL-R)和LDL受体蛋白的增加降解(IDOL)。这些蛋白质因子及其相应的功能在本领域中有所描述。此外，已经确定并表征了这些因子的功能丧失变体，并确定其具有心脏保护功能。参见例如，Jorgensen等人,N Engl JMed 2014；371:32-41 2014年7月3日；Scholtzl等人,Hum.Mol.Genet.(1999)8(11):2025-2030；De Castro-Oros等人,BMC Medical Genomics,20147:17；以及Gu等人,J LipidRes.2013,54(12):3345-57，其中的每一个通过引用并入本文。因此，本公开内容的一些方面提供了使用本文公开的方法和组合物生成APOC3(例如，A43T和R19X)、LDL-R和IDOL(例如，R266X)的功能丧失变体。
载脂蛋白C-III(APOC3)是一种在人类中由APOC3基因编码的蛋白质。APOC3是极低密度脂蛋白(VLDL)的组分。APOC3抑制脂蛋白脂肪酶和肝脂肪酶。它也被认为抑制肝脏对富含甘油三酯的颗粒的摄取。APOC3水平的增加诱导高甘油三酯血症的发展。最近的证据表明，APOC3在富含脂质的条件下促进肝细胞中富含甘油三酯的VLDL颗粒的组装和分泌方面具有细胞内作用。然而，已经显示人apoC3编码序列中两个天然存在的点突变A23T和K58E可以消除肝细胞中富含甘油三酯的VLDL颗粒的细胞内组装和分泌。
还提供了使用本文所述的方法和组合物可以在APOC3基因中产生的功能丧失突变。生成功能丧失突变的策略类似于用于PCSK9或ANGPTL3的那些策略(例如，提前终止密码子、去稳定突变、改变剪接等)。
在一些实施方案中，本文所述的基因修饰方法和组合物减少了细胞中由APOC3基因编码的功能性APOC3蛋白的表达。在一些实施方案中，所述修饰使所编码的功能性APOC3蛋白的表达减少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或100％。在一些实施方案中，所述修饰使细胞中由APOC3或ANGPTL3基因编码的功能性ANGPTL3蛋白的表达减少到至少1/2、至少1/3、至少1/4、至少1/5、至少1/10、至少1/20、至少1/25、至少1/30、至少1/40、至少1/50、至少1/60、至少1/70、至少1/80、至少1/90、至少1/100、至少1/200、至少1/300、至少1/400、至少1/500、至少1/600、至少1/700、至少1/800、至少1/900、至少1/1000、至少1/2000、至少1/3000、至少1/4000、至少1/5000、至少1/6000、至少1/7000、至少1/8000、至少1/9000或至少1/10000。在一些实施方案中，所述修饰消除了细胞中由APOC3基因编码的功能性APOC3蛋白的表达。
人APOC3的蛋白质序列可以在例如保藏号NP_000031.1中找到，所述参考序列以其整体并入本文。人核酸序列可以在例如GenBank登录号：NG_008949.1中找到，所述序列以其整体并入本文。小鼠、大鼠和猴APOC3核酸序列已经被保藏；分别参见例如，Ensembl登录号ENSMUSG00000032081、ENSRNOG00000047503和ENSMFAG00000001837，所述序列中的每一个以其整体并入本文。
APOC3和人类家族来源的其他成员以及许多动物的成员的多肽和编码核酸序列例如从NCBI网站或ENSEMBL网站是公开可用的。实例包括但不限于以下序列，所述序列中的每一个以其整体并入本文；
NG_008949.1:5000-8165智人载脂蛋白C3(APOC3)，第11号染色体上的RefSeqGene
CTGCTCAGTTCATCCCTAGAGGCAGCTGCTCCAGGTAATGCCCTCTGGGGAGGGGAAAGAGGAGGGGAGGAGGATGAAGAGGGGCAAGAGGAGCTCCCTGCCCAGCCCAGCCAGCAAGCCTGGAGAAGCACTTGCTAGAGCTAAGGAAGCCTCGGAGCTGGACGGGTGCCCCCCACCCCTCATCATAACCTGAAGAACATGGAGGCCCGGGAGGGGTGTCACTTGCCCAAAGCTACACAGGGGGTGGGGCTGGAAGTGGCTCCAAGTGCAGGTTCCCCCCTCATTCTTCAGGCTTAGGGCTGGAGGAAGCCTTAGACAGCCCAGTCCTACCCCAGACAGGGAAACTGAGGCCTGGAGAGGGCCAGAAATCACCCAAAGACACACAGCATGTTGGCTGGACTGGACGGAGATCAGTCCAGACCGCAGGTGCCTTGATGTTCAGTCTGGTGGGTTTTCTGCTCCATCCCACCCACCTCCCTTTGGGCCTCGATCCCTCGCCCCTCACCAGTCCCCCTTCTGAGAGCCCGTATTAGCAGGGAGCCGGCCCCTACTCCTTCTGGCAGACCCAGCTAAGGTTCTACCTTAGGGGCCACGCCACCTCCCCAGGGAGGGGTCCAGAGGCATGGGGACCTGGGGTGCCCCTCACAGGACACTTCCTTGCAGGAACAGAGGTGCCATGCAGCCCCGGGTACTCCTTGTTGTTGCCCTCCTGGCGCTCCTGGCCTCTGCCCGTAAGCACTTGGTGGGACTGGGCTGGGGGCAGGGTGGAGGCAACTTGGGGATCCCAGTCCCAATGGGTGGTCAAGCAGGAGCCCAGGGCTCGTCCAGAGGCCGATCCACCCCACTCAGCCCTGCTCTTTCCTCAGGAGCTTCAGAGGCCGAGGATGCCTCCCTTCTCAGCTTCATGCAGGGTTACATGAAGCACGCCACCAAGACCGCCAAGGATGCACTGAGCAGCGTGCAGGAGTCCCAGGTGGCCCAGCAGGCCAGGTACACCCGCTGGCCTCCCTCCCCATCCCCCCTGCCAGCTGCCTCCATTCCCACCCGCCCCTGCCCTGGTGAGATCCCAACAATGGAATGGAGGTGCTCCAGCCTCCCCTGGGCCTGTGCCTCTTCAGCCTCCTCTTTCCTCACAGGGCCTTTGTCAGGCTGCTGCGGGAGAGATGACAGAGTTGAGACTGCATTCCTCCCAGGTCCCTCCTTTCTCCCCGGAGCAGTCCTAGGGCGTGCCGTTTTAGCCCTCATTTCCATTTTCCTTTCCTTTCCCTTTCTTTCTCTTTCTATTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCCTTTCTTTCTTTCCTTTCTTTCTTTCCTTTCTTTCTTTCTTTCCTTTCTTTCTCTTTCTTTCTTTCTTTCCTTTTTCTTTCTTTCCCTCTCTTCCTTTCTCTCTTTCTTTCTTCTTCTTTTTTTTTTAATGGAGTCTCCCTCTGTCACCTAGGCTGGAGTGCAGTGGTGCCATCTCGGCTCACTGCAACCTCCGTCTCCCGGGTTCAACCCATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGATTACAGGCACGCGCCACCACACCCAGCTAATTTTTGTATTTTTAGCAGAGATGGGGTTTCACCATGTTGGCCAGGTTGGTCTTGAATTCCTGACCTCAGGGGATCCTCCTGCCTCGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCATGAGCCACTGCGCCTGGCCCCATTTTCCTTTTCTGAAGGTCTGGCTAGAGCAGTGGTCCTCAGCCTTTTTGGCACCAGGGACCAGTTTTGTGGTGGACAATTTTTCCATGGGCCAGCGGGGATGGTTTTGGGATGAAGCTGTTCCACCTCAGATCATCAGGCATTAGATTCTCATAAGGAGCCCTCCACCTAGATCCCTGGCATGTGCAGTTCACAATAGGGTTCACACTCCTATGAGAATGTAAGGCCACTTGATCTGACAGGAGGCGGAGCTCAGGCGGTATTGCTCACTCACCCACCACTCACTTCGTGCTGTGCAGCCCGGCTCCTAACAGTCCATGGACCAGTACCTATCTATGACTTGGGGGTTGGGGACCCCTGGGCTAGGGGTTTGCCTTGGGAGGCCCCACCTGACCCAATTCAAGCCCGTGAGTGCTTCTGCTTTGTTCTAAGACCTGGGGCCAGTGTGAGCAGAAGTGTGTCCTTCCTCTCCCATCCTGCCCCTGCCCATCAGTACTCTCCTCTCCCCTACTCCCTTCTCCACCTCACCCTGACTGGCATTAGCTGGCATAGCAGAGGTGTTCATAAACATTCTTAGTCCCCAGAACCGGCTTTGGGGTAGGTGTTATTTTCTCACTTTGCAGATGAGAAAATTGAGGCTCAGAGCGATTAGGTGACCTGCCCCAGATCACACAACTAATCAATCCTCCAATGACTTTCCAAATGAGAGGCTGCCTCCCTCTGTCCTACCCTGCTCAGAGCCACCAGGTTGTGCAACTCCAGGCGGTGCTGTTTGCACAGAAAACAATGACAGCCTTGACCTTTCACATCTCCCCACCCTGTCACTTTGTGCCTCAGGCCCAGGGGCATAAACATCTGAGGTGACCTGGAGATGGCAGGGTTTGACTTGTGCTGGGGTTCCTGCAAGGATATCTCTTCTCCCAGGGTGGCAGCTGTGGGGGATTCCTGCCTGAGGTCTCAGGGCTGTCGTCCAGTGAAGTTGAGAGGGTGGTGTGGTCCTGACTGGTGTCGTCCAGTGGGGACATGGGTGTGGGTCCCATGGTTGCCTACAGAGGAGTTCTCATGCCCTGCTCTGTTGCTTCCCCTGACTGATTTAGGGGCTGGGTGACCGATGGCTTCAGTTCCCTGAAAGACTACTGGAGCACCGTTAAGGACAAGTTCTCTGAGTTCTGGGATTTGGACCCTGAGGTCAGACCAACTTCAGCCGTGGCTGCCTGAGACCTCAATACCCCAAGTCCACCTGCCTATCCATCCTGCGAGCTCCTTGGGTCCTGCAATCTCCAGGGCTGCCCCTGTAGGTTGCTTAAAAGGGACAGTATTCTCAGTGCTCTCCTACCCCACCTCATGCCTGGCCCCCCTCCAGGCATGCTGGCCTCCCAATAAAGCTGGACAAGAAGCTGCTATGA(SEQ ID NO: 62)
NP_000031.1人载脂蛋白C-III前体
MQPRVLLVVALLALLASARASEAEDASLLSFMQGYMKHATKTAKDALSSVQESQVAQQARGWVTDGFSSLKDYWSTVKDKFSEFWDLDPEVRPTSAVAA(SEQ ID NO:63)
血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)
在一些实施方案中，使用本文公开的组合物和方法进行修饰的靶基因是编码ANGPTL3的基因。ANGPTL3与疾病和病症相关联，所述疾病和病症诸如但不限于动脉硬化、动脉粥样硬化、心血管疾病、冠心病、糖尿病(Diabetes)、糖尿病(Diabetes Mellitus)、非胰岛素依赖性糖尿病、脂肪肝、胰岛素过多症、高脂血症、高甘油三酯血症、低β脂蛋白血症、炎症、胰岛素抗性、代谢性疾病、肥胖症、口腔恶性肿瘤、脂质代谢紊乱、唇和口腔癌、血脂异常、代谢综合征X、低甘油三酯血症、Opitz三角头综合征、缺血性中风、高甘油三酯血症结果、家族性低β脂蛋白血症2、家族性低β脂蛋白血症和缺血性脑血管意外。使用本文所述的任何方法编辑ANGPTL3基因可以用于治疗、预防和/或减轻本文所述的疾病和病症的症状。
ANGPTL3基因编码血管生成素样蛋白3蛋白质，所述蛋白质是人类中高密度脂蛋白(HDL)水平的决定性因素。它与血浆甘油三酯和HDL胆固醇呈正相关。ANGPTL3的活性主要在肝脏中表达。ANGPTL3与血脂异常相关联。血脂异常是一种遗传性疾病，其特征是血液中脂质水平升高，这导致发展动脉阻塞(动脉粥样硬化)。这些脂质包括血浆胆固醇、甘油三酯或高密度脂蛋白。血脂异常增加心脏病发作、中风或其他血液循环问题的风险。当前的管理包括生活方式的改变，诸如运动和饮食调整，以及使用降脂药物，诸如他汀类药物。非他汀类降脂药物包括胆汁酸螯合剂、胆固醇吸收抑制剂、用于纯合子家族性高胆固醇血症的药物、贝特类、烟酸、ω-3脂肪酸和/或组合产品。治疗选择通常取决于具体的脂质异常，尽管不同的脂质异常经常共存。儿童的治疗更具挑战性，因为饮食改变可能难以实施，并且降脂疗法尚未被证明是有效的。
还已知ANGPTL3会导致低β脂蛋白血症。
低β脂蛋白血症是是一种遗传性疾病(常染色体隐性遗传)，其影响全球1000分之1与3000分之1之间的人。低β脂蛋白血症的常见症状包括血浆LDL胆固醇或载脂蛋白B水平低于第5百分位数，这会损害身体吸收和运输脂肪的能力，并且可能导致视网膜变性、神经病变、凝血病或脂肪中脂肪的异常积聚(被称为肝脂肪变性)。在严重受影响的患者中，肝脂肪变性可能进展为慢性肝病(肝硬化)。当前对低β脂蛋白血症的治疗包括将长链脂肪酸严格限制至每天15克，以改善脂肪吸收。在患有低β脂蛋白血症的婴儿中，短暂补充中链甘油三酯可能是有效的，但必须密切监测用量以避免肝毒性。治疗低β脂蛋白血症的另一种选择是施用高剂量的维生素E以预防神经系统并发症。可替代地，如果凝血酶原时间升高提示维生素K耗竭，则补充维生素A(10,000-25,000IU/d)可能是有效的。
在一个实例中，用于本文所述的组合物和方法的靶组织是肝组织。在一个实例中，所述基因是ANGPTL3，其可以被称为血管生成素5、ANGPT5、ANG-5、血管生成素样蛋白3、血管生成素-5、FHBL2和ANL3。ANGPTL3具有lp31.3的细胞遗传学位置并且基因组坐标位于正向链上的第1号染色体上的位置62,597,487-62,606,159处。
还提供了使用本文所述的方法和组合物可以在ANGPTL3基因中产生的功能丧失突变。生成功能丧失突变的策略类似于用于PCSK9的那些策略(例如，包括但不限于提前终止密码子、去稳定突变、改变剪接等)。
在一些实施方案中，所述修饰减少了细胞中由ANGPTL3基因编码的功能性ANGPTL3蛋白的表达。在一些实施方案中，所述修饰使所编码的功能性ANGPTL3蛋白的表达减少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或100％。在一些实施方案中，所述修饰使细胞中由ANGPTL3基因编码的功能性ANGPTL3蛋白的表达减少到至少1/2、至少1/3、至少1/4、至少1/5、至少1/10、至少1/20、至少1/25、至少1/30、至少1/40、至少1/50、至少1/60、至少1/70、至少1/80、至少1/90、至少1/100、至少1/200、至少1/300、至少1/400、至少1/500、至少1/600、至少1/700、至少1/800、至少1/900、至少1/1000、至少1/2000、至少1/3000、至少1/4000、至少1/5000、至少1/6000、至少1/7000、至少1/8000、至少1/9000或至少1/10000。在一些实施方案中，所述修饰消除了细胞中由ANGPTL3基因编码的功能性ANGPTL3蛋白的表达。
在一些实施方案中，由本文公开的碱基编辑器系统生成的剪接位点破坏可以导致在由ANGPTL3基因编码的信使RNA(mRNA)中包含内含子序列。在一些实施方案中，剪接位点破坏生成无义、移码或框内插入缺失突变，其导致提前终止密码子或破坏蛋白质活性的氨基酸的插入/缺失。在一些实施方案中，剪接位点破坏导致排除外显子序列。在一些实施方案中，剪接位点破坏导致排除外显子序列，这在ANGPTL3转录物中产生无义、移码或框内插入缺失突变。典型剪接供体在有义链上包含DNA序列GT，而典型剪接受体包含DNA序列AG。改变所述序列破坏正常剪接。剪接供体可以通过反义链中第二位置的互补碱基的腺嘌呤碱基编辑(GT至GC)来破坏，并且剪接受体可以通过有义链中第一位置的腺嘌呤碱基编辑(AG至GG)来破坏。
在一些实施方案中，本文提供的碱基编辑器系统在与ANGPTL3基因接触时在ANGPTL3基因中实现A·T至G·C改变。在一些实施方案中，所述A·T至G·C改变是在ANGPTL3基因的剪接供体位点处。在一些实施方案中，所述A·T至G·C改变是在ANTPTL3基因的剪接受体位点处。在一些实施方案中，所述A·T至G·C改变产生由ANGPTL3基因编码的异常ANGPTL3转录物。在一些实施方案中，所述A·T至G·C改变产生由ANGPTL3基因编码的非功能ANGPTL3多肽。在一些实施方案中，所述A·T至G·C改变是在ANGPLT3基因的内含子6的剪接供体位点的5’末端处。
人ANGPTL3的核苷酸序列在例如NG_028169.1中提供，所述序列以其整体并入本文。人ANGPTL3的蛋白质序列在例如AAD34156.1中提供，所述序列以其整体并入本文。
小鼠、大鼠和猴ANGPTL3核酸序列已经被保藏；分别参见例如，Ensembl登录号ENSMUSG00000028553、ENSRNOG00000008638和ENSMFAG00000007083，所述序列中的每一个以其整体并入本文。
ANGPTL3和人类家族来源的其他成员以及许多动物的成员的多肽和编码核酸序列例如从NCBI网站或ENSEMBL网站是公开可用的。实例包括但不限于以下序列，所述序列中的每一个以其整体并入本文；
NG_028169.1人血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)，第1号染色体上的RefSeqGene
AATGACAAACTGAAAAAATCTATTGTTTGTTATATATATAACAAAGAATTAGTATCCACAATATGTAAATAATTCCTAAAATTAGTCAGAAAGAGACAAACTTAAAAAGAGGGTAACAAGGAGGGGAGCAAATTATGTACATAACCAGATGATTCGCAAAGACGGCAACAGAGATGGCCAGCAAAACAAACTAGATATATACTTGTCTATTAGATTTATCAACATTTTTTGCCTTTTTCATTAAAAGCATTTGTAAAAGGATATAGGAAAAGAGGAACTCTCATATACTCCTGGCAGGGATGTAAATTGGTACAACCCTTTTGAAGGACAATCTGACAAAAGCAATCGTAAGTTACAAGTCAACATCTATGAATGTATATGAAAATATTTATATACATACATCACCACCATAAAAGCATTTTCTATACATACTGTTTATAATTAGAAAATTGGAAACAAATGATTAAAAGGGGGCTGATTAAATTAAGGTTCATCTATATAACAGGATTATGCAGCTATTAAAAAGGACGTGGTAACTCTATAGACATTCATAGGAAAATAAATTTTAAAATACTAAGATCCTGAATGATATATATATCATGAGCTATTATACATAACAAGATCCCACTTGTGTTATAAAAAATTATGTTTAGTCATTCAAAGGGTCTGGTATGATAGACCCAAAATGTTAATAGAGTCGAGATTTTTATTTTTTATAGGTTTTTGAAATACCTGAATTTTCACAATAAGTACTTTGCACATTAAAAATCTTAGCTGGGCATGGTGGCTCACGCTTGTAATCCCAGCACTCTGGGAGGCCAAGGTAGGCAGATCACCTGAGGTCAGGAGTTCGAGACCAGTCTGGCCAACATGGTGAAACCCCGTCTCTACTAAAAATACAAAAATTAGCCAGGCTTGGTTGGGGGTGCCTGTAATTCCAGATACTCGGGAAGCTGAGACAGGAGAATCGCTTGAACCCAGGAGGGGGAAGTTGCAGTGAGCTGAGATCACGACGCTGCACTCCAGCCTGGGCAACAAAGAGCAAAACTCCGTCTCAAAAATAAATAAAGAAAAAATCTTTACATGTCCAAAGATACGGCTGTTCAACTAAAAAATATATATGTATAAAACTTAACATGTTAATAGTGAACACACAAAACAGTAAGATAGATAAAATTATTCCTTCAAAGCTCACTTAACCTCTGGATCTACACTGTCCAAAAAGACGGTCTAATGAGACAATTGAGCACTTGATAGGTGAGTGGTTCTAACTGAGATATGTTCTCAGTATAAAACATACAATAGGATCTTCCTATACAACATTAATTAAAAAACAAACTATTGTAGTTAAAAAGGAAAAAATTAGAGATACTATGTAAAAAAGAGCCAAAATACCTTGTATTTTATTTGAAAGACATATCTCCATAAGATTACACAACCTCGTGTAGGATAAAGGACTTTGCTTTGCTTGGAATTTAAACAATTTAGGCTCTTAAATGTCCTAAAATTCTCTGTAGCTAAGAAATTTTTATATTGGTTCCTAGGAACTAGGAATCCTTAAATTAGGCCCTACATTTGCTTACAAGTTTATTTTCCTTGGCATAAAATTTTTTAGTTTTTACATTACTGGTTATATTTGATCAGGGTTCTATTTAAATAGGCACAAGTTCAAGCAAAGATCAGATTCTGCTTTTAGCAGTGTGTACTCAGACAGGAAGTATTAAAAGGCAGGCAGAAAATCCTTTATAAAATTACTACTTTCAATGCATTTTCCCACGTTGAAATGCTTCTGCAGTTTATAATTAGGCAAATTACTTTAATTATAATCAATAATGCTGTTCAAATTACTATAAGAATTATACAGATATTTATACCAAGAGACAATATACTAGAAACCAAGACTACGTGACCATTACCTCTACTCTGTCAGTGTTATTTGTGAGAAATTGCACAAATTTTGCAAAAAGTGTTAGTATCCTACTACAGTAGGATATAATATAGAAGGAAATAATTTCATAAAGCCTGTCTTTGGTACTAGTGCTCAGTTACTTTCATTAACTAAAAAAGGGGCTACTCTTCAAATTCCCTTCTCTAAAAAGAATGTACTATATCAAAAGGGGGTAAACACTACTACGTATACATTCTGCACTTAGAAATCCCTATATGTTGATTTTATCATTCTCTTATTCAATAAATATTGTTTCTACAATGTGTAAGGCATTACTGTACTAAAGCATTATAAGGAATATAAGTTAAAAACACATACAAATCTTGCCAATCAACAGCTTATAGTGTAATAGGGGAGAGAAGCTGGCCCATCTATATTCTCCCTCAACTAGCAAGTGGATGAAATATCAGGGTCAATAGTTATAAGCCACAAAAGCTGACAGCTTAATTAAGAGAAGTTTTGAAATATGTATTTCATGACCAATAATTACAACTGTAACTTTTCTATTTAAAGAAGGAGAAAATTTGAATTTCTTCTCTAGCTCAACATACACTTCTATAATTCCATTACATGAACCAGAGTAAAGGGTAAGATGGAAATGAAGAATATTTTCTTACCCTTTTGTGGTTCTATATTGGACACTTAAAAATCATACACAACCTAATCAAAAGATGTAATTCTTTAAAAAGGTACGAGACCAAAATTCAGAAAATCTAGACTATAACAAAATTTCTCAATTTACATTATCTTAATATGCAATTAATTTTCACCAGTAAAATACTATAGTATGGGTACAAATGCATTGATTAGTTCTAATTACAAAAATGGCTAATATATAATACTGTGTAGTGTTTATGATACATCAGATAATGTTCTAAGTGCTCTGAAAATATAAACTTTTAATCTTTTATACGACCCTATAAAATAGGTGTTATTCTCACTGGAGAGATGAGAAAACAGGGGTTCAGAGATGTGAAGTAATTTGACCAAAGGTCACAAAGCTGAAGAATATGAAATCCGGGATTCTGATTCAGGCAGTCTTATTCCAGAATCATGCTCTTAACCACTATGGAATACTGCCTCTACTGTAACTATTATACCCAAAACCCTTAATCCTAAGTCATCAAAAGGAAGAGCCTCTATTTTACACAATGAAGAGGCATTTCTAAGAATAGAAATTTAGGGACGAGCACAGTGGCTTACTCCTTTAATATCAGCACTTTGAGAGGCTGATATGGGAGGTTCACTTGAAGTCAGGAGTTCAAGGTCAGCTTGGGCAACATAGTGAAACACAGTCTCTACAAAATATTTAAAAATTAGCTGGGTGTGGTGGCATGCATCTATAGTCTCAGCTACTTGGGAGACAGAGGGAGGAGGCTTGCTCGAGCCCAGGAGTTCGTGGCTATAGTGAGCTATGATCATGCCACTGCACTCCAGCCTGGACAACAGAGCAAGACCCTGTCTCTAAAAAAGAAAAGAAATTTGGAAATGGTTTATTTTGTATTAACAATTTATAATTTACACTGAAATTTATTATGATAAAACTTTTCCCTGTGTTAAAAAGCTATTAACTTTATGAAAAATTTCTTTTAGGTAAGGTTGATTATATATACCCACACACATACACAGGTTAAAAGTTAGTTTCATGTGACATAATAACTAGCATTTTGAGCACTACCTGTTTGCCCAGCACTGTTCTAAGTGCTCTACATGTATTATTGTTAAATTATCATAACACTATGAATTATGTACTATAATTACCCCAGCTTTACAGATGAGGAGACTAATCCATGGGGAGGTTAAGTAACTTGTCCAAGGCCAGACAGCTAGAGCCGGCTTTTGGACCCACACCACAGTCTGACTCCAGCACCCATATTCTTAACAATTTCACCATATTAATATGTCAAGATTAAGCAGTTTTAAAGGATGCTATTTTCTCACAAATTTCTTAATATGAACACTCAATAAGAATAATCACTAATATAAGCATTTAGTATTTTTTTAACACTAAGTTGGAAGCATAGTGGAACATTTATTTTTAGAAATATTATTAATTGGCTGGGCTCACGCTTGTAATCGGCTGGGCTCATGCCTGTAAATTTTGGGAGGCCAAGGTAAAAGAATTGCTTGAGCCCAGTATTTCCAGACCAGCATGGGCAATACATTAAGACATCATCTTTAAAAAAAAAATGTTATTAATCTCCTCTTTTTGTTAAATGTATATTATCAAAATTGTTACTAAGCTAACAAACTTCAGAAAAACTTATGATGGGCAAGCTGCTTGTGACATTGAAGGTATTTAAGATTCAATTCTAGTTTGGTCCTAGATGACCACATATCCATTGTTCCTTCAACGAGCACATGGTAAAGAGCCTAGAACACAGAGACACAGAACACAGTGGAGAAAAGGGAGTGAAATGTCTTTAATGACACTTACTATATATGGGATTTTGTGACAATATACAAGGATGGTTAAGACATATAAGGTGATGCAAAAAAACATATTAACAATTATAGTGACAAAAAATGAGGAGCATATAATTATACATTGATTTATACAGAGTACCAGAGGAACACAGCATTGAGAGCCGTAACACCACCTGAGGGAGTGGAGAAAGGCTTCAGAGAGAAAGTGTTTTTTGGAATGGATCACTGTTTCCAAAAGAACTAAAGTACAGTTTGAGAAATGCATACTTAATTCATTACTTTTTTCCCCTCAACTTTAATAATAAATTTACCCAACAAAAAAGTTTATTTTTGACTTGTAAATCTCTTAAAATCATAAAAAAGTAAAATTAGCTTTTAAAAACAGGTAGTCACCATAGCATTGAATGTGTAGTTTATAATACAGCAAAGTTAAATACAATTTCAAATTACCTATTAAGTTAGTTGCTCATTTCTTTGATTTCATTTAGCATTGATCTAACTCAATGTGGAAGAAGGTTACATTCGTGCAAGTTAACACGGCTTAATGATTAACTATGTTCACCTACCAACCTTACCTTTTCTGGGCAAATATTGGTATATATAGAGTTAAGAAGTCTAGGTCTGC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ID NO:7)
AAD34156.1人血管生成素相关蛋白3
MFTIKLLLFIVPLVISSRIDQDNSSFDSLSPEPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGHGLKDFVHKTKGQINDIFQKLNIFDQSFYDLSLQTSEIKEEEKELRRTTYKLQVKNEEVKNMSLELNSKLESLLEEKILLQQKVKYLEEQLTNLIQNQPETPEHPEVTSLKTFVEKQDNSIKDLLQTVEDQYKQLNQQHSQIKEIENQLRRTSIQEPTEISLSSKPRAPRTTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAKSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFE(SEQ ID NO:8)
脂蛋白(a)(LPA)
在一些实施方案中，使用本文公开的组合物和方法进行修饰的靶基因是编码脂蛋白a(LPA)的基因。LPA是低密度脂蛋白变体。遗传和流行病学研究已经将LPA鉴定为动脉粥样硬化和相关疾病(诸如冠心病和中风)的风险因子。LPA浓度在个体之间变化超过一千倍：从<0.2至>200mg/dL。到目前为止，在科学家研究的所有人群中都观察到了这个浓度范围。世界不同人群之间的平均值和中值浓度显示出不同的特殊性，主要是非洲人后裔人群的LPA血浆浓度是亚洲、大洋洲或欧洲人群的二至三倍高。血液中的高LPA与冠心病(CHD)、心血管疾病(CVD)、动脉粥样硬化、血栓形成和中风相关。没有LPA或具有非常低的LPA水平的人似乎是健康的。因此，血浆LPA并不重要，至少在正常环境条件下是这样。因为apo(a)/LPA最近才出现在哺乳动物进化中-只有旧世界的猴子和人类被证明携带LPA-它的功能可能并不重要，但在某些环境条件下只是进化上有利，例如在暴露于某些传染病的情况下。
以下提供了由人参考序列NG_016147.1编码的示例性LPA氨基酸序列：
>sp|P08519|APOA_人载脂蛋白(a)OS＝智人OX＝9606GN＝LPA PE＝1SV＝1
MEHKEVVLLLLLFLKSAAPEQSHVVQDCYHGDGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHQHNRTTENYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDPVAAPYCYTRDPSVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTITPIPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYQGTYFITVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPAYYPNAGLIKNYCRNPDPVAAPWCYTTDPSVRWEYCNLTRCSDAEWTAFVPPNVILAPSLEAFFEQALTEETPGVQDCYYHYGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHQHSRTPENYPNAGLTRNYCRNPDAEIRPWCYTMDPSVRWEYCNLTQCLVTESSVLATLTVVPDPSTEASSEEAPTEQSPGVQDCYHGDGQSYRGSFSTTVTGRTCQSWSSMTPHWHQRTTEYYPNGGLTRNYCRNPDAEISPWCYTMDPNVRWEYCNLTQCPVTESSVLATSTAVSEQAPTEQSPTVQDCYHGDGQSYRGSFSTTVTGRTCQSWSSMTPHWHQRTTEYYPNGGLTRNYCRNPDAEIRPWCYTMDPSVRWEYCNLTQCPVMESTLLTTPTVVPVPSTELPSEEAPTENSTGVQDCYRGDGQSYRGTLSTTITGRTCQSWSSMTPHWHRRIPLYYPNAGLTRNYCRNPDAEIRPWCYTMDPSVRWEYCNLTRCPVTESSVLTTPTVAPVPSTEAPSEQAPPEKSPVVQDCYHGDGRSYRGISSTTVTGRTCQSWSSMIPHWHQRTPENYPNAGLTENYCRNPDSGKQPWCYTTDPCVRWEYCNLTQCSETESGVLETPTVVPVPSMEAHSEAAPTEQTPVVRQCYHGNGQSYRGTFSTTVTGRTCQSWSSMTPHRHQRTPENYPNDGLTMNYCRNPDADTGPWCFTMDPSIRWEYCNLTRCSDTEGTVVAPPTVIQVPSLGPPSEQDCMFGNGKGYRGKKATTVTGTPCQEWAAQEPHRHSTFIPGTNKWAGLEKNYCRNPDGDINGPWCYTMNPRKLFDYCDIPLCASSSFDCGKPQVEPKKCPGSIVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGKHFCGGTLISPEWVLTAAHCLKKSSRPSSYKVILGAHQEVNLESHVQEIEVSRLFLEPTQADIALLKLSRPAVITDKVMPACLPSPDYMVTARTECYITGWGETQGTFGTGLLKEAQLLVIENEVCNHYKYICAEHLARGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYARVSRFVTWIEGMMRNN(SEQID NO:64)
碱基编辑器蛋白-gRNA复合物
在另一方面，本文提供了一种复合物，其包含与碱基编辑器融合蛋白，例如腺苷碱基编辑器融合蛋白复合的如本文提供的单指导RNA，其中与具有未修饰的单指导RNA和碱基编辑器蛋白的复合物相比，所述复合物具有增加的稳定性，其中稳定性通过复合物的半衰期离体或体外测量。
在一些实施方案中，与具有未修饰的单指导RNA和Cas9蛋白的复合物相比，所述复合物具有增加的稳定性。在一些实施方案中，与具有未修饰的单指导RNA和Cas9蛋白的复合物相比，所述复合物具有至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％、至少600％、至少700％、至少800％、至少900％、至少1000％、至少2000％、至少3000％、至少4000％、至少5000％、至少6000％、至少7000％、至少8000％、至少9000％、至少10000％、至少20000％、至少30000％、至少40000％、至少50000％、至少60000％、至少70000％、至少80000％、至少90000％或至少100000％增加的稳定性。在一些实施方案中，与具有未修饰的单指导RNA和Cas9蛋白的复合物相比，所述复合物具有至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍、至少900倍、至少1000倍、至少2000倍、至少3000倍、至少4000倍、至少5000倍、至少6000倍、至少7000倍、至少8000倍、至少9000倍或至少10000倍增加的稳定性。
在一些实施方案中，其中所述复合物的稳定性通过复合物的半衰期测量。在一些实施方案中，其中所述复合物的稳定性通过复合物的半衰期离体测量。在一些实施方案中，其中所述复合物的稳定性通过复合物的半衰期体外测量。
在一些实施方案中，与具有未修饰的单指导RNA和Cas9蛋白的复合物相比，所述复合物具有至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％、至少600％、至少700％、至少800％、至少900％、至少1000％、至少2000％、至少3000％、至少4000％、至少5000％、至少6000％、至少7000％、至少8000％、至少9000％、至少10000％、至少20000％、至少30000％、至少40000％、至少50000％、至少60000％、至少70000％、至少80000％、至少90000％或至少100000％增加的半衰期，其中所述复合物的半衰期离体测量。在一些实施方案中，与具有未修饰的单指导RNA和Cas9蛋白的复合物相比，所述单指导RNA表现出至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍、至少900倍、至少1000倍、至少2000倍、至少3000倍、至少4000倍、至少5000倍、至少6000倍、至少7000倍、至少8000倍、至少9000倍或至少10000倍增加的复合物半衰期，其中所述复合物的半衰期离体测量。
在一些实施方案中，与具有未修饰的单指导RNA和Cas9蛋白的复合物相比，所述复合物具有体外测量时至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％、至少600％、至少700％、至少800％、至少900％、至少1000％、至少2000％、至少3000％、至少4000％、至少5000％、至少6000％、至少7000％、至少8000％、至少9000％、至少10000％、至少20000％、至少30000％、至少40000％、至少50000％、至少60000％、至少70000％、至少80000％、至少90000％或至少100000％增加的半衰期，其中所述复合物的半衰期体外测量。在一些实施方案中，与具有未修饰的单指导RNA和Cas9蛋白的复合物相比，所述单指导RNA表现出至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍、至少900倍、至少1000倍、至少2000倍、至少3000倍、至少4000倍、至少5000倍、至少6000倍、至少7000倍、至少8000倍、至少9000倍或至少10000倍增加的复合物半衰期，其中所述复合物的半衰期体外测量。
在另一方面，本文提供了一种细胞，其包含如本文提供的复合物。在一些实施方案中，所述细胞可以是体外细胞。在一些实施方案中，所述细胞可以是离体细胞。在一些实施方案中，所述细胞可以是体内细胞。在一些实施方案中，所述细胞可以是分离细胞。
基因修饰组合物
在另一方面，本文提供了一种用于基因修饰的组合物，其包含如本文提供的单指导RNA和碱基编辑器蛋白或编码碱基编辑器蛋白的核酸序列。在一些实施方案中，所述组合物还包含载体，所述载体包含编码碱基编辑器蛋白的核酸序列。
在一些实施方案中，所述核酸序列可以是DNA、RNA或mRNA、或经修饰的核酸序列。在一些实施方案中，所述载体可以是表达载体。在一些实施方案中，所述核酸与所述载体的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，所述载体是质粒或病毒载体。
治疗剂和治疗方法
在一些方面，本文提供了一种用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，和(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸。在一些实施方案中，碱基编辑器系统包含指导多核苷酸。在一些实施方案中，碱基编辑器系统包含编码指导多核苷酸的核酸。在一些实施方案中，碱基编辑器系统包含具有可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白。在一些实施方案中，碱基编辑器系统包含核酸，所述核酸编码包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白。
在一些实施方案中，指导多核苷酸引导碱基编辑器系统在对象的ANGPTL3基因中实现核碱基改变。在一些实施方案中，指导多核苷酸引导碱基编辑器系统在对象的PCSK9基因中实现核碱基改变。
在一些实施方案中，碱基改变在对象的全部肝脏细胞的至少35％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量，从而治疗或预防对象的病症。
在一些方面，本文提供了一种用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的第一组合物，所述第一组合物包含(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，和(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，其中所述指导多核苷酸引导所述碱基编辑器系统在所述对象的PCSK9基因中实现核碱基改变，其中所述碱基改变在所述对象的全部肝脏细胞的至少35％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量；和第二组合物，所述第二组合物包含(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，和(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，其中所述指导多核苷酸引导所述碱基编辑器系统在所述对象的ANGPTL3基因中实现核碱基改变，其中所述碱基改变在所述对象的全部肝脏细胞的至少35％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
在一些实施方案中，顺序施用第一组合物和第二组合物。在一些实施方案中，施用一个或多个剂量的第一组合物，然后施用一个或多个剂量的第二组合物。在一些实施方案中，穿插施用第一组合物和第二组合物。在一些实施方案中，并行施用第一组合物和第二组合物。在一些实施方案中，施用一个或多个剂量的第一组合物和第二组合物。在一些实施方案中，施用第一组合物和第二组合物，间隔为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个小时。在一些实施方案中，施用第一组合物和第二组合物，间隔为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天。在一些实施方案中，施用第一组合物和第二组合物，间隔为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30周。
在一些实施方案中，碱基改变在对象的全部肝脏细胞的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.3％、99.5％、99.7％、99.8％或99.9％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。在一些实施方案中，碱基改变在对象的全部肝脏细胞的至多1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.3％、99.5％、99.7％、99.8％或99.9％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。在一些实施方案中，碱基改变在对象的全部肝脏细胞的1％-99.9％、2％-99.9％、3％-99.9％、4％-99.9％、5％-99.9％、6％-99.9％、7％-99.9％、8％-99.9％、9％-99.9％、10％-99.9％、15％-99.9％、20％-99.9％、25％-99.9％、30％-99.9％、35％-99.9％、40％-99.9％、45％-99.9％、50％-99.9％、55％-99.9％、60％-99.9％、65％-99.9％、70％-99.9％、75％-99.9％、80％-99.9％、85％-99.9％、90％-99.9％或95-99.9％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。在一些实施方案中，碱基改变在对象的全部肝脏细胞的1％-99.5％、1％-99％、1％-98％、1％-97％、1％-96％、1％-95％、1％-90％、1％-85％、1％-80％、1％-75％、1％-70％、1％-65％、1％-60％、1％-55％、1％-50％、1％-45％、1％-40％、1％-35％、1％-30％、1％-25％、1％-20％、1％-15％、1％-10％、1％-9％、1％-8％、1％-7％、1％-6％、1％-5％、1％-4％、1％-3％或1％-2％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。在一些实施方案中，碱基改变在对象的全部肝脏细胞的1％-90％、5％-85％、10％-80％、15％-75％、20％-70％、25％-65％、30％-60％、35％-55％或40％-50％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。在一些实施方案中，碱基改变在对象的全部肝脏细胞的100％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
在一些实施方案中，碱基改变在对象的肝细胞中发生。在一些实施方案中，碱基改变在对象的肝细胞的至少30％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。在一些实施方案中，碱基改变在对象的肝细胞中发生。在一些实施方案中，碱基改变在对象的肝细胞的至少35％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。在一些实施方案中，碱基改变在对象的肝细胞的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.3％、99.5％、99.7％、99.8％或99.9％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。在一些实施方案中，碱基改变在对象的肝细胞的至多1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.3％、99.5％、99.7％、99.8％或99.9％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。在一些实施方案中，碱基改变在对象的肝细胞的1％-99.9％、2％-99.9％、3％-99.9％、4％-99.9％、5％-99.9％、6％-99.9％、7％-99.9％、8％-99.9％、9％-99.9％、10％-99.9％、15％-99.9％、20％-99.9％、25％-99.9％、30％-99.9％、35％-99.9％、40％-99.9％、45％-99.9％、50％-99.9％、55％-99.9％、60％-99.9％、65％-99.9％、70％-99.9％、75％-99.9％、80％-99.9％、85％-99.9％、90％-99.9％或95-99.9％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。在一些实施方案中，碱基改变在对象的肝细胞的1％-99.5％、1％-99％、1％-98％、1％-97％、1％-96％、1％-95％、1％-90％、1％-85％、1％-80％、1％-75％、1％-70％、1％-65％、1％-60％、1％-55％、1％-50％、1％-45％、1％-40％、1％-35％、1％-30％、1％-25％、1％-20％、1％-15％、1％-10％、1％-9％、1％-8％、1％-7％、1％-6％、1％-5％、1％-4％、1％-3％或1％-2％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。在一些实施方案中，碱基改变在对象的肝细胞的1％-90％、5％-85％、10％-80％、15％-75％、20％-70％、25％-65％、30％-60％、35％-55％或40％-50％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。在一些实施方案中，碱基改变在对象的肝细胞的100％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
在一些实施方案中，在对象的全部肝脏细胞中发生的碱基改变通过下一代测序测量。在一些实施方案中，在对象的全部肝脏细胞中发生的碱基改变通过桑格测序测量。在一些实施方案中，在对象的肝细胞中发生的碱基改变通过下一代测序测量。在一些实施方案中，在对象的肝细胞中发生的碱基改变通过桑格测序测量。
在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括向所述对象施用(i)指导多核苷酸和(ii)编码碱基编辑器融合蛋白的核酸。在一些实施方案中，碱基编辑器系统包含指导多核苷酸。在一些实施方案中，碱基编辑器系统包含编码指导多核苷酸的核酸。
在一些实施方案中，编码碱基编辑器融合蛋白的核酸是mRNA。在一些实施方案中，在施用之后，mRNA在对象中翻译后生成碱基编辑器融合蛋白。在一些实施方案中，碱基编辑器融合蛋白在对象中形成RNP复合物。
在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法还包括施用脂质纳米颗粒(LNP)，所述脂质纳米颗粒包封指导多核苷酸或编码指导多核苷酸的核酸(i)。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法还包括施用第二LNP，所述第二LNP包封包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸(ii)。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法还包括施用LNP，所述LNP包封指导多核苷酸或编码指导多核苷酸的核酸(i)，和包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸(ii)。在一些实施方案中，LNP或第二LNP在对象中被肝脏细胞摄取后，形成了RNP复合物。
在一些实施方案中，指导多核苷酸或编码指导多核苷酸的核酸(i)和包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸(ii)的比率是按重量计约1:10至约10:1。在一些实施方案中，指导多核苷酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的比率是按重量计约1:1、1.5:1、2:1、3:1、4:1、1:1.5、1:2、1:3或1:4。在一些实施方案中，指导多核苷酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的摩尔比是约500:1至约1:500。
在一些实施方案中，指导多核苷酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的比率是按重量计约1000:1至约1:1000。在一些实施方案中，指导多核苷酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的比率是按重量计约1000:1、950:1、900:1、850:1、800:1、750:1、700:1、650:1、600:1、550:1、500:1、450:1、400:1、350:1、300:1、250:1、200:1、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、19:1、18:1、17:1、17:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2；1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1.0:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0.2:1或0.1。在一些实施方案中，指导多核苷酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的比率是按重量计约1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100、1:150、1:200、1:250、1:300、1:350、1:400、1:450、1:500、1:550、1:600、1:650、1:700、1:750、1:800、1:850、1:900、1:950或1:1000。在一些实施方案中，指导多核苷酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的比率是按重量计至少约1000:1、950:1、900:1、850:1、800:1、750:1、700:1、650:1、600:1、550:1、500:1、450:1、400:1、350:1、300:1、250:1、200:1、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、19:1、18:1、17:1、17:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2；1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1.0:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0.2:1或0.1。在一些实施方案中，指导多核苷酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的比率是按重量计至少约1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100、1:150、1:200、1:250、1:300、1:350、1:400、1:450、1:500、1:550、1:600、1:650、1:700、1:750、1:800、1:850、1:900、1:950或1:1000。在一些实施方案中，指导多核苷酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的比率是按重量计至多约1000:1、950:1、900:1、850:1、800:1、750:1、700:1、650:1、600:1、550:1、500:1、450:1、400:1、350:1、300:1、250:1、200:1、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、19:1、18:1、17:1、17:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2；1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1.0:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0.2:1或0.1。在一些实施方案中，指导多核苷酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的比率是按重量计至多约1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100、1:150、1:200、1:250、1:300、1:350、1:400、1:450、1:500、1:550、1:600、1:650、1:700、1:750、1:800、1:850、1:900、1:950或1:1000。
在一些实施方案中，指导多核苷酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的摩尔比是约10000:1至约1:10000。在一些实施方案中，指导多核苷酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的摩尔比是约10000:1、9500:1、9000:1、8500:1、8000:1、7500:1、7000:1、6500:1、6000:1、5500:1、5000:1、4500:1、4000:1、3500:1、3000:1、2500:1、2000:1、1500:1、1000:1、950:1、900:1、850:1、800:1、750:1、700:1、650:1、600:1、550:1、500:1、450:1、400:1、350:1、300:1、250:1、200:1、190:1、180:1、170:1、160:1、150:1、140:1、130:1、120:1、110:1、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、69:1、68:1、67:1、66:1、65:1、64:1、63:1、62:1、61:1、60:1、59:1、58:1、57:1、56:1、55:1、54:1、53:1、52:1、51:1、50:1、49:1、48:1、47:1、46:1、45:1、44:1、43:1、42:1、41:1、40:1、39:1、38:1、37:1、36:1、35:1、34:1、33:1、32:1、31:1、30:1、29:1、28:1、27:1、26:1、25:1、24:1、23:1、22:1、21:1、20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0.2:1或0.1:1。在一些实施方案中，指导多核苷酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的摩尔比是至少约1:10000、1:9500、1:9000、1:8500、1:8000、1:7500、1:7000、1:6500、1:6000、1:5500、1:5000、1:4500、1:4000、1:3500、1:3000、1:2500、1:2000、1:1500、1:1000、1:950、1:900、1:850、1:800、1:750、1:700、1:650、1:600、1:550、1:500、1:450、1:400、1:350、1:300、1:250、1:200、1:190、1:180、1:170、1:160、1:150、1:140、1:130、1:120、1:110、1:100、1:95、1:90、1:85、1:80、1:75、1:70、1:69、1:68、1:67、1:66、1:65、1:64、1:63、1:62、1:61、1:60、1:59、1:58、1:57、1:56、1:55、1:54、1:53、1:52、1:51、1:50、1:49、1:48、1:47、1:46、1:45、1:44、1:43、1:42、1:41、1:40、1:39、1:38、1:37、1:36、1:35、1:34、1:33、1:32、1:31、1:30、1:29、1:28、1:27、1:26、1:25、1:24、1:23、1:22、1:21、1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、1:0.9、1:0.8、1:0.7、1:0.6、1:0.5、1:0.4、1:0.3、1:0.2或1:0.1。在一些实施方案中，指导多核苷酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的摩尔比是至少约10000:1、9500:1、9000:1、8500:1、8000:1、7500:1、7000:1、6500:1、6000:1、5500:1、5000:1、4500:1、4000:1、3500:1、3000:1、2500:1、2000:1、1500:1、1000:1、950:1、900:1、850:1、800:1、750:1、700:1、650:1、600:1、550:1、500:1、450:1、400:1、350:1、300:1、250:1、200:1、190:1、180:1、170:1、160:1、150:1、140:1、130:1、120:1、110:1、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、69:1、68:1、67:1、66:1、65:1、64:1、63:1、62:1、61:1、60:1、59:1、58:1、57:1、56:1、55:1、54:1、53:1、52:1、51:1、50:1、49:1、48:1、47:1、46:1、45:1、44:1、43:1、42:1、41:1、40:1、39:1、38:1、37:1、36:1、35:1、34:1、33:1、32:1、31:1、30:1、29:1、28:1、27:1、26:1、25:1、24:1、23:1、22:1、21:1、20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0.2:1或0.1:1。在一些实施方案中，指导多核苷酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的摩尔比是至少约1:10000、1:9500、1:9000、1:8500、1:8000、1:7500、1:7000、1:6500、1:6000、1:5500、1:5000、1:4500、1:4000、1:3500、1:3000、1:2500、1:2000、1:1500、1:1000、1:950、1:900、1:850、1:800、1:750、1:700、1:650、1:600、1:550、1:500、1:450、1:400、1:350、1:300、1:250、1:200、1:190、1:180、1:170、1:160、1:150、1:140、1:130、1:120、1:110、1:100、1:95、1:90、1:85、1:80、1:75、1:70、1:69、1:68、1:67、1:66、1:65、1:64、1:63、1:62、1:61、1:60、1:59、1:58、1:57、1:56、1:55、1:54、1:53、1:52、1:51、1:50、1:49、1:48、1:47、1:46、1:45、1:44、1:43、1:42、1:41、1:40、1:39、1:38、1:37、1:36、1:35、1:34、1:33、1:32、1:31、1:30、1:29、1:28、1:27、1:26、1:25、1:24、1:23、1:22、1:21、1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、1:0.9、1:0.8、1:0.7、1:0.6、1:0.5、1:0.4、1:0.3、1:0.2或1:0.1。在一些实施方案中，指导多核苷酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的摩尔比是至多约10000:1、9500:1、9000:1、8500:1、8000:1、7500:1、7000:1、6500:1、6000:1、5500:1、5000:1、4500:1、4000:1、3500:1、3000:1、2500:1、2000:1、1500:1、1000:1、950:1、900:1、850:1、800:1、750:1、700:1、650:1、600:1、550:1、500:1、450:1、400:1、350:1、300:1、250:1、200:1、190:1、180:1、170:1、160:1、150:1、140:1、130:1、120:1、110:1、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、69:1、68:1、67:1、66:1、65:1、64:1、63:1、62:1、61:1、60:1、59:1、58:1、57:1、56:1、55:1、54:1、53:1、52:1、51:1、50:1、49:1、48:1、47:1、46:1、45:1、44:1、43:1、42:1、41:1、40:1、39:1、38:1、37:1、36:1、35:1、34:1、33:1、32:1、31:1、30:1、29:1、28:1、27:1、26:1、25:1、24:1、23:1、22:1、21:1、20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0.2:1或0.1:1。在一些实施方案中，指导多核苷酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的摩尔比是至多约1:10000、1:9500、1:9000、1:8500、1:8000、1:7500、1:7000、1:6500、1:6000、1:5500、1:5000、1:4500、1:4000、1:3500、1:3000、1:2500、1:2000、1:1500、1:1000、1:950、1:900、1:850、1:800、1:750、1:700、1:650、1:600、1:550、1:500、1:450、1:400、1:350、1:300、1:250、1:200、1:190、1:180、1:170、1:160、1:150、1:140、1:130、1:120、1:110、1:100、1:95、1:90、1:85、1:80、1:75、1:70、1:69、1:68、1:67、1:66、1:65、1:64、1:63、1:62、1:61、1:60、1:59、1:58、1:57、1:56、1:55、1:54、1:53、1:52、1:51、1:50、1:49、1:48、1:47、1:46、1:45、1:44、1:43、1:42、1:41、1:40、1:39、1:38、1:37、1:36、1:35、1:34、1:33、1:32、1:31、1:30、1:29、1:28、1:27、1:26、1:25、1:24、1:23、1:22、1:21、1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、1:0.9、1:0.8、1:0.7、1:0.6、1:0.5、1:0.4、1:0.3、1:0.2或1:0.1。
在一些实施方案中，编码指导多核苷酸的核酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的比率是按重量计约10:1至约1:10。在一些实施方案中，编码指导多核苷酸的核酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的比率是按重量计约4:1、3:1、2:1、1.5:1、1:1、1:1.5、1:2、1:3或1:4。在一些实施方案中，编码指导多核苷酸的核酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的摩尔比是约500:1至约1:500。
在一些实施方案中，编码指导多核苷酸的核酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的比率是按重量计约1000:1至约1:1000。在一些实施方案中，编码指导多核苷酸的核酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的比率是按重量计约1000:1、950:1、900:1、850:1、800:1、750:1、700:1、650:1、600:1、550:1、500:1、450:1、400:1、350:1、300:1、250:1、200:1、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、19:1、18:1、17:1、17:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2；1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1.0:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0.2:1或0.1。在一些实施方案中，编码指导多核苷酸的核酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的比率是按重量计约1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100、1:150、1:200、1:250、1:300、1:350、1:400、1:450、1:500、1:550、1:600、1:650、1:700、1:750、1:800、1:850、1:900、1:950或1:1000。在一些实施方案中，编码指导多核苷酸的核酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的比率是按重量计至少约1000:1、950:1、900:1、850:1、800:1、750:1、700:1、650:1、600:1、550:1、500:1、450:1、400:1、350:1、300:1、250:1、200:1、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、19:1、18:1、17:1、17:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2；1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1.0:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0.2:1或0.1。在一些实施方案中，编码指导多核苷酸的核酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的比率是按重量计至少约1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100、1:150、1:200、1:250、1:300、1:350、1:400、1:450、1:500、1:550、1:600、1:650、1:700、1:750、1:800、1:850、1:900、1:950或1:1000。在一些实施方案中，编码指导多核苷酸的核酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的比率是按重量计至多约1000:1、950:1、900:1、850:1、800:1、750:1、700:1、650:1、600:1、550:1、500:1、450:1、400:1、350:1、300:1、250:1、200:1、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、19:1、18:1、17:1、17:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2；1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1.0:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0.2:1或0.1。在一些实施方案中，编码指导多核苷酸的核酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的比率是按重量计至多约1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100、1:150、1:200、1:250、1:300、1:350、1:400、1:450、1:500、1:550、1:600、1:650、1:700、1:750、1:800、1:850、1:900、1:950或1:1000。
在一些实施方案中，编码指导多核苷酸的核酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的摩尔比是约10000:1至约1:10000。在一些实施方案中，编码指导多核苷酸的核酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的摩尔比是约10000:1、9500:1、9000:1、8500:1、8000:1、7500:1、7000:1、6500:1、6000:1、5500:1、5000:1、4500:1、4000:1、3500:1、3000:1、2500:1、2000:1、1500:1、1000:1、950:1、900:1、850:1、800:1、750:1、700:1、650:1、600:1、550:1、500:1、450:1、400:1、350:1、300:1、250:1、200:1、190:1、180:1、170:1、160:1、150:1、140:1、130:1、120:1、110:1、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、69:1、68:1、67:1、66:1、65:1、64:1、63:1、62:1、61:1、60:1、59:1、58:1、57:1、56:1、55:1、54:1、53:1、52:1、51:1、50:1、49:1、48:1、47:1、46:1、45:1、44:1、43:1、42:1、41:1、40:1、39:1、38:1、37:1、36:1、35:1、34:1、33:1、32:1、31:1、30:1、29:1、28:1、27:1、26:1、25:1、24:1、23:1、22:1、21:1、20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0.2:1或0.1:1。在一些实施方案中，编码指导多核苷酸的核酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的摩尔比是至少约1:10000、1:9500、1:9000、1:8500、1:8000、1:7500、1:7000、1:6500、1:6000、1:5500、1:5000、1:4500、1:4000、1:3500、1:3000、1:2500、1:2000、1:1500、1:1000、1:950、1:900、1:850、1:800、1:750、1:700、1:650、1:600、1:550、1:500、1:450、1:400、1:350、1:300、1:250、1:200、1:190、1:180、1:170、1:160、1:150、1:140、1:130、1:120、1:110、1:100、1:95、1:90、1:85、1:80、1:75、1:70、1:69、1:68、1:67、1:66、1:65、1:64、1:63、1:62、1:61、1:60、1:59、1:58、1:57、1:56、1:55、1:54、1:53、1:52、1:51、1:50、1:49、1:48、1:47、1:46、1:45、1:44、1:43、1:42、1:41、1:40、1:39、1:38、1:37、1:36、1:35、1:34、1:33、1:32、1:31、1:30、1:29、1:28、1:27、1:26、1:25、1:24、1:23、1:22、1:21、1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、1:0.9、1:0.8、1:0.7、1:0.6、1:0.5、1:0.4、1:0.3、1:0.2或1:0.1。在一些实施方案中，编码指导多核苷酸的核酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的摩尔比是至少约10000:1、9500:1、9000:1、8500:1、8000:1、7500:1、7000:1、6500:1、6000:1、5500:1、5000:1、4500:1、4000:1、3500:1、3000:1、2500:1、2000:1、1500:1、1000:1、950:1、900:1、850:1、800:1、750:1、700:1、650:1、600:1、550:1、500:1、450:1、400:1、350:1、300:1、250:1、200:1、190:1、180:1、170:1、160:1、150:1、140:1、130:1、120:1、110:1、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、69:1、68:1、67:1、66:1、65:1、64:1、63:1、62:1、61:1、60:1、59:1、58:1、57:1、56:1、55:1、54:1、53:1、52:1、51:1、50:1、49:1、48:1、47:1、46:1、45:1、44:1、43:1、42:1、41:1、40:1、39:1、38:1、37:1、36:1、35:1、34:1、33:1、32:1、31:1、30:1、29:1、28:1、27:1、26:1、25:1、24:1、23:1、22:1、21:1、20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0.2:1或0.1:1。在一些实施方案中，编码指导多核苷酸的核酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的摩尔比是至少约1:10000、1:9500、1:9000、1:8500、1:8000、1:7500、1:7000、1:6500、1:6000、1:5500、1:5000、1:4500、1:4000、1:3500、1:3000、1:2500、1:2000、1:1500、1:1000、1:950、1:900、1:850、1:800、1:750、1:700、1:650、1:600、1:550、1:500、1:450、1:400、1:350、1:300、1:250、1:200、1:190、1:180、1:170、1:160、1:150、1:140、1:130、1:120、1:110、1:100、1:95、1:90、1:85、1:80、1:75、1:70、1:69、1:68、1:67、1:66、1:65、1:64、1:63、1:62、1:61、1:60、1:59、1:58、1:57、1:56、1:55、1:54、1:53、1:52、1:51、1:50、1:49、1:48、1:47、1:46、1:45、1:44、1:43、1:42、1:41、1:40、1:39、1:38、1:37、1:36、1:35、1:34、1:33、1:32、1:31、1:30、1:29、1:28、1:27、1:26、1:25、1:24、1:23、1:22、1:21、1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、1:0.9、1:0.8、1:0.7、1:0.6、1:0.5、1:0.4、1:0.3、1:0.2或1:0.1。在一些实施方案中，编码指导多核苷酸的核酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的摩尔比是至多约10000:1、9500:1、9000:1、8500:1、8000:1、7500:1、7000:1、6500:1、6000:1、5500:1、5000:1、4500:1、4000:1、3500:1、3000:1、2500:1、2000:1、1500:1、1000:1、950:1、900:1、850:1、800:1、750:1、700:1、650:1、600:1、550:1、500:1、450:1、400:1、350:1、300:1、250:1、200:1、190:1、180:1、170:1、160:1、150:1、140:1、130:1、120:1、110:1、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、69:1、68:1、67:1、66:1、65:1、64:1、63:1、62:1、61:1、60:1、59:1、58:1、57:1、56:1、55:1、54:1、53:1、52:1、51:1、50:1、49:1、48:1、47:1、46:1、45:1、44:1、43:1、42:1、41:1、40:1、39:1、38:1、37:1、36:1、35:1、34:1、33:1、32:1、31:1、30:1、29:1、28:1、27:1、26:1、25:1、24:1、23:1、22:1、21:1、20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0.2:1或0.1:1。在一些实施方案中，编码指导多核苷酸的核酸和编码碱基编辑器融合蛋白的核酸的摩尔比是至多约1:10000、1:9500、1:9000、1:8500、1:8000、1:7500、1:7000、1:6500、1:6000、1:5500、1:5000、1:4500、1:4000、1:3500、1:3000、1:2500、1:2000、1:1500、1:1000、1:950、1:900、1:850、1:800、1:750、1:700、1:650、1:600、1:550、1:500、1:450、1:400、1:350、1:300、1:250、1:200、1:190、1:180、1:170、1:160、1:150、1:140、1:130、1:120、1:110、1:100、1:95、1:90、1:85、1:80、1:75、1:70、1:69、1:68、1:67、1:66、1:65、1:64、1:63、1:62、1:61、1:60、1:59、1:58、1:57、1:56、1:55、1:54、1:53、1:52、1:51、1:50、1:49、1:48、1:47、1:46、1:45、1:44、1:43、1:42、1:41、1:40、1:39、1:38、1:37、1:36、1:35、1:34、1:33、1:32、1:31、1:30、1:29、1:28、1:27、1:26、1:25、1:24、1:23、1:22、1:21、1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、1:0.9、1:0.8、1:0.7、1:0.6、1:0.5、1:0.4、1:0.3、1:0.2或1:0.1。
在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液PCSK9蛋白水平降低至少35%，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。
在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液PCSK9蛋白水平降低至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。
在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液PCSK9蛋白水平降低至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、90％、95％、97％、98％、99％、99.3％、99.5％、99.7％、99.8％或99.9％，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液PCSK9蛋白水平降低至多1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、90％、95％、97％、98％、99％、99.3％、99.5％、99.7％、99.8％或99.9％，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液PCSK9蛋白水平降低1％-99.9％、2％-99.9％、3％-99.9％、4％-99.9％、5％-99.9％、6％-99.9％、7％-99.9％、8％-99.9％、9％-99.9％、10％-99.9％、15％-99.9％、20％-99.9％、25％-99.9％、30％-99.9％、31％-99.9％、32％-99.9％、33％-99.9％、34％-99.9％、35％-99.9％、36％-99.9％、37％-99.9％、38％-99.9％、39％-99.9％、40％-99.9％、45％-99.9％、50％-99.9％、55％-99.9％、60％-99.9％、65％-99.9％、70％-99.9％、75％-99.9％、80％-99.9％、85％-99.9％、90％-99.9％或95-99.9％，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液PCSK9蛋白水平降低1％-99.5％、1％-99％、1％-98％、1％-97％、1％-96％、1％-95％、1％-90％、1％-85％、1％-80％、1％-79％、1％-78％、1％-77％、1％-76％、1％-75％、1％-74％、1％-73％、1％-72％、1％-71％、1％-70％、1％-65％、1％-60％、1％-55％、1％-50％、1％-45％、1％-40％、1％-39％、1％-38％、1％-37％、1％-36％、1％-35％、1％-34％、1％-33％、1％-32％、1％-31％、1％-30％、1％-25％、1％-20％、1％-15％、1％-10％、1％-9％、1％-8％、1％-7％、1％-6％、1％-5％、1％-4％、1％-3％或1％-2％，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液PCSK9蛋白水平降低1％-99.9％、5％-99.5％、10％-99％、15％-97％、20％-95％、25％-90％、30％-85％、31％-80％、32％-79％、33％-78％、34％-77％、35％-76％、36％-76％、37％-75％、38％-74％、39％-73％、40％-72％、45％-71％、50％-70％或55％-65％，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液PCSK9蛋白水平降低100％，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。
在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液PCSK9蛋白水平为至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、75％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％更少，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液PCSK9蛋白水平减少到至少1/1.1、1/1.2、1/1.3、1/1.4、1/1.5、1/1.6、1/1.7、1/1.8、1/1.9、1/2、1/2.5、1/3、1/3.5、1/4、1/4.5、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10或超过1/10，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。
在一些实施方案中，与施用之前相比对象的血液PCSK9蛋白水平的降低或血液PCSK9蛋白水平通过ELISA(酶联免疫吸附测定)测量。在一些实施方案中，与施用之前相比对象的血液PCSK9蛋白水平的降低或血液PCSK9蛋白水平通过蛋白质印迹分析测量。在一些实施方案中，与施用之前相比对象的血液PCSK9蛋白水平的降低或血液PCSK9蛋白水平通过LC-MS/MS(液相色谱-串联质谱法)测量。
在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液ANGPTL3蛋白水平降低至少35％，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。
在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液ANGPTL3蛋白水平降低至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。
在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液ANGPTL3蛋白水平降低至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、90％、95％、97％、98％、99％、99.3％、99.5％、99.7％、99.8％或99.9％，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液ANGPTL3蛋白水平降低至多1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、90％、95％、97％、98％、99％、99.3％、99.5％、99.7％、99.8％或99.9％，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液ANGPTL3蛋白水平降低1％-99.9％、2％-99.9％、3％-99.9％、4％-99.9％、5％-99.9％、6％-99.9％、7％-99.9％、8％-99.9％、9％-99.9％、10％-99.9％、15％-99.9％、20％-99.9％、25％-99.9％、30％-99.9％、31％-99.9％、32％-99.9％、33％-99.9％、34％-99.9％、35％-99.9％、36％-99.9％、37％-99.9％、38％-99.9％、39％-99.9％、40％-99.9％、45％-99.9％、50％-99.9％、55％-99.9％、60％-99.9％、65％-99.9％、70％-99.9％、75％-99.9％、80％-99.9％、85％-99.9％、90％-99.9％或95-99.9％，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液ANGPTL3蛋白水平降低1％-99.5％、1％-99％、1％-98％、1％-97％、1％-96％、1％-95％、1％-90％、1％-85％、1％-80％、1％-79％、1％-78％、1％-77％、1％-76％、1％-75％、1％-74％、1％-73％、1％-72％、1％-71％、1％-70％、1％-65％、1％-60％、1％-55％、1％-50％、1％-45％、1％-40％、1％-39％、1％-38％、1％-37％、1％-36％、1％-35％、1％-34％、1％-33％、1％-32％、1％-31％、1％-30％、1％-25％、1％-20％、1％-15％、1％-10％、1％-9％、1％-8％、1％-7％、1％-6％、1％-5％、1％-4％、1％-3％或1％-2％，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液ANGPTL3蛋白水平降低1％-99.9％、5％-99.5％、10％-99％、15％-97％、20％-95％、25％-90％、30％-85％、31％-80％、32％-79％、33％-78％、34％-77％、35％-76％、36％-76％、37％-75％、38％-74％、39％-73％、40％-72％、45％-71％、50％-70％或55％-65％，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液ANGPTL3蛋白水平降低100％，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。
在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液ANGPTL3蛋白水平为至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、75％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％更少，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液ANGPTL3蛋白水平减少到至少1/1.1、1/1.2、1/1.3、1/1.4、1/1.5、1/1.6、1/1.7、1/1.8、1/1.9、1/2、1/2.5、1/3、1/3.5、1/4、1/4.5、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10或超过1/10，如通过ELISA、蛋白质印迹或LC-MS/MS测量。
在一些实施方案中，与施用之前相比对象的血液ANGPTL3蛋白水平的降低或血液ANGPTL3蛋白水平通过ELISA(酶联免疫吸附测定)测量。在一些实施方案中，与施用之前相比对象的血液ANGPTL3蛋白水平的降低或血液ANGPTL3蛋白水平通过蛋白质印迹分析测量。在一些实施方案中，与施用之前相比对象的血液ANGPTL3蛋白水平的降低或血液ANGPTL3蛋白水平通过LC-MS/MS(液相色谱-串联质谱法)测量。
在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平降低至少35％。
在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平降低至少30％、35％、40％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平降低至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.3％、99.5％、99.7％、99.8％或99.9％。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平降低至多1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.3％、99.5％、99.7％、99.8％或99.9％。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平降低1％-99.9％、2％-99.9％、3％-99.9％、4％-99.9％、5％-99.9％、6％-99.9％、7％-99.9％、8％-99.9％、9％-99.9％、10％-99.9％、15％-99.9％、20％-99.9％、25％-99.9％、30％-99.9％、35％-99.9％、40％-99.9％、45％-99.9％、50％-99.9％、55％-99.9％、60％-99.9％、65％-99.9％、70％-99.9％、75％-99.9％、80％-99.9％、85％-99.9％、90％-99.9％或95-99.9％。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平降低1％-99.5％、1％-99％、1％-98％、1％-97％、1％-96％、1％-95％、1％-90％、1％-85％、1％-80％、1％-75％、1％-70％、1％-65％、1％-60％、1％-55％、1％-50％、1％-45％、1％-40％、1％-35％、1％-30％、1％-25％、1％-20％、1％-15％、1％-10％、1％-9％、1％-8％、1％-7％、1％-6％、1％-5％、1％-4％、1％-3％或1％-2％。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平降低1％-99.9％、5％-99.5％、10％-99％、15％-97％、20％-95％、25％-90％、30％-85％、35％-80％、40％-75％、45％-70％、50％-65％或55％-60％。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平降低100％。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平为至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、75％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％更少。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平减少到至少1/1.1、1/1.2、1/1.3、1/1.4、1/1.5、1/1.6、1/1.7、1/1.8、1/1.9、1/2、1/2.5、1/3、1/3.5、1/4、1/4.5、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10或超过1/10。
在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液甘油三酯水平降低至少35％。
在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液甘油三酯水平降低至少30％、35％、40％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液甘油三酯水平降低至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.3％、99.5％、99.7％、99.8％或99.9％。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液甘油三酯水平降低至多1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.3％、99.5％、99.7％、99.8％或99.9％。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液甘油三酯水平降低1％-99.9％、2％-99.9％、3％-99.9％、4％-99.9％、5％-99.9％、6％-99.9％、7％-99.9％、8％-99.9％、9％-99.9％、10％-99.9％、15％-99.9％、20％-99.9％、25％-99.9％、30％-99.9％、35％-99.9％、40％-99.9％、45％-99.9％、50％-99.9％、55％-99.9％、60％-99.9％、65％-99.9％、70％-99.9％、75％-99.9％、80％-99.9％、85％-99.9％、90％-99.9％或95-99.9％。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液甘油三酯水平降低1％-99.5％、1％-99％、1％-98％、1％-97％、1％-96％、1％-95％、1％-90％、1％-85％、1％-80％、1％-75％、1％-70％、1％-65％、1％-60％、1％-55％、1％-50％、1％-45％、1％-40％、1％-35％、1％-30％、1％-25％、1％-20％、1％-15％、1％-10％、1％-9％、1％-8％、1％-7％、1％-6％、1％-5％、1％-4％、1％-3％或1％-2％。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液甘油三酯水平降低1％-99.9％、5％-99.5％、10％-99％、15％-97％、20％-95％、25％-90％、30％-85％、35％-80％、40％-75％、45％-70％、50％-65％或55％-60％。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液甘油三酯水平降低100％。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液甘油三酯水平为至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、75％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％更少。在一些实施方案中，核碱基改变导致与施用之前相比，对象的血液甘油三酯水平减少到至少1/1.1、1/1.2、1/1.3、1/1.4、1/1.5、1/1.6、1/1.7、1/1.8、1/1.9、1/2、1/2.5、1/3、1/3.5、1/4、1/4.5、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10或超过1/10。
在一些实施方案中，与施用之前相比对象的血液甘油三酯水平或血液甘油三酯水平的降低通过任何标准技术测量。在一些实施方案中，与施用之前相比对象的血液低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平或血液低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平的降低通过任何标准技术测量。例如，临床分析仪仪器可以用于测量血清样品中的‘脂质组(lipid panel)’，这需要通过酶直接测量胆固醇(总C)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。针对每种分析物的特定试剂盒含有缓冲液、校准物、空白和对照。如本公开内容所用，胆固醇、甘油三酯和HDL-C可以使用特定酶促反应产物的吸光度测量进行定量。LDL-C可以间接地确定。在一些情况下，大多数循环胆固醇可以在三种主要的脂蛋白级分中找到：极低密度脂蛋白(VLDL)、LDL和HDL。在一些实施方案中，总循环胆固醇可以通过下式估计：[总C]＝[VLDL-C]+[LDL-C]+[HDL-C]。因此，LDL-C可以由总胆固醇、甘油三酯和HDL-C的测量值根据以下关系计算：[LDL-C]＝[总C]-[HDL-C]-[TG]/5，其中[TG]/5是VLDL-胆固醇的估计值。针对甘油三酯的特定试剂盒含有缓冲液、校准物、空白和对照。如本文所用，可以分析来自研究的血清样品，并且可以使用一系列偶联酶促反应来测量甘油三酯。在一些实施方案中，作为最后一个最终产物的的H2O2及其在500nm处的吸光度可以用于定量分析物，并且颜色强度与甘油三酯浓度成比例。
在一些实施方案中，所述指导多核苷酸是指导RNA。在一些实施方案中，所述指导RNA包含与ANGPTL3基因的原间隔子序列的互补链结合且具有0、1或2个错配的间隔子序列。在一些实施方案中，所述指导RNA包含与ANGPTL3基因的原间隔子序列的互补链结合且具没有错配的间隔子序列。在一些实施方案中，所述指导RNA包含与ANGPTL3基因的原间隔子序列的互补链结合且具有1个错配的间隔子序列。在一些实施方案中，所述指导RNA包含与ANGPTL3基因的原间隔子序列的互补链结合且具有2个错配的间隔子序列。在一些实施方案中，所述指导RNA包含与ANGPTL3基因的原间隔子序列的互补链结合且具有3个错配的间隔子序列。在一些实施方案中，所述指导RNA包含与ANGPTL3基因的原间隔子序列的互补链结合且具有4个错配的间隔子序列。在一些实施方案中，所述指导RNA包含与ANGPTL3基因的原间隔子序列的互补链结合且具有5个错配的间隔子序列。
在一些实施方案中，所述指导多核苷酸是指导RNA。在一些实施方案中，所述指导RNA包含与PCSK9基因的原间隔子序列的互补链结合且具有0、1或2个错配的间隔子序列。在一些实施方案中，所述指导RNA包含与PCSK9基因的原间隔子序列的互补链结合且具没有错配的间隔子序列。在一些实施方案中，所述指导RNA包含与PCSK9基因的原间隔子序列的互补链结合且具有1个错配的间隔子序列。在一些实施方案中，所述指导RNA包含与PCSK9基因的原间隔子序列的互补链结合且具有2个错配的间隔子序列。在一些实施方案中，所述指导RNA包含与PCSK9基因的原间隔子序列的互补链结合且具有3个错配的间隔子序列。在一些实施方案中，所述指导RNA包含与PCSK9基因的原间隔子序列的互补链结合且具有4个错配的间隔子序列。在一些实施方案中，所述指导RNA包含与PCSK9基因的原间隔子序列的互补链结合且具有5个错配的间隔子序列。
在一些实施方案中，核碱基改变位于对象的小于1％的全部肝脏细胞中的原间隔子序列之外，如通过净核碱基编辑测量。在一些实施方案中，核碱基改变位于对象的小于1％的肝细胞中的原间隔子序列之外，如通过净核碱基编辑测量。在一些实施方案中，核碱基改变仅位于原间隔子序列之内，如通过净核碱基编辑测量。
在一些实施方案中，核碱基改变位于对象的小于0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％、6.0％、7.0％、8.0％、9.0％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、65％、80％、85％、90％的全部肝脏细胞中的原间隔子序列之外，如通过净核碱基编辑测量。在一些实施方案中，核碱基改变位于对象的小于0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％、6.0％、7.0％、8.0％、9.0％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、65％、80％、85％、90％的肝细胞中的原间隔子序列之外，如通过净核碱基编辑测量。在一些实施方案中，核碱基改变位于对象的小于0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％、6.0％、7.0％、8.0％、9.0％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、65％、80％、85％、90％的细胞中的原间隔子序列之外，如通过净核碱基编辑测量。
在一些实施方案中，所述施用是经由静脉内输注。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括顺序施用LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码指导多核苷酸的核酸；和第二LNP，所述第二LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括并行施用LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码指导多核苷酸的核酸；和第二LNP，所述第二LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，接着施用交错剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码指导多核苷酸的核酸，间隔为1、2、3、4、5、6或7天。
在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，接着施用交错剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码指导多核苷酸的核酸，间隔为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个小时。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，接着施用交错剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码指导多核苷酸的核酸，间隔为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，接着施用交错剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码指导多核苷酸的核酸，间隔为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个月。
如本文所述的方法可以用于治疗或预防有需要的对象的病症。在一些实施方案中，所述方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸(例如，指导RNA)或编码指导多核苷酸的核酸，和(ii)碱基编辑器融合蛋白或编码碱基编辑器融合蛋白的核酸，例如编码碱基编辑器融合蛋白的mRNA。例如，所述方法可以包括施用包封(i)指导RNA和(i)编码碱基编辑器融合蛋白的mRNA的LNP。LNP可以以单剂量或以多个剂量施用。在其他实施方案中，所述方法包括施用LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码指导多核苷酸的核酸；和第二LNP，所述第二LNP包封(ii)碱基编辑器融合蛋白或编码碱基编辑器融合蛋白的核酸。LNP可以以单剂量或以多个剂量施用。
在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在1天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以1天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在1天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以2天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在1天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以3天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在1天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以4天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在1天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以5天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在1天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以6天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在1天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以7天间隔给予。
在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在2天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以1天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在2天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以2天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在2天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以3天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在2天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以4天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在2天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以5天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在2天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以6天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在2天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以7天间隔给予。
在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在3天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以1天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在3天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以2天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在3天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以3天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在3天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以4天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在3天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以5天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在3天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以6天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在3天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以7天间隔给予。
在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在4天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以1天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在4天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以2天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在4天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以3天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在4天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以4天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在4天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以5天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在4天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以6天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在4天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以7天间隔给予。
在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在5天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以1天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在5天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以2天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在5天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以3天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在5天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以4天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在5天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以5天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在5天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以6天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在5天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以7天间隔给予。
在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在6天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以1天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在6天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以2天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在6天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以3天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在6天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以4天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在6天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以5天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在6天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以6天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在6天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以7天间隔给予。
在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在7天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以1天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在7天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以2天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在7天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以3天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在7天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以4天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在7天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以5天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在7天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以6天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且在7天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且所述多个剂量以7天间隔给予。
在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在1天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以1天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在1天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以2天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在1天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以3天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在1天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以4天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在1天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以5天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在1天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以6天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在1天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以7天间隔给予。
在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在2天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以1天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在2天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以2天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在2天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以3天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在2天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以4天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在2天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以5天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在2天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以6天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在2天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以7天间隔给予。
在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在3天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以1天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在3天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以2天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在3天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以3天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在3天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以4天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在3天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以5天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在3天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以6天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在3天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以7天间隔给予。
在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在4天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以1天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在4天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以2天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在4天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以3天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在4天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以4天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在4天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以5天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在4天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以6天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在4天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以7天间隔给予。
在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在5天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以1天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在5天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以2天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在5天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以3天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在5天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以4天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在5天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以5天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在5天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以6天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在5天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以7天间隔给予。
在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在6天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以1天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在6天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以2天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在6天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以3天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在6天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以4天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在6天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以5天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在6天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以6天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在6天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以7天间隔给予。
在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在7天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以1天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在7天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以2天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在7天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以3天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在7天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以4天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在7天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以5天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在7天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以6天间隔给予。在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸，并且在7天之后施用多个剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码其的核酸，并且所述多个剂量以7天间隔给予。
在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法包括施用单剂量的LNP，所述LNP包封(i)指导多核苷酸或编码指导多核苷酸的核酸，和(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码其的核酸。在一些实施方案中，所述单剂量的LNP是0.3mg/kg。在一些实施方案中，所述单剂量的LNP是0.5mg/kg。在一些实施方案中，所述单剂量的LNP是1mg/kg。在一些实施方案中，所述单剂量的LNP是1mg/kg。在一些实施方案中，所述单剂量的LNP是约0.3至约3mg/kg。
如本文提供的用于治疗病症的方法可以包括一个或多个治疗的疗程，其中每个治疗包括单剂量或多个剂量的碱基编辑器系统或包封碱基编辑器系统的一种或多种组分的LNP。例如，可以向有需要的对象施用单剂量的LNP以进行治疗，所述LNP包封编码碱基编辑器融合蛋白的mRNA和指导RNA。在一些实施方案中，可以向对象施用一个或多个治疗的疗程，其中每个治疗包括一个或多个单剂量的LNP，例如还可以向对象施用2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多个剂量的LNP以进行治疗，所述LNP包封编码碱基编辑器融合蛋白的mRNA和指导RNA。对象可以接受1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多个治疗的疗程，其中每个剂量可以间隔1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月、24个月、48个月施用。如本文所述的用于治疗的单剂量可以包括包封指导RNA或编码碱基编辑器融合蛋白的mRNA或两者的LNP。
在一些实施方案中，单剂量的LNP包括0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.1mg/kg、2.2mg/kg、2.3mg/kg、2.4mg/kg、2.5mg/kg、2.6mg/kg、2.7mg/kg、2.8mg/kg、2.9mg/kg、3.0mg/kg、3.1mg/kg、3.2mg/kg、3.3mg/kg、3.4mg/kg、3.5mg/kg、3.6mg/kg、3.7mg/kg、3.8mg/kg、3.9mg/kg、4.0mg/kg、4.1mg/kg、4.2mg/kg、4.3mg/kg、4.4mg/kg、4.5mg/kg、4.6mg/kg、4.7mg/kg、4.8mg/kg、4.9mg/kg、5.0mg/kg、5.1mg/kg、5.2mg/kg、5.3mg/kg、5.4mg/kg、5.5mg/kg、5.6mg/kg、5.7mg/kg、5.8mg/kg、5.9mg/kg、6.0mg/kg、6.1mg/kg、6.2mg/kg、6.3mg/kg、6.4mg/kg、6.5mg/kg、6.6mg/kg、6.7mg/kg、6.8mg/kg、6.9mg/kg、7.0mg/kg、7.1mg/kg、7.2mg/kg、7.3mg/kg、7.4mg/kg、7.5mg/kg、7.6mg/kg、7.7mg/kg、7.8mg/kg、7.9mg/kg、8.0mg/kg、8.1mg/kg、8.2mg/kg、8.3mg/kg、8.4mg/kg、8.5mg/kg、8.6mg/kg、8.7mg/kg、8.8mg/kg、8.9mg/kg、9.0mg/kg、9.1mg/kg、9.2mg/kg、9.3mg/kg、9.4mg/kg、9.5mg/kg、9.6mg/kg、9.7mg/kg、9.8mg/kg、9.9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、55mg/kg、60mg/kg、65mg/kg、70mg/kg、75mg/kg、80mg/kg、85mg/kg、90mg/kg、95mg/kg、100mg/kg、105mg/kg、110mg/kg、115mg/kg、120mg/kg、125mg/kg、130mg/kg、135mg/kg、140mg/kg、145mg/kg、150mg/kg、155mg/kg、160mg/kg、165mg/kg、170mg/kg、175mg/kg、180mg/kg、185mg/kg、190mg/kg、195mg/kg、200mg/kg、250mg/kg、300mg/kg、350mg/kg、400mg/kg、450mg/kg或500mg/kg。
在一些实施方案中，所述病症是动脉粥样硬化性心血管疾病。在一些实施方案中，所述病症是心血管疾病或糖尿病。在一些实施方案中，所述病症是动脉粥样硬化性血管疾病。
在一些实施方案中，所述对象是非人灵长类动物。在一些实施方案中，所述对象是猴。在一些实施方案中，所述对象是人。在一些实施方案中，所述脱氨酶是腺嘌呤脱氨酶。在一些实施方案中，所述核碱基改变是A·T至G·C改变。在一些实施方案中，所述脱氨酶是腺嘌呤脱氨酶，并且核碱基改变是A·T至G·C改变。在一些实施方案中，所述可编程DNA结合结构域包含核酸酶活性丧失的Cas9。在一些实施方案中，所述可编程DNA结合结构域包含Cas9切口酶。在一些实施方案中，所述可编程DNA结合结构域包含Cas9。
在一些实施方案中，所述核碱基改变是在所述PCSK9基因的剪接位点处。在一些实施方案中，所述核碱基改变是在所述PCSK9基因的剪接供体位点处。在一些实施方案中，所述剪接供体位点是在PCSK9内含子1的5’末端处，如SEQ ID NO:5中所引用。在一些实施方案中，所述核碱基改变是在所述PCSK9基因的剪接受体位点处。在一些实施方案中，所述核碱基改变在由所述PCSK9基因编码的转录物中产生移码、提前终止密码子、插入或缺失。在一些实施方案中，所述核碱基改变产生由所述PCSK9基因编码的异常转录物。在一些实施方案中，所述指导多核苷酸是指导RNA。在一些实施方案中，所述指导RNA是经化学修饰的。在一些实施方案中，所述指导RNA包含tracrRNA序列。在一些实施方案中，所述指导RNA包含如表1或表24中列出的化学修饰。
在一些实施方案中，所述核碱基改变是在所述ANGPTL3基因的剪接位点处。在一些实施方案中，所述核碱基改变是在所述ANGPTL3基因的剪接供体位点处。在一些实施方案中，所述剪接供体位点是在ANGPTL3内含子6的5’末端处，如SEQ ID NO:7中所引用。在一些实施方案中，所述核碱基改变是在所述ANGPTL3基因的剪接受体位点处。在一些实施方案中，所述核碱基改变在由所述ANGPTL3基因编码的转录物中产生移码、提前终止密码子、插入或缺失。在一些实施方案中，所述核碱基改变产生由所述ANGPTL3基因编码的异常转录物。在一些实施方案中，所述指导多核苷酸是指导RNA。在一些实施方案中，所述指导RNA是经化学修饰的。在一些实施方案中，所述指导RNA包含tracrRNA序列。在一些实施方案中，所述指导RNA包含如表1或表24中列出的化学修饰。
在一些实施方案中，所述指导RNA包含如表1或表24中列出的指导RNA序列。在一些实施方案中，所述指导RNA包含序列5’-5’-cscscsGCACCUUGGCGCAGCGGgUUUUAGagcuaGaaauagcaaGUUaAaAuAaggCUaGUCcGUUAucAAcuuGaaaaaguGgcaccgAgUCggugcusususu-3’(SEQ IDNO:9)、5’-cscscsGCACCUUGGCGCAGCGGgUUUUAGagcuagaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuugaaaaagugGcaccgagucggugcusususu-3’(SEQ ID NO:9)、5’-cscscsGCACCUUGGCGCAGCGGgUUUUAGagcuaGaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuuGaaaaagugGcaccgagucggugcusususu-3’(SEQ ID NO:9)(GA346)、5’-cscscsGCACCUUGGCGCAGCGGgUUUUAGagcuagaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAacAAcuugaaaaagugGcaccgagucggugcusususu-3(SEQID NO:65)(GA374)、5’-cscscsGCACCUUGGCGCAGCGGgUUUUAGagcuagaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuugaaaaagugGcaccgagucggugcusususuuuu-3’(SEQ ID NO:11)(GA385)、5’-cscscsGCACCUUGGCGCAGCGGgUUUUAGagcuagaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuugaaaaagugGcaccgagucggugcusususuuUu-3’(SEQ ID NO:11)(GA386)或5’-cscscsGCACCUUGGCGCAGCGgUUUUAGagcuaGaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuuGaaaaagugGcaccgagucggugcuususuuuu-3’(SEQ ID NO:12)(GA387)。
在一些实施方案中，所述原间隔子序列包括表1或表24中列出的原间隔子序列。在一些实施方案中，所述原间隔子包含序列5’-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3’(SEQ ID NO:13)、AAGATACCTGAATAACTCTC-3’(SEQ ID NO:14)或5’-AAGATACCTGAATAACCCTC-3’(SEQ ID NO:15)。
在一些实施方案中，所述碱基编辑器融合蛋白包含SEQ ID NO:3的序列。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含与SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列或与本文提供的腺苷脱氨酶中的任一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。应理解，本文提供的腺苷脱氨酶可以包含一个或多个突变(例如，本文提供的突变中的任一种)。本公开内容提供了具有某一同一性百分比加上本文所述的突变中的任一种或其组合的任何脱氨酶结构域。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含与SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列或本文提供的腺苷脱氨酶中的任一种相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、21、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多个突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含与SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列或本文提供的腺苷脱氨酶中的任一种相比具有至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少110个、至少120个、至少130个、至少140个、至少150个、至少160个或至少170个相同的连续氨基酸残基的氨基酸序列。
在一些实施方案中，mRNA包含帽类似物。
在一些实施方案中，mRNA在5’末端处包含至少1、2或3个核苷酸，所述核苷酸包含2’-羟基基团、2’-O-甲基基团或另外的2’化学修饰或其组合。在一些实施方案中，mRNA在5’末端处包含至少1、2或3个核苷酸，所述核苷酸包含2’-羟基基团、2’-O-甲基基团或另外的2’化学修饰或其组合。在一些实施方案中，mRNA在5’末端处包含至少1个核苷酸，所述核苷酸包含2’-羟基基团、2’-O-甲基基团或另外的2’化学修饰或其组合。在一些实施方案中，mRNA在5’末端处包含至少2个核苷酸，所述核苷酸包含2’-羟基基团、2’-O-甲基基团或另外的2’化学修饰或其组合。在一些实施方案中，mRNA在5’末端处包含至少3个核苷酸，所述核苷酸包含2’-羟基基团、2’-O-甲基基团或另外的2’化学修饰或其组合。在一些实施方案中，mRNA在5’末端处包含至少4个核苷酸，所述核苷酸包含2’-羟基基团、2’-O-甲基基团或另外的2’化学修饰或其组合。在一些实施方案中，mRNA在5’末端处包含至少5个核苷酸，所述核苷酸包含2’-羟基基团、2’-O-甲基基团或另外的2’化学修饰或其组合。在一些实施方案中，mRNA在5’末端处包含至少6个核苷酸，所述核苷酸包含2’-羟基基团、2’-O-甲基基团或另外的2’化学修饰或其组合。在一些实施方案中，mRNA在5’末端处包含至少7个核苷酸，所述核苷酸包含2’-羟基基团、2’-O-甲基基团或另外的2’化学修饰或其组合。在一些实施方案中，mRNA在5’末端处包含至少8个核苷酸，所述核苷酸包含2’-羟基基团、2’-O-甲基基团或另外的2’化学修饰或其组合。在一些实施方案中，mRNA在5’末端处包含至少9个核苷酸，所述核苷酸包含2’-羟基基团、2’-O-甲基基团或另外的2’化学修饰或其组合。在一些实施方案中，mRNA在5’末端处包含至少10个核苷酸，所述核苷酸包含2’-羟基基团、2’-O-甲基基团或另外的2’化学修饰或其组合。
在一些实施方案中，mRNA包含多聚A尾。
本文所述的组合物可以以治疗有效量施用于有需要的对象，以治疗与高循环胆固醇水平相关的病症。可以使用本文所述的组合物和方法治疗的与高循环胆固醇水平相关的病症包括但不限于：高胆固醇血症、升高的总胆固醇水平、升高的低密度脂蛋白(LDL)水平、升高的血液LDL-胆固醇水平、降低的血液高密度脂蛋白胆固醇水平、肝脂肪变性、冠心病、血管疾病、缺血、中风、外周血管疾病、血栓形成、2型糖尿病、高甘油三酯血症、高血压、动脉粥样硬化、肥胖症、阿尔茨海默病、神经变性及其组合。本文公开的组合物和方法有效降低对象的循环胆固醇水平，从而治疗所述病症。与施用之前相比，本文公开的组合物和方法有效降低血液LDL胆固醇水平和/或降低血液甘油三酯水平。
在另一方面，本文提供了一种用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法，所述方法包括向所述对象施用如本文提供的复合物、如本文提供的组合物或如本文提供的脂质纳米颗粒，其中所述sgRNA引导腺苷碱基编辑器蛋白以在对象的细胞中的靶多核苷酸序列中实现修饰，从而治疗或预防所述病症。
在一些实施方案中，所述靶多核苷酸序列是在PCSK9基因中。在一些实施方案中，所述修饰减少了对象中由PCSK9基因编码的功能性PCSK9蛋白的表达。在一些实施方案中，所述病症是动脉粥样硬化性血管疾病。在一些实施方案中，所述靶多核苷酸序列是在ANGPTL3基因中。在一些实施方案中，所述修饰减少了对象中由ANGPTL3基因编码的功能性ANGPTL3蛋白的表达。在一些实施方案中，所述病症是动脉粥样硬化性血管疾病、高甘油三酯血症或糖尿病。
正在治疗病症、疾病或病症的患者是被开业医师诊断为患有这种病症的患者。诊断可以通过任何合适的方式进行。诊断和监测可以涉及例如检测生物样品中患病、垂死或死亡细胞的存在(例如，组织活检、血液测试或尿液测试)、检测斑块的存在、检测生物样品中替代标记物的水平或检测与病症相关联的症状。预防病症发展的患者可以接受过或可以没有接受过这种诊断。本领域人员将理解，这些患者可以已经接受了与如上所述相同的标准测试，或者由于存在一个或多个风险因素(例如，家族史或遗传倾向性)而在未经检查的情况下就被鉴定为高风险患者。
本公开内容的治疗方法可以针对显示由疾病或病症引起的病理的对象、疑似显示由疾病或病症引起的病理的对象以及显示具有由疾病或病症引起的病理风险的对象进行。例如，对疾病或病症具有遗传倾向性的对象可以进行预防性治疗。表现出与病症、疾病或病症相关联的症状的对象可以接受治疗以减少症状或者减缓或预防症状的进一步进展。与疾病或病症的严重性增加相关联的物理变化在本文中显示为进行性的。因此，在本公开内容的实施方案中，表现出与病症或疾病相关联的轻度病理迹象的对象可以接受治疗以改善症状和/或预防症状的进一步进展。
在一些实施方案中，与施用之前相比，对象表现出降低的血液LDL胆固醇水平和/或降低的血液甘油三酯水平。
在一些实施方案中，在施用之后，对象表现出与施用之前相比至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或100％降低的血液低密度脂蛋白(LDL)胆固醇水平。在一些实施方案中，在施用之后，对象表现出与施用之前相比降低到至少2、至少1/3、至少1/4、至少1/5、至少1/10、至少1/20、至少1/25、至少1/30、至少1/40、至少1/50、至少1/60、至少1/70、至少1/80、至少1/90、至少1/100、至少1/200、至少1/300、至少1/400、至少1/500、至少1/600、至少1/700、至少1/800、至少1/900、至少1/1000、至少1/2000、至少1/3000、至少1/4000、至少1/5000、至少1/6000、至少1/7000、至少1/8000、至少1/9000或至少1/10000的血液低密度脂蛋白(LDL)胆固醇水平。
在一些实施方案中，在施用之后，对象表现出与施用之前相比至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或100％降低的血液甘油三酯水平。
在一些实施方案中，在施用之后，对象表现出与施用之前相比至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或100％降低的血液甘油三酯水平。在一些实施方案中，在施用之后，对象表现出与施用之前相比降低到至少1/2、至少1/3、至少1/4、至少1/5、至少1/10、至少1/20、至少1/25、至少1/30、至少1/40、至少1/50、至少1/60、至少1/70、至少1/80、至少1/90、至少1/100、至少1/200、至少1/300、至少1/400、至少1/500、至少1/600、至少1/700、至少1/800、至少1/900、至少1/1000、至少1/2000、至少1/3000、至少1/4000、至少1/5000、至少1/6000、至少1/7000、至少1/8000、至少1/9000或至少1/10000的血液甘油三酯水平。
向哺乳动物施用的剂量和频率(单个或多个剂量)可以根据多种因素而变化，例如，所述哺乳动物是否罹患另一种疾病；及其施用途径；大小、年龄、性别、健康状况、体重、身体质量指数和接受者的饮食；所治疗疾病的症状的性质和程度、并行治疗的种类、来自所治疗疾病的并发症或其他健康相关问题。所确立剂量(例如，频率和持续时间)的调节和操纵完全在本领域中技术人员的能力范围内。治疗，诸如本文公开的那些，可以每天一次、每天两次、每两周一次、每月一次或任何治疗有效的适用基础上施用于对象。在实施方案中，治疗仅根据需要进行，例如，在出现病症或疾病的迹象或症状时，例如动脉粥样硬化性血管疾病、高甘油三酯血症或糖尿病。
本文所述的组合物可以以治疗有效量施用于有需要的对象，以治疗与高循环胆固醇水平相关的病症。可以使用本文所述的组合物和方法治疗的与高循环胆固醇水平相关的病症包括但不限于：高胆固醇血症、升高的总胆固醇水平、升高的低密度脂蛋白(LDL)水平、升高的血液LDL-胆固醇水平、降低的血液高密度脂蛋白胆固醇水平、肝脂肪变性、冠心病、血管疾病、缺血、中风、外周血管疾病、血栓形成、2型糖尿病、高甘油三酯血症、高血压、动脉粥样硬化、肥胖症、阿尔茨海默病、神经变性及其组合。本文公开的组合物和方法有效降低对象的循环胆固醇水平，从而治疗所述病症。与施用之前相比，本文公开的组合物和方法有效降低血液LDL胆固醇水平和/或降低血液甘油三酯水平。
可以在细胞培养物或实验动物中通过标准药学程序来确定本公开内容的组合物的毒性和治疗功效，例如用于确定LD50(对群体的50％致死的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)。毒性与治疗作用之间的剂量比(LD50/ED50比率)是治疗指数。优选表现出高治疗指数的药剂。药剂剂量优选地在包括ED50而具有很小或没有毒性的一系列循环浓度内。虽然可以使用表现出毒副作用的药剂，然而，应小心设计使此类药剂靶向受影响组织的位点的递送系统，以便使对未受影响的细胞的潜在损害减到最小，并由此降低副作用。
熟练技术人员将理解，某些因素可能影响有效治疗对象所需的施用剂量和频率，包括但不限于疾病或病症的严重性、先前的治疗、对象的总体特征包括对象的健康状况、性别、体重和/或年龄以及存在的其他疾病。此外，用治疗有效量的组合物治疗对象可以包括单一治疗，或者优选地可以包括一系列治疗。还应理解，用于治疗的本公开内容的组合物的有效剂量可以在特定治疗过程中增加或降低。剂量的变化可能由如本文所述的诊断测定的结果导致并且从中变得明显。治疗有效剂量通常取决于患者在施用时的状态。精确的量可以通过常规实验来确定，但是最终可能取决于临床医师的判断，例如，通过监测患者的疾病迹象并相应地调整治疗。
施用频率可以在治疗过程中确定和调整，并且通常(但不一定)是基于疾病的治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟。可替代地，多肽或多核苷酸的持续连续释放配制品可能是合适的。用于实现持续释放的各种配制品和装置是本领域已知的。在一些实施方案中，剂量是每天一次、每隔一天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次或每六天一次。在一些实施方案中，给药频率是每周一次、每2周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每9周一次或每10周一次；或每月一次、每2个月一次、或每3个月一次或更长时间一次。此疗法的进展容易地通过常规技术和测定来监测。
给药方案(包括本文公开的组合物)可以随时间变化。在一些实施方案中，对于具有正常体重的成年对象，可以施用范围为约0.01至1000mg/kg的剂量。在一些实施方案中，剂量在1至200mg之间。特定剂量方案，即剂量、时间和重复，将取决于特定对象和对象的病史以及多肽或多核苷酸的特性(诸如多肽或多核苷酸的半衰期，以及本领域熟知的其他考虑)。
出于本公开内容的目的，如本文所述的组合物的适当治疗剂量将取决于所采用的具体药剂(或其组合物)、施用的配制品和途径、疾病的类型和严重性、多肽或多核苷酸是用于预防目的还是治疗目的来施用、先前的疗法、受对象的临床史和对拮抗剂的应答以及主治医师的判断。通常，临床医师将施用多肽，直至达到实现所需结果的剂量为止。
一种或多种组合物的施用可以是连续的或间歇的，例如取决于接受者的生理状况、施用的目的是治疗性还是预防性以及技术人员已知的其他因素。组合物的施用在预选的时间段内可以是基本上连续的，或者可以以一系列间隔剂量进行，例如，在发展疾病之前、期间或之后。
本文所述的本公开内容的方法和组合物(包括其实施方案)可以与一种或多种另外的治疗方案或药剂或治疗一起施用，其可以共施用于哺乳动物。
代谢综合征和心血管疾病
基因修饰的能力，特别是直接编辑碱基的能力允许进行基因的体内精确编辑、修饰和/或破坏，而无需创建DSB和改进治疗人类疾病的方法。例如，Chadwick等人使用胞嘧啶碱基编辑将无义突变引入成年小鼠的Pcsk9基因中。经由腺病毒载体将BE3和gRNA递送到肝脏中导致血浆PCSK9水平降低56％。此外，经碱基编辑的小鼠的胆固醇水平降低了约30％。在随后的工作中，进行编辑胞嘧啶碱基以破坏成年小鼠的Angptl3基因导致血液胆固醇和甘油三酯水平明显降低，并且进行胞嘧啶碱基编辑以破坏胎儿小鼠的Pcsk9基因或Hpd基因导致出生后胆固醇水平降低或治愈遗传性酪氨酸血症1型疾病。
心血管疾病、肥胖症、2型糖尿病、代谢综合征可能具有一种或多种类似的潜在病因。人PCSK9基因编码帮助调节血液中的胆固醇量的蛋白质。人类中的肝脏蛋白质人前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 9型(PCSK9)是一种分泌的球状自激活丝氨酸蛋白酶，其在内体囊泡内充当蛋白质结合衔接子，在LDL颗粒的内吞期间桥接与低密度脂蛋白受体(LDL-R)的pH依赖性相互作用，从而防止LDL-R循环到细胞表面并导致LDL-胆固醇清除率降低。PCSK9直系同源物存在于许多物种中。PCSK9蛋白在低密度脂蛋白受体到达细胞表面之前将其分解，因此更多的胆固醇可以留在血液中。因此，PCSK9基因和编码的PCSK9蛋白是调节胆固醇代谢的有吸引力的靶标，特别是在降低血液胆固醇水平方面。
其他靶标也显示与甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的血浆水平降低相关联，这导致心血管风险显著降低。例如，人ANGPTL3被认为是治疗心血管疾病的重要新药理学靶标。实验证据证明了抗ANGPTL3疗法具有重要的抗动脉粥样硬化作用。使用单克隆抗ANGPTL3抗体(依维苏单抗(evinacumab))和抗有义寡核苷酸(ASO)的I期临床试验结果清楚地显示显著的降脂作用。
人ANGPTL3基因位于染色体1p31上。人ANGPTL3基因的遗传变体与不同的血浆脂质谱有关。例如，ANGPTL3基因的纯合子功能丧失(LOF)变体导致所有的血浆脂蛋白水平大大降低。ANGPTL3仅在肝脏中表达并分泌到循环中，在那里它通过肝前蛋白转化酶进行切割。ANGPTL3蛋白是一种460个氨基酸(aa)的多肽，具有独特的信号肽序列、N末端螺旋结构域和C末端球状纤维蛋白原同源结构域。N末端卷曲线圈区域(17-207aa)经由可逆地抑制LPL的催化活性来影响血浆TG水平，而纤维蛋白原样结构域(207-460aa)与整联蛋白αvβ3受体结合并影响血管生成，这与血管生成素的功能类似。N末端与C末端结构域之间的短接头区(在221-222和224-225处)是一个特殊区域，其已经被验证为被弗林蛋白酶(furin)分割。现有结果显示，截短形式的切割ANGPTL3可以强化LPL和内皮脂肪酶(EL)的抑制活性，从而表明ANGPTL3的切割类型可能更有效地发挥作用。
此外，人载脂蛋白C-III(APOC3)可能是另一个治疗靶标。APOC3是一种在人类中由APOC3基因编码的蛋白质。APOC3是VLDL的一种组分。APOC3抑制脂蛋白脂肪酶和肝脂肪酶。它也被认为抑制肝脏对富含甘油三酯的颗粒的摄取。APOC3水平的增加诱导高甘油三酯血症的发展。最近的证据表明，APOC3在富含脂质的条件下促进肝细胞中富含甘油三酯的VLDL颗粒的组装和分泌方面具有细胞内作用。然而，已经显示人apoC3编码序列中两个天然存在的点突变A23T和K58E可以消除肝细胞中富含甘油三酯的VLDL颗粒的细胞内组装和分泌。
如下中所述的对血管疾病和糖尿病中涉及的靶基因进行靶向碱基编辑通过引用以其全文并入本文：Chadwick AC,Wang X,Musunuru K.In vivo base editing of PCSK9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9)as a therapeutic alternativeto genome editing.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2017,37:1741-7；Chadwick AC,Evitt NH,Lv W等人Reduced blood lipid levels with in vivo CRISPR-Cas9 baseediting of ANGPTL3.Circulation,2018,137:975-7；Rossidis AC,Stratigis JD,Chadwick AC等人In utero CRISPR-mediated therapeutic editing of metabolicgenes.Nat Med,2018,24:1513-8。虽然脂质代谢中涉及的基因，包括PCSK9，已经通过当前的基因编辑技术进行靶向编辑，但仍需要针对这些基因的精确碱基编辑，以改善编辑结果。
药物组合物
在一些方面，本文提供了一种药物组合物，其包含如本文提供的碱基编辑器系统和药学上可接受的载体或赋形剂。
在一些方面，本文提供了一种用于基因修饰的药物组合物，其包含本文所述的gRNA或sgRNA和碱基编辑器融合蛋白或编码碱基编辑器融合蛋白的核酸序列以及药学上可接受的载体。包含本文所述的gRNA或sgRNA和碱基编辑器融合蛋白或编码碱基编辑器融合蛋白的核酸序列的用于基因修饰的组合物可以被配制成药物组合物。药物组合物以常规方式使用一种或多种药学上可接受的无活性成分来配制，所述成分促进将活性化合物加工成可以在药学上使用的制剂。用于本公开内容的合适配制品和递送方法通常是本领域熟知的。适当的配制品依赖于所选的施用途径。本文所述的药物组合物的总结可以例如在以下中找到：Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第十九版(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1995)；Hoover,John E.,Remington’s PharmaceuticalSciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania 1975；Liberman,H.A.和Lachman,L.编,Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Decker,New York,N.Y.,1980；以及Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,第七版(LippincottWilliams&Wilkins1999)，对于这种公开通过引用并入本文。
药物组合物可以是本文所述的gRNA或sgRNA和碱基编辑器融合蛋白或编码碱基编辑器融合蛋白的核酸序列与一种或多种其他化学组分(即，药学上可接受的成分)的混合物，所述化学组分诸如载体、赋形剂、粘合剂、填充剂、悬浮剂、调味剂、甜味剂、崩解剂、分散剂、表面活性剂、润滑剂、着色剂、稀释剂、增溶剂、湿润剂、增塑剂、稳定剂、渗透增强剂、润湿剂、消泡剂、抗氧化剂、防腐剂或其一种或多种组合。所述药物组合物有利于向有需要的生物体或对象施用本文所述的gRNA或sgRNA和碱基编辑器融合蛋白或编码碱基编辑器融合蛋白的核酸序列。
可以使用本领域已知的任何合适的方法将本公开内容的药物组合物施用于对象。本文所述的药物组合物可以以多种方式施用于对象，包括肠胃外、静脉内、皮内、肌内、结肠、直肠或腹膜内。在一些实施方案中，所述药物组合物可以通过对象的腹膜内注射、肌内注射、皮下注射或静脉注射进行施用。在一些实施方案中，所述药物组合物可以肠胃外、静脉内、肌内或口服施用。
对于通过吸入进行的施用，本文所述的腺病毒可以被配制成作为气溶胶、雾或粉末来使用。对于口腔或舌下施用，所述药物组合物可以被配制成以常规方式配制的片剂、锭剂或凝胶的形式。在一些实施方案中，本文所述的腺病毒可以被制备为透皮剂型。在一些实施方案中，本文所述的腺病毒可以被配制成适于肌内、皮下或静脉内注射的药物组合物。在一些实施方案中，本文所述的腺病毒可以局部施用，并且可以被配制成各种可局部施用的组合物，诸如溶液、悬浮液、洗液、凝胶、浆料、医用棒、护肤膏、乳膏或软膏。在一些实施方案中，本文所述的腺病毒可以被配制成直肠组合物，诸如灌肠剂、直肠凝胶、直肠泡沫、直肠气溶胶、栓剂、果冻栓剂或保留灌肠剂。在一些实施方案中，本文所述的腺病毒可以被配制成用于口服施用，诸如片剂、胶囊或呈水性悬浮液或选自以下的溶液形式的液体，包括但不限于水性口服分散剂、乳液、溶液、酏剂、凝胶和糖浆。
在一些实施方案中，包含本文所述的gRNA或sgRNA和II型Cas蛋白或编码II型Cas蛋白的核酸序列的用于基因修饰的药物组合物包含治疗剂。另外的治疗剂可以调节正在治疗的疾病、病症或病症的不同方面，并且比单独施用复制能力强的重组腺病毒或治疗剂提供更大的总体益处。治疗剂包括但不限于化学治疗剂、放射治疗剂、激素治疗剂和/或免疫治疗剂。在一些实施方案中，所述治疗剂可以是放射治疗剂。在一些实施方案中，所述治疗剂可以是激素治疗剂。在一些实施方案中，所述治疗剂可以是免疫治疗剂。在一些实施方案中，所述治疗剂是化学治疗剂。另外的治疗剂的制备和给药时间表可以根据制造商的说明书使用，或由熟练的从业者根据经验确定。例如，化疗的制备和给药时间表还描述于TheChemotherapy Source Book,第4版,2008,M.C.Perry,Editor,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA中。
可以用本文所述的经化学修饰的gRNA或sgRNA和II型Cas蛋白或编码II型Cas蛋白的核酸序列的基因修饰组合物和本文所述的方法治疗的对象可以是患有疾病或病症的任何对象。例如，所述对象可以是真核生物对象，诸如动物。在一些实施方案中，所述对象是哺乳动物，例如人类。在一些实施方案中，所述对象是人。在一些实施方案中，所述对象是非人类动物。在一些实施方案中，所述对象是胎儿、胚胎或儿童。在一些实施方案中，所述对象是非人灵长类动物，诸如黑猩猩和其他猿类和猴物种；农场动物，诸如牛、马、绵羊、山羊、猪；家养动物，诸如兔、狗和猫；实验室动物，包括啮齿动物，诸如大鼠、小鼠和豚鼠等。
在一些实施方案中，所述对象是产前(例如，胎儿)、儿童(例如，新生儿、婴儿、幼儿、青春期前)、青少年、青春期或成人(例如，早期成人、中年人、老年人)。人类对象的年龄可以在约0个月与约120岁之间或更大。人类对象的年龄可以在约0个月与约12个月之间；例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月大。人类对象的年龄可以在约0岁与12岁之间；例如，约0天与30天之间；约1个月与12个月之间；约1岁与3岁之间；约4岁与5岁之间；约4岁与12岁之间；约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12岁。人类对象的年龄可以在约13岁与19岁之间；例如，约13、14、15、16、17、18或19岁。人类对象的年龄可以在约20岁与约39岁之间；例如，约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39岁。人类对象的年龄可以在约40岁至约59岁之间；例如，约40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59岁。人类对象的年龄可以大于59岁；例如，约60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119或120岁。人类对象可以包括男性对象和/或女性对象。
脂质纳米颗粒(LNP)组合物
在一些实施方案中，根据以下中所述的方法制备LNP：Conway,A.等人2019Mol.Ther.27,866-877和Villiger,L.等人2021Nat.Biomed.Eng.5,179-18，其通过引用并入。在一些实施方案中，LNP由氨基脂质、与脂质缀合的平均分子量为2000Da的单甲氧基聚乙二醇(或甲氧基聚乙二醇，被称为PEG-脂质)、胆固醇和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)构成。在一些实施方案中，LNP由专有可电离阳离子脂质、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、胆固醇和PEG-脂质构成。
在一些实施方案中，LNP具有约30-约160、约35-约160、约40-约160、约45-约160、约50-约160、约55-约160、约60-约160、约65-约160、约70-约160、约75-约160、约80-约160、约85-约160、约90-约160、约95-约160、约100-约160、约105-约160、约110-约160、约115-约160、约120-约160、约125-约160、约130-约160、约135-约160、约140-约160、约145-约160、约150-约160、约30-约155、约30-约150、约30-约145、约30-约140、约30-约135、约30-约130、约30-约125、约30-约120、约30-约115、约30-约110、约30-约105、约30-约100、约30-约95、约30-约90、约30-约85、约30-约80、约30-约75、约30-约70、约30-约65、约30-约60、约30-约55、约30-约50、约30-约45、约30-约40、约30-约45、约35-约45、约35-约50、约40-约50、约40-约55、约45-约55、约45-约60、约50-约60、约50-约65、约55-约60、约55-约65、约55-约70、约60-约70、约60-约75、约65-约75、约65-约80、约70-约80、约70-约85、约75-约85、约75-约90、约80-约90、约80-约95、约85-约95、约85-约100、约90-约100、约90-约105、约95-约105、约95-约110、约100-约110、约100-约115、约105-约115、约105-约120、约110-约120、约110-约125、约115-约125、约115-约130、约120-约130、约120-约135、约125-约135、约125-约140、约130-约140、约130-约145、约35-约140、约45-约130、约55-约120、约65-约110、约75-约100、或约85-约90nm的流体动力学直径。
在一些实施方案中，LNP包含约1％-约97％、约5％-约97％、约10％-约97％、约15％-约97％、约20％-约97％、约25％-约97％、约30％-约97％、约35％-约97％、约40％-约97％、约45％-约97％、约50％-约97％、约55％-约97％、约60％-约97％、约65％-约97％、约70％-约97％、约75％-约97％、约80％-约97％、约1％-约95％、约1％-约90％、约1％-约85％、约1％-约80％、约1％-约75％、约1％-约70％、约1％-约65％、约1％-约60％、约1％-约55％、约1％-约50％、约1％-约45％、约1％-约40％、约1％-约35％、约1％-约30％、约1％-约25％、约1％-约20％、约1％-约15％、约1％-约10％、约10％-约30％、约10％-约35％、约15％-约35％、约15％-约40％、约20％-约40％、约20％-约45％、约25％-约45％、约25％-约50％、约30％-约50％、约30％-约55％、约35％-约55％、约35％-约60％、约40％-约60％、约40％-约65％、约45％-约65％、约45％-约70％、约50％-约70％、约50％-约75％、约55％-约75％、约55％-约80％、或约60％-约80％的氨基酸(以mol％为单位)。
在一些实施方案中，LNP包含约1％-约40％、约1％-约38％、约1％-约36％、约1％-约34％、约1％-约32％、约1％-约30％、约1％-约28％、约1％-约26％、约1％-约24％、约1％-约22％、约1％-约20％、约1％-约18％、约1％-约16％、约1％-约14％、约1％-约12％、约1％-约10％、约1％-约8％、约1％-约6％、约1％-约4％、约1％-约2％、约2％-约40％、约4％-约40％、约6％-约40％、约8％-约40％、约10％-约40％、约12％-约40％、约14％-约40％、约16％-约40％、约18％-约40％、约20％-约40％、约22％-约40％、约24％-约40％、约26％-约40％、约28％-约40％、约30％-约40％、约32％-约40％、约34％-约40％、约36％-约40％、约38％-约40％、约2％-约35％、约2％-约30％、约2％-约25％、约2％-约20％、约2％-约15％、约2％-约10％、约2％-约8％、约2％-约6％、或约2％-约4％的DSPC(以mol％为单位)。
在一些实施方案中，LNP包含约1％-约20％、约1％-约19％、约1％-约18％、约1％-约17％、约1％-约16％、约1％-约15％、约1％-约14％、约1％-约13％、约1％-约12％、约1％-约11％、约1％-约10％、约1％-约9％、约1％-约8％、约1％-约7％、约1％-约6％、约1％-约5％、约1％-约4％、约1％-约3％、约2％-约6％、约3％-约7％、约4％-约8％、约5％-约9％、约6％-约10％、约7％-约11％、约8％-约12％、约9％-约13％、约10％-约14％、约11％-约15％、约12％-约16％、约13％-约17％、约14％-约18％、约15％-约19％、或约16％-约20％的PEG-脂质(以mol％为单位)。
在一些实施方案中，LNP包含约1％-约97％、约5％-约97％、约10％-约97％、约15％-约97％、约20％-约97％、约25％-约97％、约30％-约97％、约35％-约97％、约40％-约97％、约45％-约97％、约50％-约97％、约55％-约97％、约60％-约97％、约65％-约97％、约70％-约97％、约75％-约97％、约80％-约97％、约1％-约95％、约1％-约90％、约1％-约85％、约1％-约80％、约1％-约75％、约1％-约70％、约1％-约65％、约1％-约60％、约1％-约55％、约1％-约50％、约1％-约45％、约1％-约40％、约1％-约35％、约1％-约30％、约1％-约25％、约1％-约20％、约1％-约15％、约1％-约10％、约10％-约30％、约10％-约35％、约15％-约35％、约15％-约40％、约20％-约40％、约20％-约45％、约25％-约45％、约25％-约50％、约30％-约50％、约30％-约55％、约35％-约55％、约35％-约60％、约40％-约60％、约40％-约65％、约45％-约65％、约45％-约70％、约50％-约70％、约50％-约75％、约55％-约75％、约55％-约80％、或约60％-约80％的胆固醇(以mol％为单位)。
在一些实施方案中，LNP包含约1％-约97％、5％-约97％、10％-约97％、15％-约97％、20％-约97％、25％-约97％、30％-约97％、35％-约97％、40％-约97％、45％-约97％、50％-约97％、55％-约97％、60％-约97％、65％-约97％、70％-约97％、75％-约97％、80％-约97％、1％-约95％、1％-约90％、1％-约85％、1％-约80％、1％-约75％、1％-约70％、1％-约65％、1％-约60％、1％-约55％、1％-约50％、1％-约45％、1％-约40％、1％-约35％、1％-约30％、1％-约25％、1％-约20％、1％-约15％、1％-约10％、10％-约30％、10％-约35％、15％-约35％、15％-约40％、20％-约40％、20％-约45％、25％-约45％、25％-约50％、30％-约50％、30％-约55％、35％-约55％、35％-约60％、40％-约60％、40％-约65％、45％-约65％、45％-约70％、50％-约70％、50％-约75％、55％-约75％、55％-约80％、或60％-约80％的氨基酸；1％-约40％、1％-约38％、1％-约36％、1％-约34％、1％-约32％、1％-约30％、1％-约28％、1％-约26％、1％-约24％、1％-约22％、1％-约20％、1％-约18％、1％-约16％、1％-约14％、1％-约12％、1％-约10％、1％-约8％、1％-约6％、1％-约4％、1％-约2％、2％-约40％、4％-约40％、6％-约40％、8％-约40％、10％-约40％、12％-约40％、14％-约40％、16％-约40％、18％-约40％、20％-约40％、22％-约40％、24％-约40％、26％-约40％、28％-约40％、30％-约40％、32％-约40％、34％-约40％、36％-约40％、38％-约40％、2％-约35％、2％-约30％、2％-约25％、2％-约20％、2％-约15％、2％-约10％、2％-约8％、2％-约6％、或2％-约4％的DSPC；1％-约20％、1％-约19％、1％-约18％、1％-约17％、1％-约16％、1％-约15％、1％-约14％、1％-约13％、1％-约12％、1％-约11％、1％-约10％、1％-约9％、1％-约8％、1％-约7％、1％-约6％、1％-约5％、1％-约4％、1％-约3％、2％-约6％、3％-约7％、4％-约8％、5％-约9％、6％-约10％、7％-约11％、8％-约12％、9％-约13％、10％-约14％、11％-约15％、12％-约16％、13％-约17％、14％-约18％、15％-约19％、和约16％-约20％的PEG-脂质，剩下的是胆固醇(全部以mol％为单位)。
氨基脂质
本文描述了LNP组合物，其包含氨基脂质、磷脂、PEG脂质、胆固醇或其衍生物、有效载荷或其任何组合。在一些实施方案中，所述LNP组合物包含氨基脂质。在一方面，本文公开了一种具有式(I)的结构的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
Figure BDA0003991453200003521
其中
R1和R2中的每一个独立地是C7-C22烷基、C7-C22烯基、C3-C8环烷基、-C2-C10亚烷基-L-R6或
Figure BDA0003991453200003522
其中烷基、亚烷基、烯基和环烷基中的每一个独立地是经取代的或未取代的；
X、Y和Z中的每一个独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝O)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-.-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-O、S或键；
每个L独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-.-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝O)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、O、S、-C1-C10亚烷基-O-、-C1-C10亚烷基-C(＝O)O-、-C1-C10亚烷基-OC(＝O)-或键，其中亚烷基是经取代的或未取代的；
R3是-C0-C10亚烷基-NR7R8,-C0-C10亚烷基-杂环烷基或-C0-C10亚烷基-杂环芳基，其中亚烷基,杂环烷基和杂环芳基独立地是经取代的或未取代的；每个R4独立地是氢或经取代或未取代的C1-C6烷基；
R5是氢或经取代或未取代的C1-C6烷基；
每个R6独立地是经取代或未取代的C3-C22烷基或经取代或未取代的C3-C22烯基；
R7和R8中的每一个独立地是氢或经取代或未取代的C1-C6烷基，或者
R7和R8与它们所附接的氮一起形成经取代或未取代的C2-C6杂环基；
p是选自1至10的整数；并且
n、m和q中的每一个独立地是0、1、2、3、4或5。
在式(I)的一些实施方案中，如果所述结构携带超过一个不对称C原子，则每个不对称C原子独立地表示外消旋、手性纯R和/或手性纯S异构体或其组合。
在一些实施方案中，式(I)中n、m和q中的每一个独立地是0、1、2或3。在一些实施方案中，式(I)中n、m和q中的每一个是1。
在一些实施方案中，式(1)的化合物具有式(Ia)的结构或其药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂化物：
Figure BDA0003991453200003531
其中
R1和R2中的每一个独立地是C7-C22烷基、C7-C22烯基、C3-C8环烷基、-C2-C10亚烷基-L-R6或
Figure BDA0003991453200003532
其中烷基、亚烷基、烯基和环烷基中的每一个独立地是经取代的或未取代的；
X、Y和Z中的每一个独立地是C(＝O)NR4-、-NR4C(D)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-.-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(E)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4--C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-.-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-.-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、O、S、-C1-C10亚烷基-O-或键，其中亚烷基是经取代的或未取代的；
每个L独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-.-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝O)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4--C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、O、S.-C1-C10亚烷基-O-、-C1-C10亚烷基-C(＝O)O-、-C1-C10亚烷基-OC(＝O)-或键，其中亚烷基是经取代的或未取代的；
R3 is-C0-C10亚烷基-NR7R8、-C0-C10亚烷基-杂环烷基或-C0-C10亚烷基-杂环芳基，其中亚烷基、杂环烷基和杂环芳基独立地是经取代的或未取代的；
每个R4独立地是氢或经取代或未取代的CI-C6烷基；
R5是氢或经取代或未取代的C1-C6烷基；
每个R6独立地是经取代或未取代的C3-C22烷基或经取代或未取代的C3-C22烯基；
R7和R8中的每一个独立地是氢或经取代或未取代的C1-C6烷基，或者
R7和R8与它们所附接的氮一起形成经取代或未取代的C2-C6杂环基；并且
p是选自1至10的整数。
在式(la)的一些实施方案中，如果所述结构携带超过一个不对称C原子，则每个不对称C原子独立地表示外消旋、手性纯R和/或手性纯S异构体或其组合。
在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R1和R2独立地是C7-C22烷基、C7-C22烯基、-C2-C10亚烷基-L-R6或
Figure BDA0003991453200003551
其中烷基、亚烷基、烯基和环烷基中的每一个独立地是经取代的或未取代的。在一些实施方案中，式(I)和式(la)中的R1和R2独立地是C10-C20烷基、C10-C20烯基、-C8-C7亚烷基-L-R6或
Figure BDA0003991453200003552
其中烷基、亚烷基、烯基和环烷基中的每一个独立地是经取代的或未取代的。在一些实施方案中，式(I)和式(la)中的R1是
Figure BDA0003991453200003553
在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的每个L独立地是O、S、-C1-C10亚烷基-O-、-C1-C10亚烷基-C(＝O)O-、-C1-C10亚烷基-OC(＝O)-、或键，其中亚烷基是经取代的或未取代的。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的每个L独立地是O、S、-C1-C3亚烷基-O-、-C1-C3亚烷基-C(＝O)O-、-C1-C3亚烷基-OC(＝O)-或键，其中亚烷基是经取代的或未取代的。在一些实施方案中，式(I)和式(la)中的每个L独立地是O、S、-C1-C3亚烷基-O-、-C1-C3亚烷基-C(＝O)O-、-C1-C3亚烷基-OC(＝O)-或键，其中亚烷基是直链或支链未取代的亚烷基。
在一些实施方案中，式(I)和式(la)中的每个R6独立地是经取代或未取代的直链C3-C22烷基或经取代或未取代的直链C3-C22烯基。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的每个R6独立地是经取代或未取代的C3-C20烷基或经取代或未取代的C3-C20烯基。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的每个R6独立地是经取代或未取代的C3-C10烷基或经取代或未取代的C3-C10烯基。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的每个R6独立地是经取代或未取代的C3-C10烷基。在一些实施方案中，式(I)和式(la)中的每个R6独立地是经取代或未取代的直链C3-C10烷基。在一些实施方案中，式(I)和式(la)中的每个R6独立地是经取代或未取代的正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基或正十二烷基。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的每个R6独立地是经取代或未取代的正辛基。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的每个R6是正辛基。
在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的每个L独立地是-C(＝O)O-,-OC(＝O)-,-C1-C10亚烷基-O-或O。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的每个L独立地是O。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的每个L独立地是-C1-C3亚烷基-O-。在一些实施方案中，式(I)和式(la)中的p是1、2、3、4或5。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的p是2。
在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R1是
Figure BDA0003991453200003561
在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的每个R4独立地是H或经取代或未取代的C1-C4烷基。在一些实施方案中，式(I)和式(la)中的每个R4独立地是经取代或未取代的直链C1-C4烷基。在一些实施方案中，式(1)和式(la)中的每个R4是H。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的每个R4独立地是H、-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、or-CH(CH3)2。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的每个R4独立地是H或-CH3。在一些实施方案中，式(1)和式(Ia)中的每个R4是-CH3。
在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的X是-C(＝O)O-或-OC(＝O))-。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的X是-C(＝O)NR4-或-NR4C(＝O)-。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的X是-C(＝O)N(CH3)-、-N(CH3)C(＝O)-、-C(＝O)NH-或-NHC(＝O)-。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的X是-C(＝O))NH-、-C(＝O)N(CH3)-.-OC(＝O))-、-NHC(＝O)-、-N(CH3)C(＝O))-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-NHC(＝O)O-、-N(CH3)C(＝O)O-、-OC(＝O))NH-、-OC(＝O)N(CH3)-、-NHC(＝O)NH-、-N(CH3)C(＝O))NH-、-NHC(＝O)N(CH3)-、-N(CH3)C(＝O)N(CH3)-、NHC(＝NH)NH-、-N(CH3)C(＝NH)NH-、-NHC(＝NH)N(CH3)-、-N(CH3)C(＝NH)N(CH3)-、NHC(＝NMe)NH-、-N(CH3)C(＝NMe)NH-、-NHC(＝NMe)N(CH3)-或-N(CH3)C(＝NMe)N(CH3)-。
在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R2是C7-C22烷基、C7-C22烯基、-C2-C10亚烷基-L-R6或
Figure BDA0003991453200003571
其中烷基、亚烷基、烯基和环烷基中的每一个独立地是经取代的或未取代的。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R2是经取代或未取代的C7-C22烷基或经取代或未取代的C7-C22烯基。在一些实施方案中，式(I)和式(la)中的R2是经取代或未取代的直链C7-C22烷基或经取代或未取代的直链C7-C22烯基。在一些实施方案中，式(I)和式(la)中的R2是经取代或未取代的C10-C20烷基或经取代或未取代的C10-C20烯基。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R2是未取代的C10-C20烷基。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R2是未取代的C10-C20烯基。在一些实施方案中，式(I)和式(la)中的R2是C2-C10亚烷基-L-R6。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R2是-C2-C10亚烷基-C(＝O)O-R6或-C2-C10亚烷基-OC(＝O)-R6。
在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R2是
Figure BDA0003991453200003581
在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的Y是-C(＝O)O-或-OC(＝O)-。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的Y是C(＝O)NR4-或-NR4C(＝O)-。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的Y是-C(＝O)N(CH3)-、-N(CH3)C(＝O)-、-C(＝O)NH-或-NHC(＝O)-。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的Y是-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-或-NR4C(＝O)NR4-。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的Y是-OC(＝O)O-、-NHC(＝O)O-、-OC(＝O)NH-、-NHC(＝O)NH-、-N(CH3)C(＝O)O-.-OC(＝O)N(CH3)-、-N(CH3)C(＝O)N(CH3)-或-N(CH3)C(＝O)NH-。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的Y是-OC(＝O)O-、-NHC(＝O)0-、-OC(＝O)NH-或-NHC(＝O)NH-。
在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R3是-C0-C10亚烷基-NR7R8或-C0-C10亚烷基-杂环烷基，其中亚烷基和杂环烷基独立地是经取代的或未取代的。在一些实施方案中，式(I)和式(Ta)中的R3是-C0-C10亚烷基-NR7R8。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R3是-C1-C6亚烷基-NR7R8。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R3是-C1-C4亚烷基-NR7R8。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R3是-C1-亚烷基-NR7R8。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R3是-C2--亚烷基-NR7R8在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R3是-C3-亚烷基-NR7R8。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R3是-C4-亚烷基-NR7R8。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R3是-C5-亚烷基-NR7R8。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R3是-C0-C10亚烷基-杂环烷基。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R3是-C1-C6亚烷基-杂环烷基其中杂环烷基包含1至3个氮和0-2个氧。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R3是-C1-C6亚烷基-杂环芳基。
在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R7和R8中的每一个独立地是氢或经取代或未取代的C1-C6烷基。在一些实施方案中，R7和R8中的每一个独立地是氢或经取代或未取代的C1-C3烷基。在一些实施方案中，R7和R8中的每一个独立地是经取代或未取代的C1-C3烷基。在一些实施方案中，R7和R8中的每一个独立地是-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3或-CH(CH3)2。在一些实施方案中，R7和R8中的每一个是CH3。在一些实施方案中，R7和R8中的每一个是-CH2CH3。
在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R7和R8与它们所附接的氮一起形成经取代或未取代的C2-C6杂环基。在一些实施方案中，R7和R8与它们所附接的氮一起形成经取代或未取代的C2-C6杂环烷基。在一些实施方案中，R7和R8与它们所附接的氮一起形成经取代或未取代的3-7元杂环烷基。
在一些实施方案中，式(I)和式(la)中的R3是
Figure BDA0003991453200003591
在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R3是
Figure BDA0003991453200003592
在一些实施方案中，式(1)和式(la)中的R3是
Figure BDA0003991453200003601
一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的Z是-C(＝O)O-或-OC(＝O)-。在一些实施方案中，式(1)和式(Ia)中的Z是-C(＝O)NR4-或-NR4C(＝O)-。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的Z是-C(＝O)N(CH3)-、-N(CH3)C(＝O)-、-C(＝O)NH-或-NHC(＝O)-。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的Z是-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(O)NR4-或-NR4C(＝O)NR4-。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的Z是-OC(＝O)O-、-NHC(＝O)O-、-OC(＝O)NH-、-NHC(＝O)NH-、-N(CH3)C(＝O)O-、-OC(＝O)N(CH3)-、-N(CH3)C(＝O)N(CH3)-、-NHC(＝O)N(CH3)-或-N(CH3)C(＝O)NH-。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的Y是-OC(＝O)O-、-NHC(＝O)O-、-OC(＝O)NH-或-NHC(＝O)NH-。
在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R5是氢或经取代或未取代的C1-C3烷基。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R5是H、-CH3、-CH-)CH3、-CH2CH2CH3或-CH(CH3)2。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R5是H。
在一些实施方案中，LNP包含多种氨基脂质。例如，LNP组合物可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种氨基脂质。在另一个实例中，LNP组合物可以包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少9、至少10或至少20种氨基脂质。在又一个实例中，LNP组合物可以包含至多2、至多3、至多4、至多5、至多6、至多7、至多9、至多10、至多20或至多30种氨基脂质。
在一些实施方案中，LNP组合物包含第一氨基脂质。在一些实施方案中，LNP组合物包含第一氨基脂质和第二氨基脂质。在一些实施方案中，LNP组合物包含第一氨基脂质、第二氨基脂质和第三氨基脂质。在一些实施方案中，LNP组合物包含第一氨基脂质、第二氨基脂质、第三氨基脂质和第四氨基脂质。在一些实施方案中，LNP组合物不包含第四氨基脂质。在一些实施方案中，LNP组合物不包含第三氨基脂质。在一些实施方案中，第一氨基脂质与第二氨基脂质的摩尔比是约0.1至约10。在一些实施方案中，第一氨基脂质与第二氨基脂质的摩尔比是约0.20至约5。在一些实施方案中，第一氨基脂质与第二氨基脂质的摩尔比是约0.25至约4。在一些实施方案中，第一氨基脂质与第二氨基脂质的摩尔比是约0.25、约0.33、约0.5、约1、约2、约3或约4。
在一些实施方案中，第一氨基脂质:第二氨基脂质:第三氨基脂质的摩尔比是约4:1:1。在一些实施方案中，第一氨基脂质:第二氨基脂质:第三氨基脂质的摩尔比是约1:1:1。在一些实施方案中，第一氨基脂质:第二氨基脂质:第三氨基脂质的摩尔比是约2:1:1。在一些实施方案中，第一氨基脂质:第二氨基脂质:第三氨基脂质的摩尔比是约2:2:1。在一些实施方案中，第一氨基脂质:第二氨基脂质:第三氨基脂质的摩尔比是约3:2:1。在一些实施方案中，第一氨基脂质:第二氨基脂质:第三氨基脂质的摩尔比是约3:1:1。在一些实施方案中，第一氨基脂质:第二氨基脂质:第三氨基脂质的摩尔比是约5:1:1。在一些实施方案中，第一氨基脂质:第二氨基脂质:第三氨基脂质的摩尔比是约3:3:1。在一些实施方案中，第一氨基脂质:第二氨基脂质:第三氨基脂质的摩尔比是约4:4:1。
在一些实施方案中，LNP组合物包含一种或多种氨基脂质。在一些实施方案中，一种或多种氨基脂质占颗粒中存在的总脂质的约40mol％至约65mol％。在一些实施方案中，一种或多种氨基脂质占颗粒中存在的总脂质的约40mol％、约41mol％、约42mol％、约43mol％、约44mol％、约45mol％、约46mol％、约47mol％、约48mol％、约49mol％、约50mol％、约51mol％、约52mol％、约53mol％、约54mol％、约55mol％、约56mol％、约57mol％、约58mol％、约59mol％、约60mol％、约61mol％、约62mol％、约63mol％、约64mol％或约65mol％。在一些实施方案中，第一氨基脂质占颗粒中存在的总氨基脂质的约1mol％至约99mol％。在一些实施方案中，第一氨基脂质占颗粒中存在的总氨基脂质的约16.7mol％至约66.7mol％。在一些实施方案中，第一氨基脂质占颗粒中存在的总氨基脂质的约20mol％至约60mol％。
在一些实施方案中，氨基脂质是可电离脂质。可电离脂质可以包含一个或多个可电离氮原子。在一些实施方案中，一个或多个可电离氮原子中的至少一个带正电荷。在一些实施方案中，LNP组合物中至少10mol％、20mol％、30mol％、40mol％、50mol％、60mol％、70mol％、80mol％、90mol％、95mol％或99mol％的可电离氮原子带正电荷。在一些实施方案中，氨基脂质包含伯胺、仲胺、叔胺、亚胺、酰胺、胍部分、组氨酸残基、赖氨酸残基、精氨酸残基或其任何组合。在一些实施方案中，氨基脂质包含伯胺、仲胺、叔胺、胍部分或其任何组合。在一些实施方案中，氨基脂质包含叔胺。
在一些实施方案中，氨基脂质是阳离子脂质。在一些实施方案中，氨基脂质是可电离脂质。在一些实施方案中，氨基脂质包含一个或多个氮原子。在一些实施方案中，氨基脂质包含一个或多个可电离氮原子。示例性阳离子和/或可电离脂质包括但不限于3-(双十二烷基氨基)-N1,N1,4-三十二烷基-1-哌嗪乙胺(KL10)、N142-(双十二烷基氨基)乙基]-N1,N4,N4-三十二烷基-1,4-哌嗪二乙胺(KL22)、14,25-双十三烷基-15,18,21,24-四氮杂-三十八烷(KL25)、1,2-二亚油烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLin-DMA)、2,2-二亚油烯基-4-二甲基氨基甲基-
[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC 3-DMA)、2,2-二亚油烯基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DODMA)、2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA)、(2R)-2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA(2R))以及(2S)-2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA(2S))。
在一些实施方案中，本文所述的氨基脂质可以采取盐的形式，诸如药学上可接受的盐。本公开内容涵盖氨基脂质的所有药学上可接受的盐。如本文所用，氨基脂质还包括其药学上可接受的盐及其非对映体、对映体和异构体形式。
在一些实施方案中，本文所述的氨基脂质具有一个或多个立体中心，并且每个立体中心独立地存在于R或S构型中。本文呈现的脂质包括所有的非对映体、对映体和异构体形式及其适当的混合物。本文提供的脂质包括所有顺式(cis)、反式(trans)、顺式(syn)、反式(anti)、反式(entgegen(E))和顺式(zusammen(Z))异构体及其适当的混合物。在某些实施方案中，通过使化合物的外消旋混合物与光学活性拆分剂反应形成一对非对映体化合物/盐，分离非对映体并回收光学纯对映体来将本文所述的脂质制备为其各自的立体异构体。在一些实施方案中，使用本文所述的化合物的共价非对映体衍生物来进行对映体的拆分。在另一个实施方案中，通过基于溶解性差异的分离/拆分技术来分离非对映体。在其他实施方案中，通过色谱法或通过形成非对映体盐并通过重结晶或色谱法分离或其任何组合进行立体异构体的分离。Jean Jacques,Andre Collet,Samuel H.Wilen,“Enantiomers,Racemates and Resolutions”,John Wiley and Sons,Inc.,1981。在一方面，通过立体选择性合成获得离体异构体。
在一些实施方案中，基于本文公开的结构，脂质(诸如氨基脂质)是经取代的。在一些实施方案中，脂质(诸如氨基脂质)是未取代的。在另一个实施方案中，本文所述的脂质被同位素标记(例如，用放射性同位素)或通过其他手段标记，包括但不限于使用发色团或荧光部分、生物发光标记或化学发光标记。
本文所述的脂质包括同位素标记的化合物，其与以本文呈现的各种式和结构叙述的那些化合物相同，只是一个或多个原子被所具有的原子质量或质量数不同于自然界中通常发现的原子质量或质量数的一个原子代替。可以被并入到本发明的脂质中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、硫、氟和氯的同位素，例如像2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、35S、18F、36Cl。在一方面，本文所述的同位素标记的脂质，例如并入放射性同位素(诸如3H和14C)的那些，可用于药物和/或底物组织分布测定。在一方面，用同位素诸如氘进行的取代提供由较大代谢稳定性带来的某些治疗优点，例如像体内半衰期增加或剂量要求减少。
在一些实施方案中，氨基脂质的不对称碳原子以对映体富集的形式存在。在某些实施方案中，氨基脂质的不对称原子具有至少50％对映体过量、至少60％对映体过量、至少70％对映体过量、至少80％对映体过量、至少90％对映体过量、至少95％对映体过量或至少99％对映体过量的(S)-或(R)-构型。
在一些实施方案中，可以将所公开的氨基脂质转化为N-氧化物。在一些实施方案中，通过用氧化剂(例如，3-氯过氧化苯甲酸和/或过氧化氢)处理形成N-氧化物。因此，本文公开了所述氨基脂质的N-氧化物化合物，当化合价和结构允许时，其可以被指定为N O或N+-O-。在一些实施方案中，可以将本公开内容的化合物中的氮转化为N-羟基或N-烷氧基。例如，可以通过用氧化剂诸如ra-CPBA氧化母体胺来制备N-羟基化合物。所有示出和要求保护的含氮化合物也被考虑在内。因此，本文还公开了所述氨基脂质的N-羟基和N烷氧基(例如，N-OR，其中R是经取代或未取代的C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6炔基、3-14元碳环或3-14元杂环)衍生物。
PEG-脂质
如本文所用，“PEG脂质”或“PEG-脂质”是指包含聚乙二醇组分的脂质。
在一些实施方案中，所述的LNP组合物包含PEG-脂质。在一些实施方案中，所述的LNP组合物包含两种或更多种PEG-脂质。示例性PEG-脂质包括但不限于脂质。示例性PEG脂质还包括但不限于PEG改性的磷脂酰乙醇胺、PEG改性的磷脂酸、PEG改性的神经酰胺、PEG改性的二烷基胺、PEG改性的二酰基甘油、PEG改性的二烷基甘油及其混合物。例如，一种或多种PEG-脂质可以包括PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC、PEG-DSPE脂质或其组合。在一些实施方案中，PEG部分是乙二醇或环氧乙烷的任选取代的直链或支链聚合物。在一些实施方案中，PEG部分是经取代的，例如被一个或多个烷基、烷氧基、酰基、羟基或芳基基团取代。在一些实施方案中，PEG部分包括PEG共聚物，诸如PEG-聚氨酯或PEG-聚丙烯(参见例如，j.Milton Harris,Poly(ethylene glycol)chemistry:biotechnical andbiomedical applications(1992))。在一些实施方案中，PEG部分不包括PEG共聚物，例如，它可以是PEG单聚物。示例性PEG-脂质包括但不限于PEG-二月桂酰基甘油、PEG-二肉豆蔻酰基甘油(PEG-DMG)、PEG-二棕榈酰基甘油、PEG-二硬脂酰基甘油(PEG-DSPE)、PEG-二棕榈酰基甘油、PEG-disteiylglycerol、PEG-dilawylglycamide、PEG-二肉豆蔻酰基咪唑双酰胺、PEG-二棕榈酰基咪唑双酰胺、PEG-二硬脂酰基咪唑双酰胺、PEG-胆固醇和PEG-DMB(3,4-双十四氧基苄基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000])。
在一些实施方案中，PEG-脂质是PEG-脂质缀合物，例如PEG与二烷基氧基丙基偶联(例如，PEG-DAA缀合物)、PEG与二酰基甘油偶联(例如，PEG-DAG缀合物)、PEG与胆固醇偶联、PEG与磷脂酰乙醇胺偶联以及PEG与神经酰胺偶联(参见例如，美国专利号5,885,613)、阳离子PEG脂质、聚噁唑啉(POZ)-脂质缀合物(例如，POZ-DAA缀合物；参见例如，WO 2010/006282)、聚酰胺寡聚物(例如，ATTA-脂质缀合物)及其混合物。
PEG-脂质可以包含一个或多个乙二醇单元，例如至少1个、至少2个、至少5个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少120个或至少150个乙二醇单元。在一些实施方案中，PEG-脂质的数均分子量是约200Da至约5000Da。在一些实施方案中，PEG-脂质的数均分子量是约500Da至约3000Da。在一些实施方案中，PEG-脂质的数均分子量是约750Da至约2500Da。在一些实施方案中，PEG-脂质的数均分子量是约750Da至约2500Da。在一些实施方案中，PEG-脂质的数均分子量是约500Da、约750Da、约1000Da、约1250Da、约1500Da、约1750Da或约2000Da。在一些实施方案中，一种或多种PEG-脂质的多分散性指数(PD1)小于2。在一些实施方案中，一种或多种PEG-脂质的PDI是至多1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0。在一些实施方案中，一种或多种PEG-脂质的PDI是至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0。
在一些实施方案中，PEG-脂质占颗粒中存在的总脂质的约0.1mol％至约10mol％。在一些实施方案中，PEG-脂质占颗粒中存在的总脂质的约0.1mol％至约6mol％。在一些实施方案中，PEG-脂质占颗粒中存在的总脂质的约0.5mol％至约5mol％。在一些实施方案中，PEG-脂质占颗粒中存在的总脂质的约1mol％至约3mol％。在一些实施方案中，PEG-脂质占颗粒中存在的总脂质的约2.0mol％至约2.5mol％。在一些实施方案中，PEG-脂质占颗粒中存在的总脂质的约1mol％、约1.1mol％、约1.2mol％、约1.3mol％、约1.4mol％、约1.5mol％、约1.6mol％、约1.7mol％、约1.8mol％、约1.9mol％、约2.0mol％、约2.1mol％、约2.2mol％、约2.3mol％、约2.4mol％、约2.5mol％、约2.6mol％、约2.7mol％、约2.8mol％、约2.9mol％或约3.0mol％。
在一些实施方案中，LNP组合物包含多种PEG-脂质，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同的PEG-脂质。
磷脂
如本文所用，“磷脂”是指包含磷酸酯部分和一个或多个碳链(诸如不饱和脂肪酸链)的脂质。磷脂可以包含一个或多个多重键(例如，双键或三键)。在一些实施方案中，磷脂可以促进与膜的融合。例如，阳离子磷脂可以与膜(例如，细胞或细胞内膜)的一种或多种带负电荷的磷脂相互作用。磷脂与膜的融合可以允许LNP的一种或多种元素穿过膜，即将所述一种或多种元素递送至细胞。
在一些实施方案中，所述的LNP组合物包含磷脂。在一些实施方案中，磷脂包括选自以下的脂质：磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺、甘油磷脂、鞘磷脂、Guriserohosuhono、鞘脂磷脂、天然卵磷脂和氢化磷脂。在一些实施方案中，磷脂包括磷脂酰胆碱。示例性磷脂酰胆碱包括但不限于大豆磷脂酰胆碱、蛋黄磷脂酰胆碱(EPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、2-油酰基-1-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)和二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)。在某些具体实施方案中，磷脂是DSPC。
在一些实施方案中，磷脂包括磷脂酰乙醇胺。在一些实施方案中，磷脂酰乙醇胺是二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、16-0-单体Le PE、16-0-二甲基PE、18-1-反式PE、棕榈酰基油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)或1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)。在一些实施方案中，磷脂包括甘油磷脂。在一些实施方案中，甘油磷脂是缩醛磷脂、磷脂酸酯或磷脂酰胆碱。在一些实施方案中，甘油磷脂是磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、棕榈酰基油酰基磷脂酰甘油(POPG)或溶血磷脂酰胆碱。在一些实施方案中，磷脂包括鞘磷脂。在一些实施方案中，鞘磷脂是神经鞘磷脂、神经酰胺磷酸乙醇胺、神经酰胺磷酸甘油或神经酰胺磷酸甘油磷酸。在一些实施方案中，磷脂包括天然卵磷脂。在一些实施方案中，天然卵磷脂是蛋黄卵磷脂或大豆卵磷脂。在一些实施方案中，磷脂包括氢化磷脂。在一些实施方案中，氢化磷脂是氢化大豆磷脂酰胆碱。在一些实施方案中，磷脂选自：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱和二亚油酰基磷脂酰胆碱。
在一些实施方案中，磷脂包括选自以下的脂质：1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-双十一碳酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、2-油酰基-1-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0二醚PC)、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、2-二亚油烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酸-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)钠盐(DOPG)和鞘磷脂。
磷脂可以包含磷脂部分和一个或多个脂肪酸部分。磷脂部分可以包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、2-溶血磷脂酰胆碱或鞘磷脂。脂肪酸部分可以包括月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻脑酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、芥酸、植酸、花生酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、山萮酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸。在一些具体实施方案中，磷脂可以用一种或多种炔烃官能化或与其交联，所述炔烃在暴露于叠氮化物时可以经历铜催化的环加成。
在一些实施方案中，LNP组合物包含多种磷脂，例如至少2、3、4、5或更多种不同的磷脂。在一些实施方案中，磷脂占颗粒中存在的总脂质的约1mol％至20mol％。在一些实施方案中，磷脂占颗粒中存在的总脂质的约5mol％至约15mol％。在一些实施方案中，磷脂占颗粒中存在的总脂质的约8mol％至约12mol％。在一些实施方案中，磷脂占颗粒中存在的总脂质的约9mol％、10mol％或11mol％。
胆固醇
在一些实施方案中，LNP组合物包含胆固醇或其衍生物。在一些实施方案中，LNP组合物包含结构脂质。结构脂质可以选自类固醇、甾醇、烷基间苯二酚、胆固醇或其衍生物、粪甾醇、谷甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜子甾醇、番茄碱、番茄苷、熊果酸、α生育酚及其组合。在一些实施方案中，结构脂质是皮质类固醇，诸如泼尼松龙、地塞米松、泼尼松和氢化可的松。在一些实施方案中，胆固醇或其衍生物是胆固醇、5-十七烷基间苯二酚或胆固醇半琥珀酸酯。在一些实施方案中，胆固醇或其衍生物是胆固醇。
在一些实施方案中，胆固醇或其衍生物是胆固醇衍生物。在一些实施方案中，胆固醇衍生物是极性胆固醇类似物。在一些实施方案中，极性胆固醇类似物是5a-胆甾烷醇、513-粪甾烷醇、胆固醇基-(2’-羟基)-乙醚、胆固醇基-(4’-羟基)-丁醚或6-胆甾烷醇酮。在一些实施方案中，极性胆固醇类似物是胆固醇基-(4’-羟基)-丁醚。在一些实施方案中，胆固醇衍生物是非极性胆固醇类似物。在一些实施方案中，非极性胆固醇类似物是5a胆甾烷、胆甾烯酮、5α-胆甾烷酮、5β-胆甾烷酮或胆固醇基癸酸酯。
在一些实施方案中，胆固醇或其衍生物占颗粒中存在的总脂质的约20mol％至50mol％。在一些实施方案中，胆固醇或其衍生物占颗粒中存在的总脂质的约20mol％、约21mol％、约22mol％、约23mol％、约24mol％、约25mol％、约26mol％、约27mol％、约28mol％、约29mol％、约30mol％、约31mol％、约32mol％、约33mol％、约34mol％、约35mol％、约36mol％、约37mol％、约38mol％、约39mol％、约40mol％、约41mol％、约42mol％、约43mol％、约44mol％、约45mol％、约46mol％、约47mol％、约48mol％或约50mol％。
磷酸酯电荷中和剂
在一些实施方案中，本文所述的LNP组合物包含磷酸酯电荷中和剂。在一些实施方案中，磷酸酯电荷中和剂包括精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、组氨酸、阳离子树枝状聚合物、聚胺或其组合。在一些实施方案中，磷酸酯电荷中和剂包含一个或多个氮原子。在一些实施方案中，磷酸酯电荷中和剂包括聚胺。在一些实施方案中，聚胺是1,3-丙二胺、精胺、亚精胺、去亚精胺、三(2-氨基乙胺)、环烯、1,4,7-三氮杂环壬烷、1,1,1-三(氨基甲基)乙烷、二乙烯三胺、三乙烯四胺或其组合。在一些实施方案中，聚胺是1,3-丙二胺、1,4-丁二胺、精胺、亚精胺或其组合。在一些实施方案中，磷酸酯电荷中和剂的N/P比率是0.01至10。在一些实施方案中，磷酸酯电荷中和剂的N/P比率是约0.05至约2。在一些实施方案中，磷酸酯电荷中和剂的N/P比率是约0.1至约1。在一些实施方案中，磷酸酯电荷中和剂的N/P比率是约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9或约1。在一些实施方案中，磷酸酯电荷中和剂的NIP比率是约0.25、0.5或0.75。
抗氧化剂
在一些实施方案中，本文所述的LNP组合物包含一种或多种抗氧化剂。在一些实施方案中，一种或多种抗氧化剂用于减少阳离子脂质、有效载荷或两者的降解。在一些实施方案中，一种或多种抗氧化剂包括亲水性抗氧化剂。在一些实施方案中，一种或多种抗氧化剂是螯合剂，诸如乙二胺四乙酸(EDTA)和柠檬酸盐。在一些实施方案中，一种或多种抗氧化剂是EDTA。在一些实施方案中，一种或多种抗氧化剂包括亲脂性抗氧化剂。在一些实施方案中，亲脂性抗氧化剂包括维生素E异构体或多酚。在一些实施方案中，一种或多种抗氧化剂以至少1mM、至少10mM、至少20mM、至少50mM或至少100mM的浓度存在于LNP组合物中。在一些实施方案中，一种或多种抗氧化剂以约20mM的浓度存在于颗粒中。
有效载荷
本文所述的LNP可以被设计来递送有效载荷，诸如治疗剂或感兴趣的靶标。在一些实施方案中，本文所述的LNP包封如本文所述的碱基编辑系统的一种或多种组分。例如，LNP可以包封指导RNA、编码指导RNA的核酸、编码指导RNA的载体、碱基编辑器融合蛋白、编码碱基编辑器融合蛋白的核酸、可编程DNA结合结构域、编码可编程DNA结合结构域的核酸、脱氨酶、编码脱氨酶的核酸中的一种或多种或全部或其任何组合。在一些实施方案中，核酸是DNA。在一些实施方案中，核酸是RNA，例如mRNA。
另外的示例性治疗剂包括但不限于抗体(例如，单克隆、嵌合、人源化、纳米抗体及其片段等)、胆固醇、激素、肽、蛋白质、化疗剂和其他类型的抗肿瘤药剂、低分子量药物、维生素、辅因子、核苷、核苷酸、寡核苷酸、酶核酸、反义核酸、三链形成寡核苷酸、反义DNA或RNA组合物、嵌合DNA:RNA组合物、等位基因酶、适配体、核酶、诱饵及其类似物、质粒和其他类型的表达载体、以及小核酸分子、RNAi剂、短干扰核酸(siNA)、信使核糖核酸(信使RNA，mRNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)和短发夹RNA(shRNA)分子、肽核酸(PNA)、锁核酸核糖核苷酸(LNA)、吗啉核苷酸、苏糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)、sisiRNA(小的内部分段干扰RNA)、aiRNA(非对称干扰RNA)以及在有义链与反义链之间与相关细胞和/或组织(诸如细胞培养物、对象或生物体中)具有1、2或更多个错配的siRNA。治疗剂可以是纯化的或部分纯化的，并且可以是天然存在的或合成的，或经化学改性的。在一些实施方案中，治疗剂是RNAi剂、短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)分子。在一些实施方案中，治疗剂是mRNA。
在一些实施方案中，有效载荷包括一种或多种核酸(即，一种或多种核酸分子实体)。在一些实施方案中，核酸是单链核酸。在一些实施方案中，单链核酸是DNA。在一些实施方案中，单链核酸是RNA。在一些实施方案中，核酸是双链核酸。在一些实施方案中，双链核酸是DNA。在一些实施方案中，双链核酸是RNA。在一些实施方案中，双链核酸是DNA-RNA杂交体。在一些实施方案中，核酸是信使RNA(mRNA)、微RNA、非对称干扰RNA(aiRNA)、小发夹RNA(shRNA)或Dicer-底物dsRNA。
其他脂质
在一些实施方案中，所公开的LNP组合物包含辅助脂质。在一些实施方案中，所公开的LNP组合物包含中性脂质。在一些实施方案中，所公开的LNP组合物包含隐形脂质。在一些实施方案中，所公开的LNP组合物包含另外的脂质。
如本文所用，适于在本公开内容的脂质组合物中使用的中性脂质包括例如各种中性、不带电荷或两性离子脂质。适于在本公开内容中使用的中性磷脂的实例包括但不限于5-十七烷基苯-1,3-二醇(间苯二酚)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、磷脂酰胆碱(PLPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DAPC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、蛋黄磷脂酰胆碱(EPC)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(DLPC)、1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(MPPC)、1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(PMPC)、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基磷脂酰胆碱(PSPC)、1,2-二花生酰基sn-甘油-3-磷酸胆碱(DBPC)、1-硬脂酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(SPPC)、1,2-双二十碳烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DEPC)、2-油酰基-1-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、溶血磷脂酰胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、二亚油酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、溶血磷脂酰乙醇胺及其组合。在一些实施方案中，中性磷脂选自DSPC和二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)。在一些实施方案中，中性磷脂是DSPC。中性脂质可以用于稳定并改善LNP的加工。
辅助脂质可以指增强转染(例如，包含如本文提供的组合物的纳米颗粒(LNP)，包括生物活性剂的转染)的脂质。辅助脂质增强转染的机制包括增强颗粒稳定性。在一些实施方案中，辅助脂质增强膜融合性(fusogenicity)。辅助脂质可以包括类固醇、甾醇和烷基间苯二酚。适于在本公开内容中使用的辅助脂质可以包括但不限于胆固醇、5-十七烷基间苯二酚和胆固醇半琥珀酸酯。在一些实施方案中，辅助脂质是胆固醇。在一些实施方案中，辅助脂质是胆固醇半琥珀酸酯。
隐形脂质可以指改变纳米颗粒在体内(例如，在血液中)存在的时间长度的脂质。隐形脂质可以通过例如减少颗粒聚集和控制粒径来协助配制过程。本文所用的隐形脂质可以调节LNP的药代动力学特性。适于在本公开内容的脂质组合物中使用的隐形脂质可以包括但不限于具有与脂质部分连接的亲水性头部基团的隐形脂质。适于在本公开内容的脂质组合物中使用的隐形脂质和关于此类脂质的生物化学的信息可以在Romberg等人,Pharmaceutical Research,第25卷,1号,2008,第55-71页和I-Toekstra等人,Biochimicaet Biophysica Acta 1660(2004)41-52中找到。另外的合适PEG脂质公开于例如WO 2006/007712中。
在一些实施方案中，隐形脂质是PEG-脂质。在一个实施方案中，隐形脂质的亲水性头部基团包括选自基于以下的聚合物的聚合物部分：PEG(有时被称为聚环氧乙烷)、聚(噁唑啉)、聚(乙烯醇)、聚(甘油)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚氨基酸和聚N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺]。隐形脂质可以包含脂质部分。在一些实施方案中，隐形脂质的脂质部分可以衍生自二酰基甘油或二酰基咪唑双酰胺，包括包含二烷基甘油和二烷基咪唑双酰胺基团的那些，所述基团具有独立地包含约C4至约C40饱和或不饱和碳原子的烷基链长，其中所述链可以包含一个或多个官能团，例如像酰胺或酯。二烷基甘油和二烷基咪唑双酰胺基团还可以包含一个或多个经取代的烷基基团。
辅助脂质、中性脂质、隐形脂质和/或其他脂质的结构和特性还描述于以下中：W02017173054A1、W02019067999A1、US20180290965A1、US20180147298A1、US20160375134A1、US8236770、US8021686、US8236770B2、US7371404B2、US7780983B2、US7858117B2、US20180200186A1、US20070087045A1、W02018119514A1和W02019067992A1，其全部特此通过引用以其全文并入。
LNP配制品
文所述的LNP可以被设计用于一个或多个具体应用或靶标。纳米颗粒(LNP)组合物或组合物的元素可以基于特定应用或靶标和/或基于功效、毒性、费用、易用性和可用性来选择。类似地，纳米颗粒组合物的特定配制品是包含一种或多种所述脂质的组合物。可以针对特定应用或靶标来选择。在配制品中使用的合适的磷酸酯电荷中和剂包括但不限于亚精胺和1,3-丙二胺。
所述的LNP配制品可以被设计用于一个或多个具体应用或靶标。例如，纳米颗粒组合物可以被设计来将治疗剂诸如RNA递送至哺乳动物体内的特定细胞、组织、器官或其系统或其组。纳米颗粒组合物的理化特性可以改变，以便增加对具体身体靶标的选择性。例如，可以基于不同器官的开窗术尺寸来调整粒径。纳米颗粒组合物中包含的治疗剂还可以基于所需的递送靶标或靶标来选择。例如，治疗剂可以针对特定适应症、病症、疾病或病症和/或针对递送至特定细胞、组织、器官或系统或其组(例如，局部或特异性递送)来选择。在某些实施方案中，纳米颗粒组合物可以包含编码感兴趣的多肽的mRNA，所述mRNA能够在细胞内被翻译以产生感兴趣的多肽。这种组合物可以被设计来特异性地递送至特定器官。
LNP组合物中治疗剂的量可以取决于纳米颗粒组合物的大小、组成、所需的靶标和/或应用或其它特性。例如，纳米颗粒组合物中包含的RNA的量可以取决于RNA的大小、序列和其他特征。纳米颗粒组合物中治疗剂和其他元素(例如，脂质)的相对量也可以变化。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物中脂质组分与治疗剂的wt/wt比率可以是约5:1至约60:1，诸如约5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1和60:1。例如，脂质组分与治疗剂的wt/wt比率可以是约10:1至约40:1。在某些实施方案中，wt/wt比率是约20:1。纳米颗粒组合物中治疗剂的量可以使用吸收光谱法(例如紫外-可见光谱法)来测量。
在一些实施方案中，LNP组合物包含一种或多种核酸，诸如RNA。在一些实施方案中，可以选择一种或多种RNA、脂质及其量以提供特定NIP比率。NIP比率可以选自约1至约30。N/P比率可以选自约2至约10。在一些实施方案中，NIP比率是约0.1至约50。在一些实施方案中，N/P比率约2至约8。在一些实施方案中，NIP比率是约2至约15、约2至约10、约2至约8、约2至约6、约3至约15、约3至约10、约3至约8、约3至约6、约4至约15、约4至约10、约4至约8、或约4至约6。在一些实施方案中，N/P比率是约2、约2.5、约3、约3.5、约4、约4.5、约5、约5.5、约6或约6.5。在一些实施方案中，NIP比率是约4至约6。在一些实施方案中，NIP比率是约4、约4.5、约5、约5.5或约6。
在一些实施方案中，LNP形成为具有范围为约50％至约70％、约70％至约90％、或约90％至约100％的平均包封效率。在一些实施方案中，LNP形成为具有范围为约75％至约95％的平均包封效率。
在另一方面，本文提供了一种脂质纳米颗粒(LNP)，其包含如本文提供的组合物。如本文所用，脂质纳米颗粒(LNP)组合物或纳米颗粒组合物是包含一种或多种所述脂质的组合物。LNP组合物的大小量级通常为微米或更小，并且可以包括脂质双层。纳米颗粒组合物涵盖脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体(例如，脂质囊泡)和脂质复合物。在一些实施方案中，LNP是指直径小于1000nm、500nm、250nm、200nm、150nm、100nm、75nm、50nm或25nm的任何颗粒。在一些实施方案中，纳米颗粒的大小范围可以是1-1000nm、1-500nm、1-250nm、25-200nm、25-100nm、35-75nm或25-60nm。在一些实施方案中，脂质体具有直径为500nm或更小的脂质双层。在一些实施方案中，本文所述的LNP可以具有约1nm至约2500nm、约10nm至约1500nm、约20nm至约1000nm、约30nm至约150nm、约40nm至约150nm、约50nm至约150nm、约60nm至约130nm、约70nm至约110nm、约70nm至约100nm、约80nm至约100nm、约90nm至约100nm、约70至约90nm、约80nm至约90nm、或约70nm至约80nm的平均直径。本文所述的LNP可以具有约30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm、150nm或更大的平均直径。本文所述的LNP可以是基本上无毒的。
在一些实施方案中，LNP可以由阳离子、阴离子或中性脂质制成。在一些实施方案中，LNP可以包含中性脂质，诸如膜融合磷脂1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)或膜组分胆固醇，作为辅助脂质以增强转染活性和纳米颗粒稳定性。在一些实施方案中，LNP可以包含疏水性脂质、亲水性脂质或疏水性和亲水性脂质两者。本领域已知的任何脂质或脂质组合均可以用于产生LNP。用于产生LNP的脂质的实例包括但不限于DOTMA(N[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵)、DOSPA(N,N-二甲基-N-([2-精胺羧酰胺基]乙基)-2,3-双(二油烯基氧基)-1-丙亚胺五盐酸盐)、DOTAP(1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷)、DMRIE(N-(2-羟基乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基-1-溴丙胺)、DC-胆固醇(3β-[N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇)、DOTAP-胆固醇、GAP-DMORIE-DPyPE和GL67A-DOPE-DMPE(,2-双(二甲基膦)乙烷)-聚乙二醇(PEG)。阳离子脂质的实例包括但不限于98N12-5、C12-200、DLin-KC2-DMA(KC2)、DLin-MC3-DMA(MC3)、XTC、MD1和7C1。中性脂质的实例包括但不限于DPSC、DPPC(二棕榈酰基磷脂酰胆碱)、POPC(1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DOPE和SM(鞘磷脂)。PEG改性的脂质的实例包括但不限于PEG-DMG(二肉豆蔻酰基甘油)、PEG-CerC14和PEG-CerC20。在一些实施方案中，脂质可以以任何数量的摩尔比组合以产生LNP。在一些实施方案中，多核苷酸可以以宽范围的摩尔比与一种或多种脂质组合以产生LNP。
除非另外指示，否则术语“取代”是指用指定取代基的自由基替换给定结构中的一个或多个氢自由基，所述指定取代基包括但不限于：卤代基、烷基、烯基、炔基、芳基、杂环基、硫醇、烷基硫基、氧代基、硫氧基、芳基硫基、烷基硫代烷基、芳基硫代烷基、烷基磺酰基、烷基磺酰基烷基、芳基磺酰基烷基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、氨基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、卤代烷基、氨基、三氟甲基、氰基、硝基、烷基氨基、芳基氨基、烷基氨基烷基、芳基氨基烷基、氨基烷基氨基、羟基、烷氧基烷基、羧基烷基、烷氧基羰基烷基、氨基羰基烷基、酰基、芳烷氧基羰基、羧酸、磺酸、磺酰基、膦酸、芳基、杂芳基、杂环和脂肪族基团。应理解，取代基可以被进一步取代。示例性取代基包括氨基、烷基氨基等。
如本文所用，术语“取代基”是指在指定原子位置处被取代、从而替换指定原子上的一个或多个氢的核心分子的原子上的位置变量，前提是不超过指定原子的正常化合价，并且取代产生稳定的化合物。只有当此类组合产生稳定化合物时，取代基和/或变量的组合才是允许的。本领域普通技术人员应注意，任何碳以及具有似乎不满足的本文所述或所示的价态的杂原子都假定具有足够数量的氢原子来满足所述或所示的价态。在某些情况下，具有双键(例如，“氧代基”或“＝O”)作为附接点的一个或多个取代基可以在本文中描述、示出或列在取代基基团内，其中所述结构可以仅显示单个键作为与式(I)的核心结构的附接点。本领域普通技术人员将理解，虽然仅显示单个键，但双键针对这些取代基是可用的。
术语“烷基”是指直链或支链烃链自由基，所述自由基具有一至二十个碳原子，并且通过单键附接至分子的其余部分。包含多达10个碳原子的烷基被称为C1-C10烷基，同样，例如包含多达6个碳原子的烷基是C1-C6烷基。包含其他数量的碳原子的烷基(和本文定义的其他部分)以类似的方式表示。烷基基团包括但不限于C1-C10烷基、C1-C9烷基、C1-C8烷基、C1-C7烷基、C1-C6烷基、C1-C5烷基、C1-C4烷基、C1-C3烷基、C1-C2烷基、C2-C8烷基、C3-C8烷基和C4-C8烷基。表性的烷基基团包括但不限于甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、异丁基、s-丁基、正戊基、1,1-二甲基乙基(叔丁基)、3-甲基己基、2-甲基己基、1-乙基-丙基等。在一些实施方案中，烷基是甲基或乙基。在一些实施方案中，烷基是-CH(CH3)2或-C(CH3)3。除非在说明书中明确地另外声明，否则烷基基团是如本文所述任选取代的。“亚烷基”或“亚烷基链”是指将分子的其余部分连接至自由基基团的直链或支链二价烃链。在一些实施方案中，亚烷基是-CI-12-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-。在一些实施方案中，亚烷基是-CH2-。在一些实施方案中，亚烷基是-CH2CH2-。在一些实施方案中，亚烷基是-CH2CH2CH2-。
术语“烯基”是指其中存在至少一个碳-碳双键的烷基基团类型。在一个实施方案中，烯基基团具有式-C(R)＝CR2，其中R是指烯基基团的其余部分，其可以是相同或不同的。在一些实施方案中，R是H或烷基。在一些实施方案中，烯基选自乙烯基(即，乙烯基)、丙烯基(即，烯丙基)、丁烯基、戊烯基、戊二烯基等。烯基基团的非限制性实例包括-CH＝CH2、-C(CH3)＝CH2、-CH＝CHCH3、-C(CH3)＝CHCH3和-CH2CH＝CH2。
术语“环烷基”是指单环或多环非芳族自由基，其中形成环的每个原子(即，骨架原子)是碳原子。在一些实施方案中，环烷基是饱和的或部分不饱和的。在一些实施方案中，环烷基是螺环或桥接化合物。在一些实施方案中，环烷基与芳环稠合(在这种情况下，环烷基通过非芳环碳原子键合)。环烷基基团包括具有3至10个环原子的基团。代表性的环烷基包括但不限于具有三至十个碳原子、三至八个碳原子、三至六个碳原子、或三至五个碳原子的环烷基。单环环烷基自由基包括例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。在一些实施方案中，单环环烷基是环丙基、环丁基、环戊基或环己基。在一些实施方案中，单环环烷基是环戊烯基或环己烯基。在一些实施方案中，单环环烷基是环戊烯基。多环自由基包括例如金刚烷基、1,2-二氢萘基、1,4-二氢萘基、四氢萘基、十氢萘基、3,4-二氢萘基-.l(2H)-酮、螺[2.2]戊基、降冰片基和双环[1.1.1]戊基。除非在说明书中明确地另外声明，否则环烷基基团可以是任选取代的。根据结构，环烷基基团可以是单价的或二价的(即，环亚烷基基团)。
术语“杂环(heterocycle)”或“杂环(heterocyclic)”是指杂芳环(也被称为杂芳基)和杂环烷基环(也被称为脂族杂环基基团)，其包含至少一个选自氮、氧和硫的杂原子，其中每个杂环基团在其环系统中具有3至12个原子，并且条件是任何环不含两个相邻的O或S原子。“杂环基”是通过从杂环化合物的任何环原子中去除氢原子而形成的单价基团。在一些实施方案中，杂环是单环、双环、多环、螺环或桥接化合物。非芳族杂环基团(也被称为杂环烷基)包括在其环系统中具有3至12个原子的环，并且芳族杂环基团包括在其环系统中具有5至12个原子的环。杂环基团包括苯并稠合的环系统。非芳族杂环基团的实例是吡咯烷基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、噁唑烷酮基、四氢吡喃基、二氢吡喃基、四氢噻喃基、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、噻噁烷基(thioxanyl)、哌嗪基、吖丙啶基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、高哌啶基、氧杂环庚烷基、硫杂环庚烷基、氧杂环庚烷基、二氮杂环基、硫氮杂环基(thiazepinyl)、1,2,3,6-四氢吡啶基、吡咯啉-2-基、吡咯啉-3-基、二氢吲哚基、2H-吡喃基、4H吡喃基、二氧杂烷基、1,3-二氧杂环戊烷基、吡唑啉基、二噻烷基、二硫烷基、二氢吡喃基、二氢噻吩基、二氢呋喃基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、3-氮杂双环[3.1.0]己烷基、3-氮杂双环[4.1.0]庚烷基、3h-吲哚基、吲哚啉-2-酮基、异吲哚啉-1-酮基、异吲哚啉-1,3-二酮基、3,4-二氢异喹啉-1(2H)-酮基、3,4-二氢异喹啉-2(1H)-酮基、异吲哚啉-1,3-二亚硫酰基、苯并[d]噁唑-2(3H)-酮基、1H-苯并[d]咪唑-2(3H)-酮基、苯并[d]噻唑-2(3H)-酮基和喹啉嗪基。芳族杂环基团的实例是吡啶基、咪唑基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、喹啉基、异喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、噌啉基、吲唑基、吲嗪基、酞嗪基、哒嗪基、三嗪基、异吲哚基、蝶啶基、嘌呤基、噁二唑基、噻二唑基、呋吖基、苯并呋吖基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基和呋喃并吡啶基。在可能的情况下，前述基团是C附接的(C连接的)或N附接的。例如，衍生自吡咯的基团包括吡咯-1-基(N附接的)或吡咯-3-基(C附接的)。此外，衍生自咪唑的基团包括咪唑-1-基或咪唑-3-基(均为N附接的)或咪唑-2-基、咪唑-4-基或咪唑-5-基(全部为C附接的)。杂环基团包括苯并稠合的环系统。非芳族杂环任选地被一个或两个氧代基(＝O)部分，诸如吡咯烷-2-酮取代。在一些实施方案中，双环杂环的两个环中的至少一个是芳族的。在一些实施方案中，双环杂环的两个环均是芳族的。
术语“杂环烷基”是指包含至少一个选自氮、氧和硫的杂原子的环烷基基团。除非在说明书中明确地另外声明，否则杂环烷基自由基可以是单环或双环系统，其可以包括稠合(当与芳基或杂芳基环稠合时，杂环烷基通过非芳族环原子键合)或桥接环系统。杂环基自由基中的氮、碳或硫原子可以任选地被氧化。氮原子可以任选地被季铵化。杂环烷基自由基是部分或完全饱和的。杂环烷基自由基的实例包括但不限于二氧杂环戊烷基、噻吩基[1,3]二噻烷基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎宁环基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三噻烷基、四氢吡喃基、硫代吗啉基、硫杂吗啉基、1-氧代硫代吗啉基和1,1-二氧代-硫代吗啉基。术语杂环烷基还包括所有环形式的碳水化合物，包括但不限于单糖、二糖和寡糖。除非另外说明，否则杂环烷基在环中具有2至12个碳。在一些实施方案中，杂环烷基在环中具有2至10个碳。在一些实施方案中，杂环烷基在环中具有2至10个碳和1或2个N原子。在一些实施方案中，杂环烷基在环中具有2至10个碳和3或4个N原子。在一些实施方案中，杂环烷基在环中具有2至12个碳、0-2个N原子、0-2个O原子、0-2个P原子和0-1个S原子。在一些实施方案中，杂环烷基在环中具有2至12个碳、1-3个N原子、0-1个O原子和0-1个S原子。应理解，当提及杂环烷基中的碳原子数时，杂环烷基中的碳原子数与构成杂环烷基(即，杂环烷基环的骨架原子)的原子总数(包括杂原子)不同。除非在说明书中明确地另外声明，否则杂环烷基基团可以是任选取代的。如本文所用，术语“四环亚烷基”可以指二价杂环烷基基团。
术语“杂芳基”是指包含一个或多个选自氮、氧和硫的环杂原子的芳基基团。杂芳基是单环的或双环的。单环杂芳基的说明性实例包括吡啶基、咪唑基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、哒嗪基、三嗪基、噁二唑基、噻二唑基、呋咱基、吲嗪、吲哚、苯并呋喃、苯并噻吩、吲唑、苯并咪唑、嘌呤、喹嗪、喹啉、异喹啉、噌啉、酞嗪、喹唑啉、喹喔啉、1,8-萘啶和蝶啶。单环杂芳基的说明性实例包括吡啶基、咪唑基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、哒嗪基、三嗪基、噁二唑基、噻二唑基和呋咱基。双环杂芳基的说明性实例包括吲嗪、吲哚、苯并呋喃、苯并噻吩、吲唑、苯并咪唑、嘌呤、喹嗪、喹啉、异喹啉、噌啉、酞嗪、喹唑啉、喹喔啉、1,8-萘啶和蝶啶。在一些实施方案中，杂芳基是吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、噻唑基、噻吩基、噻二唑基或呋喃基。在一些实施方案中，杂芳基在环中含有0-6个N原子。在一些实施方案中，杂芳基在环中含有1-4个N原子。在一些实施方案中，杂芳基在环中含有4-6个N原子。在一些实施方案中，杂芳基在环中含有0-4个N原子、0-1个O原子、0-1个P原子和0-1个S原子。在一些实施方案中，杂芳基在环中含有1-4个N原子、0-1个O原子和0-1个S原子。在一些实施方案中，杂芳基是C1-C9杂芳基。在一些实施方案中，单环杂芳基是C1-C5杂芳基。在一些实施方案中，单环杂芳基是5元或6元杂芳基。在一些实施方案中，双环杂芳基是C6-C9杂芳基。在一些实施方案中，杂芳基被部分还原以形成本文定义的杂环烷基基团。在一些实施方案中，杂芳基被完全还原以形成本文定义的杂环烷基基团。
如本文所用，“N/P比率”是例如在包含脂质组分和RNA的纳米颗粒组合物中，一种或多种脂质中的可电离(例如，在生理pH范围内)氮原子与一种或多种核酸分子实体中的磷酸酯基团的摩尔比。可电离氮原子可以包括例如可以在约pH 1、约pH 2、约pH 3、约pH 4、约pH 5、约pH 6、约pH 7、约pH 7.5或约pH 8或更高时质子化的氮原子。生理pH范围可以包括例如不同细胞区室(诸如器官、组织和细胞)和体液(诸如血液、CSF、胃液、牛奶、胆汁、唾液、泪液和尿液)的pH范围。在某些具体实施方案中，生理pH范围是指哺乳动物的血液的pH范围，例如约7.35至约7.45。类似地，对于具有一个或多个可电离氮原子的磷酸酯电荷中和剂，N/P比率可以指磷酸酯电荷中和剂中可电离氮原子与核酸中磷酸酯基团的摩尔比。在一些实施方案中，可电离氮原子是指在5与14之间的pH范围内可电离的那些氮原子。
还设想，包封本文所述的gRNA和mRNA药物物质的LNP配制品可以被修改为包括GalNac脂质配制品，诸如在共同拥有的于2021年3月4日提交的美国专利申请序列号17/192,709和在相同日期提交的具有国际申请号PCT/US21/20955的并行PCT申请中公开的那些。应理解，采用此类GalNac脂质配制品能够增强LDL-R缺乏型细胞，诸如与杂合子和纯合子家族性高胆固醇血症患者群体相关联的那些细胞中的LNP摄取。
对于不含磷酸酯基团的有效载荷，N/P比率可以指脂质中可电离氮原子与有效载荷中总负电荷的摩尔比。例如，LNP组合物的N/P比率可以指LNP组合物中总可电离氮原子与组合物中存在的有效载荷中总负电荷的摩尔比。
如本文所用，氨基脂质可以含有至少一个伯胺、仲胺或叔胺部分，其在4与14之间的pH范围内可质子化(或可电离)。在一些实施方案中，一个或多个胺部分充当氨基脂质的亲水性头部基团。当核酸-脂质纳米颗粒配制品中一种或多种氨基脂质的大部分胺部分在生理pH下质子化时，所述纳米颗粒可以被称为阳离子脂质纳米颗粒(cLNP)。当核酸-脂质纳米颗粒配制品中一种或多种氨基脂质的大部分胺部分在生理pH下不质子化但在酸性pH(例如，内体pH)下可以质子化时，所述纳米颗粒可以被称为可电离脂质纳米颗粒(iLNP)。构成cLNP的氨基脂质通常可以被称为阳离子氨基脂质(cLipid)。构成iLNP的氨基脂质可以被称为可电离氨基脂质(iLipid)。氨基脂质在生理pH下可以是iLipid或cLipid。
试剂盒
本公开内容的一方面涉及用于治疗或预防病症的试剂盒，其包括如本文提供的包含单指导RNA的组合物、如本文提供的碱基编辑器系统和复合物、如本文提供的组合物或如本文提供的脂质纳米颗粒。所述试剂盒还可以包括用于治疗或预防病症的一种或多种另外的治疗方案或治疗剂。
在某些实施方案中，本文还公开了与本文所述的一种或多种方法一起使用的试剂盒和制品。此类试剂盒包括载体、包装或容器，其被分隔以容纳一个或多个容器，诸如小瓶、管等，每个容器包含待用于本文所述方法的单独元素中的一种。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。在一个实施方案中，容器由各种材料(诸如玻璃或塑料)制成。
本文提供的制品含有包装材料。药物包装材料的实例包括但不限于泡罩包装、瓶、管、袋、容器、瓶、以及适用于所选配制品以及预期施用方式和治疗的任何包装材料。
例如，一个或多个容器包括本公开内容的组合物，并且除此之外任选地包括本文公开的治疗方案或治疗剂。此类试剂盒任选地包括与其在本文所述的方法中的使用有关的鉴定描述或标签或说明书。
试剂盒通常包括列出内容物和/或使用说明书的标签、以及包含使用说明书的包装说明书。通常还将包括一组指令。
在实施方案中，标签在容器上或与容器相关联。在一个实施方案中，当形成标签的字母、数字或其他字符被贴附、模制或蚀刻到容器本身中时，标签在容器上；当标签存在于也容纳容器的器皿或载体内时，标签与容器相关联，例如作为包装说明书。在一个实施方案中，标签用于指示内容物将用于特定治疗应用。标签还指示使用内容物的方向，诸如在本文所述的方法中。
实施例
介绍
将通过特定实施例更详细地描述本公开内容。这些实施例仅仅出于说明性目的提供，并且不限制本文提供的权利要求的范围。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改各种非临界参数以根据本公开内容产生替代性实施方案。
基因编辑技术，包括CRISPR-Cas9核酸酶和CRISPR碱基编辑器，具有精确且永久地修饰人类患者的致病基因的潜力。在非人灵长类动物(NHP)的靶器官中证明持久编辑是临床试验中向患者体内施用基因编辑器之前的重要且必要的步骤。本文首次证明了，使用脂质纳米颗粒(LNP)在体内递送的CRISPR碱基编辑器可以有效地修饰NHP中的疾病相关基因。除了为降低胆固醇和治疗冠心病(全球主要死亡原因)的一次性方法提供概念验证之外，这些结果还证明了CRISPR碱基编辑器如何可以有效地应用于肝脏和潜在其他器官中的各种治疗靶基因。
体内基因编辑是一种新兴的新治疗方法，用于在患者体内的肝脏等器官中进行DNA修饰。基因编辑方法包括CRISPR-Cas9和-Cas12核酸酶、CRISPR胞嘧啶碱基编辑器、CRISPR腺嘌呤碱基编辑器和CRISPR先导编辑器。人PCSK9和ANGPTL3基因是用于体内基因编辑的特别有吸引力的潜在靶标。原则上，相比于所有现有疗法(例如，他汀类药物、依泽替米贝(ezetimibe)或PCSK9抑制剂，所述疗法必须每天或每隔几周到几个月服用一次，并且可能缺乏患者依从性)，编辑PCSK9可以持久地降低血液LDL-C水平，并且因此明显降低人对LDL-C的累积暴露。
可以在肝脏中引入PCSK9或ANGPTL3功能丧失突变的基因编辑器的体内递送有可能提供一种新的一次性疗法，其为冠心病提供终身治疗。为此目的，CRISPR碱基编辑器成为了一种有吸引力的基因编辑方式，因为它们可以有效地引入精确的靶向改变，并且相比于CRISPR-Cas9和其他基因编辑核酸酶，最大限度地减少引入双链DNA断裂的任何有害后果。
CRISPR腺嘌呤碱基编辑器可以在DNA中诱导靶向AG编辑(相反链上TC)，并且可以通过破坏外显子-内含子或内含子-外显子边界的起始密码子、剪接供体(有义链上的典型GT序列)或剪接受体(有义链上的典型AG序列)或引入错义突变来使基因失活。腺嘌呤8.8-m(以下称为ABE8.8)使用其核心酿脓链球菌切口酶Cas9(nSpCas9)蛋白与指导RNA(gRNA)来接合双链原间隔子DNA序列，在其3’末端上侧翼是NGG原间隔子相邻基序(PAM)序列。经由将gRNA的前20个碱基与“靶”DNA链上的互补序列杂交，将另一条(“非靶标”)链的一部分留在被称为R环的暴露的单链形式结构中来指定原间隔子序列。ABE碱基编辑器使用进化的脱氧腺苷脱氨酶结构域(与nSpCas9融合)来将R环的单链DNA部分中包含的腺苷核苷化学修饰为肌苷，并且在R环的DNA:RNA异质双链中切开靶DNA链。此切口使DNA修复机制偏向于使用新鲜脱氨的链作为模板，从而在靶向位点处实现高效的转换突变。ABE8.8的活性窗口的范围通常是通过gRNA指定的原间隔子DNA序列中的位置3至9，NGG PAM的5’处的12至18个碱基(位置21至23)，在原间隔子的位置6处观察到峰编辑。虽然ABE8.8的作用机制不涉及双链DNA断裂，但插入缺失诱变可以低频率发生。
注意到与CRISPR-Cas9基因组编辑相比，碱基编辑在基因失活或其他类型的基因改变方面具有优势。标准CRISPR-Cas9编辑具有更高的由双链断裂引起的不想要的中靶效应和脱靶效应(大量缺失、载体DNA序列整合、染色体重排、p53活性诱导等)的风险。即使是预期的中靶效应(小的插入缺失突变)也具有不可预测性，因为它们可能导致移码突变(这在截短蛋白质产物的末端处添加不同的异常氨基酸串)或框内突变(这从蛋白质中添加或去除氨基酸而不敲除其功能)。相比之下，碱基编辑提供了一种在基因组中有效地进行精确的定型变化的手段，从而允许基因功能更可重复地改变。碱基编辑通过不需要双链断裂，而是经由脱氨酶结构域对DNA碱基进行酶促修饰来减轻非预期的中靶效应。
虽然已经在本文中示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员而言将显而易见的是，此类实施方案仅为通过举例方式提供。本发明并不旨在受本说明书内提供的具体实施例的限制。虽然已经参考上述具体说明描述了本发明，但是对本文中实施方案的描述和示例说明不意在以限制性意义进行解释。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现将想到多种变型、变化和替代方案。此外，应理解，本发明的所有方面不限于本文中所述的取决于各种条件和变量的具体的描绘、配置或相对比例。应理解，本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案可以用于实施本发明。因此，设想本发明还应覆盖任何此类替代方案、修改、变型或等同方案。
原间隔子选择和编辑
实施例1.用于靶向PCSK9和ANGPTL3的gRNA设计
表1和表24中所示的所有原间隔子均通过两个标准进行选择。首先，它们匹配(或非常接近匹配)人类、食蟹猴和/或小鼠基因直系同源物中的序列。其次，它们具有有利的预测脱靶谱，如通过MIT特异性分数判断(通过http://crispor.tefor.net/计算；最小分数为50)。
在目标是破坏体内基因以用于治疗目的的情况下，胞嘧啶碱基编辑器具有能够通过改变谷氨酰胺(CAGTAG，CAATAA)、精氨酸(CGATGA)和色氨酸(TGGTAG/TAA/TGA，编辑反义链上的胞嘧啶)的特定密码子来将终止密码子直接引入基因的编码序列中(无义突变)的优点。相比之下，腺嘌呤碱基编辑器不能直接引入终止密码子，因为没有导致无义突变的AG变化。然而，更有利的腺嘌呤碱基编辑器的脱靶谱，特别是在gRNA非依赖性脱靶DNA碱基编辑方面，建议在治疗目的中使用腺嘌呤碱基编辑器而不是胞嘧啶碱基编辑器。遵循类似的方法来鉴定和选择表1和24中列出的小鼠/啮齿动物特异性原间隔子。
腺嘌呤碱基编辑器可以用于破坏基因功能的一种策略是编辑起始密码子，诸如ATGGTG或ATGACG。因此，由此产生的蛋白质翻译将不在典型ATG位点处启动。腺嘌呤碱基编辑器可以用于破坏基因功能的第二种策略是编辑剪接位点，无论是内含子5’末端处的剪接供体还是内含子3’末端处的剪接受体。剪接位点破坏可以使得在信使RNA(mRNA)中包含内含子序列—可能引入无义、移码或框内插入缺失突变，其产生破坏蛋白质活性的提前终止密码子或氨基酸插入/缺失—或排除外显子序列，这也可以引入无义、移码或框内插入缺失突变。典型剪接供体在有义链上包含DNA序列GT，而典型剪接受体包含DNA序列AG。改变所述序列破坏正常剪接。剪接供体可以通过反义链中第二位置的互补碱基的腺嘌呤碱基编辑(GTGC)来破坏，并且剪接受体可以通过有义链中第一位置的腺嘌呤碱基编辑(AGGG)来破坏。腺嘌呤碱基编辑器可以用于破坏基因功能的第三种策略是将一个或多个错义突变引入基因的编码区中，从而导致产生功能较差或非功能的蛋白质。
经由在其编辑窗口内(大约在DNA的20-nt原间隔子区的位置3至9)进行AG编辑，鉴定了允许ABE8.8(以及含有酿脓链球菌Cas9的其他ABE变体，诸如ABE7.10，或另一种可以使用NGG PAM的Cas蛋白)破坏剪接位点的所有gRNA间隔子序列，无论是供体还是受体。合成匹配每个原间隔子序列并以其他方式符合标准100-nt酿脓链球菌CRISPR gRNA序列的指导RNA，其中每个gRNA分子具有中度化学修饰(例如，在表1中)。
表1.Cas9核酸酶和ABE编辑器的指导RNA(SgRNA/gRNA)
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除非另外指定，否则如以上表1、表23和表24中所用，在原间隔子中：大写核苷酸(A、G、C、I和T)分别指示2’-脱氧核糖核苷酸、腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、肌苷和胸腺嘧啶；在指导RNA序列中：大写核苷酸(A、C、G、I和U)分别指示核糖核苷酸、腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、肌苷和尿嘧啶，并且小写核苷酸(a、g、c、i和u)指示2’-O-甲基核糖核苷酸(2’-OMe)，除非另有说明。应理解，DNA原间隔子在指导RNA设计中被转化为RNA或RNA等效物，除非将包括2’-脱氧核糖核苷酸的其他修饰引入单指导RNA的间隔子部分中；s：硫代磷酸酯(PS)，X＝核糖水粉蕈素；x＝2’-O-甲基水粉蕈素；dX＝2’-脱氧水粉蕈素；5’-NNN-3’指示一致的A、C、G、I、U、dA、dG、dC、dI、T、X、x、dX及其组合。5’-nnn-3’指示一致的a、c、g、i、u、dA、dG、dC或T、x、dX及其组合。mANGPTL3：小鼠ANGPTL3；hANGPTL3：人ANGPTL3；cANGPTL3：食蟹猴ANGPTL3；mcANGPTL3：小鼠、食蟹猴交叉反应性ANGPTL3；hcANGPTL3：人、食蟹猴交叉反应性ANGPTL3；mPCSK9：小鼠PCSK9；hPCSK9：人PCSK9；cPCSK9：食蟹猴PCSK9；mcPCSK9：小鼠、食蟹猴交叉反应性PCSK9；hcPCSK9：人、食蟹猴交叉反应性PCSK9；hcAPOC3：人、食蟹猴交叉反应性APOC3。如本文所公开的，核苷酸序列和修饰模式涵盖所有长度、结构和类型的RNA或其片段、CRISPR指导RNA(例如sgRNA)、双指导RNA或mRNA。例如，如上表所述的核苷酸序列和修饰模式可以指示单指导RNA、双指导RNA、核酸酶mRNA或其任何片段或区段中的RNA序列和修饰模式。在表23中，u’指示N1-甲基假尿苷。
实施例2.体外PCSK9和ANGPTL3 Cas9编辑
在一组实验中，将PCSK9 gRNA与等量(重量比为1:1)的体外转录的从TriLinkBiotechnologies购买的可商购获得的SpCas9 mRNA MS002以2500、500或100ng/RNA/mL共转染到原代人肝细胞中，并如详细方法中所述进行加工。通过对靶位点周围生成的PCR扩增子进行下一代测序，分析提取的基因组DNA在靶位点处的基因编辑。根据制造商的方案，使用Nextera XT DNA文库制备试剂盒(Illumina)制备样品。简而言之，首先进行两轮PCR以扩增感兴趣的区域，然后将下一代测序和样品鉴定所需的DNA序列添加到初始产物中。根据制造商的方案在Illumina MiSeq仪器上对最终扩增子进行测序。观察到宽范围的编辑活性(表2)。在第二组实验中，将ANGPTL3gRNA与等量的体外转录的SpCas9 mRNA(重量比为1:1)共转染到原代人肝细胞中，并以类似方式进行加工和分析(表3)。
表2.原代肝细胞中的PCSK9 gRNA/SpCas9编辑
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表3.原代肝细胞中的ANGPTL3 gRNA/SpCas9编辑
Figure BDA0003991453200004392
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分别说明了Cas9、胞苷碱基编辑器(CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(ABE)的操作模式，以及本申请中使用的相关术语，包括“原间隔子”、“PAM”、“间隔子”(图1A-图1C)。对于性能良好的指导物中的一个，GA156，间隔子序列为5’-GGTGCTAGCCTTGCGTTCCG-3’(SEQ ID NO:66)，通过对tracrRNA序列进行修饰合成了另外的指导物。另外，使用X射线晶体结构指导的方法(图1D)。酿脓链球菌Cas9与sgRNA的复合物(Jiang等人,2015,PDB ID 4ZT0)和呈催化前三元复合物的酿脓链球菌Cas9(Jiang等人,2016,PDB ID 5F9R)的晶体结构为结构指导的间隔子和tracr设计提供了信息(图2)。晶体结构中给定核苷酸的2’-OH与Cas9蛋白(或sgRNA的另一部分)之间似乎存在氢键的任何位置均保持不变。另外，预测2’-OMe与蛋白质之间发生空间位阻的任何位置均保持不变。在2’-OH暴露于溶剂或以其他方式远离蛋白质残基的位点处，进行2’-OMe取代。在两个晶体结构不一致的情况下，不进行任何修饰。此策略应用于整个sgRNA或仅应用于tracr区。示例性结构在图3-图7中示出。
将PCSK9 gRNA与等量的体外转录的SpCas9 mRNA MS002(重量比为1:1)共转染到原代人肝细胞中，并如详细方法中所述进行加工。观察到宽范围的编辑活性(表4；ND＝未确定)。在转染后五天具有最高编辑活性的指导物是GA001、GA002、GA007和GA008。结构指导的2’-OMe重指导RNA(gRNA)设计GA007和GA008显示与最少修饰的对照gRNA GA009相比改善的编辑。
表4.原代人肝细胞中经由SpCas9编辑修饰的gRNA的体外评价
Figure BDA0003991453200004421
实施例3.体外PCSK9和ANGPTL3碱基编辑
在原代肝细胞中观察到通过ABE8.8对PCSK9进行的编辑。将PCSK9 gRNA与等量的体外转录的ABE8.8 mRNA MA002(重量比为1:1)共转染到原代肝细胞中，并如详细方法中所述进行加工。在一组实验中，通过对靶位点周围生成的PCR扩增子进行下一代测序，分析提取的基因组DNA在靶剪接位点处的碱基编辑。根据制造商的方案，使用Nextera XT DNA文库制备试剂盒(Illumina)制备样品。简而言之，首先进行两轮PCR以扩增感兴趣的区域，然后将下一代测序和样品鉴定所需的DNA序列添加到初始产物中。根据制造商的方案在Illumina MiSeq仪器上对最终扩增子进行测序。观察到宽范围的编辑活性(表5；图8)，其中指导物GA066、GA073和GA074性能最佳。
表5.原代肝细胞中的ABE8.8/PCSK9 gRNA编辑
Figure BDA0003991453200004431
Figure BDA0003991453200004441
当考虑来自原代人肝细胞的数据时，将匹配以下三个原间隔子序列的PCSK9靶向gRNA鉴定为在原代人肝细胞与原代食蟹猴肝细胞之间具有最佳的跨物种活性：5’-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3’(SEQ ID NO:13)(GA066)、5’-GCTTACCTGTCTGTGGAAGC-3’(SEQID NO:67)(GA073)和5’-TGCTTACCTGTCTGTGGAAG-3’(SEQ ID NO:68)(GA074)。GA066序列靶向人PCSK9内含子1的5’末端处的剪接供体，并且预测产生从外显子1翻译的异常PCSK9蛋白，接着是从内含子1的开头翻译的若干氨基酸(从外显子1通读到内含子1中)，接着是提前终止密码子(图9)。GA073和GA074序列各自靶向人PCSK9内含子4的5’末端处的剪接供体，并且预测产生从外显子1、2、3和4翻译的异常PCSK9蛋白，接着是从内含子4的开头翻译的若干氨基酸(从外显子4通读到内含子4中)，接着是提前终止密码子。在这些情况中的每一个中，预测的提前截短蛋白可能完全丧失功能，并且由于与天然存在的野生型人PCSK9氨基酸序列的一部分几乎完全匹配而具有最小的免疫原性。在食蟹猴基因组中发现相同的原间隔子序列5’-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3’(SEQ ID NO:13)(GA066)，其类似地靶向食蟹猴PCSK9内含子1的5’末端处的剪接供体。
在原代肝细胞中观察到通过ABE8.8对ANGPTL3进行的编辑。将ANGPTL3 gRNA与等量的体外转录的ABE8.8 mRNA MA004(重量比为1:1)共转染到原代肝细胞中，并如详细方法中所述进行加工。鉴定了匹配以下原间隔子序列5’-AAGATACCTGAATAACCCTC-3’(SEQ IDNO:15)(GA091)的人ANGPTL3靶向gRNA。GA091序列靶向人ANGPTL3内含子6的5’末端处的剪接供体，并且预测产生从外显子1、2、3、4、5和6翻译的异常ANGPTL3蛋白，接着是从内含子6的开头翻译的若干氨基酸(从外显子6通读到内含子6中)，接着是提前终止密码子(图10)。值得注意的是，具有一种天然存在的罕见人DNA变体，它破坏相同的剪接供体并具有名称rs398122985。用直系同源的食蟹猴间隔子序列合成gRNA，相差1个核苷酸：5’-AAGATACCTGAATAACTCTC-3’(SEQ ID NO:14)(GA067)，并且具有中度化学修饰(表1)。人原代肝细胞中的GA091和食蟹猴原代肝细胞中的GA067两者在与ABE8.8 mRNA共转染时(在详细方法部分描述的方案)均产生大量剪接编辑(表6)。RNA在2500、1250、625和312.5ng/测试制品/mL下转染，报告了两个重复(rep 1和rep 2)。
表6.原代肝细胞中的ABE8.8/ANGPTL3 gRNA编辑
Figure BDA0003991453200004451
Figure BDA0003991453200004461
腺嘌呤碱基编辑器可以用于破坏基因功能的另一种策略是将一个或多个错义突变引入基因的编码区中，从而导致产生功能较差或非功能的蛋白质。评估靶向ANGPTL3外显子中的原间隔子的指导RNA引入一个或多个错义突变的碱基编辑活性。将每一种gRNA与等量的体外转录的ABE8.8 mRNA MA004(重量比为1:1)在两个重复(rep 1和rep 2)中以2500、1250、625和312.5ng/RNA/mL共转染到原代人肝细胞中并如详细方法中所述进行加工。所得的碱基编辑效率以及一个潜在的氨基酸取代在表7中列出。
在一些实施方案中，腺嘌呤碱基编辑器通过用不相同的氨基酸A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V替换选自A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V的任一个氨基酸来破坏基因功能。在一些实施方案中，腺嘌呤碱基编辑器通过用T或V取代I来破坏基因功能。在一些实施方案中，腺嘌呤碱基编辑器通过用G取代D来破坏基因功能。在一些实施方案中，腺嘌呤碱基编辑器通过用G取代E来破坏基因功能。在一些实施方案中，腺嘌呤碱基编辑器通过用L或P取代F来破坏基因功能。在一些实施方案中，腺嘌呤碱基编辑器通过用R取代H来破坏基因功能。在一些实施方案中，腺嘌呤碱基编辑器通过用P取代L来破坏基因功能。在一些实施方案中，腺嘌呤碱基编辑器通过用P取代S来破坏基因功能。在一些实施方案中，腺嘌呤碱基编辑器通过用T取代M来破坏基因功能。在一些实施方案中，腺嘌呤碱基编辑器通过用G取代N来破坏基因功能。在一些实施方案中，腺嘌呤碱基编辑器通过用R取代Q来破坏基因功能。在一些实施方案中，腺嘌呤碱基编辑器通过用G取代R来破坏基因功能。在一些实施方案中，腺嘌呤碱基编辑器通过用A取代T来破坏基因功能。在一些实施方案中，腺嘌呤碱基编辑器通过用A取代V来破坏基因功能。在一些实施方案中，腺嘌呤碱基编辑器通过用C或H取代Y来破坏基因功能。在一些实施方案中，腺嘌呤碱基编辑器通过用G取代K来破坏基因功能。在一些实施方案中，腺嘌呤碱基编辑器通过引入如表7中列出的氨基酸取代基来破坏基因功能。
表7.ANGPTL3 gRNA ABE编辑可以引入错义突变
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合成了匹配5’-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3’(SEQ ID NO:13)(GA066)原间隔子序列但具有更广泛的各种化学修饰(表1)的gRNA GA066/GA095、GA096、G097、GA346。类似地，合成了匹配5’-AAGATACCTGAATAACCCTC-3’(SEQ ID NO:15)(GA091)人原间隔子序列的三种gRNA(GA098、GA099、GA100)以及匹配5’-AAGATACCTGAATAACTCTC-3’(SEQ ID NO:14)(GA067)食蟹猴原间隔子序列但具有更广泛的各种化学修饰(表1)的四种gRNA(GA067/GA101、GA102、GA103、GA347)。GA066和GA095含有相同的化学组成和修饰模式，GA067和GA101彼此也是如此。设想此类gRNA可以改善针对核酸酶和gRNA碱基编辑器复合物的稳定性，并且减少或抑制gRNA触发的免疫反应。经由MessengerMax试剂，使用各种稀释液将表8中所述的每一种gRNA与等量的体外转录的ABE8.8 mRNA MA002(重量比为1:1)共转染到原代人肝细胞和原代食蟹猴肝细胞中，以评估不同浓度的测试制品的编辑活性。转染之后三天，从肝细胞中收获基因组DNA，并且然后用下一代测序评估靶剪接位点的碱基编辑。在人和食蟹猴肝细胞两者中，均观察到靶剪接位点(PCSK9内含子1剪接供体；ANGPTL3内含子6剪接供体)的高达60％-70％的编辑(表8)。
表8.在人和食蟹猴原代肝细胞中，经化学修饰的gRNA具有高编辑效率
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Figure BDA0003991453200004541
经典CRISPR/Cas9通过最终引入插入缺失来破坏基因的方法与碱基编辑明显且显著不同。具体地，碱基编辑用于在更接近原间隔子的5’区域(而不是像在CRISPR/Cas9中通常看到的距离PAM 3-4bp)的靶窗口内引入一个或多个碱基突变。此外，高度适于CRISPR/Cas9编辑的靶区域并不一定意味着在此位置处会发生碱基编辑，反之亦然。在人原代肝细胞中转染含有以下的LNP：(1)Cas9mRNA MS010和匹配5’-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3’(SEQID NO:13)(GA097)原间隔子序列的gRNA；或(2)ABE8.8 mRNA MA004和匹配5’-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3’(SEQ ID NO:13)(GA097)原间隔子序列的gRNA。对编辑的基因组DNA进行桑格测序，并说明了由CRISPR/Cas9产生的基因编辑与碱基编辑相比的差异(图11)。箭头突出显示了主要碱基编辑位置，而剪刀突出显示了Cas9切割的一般区域。
为了证明剪接位点的碱基编辑会破坏剪接，使用外显子1和外显子2中的引物对来自经处理的原代人肝细胞的mRNA进行逆转录-PCR。结果确认了剪接位点破坏导致在内含子1内使用替代剪接供体位点，所述内含子位于框内TAG终止密码子的下游(图12，表9)。所述表报告了如由下一代测序确定的每个剪接位点供体的映射读取数。
表9.原代人肝细胞中由PCSK9外显子1剪接供体腺嘌呤碱基的编辑产生的PCSK9内含子1内的替代剪接供体位点。
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*使用四个不同的引物对对对照/经处理的样品进行RT-PCR。
实施例4.体外PCSK9和ANGPTL3脱靶验证
为了建立体内敲低人肝脏中的PCSK9的碱基编辑疗法的安全性，评估了脱靶诱变分析。使用两种不同的方法组装人基因组中用于脱靶诱变的候选位点列表。第一种方法使用人基因组的生物信息学分析，鉴定了具有与酿脓链球菌Cas9(并且因此ABE 8.8)相容的PAM序列和与GA066间隔子序列5’-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3’(SEQ ID NO:13)具有最多4个单核苷酸错配的原间隔子序列的所有位点。生成候选位点的第二种方法使用体外生物化学测定ONE-seq，其确定包含ABE8.8碱基编辑器蛋白和PCSK9 gRNA(5’-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3’(SEQ ID NO:13))的核糖核蛋白在文库中切割寡核苷酸的倾向。搜索参考人基因组(GRCh38)中与通过PCSK9 gRNA(5’-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3’(SEQ IDNO:13))指定的原间隔子序列具有最多6个错配的位点，并且使用Cas-Designer鉴定具有最多4个错配加上最多2个DNA或RNA凸起的位点。关于ONE-seq文库制备、实验方案和生物信息学分析的更多细节描述于另外的详细方法部分中。
任何切割的寡核苷酸都进行PCR扩增并经历下一代测序。具有较高序列计数的寡核苷酸反映了体外Cas9/gRNA切割的较高倾向，并且代表最有可能在细胞中发生脱靶诱变的位点。通过ONE-seq测定鉴定的顶部位点是中靶PCSK9位点。候选脱靶位点的列表包括超过250个位点，并且需要进一步调查(表10)。
将原代人肝细胞用包封1:1重量比的ABE8.8 mRNA MA004和PCSK9 gRNA(GA097或GA346)的脂质纳米颗粒(LNP)处理(关于LNP制备的细节，参见脂质纳米颗粒配制品和分析)。在使用Agilent SureSelect技术进行下一代测序后(表11)，当从中靶位点和候选脱靶位点的LNP处理细胞中观察到的碱基编辑率中减去对照细胞中观察到的碱基编辑率时(以将下一代测序中固有的背景测序错误考虑在内)，在中靶PCSK9靶位点处观察到明显的碱基编辑。这些结果在来自两名男性和一名女性患者的三个不同的原代肝细胞批次(STL、HLY和JLP)中重复。
另外，使用来自四个个体供体的肝细胞(除了以上列出的三个批次之外，还包括来自一名女性患者的批次TLY)，通过对LNP处理的肝细胞相对于未处理的肝细胞的靶向PCR扩增子进行下一代测序，评估了超过50个脱靶位点。在这些潜在脱靶位点处均没有观察到编辑，并且在PCSK9靶位点处仅观察到中靶编辑(图13)。
表10.如通过ONE-seq确定的PCSK9 gRNA(原间隔子5’-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3’(SEQ ID NO:13))候选脱靶位点
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表11.人原代肝细胞中PCSK9 gRNA GA346脱靶位点验证
Figure BDA0003991453200004682
Figure BDA0003991453200004691
Figure BDA0003991453200004701
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据报道，腺嘌呤碱基编辑器经由脱氧腺苷脱氨酶结构域诱导gRNA非依赖性RNA编辑。为了评估gRNA非依赖性RNA编辑，将原代人肝细胞用mRNA和PCSK9 gRNA(n＝4个生物重复)、SpCas9 mRNA和gRNA(n＝4)处理，或者不进行处理(n＝4)。在2天之后提取RNA，并且如另外的详细方法部分中所述进行加工。将ABE8.8和SpCas9处理的肝细胞与未处理的肝细胞的RNA谱进行比较，在ABE8.8处理的肝细胞中没有观察到实质性的RNA编辑(图14)。将每个重复与四个未处理的肝细胞样品中的每一个进行比较，以消除任何具有两种情况都常见的编辑的位置。抖动图描绘出经处理的样品中具有编辑的转录组基因座(数字指示经处理的样品中鉴定的总计经编辑的基因座，盒形图指示样品中所有经编辑的基因座中经编辑的读取的比例的中位数±四分位距)。
通过改变GA066间隔子(5’-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3’(SEQ ID NO:13))来评估对gRNA的间隔子或tracr部分的修饰和/或截短(表12)。对指导物进行修饰可以用于提高中靶编辑效率和/或提高脱靶编辑效率。将每一种gRNA与等量的体外转录的ABE8.8mRNA(重量比为1:1)共转染到原代人肝细胞和原代食蟹猴肝细胞中并如详细方法中所述进行加工。
表12.PCSK9指导物GA346的修饰和/或截短在人原代肝细胞中产生高水平编辑
Figure BDA0003991453200004831
Figure BDA0003991453200004841
Figure BDA0003991453200004851
为了建立体内敲低人肝脏中的ANGPTL3的碱基编辑疗法的安全性，使用两种不同的方法组装人基因组中用于脱靶诱变的候选位点列表。第一种方法使用人基因组的生物信息学分析，鉴定了具有与酿脓链球菌Cas9(并且因此ABE 8.8)相容的PAM序列和与GA100间隔子序列5’-AAGATACCTGAATAACTCTC-3’(SEQ ID NO:14)具有最多4个单核苷酸错配的原间隔子序列的所有位点。
生成候选位点的第二种方法使用体外生物化学测定ONE-seq，其确定包含ABE8.8碱基编辑器蛋白和gRNA GA441的核糖核蛋白在文库中切割寡核苷酸的倾向。搜索参考人基因组(GRCh38)中与通过ANGPTL3 gRNA(5’-AAGATACCTGAATAACTCTC-3’(SEQ ID NO:14))指定的原间隔子序列具有最多6个错配的位点，并且使用Cas-Designer鉴定具有最多4个错配加上最多2个DNA或RNA凸起的位点。关于ONE-seq文库制备、实验方案和生物信息学分析的更多细节描述于另外的详细方法部分中。
具有较高序列计数的寡核苷酸反映了体外Cas9/gRNA切割的较高倾向，并且代表最有可能在细胞中发生脱靶诱变的位点。在表13中鉴定了顶部候选位点。使用ANGPTL3编辑的和未处理的人原代肝细胞进行候选位点的验证。在进行下一代测序后(表14)，当从中靶位点和候选脱靶位点的LNP处理细胞中观察到的碱基编辑率中减去对照细胞中观察到的碱基编辑率时(以将下一代测序中固有的背景测序错误考虑在内)，在中靶ANGPTL3靶位点处观察到明显的碱基编辑。
表13.通过ONE-seq鉴定的ANGPTL3 gRNA(原间隔子5’-AAGATACCTGAATAACCCTC-3’(SEQ ID NO:15))候选脱靶位点
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Figure BDA0003991453200004871
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Figure BDA0003991453200004891
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Figure BDA0003991453200004941
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表14.人原代肝细胞中ANGPTL3 gRNA脱靶位点验证
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通过改变gRNA GA100间隔子(5’-AAGATACCTGAATAACCCTC-3’(SEQ ID NO:15))来评估对gRNA的间隔子或tracr部分的修饰和/或截短(表15)。对指导物进行修饰可以用于提高中靶编辑效率和/或提高脱靶编辑效率。另外，在两个不同的实验(在下表中分开)中评估了四种不同的ABE8.8 mRNA(MA004、MA040、MA041、MA045；表23)。将每一种gRNA与等量的体外转录的ABE8.8 mRNA(重量比为1:1)以5000、2500和1250ng/RNA/mL共转染到原代人肝细胞和原代食蟹猴肝细胞中并如所述进行加工。
表15.gRNA和/或mRNA修饰改善gRNA特异性
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对先前鉴定的显示脱靶编辑的两个位点进行在5,000ng/RNA/mL的最高剂量下改变的gRNA/mRNA组合的脱靶分析(表16)。对跨原间隔子计算的编辑百分比求和，并且减去阴性对照编辑％。此数据显示对指导物和/或ABE mRNA进行修饰提高脱靶编辑效率。
表16.对指导物和/或ABE mRNA进行修饰提高脱靶编辑效率。
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Figure BDA0003991453200005361
配制含有1:1重量比的ABE8.8 mRNA和匹配靶向PCSK9内含子1的5’末端处的剪接供体的人/食蟹猴5’-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3’(SEQ ID NO:13)序列(GA066)的gRNA的脂质纳米颗粒。使用各种稀释液向原代人肝细胞和原代食蟹猴肝细胞施用LNP，以评估不同浓度的测试制品的编辑活性。这些实验使用含有Cas9 mRNA和匹配另一个基因ANGPTL3中的原间隔子序列的gRNA的LNP作为阳性对照。之所以选择这种Cas9mRNA/gRNA组合，是因为先前已观察到它在原代人肝细胞、原代食蟹猴肝细胞和食蟹猴肝脏中体内产生高水平的基因组编辑活性。观察到ABE8.8/GA066 LNP在编辑方面的性能明显优于对照LNP，从而在人和食蟹猴肝细胞中均显示高得多的效力(图15)。
实施例5.小鼠中的Pcsk9基因编辑
配制含有1:1重量比的SpCas9 mRNA和具有不同tracr设计(GA052、GA053、GA054和GA055)的小鼠Pcsk9靶向gRNA的LNP。向野生型C57BL/6小鼠给药2mg/kg的LNP测试制品。在给药之后7天，对小鼠进行安乐死，并且从小鼠肝脏中收获基因组DNA，然后用下一代测序评估靶位点的编辑。GA052、GA054和GA055的性能全部优于具有先前公开的tracr设计的GA053(图16)。
实施例6.小鼠中的Pcsk9碱基编辑
配制含有1:1重量比的ABE8.8 mRNA和小鼠Pcsk9靶向gRNA的LNP。此gRNA匹配5’-CCCATACCTTGGAGCAACGG-3’(SEQ ID NO:69)原间隔子序列，它是靶向PCSK9内含子1的5’末端处的剪接供体的人5’-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3’(SEQ ID NO:13)序列(与GA066、GA095、GA096、GA097和GA346匹配)的小鼠直系同源物。经由侧尾静脉或眼球后以10ml/kg的总体积向野生型C57BL/6小鼠给药2mg/kg的LNP测试制品。在给药之后7天，对小鼠进行安乐死，并且从小鼠肝脏中收获基因组DNA，然后用下一代测序评估靶剪接位点的碱基编辑。观察到靶剪接位点的大约60％编辑(小鼠Pcsk9内含子1剪接供体)(图17)，从而提供了体内敲低肝脏中的PCSK9的碱基编辑疗法的临床前概念验证。
在随后的研究中，配制含有1:1重量比的ABE8.8 mRNA和小鼠Pcsk9靶向gRNA的LNP，并且以范围为0-2.0mg总RNA/kg的剂量在野生型C57BL/6小鼠中给药。0.05mg RNA/kg的低剂量显示高编辑(>45％)，而碱基编辑的饱和发生在0.25mg RNA/kg剂量左右(图18)。
在另一项研究中，以范围为1:1-1:6和2:1-6:1的不同重量比的mRNA和gRNA配制含有ABE8.8 mRNA和小鼠Pcsk9靶向gRNA的LNP。此gRNA匹配5’-CCCATACCTTGGAGCAACGG-3’(SEQ ID NO:69)原间隔子序列，它是靶向PCSK9内含子1的5’末端处的剪接供体的人5’-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3’(SEQ ID NO:13)序列(与GA066、GA095、GA096、GA097和GA346匹配)的小鼠直系同源物。以0.05mg/kg总RNA剂量向野生型小鼠给药LNP。另外，还将两个由相同的mRNA和两个指导物GA255和GA257构成的个体LNP注射到小鼠中，所述指导物匹配5’-CCCATACCTTGGAGCAACGG-3’(SEQ ID NO:69)原间隔子序列，但具有对tracr的修饰以改善稳定性。在给药之后7天，对小鼠进行安乐死，并且从小鼠肝脏中收获基因组DNA，然后用下一代测序评估靶剪接位点的碱基编辑(图19)。碱基编辑在许多比率之间是相当的，其中1:6和6:1(gRNA:mRNA)的性能最差。具有对tracr的修饰的指导物具有增加的编辑效率。
实施例7.小鼠中的Angptl3碱基编辑
配制含有1:1重量比的ABE8.8 mRNA和小鼠Angptl3靶向gRNA(GA258、GA259、GA260、GA349、GA353)的LNP。以0.05mg/kg总RNA剂量向野生型C57BL/6小鼠给药LNP测试制品。之后对小鼠进行安乐死，并且从小鼠肝脏中收获基因组DNA，然后用下一代测序评估靶剪接位点的碱基编辑(图20)。
非人灵长类动物(NHP)中的体内评价
实施例8.PCSK9/ABE的评价
首先，进行为期2周的研究，以评价通过施用LNP使用特异性gRNA和碱基编辑器核酸酶ABE 8.8对食蟹猴中PCSK9基因进行的编辑(图21)。以两个剂量，3mg/kg(n＝3只动物)和1mg/kg(n＝2只动物)经由静脉内输注向食蟹猴施用ABE8.8/GA066 LNP，目的是在肝脏中产生PCSK9基因的高水平碱基编辑。在施用测试制品之后两周，收集血液样品进行临床化学测定和PCSK9 ELISA测定，并且对动物进行尸检以收集肝脏样品，肝脏的4个叶中的每一个各自收集2个样品(每只动物总计8个样品)。
通过下一代测序进行肝脏样本的编辑分析。在3mg/kg剂量下，观察到肝脏样品中靶剪接位点处腺嘌呤碱基的平均55％编辑；在1mg/kg剂量下，观察到肝脏样品中靶剪接位点处腺嘌呤碱基的平均24％编辑(图22)。对于PCSK9 ELISA分析，在剂量前D-10、D-7和D-5天(显示平均值)以及剂量后D8和D15天从动物收集血液样品。在给药之后2周，与给药前水平相比，3mg/kg组的血液PCSK9蛋白水平平均降低76％(图23)，并且1mg/kg组的血液PCSK9蛋白水平平均降低32％(表17)。使用标准临床分析仪在剂量前以及D8和D15采集的血清样品中确定低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)(表18)。3mg/kg组的血液低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平平均降低57％(图24)，并且1mg/kg组的血液LDL-C水平平均降低25％。
表17.在PCSK9 gRNA/ABE编辑之后循环PCSK9蛋白水平降低
Figure BDA0003991453200005391
Figure BDA0003991453200005401
表18.PCSK9基因编辑之后的LDL-C降低
Figure BDA0003991453200005402
在随后的实验中，经由静脉内输注以1.0mg/kg剂量将LNP递送在猴中。对于在LNP输注之后2周进行尸检的三只猴，肝脏中PCSK9剪接位点腺嘌呤的平均碱基编辑频率为63％，在原间隔子的其他地方未观察到旁观者碱基编辑(图25)；平均插入缺失频率为0.5％。编辑伴随着血液PCSK9水平降低平均81％，并且血液LDL-C水平降低平均65％。对于在LNP输注之后24小时进行尸检的两只猴，平均编辑频率为48％。
在随后的短期剂量应答研究中(0.5、1.0和1.5mg/kg剂量，每个剂量三只猴，在2周时进行尸检)，所有剂量均达到>50％的平均碱基编辑率；PCSK9的编辑以及PCSK9蛋白和LDL-C的降低似乎在≥1.0mg/kg的剂量下饱和(图26)。
在这些研究中，我们评估了肝功能测试，并且在一些组中注意到AST和ALT的中度升高，所述升高在第一周结束时在很大程度消退，并且在LNP输注之后2周完全消退，在任何动物中均未观察到不良健康事件。在测定各种组织中的碱基编辑时，我们发现肝脏是主要的编辑部位，在脾脏和肾上腺中观察到的编辑要低得多，并且在其他地方观察到的编辑很少(图27)。
表25.三只动物中PCSK9外显子1剪接供体腺嘌呤碱基编辑的组织分布的数字格式，如图27所示。
组织 对照NHP NHP#1 NHP#2 NHP#3
肝脏 0.12 59.49 73.83 55.10
脾脏 0.02 5.25 7.99 5.67
肾上腺(左) 0.02 1.81 7.49 1.79
肾上腺(右) 0.10 1.54 0.22 2.18
肾脏(左) 0.10 0.63 0.89 0.24
肾脏(右) 0.06 0.64 0.27 0.32
皮肤(注射部位) 0.13 0.08 1.47 1.56
下颌淋巴结(左) 0.06 0.15 0.48 0.43
下颌淋巴结(右) 0.06 0.18 0.17 0.96
肠系膜淋巴结 0.04 0.12 0.15 0.12
睾丸(左) 0.13 0.11 0.06 0.38
睾丸(右) 0.07 0.16 0.09 0.38
附睾(左) 0.09 0.12 0.58 0.83
附睾(右) 0.80 0.25 0.79 0.52
骨骼肌 0.16 0.40 0.33 0.07
十二指肠 0.07 0.30 0.83 0.26
空肠 0.06 0.19 0.28 0.58
结肠 0.08 0.07 0.08 0.13
肺(左) 0.01 0.16 0.22 0.18
肺(右) 0.10 0.54 0.24 0.16
脑 0.12 0.17 0.05 0.15
在另一项研究中，评估了不同的tracr设计。除非另外指定，否则经由静脉内输注以1.0mg/kg总RNA剂量将LNP递送在NHP中。评估了肝脏的碱基编辑，并且若干指导物的性能优于具有文献tracr的GA066(图28)。
在相同的NHP研究，将含有以下的LNP静脉内递送到NHP中：1)Cas9 mRNA和匹配5’-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3’(SEQ ID NO:13)(GA097)原间隔子序列的gRNA；或2)ABE8.8mRNA和匹配5’-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3’(SEQ ID NO:13)(GA097)原间隔子序列的gRNA。重要的是，经典CRISPR/Cas9通过最终引入插入缺失来破坏基因的方法与发生碱基突变的碱基编辑不同。此外，高度适于CRISPR/Cas9编辑的靶区域并不一定意味着在此位置处会发生碱基编辑，反之亦然。这在NHP研究中得到了强调，其中含有SpCas9/gRNA的LNP在NHP中产生低肝脏编辑(<5％)，而含有ABE8.8/gRNA的LNP在低于SpCas9/gRNA剂量(1.5mg/kg)的剂量(1mg/kg)下具有显著更高的接近40％的编辑(图29)。
在另一项研究中，比较了两种LNP在经由静脉内输注以范围为0.5mg/kg-3.0mg/kg的剂量递送在NHP中之后的碱基编辑活性。两种LNP均显示高功效，第一种LNP(LNP#1)的性能优于第二种LNP(LNP#2)，在低至0.5mg/kg的剂量下具有大于50％的平均编辑(图30)。与过去的实验类似，在剪接位点处进行高水平的碱基编辑后PCSK9蛋白水平显著降低，从而使循环PCSK9蛋白降低80％-90％(图31)。
在一项长期研究(四只动物，2周时进行肝脏活检)中，经由静脉内输注以3.0mg/kg的较高剂量引入LNP，以评估由PCSK9编辑引起的PCSK9蛋白和LDL-C降低的药物耐受性和持久性。肝脏活检样品显示66％的平均碱基编辑频率(图32)。血液PCSK9蛋白水平在1周时达到低谷，并且此后保持稳定至少6个月，稳定在大约90％降低(图33)。血液LDL-C和脂蛋白(a)[Lp(a)]水平类似地达到持续8个月的稳定低谷，分别稳定在≈60％和≈35％降低(图34，图35)。
AST和ALT具有短暂的中度升高，所述升高在LNP输注后2周完全消退(图36)，任何其他肝功能测试没有变化，并且迄今为止没有观察到不良健康事件(图37)。重要的是，PCSK9和LDL-C降低持续8个月，没有晚期AST和ALT升高，这表明这种应答，无论其规模如何，都不会对治疗功效产生不利影响。
为了评价原代食蟹猴肝细胞和猴肝脏样品中ABE8.8/gRNA(匹配GA346的原间隔子)LNP介导的脱靶编辑，使用通过与gRNA间隔子序列的同源性选择的合成食蟹猴基因组文库进行ONE-seq。将此文库用ABE8.8蛋白和PCSK9 gRNA处理，并且通过对来自LNP处理相对于未处理的NHP样品的靶向PCR扩增子进行下一代测序(图39)来评估前48个ONE-seq提名位点(图38)，其中PCSK9靶位点是最顶部位点。
在LNP处理的原代食蟹猴肝细胞中，除了在PCSK9靶位点处进行编辑外，仅在一个位点(指定为C5)处存在明显的脱靶编辑(平均值<1％)，所述位点与人基因组的同源性较差(图39)。评估来自用1.0mg/kg LNP剂量处理的猴的肝脏样品中的相同48个位点(来自上述剂量应答研究)，仅在C5位点(图40)处观察到低水平脱靶编辑(平均值<1％)。在0.5mg/kgLNP剂量下没有观察到脱靶编辑，并且在1.5mg/kg LNP剂量下仅观察到低水平脱靶编辑(平均值<1％)。
实施例9.ANGPTL3/ABE的评价
类似于用一种或多种ABE/PCSK9指导物进行的NHP研究，以两个剂量，3mg/kg(n＝3只动物)和1mg/kg(n＝2只动物)经由静脉内输注向食蟹猴施用用ABE8.8 mRNA和具有5’-AAGATACCTGAATAACTCTC-3’(SEQ ID NO:14)(GA067)食蟹猴间隔子的gRNA配制的LNP，目的是在肝脏中产生ANGPTL3的高水平碱基编辑。施用测试制品之后两周，收集血液样品进行临床化学测定和ANGPTL3 ELISA测定，并且对动物进行尸检以收集肝脏样品。从肝脏的每个叶的中心和外围切出小段并在液氮中快速冷冻并储存在-86℃至-60℃下。通过下一代测序分析剪接位点编辑，从而确认发生了碱基变化。在最高剂量(3mg/kg)下，在肝脏中的靶剪接位点处观察到腺嘌呤碱基的平均61％编辑；在最低剂量(1mg/kg)下，在肝脏中的靶剪接位点处观察到28％编辑(表19)。
此外，在剂量前、剂量后D7和D15收集血液样品以确定血清ANGPTL3和甘油三酯。在给药之后两周，在较高(3mg/kg)和较低(1mg/kg)给药组中，与给药前水平相比，血液ANGPTL3蛋白水平降低平均90％和31％(表20)。
表19.食蟹猴中的肝脏编辑
Figure BDA0003991453200005441
表20.在使用ABE进行基因编辑后循环食蟹猴ANGPTL3的敲低
Figure BDA0003991453200005442
使用标准临床分析仪在剂量前以及D8和D15采集的血清样品中确定甘油三酯。表21中总结了响应于用ABE8.8和GA067进行的LNP介导的ANGPTL3碱基编辑的血清甘油三酯降低。响应于1mg/kg和3mg/kg剂量的碱基编辑器ABE8.8和靶向ANGPTL3的GA067，甘油三酯水平降低24％和59％。
表21.肝脏中响应于ANGPTL3基因的甘油三酯降低
Figure BDA0003991453200005451
在另一项独立研究中，以3mg/kg(n＝3只动物)的剂量经由静脉内输注向食蟹猴施用相同的ABE8.8/GA067 LNP，目的是在肝脏中产生ANGPTL3的高水平碱基编辑。在施用测试制品之后两周，收集血液样品进行临床化学测定，并且对动物进行肝脏活检以收集肝脏样品。在3mg/kg剂量下，在肝脏活检样品中在靶剪接位点处实现了腺嘌呤碱基的平均60％编辑。一致地，在给药之后2周，与给药前水平相比，血液ANGPTL3蛋白水平平均降低95％，并且血液甘油三酯水平平均降低64％(图41)。这些结果提供了体内敲低肝脏中的ANGPTL3并实现血液ANGPTL3蛋白和甘油三酯水平降低的碱基编辑疗法的另外临床前概念验证。
实施例10.双重PCSK9和ANGPTL3碱基编辑的评价
为了评估是否可能用单个测试制品影响PCSK9和ANGPTL3的同时碱基编辑，配制了包含三种组分的混合物的LNP：ABE8.8mRNA、PCSK9靶向gRNA(GA095)和ANGPTL3靶向gRNA(GA098)，重量比为2:1:1。将原代人肝细胞用各种稀释度的LNP温育。温育之后三天，从肝细胞中收获基因组DNA，并且然后用下一代测序评估靶剪接位点的碱基编辑。在最高LNP浓度下，观察到PCSK9剪接位点(内含子1剪接供体)的≈40％编辑和ANGPTL3剪接位点(内含子6剪接供体)的≈40％编辑(图42)，从而证明了在人肝细胞中用单个测试制品进行双重基因破坏的可行性，并提供了同时敲低PCSK9和ANGPTL3的单一碱基编辑疗法的临床前概念验证，预测这将明显降低人类接受者的血液LDL胆固醇水平和血液甘油三酯水平。这种方法的一个优点是，因为相比于标准CRISPR-Cas9，碱基编辑器不需要双链断裂(DSB)来进行编辑，因此同时靶向基因组中的两个不同位点所固有的染色体重排或其他结构变化的风险明显更低。
进行了后续NHP研究以解决：1)施用第二剂量的LNP释放可能导致靶基因的编辑；2)是否可以对不同的靶标进行碱基编辑。以范围为0.5-2mg/kg的剂量经由静脉内输注向食蟹猴施用用ABE8.8 mRNA和靶向PCSK9的gRNA(GA346)或靶向ANGPTL3的gRNA(GA347)配制的LNP。在施用测试制品之后两周，进行活检以评估碱基编辑。在从研究开始30天之后，施用相反的LNP。再过2周之后进行第二次活检后，提取gDNA，并且使用下一代测序评估碱基编辑。来自此研究的发现显示在第一剂量和第二剂量的LNP之后，实现了PCSK9和ANGPTL3靶标的高水平编辑(图43)。在两个活检时间点收集血液样品，并且显示在随后用1mg/kg LNP给药之后，循环PCSK9和ANGPTL3显著降低约90％(图44)。在同一项研究中，以2mg/kg总RNA剂量施用包封1:0.5:0.5重量比的ABE8.8 mRNA、PCSK9 gRNA GA346和ANGPTL3 gRNA GA347的LNP，这产生稳健的同步PCSK9和ANGPTL3基因编辑(图44，顶部和底部数据标记为GA346+GA347(D1)–上图和下图显示PSCK9和ANGPTL3编辑)。数据证明了通过单次施用1个剂量的ABE碱基编辑器mRNA和两种或更多种靶向哺乳动物(和/或哺乳动物细胞)中的两种或更多种感兴趣的基因的gRNA能够实现稳健的多基因编辑。图44反映了ANGPTL3(底部)和PCSK9(顶部)蛋白的对应敲低。
在另一项研究中，向NHP重复给药LNP(图45)。以0.5mg/kg的总RNA剂量经由静脉内输注向NHP给药用ABE8.8 mRNA MA004和靶向PCSK9的gRNA(GA097)配制的LNP#1和LNP#2。NHP在第30天和第60天接受额外的LNP剂量。提取第14天、第46天和第75天的肝脏活检以进行腺苷碱基编辑分析。提取所有的gDNA，并且使用下一代代测序评估碱基编辑。这些结果证明了重复给药含有ABE8.8 mRNA和PCSK9 gRNA的LNP会导致肝脏中的相加碱基编辑，因为编辑效率在第一剂量的LNP之后接近30％，而在第三剂量的LNP之后超过50％。还观察到相加编辑的程度是LNP依赖性的。
此外，重复给药LNP降低了NHP中的PCSK9蛋白水平(图46)。在90天内监测重复给药用ABE8.8 mRNA MA004和靶向PCSK9的gRNA(GA097)配制的LNP的NHP中的PCSK9蛋白水平。在第0天、第30天和第60天以0.5mg/kg的总RNA剂量经由静脉内输注向NHP给药(图上示出了箭头来描绘给药)。关于PCSK9蛋白水平的分析描述，参见详细方法部分。与基础水平相比，PCSK9蛋白在初始剂量的LNP之后下降了近40％，但在额外剂量后进一步下降。
在重复给药LNP后评估肝脏标记物(图47)。在长达71天内评估重复给药用ABE8.8mRNA MA004和靶向PCSK9的gRNA(GA097)配制的LNP的NHP中的ALT、AST、总胆红素和肌酸激酶水平。在第0天、第30天和第60天(其在图上分别显示为D1、D2和D3)以0.5mg/kg的总RNA剂量经由静脉内输注向NHP给药。在第14天和第46天(其在图上分别显示为B1和B2)进行肝脏活检。如图上所述，在多个时间点收集血液。尽管ALT和AST在给药后略有上升，但这是短暂的应答，在几天时间段之后恢复正常。类似地，肌酸激酶水平在给药后增加，在第一剂量之后效果最大，并且在几天时间段之后恢复到基础水平。
在用ABE8.8 mRNA MA004和靶向PCSK9的gRNA(GA097)配制的LNP重复给药的NHP中评估肝酶LDH、GLDH、GGT和ALP(图48)。在第0天、第30天和第60天以0.5mg/kg的总RNA剂量经由静脉内输注向NHP给药。如图上所述，在多个时间点收集血液。尽管LDH和GLDH在给药后上升，但这是短暂的应答，在几天时间段之后恢复正常。
此外，在非人灵长类动物中评估了ANGPTL3的长期腺嘌呤碱基编辑(图49)。食蟹猴接受3mg/kg剂量的具有ABE8.8 mRNA MA004和ANGPTL3 gRNA GA067的LNP配制品的静脉内输注。在指定时间点处收集血液并分析图，并且分析ANGPTL3蛋白水平(图49A)和甘油三酯水平(图49B)。与对照相比，ANGPTL3蛋白水平(降低96％)和甘油三酯水平在基因的碱基编辑后均明显降低，并保持稳定降低超过170天。
在接受LNP的NHP中评估细胞因子激活和免疫应答。在一组研究中，食蟹猴在三个指定时间点处(图50A和图50B)接受0.5mg/kg剂量的具有ABE8.8 mRNA MA004和PCSK9 gRNAGA346的LNP配制品的静脉内输注。在指定时间点处收集血液，并且分析了图以及IP-10和MCP-1。这些结果证明了：1)与对照组相比，接受LNP的NHP没有细胞因子激活或免疫应答的证据；并且2)重复给药相同的LNP不会引起细胞因子激活或免疫应答。
在另外的研究中，在不同时间点处分析来自从接受1.0mg/kg总RNA剂量的由MA004和PCSK9 gRNA GA346配制的LNP的静脉输注的NHP中收集的血液的IL-6、MCP-1和SC5b-9(分别为图50C、图50D和图50E)。与对照相比，这导致最小的细胞因子/补体激活，其在336小时处/之前恢复到基线。
实施例11.SpCa9介导的中靶编辑效率的评价
评估了非人灵长类动物中ANGPTL3或PCSK9的基因编辑。食蟹猴接受1.5mg/kg剂量的具有SpCas9 mRNA MS004和一种靶向ANGPTL3(GA261-GA263)或PCSK9(GA266-GA271)的gRNA的LNP配制品的静脉内输注。在2周之后进行尸检时，从每个肝叶中分离两片(总计8片)并提取gDNA。如详细方法部分中所述对样品进行加工。分析每个单片的插入缺失％并且作为单个点作图(图51)。在大多数NHP肝脏中观察到高编辑效率。测量了LDL-C水平(图52)。接受具有SpCas9 mRNA/PCSK9 gRNA的LNP的所有NHP的循环LDL-C水平降低至少35％。虽然更中度，但具有SpCas9 mRNA/ANGPTL3 gRNA的LNP使循环LDL-C水平降低10％-25％。另外，接受具有SpCas9 mRNA/ANGPTL3 gRNA的LNP的NHP的甘油三酯水平降低约10％-50％(图53)。接受具有SpCas9 mRNA/PCSK9 gRNA的LNP的NHP没有显示显著的甘油三酯水平降低。
将食蟹猴原代肝细胞以2500、1250和625ng/测试制品/mL用SpCas9 mRNA MS002和具有对tracr的修饰的靶向PCSK9的gRNA转染。如详细方法部分中所述处理、测序并分析基因组DNA。独立地对GA266转染两次以充当两个阳性对照。与阳性对照相比，几乎所有转染都产生高编辑效率，而GA405具有略低的编辑效率。
表22.对指导物的修饰保持食蟹猴原代肝细胞中的中靶编辑效率。
Figure BDA0003991453200005491
Figure BDA0003991453200005501
先前已经证明对gRNA的PACE修饰会降低脱靶编辑效率。将人原代肝细胞以2500、1250、500和250ng/测试制品/mL用SpCas9 mRNA MS002和具有对tracr的修饰的靶向PCSK9的gRNA转染。如详细方法部分中所述处理、测序并分析基因组DNA。对GA156进行转染以充当阳性对照。GA248和GA249含有对gRNA的PACE修饰，所述修饰先前已被证明会降低脱靶编辑效率。实际上，虽然与未修饰的gRNA相比，GA248和GA249具有更低的中靶编辑，但GA156(图54A)、GA248和GA249在鉴定的脱靶位点处显示降低的脱靶编辑(图54B)。
评价ABE mRNA序列-MA004、MA019、MA020和MA021-的GC含量(图55A)。通常，MA004序列的GC含量高于MA019、MA020、MA021和ABE8.8m序列。序列MA004中的GC水平在整个ABE序列的某些区域(诸如TadA结构域、N末端接头和C末端接头)以及各个亚区域中也升高(高于60％)。对于所有序列，低于60％的GC水平以灰色阴影显示，以提供与升高的GC区的对比。GC含量是通过确定整个mRNA序列中给定25个核苷酸延伸(即，对于每25个核苷酸)内的G和C的相对量来计算的，G和C的总和除以核苷酸的总数。此比较显示相对于其他mRNA序列，mRNAMA004序列具有不同的G和C核苷酸分布和富集。
进一步说明了序列MA004的区域特异性GC表征(图55)。每行中的图显示了构成完整ABE编码序列(4,767nt)的每1,000个核苷酸延伸中的GC含量。GC含量在序列的5’末端中特别高，其包括TadA区和N末端接头。GC含量在Cas9切口酶的各个部分和ABE序列的3’末端中也很高；在那里，高GC％集中在接头区域周围而非NLS中。具有高GC含量的亚区域按GC达到60％阈值水平的地方划定。每个亚区域中的GC含量是通过确定G和C核苷酸的数量除以每个亚区域的核苷酸总数来计算的。
表26.ABE编码核苷酸MA004、MA019、MA020、MA021和ABE8.8m的GC比较
Figure BDA0003991453200005511
Figure BDA0003991453200005521
*ΔGC是序列MA004 CDS(cDNA序列)的GC含量与序列MA019 CDS、MA020 CDS、MA021CDS和ABE8.8m的平均值之间的差值。
在小鼠中评估这些mRNA构建体的编辑效率(图55B)。这些mRNA，MA004、MA019、MA020和MA021编码相同的ABE蛋白序列，但具有不同的核苷酸序列优化。这些组之间的唯一区别是mRNA序列；mRNA具有相同的碱基修饰，并且每个组使用相同的LNP配制品和gRNA。每个组静脉内施用于小鼠，并且此研究使用0.05mg/kg的低剂量以实现亚饱和水平的肝脏编辑以解决功效差异。在剂量后第5天，分离gDNA，并且通过下一代测序评估碱基编辑。这些结果证明了mRNA序列变化可能影响体内腺苷碱基编辑性能。
所述方法的另外细节
原代肝细胞的铺板、培养和转染。按照制造商的方案培养来自BioIVT的原代人肝细胞(PHH)和原代食蟹猴肝细胞(PCH)。简而言之，从BioIVT获得作为冷冻等分试样的原代人肝细胞和原代食蟹猴肝细胞。实验中使用了四个批次的原代人肝细胞，每个来源于去识别的个体供体：STL(主供体)用于所有实验，包括筛选实验和脱靶实验；HLY、JLP和TLY用于脱靶实验。使用HFG批次的原代食蟹猴肝细胞进行实验。根据制造商的说明书，将细胞解冻并冲洗，然后铺板在涂覆牛胶原蛋白的24孔板中过夜，在补充有TORPEDO抗生素混合物(BioIVT)的INVITROGRO肝细胞培养基中的密度为大约350,000个细胞/孔。将细胞解冻并重悬在肝细胞解冻培养基中，然后在4℃下以100g离心10min。弃去上清液，并且将沉淀的细胞重悬在肝细胞铺板培养基中。每个小瓶含有大约500万个细胞用于铺板一个24孔板。将铺板的细胞在37℃、5％CO2气氛下的组织培养箱中沉降并附着4-6h。在温育之后，检查细胞是否形成单层。然后将温育培养基替换为新鲜的肝细胞维持培养基(从细胞系提供商BioIVT获得的完整INVITROGRO培养基)。因此，细胞已准备好进行转染。经由MessengerMax试剂(Lipofectamine)，使用各种稀释液将每一种gRNA与等量的体外转录的ABE8.8 mRNA(分子量比为1:1)共转染到原代人肝细胞中，以评估不同浓度的测试制品的编辑活性。使用来自Thermo Fisher的MessengerMAX进行转染。溶液A：在OptiMEM中将所需量的指导RNA与1:1wt比的mRNA混合。溶液B：OptiMEM中的MessengerMAX。在将溶液A和B混合之后，将混合物在室温下温育20min。将60μL温育溶液逐滴添加到每个细胞孔中。对于与对应的食蟹猴PCSK9或ANGPTL3基因序列完全匹配的原间隔子序列，将每种gRNA也与等量的ABE8.8 mRNA(分子量比为1:1)共转染到原代食蟹猴肝细胞中，并遵循相同的转染方案。然后将细胞保持在37℃下，持续3天。根据制造商的说明书，使用Thermo Kingfisher或Qiagen DNEasy血液和组织试剂盒收获细胞并准备用于基因组DNA提取。
生物信息学分析。使用CRISPResso2 v2.0.31以批处理模式(CRISPRessoBatch)分析靶向扩增子测序数据。针对Cas9实验，设定以下参数：“--quantification_window_center-3--quantification_window_size 5--min_frequency_alleles_around_cut_to_plot 0.1--max_rows_alleles_around_cut_to_plot 100”。针对ABE实验，设定以下参数：“--default_min_aln_score 95--quantification_window_center-10--quantification_window_size10--base_editor_output--conversion_nuc_from A--conversion_nuc_to G--min_frequency_alleles_around_cut_to_plot 0.1--max_rows_alleles_around_cut_to_plot100”。针对NHP实验，设定另外的参数以排除低质量读取：“--min_single_bp_quality 30”。此外，在所有情况下，遵循FLASH建议(http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)，参数“--max_paired_end_reads_overlap”设定为2R-F+0.25*F，其中R是读长并且F是扩增子长度。
由“Quantification_window_nucleotide_percentage_table.txt”输出表将编辑定量为支持主要编辑位置(原间隔子DNA序列的位置6)中的任何A至G/C/T取代的读取百分比。由“Alleles_frequency_table_around_sgRNA_*.txt”输出表将插入缺失定量为支持切口位点(PAM序列上游的位置-3处)的任一侧上5-bp窗口内的插入或缺失的读取的百分比，从而排除支持大于30bp的缺失的读取。对于候选脱靶位点，由“Alleles_frequency_table_around_sgRNA_*.txt”输出表将编辑定量为来自在编辑窗口(原间隔子的PAM远侧中的位置1-10)中具有A->G取代的等位基因的读取的百分比，从而排除来自具有大于30bp的缺失的等位基因的读取。
逆转录。根据制造商的说明书，使用miRNeasy Mini试剂盒(QIAGEN)加工收集的细胞，以分离大RNA和小RNA物种，收获另一部分的基因组DNA以建立PCSK9编辑，并且从而确认细胞中的碱基编辑器活性。根据制造商的说明书，使用iScript逆转录Supermix试剂进行逆转录，使用四种不同的引物对对跨越外显子1和外显子2、具有或没有内含子1的任何部分的转录物进行PCR扩增。如上所述，使用具有参数“ILLUMINACLIP:NexteraPE-PE.fa:2:30:10:1:true LEADING:3TRAILING:3SLIDINGWINDOW:4:15MINLEN:36”的trimmomatic v0.39将使用Illumina MiSeq系统生成的250-bp长度的双端测序读取针对适体进行剪切。然后将读取用FLASH v1.2.1134合并并且用具有参数“--local--very-sensitive-local-k 1--np 0”的Bowtie2v2.4.1与PCSK9基因体比对。从Ensembl v98(ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-98/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.98.gtf.gz)获得基因注释。将比对用samtools v1.10过滤，并且用bedtools v2.25.0bamtobed函数转换为BED格式。每个样品最少需要1000个映射读取，并且统计映射读取的结束位置。报告了在至少一个经处理的样品中由最少10个读取支持的整个PCSK9内含子1中的位置。
预测候选脱靶位点的ONE-seq分析。ONE-seq文库的设计始于对参考基因组中与中靶具有序列同源性的位点的计算鉴定。对于人ONE-seq文库，使用Cas-Designer v1.2(http://www.rgenome.net/cas-designer/)搜索参考人基因组(GRCh38，Ensembl v98，染色体ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-98/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCh38.dna.chromosome.{1-22,X,Y,MT}.fa和ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-98/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCh38.dna.nonchromosomal.fa)，以寻找与以上原间隔子序列具有最多6个错配的潜在脱靶位点，以及具有最多4个错配加上最多2个DNA或RNA凸起的位点。
对于与食蟹猴有关的ONE-seq文库，使用类似的参数搜索参考食蟹猴基因组(macFas5，Ensembl 98，染色体ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-98/fasta/macaca_fascicularis/dna/Macaca_fascicularis.Macaca_fascicularis_5.0.dna.chromosome.{1-20,X,MT}.fa.gz和ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-98/fasta/macaca_fascicularis/dna/Macaca_fascicularis.Macaca_fascicularis_5.0.dna.nonchromosomal.fa.gz)。
使用X<错配数><凸起数>代码来引用具有最多6个错配且没有凸起的位点。由此，中靶位点被标记为X00；与中靶具有1个错配且没有凸起的位点白标记为X10，以此类推。用类似的命名法，DNA<错配数><凸起数>来引用具有DNA凸起的位点。由此，与中靶具有4个错配和2个DNA凸起的位点被标记为DNA42。针对RNA凸起使用相同的命名法，但是这些被编码为RNA<错配数><凸起数>。
鉴定的原间隔子序列在具有来自相应参考基因组的相邻序列(这些区域在本文中被称为基因组环境)的两侧上延伸了10个核苷酸(nt)。然后用最终长度为大约200nt的附加序列填充这些延伸序列，包括6个具有不同核苷酸组成和序列长度的预定义恒定区；2个14-nt位点特异性条形码的拷贝，中心原间隔子序列的每侧上各一个；以及2个不同的11-nt独特分子标识符(UMI)，中心原间隔子序列的每侧上各一个。UMI用于校正PCR扩增的偏向，并且条形码允许在分析期间明确地鉴定每个位点。条形码选自668,420个条形码的初始列表，所述条形码的序列中既不包含CC也不包含GG，并且每个条形码与任何其他条形码的汉明距离为2。使用自定义Python脚本来设计最终文库。
最终寡核苷酸文库由商业供应商(Agilent Technologies)合成。对每个文库进行PCR扩增并经受1.25×AMPure XP珠纯化(Beckman Coulter)。在CutSmart缓冲液(NewEngland Biolabs)中在25℃下温育10分钟之后，将包含769nM重组ABE8.8-m蛋白和1.54μMgRNA的RNP与100ng纯化文库混合并在37℃下温育8小时。RNP剂量来源于一项分析，所述分析记录了它是超饱和剂量，即高于在生物化学测定中实现最大中靶编辑量的剂量。
添加蛋白酶K(New England Biolabs)以在37℃下淬灭反应物45分钟，接着进行2×AMPure XP珠纯化。然后将反应物连续地用EndoV(New England Biolabs)在37℃下温育30分钟，用Klenow Fragment(New England Biolabs)在37℃下温育30分钟，并且用NEBNextUltra II End Prep Enzyme Mix(New England Biolabs)在20℃下温育30分钟，接着在65℃下温育30分钟，在每次温育之后进行2×AMPure XP珠纯化。将反应物与退火衔接子寡核苷酸双链体在20℃下连接1小时，以促进切割文库产物的PCR扩增，接着进行2×AMPure XP珠纯化。在PippinHT系统(Sage Sciences)上进行连接反应物的大小选择，以在3％琼脂糖凝胶盒上分离150至200bp的DNA，接着进行2轮PCR扩增以生成条形码文库，所述文库在如上所述的Illumina MiSeq系统上进行双端测序。
在ONE-seq实验中获得两个切割产物。PROTO侧包括切割位置上游的寡核苷酸部分，而PAM侧包括切割位置下游的寡核苷酸部分。在ABE实验中，只有PROTO侧提供了编辑活性的信息(A→G取代)；因此，只对这一侧进行测序。
使用immomatic v0.39(Bolger等人，2014)，用自定义Nextera适体(PrefixPE/1：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT；PrefixPE/2：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT；如文件中指定的)和参数“ILLUMINACLIP:NEB_custom.fa:2:30:10:1:true LEADING:0TRAILING:0SLIDINGWINDOW:4:30MINLEN:36”对双端测序读取进行剪切以对适体进行测序。对于具有较低测序质量的实验(VOL014)，将这些参数设定为“ILLUMINACLIP NEB_custom.fa:2:30:10:1:true LEADING:2TRAILING:0 SLIDINGWINDOW:30:30MINLEN:36”。然后使用具有参数“--max-mismatch-density＝0.25--max-overlap＝160”的FLASH v1.2.11(Magoc和Salzberg，2011)将读取合并。扫描合并的读取以查找每个位点独有的恒定序列、条形码和原间隔子序列，并过滤到编辑窗口(定义为原间隔子的1-10个PAM最远端位置)中具有A→G取代证据的那些序列。弃去重复读取。
对于每个位点，将经编辑读取的总数归一化为分配至中靶位点的经编辑读取总数，并且此比率定义了位点的ONE-seq分数。根据ONE-seq分数对位点进行排序，并且选择分数等于或大于0.001的位点进行验证。这意味着申办者对生物化学测定中编辑活性低至中靶位点的编辑活性的1/1000的位点进行随访。此阈值基于以下前提：在细胞中，如果有100％中靶编辑，则低至1/1000的编辑活性将转化为<0.1％脱靶编辑，这低于NGS检测编辑的下限。
SureSelect。SureSelect组由Agilent Technologies设计并从其购买。使用seqtkv1.3-r106(https://github.com/lh3/seqtk)将质量低于30的原始FASTQ文件中的碱基屏蔽为N。使用Agilent的AGeNT v2.0.5工具中的“Trimmer”脚本对适体进行剪切。使用具有参数“-C”的BWA MEM v 0.7.17-r1188将读取与GRCh38参考人基因组(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCA/000/001/405/GCA_000001405.15_GRCh38/seqs_for_alignment_pipelines.ucsc_ids/GCA_000001405.15_GRCh38_no_alt_analysis_set.fna)比对。对比对读取进行加工并且使用具有参数“-i-R-IB-OB-U-l<Covered.bed>”的Agilent的AGeNT v2.0.5工具中的“LocatIt”脚本去除重复。使用具有参数“base-depth-F 3848”的perbase v0.6.3(https://github.com/sstadick/perbase)确定编辑窗口(原间隔子的PAM远侧中的位置1-10)中每个位置处的核苷酸分布。通过对编辑窗口中支持A→G取代的读取百分比求和来定量编辑。
指导物非依赖性脱靶分析的RNA-seq。对RNA样品进行加工并通过GENEWIZ测序；在rRNA耗尽后，制备文库并在Illumina HiSeq System系统上进行2150-bp双端测序，每个样品大约5000万个读取。使用GATK Best Practices执行所有样品的RNA-seq变体调用。简而言之，用gencode v34(ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_34/ge ncode.v34.primary_assembly.annotation.gtf.gz)，使用STAR将读取与GRCh38参考基因组(ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCA/000/001/405/GCA_000001405.15_GRCh38/seqs_for_alignment_pipelines.ucsc_ids/GCA_000001405.15_GRCh38_no_alt_analysis_set.fna.gz)比对。使用GATK MarkDuplicates去除PCR重复，接着使用GATKHaplotypeCaller进行变体鉴定。然后通过排除QD(深度质量)<2.0且FS(Fisher strand-链偏倚的证据)>30的那些变体来过滤变体。用gatk4 v4.1.8.1进行所有的GATK分析。
通过与未处理的对照样品进行比较，进一步过滤如上获得的变体，如下所示。(1)经处理的细胞中每个鉴定的变体处的核苷酸分布，每个未处理的对照样品和每个经处理的样品，使用perbase v0.5.1(https://github.com/sstadick/perbase)。(2)对于在经处理和未处理条件中被至少20个读取覆盖的所有变体，RNA编辑被鉴定为所有未处理的对照样品中至少95％的读取中具有参考等位基因(A或T)以及经处理的样品中至少一个读取中具有替代等位基因(G或C)的变体。用经ABE8.8处理和经SpCas9处理的样品中的每一个执行以上步骤。
指导RNA分析。在固相寡核苷酸合成和去保护条件下使用受控孔玻璃支持物和可商购获得的亚磷酰胺单体和寡核苷酸合成试剂来合成表1中所示的指导RNA(Methods inMolecular Biology,1993,20,81-114；ACS Chem.Biol.2015,10,1181-1187，通过引用以其全文并入本文)。将指导RNA的间隔子部分转化为对应的核糖核苷酸，自5’-末端的前1-3个核苷酸除外。将自5’-末端的前1-3个核苷酸转化为对应的2’-O-甲基核糖核苷酸，如表1中概述。通过HPLC纯化去保护的指导RNA，并且通过质谱分析确认每个指导RNA的完整性。观察到的每个指导RNA的质量符合计算的质量。
通过体外转录(IVT)产生mRNA通过本领域熟知的不同方法产生本文所述的mRNA。其中一种方法是使用T7聚合酶或另外的RNA聚合酶变体进行体外转录(IVT)。通常，mRNA的IVT使用线性化DNA模板，所述模板包含T7聚合酶启动子和相关调控序列、mRNA编码序列(CDS)、3’和5’非翻译区(UTR)、多聚A尾和另外的序列元件，以增强mRNA稳定性和体内性能。在IVT之前，DNA模板呈质粒、PCR产物、合成DNA产物或任何其他双链DNA构建体的形式；通常用限制性消化酶对DNA模板进行线性化以促进失控转录。典型的IVT反应物包括T7聚合酶、DNA模板、RNA酶抑制剂、帽类似物、无机焦磷酸酶和天然存在的核糖核苷酸三磷酸(NTP)，诸如GTP、ATP、CTP、UTP，或用经修饰的NTP(诸如假尿苷、N1-甲基假尿苷、5’甲基胞苷、5-甲氧基尿苷、N6-甲基腺苷和N4-乙酰胞苷)取代天然NTP。帽类似物可以在转录期间添加，或在IVT反应之后使用加帽酶补充；在这两种情况下，添加2’-O-甲基基团或另外的2’化学修饰以首先启动核苷酸来产生cap-1形式的mRNA。在一些情况下，在IVT反应之后使用RNA连接酶将多聚A尾添加到mRNA中。在IVT之后，在一些情况下，将DNA酶添加到转录混合物中以去除DNA模板；可替代地，通过色谱法、沉淀或切向流过滤去除残留的DNA。mRNA的纯化和浓缩通过诸如以下的方法进行：离子交换色谱法、亲和色谱法、沉淀、反相离子对色谱法、氢键色谱法、纤维素色谱法、反相色谱法、酶促反应、尺寸排阻色谱法和切向流过滤。类似的IVT和纯化过程用于产生编码荧光素酶、eGFP、SpCas9、Cas12b、CBE和ABE的mRNA；在所有情况下，DNA模板、反应条件和纯化参数都针对感兴趣的特定基因进行了优化。
脂质纳米颗粒配制品和分析。所用的LNP如先前所述配制(Conway,A.等人2019Mol.Ther.27,866-877；Villiger,L.等人2021Nat.Biomed.Eng.5,179-189)并且通过以下生成：(1)根据制造商的方案使用Precision Nanosystems NanoAssemblr系统进行微流体混合，针对个体有效载荷进行一些优化，或(2)对脂质赋形剂在有机溶剂中的溶液和gRNA和mRNA的水溶液进行快速在线混合。脂质溶液通常包含四种配制赋形剂的混合物，即：氨基脂质、与脂质缀合的平均分子量为2000Da的单甲氧基聚乙二醇(或甲氧基聚乙二醇，被称为PEG-脂质)、胆固醇和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)，在乙醇中以预定摩尔比混合。LNP组合物包含40％-65％的氨基脂质、2％-20％DSPC、1％-5％PEG-脂质，剩下的是胆固醇(全部以mol％为单位)。除非另外指定，否则RNA水溶液含有按重量计1:1的所需mRNA和指导RNA(gRNA)混合物。为了评价mRNA与gRNA比率的影响，在制备对应的LNP之前，制备含有所需重量比的mRNA和gRNA的水溶液，用于评价；例如，制备LNP测试制品以评价小鼠中6:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3和1:6的mRNA与gRNA比率(实施例6，图19)。在一些其他情况下，将mRNA和两种gRNA以1:0.5:0.5(mRNA:gRNA1:gRNA2)的重量比混合，以在单个测试制品中制备含有所需mRNA和两种gRNA的LNP(实施例10，图43)。然后将所需mRNA与gRNA的水溶液通过微流体或通过快速在线混合与乙醇中的脂质赋形剂混合。通过遵循如WO 2019/036028Al、WO 2015/199952 A1、WO 2017/004143、WO 2020/081938 Al和WO 2020/061426 A2中所述的在线混合方案制备用于报告的NHP研究的所有LNP。用于制备NHP LNP测试制品的PEG-脂质选自WO 2019/036028 Al、WO 2015/199952 A1。LNP组合物和可电离氨基脂质选自专利公布WO/2017/004143A1、WO/2017/075531A1和WO/2018/191719A1。用于制备LNP#1和LNP#2(实施例8，图30&图45)的可电离氨基脂质选自公布WO 2018/191719 Al。随后将所得的LNP配制品针对测试制品缓冲液进行透析，并使用0.2μm无菌过滤器过滤。
作为实例，用于细胞和NHP研究的LNP具有55至65nm的平均流体动力学直径范围，如通过动态光散射确定的<0.2的多分散性指数，以及如通过Quant-iT Ribogreen测定测量的85％-98％总RNA包封率。在施用之前如文献中所述测量LNP粒径(Z-Ave，流体动力学直径)、多分散性指数和总RNA包封率。
作为实例，用于细胞和小鼠研究的LNP具有55-120nm的粒径(Z-Ave，流体动力学直径)，如通过动态光散射(Malvern NanoZS Zetasizer)确定的<0.2的多分散性指数，以及如通过Quant-iT Ribogreen测定(Thermo Fisher)测量的85％-100％总RNA包封率。
基因组DNA提取。将整个小鼠肝脏或100-200mg的猴肝脏加载到2mL裂解介质管(MPBio)中。根据制造商的方案，使用FastPrep-24系统(MP Bio)裂解肝脏，用0.5ml PBS裂解小鼠肝脏或用0.25mL PBS裂解猴肝脏。根据制造商的方案，使用基于珠的提取试剂盒MagMAX-96DNA多样品试剂盒(Thermo-Fisher Scientific)，在KingFisher Flex自动提取仪器(Thermo-Fisher Scientific)上从大约20μL小鼠或猴肝脏裂解物中分离基因组DNA。对于猴肝脏活检样品，使用Qiagen DNEasy Blood&Tissue试剂盒提取来根据制造商的说明书提取基因组DNA。将提取的基因组DNA储存在4℃下直至进一步使用，或在-80℃下长期储存。
通过ELISA定量的PCSK9蛋白水平。在抽血后收集血液样品并加工成血浆。使用所述的ELISA通过ELISA确定血浆食蟹猴PCSK9水平；简而言之，将在测定稀释液D(Biolegend，部件#76384)中稀释的纯化食蟹猴PCSK9的测试样品或标准物用测定缓冲液A(Biolegend，部件#78232)在涂覆人PCSK9特异性单克隆抗体(Biolegend，部件#76157)的96孔微板中温育。在用洗涤缓冲液(Biolegend，部件#78233)洗涤四次之后，将人PCSK9特异性多克隆抗体(Biolegend，部件#76158)在单个孔中温育。在四次洗涤之后，接下来将亲和素-HRP(Biolegend，部件#77897)在单个孔中温育。在六次洗涤之后，使用含有TMB的底物溶液F(Biolegend，部件#79132)来使板显影。在设定为450nm的微板读取器上确定光学密度。从450nm处的读取中减去570nm处的读取，以校正板中的光学缺陷。在抽血后收集血液样品并加工成血浆，并且储存在-86℃至-60℃下，直至进行分析。
通过ELISA定量的ANGPTL3蛋白水平。通过ELISA确定血浆食蟹猴ANGPTL3水平；简而言之，将在校准物稀释液RD6Q(R&D，部件#895128)中稀释的纯化食蟹猴ANGPTL3的测试样品或标准物用测定缓冲液RD1-76(R&D，部件#895812)在涂覆人ANGPTL3特异性单克隆抗体(R&D，部件#893734)的96孔微板中温育。在用洗涤缓冲液(R&D，部件#895003)洗涤四次之后，接下来将含有与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的人ANGPTL3特异性多克隆抗体的人ANGPTL3缀合物(R&D，部件#893735)在单个孔中温育。在四次洗涤之后，使用TMB底物溶液(R&D，部件#895000和895001)来使板显影。在设定为450nm的微板读取器上确定光学密度。从450nm处的读取中减去540nm处的读取，以校正板中的光学缺陷。
定量脂质水平。针对每种分析物的试剂盒含有试剂、胆固醇、甘油三酯和HDL-C，其使用特定酶促反应产物的吸光度测量来定量。间接地确定LDL-C。大多数循环胆固醇在三种主要的脂蛋白级分中找到：极低密度脂蛋白(VLDL)、LDL和HDL。[总C]＝[VLDL-C]+[LDL-C]+[HDL-C]。因此，LDL-C可以由总胆固醇、甘油三酯和HDL-C的测量值根据以下关系计算：[LDL-C]＝[总C]-[HDL-C]-[TG]/5，其中[TG]/5是表达的VLDL-胆固醇的估计值。这些结果提供了体内敲低人肝脏中的PCSK9并实现血液PCSK9蛋白和LDL-C水平降低的碱基编辑疗法的临床前概念验证。
甘油三酯水平的直接测量。使用临床分析仪仪器来测量血清样品中的‘脂质组’。这需要直接测量胆固醇(总C)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。针对甘油三酯的特定试剂盒含有缓冲液、校准物、空白和对照。使用所提供的试剂，分析来自研究的血清样品。使用一系列偶联酶促反应来测量甘油三酯。H2O2是最后一个最终产物，并且使用其在500nm处的吸光度来定量分析物。颜色强度与甘油三酯浓度成比例。所有值以mg/dL为单位报告。
小鼠的LNP处理。小鼠研究得到了查尔斯河加速器和开发实验室(CRADL)的机构动物护理和使用委员会的批准，并在那里进行了研究。从美国杰克逊实验室(The Jackson Laboratory)获得雌性C57BL/6J小鼠，并在8-10周龄时用于实验，将动物随机分配到各个实验组。以对应于mg总RNA/动物体重(千克)的mg/kg剂量，经由注射到侧尾静脉中和/或静脉窦的眼球后注射(LabAnim 2011；40(5):155-160)将LNP施用于小鼠。在配制LNP之后，基于构成mRNA和gRNA量的总RNA计算剂量。在处理后一周，除非另外说明，否则对小鼠进行安乐死，并且在尸检时获得肝脏样品并根据制造商的说明书用KingFisher Flex纯化系统进行加工以分离基因组DNA。
NHP的LNP处理。NHP研究分别得到了Envol Biomedical和Altasciences的机构动物护理和使用委员会的批准。NHP研究在Envol Biomedical(研究#VTP2001)和Altasciences(研究#1388.02、04、05、09和11)处进行，两项研究均使用柬埔寨起源的食蟹猕猴。在研究开始时，动物年龄为2-3岁，体重为2-3千克。所有动物均在一个或多个PCSK9和/或ANGPTL3编辑位点处进行基因分型，以确保接受LNP的任何动物都是完全匹配gRNA序列的原间隔子DNA序列的纯合子，并且将动物随机分配到各个实验组。除非另外声明，否则在LNP施用之前用1mg/kg地塞米松、0.5mg/kg法莫替丁和5mg/kg苯海拉明对动物进行预用药。在1小时(+/-5分钟)时间段内，使用插入到与预输注线连接的外周静脉中的临时导管施用LNP。除非另外指定，否则剂量配制品以6ml/kg的体积施用，并且以对应于mg总RNA/动物重量(千克)的mg/kg给药。在配制LNP之后，基于构成mRNA和gRNA量的总RNA计算剂量。使用输注泵递送基于动物体重的适当体积。在相同的输注条件下，对照动物接受磷酸盐缓冲盐水而不是LNP。当在同一NHP研究中使用两种由氨基脂质1和氨基脂质2构成的LNP时，将测试物品鉴定为LNP#1和LNP#2，其中用于制备这些LNP的mRNA和gRNA是相同的。如果在研究中仅使用一种LNP组合物，则将测试制品鉴定为LNP。
对于血液化学样品，在经由外周静脉穿刺收集之前将动物禁食至少4小时。NHP研究通常按照以下时间表进行收集：第-10天、第-7天、第-5天、第1天(LNP输注之后6小时)、第2天、第3天、第5天、第8天和第15天。在长期研究中，也在第21天和第28天收集样品，并且通常在此之后每2周收集一次，并且由研究地点分析LDL胆固醇、HDL胆固醇、总胆固醇、甘油三酯、AST和ALT。对于每种分析物，将第-10天、第-7天和第-5天的值的平均值视为基线值。将每个血液样品的一部分发送给研究人员进行PCSK9或ANGPTL3蛋白测量。
细胞因子水平的分析。根据制造商的说明书，通过U-PLEX生物标记物组1(NHP)测定(Meso Scale Discovery，#K15068L-2)确定血清食蟹猴IL-6、MCP-1和IP-10水平。简而言之，将U-PLEX(Meso Scale Discovery，#N05230)板用接头偶联捕获抗体(MCP-1抗体；MesoScale Discovery，#C26UG-3，IL-6抗体；Meso Scale Discovery，#C21TX-3，IP-10抗体；Meso Scale Discovery，#C21UF-3)在4℃下温育过夜。在用PBS-T(含有0.05％Tween 20的PBS)洗涤3次之后，将测试样品或校准标准物(校准物1：Meso Scale Discovery，#C0060-2，校准物2：Meso Scale Discovery，#C0061-2)用测定稀释液43(Meso Scale Discovery，#R50AG-2)在室温下温育一小时，所述测定稀释液含有血清、阻断剂和防腐剂。在3次洗涤之后，将IL-6(Meso Scale Discovery，#D26TX-3)、MCP-1(Meso Scale Discovery，#D26UG-3)和IP-10(Meso Scale Discovery，#D21UF-3)的SULFO-TAG缀合检测抗体在室温下在单个孔中温育一小时。在3次洗涤并向每个孔中添加GoldTM读取缓冲液B(Meso ScaleDiscovery，#R60AM-2)之后，通过MSD仪器(Meso Scale Discovery，#R31QQ-3)分析板。
表23.ABE变体序列
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表24.指导RNA(SgRNA/gRNA)序列
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本说明书中提及的所有专利和出版物均通过引用并入本文，就好像每个独立的专利和出版物被明确地并单独地指示通过引用并入一样。
其他实施方案
[763]根据以上描述将显而易见的是，可以对本文所述的公开内容做出变化和修改，以将其应用于各种用途和条件。此类实施方案也在以下权利要求书的范围内。
[764]本文中对变量的任何定义中的元素列表的叙述包括将此变量定义为所列元素的任何单个元素或组合(或子组合)。本文中对实施方案的叙述包括此实施方案作为任何单个实施方案、此实施方案的任何部分或与任何其他实施方案或其任何部分组合。
[765]如本文所列，将认识到本公开内容包括用于在基因中实现核碱基改变的碱基编辑系统及其用于治疗疾病的使用方法的特定实施方案和实例，包括包含此类碱基编辑系统、设计及其修改的组合物；以及单独地和组合地描述前述内容的合成、制造、使用和功效的特定实例和实施方案，包括作为用于治疗疾病和在所述条件下将活性剂体内和体外递送至哺乳动物的药物组合物。
虽然已经提供了特定实例和许多实施方案来说明前述内容的各个方面和方面的组合，但是应认识到并理解，示例性或公开的实施方案的任何方面或其组合可以不受限制地从中排除以构成另一个实施方案，并且可以设想任何此类实施方案可以构成单独的和独立的权利要求。类似地，应认识到并理解，一个或多个实施方案的任何方面或方面的组合也可以包括或与一个或多个实施方案的任何方面或方面的组合进行组合，并且本文中设想其所有此类组合都落在本公开内容的范围被，并且可以作为单独的和独立的权利要求而不受限制地呈现。因此，应认识到，一项权利要求中呈现的任何特征都可以包括在另一项权利要求中；一项权利要求中呈现的任何特征都可以从权利要求中去除，以构成没有此特征的权利要求；并且一项权利要求中呈现的任何特征可以与另一项权利要求中的任何特征组合，本文中设想其中的每一个。以下列举的条款是前述实施方案和实例的各个方面和方面的组合的进一步说明性实例：
以下是列举的条款的第一实例：
1.一种用于编辑基因靶标的组合物，其包含：
(i)碱基编辑器融合蛋白，所述碱基编辑器融合蛋白包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶，或编码其的mRNA，
(ii)指导RNA，所述指导RNA包含充当所述碱基编辑器融合蛋白的结合支架的tracr序列和对应于PCSK9基因上的原间隔子的间隔子序列，
其中当施用于哺乳动物对象时，所述指导RNA引导所述碱基编辑器融合蛋白在所述PCSK9基因中体内实现核碱基改变，
其中当所述指导RNA和所述mRNA以至少0.05mg/kg的总量施用时，所述碱基改变在所述哺乳动物对象的全部肝脏细胞的至少35％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
2.如条款1所述的组合物，其中所述哺乳动物对象是食蟹猴，其中当所述指导RNA和所述mRNA以至少0.5mg/kg的总量施用时，所述碱基改变在所述食蟹猴的全部肝脏细胞的至少40％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
3.如条款1所述的组合物，其中所述哺乳动物对象是食蟹猴，其中当所述指导RNA和所述mRNA以至少1mg/kg的总量施用时，所述碱基改变在所述食蟹猴的全部肝脏细胞的至少45％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
4.如条款1所述的组合物，其中所述哺乳动物对象是食蟹猴，其中当所述指导RNA和所述mRNA以至少1.5mg/kg的总量施用时，所述碱基改变在所述食蟹猴的全部肝脏细胞的至少50％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
5.如条款1所述的组合物，其中所述哺乳动物对象是食蟹猴，其中当所述指导RNA和所述mRNA以至少3mg/kg的总量施用时，所述碱基改变在所述食蟹猴的全部肝脏细胞的至少55％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
6.如条款1所述的组合物，其中所述哺乳动物对象是小鼠，其中当所述指导RNA和所述mRNA以至少0.125mg/kg的总量施用时，所述碱基改变在所述小鼠的全部肝脏细胞的至少40％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
7.如条款1所述的组合物，其中所述哺乳动物对象是小鼠，其中当所述指导RNA和所述mRNA以至少0.5mg/kg的总量施用时，所述碱基改变在所述小鼠的全部肝脏细胞的至少45％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
8.如条款1所述的组合物，其中所述哺乳动物对象是小鼠，其中当所述指导RNA和所述mRNA以至少2mg/kg的总量施用时，所述碱基改变在所述小鼠的全部肝脏细胞的至少50％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
9.如条款2所述的组合物，其中所述核碱基改变导致与所述施用之前相比，所述对象的血液低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平降低至少50％。
10.如条款1-9中任一项所述的组合物，其中所述原间隔子位于剪接位点中。
11.如条款1-9中任一项所述的组合物，其中所述原间隔子互补序列是在所述PCSK9基因的反义链中。
12.如条款1-9中任一项所述的组合物，其中所述原间隔子互补序列是在所述PCSK9基因的有义链中。
13.如条款1-12中任一项所述的组合物，其中所述碱基改变发生在所述PCSK9基因上的所述原间隔子之外(脱靶位点)，
其中表11中列出的脱靶位点的编辑百分比分别低于或等于表11中列出的编辑百分比。
14.如条款1-13中任一项所述的组合物，其中所述脱氨酶是腺嘌呤脱氨酶，并且其中所述核碱基改变是A·T至G·C改变。
15.如条款1-14中任一项所述的组合物，其中所述可编程DNA结合结构域包含核酸酶活性丧失的Cas9或Cas9切口酶。
16.如条款1-15中任一项所述的组合物，其中所述核碱基改变是在所述PCSK9基因的剪接位点处。
17.如条款16所述的组合物，其中所述核碱基改变是在所述PCSK9基因的剪接供体位点处。
18.如条款17所述的组合物，其中所述剪接供体位点是在PCSK9内含子1的5’末端处，如SEQ ID NO:5中所引用。
19.如条款16所述的组合物，其中所述核碱基改变是在所述PCSK9基因的剪接受体位点处。
20.如条款1-19中任一项所述的组合物，其中所述核碱基改变在由所述PCSK9基因编码的转录物中产生移码、提前终止密码子、插入或缺失。
21.如条款1-20中任一项所述的组合物，其中所述核碱基改变产生由所述PCSK9基因编码的异常转录物。
22.如条款1-21中任一项所述的组合物，其中所述指导RNA是经化学修饰的。
23.如条款16所述的组合物，其中所述指导RNA的tracr序列根据图7中描绘的方案进行化学修饰。
24.如条款1-22中任一项所述的组合物，其中所述间隔子序列包括表1中列出的PCSK9 ABE指导RNA间隔子序列。
25.如条款24所述的组合物，其中所述指导RNA包含如表1中所列出的GA096、GA097、GA343、GA346、GA375-377、GA380-389、GA391、GA439或GA440的PCSK9 ABE指导RNA序列。
26.如条款1-23中任一项所述的组合物，其中所述原间隔子序列包括表1中列出的PCSK9 ABE原间隔子序列。
27.如条款26所述的组合物，其中所述原间隔子包含序列5’-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3’(SEQ ID No:13)或5’-CCGCACCTTGGCGCAGCGG-3’(SEQ ID No:247)。
28.如条款1-27中任一项所述的组合物，其中所述碱基编辑器融合蛋白包含SEQID No:2137的氨基酸序列。
29.如条款1-28中任一项所述的组合物，其中所述mRNA序列的GC％含量大于50％。
30.如条款29所述的组合物，其中所述mRNA序列的GC％含量大于56％。
31.如条款30所述的组合物，其中所述mRNA序列的GC％含量大于或等于63％。
32.如条款29所述的组合物，其中所述mRNA包含腺嘌呤tTNA脱氨酶(TadA)区域、Cas9区域和核定位序列(NLS)区域。
33.如条款32所述的组合物，其中所述mRNA还包含连接所述TadA区域和所述Cas9区域的第一接头区域和连接所述Cas9区域和所述NLS区的第二接头区域。
34.如条款32或33所述的组合物，其中所述TadA区域的GC％含量大于60％。
35.如条款32或33所述的组合物，其中所述TadA区域的GC％含量大于或等于70％。
36.如条款32或33所述的组合物，其中所述Cas9区域的GC％含量大于56％。
37.如条款32或33所述的组合物，其中所述Cas9区域的GC％含量大于或等于62％。
38.如条款32或33所述的组合物，其中所述NLS区域的GC％含量大于54％。
39.如条款32或33所述的组合物，其中所述NLS区域的GC％含量大于或等于63％。
40.如条款33所述的组合物，其中所述第一接头区域的GC％含量大于65％。
41.如条款33所述的组合物，其中所述第一接头区域的GC％含量大于或等于79％。
42.如条款33所述的组合物，其中所述第二接头区域的GC％含量大于67％。
43.如条款33所述的组合物，其中所述第二接头区域的GC％含量大于或等于83％。
44.如条款33所述的组合物，其中所述TadA区域的GC％含量大于60％，所述Cas9区域的GC％含量大于56％，所述NLS区域的GC％含量大于54％，所述第一接头区域的GC％含量大于65％，并且所述第二接头区域的GC％含量大于67％。
45.如条款29所述的组合物，其中所述mRNA包含选自表23的mRNA序列。
46.如条款45所述的组合物，其中所述mRNA包含SEQ ID No:2136的mRNA序列。
47.如条款29-46中任一项所述的组合物，其中所述mRNA包含多聚A尾。
48.如条款1-47中任一项所述的组合物，其还包含包封(i)的脂质纳米颗粒(LNP)。
49.如条款48所述的组合物，其中所述LNP还包封(ii)。
50.如条款48所述的组合物，其还包含包封(ii)的第二LNP。
51.如条款1-44中任一项所述的组合物，其中所述指导RNA和编码所述碱基编辑器融合蛋白的所述mRNA的比率是按重量计约1:10至约10:1。
52.如条款51所述的组合物，其中所述指导RNA和编码所述碱基编辑器融合蛋白的所述mRNA的比率是按重量计约1:1、1.5:1、2:1、3:1、4:1、1:1.5、1:2、1:3或1:4。
53.如条款51所述的组合物，其中所述指导RNA和编码所述碱基编辑器融合蛋白的所述mRNA的比率是按重量计约1:1。
54.一种药物组合物，其包含如前述条款中任一项所述的组合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
55.一种用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的如条款1所述的组合物。
56.如条款55所述的方法，其中所述施用是经由静脉内输注。
57.如条款55或56所述的方法，其包括顺序施用包封(i)的LNP和包封(ii)的LNP。
58.如条款55或56所述的方法，其包括并行施用所述包封(i)的t LNP和所述包封(ii)的LNP。
59.如条款57所述的方法，其包括施用单剂量的所述包封(ii)的LNP，接着在1天的间隔内施用交错剂量的所述包封(i)的LNP。
60.如条款57所述的方法，其包括施用单剂量的所述包封(ii)的LNP，接着在2天的间隔内施用交错剂量的所述包封(i)的LNP。
61.如条款57所述的方法，其包括施用单剂量的所述包封(ii)的LNP，接着在3天的间隔内施用交错剂量的所述包封(i)的LNP。
62.如条款57所述的方法，其包括施用单剂量的所述包封(ii)的LNP，接着在4天的间隔内施用交错剂量的所述包封(i)的LNP。
63.如条款57所述的方法，其包括施用单剂量的所述包封(ii)的LNP，接着在5天的间隔内施用交错剂量的所述包封(i)的LNP。
64.如条款57所述的方法，其包括施用单剂量的所述包封(ii)的LNP，接着在6天的间隔内施用交错剂量的所述包封(i)的LNP。
65.如条款57所述的方法，其包括施用单剂量的所述包封(ii)的LNP，接着在7天的间隔内施用交错剂量的所述包封(i)的LNP。
66.如条款55或56所述的方法，其包括施用单剂量的所述包封(i)和(ii)的LNP。
67.如条款66所述的方法，其中所述单剂量的LNP是约0.3至约3mg/kg。
68.如条款66或67所述的方法，其包括向所述对象施用一个或多个治疗的疗程，其中所述一个或多个治疗中的每一个包括一个或多个所述单剂量的所述LNP。
69.如条款68所述的方法，其包括施用两个至十个治疗的疗程。
70.如条款68所述的方法，其包括施用两个至五个治疗的疗程。
71.如条款68所述的方法，其包括施用两个治疗的疗程。
72.如条款68所述的方法，其包括施用三个治疗的疗程。
73.如条款68所述的方法，其包括施用四个治疗的疗程。
74.如条款68所述的方法，其包括施用五个治疗的疗程。
75.如条款55-74中任一项所述的方法，其中所述病症是动脉粥样硬化性心血管疾病。
76.如条款55-74中任一项所述的方法，其中所述病症是动脉粥样硬化性血管疾病。
77.如条款55-74中任一项所述的方法，其中所述对象是人。
78.一种用于编辑基因靶标的组合物，其包含：
(i)碱基编辑器融合蛋白，所述碱基编辑器融合蛋白包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶，或编码其的mRNA，
(ii)指导RNA，所述指导RNA包含充当所述碱基编辑器融合蛋白的结合支架的tracr序列和对应于PCSK9基因上的原间隔子的间隔子序列，
其中当施用于哺乳动物对象时，所述指导RNA引导所述碱基编辑器融合蛋白在所述PCSK9基因中体内实现核碱基改变，并且其中所述指导RNA包含如表1中所列出的PCSK9ABE指导RNA序列。
79.一种用于编辑基因靶标的组合物，其包含：
(i)碱基编辑器融合蛋白，所述碱基编辑器融合蛋白包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶，或编码其的mRNA，
(ii)指导RNA，所述指导RNA包含充当所述碱基编辑器融合蛋白的结合支架的tracr序列和对应于PCSK9基因上的原间隔子的间隔子序列，
其中当施用于哺乳动物对象时，所述指导RNA引导所述碱基编辑器融合蛋白在所述PCSK9基因中体内实现核碱基改变，并且其中所述mRNA包含选自表23的序列。
80.一种用于治疗或预防有需要的对象的动脉粥样硬化性心血管疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的第一组合物和第二组合物，所述第一组合物包含
(i)碱基编辑器融合蛋白，所述碱基编辑器融合蛋白包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶，或编码其的mRNA，
(ii)指导RNA，所述指导RNA包含充当所述碱基编辑器融合蛋白的结合支架的tracr序列和对应于PCSK9基因上的原间隔子的间隔子序列，
其中当施用于哺乳动物对象时，所述指导RNA引导所述碱基编辑器融合蛋白在所述PCSK9基因中体内实现核碱基改变，
其中当所述指导RNA和所述mRNA以至少0.05mg/kg的总量施用时，所述碱基改变在所述哺乳动物对象的全部肝脏细胞的至少35％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量；所述第二组合物包含
(i)碱基编辑器融合蛋白，所述碱基编辑器融合蛋白包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶，或编码其的mRNA，
(ii)指导RNA，所述指导RNA包含充当所述碱基编辑器融合蛋白的结合支架的tracr序列和对应于ANGPTL3基因上的原间隔子的间隔子序列，
其中当施用于哺乳动物对象时，所述指导RNA引导所述碱基编辑器融合蛋白在所述ANGPTL3基因中体内实现核碱基改变，
其中当所述指导RNA和所述mRNA以至少0.5mg/kg的总量施用时，所述碱基改变在所述哺乳动物对象的全部肝脏细胞的至少35％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
81.如条款80所述的方法，其包括顺序施用所述第一组合物和所述第二组合物。
82.如条款81所述的方法，其包括施用一个或多个剂量的所述第一组合物，接着施用一个或多个剂量的所述第二组合物。
83.如条款82所述的方法，其包括施用一个或多个剂量的所述第二组合物，接着施用一个或多个剂量的所述第一组合物。
84.如条款80所述的方法，其包括并行施用所述第一组合物和所述第二组合物。
85.如条款84所述的方法，其包括一个或多个剂量的所述第一组合物和所述第二组合物。
86.一种用于编辑基因靶标的组合物，其包含：
(i)碱基编辑器融合蛋白，所述碱基编辑器融合蛋白包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶，或编码其的mRNA，
(ii)指导RNA，所述指导RNA包含充当所述碱基编辑器融合蛋白的结合支架的tracr序列和对应于APOC3基因上的原间隔子的间隔子序列，
其中所述指导RNA包含如表24中所列出的GA300-303的APOC3 ABE指导RNA序列。
87.一种用于编辑基因靶标的组合物，其包含：
(i)碱基编辑器融合蛋白，所述碱基编辑器融合蛋白包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶，或编码其的mRNA，
(ii)指导RNA，所述指导RNA包含充当所述碱基编辑器融合蛋白的结合支架的tracr序列和对应于PCSK9基因上的原间隔子的间隔子序列，
其中所述指导RNA引导所述碱基编辑器融合蛋白在所述PCSK9基因中体外实现核碱基改变，
其中当所述指导RNA和所述mRNA以至少2.5mg/kg的总量施用时，所述碱基改变在所述哺乳动物对象的全部肝脏细胞的至少35％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
88.一种用于编辑PCSK9基因的组合物，其包含：
(a)mRNA，所述mRNA编码具有编辑窗口的腺嘌呤碱基编辑器蛋白，和
(b)指导RNA，所述指导RNA包含充当所述碱基编辑器蛋白的结合支架的tracr序列和用于将所述碱基编辑器蛋白指引至所述PCSK9基因上的原间隔子序列的间隔子序列，
其中所述间隔子序列与所述PCSK9基因的剪接位点或外显子区是至少部分互补的。
89.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当所述碱基编辑器蛋白与所述指导RNA可操作地结合并且所述指导RNA与所述PCSK9基因上的原间隔子序列的互补链杂交时，所述编辑窗口涵盖所述PCSK9基因的剪接位点。
90.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当所述碱基编辑器蛋白与所述指导RNA可操作地结合并且所述指导RNA与所述PCSK9基因上的原间隔子序列的互补链杂交时，所述编辑窗口涵盖所述PCSK9基因的内含子的区域。
91.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当所述碱基编辑器蛋白与所述指导RNA可操作地结合并且所述指导RNA与所述PCSK9基因上的原间隔子序列的互补链杂交时，所述编辑窗口涵盖所述PCSK9基因的内含子1、内含子3或内含子4的区域。
92.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当所述碱基编辑器蛋白与所述指导RNA可操作地结合并且所述指导RNA与所述PCSK9基因上的原间隔子序列的互补链杂交时，所述编辑窗口涵盖所述PCSK9基因的内含子1的区域。
93.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中所述间隔子序列与选自被鉴定为GA066、GA073和GA074的指导RNA序列的间隔子序列具有80％-100％核苷酸序列同一性。
94.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中所述tracr序列与选自被鉴定为以下的指导RNA序列的tracr序列具有80％-100％核苷酸序列同一性：GA066、GA095、GA096、GA097、GA343、GA346、GA375、GA376、GA377、GA380、GA381、GA382、GA383、GA384、GA385、GA386、GA387、GA388、GA389、GA439和GA440。
95.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中所述mRNA与被鉴定为MA002、MA004、MA040、MA0041或MA045的mRNA序列具有80％-100％序列同一性。
96.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中所述mRNA具有下表中列出的GC核苷酸区域百分比中的一个或多个：
核苷酸区域 平均GC核苷酸含量
27-213 67％-73％
389-661 67％-71％
735-829 63％-74％
4207-4286 67％-70％
4537-4569 65％-73％
4683-4741 62％-67％
97.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中所述mRNA具有下表中列出的GC核苷酸区域百分比中的一个或多个：
核苷酸区域 平均GC核苷酸含量
27-213 至少73％
389-661 至少71％
735-829 至少74％
4207-4286 至少70％
4537-4569 至少73％
4683-4741 至少67％
98.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中所述mRNA和gRNA被封装在脂质纳米颗粒内。
99.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中所述mRNA和gRNA被封装在具有以下项的脂质纳米颗粒内：
LNP组成(mol％)：
40％-65％iLipid2％-20％DSPC
1％-5％PEG
剩余的mol％余量是胆固醇；
LNP粒径：55-120nm Z平均流体动力学直径；以及
<0.2的多分散性指数，如通过动态光散射所确定。
100.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中所述mRNA和gRNA被封装在具有在50-70nm之间的Z平均流体动力学直径的LNP粒径的脂质纳米颗粒内。
101.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述PCSK9靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于40％。
102.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述PCSK9靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于50％。
103.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述PCSK9靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于30％。
104.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述PCSK9靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于40％。
105.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述PCSK9靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于50％。
106.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述PCSK9靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于60％。
107.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述PCSK9靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于70％。
108.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述PCSK9靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于40％。
109.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述PCSK9靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于50％。
110.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述PCSK9靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于60％。
111.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述PCSK9靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于70％。
112.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述PCSK9靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于80％。
113.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述PCSK9靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于40％。
114.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述PCSK9靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于50％。
115.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述PCSK9靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于60％。
116.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述PCSK9靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于70％。
117.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述PCSK9靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于80％。
118.如条款87-117所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中经由所述猴的肝脏活检或尸检，通过分析经给药的食蟹猴肝脏来在给药之后15天时确定所述编辑百分比。
119.如条款87-117所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中通过对经给药的所述食蟹猴进行定期肝脏活检测试确定所述编辑百分比得以在给药之后至少168天的跨度内持久地维持。
120.如条款87-117所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中通过对经给药的所述食蟹猴进行定期肝脏活检测试确定所述编辑百分比得以在给药之后至少300天的跨度内持久地维持。
121.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的PCSK9蛋白与基线相比降低平均至少35％。
122.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的PCSK9蛋白与基线相比降低平均至少40％。
123.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的PCSK9蛋白与基线相比降低平均至少50％。
124.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述猴的血浆中的PCSK9蛋白与基线相比降低平均至少60％。
125.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的PCSK9蛋白与基线相比降低平均至少70％。
126.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的PCSK9蛋白与基线相比降低平均至少80％。
127.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的PCSK9蛋白与基线相比降低平均至少35％。
128.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的PCSK9蛋白与基线相比降低平均至少40％。
129.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的PCSK9蛋白与基线相比降低平均至少50％。
130.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的PCSK9蛋白与基线相比降低平均至少60％。
131.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的PCSK9蛋白与基线相比降低平均至少70％。
132.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的PCSK9蛋白与基线相比降低平均至少80％。
133.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的PCSK9蛋白与基线相比降低平均至少35％。
134.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的PCSK9蛋白与基线相比降低平均至少40％。
135.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的PCSK9蛋白与基线相比降低平均至少50％。
136.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的PCSK9蛋白与基线相比降低平均至少60％。
137.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的PCSK9蛋白与基线相比降低平均至少70％。
138.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的PCSK9蛋白与基线相比降低平均至少80％。
139.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的PCSK9蛋白与基线相比降低平均至少35％。
140.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的PCSK9蛋白与基线相比降低平均至少40％。
141.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的PCSK9蛋白与基线相比降低平均至少50％。
142.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的PCSK9蛋白与基线相比降低平均至少60％。
143.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的PCSK9蛋白与基线相比降低平均至少70％。
144.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的PCSK9蛋白与基线相比降低平均至少80％。
145.如条款121-144所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中经由对经给药的所述食蟹猴进行血液采样和分析在给药之后15天时确定血浆蛋白的所述降低。
146.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述猴的血浆中的LDL-C与基线相比降低平均至少20％。
147.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的LDL-C与基线相比降低平均至少25％。
148.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的LDL-C与基线相比降低平均至少30％。
149.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的LDL-C与基线相比降低平均至少35％。
150.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的LDL-C与基线相比降低平均至少40％。
151.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的LDL-C与基线相比降低平均至少45％。
152.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的LDL-C与基线相比降低平均至少20％。
153.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的LDL-C与基线相比降低平均至少25％。
154.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的LDL-C与基线相比降低平均至少30％。
155.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的LDL-C与基线相比降低平均至少35％。
156.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的LDL-C与基线相比降低平均至少40％。
157.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的LDL-C与基线相比降低平均至少45％。
158.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的LDL-C与基线相比降低平均至少50％。
159.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的LDL-C与基线相比降低平均至少55％。
160.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的LDL-C与基线相比降低平均至少60％。
161.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的LDL-C与基线相比降低平均至少20％。
162.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的LDL-C与基线相比降低平均至少25％。
163.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的LDL-C与基线相比降低平均至少30％。
164.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的LDL-C与基线相比降低平均至少35％。
165.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的LDL-C与基线相比降低平均至少40％。
166.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的LDL-C与基线相比降低平均至少45％。
167.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的LDL-C与基线相比降低平均至少50％。
168.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的LDL-C与基线相比降低平均至少55％。
169.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的LDL-C与基线相比降低平均至少60％。
170.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的LDL-C与基线相比降低平均至少65％。
171.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的LDL-C与基线相比降低平均至少20％。
172.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的LDL-C与基线相比降低平均至少25％。
173.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的LDL-C与基线相比降低平均至少30％。
174.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的LDL-C与基线相比降低平均至少35％。
175.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的LDL-C与基线相比降低平均至少40％。
176.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的LDL-C与基线相比降低平均至少45％。
177.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的LDL-C与基线相比降低平均至少50％。
178.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的LDL-C与基线相比降低平均至少55％。
179.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的LDL-C与基线相比降低平均至少60％。
180.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的LDL-C与基线相比降低平均至少65％。
181.如条款148-182所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中经由对经给药的所述食蟹猴进行血液采样和分析在给药之后15天时确定LDL-C的所述降低。
182.如条款148-182所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中通过对经给药的所述食蟹猴进行定期血液采样和分析确定LDL-C的所述降低得以在至少168天的跨度内持久地维持。
183.如条款148-182所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中通过对经给药的所述食蟹猴进行定期血液采样和分析确定LDL-C的所述降低得以在至少300天的跨度内持久地维持。
184.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的脂蛋白(a)与基线相比降低平均至少10％。
185.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的脂蛋白(a)水平与基线相比降低平均至少15％。186.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的脂蛋白(a)水平与基线相比降低平均至少20％。187.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的脂蛋白(a)水平与基线相比降低平均至少25％。188.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的脂蛋白(a)水平与基线相比降低平均至少30％。189.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的脂蛋白(a)水平与基线相比降低平均大于35％。190.如条款186-191所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中经由对经给药的所述食蟹猴进行血液采样和分析在给药之后15天时确定脂蛋白(a)的所述降低。
191.如条款186-191所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中通过对经给药的所述食蟹猴进行定期血液采样和分析确定脂蛋白(a)的所述降低得以在至少224天的跨度内持久地维持。
192.如条款186-191所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中通过对经给药的所述食蟹猴进行定期血液采样和分析确定脂蛋白(a)的所述降低得以在至少300天的跨度内持久地维持。
193.如条款101-194所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中在对所述食蟹猴的给药导致AST、ALT或细胞因子升高的情况下，由所述组合物的给药导致的升高是短暂的并且在给药之后3-15天内消退回到大约基线水平。
194.如条款101-103、121-126、148-153所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中PCSK9的编辑百分比在肝脏、脾脏和肾上腺组织之外是可忽略不计的，如图27所示。
195.如条款101-107、121-132、148-162所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中在PCSK9编辑百分比的编辑百分比方面，重复给药结果是相加的。
196.如条款195所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中所述重复给药不引起细胞因子激活或免疫应答。
197.如条款88所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中所述间隔子序列与所述PCSK9基因上的靶向的原间隔子的核苷酸序列具有至少80％核苷酸相关性，其中如果所述间隔子序列上的RNA核苷酸与所述原间隔子的DNA核苷酸在相同顺序上具有相同的核苷酸，则所述RNA核苷酸与所述DNA核苷酸相关，并且其中出于确定相关性的目的，尿嘧啶碱基和胸腺嘧啶碱基被认为是相同的核苷酸。
198.如条款197所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中所述间隔子序列与所述PCSK9基因上的靶向的原间隔子的核苷酸序列具有至少85％核苷酸相关性。
199.如条款197所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中所述间隔子序列与所述PCSK9基因上的靶向的原间隔子的核苷酸序列具有至少90％核苷酸相关性。
200.如条款197所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中所述间隔子序列与所述PCSK9基因上的靶向的原间隔子的核苷酸序列具有至少95％核苷酸相关性。
201.如条款197所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中所述间隔子序列与所述PCSK9基因上的靶向的原间隔子的核苷酸序列具有至少99％核苷酸相关性。
202.如条款197所述的用于编辑PCSK9基因的组合物，其中所述间隔子序列与所述PCSK9基因上的靶向的原间隔子的核苷酸序列具有至少100％核苷酸相关性。
203.一种用于治疗或预防有需要的对象的动脉粥样硬化性心血管疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的
(a)mRNA，所述mRNA编码具有编辑窗口的腺嘌呤碱基编辑器蛋白，
(b)第一指导RNA，所述第一指导RNA包含充当所述碱基编辑器蛋白的结合支架的tracr序列和用于将所述碱基编辑器蛋白指引至PCSK9基因上的原间隔子序列的间隔子序列，其中所述间隔子序列与所述PCSK9基因的剪接位点或外显子区是至少部分互补的；和
(c)第二指导RNA，所述第二指导RNA包含充当所述碱基编辑器蛋白的结合支架的tracr序列和用于将所述碱基编辑器蛋白指引至ANGPTL3基因上的原间隔子序列的间隔子序列，其中所述间隔子序列与所述ANGPTL3基因的剪接位点或外显子区域是至少部分互补的。
204.如条款203所述的方法，其还包括包封(a)的第一LNP。
205.如条款204所述的方法，其中所述第一LNP包封(b)和(c)。
206.如条款204所述的方法，其中重复施用所述第一LNP。
207.如条款204所述的方法，其中以一至六十天的间隔重复施用所述第一LNP。
208.如条款204所述的方法，其中以七天的间隔重复施用所述第一LNP。
209.如条款204所述的方法，其中所述第一LNP还包封(b)。
210.如条款209所述的方法，其还包括包封(a)和(c)的第二LNP。
211.如条款210所述的方法，其中顺序施用所述第一LNP和所述第二LNP。
212.如条款211所述的方法，其中以一天至12个月的间隔顺序施用所述第一LNP和所述第二LNP。
213.如条款212所述的方法，其中所述间隔为一天。
214.如条款212所述的方法，其中所述间隔为五天。
215.如条款212所述的方法，其中所述间隔为十天。
216.如条款212所述的方法，其中所述间隔为十五天。
217.如条款212所述的方法，其中所述间隔为二十天。
218.如条款212所述的方法，其中所述间隔为二十五天。
219.如条款212所述的方法，其中所述间隔为一个月。
220.如条款212所述的方法，其中所述间隔为两个月。
221.如条款212所述的方法，其中所述间隔为三个月。
222.如条款212所述的方法，其中所述间隔为五个月。
223.如条款212所述的方法，其中所述间隔为八个月。
224.如条款212所述的方法，其中所述间隔为十个月。
225.如条款212所述的方法，其中所述间隔为十二个月。
以下是列举的条款的第二实例：
1.一种单指导RNA，其包含：(a)间隔子序列，其中所述间隔子序列包含(i)一个或多个化学修饰和(ii)一个或多个所选位置处的一个或多个未修饰的核苷酸，和(b)tracr序列，所述tracr序列与SEQ ID NO:61具有至少70％同一性，其中所述tracr序列充当II型Cas蛋白的结合支架，并且其中所述tracr序列包含(i)一个或多个化学修饰和(ii)一个或多个所选位置处的一个或多个未修饰的核苷酸。
2.如条款1所述的单指导RNA，其中当与感兴趣的基因中的靶多核苷酸序列接触时，所述间隔子序列与所述靶多核苷酸序列杂交，其中当施用于哺乳动物对象时，所述单指导RNA引导所述Cas蛋白在所述基因中实现改变。
3.如条款1或2所述的单指导RNA，其中所述tracr序列在如SEQ ID NO:61中所编号的位置2至7、23至25、27、29、31、38、39、42至45、48、49和62或其对应位置处包含未修饰的核苷酸。
4.如条款1或2所述的单指导RNA，其中所述tracr序列在如SEQ ID NO:61中所编号的位置2至7、13、23至25、27、29、31、38、39、42至45、48、49、53和62或其对应位置处包含未修饰的核苷酸。
5.如条款1或2所述的单指导RNA，其中所述tracr序列在如SEQ ID NO:61中所编号的位置2至7、13、23至25、27、29、31、38、39、42至45、48、49、53、61、68、70和11或其对应位置处包含未修饰的核苷酸。
6.如条款1至3中任一项所述的单指导RNA，其中所述tracr序列在如SEQ ID NO:61中所编号的位置1、8至22、26、28、30、32至37、40、41、46、47、50至61、和63至80或其对应位置处包含经修饰的核苷酸。
7.如条款1至3中任一项所述的单指导RNA，其中所述tracr序列在如SEQ ID NO:61中所编号的位置1、8至12、14至22、26、28、30、32至37、40、41、46、47、50至52、54至61、和63至80或其对应位置处包含经修饰的核苷酸。
8.如条款1至7中任一项所述的单指导RNA，其中所述tracr序列在如SEQ ID NO:61中所编号的位置1、8至12、14至22、26、28、30、32至34、37、41、46、47、50至52、54至60、62至67、69和72至80或其对应位置处包含经修饰的核苷酸。
9.如条款3至8中任一项所述的单指导RNA，其中具有SEQ ID NO:61的所述tracr序列中超过60％的核苷酸是经修饰的。
10.如条款9所述的单指导RNA，其中具有SEQ ID NO:61的所述tracr序列中超过70％的核苷酸是经修饰的。
11.如条款1至10中任一项所述的单指导RNA，其中所述tracr序列在如SEQ ID NO:61中所编号的位置13、49、53和62或其对应位置处包含未修饰的核苷酸。
12.如条款11所述的单指导RNA，其中所述tracr序列在如SEQ ID NO:61中所编号的位置49和62或其对应位置处包含未修饰的核苷酸。
13.如条款1至10中任一项所述的单指导RNA，其中所述tracr序列在如SEQ ID NO:61中所编号的位置13、40、49、53、61、68、70和71或其对应位置处包含未修饰的核苷酸。
14.如条款13中任一项所述的单指导RNA，其中所述tracr序列在如SEQ ID NO:61中所编号的位置13、49和53或其对应位置处包含未修饰的核苷酸。
15.如条款1至10中任一项所述的单指导RNA，其中所述tracr序列在如SEQ ID NO:61中所编号的位置1、8、21、22、26、28、30、32至37、40、41、46和47或其对应位置处包含经修饰的核苷酸。
16.如条款1-15中任一项所述的单指导RNA，其中所述tracr序列与SEQ ID NO:61具有至少80％同一性。
17.如条款1-15中任一项所述的单指导RNA，其中所述tracr序列与SEQ ID NO:61具有至少90％同一性。
18.如条款1-17中任一项所述的单指导RNA，其中所述化学修饰包括2’-OMe修饰。
19.如条款1-17中任一项所述的单指导RNA，其中所述化学修饰包括水粉蕈素或脱氧水粉蕈素。
20.如条款1-17中任一项所述的单指导RNA，其中所述化学修饰包括硫代磷酸酯键。
21.如条款1-20中任一项所述的单指导RNA，其中所述tracr序列包括SEQ IDNo.61，并且其中所述单指导RNA在5’末端、3’末端、所选内部位置或其任何组合处还包含一个或多个硫代磷酸酯键。
22.如条款21所述的单指导RNA，其中所述单指导RNA在5’末端、3’末端或两者处还包含两个且不超过两个连续硫代磷酸酯键。
23.如条款21所述的单指导RNA，其中所述单指导RNA在5’末端、3’末端或两者处还包含三个连续硫代磷酸酯键。
24.如条款1-21中任一项所述的单指导RNA，其中所述单指导RNA在3’末端处包含序列5’-ususuNNN-3’，其中N独立地指示未修饰的核糖核苷酸，并且其中每个u指示2’-O-甲基尿苷并且每个s指示硫代磷酸酯键。
25.如条款24所述的单指导RNA，其中每个N是尿苷。
26.如条款1-21中任一项所述的单指导RNA，其中所述单指导RNA在3’末端处包含序列5’-ususuNNn-3’，其中每个N独立地指示未修饰的核糖核苷酸，其中所述n指示经修饰的核苷酸，其中每个u指示2’-O-甲基尿苷并且其中每个s指示硫代磷酸酯键。
27.如条款26所述的单指导RNA，其中每个N是尿苷并且所述n是2’-O-甲基尿苷。
28.一种单指导RNA，其包含(i)间隔子序列和(ii)tracr序列，其中当与PCSK9基因或ANGPTL3基因中的靶多核苷酸序列接触时，所述间隔子序列与所述靶多核苷酸序列杂交，其中当与II型Cas蛋白接触时，所述tracr序列结合所述II型Cas蛋白，并且其中所述单指导RNA包含水粉蕈素、脱氧水粉蕈素或2’-O-甲基水粉蕈素。
29.一种单指导RNA，其包含(i)间隔子序列和(ii)tracr序列，其中当与PCSK9基因或ANGPTL3基因中的靶多核苷酸序列接触时，所述间隔子序列与所述靶多核苷酸序列杂交，其中当与II型Cas蛋白接触时，所述tracr序列结合所述II型Cas蛋白，并且其中所述单指导RNA在5’末端或3’末端处包含两个且不超过两个硫代磷酸酯键。
30.如条款29所述的单指导RNA，其中所述单指导RNA在5’末端和3’末端处包含两个且不超过两个硫代磷酸酯键。
31.如条款29所述的单指导RNA，其中所述单指导RNA在5’末端处包含三个硫代磷酸酯键。
32.如条款29所述的单指导RNA，其中所述单指导RNA在3’末端处包含三个硫代磷酸酯键。
33.如条款29所述的单指导RNA，其中5’末端处的所述两个硫代磷酸酯键是在5’末端的前两个核苷酸位置处的两个连续硫代磷酸酯键。
34.如条款29所述的单指导RNA，其中5’末端处的所述两个硫代磷酸酯键是在5’末端的前3-10个核苷酸内。
35.如条款29所述的单指导RNA，其中3’末端处的所述两个硫代磷酸酯键是在3’末端的最后两个核苷酸位置处的两个连续硫代磷酸酯键。
36.如条款29所述的单指导RNA，其中3’末端处的所述两个硫代磷酸酯键是在3’末端的最后3-10个核苷酸内。
37.如条款29所述的单指导RNA，其在3’末端处包含序列5’-UsUsUs-3’，其中U指示尿苷，并且s指示硫代磷酸酯键。
38.如条款29所述的单指导RNA，其在3’末端处包含序列5’-UUU-3’。
39.如条款1-27中任一项所述的单指导RNA，其中与未修饰的单指导RNA中的tracr序列相比，所述tracr序列以增加的结合亲和力结合所述II型Cas蛋白。
40.如条款28-38中任一项所述的单指导RNA，其中所述II型Cas蛋白是Cas9蛋白。
41.如条款40所述的单指导RNA，其中所述Cas9蛋白是酿脓链球菌Cas9。
42.一种单指导RNA，其包含选自表1的指导RNA序列，其中a、u、g和c指示2’-OMe修饰的腺嘌呤、尿苷、鸟嘌呤和胞苷，其中s指示硫代磷酸酯键，其中X指示水粉蕈素，其中x指示2’-O-甲基水粉蕈素并且其中dX指示2’-脱氧水粉蕈素。
43.一种用于基因修饰的药物组合物，其包含如条款1-42中任一项所述的单指导RNA和II型Cas蛋白或编码所述II型Cas蛋白的核酸序列。
44.如条款43所述的的药物组合物，其还包含载体，所述载体包含编码所述II型Cas蛋白的核酸序列。
45.如条款43或44所述的药物组合物，其中所述II型Cas蛋白是Cas9。
46.如条款43-45中任一项所述的药物组合物，其还包含药学上可接受的载体。
47.一种脂质纳米颗粒，其包含如条款43-46中任一项所述的药物组合物。
48.一种用于修饰细胞中的靶多核苷酸序列的方法，其包括将如条款43-46中任一项所述的药物组合物引入所述细胞中，其中单指导RNA引导II型Cas蛋白在所述细胞中的靶多核苷酸序列中实现修饰。
49.如条款48所述的方法，其中所述靶多核苷酸序列是在PCSK9基因中。
50.如条款49所述的方法，其中所述修饰减少了所述细胞中由所述PCSK9基因编码的功能性PCSK9蛋白的表达。
51.如条款50所述的方法，其中所述靶多核苷酸序列是在ANGPTL3基因中。
52.如条款51所述的方法，其中所述修饰减少了所述细胞中由所述ANGPTL3基因编码的功能性ANGPTL3蛋白的表达。
53.如条款48-52中任一项所述的方法，其中所述引入经由包含所述组合物的脂质纳米颗粒进行。
54.一种用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法，所述方法包括向所述对象施用如条款43-46中任一项所述的药物组合物或如条款47所述的脂质纳米颗粒，其中单指导RNA引导II型Cas蛋白在所述对象的细胞中的靶多核苷酸序列中实现修饰，从而治疗或预防所述病症。
55.如条款54所述的方法，其中所述靶多核苷酸序列是在PCSK9基因中。
56.如条款54所述的方法，其中所述靶多核苷酸序列是在ANGPTL3基因中。
57.如条款55所述的方法，其中所述修饰减少了所述对象中由所述PCSK9基因编码的功能性PCSK9蛋白的表达。
58.如条款56所述的方法，其中所述修饰减少了所述对象中由所述ANGPTL3基因编码的功能性ANGPTL3蛋白的表达。
59.如条款48-58中任一项所述的方法，其中所述病症是动脉粥样硬化性血管疾病。
60.如条款48-58中任一项所述的方法，其中所述病症是动脉粥样硬化性血管疾病、高甘油三酯血症或糖尿病。
61.如条款48-60中任一项所述的方法，其中与所述施用之前相比，所述对象表现出降低的血液LDL胆固醇水平和/或降低的血液甘油三酯水平。
以下是列举的条款的第三实例：
1.一种用于编辑基因靶标的组合物，其包含：
(i)碱基编辑器融合蛋白，所述碱基编辑器融合蛋白包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶，或编码其的mRNA，
(ii)指导RNA，所述指导RNA包含充当所述碱基编辑器融合蛋白的结合支架的tracr序列和对应于ANGPTL3基因上的原间隔子的间隔子序列，
其中当施用于哺乳动物对象时，所述指导RNA引导所述碱基编辑器融合蛋白在所述ANGPTL3基因中体内实现核碱基改变，其中当所述指导RNA和所述mRNA以至少0.5mg/kg的总量施用时，所述碱基改变在所述哺乳动物对象的全部肝脏细胞的至少35％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
2.如条款1所述的组合物，其中所述哺乳动物对象是食蟹猴，其中当所述指导RNA和所述mRNA以约1mg/kg的总量施用时，所述碱基改变在所述食蟹猴的全部肝脏细胞的至少35％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
3.如条款1所述的组合物，其中所述哺乳动物对象是食蟹猴，其中当所述指导RNA和所述mRNA以约3mg/kg的总量施用时，所述碱基改变在所述食蟹猴的全部肝脏细胞的至少50％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
4.如条款2所述的组合物，其中所述核碱基改变导致与所述施用之前相比，所述食蟹猴的血液甘油三酯水平降低至少20％。
5.如条款3所述的组合物，其中所述核碱基改变导致与所述施用之前相比，所述食蟹猴的血液甘油三酯水平降低至少50％。
6.如条款1-5中任一项所述的组合物，其中所述原间隔子位于剪接位点中。
7.如条款1-5中任一项所述的组合物，其中所述原间隔子互补序列是在所述ANGPTL3基因的反义链中。
8.如条款1-5中任一项所述的组合物，其中所述原间隔子互补序列是在所述ANGPTL3基因的有义链中。
9.如条款1-8中任一项所述的组合物，其中所述碱基改变发生在所述ANGPTL3基因上的所述原间隔子之外(脱靶位点)，
其中表14中列出的脱靶位点的编辑百分比分别低于或等于表14中列出的编辑百分比。
10.如条款1-9中任一项所述的组合物，其中所述脱氨酶是腺嘌呤脱氨酶，并且其中所述核碱基改变是A·T至G·C改变。
11.如条款1-10中任一项所述的组合物，其中所述可编程DNA结合结构域包含核酸酶活性丧失的Cas9或Cas9切口酶。
12.如条款1-11中任一项所述的组合物，其中所述核碱基改变是在所述ANGPTL3基因的剪接位点处。
13.如条款12所述的组合物，其中所述核碱基改变是在所述ANGPTL3基因的剪接供体位点处。
14.如条款13所述的组合物，其中所述剪接供体位点是在ANGPTL3内含子6的5’末端处，如SEQ ID NO:7中所引用。
15.如条款12所述的组合物，其中所述核碱基改变是在所述ANGPTL3基因的剪接受体位点处。
16.如条款1-15中任一项所述的组合物，其中所述核碱基改变在由所述ANGPTL3基因编码的转录物中产生移码、提前终止密码子、插入或缺失。
17.如条款1-16中任一项所述的组合物，其中所述核碱基改变产生由所述ANGPTL3基因编码的异常转录物。
18.如条款1-17中任一项所述的组合物，其中所述指导RNA是经化学修饰的。
19.如条款16所述的组合物，其中所述指导RNA的tracr序列根据图7中描绘的方案进行化学修饰。
20.如条款1-19中任一项所述的组合物，其中所述间隔子序列包括表1中列出的ANGPTL3 ABE指导RNA间隔子序列。
21.如条款20所述的组合物，其中所述指导RNA包含如表1中列出的GA067、GA091、GA098、GA099、GA100、GA101、GA102、GA103、GA347、GA441、GA442、GA472、GA473、GA474、GA475、GA476、GA517或GA547的ANGPTL3 ABE指导RNA序列。
22.如条款1-19中任一项所述的组合物，其中所述原间隔子序列包括表1中列出的ANGPTL3 ABE原间隔子序列。
23.如条款22所述的组合物，其中所述原间隔子包含序列5’-AAGATACCTGAATAACTCTC-3’(SEQ ID No:14)、5’-AAGATACCTGAATAACCCTC-3’(SEQ ID No:15)、5’-GATACCTGAATAACTCTC-3’(SEQ ID No:1606)、5’-AGATACCTGAATAACCCTC-3’(SEQ IDNo:248)或5’-GATACCTGAATAACCCTC-3’(SEQ ID No:249)。
24.如条款1-23中任一项所述的组合物，其中所述碱基编辑器融合蛋白包含SEQID No:2137的氨基酸序列。
25.如条款1-24中任一项所述的组合物，其中所述mRNA序列的GC％含量大于50％。
26.如条款25所述的组合物，其中所述mRNA序列的GC％含量大于56％。
27.如条款26所述的组合物，其中所述mRNA序列的GC％含量大于或等于63％。
28.如条款25所述的组合物，其中所述mRNA包含腺嘌呤tTNA脱氨酶(TadA)区域、Cas9区域和核定位序列(NLS)区域。
29.如条款28所述的组合物，其中所述mRNA还包含连接所述TadA区域和所述Cas9区域的第一接头区域和连接所述Cas9区域和所述NLS区域的第二接头区域。
30.如条款28或29所述的组合物，其中所述TadA区域的GC％含量大于60％。
31.如条款28或29所述的组合物，其中所述TadA区域的GC％含量大于或等于70％。
32.如条款28或29所述的组合物，其中所述Cas9区域的GC％含量大于56％。
33.如条款28或29所述的组合物，其中所述Cas9区域的GC％含量大于或等于62％。
34.如条款28或29所述的组合物，其中所述NLS区域的GC％含量大于54％。
35.如条款28或29所述的组合物，其中所述NLS区域的GC％含量大于或等于63％。
36.如条款29所述的组合物，其中所述第一接头区域的GC％含量大于65％。
37.如条款29所述的组合物，其中所述第一接头区域的GC％含量大于或等于79％。
38.如条款29所述的组合物，其中所述第二接头区域的GC％含量大于67％。
39.如条款29所述的组合物，其中所述第二接头区域的GC％含量大于或等于83％。
40.如条款29所述的组合物，其中所述TadA区域的GC％含量大于60％，所述Cas9区域的GC％含量大于56％，所述NLS区域的GC％含量大于54％，所述第一接头区域的GC％含量大于65％，并且所述第二接头区域的GC％含量大于67％。
41.如条款25所述的组合物，其中所述mRNA包含选自表23的mRNA序列。
42.如条款41所述的组合物，其中所述mRNA包含SEQ ID No:
2136的mRNA序列。
43.如条款25-42中任一项所述的组合物，其中所述mRNA包含多聚A尾。
44.如条款1-43中任一项所述的组合物，其还包含包封(i)的脂质纳米颗粒(LNP)。
45.如条款44所述的组合物，其中所述LNP还包封(ii)。
46.如条款44所述的组合物，其还包含包封(ii)的第二LNP。
47.如条款1-44中任一项所述的组合物，其中所述指导RNA和编码所述碱基编辑器融合蛋白的所述mRNA的比率是按重量计约1:10至约10:1。
48.如条款47所述的组合物，其中所述指导RNA和编码所述碱基编辑器融合蛋白的所述mRNA的比率是按重量计约1:1、1.5:1、2:1、3:1、4:1、1:1.5、1:2、1:3或1:4。
49.如条款48所述的组合物，其中所述指导RNA和编码所述碱基编辑器融合蛋白的所述mRNA的比率是按重量计约1:1。
50.一种药物组合物，其包含如前述条款中任一项所述的组合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
51.一种用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的如条款1所述的组合物。
52.如条款51所述的方法，其中所述施用是经由静脉内输注。
53.如条款51或52所述的方法，其包括顺序施用包封(i)的LNP和包封(ii)的LNP。
54.如条款51或52所述的方法，其包括并行施用所述包封(i)的LNP和所述包封(ii)的LNP。
55.如条款53所述的方法，其包括施用单剂量的所述包封(ii)的LNP，接着在1天的间隔内施用交错剂量的所述包封(i)的LNP。
56.如条款53所述的方法，其包括施用单剂量的所述包封(ii)的LNP，接着在2天的间隔内施用交错剂量的所述包封(i)的LNP。
57.如条款53所述的方法，其包括施用单剂量的所述包封(ii)的LNP，接着在3天的间隔内施用交错剂量的所述包封(i)的LNP。
58.如条款53所述的方法，其包括施用单剂量的所述包封(ii)的LNP，接着在4天的间隔内施用交错剂量的所述包封(i)的LNP。
59.如条款53所述的方法，其包括施用单剂量的所述包封(ii)的LNP，接着在5天的间隔内施用交错剂量的所述包封(i)的LNP。
60.如条款53所述的方法，其包括施用单剂量的所述包封(ii)的LNP，接着在6天的间隔内施用交错剂量的所述包封(i)的LNP。
61.如条款53所述的方法，其包括施用单剂量的所述包封(ii)的LNP，接着在7天的间隔内施用交错剂量的所述包封(i)的LNP。
62.如条款51或52所述的方法，其包括施用单剂量的所述包封(i)和(ii)的LNP。
63.如条款62所述的方法，其中所述单剂量的LNP是约0.3至约3mg/kg。
64.如条款62或63所述的方法，其包括向所述对象施用一个或多个治疗的疗程，其中所述一个或多个治疗中的每一个包括一个或多个所述单剂量的所述LNP。
65.如条款64所述的方法，其包括施用两个至十个治疗的疗程。
66.如条款64所述的方法，其包括施用两个至五个治疗的疗程。
67.如条款64所述的方法，其包括施用两个治疗的疗程。
68.如条款64所述的方法，其包括施用三个治疗的疗程。
69.如条款64所述的方法，其包括施用四个治疗的疗程。
70.如条款62所述的方法，其包括施用五个治疗的疗程。
71.如条款51-70中任一项所述的方法，其中所述病症是动脉粥样硬化性心血管疾病。
72.如条款51-70中任一项所述的方法，其中所述病症是动脉粥样硬化性血管疾病。
73.如条款51-72中任一项所述的方法，其中所述对象是人。
74.一种用于编辑基因靶标的组合物，其包含：
(i)碱基编辑器融合蛋白，所述碱基编辑器融合蛋白包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶，或编码其的mRNA，
(ii)指导RNA，所述指导RNA包含充当所述碱基编辑器融合蛋白的结合支架的tracr序列和对应于ANGPTL3基因上的原间隔子的间隔子序列，
其中当施用于哺乳动物对象时，所述指导RNA引导所述碱基编辑器融合蛋白在所述ANGPTL3基因中体内实现核碱基改变，并且其中所述指导RNA包含如表1中列出的ANGPTL3ABE指导RNA序列。
75.一种用于编辑基因靶标的组合物，其包含：
(i)碱基编辑器融合蛋白，所述碱基编辑器融合蛋白包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶，或编码其的mRNA，
(ii)指导RNA，所述指导RNA包含充当所述碱基编辑器融合蛋白的结合支架的tracr序列和对应于ANGPTL3基因上的原间隔子的间隔子序列，
其中当施用于哺乳动物对象时，所述指导RNA引导所述碱基编辑器融合蛋白在所述ANGPTL3基因中体内实现核碱基改变，并且其中所述mRNA包含选自表23的序列。
76.一种用于治疗或预防有需要的对象的动脉粥样硬化性心血管疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的第一组合物和第二组合物，所述第一组合物包含
(i)碱基编辑器融合蛋白，所述碱基编辑器融合蛋白包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶，或编码其的mRNA，
(ii)指导RNA，所述指导RNA包含充当所述碱基编辑器融合蛋白的结合支架的tracr序列和对应于PCSK9基因上的原间隔子的间隔子序列，
其中当施用于哺乳动物对象时，所述指导RNA指导所述碱基编辑器融合蛋白在所述PCSK9基因中体内实现核碱基改变，
其中当所述指导RNA和所述mRNA以至少0.5mg/kg的总量施用时，所述碱基改变在所述哺乳动物对象的全部肝脏细胞的至少35％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量；
所述第二组合物包含
(i)碱基编辑器融合蛋白，所述碱基编辑器融合蛋白包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶，或编码其的mRNA，
(ii)指导RNA，所述指导RNA包含充当所述碱基编辑器融合蛋白的结合支架的tracr序列和对应于ANGPTL3基因上的原间隔子的间隔子序列，
其中当施用于哺乳动物对象时，所述指导RNA引导所述碱基编辑器融合蛋白在所述ANGPTL3基因中体内实现核碱基改变，其中当所述指导RNA和所述mRNA以至少1mg/kg的总量施用时，所述碱基改变在所述哺乳动物对象的全部肝脏细胞的至少35％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
77.如条款76所述的方法，其包括顺序施用所述第一组合物和所述第二组合物。
78.如条款77所述的方法，其包括施用一个或多个剂量的所述第一组合物，接着施用一个或多个剂量的所述第二组合物。
79.如条款78所述的方法，其包括施用一个或多个剂量的所述第二组合物，接着施用一个或多个剂量的所述第一组合物。
80.如条款76所述的方法，其包括并行施用所述第一组合物和所述第二组合物。
81.如条款80所述的方法，其包括一个或多个剂量的所述第一组合物和所述第二组合物。
82.一种用于编辑基因靶标的组合物，其包含：
(i)碱基编辑器融合蛋白，所述碱基编辑器融合蛋白包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶，或编码其的mRNA，
(ii)指导RNA，所述指导RNA包含充当所述碱基编辑器融合蛋白的结合支架的tracr序列和对应于ANGPTL3基因上的原间隔子的间隔子序列，
其中所述指导RNA引导所述碱基编辑器融合蛋白在所述ANGPTL3基因中体外实现核碱基改变，
其中当所述指导RNA和所述mRNA以至少0.5mg/kg的总量施用时，所述碱基改变在所述哺乳动物对象的全部肝脏细胞的至少35％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
83.如条款82所述的组合物，其中当所述指导RNA和所述mRNA以至少1mg/kg的总量施用时，所述碱基改变在所述哺乳动物对象的全部肝脏细胞的至少40％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
84.如条款82所述的组合物，其中当所述指导RNA和所述mRNA以至少1.5mg/kg的总量施用时，所述碱基改变在所述哺乳动物对象的全部肝脏细胞的至少45％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
85.如条款82所述的组合物，其中当所述指导RNA和所述mRNA以至少2mg/kg的总量施用时，所述碱基改变在所述哺乳动物对象的全部肝脏细胞的至少50％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
86.如条款82所述的组合物，其中当所述指导RNA和所述mRNA以至少2.5mg/kg的总量施用时，所述碱基改变在所述哺乳动物对象的全部肝脏细胞的至少55％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
87.如条款82所述的组合物，其中当所述指导RNA和所述mRNA以至少3mg/kg的总量施用时，所述碱基改变在所述哺乳动物对象的全部肝脏细胞的至少60％中发生，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
88.一种用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其包含：
(a)mRNA，所述mRNA编码具有编辑窗口的腺嘌呤碱基编辑器蛋白，和
(b)指导RNA，所述指导RNA包含充当所述碱基编辑器蛋白的结合支架的tracr序列和用于将所述碱基编辑器蛋白指引至所述ANGPTL3基因上的原间隔子序列的间隔子序列，
其中所述间隔子序列与所述ANGPTL3基因的剪接位点或外显子区是至少部分互补的。
89.如条款83所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当所述碱基编辑器蛋白与所述指导RNA可操作地结合并且所述指导RNA与所述ANGPTL3基因上的原间隔子序列的互补链杂交时，所述编辑窗口涵盖所述ANGPTL3基因的剪接位点。
90.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当所述碱基编辑器蛋白与所述指导RNA可操作地结合并且所述指导RNA与所述ANGPTL3基因上的原间隔子序列的互补链杂交时，所述编辑窗口涵盖所述ANGPTL3基因的内含子的区域。
91.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当所述碱基编辑器蛋白与所述指导RNA可操作地结合并且所述指导RNA与所述ANGPTL3基因上的原间隔子序列的互补链杂交时，所述编辑窗口涵盖所述ANGPTL3基因的内含子1、内含子3或内含子4的区域。
92.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当所述碱基编辑器蛋白与所述指导RNA可操作地结合并且所述指导RNA与所述ANGPTL3基因上的原间隔子序列的互补链杂交时，所述编辑窗口涵盖所述ANGPTL3基因的内含子1的区域。
93.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中所述间隔子序列与选自被鉴定为GA067、GA100和GA574的指导RNA序列的间隔子序列具有80％-100％核苷酸序列同一性。
94.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中所述tracr序列与选自被鉴定为以下的指导RNA序列的tracr序列具有80％-100％核苷酸序列同一性：GA067、GA091、GA098、GA099、GA100、GA101、GA102、GA103、GA347、GA441、GA442、GA472、GA473、GA474、GA475、GA476、GA517和GA547。
95.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中所述mRNA与被鉴定为MA002、MA004、MA040、MA0041或MA045的mRNA序列具有80％-100％序列同一性。
96.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中所述mRNA具有下表中列出的GC核苷酸区域百分比中的一个或多个：
核苷酸区域 平均GC核苷酸含量
27-213 67％-73％
389-661 67％-71％
735-829 63％-74％
4207-4286 67％-70％
4537-4569 65％-73％
4683-4741 62％-67％
97.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中所述mRNA具有下表中列出的GC核苷酸区域百分比中的一个或多个：
Figure BDA0003991453200009401
Figure BDA0003991453200009411
98.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中所述mRNA和gRNA被封装在脂质纳米颗粒内。
99.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中所述mRNA和gRNA被封装在具有以下项的脂质纳米颗粒内：
LNP组成(mol％)：
40％-65％iLipid
2％-20％DSPC
1％-5％PEG
剩余的mol％余量是胆固醇；
LNP粒径：55-120nm Z平均流体动力学直径；以及
<0.2的多分散性指数，如通过动态光散射所确定。
100.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中所述mRNA和gRNA被封装在具有在50-70nm之间的Z平均流体动力学直径的LNP粒径的脂质纳米颗粒内。
101.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于40％。
102.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于50％。
103.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于30％。
104.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于40％。
105.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于50％。
106.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于60％。
107.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于70％。
108.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于40％。
109.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于50％。
110.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于60％。
111.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于70％。
112.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于80％。
113.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于40％。
114.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于50％。
115.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于60％。
116.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于70％。
117.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于80％。
118.如条款87-117所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中经由所述猴的肝脏活检或尸检，通过分析经给药的所述食蟹猴肝脏来在给药之后15天时确定所述编辑百分比。
119.如条款87-117所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中通过对经给药的所述食蟹猴进行定期肝脏活检测试确定所述编辑百分比得以在给药之后至少168天的跨度内持久地维持。
120.如条款87-117所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中通过对经给药的所述食蟹猴进行定期肝脏活检测试确定所述编辑百分比得以在给药之后至少300天的跨度内持久地维持。
121.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白与基线相比降低平均至少35％。
122.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白与基线相比降低平均至少40％。
123.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白与基线相比降低平均至少50％。
124.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述猴的血浆中的ANGPTL3蛋白与基线相比降低平均至少60％。
125如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白与基线相比降低平均至少70％。
126.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白与基线相比降低平均至少80％。
127.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白与基线相比降低平均至少35％。
128.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白与基线相比降低平均至少40％。
129.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白与基线相比降低平均至少50％。
130.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白与基线相比降低平均至少60％。
131.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白与基线相比降低平均至少70％。
132.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白与基线相比降低平均至少80％。
133.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白与基线相比降低平均至少35％。
134.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白与基线相比降低平均至少40％。
135.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白与基线相比降低平均至少50％。
136.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白与基线相比降低平均至少60％。
137.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白与基线相比降低平均至少70％。
138.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白与基线相比降低平均至少80％。
139.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白与基线相比降低平均至少35％。
140.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白与基线相比降低平均至少40％。
141.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白与基线相比降低平均至少50％。
142.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白与基线相比降低平均至少60％。
143.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白与基线相比降低平均至少70％。
144.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白与基线相比降低平均至少80％。
145.如条款121-144所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中经由对经给药的所述食蟹猴进行血液采样和分析在给药之后15天时确定血浆蛋白的所述降低。
146.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述猴的血浆中的甘油三酯水平与基线相比降低平均至少20％。
147.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平与基线相比降低平均至少25％。
148.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平与基线相比降低平均至少30％。
149.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平与基线相比降低平均至少35％。
150.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平与基线相比降低平均至少40％。
151.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平与基线相比降低平均至少45％。
152.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平与基线相比降低平均至少20％。
153.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平与基线相比降低平均至少25％。
154.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平与基线相比降低平均至少30％。
155.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平与基线相比降低平均至少35％。
156.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平与基线相比降低平均至少40％。
157.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平与基线相比降低平均至少45％。
158.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平与基线相比降低平均至少50％。
159.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平与基线相比降低平均至少55％。
160.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平与基线相比降低平均至少60％。
161.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平与基线相比降低平均至少20％。
162.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平与基线相比降低平均至少25％。
163.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平与基线相比降低平均至少30％。
164.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平与基线相比降低平均至少35％。
165.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平与基线相比降低平均至少40％。
166.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平与基线相比降低平均至少45％。
167.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平与基线相比降低平均至少50％。
168.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平与基线相比降低平均至少55％。
169.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平与基线相比降低平均至少60％。
170.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平与基线相比降低平均至少65％。
171.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平与基线相比降低平均至少20％。
172.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平与基线相比降低平均至少25％。
173.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平与基线相比降低平均至少30％。
174.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平与基线相比降低平均至少35％。
175.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平与基线相比降低平均至少40％。
176.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平与基线相比降低平均至少45％。
177.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平与基线相比降低平均至少50％。
178.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平与基线相比降低平均至少55％。
179.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平与基线相比降低平均至少60％。
180.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平与基线相比降低平均至少65％。
181.如条款148-182所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中经由对经给药的所述食蟹猴进行血液采样和分析在给药之后15天时确定甘油三酯水平的所述降低。
182.如条款148-182所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中通过对经给药的所述食蟹猴进行定期血液采样和分析确定甘油三酯水平的所述降低得以在至少168天的跨度内持久地维持。
183.如条款148-182所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中通过对经给药的所述食蟹猴进行定期血液采样和分析确定甘油三酯水平的所述降低得以在至少300天的跨度内持久地维持。
184.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的脂蛋白(a)与基线相比降低平均至少10％。
185.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的脂蛋白(a)水平与基线相比降低平均至少15％。
186.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的脂蛋白(a)水平与基线相比降低平均至少20％。
187.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的脂蛋白(a)水平与基线相比降低平均至少25％。
188.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的脂蛋白(a)水平与基线相比降低平均至少30％。
189.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中当以大约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量/kg食蟹猴重量的剂量经由静脉内输注施用于一组食蟹猴时，所述组合物能够将经给药的所述食蟹猴的血浆中的脂蛋白(a)水平与基线相比降低平均大于35％。
190.如条款186-191所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中经由对经给药的所述食蟹猴进行血液采样和分析在给药之后15天时确定脂蛋白(a)的所述降低。
191.如条款186-191所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中通过对经给药的所述食蟹猴进行定期血液采样和分析确定脂蛋白(a)的所述降低得以在至少224天的跨度内持久地维持。
192.如条款186-191所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中通过对经给药的所述食蟹猴进行定期血液采样和分析确定脂蛋白(a)的所述降低得以在至少300天的跨度内持久地维持。
193.如条款101-194所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中在对所述食蟹猴的给药导致AST、ALT或细胞因子升高的情况下，由所述组合物的给药导致的升高是短暂的并且在给药之后3-15天内消退回到大约基线水平。
194.如条款101-103、121-126、148-153所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中ANGPTL3的编辑百分比在肝脏、脾脏和肾上腺组织之外是可忽略不计的，如图27所示。
195.如条款101-107、121-132、148-162所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中在ANGPTL3编辑百分比的编辑百分比方面，重复给药结果是相加的。
196.如条款195所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中所述重复给药不引起细胞因子激活或免疫应答。
197.如条款88所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中所述间隔子序列与所述ANGPTL3基因上的靶向的原间隔子的核苷酸序列具有至少80％核苷酸相关性，其中如果所述间隔子序列上的RNA核苷酸与所述原间隔子的DNA核苷酸在相同顺序上具有相同的核苷酸，则其与所述DNA核苷酸相关，并且其中出于确定相关性的目的，尿嘧啶碱基和胸腺嘧啶碱基被认为是相同的核苷酸。
198.如条款197所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中所述间隔子序列与所述ANGPTL3基因上的靶向的原间隔子的核苷酸序列具有至少85％核苷酸相关性。
199.如条款197所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中所述间隔子序列与所述ANGPTL3基因上的靶向的原间隔子的核苷酸序列具有至少90％核苷酸相关性。
200.如条款197所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中所述间隔子序列与所述ANGPTL3基因上的靶向的原间隔子的核苷酸序列具有至少95％核苷酸相关性。
201.如条款197所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中所述间隔子序列与所述ANGPTL3基因上的靶向的原间隔子的核苷酸序列具有至少99％核苷酸相关性。
202.如条款197所述的用于编辑ANGPTL3基因的组合物，其中所述间隔子序列与所述ANGPTL3基因上的靶向的原间隔子的核苷酸序列具有至少100％核苷酸相关性。
203.一种用于治疗或预防有需要的对象的动脉粥样硬化性心血管疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的
(a)mRNA，所述mRNA编码具有编辑窗口的腺嘌呤碱基编辑器蛋白，
(b)第一指导RNA，所述第一指导RNA包含充当所述碱基编辑器蛋白的结合支架的tracr序列和用于将所述碱基编辑器蛋白指引至PCSK9基因上的原间隔子序列的间隔子序列，其中所述间隔子序列与所述PCSK9基因的剪接位点或外显子区是至少部分互补的；和
(c)第二指导RNA，所述第二指导RNA包含充当所述碱基编辑器蛋白的结合支架的tracr序列和用于将所述碱基编辑器蛋白指引至ANGPTL3基因上的原间隔子序列的间隔子序列，其中所述间隔子序列与所述ANGPTL3基因的剪接位点或外显子区域是至少部分互补的。
204.如条款203所述的方法，其还包括包封(a)的第一LNP。
205.如条款204所述的方法，其中所述第一LNP包封(b)和(c)。
206.如条款204所述的方法，其中重复施用所述第一LNP。
207.如条款204所述的方法，其中以一至六十天的间隔重复施用所述第一LNP。
208.如条款204所述的方法，其中以七天的间隔重复施用所述第一LNP。
209.如条款204所述的方法，其中所述第一LNP还包封(b)。
210.如条款209所述的方法，其还包括包封(a)和(c)的第二LNP。
211.如条款210所述的方法，其中顺序施用所述第一LNP和所述第二LNP。
212.如条款211所述的方法，其中以一天至12个月的间隔顺序施用所述第一LNP和所述第二LNP。
213.如条款212所述的方法，其中所述间隔为一天。
214.如条款212所述的方法，其中所述间隔为五天。
215.如条款212所述的方法，其中所述间隔为十天。
216.如条款212所述的方法，其中所述间隔为十五天。
217.如条款212所述的方法，其中所述间隔为二十天。
218.如条款212所述的方法，其中所述间隔为二十五天。
219.如条款212所述的方法，其中所述间隔为一个月。
220.如条款212所述的方法，其中所述间隔为两个月。
221.如条款212所述的方法，其中所述间隔为三个月。
222.如条款212所述的方法，其中所述间隔为五个月。
223.如条款212所述的方法，其中所述间隔为八个月。
224.如条款212所述的方法，其中所述间隔为十个月。
225.如条款212所述的方法，其中所述间隔为十二个月。
通过审查本公开内容还将认识到，设想在一个或一组相关条款中呈现的一个或多个方面或特征也可以包括在其他条款中或与其他条款中的一个或多个方面或特征组合。

Claims (225)

1.一种用于编辑基因靶标的组合物，包含：
(i)碱基编辑器融合蛋白，所述碱基编辑器融合蛋白包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶，或编码其的mRNA，
(ii)指导RNA，所述指导RNA包含tracr序列和间隔子序列，所述tracr序列用作所述碱基编辑器融合蛋白的结合支架，所述间隔子序列对应于ANGPTL3基因上的原间隔子，
其中所述指导RNA引导所述碱基编辑器融合蛋白在施用给哺乳动物对象时在体内实现所述ANGPTL3基因中的核碱基改变，
其中当所述指导RNA和所述mRNA以至少0.5mg/kg的总量施用时，所述碱基改变发生在所述哺乳动物对象的全部肝细胞的至少35％中，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述哺乳动物对象是食蟹猴，
其中当所述指导RNA和所述mRNA以约1mg/kg的总量施用时，所述碱基改变发生在所述食蟹猴的全部肝细胞的至少35％中，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述哺乳动物对象是食蟹猴，
其中当所述指导RNA和所述mRNA以约3mg/kg的总量施用时，所述碱基改变发生在所述食蟹猴的全部肝细胞的至少50％中，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
4.如权利要求2所述的组合物，其中与所述施用前相比，所述核碱基改变导致所述食蟹猴中血液甘油三酯水平降低至少20％。
5.如权利要求3所述的组合物，其中与所述施用前相比，所述核碱基改变导致所述食蟹猴中血液甘油三酯水平降低至少50％。
6.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述原间隔子位于剪接位点中。
7.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述原间隔子互补序列位于所述ANGPTL3基因的反义链中。
8.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述原间隔子互补序列位于所述ANGPTL3基因的有义链中。
9.如权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中所述碱基改变发生在所述ANGPTL3基因上的所述原间隔子之外(脱靶位点)，
其中表14中列出的脱靶位点的编辑百分比分别低于或等于表14中列出的编辑百分比。
10.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述脱氨酶是腺嘌呤脱氨酶并且其中所述核碱基改变是A·T到G·C的改变。
11.如权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中所述可编程DNA结合结构域包含核酸酶活性丧失的Cas9或Cas9切口酶。
12.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中所述核碱基改变位于所述ANGPTL3基因的剪接位点处。
13.如权利要求12所述的组合物，其中所述核碱基改变位于所述ANGPTL3基因的剪接供体位点处。
14.如权利要求13所述的组合物，其中所述剪接供体位点位于如SEQ ID NO:7中所引用的ANGPTL3内含子6的5’末端。
15.如权利要求12所述的组合物，其中所述核碱基改变位于所述ANGPTL3基因的剪接受体位点处。
16.如权利要求1-15中任一项所述的组合物，其中所述核碱基改变导致由所述ANGPTL3基因编码的转录物中的移码、提前终止密码子、插入或缺失。
17.如权利要求1-16中任一项所述的组合物，其中所述核碱基改变导致由所述ANGPTL3基因编码的异常转录物。
18.如权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中所述指导RNA经化学修饰。
19.如权利要求16所述的组合物，其中所述指导RNA的所述tracr序列按照图7中描绘的方案进行化学修饰。
20.如权利要求1-19中任一项所述的组合物，其中所述间隔子序列包含表1中列出的ANGPTL3 ABE指导RNA间隔子序列。
21.如权利要求20所述的组合物，其中所述指导RNA包含如表1中所列出的GA067、GA091、GA098、GA099、GA100、GA101、GA102、GA103、GA347、GA441、GA442、GA472、GA473、GA474、GA475、GA476、GA517或GA547的ANGPTL3 ABE指导RNA序列。
22.如权利要求1-19中任一项所述的组合物，其中所述原间隔子序列包含表1中列出的ANGPTL3 ABE原间隔子序列。
23.如权利要求22所述的组合物，其中所述原间隔子包含序列5’-AAGATACCTGAATAACTCTC-3’(SEQ ID No:14)、5’-AAGATACCTGAATAACCCTC-3’(SEQ ID No:15)、5’-GATACCTGAATAACTCTC-3’(SEQ ID No:1606)、5’-AGATACCTGAATAACCCTC-3’(SEQ IDNo:248)或5’-GATACCTGAATAACCCTC-3’(SEQ ID No:249)。
24.如权利要求1-23中任一项所述的组合物，其中所述碱基编辑器融合蛋白包含SEQID No:2137的氨基酸序列。
25.如权利要求1-24中任一项所述的组合物，其中所述mRNA序列的GC％含量大于50％。
26.如权利要求25所述的组合物，其中所述mRNA序列的GC％含量大于56％。
27.如权利要求26所述的组合物，其中所述mRNA序列的GC％含量大于或等于63％。
28.如权利要求25所述的组合物，其中所述mRNA包含腺嘌呤tTNA脱氨酶(TadA)区域、Cas9区域和核定位序列(NLS)区域。
29.如权利要求28所述的组合物，其中所述mRNA进一步包含将所述TadA区域和所述Cas9区域连接的第一接头区域，以及将所述Cas9区域和所述NLS区域连接的第二接头区域。
30.如权利要求28或29所述的组合物，其中所述TadA区域的GC％含量大于60％。
31.如权利要求28或29所述的组合物，其中所述TadA区域的GC％含量大于或等于70％。
32.如权利要求28或29所述的组合物，其中所述Cas9区域的GC％含量大于56％。
33.如权利要求28或29所述的组合物，其中所述Cas9区域的GC％含量大于或等于62％。
34.如权利要求28或29所述的组合物，其中所述NLS区域的GC％含量大于54％。
35.如权利要求28或29所述的组合物，其中所述NLS区域的GC％含量大于或等于63％。
36.如权利要求29所述的组合物，其中所述第一接头区域的GC％含量大于65％。
37.如权利要求29所述的组合物，其中所述第一接头区域的GC％含量大于或等于79％。
38.如权利要求29所述的组合物，其中所述第二接头区域的GC％含量大于67％。
39.如权利要求29所述的组合物，其中所述第二接头区域的GC％含量大于或等于83％。
40.如权利要求29所述的组合物，其中所述TadA区域的GC％含量大于60％，所述Cas9区域的GC％含量大于56％，所述NLS区域的GC％含量大于54％，所述第一接头区域的GC％含量大于65％，并且所述第二接头区域的GC％含量大于67％。
41.如权利要求25所述的组合物，其中所述mRNA包含选自表23的mRNA序列。
42.如权利要求41所述的组合物，其中所述mRNA包含SEQ IDNo:2136的mRNA序列。
43.如权利要求25-42中任一项所述的组合物，其中所述mRNA包含多聚A尾。
44.如权利要求1-43中任一项所述的组合物，进一步包含包封(i)的脂质纳米颗粒(LNP)。
45.如权利要求44所述的组合物，其中所述LNP进一步包封(ii)。
46.如权利要求44所述的组合物，进一步包含包封(ii)的第二LNP。
47.如权利要求1-44中任一项所述的组合物，其中所述指导RNA和编码所述碱基编辑器融合蛋白的所述mRNA的重量比率为约1:10至约10:1。
48.如权利要求47所述的组合物，其中所述指导RNA与编码所述碱基编辑器融合蛋白的所述mRNA的重量比率为约1:1、1.5:1、2:1、3:1、4:1、1:1.5、1:2、1:3或1:4。
49.如权利要求48所述的组合物，其中所述指导RNA和编码所述碱基编辑器融合蛋白的所述mRNA的重量比率为约1:1。
50.一种药物组合物，包含如前述权利要求中任一项所述的组合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
51.一种用于治疗或预防有需要的对象的病症的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的如权利要求1所述的组合物。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述施用是通过静脉内输注。
53.如权利要求51或52所述的方法，包括顺序施用包封(i)的LNP和包封(ii)的LNP。
54.如权利要求51或52所述的方法，包括并行施用所述包封(i)的LNP和所述包封(ii)的LNP。
55.如权利要求53所述的方法，包括施用单剂量的所述包封(ii)的LNP，然后在1天的间隔中施用交错剂量的所述包封(i)的LNP。
56.如权利要求53所述的方法，包括施用单剂量的所述包封(ii)的LNP，然后在2天的间隔中施用交错剂量的所述包封(i)的LNP。
57.如权利要求53所述的方法，包括施用单剂量的所述包封(ii)的LNP，然后在3天的间隔中施用交错剂量的所述包封(i)的LNP。
58.如权利要求53所述的方法，包括施用单剂量的所述包封(ii)的LNP，然后在4天的间隔中施用交错剂量的所述包封(i)的LNP。
59.如权利要求53所述的方法，包括施用单剂量的所述包封(ii)的LNP，然后在5天的间隔中施用交错剂量的所述包封(i)的LNP。
60.如权利要求53所述的方法，包括施用单剂量的所述包封(ii)的LNP，然后在6天的间隔中施用交错剂量的所述包封(i)的LNP。
61.如权利要求53所述的方法，包括施用单剂量的所述包封(ii)的LNP，然后在7天的间隔中施用交错剂量的所述包封(i)的LNP。
62.如权利要求51或52所述的方法，包括施用单剂量的所述包封(i)和(ii)的LNP。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述LNP的所述单剂量为约0.3至约3mg/kg。
64.如权利要求62或63所述的方法，包括向所述对象施用一个或多个治疗的疗程，其中所述一个或多个治疗中的每一个包括一个或多个所述单剂量的所述LNP。
65.如权利要求64所述的方法，包括施用两个至十个治疗的疗程。
66.如权利要求64所述的方法，包括施用两个至五个治疗的疗程。
67.如权利要求64所述的方法，包括施用两个治疗的疗程。
68.如权利要求64所述的方法，包括施用三个治疗的疗程。
69.如权利要求64所述的方法，包括施用四个治疗的疗程。
70.如权利要求62所述的方法，包括施用五个治疗的疗程。
71.如权利要求51-70中任一项所述的方法，其中所述病症是动脉粥样硬化性心血管疾病。
72.如权利要求51-70中任一项所述的方法，其中所述病症是动脉粥样硬化性血管疾病。
73.如权利要求51-72中任一项所述的方法，其中所述对象是人。
74.一种用于编辑基因靶标的组合物，包含：
(i)碱基编辑器融合蛋白，所述碱基编辑器融合蛋白包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶，或编码其的mRNA，
(ii)指导RNA，所述指导RNA包含tracr序列和间隔子序列，所述tracr序列用作所述碱基编辑器融合蛋白的结合支架，所述间隔子序列对应于ANGPTL3基因上的原间隔子，
其中所述指导RNA引导所述碱基编辑器融合蛋白在施用给哺乳动物对象时在体内实现所述ANGPTL3基因中的核碱基改变，并且
其中所述指导RNA包含如表1中所列出的ANGPTL3 ABE指导RNA序列。
75.一种用于编辑基因靶标的组合物，包含：
(i)碱基编辑器融合蛋白，所述碱基编辑器融合蛋白包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶，或编码其的mRNA，
(ii)指导RNA，所述指导RNA包含tracr序列和间隔子序列，所述tracr序列用作所述碱基编辑器融合蛋白的结合支架，所述间隔子序列对应于ANGPTL3基因上的原间隔子，
其中所述指导RNA引导所述碱基编辑器融合蛋白在施用给哺乳动物对象时在体内实现所述ANGPTL3基因中的核碱基改变，并且
其中所述mRNA包含选自表23的序列。
76.一种在有需要的对象中治疗或预防动脉粥样硬化性心血管疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的第一组合物和第二组合物，所述第一组合物包含
(i)碱基编辑器融合蛋白，所述碱基编辑器融合蛋白包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶，或编码其的mRNA，
(ii)指导RNA，所述指导RNA包含tracr序列和间隔子序列，所述tracr序列用作所述碱基编辑器融合蛋白的结合支架，所述间隔子序列对应于PCSK9基因上的原间隔子，
其中所述指导RNA引导所述碱基编辑器融合蛋白在施用给哺乳动物对象时在体内实现所述PCSK9基因中的核碱基改变，
其中当所述指导RNA和所述mRNA以至少0.5mg/kg的总量施用时，所述碱基改变发生在所述哺乳动物对象的全部肝细胞的至少35％中，如通过下一代测序或桑格测序所测量；
所述第二组合物包含
(i)碱基编辑器融合蛋白，所述碱基编辑器融合蛋白包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶，或编码其的mRNA，
(ii)指导RNA，所述指导RNA包含tracr序列和间隔子序列，所述tracr序列用作所述碱基编辑器融合蛋白的结合支架，所述间隔子序列对应于ANGPTL3基因上的原间隔子，
其中所述指导RNA引导所述碱基编辑器融合蛋白在施用给哺乳动物对象时在体内实现所述ANGPTL3基因中的核碱基改变，
其中当所述指导RNA和所述mRNA以至少1mg/kg的总量施用时，所述碱基改变发生在所述哺乳动物对象的全部肝细胞的至少35％中，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
77.如权利要求76所述的方法，包括顺序施用所述第一组合物和所述第二组合物。
78.如权利要求77所述的方法，包括施用一个或多个剂量的所述第一组合物，随后施用一个或多个剂量的所述第二组合物。
79.如权利要求78所述的方法，包括施用一个或多个剂量的所述第二组合物，随后施用一个或多个剂量的所述第一组合物。
80.如权利要求76所述的方法，包括并行施用所述第一组合物和所述第二组合物。
81.如权利要求80所述的方法，包括一个或多个剂量的所述第一组合物和所述第二组合物。
82.一种用于编辑基因靶标的组合物，包含：
(i)碱基编辑器融合蛋白，所述碱基编辑器融合蛋白包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶，或编码其的mRNA，
(ii)指导RNA，所述指导RNA包含tracr序列和间隔子序列，所述tracr序列用作所述碱基编辑器融合蛋白的结合支架，所述间隔子序列对应于ANGPTL3基因上的原间隔子，
其中所述指导RNA引导所述碱基编辑器融合蛋白在体外实现所述ANGPTL3基因中的核碱基改变，
其中当所述指导RNA和所述mRNA以至少0.5mg/kg的总量施用时，所述碱基改变发生在所述哺乳动物对象的全部肝细胞的至少35％中，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
83.如权利要求82所述的组合物，其中当所述指导RNA和所述mRNA以至少1mg/kg的总量施用时，所述碱基改变发生在所述哺乳动物对象的全部肝细胞的至少40％中，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
84.如权利要求82所述的组合物，其中当所述指导RNA和所述mRNA以至少1.5mg/kg的总量施用时，所述碱基改变发生在所述哺乳动物对象的全部肝细胞的至少45％中，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
85.如权利要求82所述的组合物，其中当所述指导RNA和所述mRNA以至少2mg/kg的总量施用时，所述碱基改变发生在所述哺乳动物对象的全部肝细胞的至少50％中，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
86.如权利要求82所述的组合物，其中当所述指导RNA和所述mRNA以至少2.5mg/kg的总量施用时，所述碱基改变发生在所述哺乳动物对象的全部肝细胞的至少55％中，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
87.如权利要求82所述的组合物，其中当所述指导RNA和所述mRNA以至少3mg/kg的总量施用时，所述碱基改变发生在所述哺乳动物对象的全部肝细胞的至少60％中，如通过下一代测序或桑格测序所测量。
88.一种用于编辑ANGPTL3基因的组合物，包含：
(a)mRNA，所述mRNA编码具有编辑窗口的腺嘌呤碱基编辑器蛋白，和
(b)指导RNA，所述指导RNA包含tracr序列和间隔子序列，所述tracr序列用作所述碱基编辑器蛋白的结合支架，所述间隔子序列用于将所述碱基编辑器蛋白指引至所述ANGPTL3基因上的原间隔子序列，
其中所述间隔子序列至少部分地与所述ANGPTL3基因的剪接位点或外显子区域互补。
89.如权利要求83所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中当所述碱基编辑器蛋白与所述指导RNA可操作地结合并且所述指导RNA与所述ANGPTL3基因上的所述原间隔子序列的互补链杂交时，所述编辑窗口涵盖所述ANGPTL3基因的所述剪接位点。
90.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中当所述碱基编辑器蛋白与所述指导RNA可操作地结合并且所述指导RNA与所述ANGPTL3基因上的所述原间隔子序列的互补链杂交时，所述编辑窗口涵盖所述ANGPTL3基因的内含子的区域。
91.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中当所述碱基编辑器蛋白与所述指导RNA可操作地结合并且所述指导RNA与所述ANGPTL3基因上的所述原间隔子序列的互补链杂交时，所述编辑窗口涵盖所述ANGPTL3基因的内含子1、内含子3或内含子4的区域。
92.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中当所述碱基编辑器蛋白与所述指导RNA可操作地结合并且所述指导RNA与所述ANGPTL3基因上的所述原间隔子序列的互补链杂交时，所述编辑窗口涵盖所述ANGPTL3基因的内含子1的区域。
93.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述间隔子序列与选自经鉴定为GA067、GA100和GA574的指导RNA序列的间隔子序列具有80％-100％核苷酸序列同一性。
94.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述tracr序列与选自经鉴定为GA067、GA091、GA098、GA099、GA100、GA101、GA102、GA103、GA347、GA441、GA442、GA472、GA473、GA474、GA475、GA476、GA517和GA547的指导RNA序列的tracr序列具有80％-100％核苷酸序列同一性。
95.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述mRNA与经鉴定为MA002、MA004、MA040、MA0041或MA045的mRNA序列具有80％-100％序列同一性。
96.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述mRNA具有下表中列出的GC核苷酸区域百分比中的一个或多个：
核苷酸区域 平均GC核苷酸含量 27-213 67-73％ 389-661 67-71％ 735-829 63-74％ 4207-4286 67-70％ 4537-4569 65-73％ 4683-4741 62-67％
97.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述mRNA具有下表中列出的GC核苷酸区域百分比中的一个或多个：
核苷酸区域 平均GC核苷酸含量 27-213 至少73％ 389-661 至少71％ 735-829 至少74％ 4207-4286 至少70％ 4537-4569 至少73％ 4683-4741 至少67％
98.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述mRNA和gRNA被封装在脂质纳米颗粒中。
99.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述mRNA和gRNA被封装在脂质纳米颗粒中，所述脂质纳米颗粒具有以下项：
LNP组合物(mol％)：
40-65％iLipid
2-20％DSPC
1-5％PEG
剩余的mol％余量是胆固醇；
LNP粒径：55-120nm Z平均流体动力学直径；和
通过动态光散射确定的多分散性指数<0.2。
100.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述mRNA和gRNA被封装在LNP粒径为50-70nm Z平均流体动力学直径的脂质纳米颗粒内。
101.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于40％。
102.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于50％。
103.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于30％。
104.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于40％。
105.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于50％。
106.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于60％。
107.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于70％。
108.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于40％。
109.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于50％。
110.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于60％。
111.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于70％。
112.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于80％。
113.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于40％。
114.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于50％。
115.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于60％。
116.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于70％。
117.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够在所述食蟹猴的肝脏中在所述ANGPTL3靶剪接位点处诱导腺嘌呤碱基编辑，平均编辑百分比大于80％。
118.如权利要求87-117所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中在给药后15天时经由所述猴的肝脏活检或尸检通过分析经给药的食蟹猴肝脏来确定所述编辑百分比。
119.如权利要求87-117所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中通过对经给药的所述食蟹猴进行定期肝脏活检测试确定了所述编辑百分比得以在给药后至少168天的跨度内持久地保持。
120.如权利要求87-117所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中通过对经给药的所述食蟹猴进行定期肝脏活检测试确定了所述编辑百分比得以在给药后至少300天的跨度内持久地保持。
121.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少35％。
122.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少40％。
123.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg猴重量约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少50％。
124.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少60％。
125.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少70％。
126.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少80％。
127.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少35％。
128.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少40％。
129.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少50％。
130.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少60％。
131.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少70％。
132.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少80％。
133.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少35％。
134.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少40％。
135.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少50％。
136.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少60％。
137.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少70％。
138.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少80％。
139.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少35％。
140.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少40％。
141.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少50％。
142.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少60％。
143.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少70％。
144.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的ANGPTL3蛋白平均减少至少80％。
145.如权利要求121-144所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中在给药后15天时通过对经给药的所述食蟹猴的血液采样和分析来确定血浆蛋白的所述减少。
146.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg猴重量约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少20％。
147.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少25％。
148.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少30％。
149.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少35％。
150.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少40％。
151.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约0.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少45％。
152.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少20％。
153.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少25％。
154.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少30％。
155.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少35％。
156.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少40％。
157.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少45％。
158.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少50％。
159.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少55％。
160.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少60％。
161.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少20％。
162.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少25％。
163.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少30％。
164.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少35％。
165.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少40％。
166.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少45％。
167.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少50％。
168.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少55％。
169.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少60％。
170.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约1.5mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少65％。
171.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少20％。
172.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少25％。
173.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少30％。
174.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少35％。
175.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少40％。
176.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少45％。
177.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少50％。
178.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少55％。
179.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少60％。
180.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的甘油三酯水平平均降低至少65％。
181.如权利要求148-180所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中在给药后15天时通过对经给药的所述食蟹猴的血液采样和分析来确定甘油三酯水平的所述降低。
182.如权利要求148-180所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中通过对经给药的所述食蟹猴进行定期血液采样和分析确定甘油三酯水平的所述降低得以在至少168天的跨度内持久地保持。
183.如权利要求148-180所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中通过对经给药的所述食蟹猴进行定期血液采样和分析确定甘油三酯水平的所述降低得以在至少300天的跨度内持久地保持。
184.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的脂蛋白(a)平均减少至少10％。
185.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的脂蛋白(a)水平平均降低至少15％。
186.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的脂蛋白(a)水平平均降低至少20％。
187.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的脂蛋白(a)水平平均降低至少25％。
188.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的脂蛋白(a)水平平均降低至少30％。
189.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述组合物在以每kg食蟹猴重量约3mg的所述指导RNA和所述mRNA组合总重量的剂量通过静脉内输注施用于一组食蟹猴时能够与基线相比使经给药的所述食蟹猴的血浆中的脂蛋白(a)水平平均降低约35％。
190.如权利要求184-189所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中在给药后15天时通过对经给药的所述食蟹猴的血液采样和分析来确定脂蛋白(a)的所述减少。
191.如权利要求184-189所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中通过对经给药的所述食蟹猴进行定期血液采样和分析确定脂蛋白(a)的所述减少得以在至少224天的跨度内持久地保持。
192.如权利要求184-189所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中通过对经给药的所述食蟹猴进行定期血液采样和分析确定脂蛋白(a)的所述减少得以在至少300天的跨度内持久地保持。
193.如权利要求101-192所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中就对所述食蟹猴的给药导致AST、ALT或细胞因子升高而言，由所述组合物的给药引起的所述升高是短暂的并且在给药后3-15天内消退回至大约基线水平。
194.如权利要求101-103、121-126、148-153所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中ANGPTL3的编辑百分比在肝、脾和肾上腺组织之外是可忽略的，如图27所示。
195.如权利要求101-107、121-132、148-162所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中在ANGPTL3编辑百分比的编辑百分比方面，重复给药结果是相加的。
196.如权利要求195所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述重复给药不引起细胞因子激活，也不引起免疫应答。
197.如权利要求88所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述间隔子序列与所述ANGPTL3基因上的靶向的原间隔子的核苷酸序列具有至少80％的核苷酸相关性，其中如果所述间隔子序列上的RNA核苷酸与所述原间隔子的DNA核苷酸具有相同顺序的相同核苷酸，则所述RNA核苷酸与所述DNA核苷酸相关，并且其中出于确定相关性的目的将尿嘧啶碱基和胸腺嘧啶碱基认为是相同的核苷酸。
198.如权利要求197所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述间隔子序列与所述ANGPTL3基因上的靶向的原间隔子的核苷酸序列具有至少85％的核苷酸相关性。
199.如权利要求197所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述间隔子序列与所述ANGPTL3基因上的靶向的原间隔子的核苷酸序列具有至少90％的核苷酸相关性。
200.如权利要求197所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述间隔子序列与所述ANGPTL3基因上的靶向的原间隔子的核苷酸序列具有至少95％的核苷酸相关性。
201.如权利要求197所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述间隔子序列与所述ANGPTL3基因上的靶向的原间隔子的核苷酸序列具有至少99％的核苷酸相关性。
202.如权利要求197所述的用于编辑所述ANGPTL3基因的组合物，其中所述间隔子序列与所述ANGPTL3基因上的靶向的原间隔子的核苷酸序列具有至少100％的核苷酸相关性。
203.一种在有需要的对象中治疗或预防动脉粥样硬化性心血管疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的
(a)mRNA，所述mRNA编码具有编辑窗口的腺嘌呤碱基编辑器蛋白，
(b)第一指导RNA，所述第一指导RNA包含tracr序列和间隔子序列，所述tracr序列用作所述碱基编辑器蛋白的结合支架，所述间隔子序列用于将所述碱基编辑器蛋白指引至PCSK9基因上的原间隔子序列，其中所述间隔子序列至少部分地与所述PCSK9基因的剪接位点或外显子区域互补；和
(c)第二指导RNA，所述第二指导RNA包含tracr序列和间隔子序列，所述tracr序列用作所述碱基编辑器蛋白的结合支架，所述间隔子序列用于将所述碱基编辑器蛋白指引至ANGPTL3基因上的原间隔子序列，其中所述间隔子序列至少部分地与所述ANGPTL3基因的剪接位点或外显子区域互补。
204.如权利要求203所述的方法，进一步包括包封(a)的第一LNP。
205.如权利要求204所述的方法，其中所述第一LNP包封(b)和(c)。
206.如权利要求204所述的方法，其中重复施用所述第一LNP。
207.如权利要求204所述的方法，其中以一至六十天的间隔重复施用所述第一LNP。
208.如权利要求204所述的方法，其中以七天的间隔重复施用所述第一LNP。
209.如权利要求204所述的方法，其中所述第一LNP进一步包封(b)。
210.如权利要求209所述的方法，进一步包括包封(a)和(c)的第二LNP。
211.如权利要求210所述的方法，其中顺序施用所述第一LNP和所述第二LNP。
212.如权利要求211所述的方法，其中以一天至12个月的间隔顺序施用所述第一LNP和所述第二LNP。
213.如权利要求212所述的方法，其中所述间隔是一天。
214.如权利要求212所述的方法，其中所述间隔是五天。
215.如权利要求212所述的方法，其中所述间隔是十天。
216.如权利要求212所述的方法，其中所述间隔是十五天。
217.如权利要求212所述的方法，其中所述间隔是二十天。
218.如权利要求212所述的方法，其中所述间隔是二十五天。
219.如权利要求212所述的方法，其中所述间隔是一个月。
220.如权利要求212所述的方法，其中所述间隔是两个月。
221.如权利要求212所述的方法，其中所述间隔是三个月。
222.如权利要求212所述的方法，其中所述间隔是五个月。
223.如权利要求212所述的方法，其中所述间隔是八个月。
224.如权利要求212所述的方法，其中所述间隔是十个月。
225.如权利要求212所述的方法，其中所述间隔是十二个月。
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