CN117916368A - 甲状腺素转运蛋白基因的碱基编辑 - Google Patents

Abstract

本文提供了与碱基编辑器系统相关的用于基因修饰的组合物，以及使用所述组合物来治疗或预防与由错误折叠的甲状腺素转运蛋白(TTR)蛋白聚集形成的淀粉样原纤维在各种组织中的细胞外沉积相关的疾患的方法。此类疾患包括但不限于：由遗传性甲状腺素转运蛋白淀粉样变性引起的多发性神经病(hATTR‑PN)和由甲状腺素转运蛋白淀粉样变性引起的遗传性心肌病(hATTR‑CM)，这两者均与TTR基因的常染色体显性突变相关；以及与野生型TTR蛋白(ATTRwt)相关的年龄相关心肌病，其也被称为老年性心脏淀粉样变性。

Description

甲状腺素转运蛋白基因的碱基编辑

相关申请

本申请要求于2021年5月21日提交的美国临时专利申请号63/191,458和于2022年3月21日的美国临时专利申请号63/322,182的权益。

序列表

本申请含有序列表，该序列表已以ASCII格式以电子方式提交，并且全文以引用方式并入。所述ASCII副本创建于2022年5月20日，名称为0650_000001WO01_SL.txt，并且大小为946,110字节。

背景技术

甲状腺素转运蛋白(TTR)是一种55kDa的甲状腺素(T4)和视黄醇结合蛋白二者的转运蛋白，其以可溶形式在健康人的血清和脑脊液(CSF)中循环。在正常情况下，TTR蛋白以同源四聚体形式循环。遗传性甲状腺素转运蛋白淀粉样变性(hATTR)是一种由编码TTR的基因突变引起的疾病。常染色体显性突变使TTR四聚体不稳定并且增强解离成单体，导致错误折叠、聚集以及随后TTR淀粉样原纤维在不同部位中的细胞外沉积。这种淀粉样蛋白的多系统细胞外沉积导致不同器官和组织的功能障碍。特别是，由甲状腺素转运蛋白淀粉样变性引起的多发性神经病(ATTR-PN)和心肌病(ATTR-CM)是与显著发病率和死亡率相关的严重病症。

由于TTR主要由肝产生，因此用于治疗hATTR淀粉样变性的早期治疗方法是肝移植。其他疗法包括施用充当TTR四聚体动力学稳定剂的经口药物(诸如他法米地软(tafamidis)和二氟尼柳(diflunisal))，以及使用基因沉默药物(诸如小干扰RNA(siRNA)(帕替西兰(patisiran))和反义寡核苷酸(伊诺特生(inotersen)))压制TTR蛋白合成。

本发明在此认识到，用于治疗甲状腺素转运蛋白淀粉样变性(包括多发性神经病和心肌病二者)的基因编辑方法有潜力提供一步到位治疗，结果优于现有治疗。

发明内容

本文提供了用于基因修饰或编辑的组合物，以及使用所述组合物来治疗或预防与由错误折叠的甲状腺素转运蛋白(TTR)蛋白聚集形成的淀粉样原纤维在各种组织中的细胞外沉积相关的疾患的方法。此类疾患包括但不限于由遗传性甲状腺素转运蛋白淀粉样变性引起的多发性神经病(hATTR-PN)和由甲状腺素转运蛋白淀粉样变性引起的遗传性心肌病(hATTR-CM)(二者均与TTR基因的常染色体显性突变相关)以及与野生型TTR蛋白(ATTRwt)相关的年龄相关心肌病(也被称为老年性心脏淀粉样变性)。公开了涉及使用编辑系统(诸如包含碱基编辑器和指导RNA的编辑系统)编辑TTR基因的组合物和方法。

在第一方面，描述了经分离的多核苷酸或编码其的核酸。所述多核苷酸包含含有约17至约23个核苷酸的5’-间隔区序列，所述5’-间隔区序列与编码甲状腺素转运蛋白(TTR)的基因内的被靶向原间隔区序列同源，所述被靶向原间隔区序列与基因组内的NGG原间隔区相邻基序(PAM)序列相邻。所述经分离的多核苷酸用作用于引导碱基编辑器系统在TTR基因中实现核碱基改变的指导多核苷酸。

所述原间隔区序列可以包含所述TTR基因的起始密码子或剪接位点。所述TTR基因中实现的所述核碱基改变可以包括起始密码子的破坏或内含子外显子剪接位点的破坏。所述经分离的多核苷酸或由编码其的核酸编码的多核苷酸可以包含与以下序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％，或100％同一性的间隔区序列：

5’-GCCAUCCUGCCAAGAAUGAG-3’(SEQ ID NO:1)(GA457)；

5’-GCCAUCCUGCCAAGAACGAG-3’(SEQ ID NO:2)(GA519)；

5’-GCCAUCCUGCCAAGAACGAG-3’(SEQ ID NO:2)(GA458)；

5’-GCAACUUACCCAGAGGCAAA-3’(SEQ ID NO:3)(GA459)；

5’-UAUAGGAAAACCAGUGAGUC-3’(SEQ ID NO:4)(GA460/GA520)；或

5’-UACUCACCUCUGCAUGCUCA-3’(SEQ ID NO:5)(GA461)。

所述经分离的多核苷酸或由编码其的核酸编码的多核苷酸可以包含指导RNA。

在第二方面，描述了一种组合物。所述组合物包含根据第一方面的多核苷酸或核酸。所述组合物可以包含编码碱基编辑器融合蛋白的核酸。所述碱基编辑器融合蛋白可以包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶。所述脱氨酶可以包括胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶。所述脱氨酶可以包括ABE8.8。所述可编程DNA结合结构域可以包含Cas9蛋白。Cas9蛋白(诸如化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9蛋白)被修饰以使得其切割活性部分地或完全地被消除。此类经修饰的Cas9蛋白在本文中被称为“催化受损的”Cas9蛋白。

在第三方面，描述了一种药物组合物。所述药物组合物可以包含根据第二方面的组合物，或者可以包含根据第一方面的多核苷酸或核酸。

在第四方面，描述了一种脂质纳米颗粒(LNP)。所述LNP可以包含根据第三方面的药物组合物，可以包含根据第二方面的组合物，或者可以包含根据第一方面的多核苷酸或核酸。所述LNP可以包含胆固醇。

在第五方面，描述了一种包含LNP的药物组合物。

在第六方面，描述了一种在细胞中的TTR基因中实现一个或多个核碱基改变的方法。所述方法包括使所述细胞与根据第一方面的多核苷酸或核酸、根据第二方面的组合物、根据第三或第五方面的药物组合物，或者根据第四方面的LNP接触。

在第七方面，描述了一种在受试者的甲状腺素转运蛋白(TTR)基因中实现一个或多个核碱基改变的方法。所述方法包括向所述受试者施用根据第一方面的多核苷酸或核酸、根据第二方面的组合物、根据第三或第五方面的药物组合物，或者根据第四方面的LNP。在一些实施方案中，所述TTR基因的一个或多个等位基因被沉默。所述受试者可以是人。所述受试者可以是有需要的受试者。所述受试者可以由于所述TTR基因中的一个或多个突变而患有遗传性甲状腺素转运蛋白淀粉样变性(hATTR)或者处于患遗传性甲状腺素转运蛋白淀粉样变性(hATTR)的风险中。所述受试者可以患有心肌病(hATTR-CM)和/或多发性神经病(hATTR-PN)，或者可以处于患心肌病(hATTR-CM)和/或多发性神经病(hATTR-PN)的风险中。所述受试者可以患有以所述TTR基因的野生型等位基因(ATTRwt)为特征的老年性心脏淀粉样变性或者可以处于患该老年性心脏淀粉样变性的风险中。

可以向所述受试者施用治疗有效量的根据第一方面的多核苷酸或核酸、根据第二方面的组合物、根据第三或第五方面的药物组合物，或者根据第四方面的LNP。可以静脉内施用根据第一方面的多核苷酸或核酸、根据第二方面的组合物、根据第三或第五方面的药物组合物，或者根据第四方面的LNP。

在第八方面，描述了一种用于编辑TTR基因的组合物。所述组合物包含(a)mRNA，其编码具有编辑窗口的碱基编辑器蛋白；和(b)指导RNA，其包含用作所述碱基编辑器蛋白的结合支架的tracr序列和用于将所述碱基编辑器蛋白引导到所述TTR基因上的原间隔区的间隔区序列。所述间隔区序列至少部分地与所述TTR基因的有义链或反义链的剪接位点或起始密码子互补。

所述碱基编辑器蛋白可以包含胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶。所述胞苷脱氨酶可以是脱氧胞苷脱氨酶。所述腺苷脱氨酶可以是脱氧腺苷脱氨酶。所述碱基编辑器蛋白可以包含含有切口酶和胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶的融合蛋白。所述碱基编辑器蛋白可以包含含有D10A切口酶Cas9和胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶的融合蛋白。所述碱基编辑器蛋白可以由含有腺嘌呤碱基编辑器ABE8.8的融合蛋白组成。

所述间隔区序列可以与选自表1或表13的原间隔区序列同源。所述间隔区序列可以选自下表：

gRNA间隔区序列(5’-3’)
	gscscsAUCCUGCCAAGAAUGAG(SEQ ID NO:6)
gscscsAUCCUGCCAAGAACGAG(SEQ ID NO:7)
	gscsasACUUACCCAGAGGCAAA(SEQ ID NO:8)
usasusAGGAAAACCAGUGAGUC(SEQ ID NO:9)
	usascsUCACCUCUGCAUGCUCA(SEQ ID NO:10)
gscscsAUCCUGCCAAGAACGAG(SEQ ID NO:7)

其中：A是腺苷；C是胞苷；G是鸟苷；U是尿苷；a是2’-O-甲基腺苷；c是2’-O-甲基胞苷；g是2’-O-甲基鸟苷；u是2’-O-甲基尿苷并且s是硫代磷酸酯(PS)骨架键联。

所述间隔区序列可以与下表中呈现的间隔区序列具有大于80％的序列同一性：

其中：A是经修饰或未经修饰的腺苷；C是经修饰或未经修饰的胞苷；G是经修饰或未经修饰的鸟苷；并且U是经修饰或未经修饰的尿苷。

指导RNA可以选自下表：

其中：A是腺苷；C是胞苷；G是鸟苷；U是尿苷；a是2’-O-甲基腺苷；c是2’-O-甲基胞苷；g是2’-O-甲基鸟苷；u是2’-O-甲基尿苷并且s是硫代磷酸酯(PS)骨架键联，并且其中粗体表示间隔区序列。

所述间隔区序列可以与选自下表的指导RNA序列具有大于80％的序列同一性：

所述组合物可能能够产生在从中排除GA459的表2中或在表3中列出的编辑活性。所述组合物可能能够产生最小的或不产生表4、表6、表7、表8、表9或表10中列出的脱靶编辑活性。所述组合物可以被包封在脂质纳米颗粒内。所述组合物可以在体内施用于受试者。

附图说明

图1A、图1B和图1C与靶向目标基因的gRNA复合的基因编辑器的总体示意图。鉴定了Cas9蛋白、指导RNA、间隔区序列、原间隔区序列和PAM(原间隔区相邻基序)(图1A)。图1A公开了SEQ ID NO:5760。另外，图示了使用胞嘧啶碱基编辑器(CBE)(图1B)和腺嘌呤碱基编辑器(ABE)(图1C)进行碱基编辑的一般原理的示意图。

图2由碱基编辑引起的剪接供体位点的改变。上图表示由基因转录的RNA的正常剪接。下图表示可能由由于编辑而具有破坏的剪接位点的基因的转录引起的剪接。

图3人TTR基因(hTTR基因)图谱示出了各种限制酶识别位点，外显子1-4以及表1中指定的单指导RNA GA457、GA459、GA460和GA461的位置。

图4示出了来自人参考基因组(GRCh38)的人TTR基因(UniProtKB-P02766(TTHY_HUMAN))的核苷酸序列，并且描绘了该基因上指导GA457、GA459、GA460和GA461所在的区域。图4公开了SEQ ID NO:5761。

图5A-图5C示出GA457(图5A)、GA460(图5B)和GA461(图5C)的TTR指导物和编辑位置的示意图。人基因组DNA(gDNA)序列以黑色标记。指导序列在上方以灰色突出显示。基因组外显子序列以大写字母表示，并且内含子序列以小写字母表示。被ABE编辑靶向的主要位置用黑色箭头标记。图5按出现顺序分别公开了SEQ ID NO 1、5762、4、5763、5和5764。

图6是表示采用利用单指导RNA GA457、GA459、GA460和GA461指导RNA的ABE编辑在人肝细胞中进行的剪接编辑的百分比的图。三种TTR指导RNA GA457、GA460和GA461在人肝细胞中显示出高活性。该指导物中的每种均采用同一的tracr序列，并且不同之处仅在于它们的RNA间隔区序列，该间隔区序列对应于被靶向的TTR基因上的指定DNA原间隔区序列。

图7是用于确定候选脱靶位点的ONE-seq方案的流程图。

图8是与NHP和人TTR外显子1杂交的GA519和GA457的比较示意图。图8按出现顺序分别公开了SEQ ID NO 1、5765、2和5766。

图9是示出与NHP和人TTR外显子3杂交的GA520和GA460的比较的示意图。图9按出现顺序分别公开了SEQ ID NO 5767-5768和5767-5768。

图10是示出如实施例中所述的在非人灵长类动物(NHP)中LNP1和LNP2对TTR基因的肝编辑的柱状图。

图11是示出如实施例中所述的在用LNP1和LNP2处理的NHP中如通过ELISA测量的血清TTR蛋白变化的柱状图。

图12是示出如实施例中所述的在用LNP1和LNP2处理的NHP中如通过质谱法测量的血清TTR蛋白变化的柱状图。

图13A-图13B是示出如实施例中所述的在用LNP1和LNP2处理的NHP中血清丙氨酸转氨酶(ALT)(图13A)和血清天冬氨酸转氨酶(AST)(图13B)浓度的柱状图。

图14A-图14B是示出了如实施例中所述的在用LNP1和LNP2处理的NHP中血清乳酸脱氢酶(LDH)(图14A)和血清谷氨酸脱氢酶(GDH)(图14B)浓度的柱状图。

图15A-图15B是示出了如实施例中所述的在用LNP1和LNP2处理的NHP中血清γ-谷氨酰转移酶(GGT)(图15A)和血清碱性磷酸酶(AP)(图15B)浓度的柱状图。

图16是示出如实施例中所述的在用LNP1和LNP2处理的NHP中血清总胆红素浓度的柱状图。

图17是示出如实施例中所述的在用LNP1和LNP2处理的NHP中血清肌酸激酶浓度的柱状图。

图18示出如实施例中所述的在用LNP1和LNP2处理的NHP中血清细胞因子浓度(MCP-1，左上图；IL-6，右上图；IP-10，左下图；和IL-1RA，右下图)随时间的柱状图。

图19A-图19B是如实施例中所述的在用LNP1和LNP2处理的NHP中iLipid(图19A)和PEG脂质(图19B)的血浆药代动力学曲线图。

图20是示出了如实施例中所述的在NHP中LNP3对TTR基因的肝编辑的柱状图。

图21是示出如实施例中所述的在用LNP3处理的NHP中通过ELISA测量的血清TTR蛋白变化的图。

图22是示出如实施例中所述的在用LNP3处理的NHP中通过液相色谱-质谱法测量的血清TTR蛋白变化的图。

图23A-图23B是示出如实施例中所述的在用LNP3处理的NHP中血清丙氨酸转氨酶(ALT)(图23A)和血清天冬氨酸转氨酶(AST)(图23B)浓度的柱状图。

图24A-图24B是示出如实施例中所述的在用LNP3处理的NHP中血清乳酸脱氢酶(LDH)(图24A)和血清谷氨酸脱氢酶(GDH)(图24B)浓度的柱状图。

图25A-图25B是示出如实施例中所述的在用LNP3处理的NHP中血清γ-谷氨酰转移酶(GGT)(图25A)和血清碱性磷酸酶(AP)(图25B)浓度的柱状图。

图26是示出如实施例中所述的在用LNP2处理的NHP中血清总胆红素浓度的柱状图。

图27是示出如实施例中所述的在用LNP3处理的NHP中血清肌酸激酶浓度的柱状图。

图28A-图28B是如实施例中所述的在用LNP1和LNP2处理的NHP中iLipid(图28A)和PEG脂质(图28B)的血浆药代动力学曲线图。

具体实施方式

本文提供了用于基因修饰或编辑的组合物，以及使用所述组合物来治疗或预防与由错误折叠的甲状腺素转运蛋白(TTR)蛋白聚集形成的淀粉样原纤维在各种组织中的细胞外沉积相关的疾患的方法。此类疾患包括但不限于由遗传性甲状腺素转运蛋白淀粉样变性引起的多发性神经病(hATTR-PN)和由甲状腺素转运蛋白淀粉样变性引起的遗传性心肌病(hATTR-CM)(二者均与TTR基因的常染色体显性突变相关)以及与野生型TTR蛋白(ATTRwt)相关的年龄相关心肌病(也被称为老年性心脏淀粉样变性)。公开了涉及使用编辑系统(诸如包含碱基编辑器和指导RNA的编辑系统)编辑TTR基因的组合物和方法。

定义

下面给出了贯穿本公开提出的一些术语的定义。在一些情况下，术语在本说明书的除此“定义”章节之外的其他区域中被定义。

如本说明书和所附权利要求书所用，除非内容另外明确指出，否则单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指示物。还应注意的是，除非上下文另有明确指出，否则术语“或/或者”通常以其包括“和/或”的含义使用。如本文所用的术语“和/或”和“它们的任何组合”及它们的语法等同物可以互换使用。这些术语可以传达任何组合都是特别考虑的。仅出于说明性目的，以下短语“A、B和/或C”或“A、B、C或它们的任何组合”可以意指“单独的A；单独的B；单独的C；A和B；B和C；A和C；以及A、B和C。”除非上下文具体是指分离使用，否则术语“或/或者”可以连接或分离地使用。

术语“约”或“大约”可以意指在如由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，所述误差范围将部分取决于该值是如何测量或确定的，即测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”可意指在1个或超过1个标准偏差内。可替代地，“约”可意指给定值的至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的范围。可替代地，特别是对于生物系统或过程，该术语可以意指在值的一个数量级内，在5倍内并且更优选地在2倍内。在本申请和权利要求书中描述特定值的情况下，除非另有说明，否则术语“约”意指应假定在特定值的可接受误差范围内。

如本说明书和一条或多条权利要求所用的，词语“包含(comprising)”(以及任何形式的包含，诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(以及任何形式的具有，诸如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(以及任何形式的包括，诸如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(以及任何形式的含有，诸如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包容性或开放式的并且不排除另外的未列举的组成部分(element)或方法步骤。考虑到本说明书中讨论的任何实施方案可以针对本公开的任何方法或组合物来实现，反之亦然。此外，本公开的组合物可用于实现本公开的方法。

包含一种或多种组成部分的制品、组合物、方法等可以由该一种或多种组成部分组成或可以基本上由该一种或多种组成部分组成。如本说明书和一条或多条权利要求所用的，“由……组成(consisting of)”(以及任何形式的“由……组成”，诸如“由……组成(consists of)”和“由……组成(consist of)”)意指包括并且限于。如本说明书和一条或多条权利要求所用的，制品、组合物、方法等“基本上由……组成(consisting essentiallyof)”(以及任何形式的基本上由……组成，诸如“基本上由……组成(consistsessentially of)”和“基本上由……组成(consist essentially of)”)意指物品、组合物、方法等包括指定的列举的组成部分；诸如组分、化合物、材料、步骤等，并且可以包括不会实质上影响制品、组合物、方法等的基本特征和新特征的另外的组成部分。

本说明书中提及的“一些实施方案”、“一实施方案”、“一个实施方案”、“实施方案”或“其他实施方案”意指结合实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本公开的至少一些实施方案中，但不一定包括在本公开的所有实施方案中。

词语“优选的”和“优选地”是指在某些情形下可以提供某些益处的本发明的实施方案。然而，在相同或其他情形下，另一些实施方案也可以是优选的。此外，一个或多个优选实施方案的叙述并不意味着其他实施方案没有用，并且不旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。

如本文所用的术语“核酸”是指含有至少两个核苷酸(即，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)的单链或双链形式的聚合物，并且包括DNA和RNA。“核苷酸”含有糖脱氧核糖(DNA)或核糖(RNA)、碱基和磷酸酯基团。核苷酸通过磷酸酯基团连接在一起。“碱基”包括嘌呤和嘧啶，该嘌呤和嘧啶进一步包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷和天然类似物，以及嘌呤和嘧啶的合成衍生物，其包括但不限于安置新反应性基团(诸如但不限于胺、醇、硫醇、羧化物和烷基卤化物)的修饰。核酸包括含有已知核苷酸类似物或者经修饰的骨架残基或键联或者经修饰的糖残基，或者非经典/经化学修饰的核碱基及它们的组合的核酸，这些核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，并且具有与参考核酸相似的结合特性。此类类似物和/或经修饰的残基的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2’-O-甲基核糖核苷酸和肽核酸(PNA)。

术语“核酸”包括任何寡核苷酸或多核苷酸，其具有含有至多60个核苷酸的片段(通常被称为寡核苷酸)以及较长的片段(被称为多核苷酸)。脱氧核糖寡核苷酸由被称为脱氧核糖的5碳糖组成，该5碳糖在该糖的5’和3’碳上与磷酸酯共价联接以形成交替的无支链聚合物。DNA可以呈例如反义分子、质粒DNA、预浓缩DNA、PCR产物、载体、表达盒、嵌合序列、染色体DNA或这些组的衍生物和组合的形式。核糖寡核苷酸由相似的其中5碳糖是核糖的重复结构组成。因此，术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可以是指由天然存在的碱基、糖和糖间(骨架)键联组成的核苷酸或核苷单体的聚合物或寡聚物。术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”还可以包括包含功能相似的非天然存在的单体或其部分的聚合物或寡聚物。由于诸如例如增强的细胞摄取、降低的免疫原性和在核酸酶存在下增加的稳定性的特性，此类经修饰或经取代的寡核苷酸通常优于原生形式。应理解，术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”还可以包括包含脱氧和核糖核苷酸组合或其变体与骨架修饰(诸如本文所述的那些)的组合的聚合物或寡聚物。

本文所述的“核酸”可以包括一种或多种核苷酸变体，包括一种或多种非标准核苷酸、一种或多种非天然核苷酸、一种或多种核苷酸类似物和/或经修饰的核苷酸。经修饰的核苷酸的实例包括但不限于二氨基嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷(galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、辫苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w、2,6-二氨基嘌呤等。在一些情况下，核苷酸可以在其磷酸酯部分中包含修饰，包括对三磷酸酯部分的修饰。此类修饰的非限制性实例包括更长的磷酸酯链(例如，具有4、5、6、7、8、9、10或更多个磷酸酯部分的磷酸酯链)和具有硫醇部分的修饰(例如，α-硫代三磷酸酯和β-硫代三磷酸酯)。

本文所述的核酸可以在碱基部分(例如，在通常可与互补核苷酸形成氢键的一个或多个原子处和/或在通常不能够与互补核苷酸形成氢键的一个或多个原子处)、糖部分或磷酸酯骨架处被修饰。骨架修饰可以包括但不限于硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phosphoraniladate)、氨基磷酸酯和二氨基磷酸酯键联。硫代磷酸酯键联用硫原子取代磷酸酯骨架中的非桥接氧，并且延迟寡核苷酸的核酸酶降解。二氨基磷酸酯键联(N3’→P5’)防止核酸酶识别和降解。骨架修饰还可以包括肽键代替骨架结构中的磷(例如，通过肽核酸中的肽键连接的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元)，或包括氨基甲酸酯、酰胺以及直链和环状的烃基在内的连接基团。具有经修饰的骨架的寡核苷酸在Micklefield,Curr.Med.Chem.,8(10):1157-79,2001年和Lyer等人,Curr.Opin.Mol.Ther.,1(3):344-358,1999年中综述。本文所述的核酸分子可以含有包含如天然存在的核苷酸中存在的核糖或脱氧核糖的糖部分，或经修饰的糖部分或糖类似物。经修饰的糖部分包括但不限于2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基、2’-O-氨基乙基、2’-氟、N3’→P5’氨基磷酸酯、2’二甲基氨基氧基乙氧基、2’2′二甲基氨基乙氧基乙氧基、2′-胍鎓、2′-O-胍鎓乙基、经氨基甲酸酯修饰的糖和经双环修饰的糖。2’-O-甲基或2’-O-甲氧基乙基修饰促进寡核苷酸中的A型或RNA样构象，增加与RNA的结合亲和力，并且具有增强的核酸酶抗性。经修饰的糖部分还可以包括具有额外的桥键(例如，联接锁定核酸中核糖的2’-O和4’-C原子的亚甲基桥)或糖类似物诸如吗啉环(例如如在二氨基磷酸酯吗啉代中)。

除非另外指出，否则特定核酸序列还隐含地涵盖它的经保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体地，简并密码子取代可以通过生成其中一个或多个所选(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等人,Nucleic Acid Res.,19:5081(1991年)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.,260:2605-2608(1985年)；Rossolini等人,Mol.Cell.Probes,8:91-98(1994))。

本公开涵盖经分离的或基本上经纯化的核酸分子及含有那些分子的组合物。如本文所用，“经分离的”或“经纯化的”DNA分子或RNA分子是脱离其原生环境存在的DNA分子或RNA分子。经分离的DNA分子或RNA分子可以以纯化形式存在或可以存在于非原生环境(诸如，例如转基因宿主细胞)中。例如，“经分离的”或“经纯化的”核酸分子或其生物活性部分在通过重组技术产生时基本上不含其他细胞材料或培养基，或者在通过化学方法合成时基本上不含化学前体或其他化学物。在一个实施方案中，“经分离的”核酸不含该核酸所衍生自的生物体的基因组DNA中天然位于该核酸侧翼的序列(即，位于该核酸的5’和3’端的序列)。

如本文所用，术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”可互换使用，并且是指经由肽键连接并且可以由两个或更多个多肽链组成的氨基酸残基的聚合物。术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”是指通过酰胺键联接在一起的至少两个氨基酸单体的聚合物。氨基酸可以是L-光学异构体或D-光学异构体。更具体地，术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”是指由两个或更多个氨基酸以特定顺序(例如，如由编码蛋白质的基因或RNA中核苷酸的碱基序列确定的顺序)组成的分子。蛋白质对于身体细胞、组织和器官的结构、功能和调控至关重要，并且每种蛋白质都具有独特的功能。实例是激素、酶、抗体及它们的任何片段。在一些情况下，蛋白质可以是蛋白质的一部分，例如蛋白质的结构域、亚结构域或基序。在一些情况下，蛋白质可以是蛋白质的变体(或突变)，其中一个或多个氨基酸残基被插入到该蛋白质的天然存在的(或至少已知的)氨基酸序列中、从该蛋白质的天然存在的(或至少已知的)氨基酸序列中缺失，和/或取代到该蛋白质的天然存在的(或至少已知的)氨基酸序列中。蛋白质或其变体可以是天然存在的或重组的。用于检测和/或测量生物材料中的多肽的方法是本领域众所周知的，并且包括但不限于蛋白质印迹、流式细胞术、ELISA、RIA和各种蛋白质组学技术。测量或检测多肽的示例性方法是免疫测定，诸如ELISA。这种类型的蛋白质定量可以基于能够捕获特异性抗原的抗体和能够检测所捕获的抗原的第二抗体。

术语“受试者”或“患者”涵盖哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于哺乳动物类的任何成员：人、非人灵长类动物(诸如黑猩猩、以及其他猿类和猴类)；农场动物，诸如牛、马、绵羊、山羊、猪；家畜，诸如兔、狗和猫；实验动物，包括啮齿动物，诸如大鼠、小鼠和豚鼠等。

“有需要的受试者”是指具有疾病、疾病症状或易患疾病的体质的目的是治好、治愈、缓和、缓减、改变、补救、改善、改进或影响疾病、疾病症状或易患疾病的体质的个体。在一些实施方案中，受试者患有遗传性甲状腺素转运蛋白淀粉样变性(hATTR)。在一些实施方案中，受试者患有由甲状腺素转运蛋白淀粉样变性引起的心肌病(ATTR-CM)。在一些实施方案中，受试者患有由甲状腺素转运蛋白淀粉样变性引起的多发性神经病(ATTR-PN)。在一些实施方案中，受试者患有野生型ATTR(ATTRwt)，野生型TTR蛋白的年龄相关沉积(以前被称为老年性淀粉样变性)。

如本文所用的“施用”及其语法等同物可以是指向受试者或患者提供本文所述的一种或多种具有复制能力的重组腺病毒或药物组合物。举例来说但不限于，“施用”可以通过静脉内(i.v.)注射、皮下(s.c.)注射、皮内(i.d.)注射、腹膜内(i.p.)注射、肌内(i.m.)注射、血管内注射、脑室内(i.c.v.)注射、鞘内(i.t.)注射、输注(inf.)、经口途径(p.o.)、局部(top.)施用或经直肠(p.r.)施用来进行。可以采用一种或多种此类途径。

如本文所用的术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、脑室内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。肠胃外施用可以是例如通过弹丸注射或通过随时间逐渐灌注来进行。另外，它可以通过可注射储库施用途径(诸如使用1、3或6个月可注射储库或可生物降解的材料和方法)施用于受试者。

如本文所用的术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”及其语法等同物可以包括预防性和/或治疗性地缓和、减少或改善疾病或疾患的至少一种症状，预防另外的症状，抑制疾病或疾患(例如遏制疾病或疾患的发展、缓减疾病或疾患、引起疾病或疾患消退、缓减由疾病或疾患引起的状况，或停止疾病或疾患的症状)。“治疗”可以是指在疾病或疾患发作或疑似发作后向受试者施用包含纳米颗粒(诸如脂质纳米颗粒(LNP))的组合物。“治疗”包括“缓和”的概念，缓和是指减少与疾病或疾患相关的任何症状或其他不良影响的发生或复发的频率或者严重程度和/或与疾病或疾患相关的副作用。术语“治疗”还涵盖“管理”的概念，管理是指降低患者的特定疾病或病症的严重程度或延迟其复发，例如延长已患有该疾病的患者的缓解期。术语“治疗”进一步涵盖“预防(prevent)”、“预防(preventing)”和“预防(prevention)”的概念。应意识到，尽管不排除，但是治疗病症或疾患并不需要完全消除病症、疾患或与其相关的症状。

如本文所用，术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”、“预防(prevention)”等是指降低未患有疾病或疾患，但处于患上疾病或疾患的风险中或易患上疾病或疾患的受试者患上疾病或疾患的概率。

如本文所用的术语“改善”可以是指降低、压制、减弱、减少、阻止或稳定疾病的发展或进展。

如本文所用，“延迟”疾病的发展意指推迟、阻碍、减慢、阻滞、稳定和/或延缓疾病的进展。这种延迟的时间长度可以不同，取决于疾病史和/或要治疗的个体。“延迟”或缓和疾病发展，或延迟疾病发作的方法是当与不使用该方法相比时，在给定时间范围内降低出现该疾病的一种或多种症状的概率和/或在给定时间范围内减少该症状的程度的方法。此类比较通常基于使用足以给出统计显著结果的大量受试者的临床研究。

疾病的“发展”或“进展”意指疾病的初始表现和/或随后的进展。疾病的发展可以使用本领域众所周知的标准临床技术检测到和评估。然而，发展也是指可能无法检测到的进展。出于本公开的目的，发展或进展是指症状的生物学过程。“发展”包括发生、复发和发作。

如本文所用，疾病的“发作”或“发生”包括初始发作和/或复发。

术语“治疗剂”可以是指当施用于受试者时具有治疗、诊断和/或预防作用和/或引发所需生物学和/或药理学作用的任何剂。治疗剂也可以被称为“活性物”或“活性剂”。此类剂包括但不限于细胞毒素、放射性离子、化疗剂、小分子药物、蛋白质和核酸。

如本文所用的术语“药物组合物”及其语法等同物可以是指要施用于受试者(例如，有需要的人)的包含治疗有效量的活性药物成分以及一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体和/或治疗剂的混合物或溶液。

如本文所用的术语“药学上可接受的”及其语法等同物可以是指可用于制备药物组合物的材料的属性，该材料通常是安全的、无毒的、且在生物学上或其他方面都不是不期望的并且对于兽医以及人药物用途是可接受的。“药学上可接受的”可以是指不消除化合物的生物活性或特性并且相对无毒的材料(诸如载体或稀释剂)，即，该材料可以施用于受试者而不引起不期望的生物效应或不以有害方式与含有该材料的药物组合物的任何组分相互作用。

“药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂”是指可以与剂一起施用于受试者，并且当以足以递送治疗量的该剂的剂量施用时不破坏该剂的药理学活性且无毒的赋形剂、载体或稀释剂。

“药学上可接受的盐”可以是本领域通常认为适合用于与人类或动物的组织接触而没有过量毒性、刺激、过敏反应或者其他问题或并发症的酸盐或碱盐。本领域普通技术人员将从本公开和本领域知识中认识到，进一步的药学上可接受的盐包括由Remington'sPharmaceutical Sciences,第17版编辑,Mack Publishing Company,Easton,PA,第1418页(1985)列出的那些盐。

如本文所用，术语“治疗有效量”意指要递送的剂(例如，核酸、药物、有效载荷(payload)、组合物、治疗剂、诊断剂、预防剂等)在被施用于患有或易患感染、疾病、病症和/或疾患的受试者时足以治疗、改善该感染、疾病、病症和/或疾患的症状，诊断、预防和/或延迟该感染、疾病、病症和/或疾患的发作的量。

本文提供的范围应理解为该范围内所有值的简略表达方式。例如，1至50的范围应理解为包括来自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50，以及前面提到的整数之间的所有中间小数值(诸如例如1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8和1.9)组成的组的任何数字、数字组合或子范围。关于子范围，特别考虑到从该范围的任一端点延伸的“嵌套子范围”。例如，示例性范围1至50的嵌套子范围可以包括沿一个方向的1至10、1至20、1至30和1至40，或沿另一个方向的50至40、50至30、50至20、和50至10。

说明书和权利要求书所用的表示组分的量、分子量等的数值应理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。因此，除非另外相反地指出，否则说明书和权利要求书中列出的数值参数是近似值，其可以根据本发明寻求获得的所需特性而变化。在最低限度并且不试图限制对权利要求书范围的等同原则，每个数值参数均应当至少根据所报告的有效位数的数值和通过应用普通四舍五入技术来解读。

尽管陈述本发明的宽泛范围的数值范围和参数是近似值，但在特定实施例中所陈述的数值尽可能准确地进行报告。然而，所有数值固有地都含有必然由在其相应的测试测量中发现的标准偏差产生的范围。

如本文所用，如果包含间隔区序列的碱基编辑器系统的碱基编辑器能够对靶核酸内的碱基进行修饰，则指导核酸的间隔区序列被认为与靶核酸的原间隔区序列“同源”。与原间隔区序列同源的间隔区序列可以与原间隔区序列同一或基本上同一。

如本文所用，与另一种核酸序列“基本上同一”的核酸序列是与该另一种核酸序列具有70％或更多序列同一性的核苷酸序列。

出于RNA序列(例如，间隔区)和DNA序列(例如，靶基因原间隔区)之间的序列同一性百分比的目的，RNA中的尿嘧啶碱基被认为与DNA序列中的胸腺嘧啶碱基同一。

如本文所用，“序列同一性”是指两个最佳比对的核酸序列在整个组分(例如核苷酸)的比对窗口中不变的程度。“同一性”可以通过已知方法容易地计算，该方法包括但不限于以下文献中描述的那些方法：Computational Molecular Biology(Lesk,A.M.,编辑)Oxford University Press,New York(1988)；Biocomputing:Informatics and GenomeProjects(Smith,D.W.,编辑)Academic Press,New York(1993)；Computer Analysis ofSequence Data,第I部分(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.,编辑)Humana Press,New Jersey(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje,G.,编辑)AcademicPress(1987)；和Sequence Analysis Primer(Gribskov,M.和Devereux,J.,编辑)StocktonPress,New York(1991)。

如本文所用，术语“序列同一性百分比”或“同一性百分比”是指当测试(“受试者”)核酸(或其互补链)的线性多核苷酸序列和参考(“查询(query)”)核酸(或其互补链)的线性多核苷酸序列被最佳地比对时与该测试(“受试者”)核酸(或其互补链)相比该参考(“查询(query)”)核酸(或其互补链)的线性多核苷酸序列中同一核苷酸的百分比。可以在所比较序列针对最大对应性被比对时确定序列同一性百分比，如使用下文所述的和本领域已知的序列比较算法或通过目视检查测量的。

对于序列比较，通常一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数计算出一个或多个测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。用于比对比较窗口的序列的最佳比对是本领域技术人员众所周知的，并且可以通过诸如Smith和Waterman的局部同源性算法、Needleman和Wunsch的同源性比对算法、Pearson和Lipman的相似性搜索方法的工具以及任选地通过这些算法的计算机化实现(诸如可作为Wisconsin(Accelrys Inc.，San Diego，CA)的一部分获得的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)来进行。测试序列和参考序列的经比对片段的“同一性分数”是两个经比对序列共有的同一组分的数目除以参考序列片段(即整个参考序列或参考序列的较小限定部分)中的组分总数。序列同一性百分比表示为同一性分数乘以100。

还可以使用BLASTX 2.0版(对于翻译的核苷酸序列)和BLASTN 2.0版(对于多核苷酸序列)来确定“同一性百分比”。用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。这种算法涉及首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字比对时，这些短字匹配或满足某个正值阈值得分T。T被称为邻域字得分阈值(Altschul等人,1990年)。这些初始邻域字命中充当用于启动搜索以找到含有它们的更长HSP的种子。然后，沿着每个序列在两个方向上延伸字命中，直到累积比对得分可以增加。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；始终>0)和N(不匹配残基的惩罚得分；始终<0)来计算累积得分。当累积比对得分从其最大得到值下降数量X，累积得分由于一个或多个负评分残基比对的累积而变成零或更低，或到达任一序列的末端时，字命中在每个方向上的延伸停止。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)11、期望值(E)10、截止值100、M＝5、N＝-4以及两条链的比较作为默认设置。

除了计算序列同一性百分比之外，BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见，例如，Karlin&Altschul,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的一种相似性量度是最小总和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间将偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核苷酸序列与参考核苷酸序列的比较中的最小总和概率为小于约0.1至小于约0.001，则认为测试核酸序列与参考序列相似。

在一些实施方案中，与第二核苷酸序列同源的第一核苷酸序列可以在严格条件或高度严格条件下与第二核苷酸序列的互补序列杂交。在核酸杂交的上下文中“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的并且在不同的环境参数下是不同的。关于核酸杂交的广泛指南见于Tijssen,Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes第I部分第2章"Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays"Elsevier,New York(1993)。通常，高度严格杂交和洗涤条件被选择为比特异性序列在限定离子强度和pH下的热熔点(Tm)低约5℃。Tm是50％的靶序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在限定的离子强度和pH下)。非常严格条件被选择为等于特定探针的Tm。在Southern印迹或Northern印迹中在过滤器上具有超过100个互补残基的互补核苷酸序列的杂交的严格杂交条件的实例是在42℃下50％甲酰胺和1mg肝素，该杂交被进行过夜。高度严格洗涤条件的实例是在72℃下0.15M NaCl持续约15分钟。严格洗涤条件的实例是在65℃下0.2x SSC洗涤15分钟(关于SSC缓冲液的描述，参见Sambrook和Russel,Molecular Cloning:Alaboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001年)。通常，在高度严格洗涤之前进行低严格洗涤以去除背景探针信号。对于例如超过100个核苷酸的双链体，中等严格洗涤的实例是在45℃下1x SSC持续15分钟。对于例如超过100个核苷酸的双链体，低严格洗涤的实例是在40℃下4-6x SSC持续15分钟。对于短探针(例如，约10至50个核苷酸)，严格条件通常涉及在pH 7.0至8.3下盐浓度小于约1.0M Na离子，通常约0.01至1.0MNa离子浓度(或其他盐)，并且温度通常为至少约30℃。还可以通过添加去稳定剂(诸如甲酰胺)来实现严格条件。

在贯穿本申请的数个地方，通过实例提供了指导，这些实例(包括其特定方面)可以以各种组合使用并且是权利要求的主题。在每种情况下，所列举的列表仅用作代表性组并且不应被解释为排他性列表。应理解，具体实例、材料、量和程序应根据本文阐述的本发明的范围和精神来广义地解释。

对于本文公开的包括离散步骤的任何方法，这些步骤可以以任何可行的顺序进行。并且，适当时，可以同时进行两个或更多个步骤的任何组合。

通篇的所有标题都是为了方便读者并且不应该用于限制标题后文本的含义，除非如此指定。

甲状腺素转运蛋白和基因

甲状腺素转运蛋白(TTR)最初被称为前白蛋白，是一种55kDa的甲状腺素(T4)和视黄醇结合蛋白二者的转运蛋白，其以可溶形式在健康人的血清和脑脊液(CSF)中循环。TTR被认为主要在肝中合成。在正常情况下，TTR以具有中央通道的同源四聚体形式循环。野生型TTR单体的长度为147个氨基酸，并且具有以下氨基酸序列：

MASHRLLLLC LAGLVFVSEA GPTGTGESKC PLMVKVLDAV RGSPAINVAV

HVFRKAADDT WEPFASGKTS ESGELHGLTT EEEFVEGIYK VEIDTKSYWK

ALGISPFHEH AEVVFTANDS GPRRYTIAAL LSPYSYSTTA VVTNPKE(SEQ ID NO:23)。

TTR基因由四个外显子组成，位于18号染色体18q12.1上。人TTR基因的全序列在图4中示出，并且也可在UniProtKB-P02766(TTHY_HUMAN)上获得。迄今为止，已鉴定出超过120种TTR变体，其中绝大多数具有致病性。最常见的致病性变体由点突变组成，该点突变导致成熟蛋白的30位处的缬氨酸被甲硫氨酸替代。这种Val30Met突变是造成hATTR粉样变性的主要原因，是全世界最常见的淀粉样变性突变，占TTR变体的约50％。

遗传性甲状腺素转运蛋白淀粉样变性(hATTR)是一种由TTR基因突变引起的疾病。常染色体显性突变使TTR四聚体不稳定并且增强解离成单体，导致错误折叠、聚集以及随后TTR淀粉样原纤维在不同组织部位中的细胞外沉积。这种淀粉样蛋白的多系统细胞外沉积(淀粉样变性)导致不同器官和组织的功能障碍。特别是，由甲状腺素转运蛋白淀粉样变性引起的多发性神经病(ATTR-PN)和由甲状腺素转运蛋白淀粉样变性引起的心肌病(ATTR-CM)是与显著发病率和死亡率相关的严重病症。

当临床怀疑hATTR-PN时，通常通过组织活检使用淀粉样蛋白染色、淀粉样蛋白分型(使用免疫组织化学或质谱法)和/或TTR基因测序来完成诊断。当临床怀疑ATTR-CM时，关键的诊断工具是心内膜心肌活检(通过免疫组织化学或质谱法使用组织染色和淀粉样蛋白分型)或99m锝焦磷酸盐扫描。这两种方法都可以提供ATTR-CM的诊断。TTR基因测序可用于区分hATTR-CM(突变阳性)与ATTRwt-CM(突变阴性)。

本文所述的组合物包含具有充当指导物以引导基因编辑蛋白(例如碱基编辑器)改变TTR基因(例如通过在TTR基因中引入一个或多个核碱基改变)的核苷酸序列的间隔区。这些点突变可用于破坏基因功能，通过引入导致产生功能较差蛋白质或非功能性蛋白质，因此使TTR基因沉默的一个或多个错义突变。可替代地，本文考虑到可以使用基因编辑蛋白改变突变的基因以校正导致TTR基因功能障碍的潜在突变或以其他方式减轻该基因的功能障碍，从而对一个或多个点突变进行校正。

基因编辑/基因修饰

如本文所用的术语“基因编辑”或“基因修饰”及其语法等同物是指其中一个或多个核苷酸被插入、替代或从基因组中去除的基因工程化。可以使用核酸酶(例如，天然存在的核酸酶或人工工程化的核酸酶)进行基因编辑。基因修饰可以包括在多核苷酸序列(例如靶多核苷酸序列)中引入双链断裂、无义突变、移码突变、剪接位点改变或倒位。图1A描绘了crispr Cas9蛋白，其是可用于在DNA或基因的位点特异性位置处赋予双链断裂的RNA指导的核酸内切酶。基因修饰也可以使用其他编辑器(诸如碱基编辑器)完成。

碱基编辑器

碱基编辑器(BE)或核碱基编辑器(NBE)是指包含能够对核酸序列(例如，DNA或RNA)内的碱基(例如，A、T、C、G或U)进行修饰的多肽的剂。碱基编辑器可以包含大分子或大分子复合物，其能够在碱基编辑窗口内的一个位置或两个或更多个位置处将多核酸序列中的核碱基转化为另一种核碱基(例如，转换或颠换)。碱基编辑器可以包含(a)核苷酸转化酶、核苷转化酶或核碱基转化酶和(b)可以被编程成与特异性核酸序列结合的核酸结合蛋白的组合。核酸结合蛋白可以被催化失活或受损，使得它不切割单链核酸靶标或使得它至多切刻(nick)或切割双链核酸靶标的一条链。

碱基编辑器可以包含与具有碱基编辑活性的结构域融合或连接，从而产生碱基编辑器融合蛋白的多核苷酸可编程DNA结合结构域。碱基编辑器融合蛋白可以包含一种或多种接头，例如结构域之间的肽接头。在一些实施方案中，具有碱基编辑活性的结构域与指导RNA连接(例如，经由指导RNA上的RNA结合基序和与脱氨酶融合的RNA结合结构域)。

在一些实施方案中，碱基编辑器是一类模块化可编程蛋白质，其包含与催化受损的CRISPR-Cas酶融合的脱氨酶结构域。通过在不生成双链DNA断裂的情况下水解脱氨和随后的细胞加工，腺嘌呤碱基编辑器(ABE)将A:T碱基对转化为G:C碱基对并且胞嘧啶碱基编辑器(CBE)将C:G碱基对转化为T:A碱基对。通过D10A切口酶Cas9(nCas9)内的指导RNA(gRNA)引导碱基编辑器的相应脱氨酶到达目标位点。CBE的胞苷脱氨酶引导胞嘧啶转化为尿苷，从而实现C→T(或G→A)取代(参见图1B)。“胞苷脱氨酶”在本文中用于指作用于脱氧胞苷、胞苷，或脱氧胞苷和胞苷二者以将胞嘧啶转化为尿苷的脱氨酶。胞苷脱氨酶和胞嘧啶脱氨酶在本文中可互换使用。在目标是出于治疗目的在体内破坏基因的情况下，胞嘧啶碱基编辑器(CBE)能够潜在地能通过改变谷氨酰胺(CAG→TAG，CAA→TAA)、精氨酸(CGA→TGA)和色氨酸(TGG→TAG/TAA/TGA，其中对反义链上的胞嘧啶进行编辑)的特异性密码子来直接将终止密码子引入到该基因的编码序列中(无义突变)。

相比之下，ABE的腺苷脱氨酶引导腺苷转化为肌苷，从而实现A→G(或T→C)取代(参见图1B)。“腺苷脱氨酶”在本文中用于指作用于脱氧腺苷、腺苷，或脱氧腺苷和腺苷二者以将腺嘌呤转化为次黄嘌呤或可替代地将腺苷转化为肌苷的脱氨酶。因为肌苷的结构与鸟苷相似(肌苷不包含鸟苷的环外氨基)，因此肌苷倾向于表现得像鸟苷。通过随后的细胞加工，肌苷最终被鸟苷替代。因此，腺苷脱氨酶实现A→G(或T→C)取代。腺苷脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶在本文中可互换使用。腺嘌呤碱基编辑器(ABE)不能直接引入终止密码子，因为不存在导致无义突变的A→G变化。

例如，腺嘌呤碱基编辑器可用于通过编辑起始密码子(ATG→GTG或ATG→ACG)来破坏基因功能。腺嘌呤碱基编辑器可以破坏基因功能的第二策略是通过编辑剪接位点，无论是内含子5’端的剪接供体还是内含子3’端的剪接受体。剪接位点破坏可以导致信使RNA(mRNA)中包含内含子序列(潜在地引入无义、移码或框内突变，这些突变导致过早终止密码子或插入/缺失破坏蛋白质活性的氨基酸)，或导致不包含外显子序列(潜在地引入无义、移码或框内插入缺失突变)。

如图2所示，经典剪接供体包含有义链上的DNA序列GT，而经典剪接受体包含DNA序列AG。序列的改变破坏正常的剪接。剪接供体可以通过反义链的第二个位置的互补碱基的腺嘌呤碱基编辑(GT→GC)来破坏，并且剪接受体可以通过有义链的第一个位置的腺嘌呤碱基编辑(AG→GG)来破坏。

腺嘌呤碱基编辑器(ABE)包括但不限于ABE8.8(Gaudelli等人,NatBiotechnol.2020年7月；38(7):892-900.doi:10.1038/s41587-020-0491-6.Epub 2020年4月13日))。

在实施方案中，腺嘌呤碱基编辑器由包含表11中所示的MA004mRNA序列的mRNA编码。在实施方案中，腺嘌呤碱基编辑器由包含与表11中所示的MA004 mRNA具有50％或更多序列同一性、与表11中所示的MA004 mRNA具有60％或更多序列同一性、与表11中所示的MA004 mRNA具有70％或更多序列同一性、与表11中所示的MA004 mRNA具有75％或更多序列同一性、与表11中所示的MA004 mRNA具有80％或更多序列同一性、与表11中所示的MA004mRNA具有85％或更多序列同一性、与表11中所示的MA004 mRNA具有90％或更多序列同一性、与表11中所示的MA004 mRNA具有95％或更多序列同一性、与表11中所示的MA004mRNA具有96％或更多序列同一性、与表11中所示的MA004 mRNA具有97％或更多序列同一性、与表11中所示的MA004 mRNA具有98％或更多序列同一性，或与表11中所示的MA004mRNA具有99％或更多序列同一性的序列的mRNA编码。

ABE7.10(Gaudelli等人,Nature.2017年11月23日；551(7681):464-471.doi:10.1038/nature24644)和其他ABE变体含有化脓性链球菌Cas9。The CRISPR Journal,第4卷,第2期,2021年第169-177页和补充附图S1-s9、补充数据S4-S6和补充表S1-S2公开了另外的嵌入碱基编辑器(inlaid base editor，IBE)变体。

在一些实施方案中，碱基编辑器可以将C:G碱基对转化为G:C碱基对。此类碱基编辑器的实例公开在(a)Chen等人Programmable C:G to G:C genome editing withCRISPR-Cas9-directed base excisi on repair proteins.Nat Commun 12,1384(2021年).doi:10.1038/s41467-021-21559-9.Epub 2021年3月2日；(b)Kurt,I.C.,Zhou,R.,Iyer,S.等人CRISPR C-to-G base editors for inducing targeted DNAtransversionsin human cells.Nat Biotechnol 39,41–46(2021年).doi:10.1038/s41587-020-0609-x.Epub 2020年7月20日；和(c)Zha o,D.,Li,J.,Li,S.等人Glycosylase base editorsenable C-to-A an d C-to-G base changes.Nat Biotechnol 39,35–40(2021年).doi:10.1038/s41587-020-0592-2.Epub 2020年7月20日中。此类碱基编辑器可以包含Cas9切口酶和胞苷脱氨酶。此类碱基编辑器可以进一步包含尿嘧啶-DNA糖基化酶、DNA修复蛋白(诸如XRCC1)、DNA连接酶S，或DNA聚合酶b的DNA结合和连接酶结构域。

在一些实施方案中，碱基编辑器可以将C:G碱基对转化为A:T碱基对。此种碱基编辑器的实例公开在Zhao,D.,Li,J.,Li,S.等人Glycosylase base editors enable C-to-Aand C-to-G base changes.Nat Biotechnol 39,35–40(2021年).doi:10.1038/s41587-020-0592-2.Epub2020年7月20日中。此类碱基编辑器可以包含Cas9切口酶和胞苷脱氨酶。此类碱基编辑器可以进一步包含尿嘧啶-DNA糖基化酶。

术语“碱基编辑器系统”是指用于编辑靶核苷酸序列的核碱基的系统。在各种实施方案中，碱基编辑器系统包含(1)多核苷酸可编程核苷酸结合结构域(例如，Cas9)；(2)用于使所述核碱基脱氨的脱氨酶结构域(例如，腺苷脱氨酶或胞苷脱氨酶)；和(3)一种或多种指导多核苷酸(例如，指导RNA)。在一些实施方案中，碱基编辑器系统包含含有(1)和(2)的碱基编辑器融合蛋白，或编码含有(1)和(2)的碱基编辑器融合蛋白的多核苷酸(例如，mRNA)。在一些实施方案中，该多核苷酸可编程核苷酸结合结构域是多核苷酸可编程DNA结合结构域。在一些实施方案中，碱基编辑器是腺嘌呤或腺苷碱基编辑器(ABE)。在一些实施方案中，碱基编辑器是胞嘧啶碱基编辑器(CBE)。

基因组编辑系统包括成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas系统。示例性的指导核苷酸序列-可编程DNA-结合蛋白包括但不限于Cas9(例如，dCas9和nCas9)、saCas9(例如，saCas9d、saCas9d、saKKH Cas9)CasX、CasY、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、Argonaute以及本文所述的任何其他合适的蛋白质，或它们的合适的变体。

通过使用具有与靶基因组(被称为原间隔区)中的DNA的序列(其与该DNA中包含序列NGG(N是任何标准碱基)的特定原间隔区相邻基序(PAM)相邻)同源的序列的指导RNA(gRNA)，Cas9可以用于在被靶向序列处产生双链断裂(DSB)。DSB处的非同源末端联接(NHEJ)能够产生插入缺失，并且可能敲除遗传基因座处的基因；同样，使用引入的模板DNA的同源定向修复(HDR)可以插入基因或修饰被靶向序列。

近几年已开发了多种基于Cas9的工具。使用指导核苷酸序列-可编程DNA-结合蛋白(诸如Cas9)进行位点特异性切割(例如，以修饰基因组)的方法已在(参见例如，Cong等人,Science 339,819-823(2013年)；Mali等人,Science 339,823-826(2013年)；Hwang等人,Nature Biotechnology 31,227-229(2013年)；Jinek等人,eLife 2,e00471(2013年)；Dicarlo等人,Nucleic Acids Research(2013年)；和Jiang等人,Nature Biotechnology31,233-239(2013年)中被描述。

2016年,Komor等人描述了使用CRISPR-Cas9来将胞嘧啶碱基转化为胸腺嘧啶碱基，而无需引入模板DNA链且无需DSB(Komor等人,Nature,2016年,533:420–4)。在使用接头XTEN将大鼠APOBEC1的胞苷脱氨酶结构域与催化死亡Cas9(dCas9)的N末端融合(产生被称为碱基编辑器1或BE1的融合蛋白)之后，在DNA的20-nt原间隔区区域内的4位与8位之间(或，为了以不同的方式表达它，PAM上游的第13至17个核苷酸)观察到胞嘧啶转化为尿嘧啶。值得注意的是，这个“窗口”内的任何胞嘧啶碱基都易于编辑，从而产生不同的结局，具体取决于编辑了多少和哪些胞嘧啶。在DNA复制或修复之后，每个尿嘧啶均被胸腺嘧啶替代，从而完成C到T碱基编辑。

下一版本的碱基编辑器(BE2)掺有与dCas9的C末端融合的尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)，以帮助抑制由胞苷脱氨酶活性引起的尿嘧啶碱基的碱基切除修复(否则这会起到恢复原始的胞嘧啶碱基的作用)；这提高了C到T碱基编辑的效率。

下一版本的碱基编辑器(BE3)使用Cas9切口酶而不是dCas9；该切口酶切割与编辑的C到T碱基相对的未编辑链，从而通过真核生物错配修复刺激相对的胍的去除。在人和鼠细胞系中均观察到BE2和BE3碱基编辑。图1B是BE3的图示。通过向Cas9切口酶添加突变，已进一步提高了碱基编辑的特异性；以类似的方式，Cas9已被突变以将编辑窗口的宽度从约5个核苷酸缩小到少至1至2个核苷酸(Rees等人,Nat Commun,2017年,8:15790,Kim等人,NatBiotechnol,2017年,35:371–6)。

通过将大肠杆菌(Escherichia coli)腺嘌呤tTNA脱氨酶TadA(ecTadA)与dCas9融合并对ecTadA结构域进行诱变并结合编辑活性的选择，发现A106V和D108N突变产生了能够将DNA中的腺嘌呤编辑为鸟嘌呤的被称为ABE7.10的碱基编辑器(Gaudelli等人Nature,2017年,551:464–71)。

腺嘌呤8.8-m(在本文中也被称为ABE8.8)使用其核心化脓性链球菌切口酶Cas9(nSpCas9)蛋白以及指导RNA(gRNA)来接合双链原间隔区DNA序列(在其3’端侧接有NGG原间隔区相邻基序(PAM)序列)。经由gRNA的前20个碱基与“靶”DNA链上的互补序列杂交来指定原间隔区序列，将另一条(“非靶”)链的一部分保留在暴露的单链形式结构(被称为R环)中。与Cas9和Cas12不同，ABE8.8不会在被靶向DNA序列中造成双链断裂。相反，如图1C所图示，ABE8.8使用进化的脱氧腺苷脱氨酶结构域(与nSpCas9融合)来将R环的单链DNA部分中所包含的腺苷核苷化学修饰为肌苷，并切刻R环的DNA:RNA异源双链体内的靶DNA链。这种切刻使DNA修复机制偏向于使用新脱氨基的链作为模板，从而在被靶向位点实现非常高效的转换突变。ABE8.8的活性窗口范围通常从由gRNA指定的原间隔区DNA序列中的3位至9位，NGGPAM(21位到23位)的5’的第12到18个碱基对，其中在原间隔区的6位处观察到编辑峰(Gaudelli等人,Nat Biotechnol.2020年7月；38(7):892-900)。

在一些实施方案中，编码碱基编辑器融合蛋白的核酸是mRNA。在一些实施方案中，在施用后，该mRNA在被靶向细胞或受试者中翻译后生成碱基编辑器融合蛋白。在一些实施方案中，碱基编辑器融合蛋白在被靶向细胞或受试者中形成核糖核蛋白(RNP)复合物。

应意识到，本公开的融合蛋白可以包含一个或多个另外的特征。例如，在一些实施方案中，融合蛋白可以包含细胞质定位序列，输出序列(诸如核输出序列)或其他定位序列，以及可用于溶解、纯化或检测融合蛋白的序列标签。本文提供的合适的蛋白质标签包括但不限于生物素羧化酶载体蛋白(BCCP)标签、myc标签、钙调蛋白标签、FLAG标签、血凝素(HA)标签、多组氨酸标签(也被称为组氨酸标签或His标签)、麦芽糖结合蛋白(MBP)标签、nus标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签、绿色荧光蛋白(GFP)标签、硫氧还蛋白标签、S标签、Softag(例如，Softag 1、Softag 3)、strep标签、生物素连接酶标签、FlAsH标签、V5标签和SBP标签。另外的合适序列对于本领域技术人员将是显而易见的。在一些实施方案中，融合蛋白包含一个或多个His标签。

原间隔区

如本文所用的术语“原间隔区”或“靶序列”及其语法等同物可以是指PAM相邻核酸序列。原间隔区可以是基因、基因组或染色体内被gRNA靶向的核苷酸序列。在原生状态下，原间隔区与PAM(原间隔区相邻基序)相邻。RNA指导的核酸酶的切割位点位于原间隔区序列内。例如，如图1A所图示，当gRNA靶向特异性原间隔区时，Cas蛋白在原间隔区序列内生成双链断裂，从而切割原间隔区。切割后，可以通过非同源末端联接或同源定向修复来导致原间隔区的破坏。原间隔区的破坏可以导致原间隔区的缺失。另外地或可替代地，原间隔区的破坏可以导致外源核酸序列被插入到原间隔区中或替代原间隔区。

通过本公开，鉴定了人TTR基因的核苷酸序列内的原间隔区序列以用作这样的指导序列，该指导序列允许ABE8.8(以及含有化脓性链球菌Cas9的其他ABE变体，诸如ABE7.10，或含有可以使用NGG PAM的另一种Cas蛋白的其他ABE变体)通过其编辑窗口内(DNA的20-nt原间隔区区域中的大约4位至7位)的A→G编辑来破坏起始密码子或破坏剪接位点(无论是供体还是受体)。表1中所示的四个序列是人TTR基因内鉴定出的。这四个原间隔区序列在人TTR基因图谱上的比对在图3中示出。

对应于指导RNA GA457的原间隔区具有序列5’-GCCATCCTG CCAAGAATGAG-3’(SEQID NO:24)并且位于人TTR基因的34,879至34,898bp处。

对应于指导RNA GA459的原间隔区具有序列5’-GCAACTTAC CCAGAGGCAAA-3’(SEQID NO:25)并且位于人TTR基因的36,007至36,026bp处。

对应于指导RNA GA460的原间隔区具有序列5’-TATAGGAAA ACCAGTGAGTC-3’(SEQID NO:26)并且位于人TTR基因的38,106至38,125bp处。

对应于指导RNA GA461的原间隔区具有序列5’-TACTCACCT CTGCATGCTCA-3’(SEQID NO:27)并且位于人TTR基因的38,234至38253处。

对应于指导RNA GA458的原间隔区具有序列5’-GCCATCCTG CCAAGAACGAG-3’(SEQID NO:28)，代表食蟹猴TTR基因内对应于与指导RNA GA459相对应的人原间隔区序列的序列。

指导核酸(例如，指导RNA)长约15至100个核苷酸，并且包含与靶原间隔区序列互补的至少10个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，靶序列的3’端紧邻经典PAM序列(NGG)。在一些实施方案中，靶序列的3’端不紧邻经典PAM序列(NGG)。在一些实施方案中，靶序列的3’端紧邻AGC、GAG、TTT、GTG或CAA序列。

在一些实施方案中，指导多核苷酸是DNA。在一些实施方案中，指导多核苷酸是RNA，其在本文中也被称为指导RNA或gRNA。在一些实施方案中，指导多核苷酸是经修饰的人工多核苷酸。

在一些实施方案中，可以合成指导多核苷酸，包括但不限于gRNA。指导多核苷酸可以包含间隔区序列，该间隔区序列被配置成在例如细胞内的条件下与如表1中所示的原间隔区序列的互补序列杂交。指导多核苷酸可以包含与如表1中所示的原间隔区序列同源的间隔区序列。在一些实施方案中，指导多核苷酸包含指导RNA，该指导RNA包含具有与表1中列出的原间隔区同源的序列的间隔区。在一些实施方案中，指导RNA可以具有包含表1中列出的指导RNA(gRNA)序列的序列。

本公开包括指导多核苷酸，该指导多核苷酸具有与序列5’-GCCAUCCUGCCAAGAAUGAG-3’(SEQ ID NO:1)(GA457)至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％同一的序列。本公开包括指导多核苷酸，该指导多核苷酸具有序列5’-GCCAUCCUGCCAAGAAUGAG-3’(SEQ ID NO:1)(GA457)。

本公开包括指导多核苷酸，该指导多核苷酸具有与序列5’-GCCAUCCUGCCAAGAACGAG-3’(SEQ ID NO:2)(GA458)至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％同一的序列。本公开包括指导多核苷酸，该指导多核苷酸具有序列5’-GCCAUCCUGCCAAGAACGAG-3’(SEQ ID NO:2)(GA458)。

本公开包括指导多核苷酸，该指导多核苷酸具有与序列5’-GCAACUUACCCAGAGGCAAA-3’(SEQ ID NO:3)(GA459)至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％同一的序列。本公开包括指导多核苷酸，该指导多核苷酸具有序列5’-GCAACUUACCCAGAGGCAAA-3’(SEQ ID NO:3)(GA459)。

本公开包括指导多核苷酸，该指导多核苷酸具有与序列5’-UAUAGGAAAACCAGUGAGUC-3’(SEQ ID NO:4)(GA4560)至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％同一的序列。本公开包括指导多核苷酸，该指导多核苷酸具有序列5’-UAUAGGAAAACCAGUGAGUC-3’(SEQ ID NO:4)(GA4560)。

本公开包括指导多核苷酸，该指导多核苷酸具有与序列5’-UACUCACCUCUGCAUGCUCA-3’(SEQ ID NO:5)(Ga4561)具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％同一的序列。本公开包括指导多核苷酸，该指导多核苷酸具有序列5’-UACUCACCUCUGCAUGCUCA-3’(SEQ ID NO:5)(Ga4561)。

指导多核苷酸可以包含至少三个区域：位于5’端的可以与染色体序列中的靶位点同源的第一区域(间隔区区域)、可以形成茎环结构的第二内部区域，以及可以是单链的第三3’区域。第二区域和第三区域被认为是指导RNA的tracr序列或区域，并用作碱基编辑器或CRISPR/Cas蛋白的结合支架，而间隔区区域用于将蛋白质指导到特异性靶位点。缩写词tracr是指反式激活crispr。

gRNA的第二区域可以形成二级结构。在一些实施方案中，由gRNA形成的二级结构可以包含茎(或发夹)和环。环和茎的长度可以变化。在一些实施方案中，环的长度范围可以为约3至约10个核苷酸。在一些实施方案中，茎的长度范围可以为约6至约20个核苷酸。茎可以包含一个或多个1至10个核苷酸或约10个核苷酸的凸起。在一些实施方案中，第二区域的总长度范围可以为约16至60个核苷酸。在一些实施方案中，环的长度可以为约4个核苷酸。在一些实施方案中，茎的长度可以为约12。

gRNA的位于3’端的第三区域可以是单链的。在一些实施方案中，第三区域不与目标细胞中的任何染色体序列互补并且不与gRNA的其余部分互补。第三区域可以具有任何合适的长度。例如，第三区域的长度可以为三个或更多个，或四个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，第三区域的长度可以变化，长度范围为约5至约60个核苷酸。

在一些实施方案中，指导多核苷酸包含与如表1中所示的TTR基因的原间隔区序列同源的具有0、1、2、3、4或5个错配的间隔区序列。在一些实施方案中，指导多核苷酸包含与如表1中所示的TTR基因的原间隔区序列同源的不具有错配的间隔区序列。

在一些实施方案中，指导多核苷酸的长度取决于碱基编辑器系统的CRISPR/Cas组分和所使用的组分。例如，来自不同细菌物种的不同Cas蛋白具有不同的最佳靶向序列长度。因此，靶向序列可以包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或超过50个核苷酸的长度。在一些实施方案中，靶向序列包含18至24个核苷酸的长度。在一些实施方案中，靶向序列包含19至21个核苷酸的长度。在一些实施方案(诸如表1中所述的那些)中，靶向序列包含20个核苷酸的长度。

在一些实施方案中，指导多核苷酸包含间隔区序列并且在其他方面符合标准100-nt化脓性链球菌CRISPR gRNA序列。

在一些实施方案中，指导RNA是经化学修饰的。经化学修饰的gRNA在转染到哺乳动物细胞中时可以具有增加的稳定性。例如，gRNA可以被化学修饰成在每个gRNA的至少一个5’核苷酸和至少一个3’核苷酸上包含2’-O-甲基核糖和硫代磷酸酯骨架修饰的组合。在一些情况下，三个末端5’核苷酸和三个末端3’核苷酸被化学修饰成包含2’-O-甲基核糖和硫代磷酸酯修饰的组合。

本文所述的gRNA可以化学合成、酶促合成，或通过二者的组合来合成。例如，可以使用标准的基于亚磷酰胺的固相合成方法来合成gRNA。可替代地，可以通过将编码gRNA的DNA可操作地连接至被噬菌体RNA聚合酶识别的启动子控制序列来在体外合成gRNA。合适的噬菌体启动子序列的实例包括但不限于T7、T3、SP6启动子序列或它们的变体。在一些实施方案中，gRNA包含两个分开的分子(例如，crRNA(其包含间隔区)和tracrRNA)。一个分子(例如，crRNA)可以化学合成，另一个分子(例如，tracrRNA)可以酶促合成。

治疗应用

本文所述的指导多核苷酸和组合物可以以治疗有效量施用于靶细胞或有需要的受试者，以预防或治疗与甲状腺素转运蛋白淀粉样变性相关的疾患。在一些实施方案中，受试者患有遗传性甲状腺素转运蛋白淀粉样变性(hATTR)。在一些实施方案中，受试者患有由甲状腺素转运蛋白淀粉样变性引起的心肌病(ATTR-CM)。在一些实施方案中，受试者患有由甲状腺素转运蛋白淀粉样变性引起的多发性神经病(ATTR-PN)。在一些实施方案中，受试者患有野生型ATTR(ATTRwt)，野生型TTR蛋白的年龄相关沉积(以前被称为老年性淀粉样变性)。

通过此种施用，指导多核苷酸引导编辑器系统(例如，ABE编辑器系统)在受试者的TTR基因中实现核碱基改变，编辑TTR基因以减少或消除所产生的全长功能性蛋白质的量，从而治疗该疾患。在一些实施方案中，碱基改变发生在受试者的肝的细胞(肝细胞)中。

例如，gRNA和腺苷碱基编辑器蛋白，其可以在需要靶基因编辑的细胞(诸如，例如肝细胞)中表达，从而允许靶基因与gRNA和腺苷碱基编辑器蛋白接触。在一些实施方案中，腺苷碱基编辑器蛋白与其在靶基因中的靶多核苷酸序列的结合是由指导RNA引导的，其中gRNA的间隔区序列与靶基因中的靶多核苷酸序列(例如原间隔区的互补序列)杂交。因此，指导RNA引导腺苷碱基编辑器蛋白编辑靶基因中的靶多核苷酸序列(例如，原间隔区序列)。在一些实施方案中，将指导RNA与腺苷碱基编辑器蛋白或与编码腺苷碱基编辑器蛋白的核酸共引入到需要编辑的细胞中。

在某些实施方案中，腺嘌呤碱基编辑器可用于通过修饰靶基因剪接位点处的核碱基来破坏基因功能和/或表达。在一些实施方案中，如本文所述的腺苷核碱基编辑器可用于破坏内含子5’端处的剪接供体位点或内含子3’端处的剪接受体位点。在一些实施方案中，剪接位点破坏导致信使RNA(mRNA)中包含内含子序列——潜在地引入无义、移码或框内插入缺失突变，这些突变导致过早终止密码子或插入/缺失破坏蛋白质活性的氨基酸——或导致不包含外显子序列(这还潜在地引入无义、移码或框内插入缺失突变)。

经典剪接供体包含有义链上的DNA序列GT，而经典剪接受体包含DNA序列AG。在一些实施方案中，碱基编辑器(诸如如本文所述的腺苷核碱基编辑器)可用于生成破坏正常剪接的序列改变。在一些实施方案中，腺苷碱基编辑器破坏剪接供体的反义链上的互补A，导致GT→GC的编辑。在一些实施方案中，腺苷碱基编辑器破坏有义链上剪接受体位点的A，导致AG→GG的编辑。

在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物减少或消除由TTR基因编码的甲状腺素转运蛋白的表达和/或功能。例如，本文公开的方法和组合物可以使甲状腺素转运蛋白的表达和/或功能相对于对照降低至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍，或至少10倍。

在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的受试者的疾患的方法包括向受试者施用(i)指导多核苷酸和(ii)编码碱基编辑器融合蛋白的核酸。

在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗或预防有需要的受试者的疾患的方法包括施用脂质纳米颗粒(LNP)，该脂质纳米颗粒包裹(i)指导多核苷酸或编码指导多核苷酸的核酸和/或(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码碱基编辑器融合蛋白的核酸。在一些方面，该(i)指导多核苷酸或编码指导多核苷酸的核酸和(ii)包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白或编码碱基编辑器融合蛋白的核酸被包裹在同一个LNP中。在一些方面，它们被包裹在分开的LNP中。

药物组合物

在一些方面，本文提供了药物组合物，其包含如本文提供的碱基编辑器系统和药学上可接受的载体或赋形剂。在一些方面，本文提供了用于基因修饰的药物组合物，该药物组合物包含如本文所述的指导RNA和碱基编辑器融合蛋白或编码碱基编辑器融合蛋白的核酸序列以及药学上可接受的载体。药物组合物使用一种或多种药学上可接受的非活性成分以常规方式进行配制，该非活性成分促进活性化合物加工成可在药学上使用的配制物(preparation)。用于本公开的合适的制剂和递送方法通常是本领域众所周知的。适当的制剂取决于所选择的施用途径。本文所述的药物组合物的概述可以在例如Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,第十九版(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1995年)；Hoover,John E.,Remington’sPharmaceutical Sciences,Mack PublishingCo.,Easton,Pennsylvania1975年；Liberman,H.A.和Lachman,L.,编辑,PharmaceuticalDosage Forms,Marcel Decker,New York,N.Y.,1980年；以及Pharmaceutical DosageForms and Drug Delivery Systems,第七版(Lippincott Williams&Wilkins 1999年)中找到。

药物组合物可以是如本文所述的指导RNA或编码该指导RNA的核酸序列和碱基编辑器融合蛋白或编码碱基编辑器融合蛋白的核酸序列与一种或多种其他化学组分(即，药学上可接受的成分)的混合物，这些其他化学组分诸如载体、赋形剂、粘合剂、填充剂、悬浮剂、调味剂、甜味剂、崩解剂、分散剂、表面活性剂、润滑剂、着色剂、稀释剂、增溶剂、润湿剂、增塑剂、稳定剂、渗透促进剂、湿润剂、消泡剂、抗氧化剂、防腐剂或者其一种或多种组合。药物组合物有利于向有需要的生物体或受试者施用。

可以使用本领域已知的任何合适的方法将本公开的药物组合物施用于受试者。本文所述的药物组合物可以以多种方式(包括肠胃外、静脉内、皮内、肌内、经结肠、经直肠或腹膜内)施用于受试者。在一些实施方案中，药物组合物可以通过对受试者进行腹膜内注射、肌内注射、皮下注射或静脉内注射来施用。在一些实施方案中，药物组合物可以肠胃外、静脉内、肌内或经口施用。

在一些实施方案中，用于基因修饰的药物组合物包含另外的治疗剂。该另外的治疗剂可以调节要治疗的疾病、病症或疾患的不同方面并且提供比单独治疗剂的施用更大的总体益处。治疗剂包括但不限于化疗剂、放射性治疗剂、激素治疗剂和/或免疫治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂可以是放射性治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂可以是激素治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂可以是免疫治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂是化疗剂。另外的治疗剂的制备和给药方案可以根据制造商的说明书来使用或如由技术人员根据经验确定来使用。

脂质纳米颗粒(LNP)组合物

本文所述的用于基因修饰的药物组合物可以被包封在脂质纳米颗粒(LNP)中。如本文所用，“脂质纳米颗粒(LNP)组合物”或“纳米颗粒组合物”是包含一种或多种所描述的脂质的组合物。如本文所考虑的LNP组合物或制剂的尺寸通常为微米或更小数量级，并且可以包含脂质双层。纳米颗粒组合物涵盖脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体(例如，脂质囊泡)和脂质复合物。例如，如本文所考虑的纳米颗粒组合物或制剂可以是具有直径为500nm或更小的脂质双层的脂质体。如本文所述的LNP的平均直径可以为约1nm至约2500nm、约10nm至约1500nm、约20nm至约1000nm、约30nm至约150nm、约40nm至约150nm、约50nm至约150nm、约60nm至约130nm、约50nm至90nm、约55nm至85nm、约55nm至75nm、约50nm至约80nm、约60nm至约80nm、约70nm至约110nm、约70nm至约100nm、约80nm至约100nm、约90nm至约100nm、约70至约90nm、约80nm至约90nm，或约70nm至约80nm。本文所述的LNP的平均直径可以为约30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm、150nm或更大。在一个实施方案中，LNP的平均直径为约70nm+/-20nm、70nm+/-10nm、70nm+/-5nm。本文所述的LNP可以是基本上无毒的。

脂质纳米颗粒(LNP)使用非病毒药物递送机制，其能够穿过血管并到达肝细胞[Am.J.Pathol.2010年,176,14–21]。载脂蛋白E(ApoE)蛋白能够在PEG-脂质在血流中从带接近中性电荷的LNP表面扩散后与LNP结合，从而起到针对表达低密度脂蛋白受体(LDLr)的肝细胞的内源性配体的作用[Mol.Ther.,2010年,18,1357–1364.]。控制LNP的高效肝递送包括：1)在血清中从LNP表面的有效PEG-脂质脱落，2)ApoE与LNP的结合。内源性ApoE介导的LDLr依赖性LNP递送途径是在LDLr缺乏的患者群体中实现基于LNP的肝基因递送的不可用的或不太有效的路径。

高效递送至细胞需要特异性靶向和免遭细胞外环境(特别是血清蛋白)的实质性保护。实现特异性靶向的一种方法是将靶向部分与活性剂或药物效应物(诸如核酸剂)缀合，从而根据靶向部分的特异性将活性剂或药物效应物引导到特定细胞或组织。靶向部分可以改进递送的一种方式是通过受体介导的内吞活性。这种摄取机制涉及通过膜结构的内陷或通过递送系统与细胞膜的融合，将与膜受体结合的核酸剂移动到被膜包围的区域的内部中。这种过程是通过特异性配体与受体结合后细胞表面或膜受体的激活而开始的。受体介导的内吞系统包括识别糖(诸如半乳糖、甘露糖、甘露糖-6-磷酸)、肽和蛋白质(诸如转铁蛋白、去唾液酸糖蛋白、维生素B12、胰岛素和表皮生长因子(EGF))的那些系统。亲脂性部分(诸如胆固醇或脂肪酸)在附接到高度亲水性分子(诸如核酸)时，可以显著增强血浆蛋白结合，并从而增强循环半衰期。亲脂性缀合物还可以与靶向配体组合使用，以改进靶向递送方法的细胞内交易(trafficking)。

去唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)是一种在肝细胞上含量丰富的高容量受体。ASGP-R对N-乙酰基-D-半乳糖胺(GalNAc)的亲和力比D-Gal高50倍。包含受体靶向缀合物的LNP可用于促进本文所述的药物物质的靶向递送。LNP可以包含在颗粒的表面或周围上呈指定或工程化的表面密度(范围从相对低至相对高的表面密度)的一种或多种受体靶向部分。受体靶向缀合物可以包含靶向部分(或配体)、接头和与靶向部分连接的亲脂性部分。在一些实施方案中，受体靶向部分(或配体)靶向凝集素受体。在一些实施方案中，凝集素受体是去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。在一些实施方案中，受体靶向部分是靶向ASGPR的GalNAc或衍生物GalNAc。在一方面，受体靶向缀合物包含一个GalNAc部分或其衍生物。在另一方面，受体靶向缀合物包含两个不同的GalNAc部分或其衍生物。在另一方面，受体靶向缀合物包含三个不同的GalNAc部分或其衍生物。在另一方面，受体靶向缀合物是亲脂性的。在一些实施方案中，受体靶向缀合物包含一个或多个GalNAc部分和一个或多个脂质部分，即GalNAc-脂质。在一些实施方案中，受体靶向缀合物是GalNAc-脂质。

本文描述了(i)包含氨基脂质、磷脂、PEG脂质、胆固醇或其衍生物、有效载荷或者它们的任何组合的LNP组合物，以及(ii)包含氨基脂质、磷脂、PEG-脂质、胆固醇、GalNAc-脂质或其衍生物、有效载荷或者它们的任何组合的LNP组合物。下文更详细地描述每种组分。

在包含赋形剂氨基脂质、磷脂、PEG-脂质和胆固醇的LNP组合物的制备中，将所需摩尔比的四种赋形剂溶解于水混溶性有机溶剂(例如乙醇)中。然后将均质脂质溶液与酸性pH范围为4至6.5的含有核酸有效载荷的水性缓冲液快速在线混合，以形成包封一种或多种核酸有效载荷的脂质纳米颗粒(LNP)。在快速在线混合之后，由此形成的LNP经历包括浓缩和缓冲液交换在内的进一步的下游加工，以得到接近中性pH的最终LNP药物组合物，用于施用到用于进行评价的细胞系或动物疾病模型中或用于施用于人受试者。

为了制备GalNAc-LNP药物组合物，在制备GalNAc-LNP之前，将GalNAc-脂质与四种脂质赋形剂在水混溶性有机溶剂中混合。然后按照与针对LNP药物组合物所述的步骤相同的步骤制备GalNAc-LNP药物组合物。GalNAc-LNP配制物中GalNAc-脂质的mol％范围为总赋形剂的0.001至2.0。

对于LNP和GalNAc-LNP配制物二者，有效载荷包含靶向TTR基因的指导RNA和编码碱基编辑器蛋白的mRNA。在一些实施方案中，酸性水性缓冲液中和最终制剂中的指导RNA与mRNA之比为按重量计6:1、5:1、4:1、3:1、2.5:1、2:1、1.5:1、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:5，或1:6。在一些实施方案中，所述mRNA编码腺苷碱基编辑器蛋白。在一些其他实施方案中，所述mRNA编码胞嘧啶或胞苷碱基编辑器蛋白。

在一些实施方案中，LNP组合物可以如2021年3月4日提交的名称为“COMPOSITIONSAND METHODS FOR TARGETED RNA DELIVERY”的美国专利申请号17/192,709(其要求美国临时专利申请号62/984,866(2020年3月4日提交)和63/078,982(2020年9月16日提交)的权益，指定Kallanthottathil G.Rajeev为发明人，Verve Therapeutics,Inc.为申请人)中所述来制备，该申请全文据此以引用方式并入本文。

氨基脂质

式(I)

在一些实施方案中，LNP组合物包含氨基脂质。在一方面，本文公开了具有式(I)结构的氨基脂质或者其药学上可接受的盐或溶剂合物，

其中

R¹和R²中的每一个均独立地是C₃-C₂₂烷基、C₃-C₂₂烯基、C₃-C₈环烷基、-C₂-C₁₀亚烷基-L-R⁶，或其中烷基、亚烷基、烯基和环烷基中的每一个均独立地是经取代或未经取代的；

X、Y和Z中的每一个均独立地是-C(＝O)NR⁴-、-NR⁴C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR⁴C(＝O)O-、-OC(＝O)NR⁴-、-NR⁴C(＝O)NR⁴-、-NR⁴C(＝NR⁴)NR⁴-、-C(＝S)NR⁴-、-NR⁴C(＝S)-、-C(＝O)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR⁴C(＝S)O-、-OC(＝S)NR⁴-、-NR⁴C(＝S)NR⁴-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR⁴C(＝O)S-、-SC(＝O)NR⁴-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR⁴C(＝S)S-、-SC(＝S)NR⁴-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR⁴C(＝S)S-、-SC(＝S)NR⁴-O、S，或键；

L中的每一个均独立地是-C(＝O)NR⁴-、-NR⁴C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-NR⁴C(＝O)O-、-OC(＝O)NR⁴-、-NR⁴C(＝O)NR⁴-、-NR⁴C(＝NR⁴)NR⁴-、-C(＝S)NR⁴-、-NR⁴C(＝S)-、-C(＝O)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR⁴C(＝S)O-、-OC(＝S)NR⁴-、-NR⁴C(＝S)NR⁴-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR⁴C(＝O)S-、-SC(＝O)NR⁴-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR⁴C(＝S)S-、-SC(＝S)NR⁴-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR⁴C(＝S)S-、-SC(＝S)NR⁴-、O、S、-C₁-C₁₀亚烷基-O-、-C₁-C₁₀亚烷基-C(＝O)O-、-C₁-C₁₀亚烷基-OC(＝O)-，或键，其中亚烷基是经取代或未经取代的；

R³是-C₀-C₁₀亚烷基-NR⁷R⁸、-C₀-C₁₀亚烷基-杂环烷基，或-C₀-C₁₀亚烷基-杂环芳基，其中亚烷基、杂环烷基和杂环芳基独立地是经取代或未经取代的；R⁴中的每一个均独立地是氢或者经取代或未经取代的C₁-C₆烷基；

R⁵是氢或者经取代或未经取代的C₁-C₆烷基；

R⁶中的每一个均独立地是经取代或未经取代的C₃-C₂₂烷基或者经取代或未经取代的C₃-C₂₂烯基；

R⁷和R⁸中的每一个均独立地是氢或者经取代或未经取代的C₁-C₆烷基，或R⁷和R⁸与它们所附接的氮一起形成经取代或未经取代的C₂-C₆杂环基；

p是选自1至10的整数；以及

n、m和q中的每一个均独立地是0、1、2、3、4或5。

在式(I)的一些实施方案中，如果该结构携带多于一个不对称C原子，则每个不对称C原子均独立地表示外消旋、手性纯R和/或手性纯S异构体，或它们的组合。

在一些实施方案中，式(I)中的n、in和q中的每一个均独立地是0、1、2或3。在一些实施方案中，式(I)中的n、m和q中的每一个均是1。

式(Ia)

在一些实施方案中，式(1)的化合物具有式(Ia)或其药学上可接受的盐或其药学上可接受的溶剂合物的结构：

其中

R¹和R²中的每一个均独立地是C₃-C₂₂烷基、C₃-C₂₂烯基、C₃-C₈环烷基、-C₂-C₁₀亚烷基-L-R⁶，或其中烷基、亚烷基、烯基和环烷基中的每一个均独立地是经取代或未经取代的；

X、Y和Z中的每一个均独立地是C(＝O)NR⁴-、-NR⁴C(D)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR⁴C(＝O)O-、-OC(＝O)NR⁴-、-NR⁴C＝O)NR⁴-、-NR⁴C(＝NR⁴)NR⁴-、-C(＝S)NR⁴-、-NR⁴C(＝S)-、-C(E)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR⁴C(＝S)O-、-OC(＝S)NR⁴-、-NR⁴C(＝S)NR⁴-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR⁴C(＝O)S-、-SC(＝O)NR⁴--C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR⁴C(＝S)S-、-SC(＝S)NR⁴-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR⁴C(＝S)S-、-SC(＝S)NR⁴-、O、S、-C₁-C₁₀亚烷基-O-，或键，其中亚烷基是经取代或未经取代的；

L中的每一个均独立地是-C(＝O)NR⁴-、-NR⁴C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR⁴C(＝O)O-、-OC(＝O)NR⁴-、-NR⁴C(＝O)NR⁴-、-NR⁴C(＝NR⁴)NR⁴-、-C(＝S)NR⁴-、-NR⁴C(＝S)-、-C(＝O)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR⁴C(＝S)O-、-OC(＝S)NR⁴-、-NR⁴C(＝S)NR⁴-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR⁴C(＝O)S-、-SC(＝O)NR⁴--C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR⁴C(＝S)S-、-SC(＝S)NR⁴-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR⁴C(＝S)S-、-SC(＝S)NR⁴-、O、S、-C₁-C₁₀亚烷基-O-、-C₁-C₁₀亚烷基-C(＝O)O-、-C₁-C₁₀亚烷基-OC(＝O)-，或键，其中亚烷基是经取代或未经取代的；

R³是-C₀-C₁₀亚烷基-NR⁷R⁸、-C₀-C₁₀亚烷基-杂环烷基，或-C₀-C₁₀亚烷基-杂环芳基(heterocyclowyl)，其中亚烷基、杂环烷基和杂环芳基独立地是经取代或未经取代的；

R⁴中的每一个均独立地是氢或者经取代或未经取代的C₁-C₆烷基；

R⁵是氢或者经取代或未经取代的C₁-C₆烷基；

R⁶中的每一个均独立地是经取代或未经取代的C₃-C₂₂烷基或者经取代或未经取代的C₃-C₂₂烯基；

R⁷和R⁸中的每一个均独立地是氢或者经取代或未经取代的C₁-C₆烷基，或R⁷和R⁸与它们所附接的氮一起形成经取代或未经取代的C₂-C₆杂环基；以及

p是选自1至10的整数。

在式(Ia)的一些实施方案中，如果该结构携带多于一个不对称C原子，则每个不对称C原子独立地表示外消旋、手性纯R和/或手性纯S异构体，或它们的组合。

式(I)和(Ia)的变体

在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R¹和R²独立地是C₃-C₂₂烷基、C₃-C₂₂烯基、-C₂-C₁₀亚烷基-L-R⁶，或其中烷基、亚烷基、烯基和环烷基中的每一个均独立地是经取代或未经取代的。在一些实施方案中，式(I)和式(la)中的R¹和R²独立地是C₁₀-C₂₀烷基、C₁₀-C₂₀烯基、-C₈-C₇亚烷基-L-R⁶，或其中烷基、亚烷基、烯基和环烷基中的每一个均独立地是经取代或未经取代的。在一些实施方案中，式(I)和式(la)中的R¹是

在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的L中的每一个均独立地是O、S、-C₁-C₁₀亚烷基-O-、-C₁-C₁₀亚烷基-C(＝O)O-、-C₁-C₁₀亚烷基-OC(＝O)-，或键，其中亚烷基是经取代或未经取代的。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的L中的每一个均独立地是O、S、-C₁-C₃亚烷基-O-、-C₁-C₃亚烷基-C(＝O)O-、-C₁-C₃亚烷基-OC(＝O)-，或键，其中亚烷基是经取代或未经取代的。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的L中的每一个均独立地是O、S、-C₁-C₃亚烷基-O-、-C₁-C₃亚烷基-C(＝O)O-、-C₁-C₃亚烷基-OC(＝O)-，或键，其中亚烷基是直链或支链的未经取代的亚烷基。

在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R⁶中的每一个均独立地是经取代或未经取代的直链C₃-C₂₂烷基或者经取代或未经取代的直链C₃-C₂₂烯基。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R⁶中的每一个均独立地是经取代或未经取代的C₃-C₂₀烷基或者经取代或未经取代的C₃-C₂₀烯基。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R⁶中的每一个均独立地是经取代或未经取代的C₃-C₁₀烷基或者经取代或未经取代的C₃-C₁₀烯基。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R⁶中的每一个均独立地是经取代或未经取代的C₃-C₁₀烷基。在一些实施方案中，式(I)和式(la)中的R⁶中的每一个均独立地是经取代或未经取代的直链C₃-C₁₀烷基。在一些实施方案中，式(I)和式(la)中的R⁶中的每一个均独立地是经取代或未经取代的正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基，或正十二烷基。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R⁶中的每一个均独立地是经取代或未经取代的正辛基。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R⁶中的每一个均是正辛基。

在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的L中的每一个均独立地是-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C₁-C₁₀亚烷基-O-，或O。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的L中的每一个均是O。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的L中的每一个均是-C₁-C₃亚烷基-O-。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的p是1、2、3、4或5。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的p是2。

在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R¹是

在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R¹是R²。

在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R⁴中的每一个均独立地是H或者经取代或未经取代的C₁-C₄烷基。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R⁴中的每一个均独立地是经取代或未经取代的直链C₁-C₄烷基。在一些实施方案中，式(1)和式(la)中的R⁴中的每一个均是H。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R⁴中的每一个均独立地是H、-CH₃、-CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₃，或-CH(CH₃)₂。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R⁴中的每一个均独立地是H或-CH3。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R⁴中的每一个均是-CH₃。

在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的X是-C(＝O)O-或-OC(＝O))-。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的X是-C(＝O)NR⁴-或-NR⁴C(＝O)-。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的X是-C(＝O)N(CH₃)-、-N(CH₃)C(＝O)-、-C(＝O)NH-，或-NHC(＝O)-。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的X是-C(＝O))NH-、-C(＝O)N(CH₃)-、-OC(＝O))-、-NHC(＝O)-、-N(CH₃)C(＝O))-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-NHC(＝O)O-、-N(CH₃)C(＝O)O-、-OC(＝O))NH-、-OC(＝O)N(CH₃)-、-NHC(＝O)NH-、-N(CH₃)C(＝O))NH-、-NHC(＝O)N(CH₃)-、-N(CH₃)C(＝O)N(CH₃)-、NHC(＝NH)NH-、-N(CH₃)C(＝NH)NH-、-NHC(＝NH)N(CH₃)-、-N(CH₃)C(＝NH)N(CH₃)-、NHC(＝NMe)NH-、-N(CH₃)C(＝NMe)NH-、-NHC(＝NMe)N(CH₃)-，或-N(CH₃)C(＝NMe)N(CH₃)-。

在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R²是C₃-C₂₂烷基、C₃-C₂₂烯基、-C₂-C₁₀亚烷基-L-R⁶，或其中烷基、亚烷基、烯基或环烷基中的每一个均独立地是经取代或未经取代的。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R²是经取代或未经取代的C₇-C₂₂烷基或者经取代或未经取代的C₃-C₂₂烯基。在一些实施方案中，式(I)和式(la)中的R²是经取代或未经取代的直链C₇-C₂₂烷基或者经取代或未经取代的直链C₃-C₂₂烯基。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R²是经取代或未经取代的C₁₀-C₂₀烷基或者经取代或未经取代的C₁₀-C₂₀烯基。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R²是未经取代的C₁₀-C₂₀烷基。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R²是未经取代的C₁₀-C₂₀烯基。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R²是-C₂-C₁₀亚烷基-L-R⁶。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R²是-C₂-C₁₀亚烷基-C(＝O)O-R⁶或-C₂-C₁₀亚烷基-OC(＝O)-R⁶。

在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R²是

在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R¹是R¹。

在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的Y是-C(＝O)O-或-OC(＝O)-。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的Y是-C(＝O)NR⁴-或-NR⁴C(＝O)-。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的Y是-C(＝O)N(CH₃)-、-N(CH₃)C(＝O)-、-C(＝O)NH-，或-NHC(＝O)-。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的Y是-OC(＝O)O-、-NR⁴C(＝O)O-、-OC(＝O)NR⁴-，或-NR⁴C(＝O)NR⁴-。在一些实施方案中，式(I)和式(la)中的Y是-OC(＝O)O-、-NHC(＝O)O-、-OC(＝O)NH-、-NHC(＝O)NH-、-N(CH₃)C(＝O)O-、-OC(＝O)N(CH₃)-、-N(CH₃)C(＝O)N(CH₃)-或-N(CH₃)C(＝O)NH-。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的Y是-OC(＝O)O-、-NHC(＝O)0-、-OC(＝O)NH-，或-NHC(＝O)NH-。

在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R³是-C₀-C₁₀亚烷基-NR⁷R⁸或-C₀-C₁₀亚烷基-杂环烷基，其中亚烷基和杂环烷基独立地是经取代或未经取代的。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R³是-C₀-C₁₀亚烷基-NR⁷R⁸。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R³是-C₁-C₆亚烷基-NR⁷R⁸。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R³是-C₁-C₄亚烷基-NR⁷R⁸。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R³是-C₁-亚烷基-NR⁷R⁸。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R³是-C₂--亚烷基-NR⁷R⁸。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R³是-C₃-亚烷基-NR⁷R⁸。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R³是-C₄-亚烷基-NR⁷R⁸。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R³是-C₅-亚烷基-NR⁷R⁸。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R³是-C₀-C₁₀亚烷基-杂环烷基。在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R³是-C₁-C₆亚烷基-杂环烷基，其中杂环烷基包含1至3个氮和0至2个氧。在一些实施方案中，式(I)和式(la)中的R³是-C₁-C₆亚烷基-杂环芳基。

在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R⁷和R⁸中的每一个均独立地是氢或者经取代或未经取代的C₁-C₆烷基。在一些实施方案中，R⁷和R⁸中的每一个均独立地是氢或者经取代或未经取代的C₁-C₃烷基。在一些实施方案中，R⁷和R⁸中的每一个均独立地是经取代或未经取代的C₁-C₃烷基。在一些实施方案中，R⁷和R⁸中每一个均独立地是-CH₃、-CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₃，或-CH(CH₃)₂。在一些实施方案中，R和R⁸中的每一个均是CH₃。在一些实施方案中，R⁷和R⁸中的每一个均是-CH₂CH₃。

在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R⁷和R⁸与它们所附接的氮一起形成经取代或未经取代的C2-C6杂环基。在一些实施方案中，R⁷和R⁸与它们所附接的氮一起形成经取代或未经取代的C₂-C₆杂环烷基。在一些实施方案中，R⁷和R⁸与它们所附接的氮一起形成经取代或未经取代的3至7元杂环烷基。

在一些实施方案中，式(I)和式(la)中的R³是

在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R³是

在一些实施方案中，式(1)和式(la)中的R³是

在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的Z是-C(＝O)O-或-OC(＝O)-。

在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的Z是-C(＝O)NR⁴-或-NR⁴C(＝O)-。

在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的Z是-C(＝O)N(CH₃)-、-N(CH₃)C(＝O)-、-C(＝O)NH-，或-NHC(＝O)-。

在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的Z是-OC(＝O)O-、-NR⁴C(＝O)O-、-OC(O)NR⁴-，或-NR⁴C(＝O)NR⁴-。

在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的Z是-OC(＝O)O-、-NHC(＝O)O-、-OC(＝O)NH-、-NHC(＝O)NH-、-N(CH₃)C(＝O)O-、-OC(＝O)N(CH₃)-、-N(CH₃)C(＝O)N(CH₃)-、-NHC(＝O)N(CH₃)-或-N(CH₃)C(＝O)NH-。

在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的Y是-OC(＝O)O-、-NHC(＝O)O-、-OC(＝O)NH-，或-NHC(＝O)NH-。

在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R⁵是氢或者经取代或未经取代的C₁-C₃烷基。

在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R⁵是H、-CH₃、-CH-)CH₃、-CH₂CH₂CH₃，或-CH(CH₃)₂。

在一些实施方案中，式(I)和式(Ia)中的R⁵是H。

包含不同氨基脂质的LNP组合物

在一些实施方案中，LNP包含多种具有不同式的氨基脂质。例如，LNP组合物可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种氨基脂质。又例如，LNP组合物可以包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少9种、至少10种或至少20种氨基脂质。再例如，LNP组合物可以包含至多2种、至多3种、至多4种、至多5种、至多6种、至多7种、至多9种、至多10种、至多20种或至多30种氨基脂质。

在一些实施方案中，LNP组合物包含第一氨基脂质。在一些实施方案中，LNP组合物包含第一氨基脂质和第二氨基脂质。在一些实施方案中，LNP组合物包含第一氨基脂质、第二氨基脂质和第三氨基脂质。在一些实施方案中，LNP组合物包含第一氨基脂质、第二氨基脂质、第三氨基脂质和第四氨基脂质。在一些实施方案中，LNP组合物不包含第四氨基脂质。在一些实施方案中，LNP组合物不包含第三氨基脂质。在一些实施方案中，第一氨基脂质与第二氨基脂质的摩尔比为约0.1至约10。在一些实施方案中，第一氨基脂质与第二氨基脂质的摩尔比为约0.20至约5。在一些实施方案中，第一氨基脂质与第二氨基脂质的摩尔比为约0.25至约4。在一些实施方案中，第一氨基脂质与第二氨基脂质的摩尔比为约0.25、约0.33、约0.5、约1、约2、约3或约4。

在一些实施方案中，第一氨基脂质:第二氨基脂质:第三氨基脂质的摩尔比为约4:1:1。在一些实施方案中，第一氨基脂质:第二氨基脂质:第三氨基脂质的摩尔比为约1:1:1。在一些实施方案中，第一氨基脂质:第二氨基脂质:第三氨基脂质的摩尔比为约2:1:1。在一些实施方案中，第一氨基脂质:第二氨基脂质:第三氨基脂质的摩尔比为约2:2:1。在一些实施方案中，第一氨基脂质:第二氨基脂质:第三氨基脂质的摩尔比为约3:2:1。在一些实施方案中，第一氨基脂质:第二氨基脂质:第三氨基脂质的摩尔比为约3:1:1。在一些实施方案中，第一氨基脂质:第二氨基脂质:第三氨基脂质的摩尔比为约5:1:1。在一些实施方案中，第一氨基脂质:第二氨基脂质:第三氨基脂质的摩尔比为约3:3:1。在一些实施方案中，第一氨基脂质:第二氨基脂质:第三氨基脂质的摩尔比为约4:4:1。

另外的氨基脂质实施方案

在一些实施方案中，LNP组合物包含一种或多种氨基脂质。在一些实施方案中，该一种或多种氨基脂质占颗粒中存在的总脂质的约40mol％至约65mol％。在一些实施方案中，该一种或多种氨基脂质占颗粒中存在的总脂质的约40mol％、约41mol％、约42mol％、约43mol％、约44mol％、约45mol％、约46mol％、约47mol％、约48mol％、约49mol％、约50mol％、约51mol％、约52mol％、约53mol％、约54mol％、约55mol％、约56mol％、约57mol％、约58mol％、约59mol％、约60mol％、约61mol％、约62mol％、约63mol％、约64mol％，或约65mol％。在一些实施方案中，第一氨基脂质占颗粒中存在的总氨基脂质的约1mol％至约99mol％。在一些实施方案中，第一氨基脂质占颗粒中存在的总氨基脂质的约16.7mol％至约66.7mol％。在一些实施方案中，第一氨基脂质占颗粒中存在的总氨基脂质的约20mol％至约60mol％。

在一些实施方案中，氨基脂质是可电离脂质。可电离脂质可以包含一个或多个可电离氮原子。在一些实施方案中，该一个或多个可电离氮原子中的至少一个带正电荷。在一些实施方案中，LNP组合物中至少10mol％、20mol％、30mol％、40mol％、50mol％、60mol％、70mol％、80mol％、90mol％、95mol％，或99mol％的可电离氮原子带正电荷。在一些实施方案中，氨基脂质包含伯胺、仲胺、叔胺、亚胺、酰胺、胍部分、组氨酸残基、赖氨酸残基、精氨酸残基或它们的任何组合。在一些实施方案中，氨基脂质包含伯胺、仲胺、叔胺、胍部分或它们的任何组合。在一些实施方案中，氨基脂质包含叔胺。

在一些实施方案中，氨基脂质是阳离子脂质。在一些实施方案中，氨基脂质是可电离脂质。在一些实施方案中，氨基脂质包含一个或多个氮原子。在一些实施方案中，氨基脂质包含一个或多个可电离氮原子。示例性的阳离子且/或可电离的脂质包括但不限于3-(双十二烷基氨基)-N1,N1,4-三(十二烷基)-l-哌嗪乙胺(KL10)、N142-(双十二烷基氨基)乙基]-N1,N4,N4-三(十二烷基)-1,4-哌嗪二乙胺(KL22)、14,25-双十三烷基-15,18,21,24-四氮杂-三十八烷(KL25)、1,2-二亚油酰氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLin-DMA)、2,2-二亚油酰基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-K-DMA)、三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC 3-DMA)、2,2-二亚油酰基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)、1,2-二油酰氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DODMA)、2-({8-[(3β)-胆甾基-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八烷基-9,12-二烯-l-基氧基]丙-l-胺(辛基-CLinDMA)、(2R)-2-({8-[(3β)-胆甾基-5-烯基-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八烷基-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA(2R))、和(2S)-2-({8-[(3β)-胆甾基-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八烷基-9,12-二烯-l-基氧基]丙-l-胺(辛基-CLinDMA(2S))。

在一些实施方案中，本文所述的氨基脂质可以采取盐，例如药学上可接受的盐的形式。本公开涵盖氨基脂质的所有药学上可接受的盐。如本文所用，术语“氨基脂质”还包括它的药学上可接受的盐及它的非对映异构体、对映异构体和差向异构体形式。

在一些实施方案中，本文所述的氨基脂质具有一个或多个立构中心并且每个立构中心独立地以R或S构型存在。本文提出的脂质包括所有非对映异构体、对映异构体和差向异构体形式以及它们的适当的混合物。本文提供的脂质包括所有顺式(cis)、反式(trans)、同侧(syn)、反侧(anti)、entgegen(E)和zusammen(Z)异构体及它们的适当的混合物。在某些实施方案中，本文所述的脂质通过以下步骤来制备成其单独的立体异构体：使化合物的外消旋混合物与光学活性拆分剂反应以形成一对非对映异构体化合物/盐，分离非对映异构体并回收光学纯的对映异构体。在一些实施方案中，使用本文所述的化合物的共价非对映异构体衍生物进行对映异构体的拆分。在另一个实施方案中，通过基于溶解度差异的分离/拆分技术来分离非对映异构体。在其他实施方案中，通过色谱法或者通过形成非对映异构体盐并通过重结晶或色谱法或其任何组合分离来进行立体异构体的分离。JeanJacques,Andre Collet,Samuel H.Wilen,"Enantiomers,Racemates and Resolutions",John Wiley and Sons,Inc.,1981年。在一方面，通过立体选择性合成获得立体异构体。

在一些实施方案中，基于本文公开的结构，脂质(诸如氨基脂质)是经取代的。在一些实施方案中，脂质(诸如氨基脂质)是未经取代的。在另一个实施方案中，本文所述的脂质被同位素标记(例如，用放射性同位素)或通过另外的其他方式(包括但不限于使用发色团或荧光部分、生物发光标记或化学发光标记)来标记。

本文所述的脂质包括同位素标记的化合物，其与本文呈现的各种式和结构中列举的那些化合物同一，但事实上一个或多个原子被具有与通常在自然界中发现的原子质量或质量数不同的原子质量或质量数的原子替代。可掺入本发明的脂质中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、硫、氟和氯的同位素，诸如例如²H、³H、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁸O、¹⁷O、³⁵S、¹⁸F、³⁶Cl。在一方面，本文所述的同位素标记的脂质，例如掺有放射性同位素(诸如³H和¹⁴C)的那些脂质，可用于药物和/或底物组织分布测定中。在一方面，用同位素(诸如氘)取代提供了由于更大的代谢稳定性而产生的某些治疗优势，诸如例如体内半衰期增加或剂量需求减少。

在一些实施方案中，氨基脂质的不对称碳原子以对映异构体富集的形式存在。在某些实施方案中，氨基脂质的不对称碳原子在(S)-或(R)-构型中具有至少50％对映异构体过量、至少60％对映异构体过量、至少70％对映异构体过量、至少80％对映异构体过量、至少90％对映异构体过量、至少95％对映异构体过量，或至少99％对映异构体过量。

在一些实施方案中，所公开的氨基脂质可以转化为N-氧化物。在一些实施方案中，通过用氧化剂(例如，3-氯过氧苯甲酸和/或过氧化氢)处理来形成N-氧化物。因此，本文公开了所描述的氨基脂质的N-氧化物化合物，其在化合价和结构允许时可以被指定为NO或N⁺-O^-。在一些实施方案中，本公开的化合物中的氮可以被转化为N-羟基或N-烷氧基。例如，可以通过用氧化剂(诸如ra-CPBA)氧化母体胺来制备N-羟基化合物。还考虑了所有所示的含氮化合物。因此，本文还公开了所描述的氨基脂质的N-羟基和N-烷氧基(例如N-OR，其中R是经取代或未经取代的C₁-C₆烷基、C₁-C₆烯基、C₁-C₆炔基、3至14元碳环或3至14元杂环)衍生物。

在一些实施方案中，该一种或多种氨基脂质占颗粒中存在的总脂质的约40mol％至约65mol％。

PEG-脂质

在一些实施方案中，所述LNP组合物包含一种或多种PEG-脂质。如本文所用，“PEG脂质”或“PEG-脂质”是指包含聚乙二醇组分的脂质。合适的PEG-脂质的实例还包括但不限于经PEG-修饰的磷脂酰乙醇胺、经PEG-修饰的磷脂酸、经PEG-修饰的神经酰胺、经PEG-修饰的二烷基胺、PEG-修饰的二酰基甘油、经PEG-修饰的二烷基甘油及它们的混合物。例如，该一种或多种PEG-脂质可以包括PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC、PEG-DSPE脂质或它们的组合。

在一些实施方案中，PEG-脂质占颗粒中存在的总脂质的约0.1mol％至约10mol％。

磷脂

在一些实施方案中，所描述的LNP组合物包含一种或多种磷脂。

在一些实施方案中，磷脂占颗粒中存在的总脂质的约5mol％至约15mol％。

胆固醇

在一些实施方案中，LNP组合物包含胆固醇或其衍生物。

GalNAc-脂质

在一些实施方案中，LNP组合物包含受体靶向缀合物，该受体靶向缀合物包含式(V)化合物，

其中，

多个A基团共同地包含受体靶向配体；

每个L¹、L²、L³、L⁴、L⁵、L⁶、L⁷、L⁸、L⁹、L¹⁰和L¹²均独立地是经取代或未经取代的C₁-C₁₂亚烷基、经取代或未经取代的C₁-C₁₂杂亚烷基、经取代或未经取代的C₂-C₁₂亚烯基、经取代或未经取代的C₂-C₁₂亚炔基、-(CH₂CH₂O)_m-、-(OCH₂CH₂)_m-、-O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)₂-、-S(＝O)(＝NR¹)-、-C(＝O)-、-C(＝N-OR¹)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)C(＝O)-、-C(＝O)NR¹-、-NR¹C(＝O)-、-OC(＝O)NR¹-、-NR¹C(＝O)O-、-NR¹C(＝O)NR¹-、-C(＝O)NR¹C(＝O)-、-S(＝O)₂NR¹-、-NR¹S(＝O)₂-、-NR¹-，或-N(OR¹)-；

L¹¹是经取代或未经取代的-(CH₂CH₂O)_n-、经取代或未经取代的-(OCH₂CH₂)_n-或者经取代或未经取代的–(CH₂)_n-；

每个R¹均独立地是H或者经取代或未经取代的C₁-C₆烷基；

R是脂质、核酸、氨基酸、蛋白质或脂质纳米颗粒；

m是选自1至10的整数；以及

n是选自1至200的整数。

在一些实施方案中，每个L¹、L⁴和L⁷均独立地是经取代或未经取代的C₁-C₁₂亚烷基。在一些实施方案中，每个L¹、L⁴和L⁷均独立地是经取代或未经取代的C₂-C₆亚烷基。在一些实施方案中，每个L¹、L⁴和L⁷均是C₄亚烷基。在一些实施方案中，每个L²、L⁵和L⁸均独立地是-C(＝O)NR¹-、-NR¹C(＝O)-、-OC(＝O)NR¹-、-NR¹C(＝O)O-、-NR1C(＝O)NR¹-，或-C(＝O)NR¹C(＝O)-。在一些实施方案中，每个L²、L⁵和L⁸均独立地是-C(＝O)NR¹-或-NR¹C(＝O)-。在一些实施方案中，每个L²、L⁵和L⁸均是-C(＝O)NH-。在一些实施方案中，每个L³、L⁶和L⁹均独立地是经取代或未经取代的C₁-C₁₂亚烷基。在一些实施方案中，每个L³均是经取代或未经取代的C₂-C₆亚烷基。在一些实施方案中，L³是C₄亚烷基。在一些实施方案中，每个L⁶和L⁹均独立地是经取代或未经取代的C₂-C₁₀亚烷基。在一些实施方案中，每个L⁶和L⁹均独立地是经取代或未经取代的C₂-C₆亚烷基。在一些实施方案中，每个L⁶和L⁹均是C₃亚烷基。在一些实施方案中，A与凝集素结合。在一些实施方案中，凝集素是去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。在一些实施方案中，A是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或其衍生物。A是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或其衍生物。

在一些实施方案中，受体靶向缀合物占纳米颗粒组合物中存在的总脂质含量的约0.001mol％至约20mol％。

磷酸酯电荷中和剂(Phosphate charge neutralizer)

在一些实施方案中，本文所述的LNP包含磷酸酯电荷中和剂。在一些实施方案中，磷酸酯电荷中和剂包括精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、组氨酸、阳离子树枝状聚合物、聚胺或它们的组合。在一些实施方案中，磷酸酯电荷中和剂包含一个或多个氮原子。在一些实施方案中，磷酸酯电荷中和剂包括聚胺。

待用于下文阐述的LNP制剂中的合适的磷酸酯电荷中和剂例如包括但不限于亚精胺和1,3-丙二胺。

抗氧化剂

在一些实施方案中，本文所述的LNP包含一种或多种抗氧化剂。在一些实施方案中，该一种或多种抗氧化剂起到减少阳离子脂质、有效载荷或二者的降解的作用。在一些实施方案中，该一种或多种抗氧化剂包括亲水性抗氧化剂。在一些实施方案中，该一种或多种抗氧化剂是螯合剂，诸如乙二胺四乙酸(EDTA)和柠檬酸盐。在一些实施方案中，该一种或多种抗氧化剂包括亲脂性抗氧化剂。在一些实施方案中，该亲脂性抗氧化剂包括维生素E异构体或多酚。在一些实施方案中，该一种或多种抗氧化剂以至少1mM、至少10mM、至少20mM、至少50mM或至少100mM的浓度存在于LNP组合物中。在一些实施方案中，该一种或多种抗氧化剂以约20mM的浓度存在于颗粒中。

其他脂质

在一些实施方案中，所公开的LNP组合物可以包含辅助脂质(helper lipid)。在一些实施方案中，所公开的LNP组合物包含中性脂质。在一些实施方案中，所公开的LNP组合物包含隐形脂质(stealth lipid)。在一些实施方案中，所公开的LNP组合物包含另外的脂质。中性脂质可以起到稳定和改进LNP加工的作用。

“辅助脂质”可以是指增强转染(例如，包含如本文提供的组合物(包括生物活性剂)的纳米颗粒(LNP)的转染)的脂质。辅助脂质增强转染的机制包括增强颗粒稳定性。在一些实施方案中，辅助脂质增强膜的促融合性(fusogenicity)。辅助脂质可以包括类固醇、固醇和烷基间苯二酚。适合用于本公开的辅助脂质可以包括但不限于胆固醇、5-十七烷基间苯二酚和胆固醇半琥珀酸酯。在一些实施方案中，辅助脂质是胆固醇。在一些实施方案中，辅助脂质可以是胆固醇半琥珀酸酯。

“隐形脂质”可以是指改变纳米颗粒可以在体内(例如，在血液中)存在的时间长度的脂质。隐形脂质可以通过例如减少颗粒聚集和控制颗粒尺寸来辅助配制过程。本文所用的隐形脂质可以调节LNP的药代动力学特性。适合用于本公开的脂质组合物的隐形脂质可以包括但不限于具有与脂质部分连接的亲水性头基的隐形脂质。适合用于本公开的脂质组合物的隐形脂质和关于此类脂质的生物化学的信息可以在Romberg等人,PharmaceuticalResearch,第25卷,第1期,2008年,第55-71页和I-Toekstra等人,Biochimica etBiophysica Acta 1660(2004年)41-52中找到。另外的合适PEG脂质公开在例如WO 2006/007712中。

在一些实施方案中，隐形脂质是PEG-脂质。在一个实施方案中，隐形脂质的亲水性头基包含聚合物部分，该聚合物部分选自基于PEG(有时被称为聚(环氧乙烷))、聚(噁唑啉)、聚(乙烯醇)、聚(甘油)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚氨基酸和聚N-(2-羟丙基)甲丙烯酰胺]的聚合物。隐形脂质可以包含脂质部分。在一些实施方案中，隐形脂质的脂质部分可衍生自二酰基甘油或二酰基甘油酰胺(diacylglycamide)，包括包含具有独立地包含约C4至约C40饱和或不饱和碳原子的烷基链长度的二烷基甘油或二烷基甘油酰胺基团的那些二酰基甘油或二酰基甘油酰胺，其中该链可以包含一个或多个官能团，诸如例如酰胺或酯。该二烷基甘油或二烷基甘油酰胺基团可以进一步包含一个或多个经取代的烷基。

辅助脂质、中性脂质、隐形脂质和/或其他脂质的结构和特性进一步描述在W02017173054A1、W02019067999A1、US20180290965A1、US20180147298A1、US20160375134A1、US8236770、US8021686、US8236770B2、US7371404B2、US7780983B2、US7858117B2、US20180200186A1、US20070087045A1、W02018119514A1和W02019067992A1中，所有这些文献全文据此以引用方式并入。

LNP制剂

本文描述了包含一种或多种所描述的脂质的纳米颗粒组合物的特定制剂。

所描述的纳米颗粒组合物能够将治疗剂(诸如RNA)递送至哺乳动物身体的特定细胞、组织、器官或系统或它们的组。可以改变纳米颗粒组合物的物理化学特性，以增加对特定身体靶标的选择性。例如，可以基于不同器官的开窗尺寸来调整颗粒尺寸。还可以基于一种或多种所需递送靶标来选择纳米颗粒组合物中包含的治疗剂。例如，治疗剂可以被选择用于特定适应症、疾患、疾病或病症和/或用于递送至特定细胞、组织、器官或系统或它们的组(例如，局部或特异性递送)。在某些实施方案中，纳米颗粒组合物可以包含编码目标多肽的mRNA，该mRNA能够在细胞内被翻译以产生目标多肽(例如，碱基编辑器)。此种组合物能够对特定器官或细胞类型具有特异性或亲和力，以促进药物物质递送至该特定器官或细胞类型，例如肝或肝细胞。

LNP组合物中治疗剂或药物物质(例如，编码碱基编辑器的mRNA和指导RNA)的量可以取决于纳米颗粒组合物的尺寸、组成、所需靶标和/或应用，或其他特性。例如，纳米颗粒组合物中包含的RNA的量可以取决于RNA的尺寸、序列和其他特征。纳米颗粒组合物中治疗剂和其他组成部分(例如，脂质)的相对量也可以变化。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物中脂质组分与治疗剂的wt/wt比可以为约5:1至约60:1，诸如约5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1和60:1。例如，脂质组分与治疗剂的wt/wt比可以为约10:1至约40:1。在某些实施方案中，wt/wt比为约20:1。纳米颗粒组合物中治疗剂的量可以使用吸收光谱法(例如，紫外-可见光谱法)来测量。

在一些实施方案中，LNP制剂包含一种或多种核酸，诸如RNA。在一些实施方案中，一种或多种RNA、脂质及其量可以被选择成提供特定的N/P比。该N/P比可以选自约1至约30。该N/P比可以选自约2至约12。在一些实施方案中，该N/P比为约0.1至约50。在一些实施方案中，该N/P比为约2至约8。在一些实施方案中，该N/P比为约2至约15、约2至约10、约2至约8、约2至约6、约3至约15、约3至约10、约3至约8、约3至约6、约4至约15、约4至约10、约4至约8，或约4至约6。在一些实施方案中，该N/P比为约2、约2.5、约3、约3.5、约4、约4.5、约5、约5.5、约6、约6.5、约7、约7.5、约8、约9，或约10。在一些实施方案中，该N/P比为约4至约6。在一些实施方案中，该NIP比为约4、约4.5、约5、约5.5，或约6。

如本文所用，“N/P比”是例如在包含脂质组分和RNA的纳米颗粒组合物中一种脂质(或多种脂质)中的可电离(例如，在生理pH范围内)氮原子与一种核酸分子实体(或多种核酸分子实体)中的磷酸酯基团的摩尔比。可电离氮原子可以包括例如可以在约pH 1、约pH2、约pH 3、约pH 4、约pH 4.5、约pH 5、约pH 5.5、约pH 6、约pH 6.5、约pH 7、约pH 7.5，或者约pH 8或更高下质子化的氮原子。生理pH范围可以包括例如不同细胞区室(诸如器官、组织和细胞)和体液(诸如血液、CSF、胃液、乳汁、胆汁、唾液、眼泪和尿)的pH范围。在某些具体实施方案中，生理pH范围是指哺乳动物血液的pH范围，例如约7.35至约7.45。类似地，对于具有一个或多个可电离氮原子的磷酸酯电荷中和剂，N/P比可以是指磷酸酯电荷中和剂中的可电离氮原子与核酸中的磷酸酯基团的摩尔比。在一些实施方案中，可电离氮原子是指在5至14之间的pH范围内可电离的那些氮原子。

对于不含磷酸酯基团的有效载荷，N/P比可以是指脂质中的可电离氮原子与有效载荷中的总负电荷的摩尔比。例如，LNP组合物的N/P比可以是指LNP组合物中的总可电离氮原子与组合物中存在的有效载荷中的总负电荷的摩尔比。

在一些实施方案中，形成具有范围为约50％至约70％、约70％至约90％，或约90％至约100％的平均包封效率(encapsulation efficiency)的LNP。在一些实施方案中，形成具有范围为约75％至约98％的平均包封效率的LNP。

在另一方面，本文提供了包含如本文提供的组合物的脂质纳米颗粒(LNP)。如本文所用，“脂质纳米颗粒(LNP)组合物”或“纳米颗粒组合物”是包含一种或多种所描述的脂质的组合物。LNP组合物的尺寸通常为微米或更小数量级，并且可以包含脂质双层。纳米颗粒组合物涵盖脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体(例如，脂质囊泡)和脂质复合物。在一些实施方案中，LNP是指直径小于1000nm、500nm、250nm、200nm、150nm、100nm、75nm、50nm或25nm的任何颗粒。在一些实施方案中，纳米颗粒的尺寸范围可以为1-1000nm、1-500nm、1-250nm、25-200nm、40-100nm、50-100nm.50-90nm、50-80nm、50-70nm、55-95nm、55-80nm、55-75nm、60-100nm、60-90nm、60-80nm、60-70nm、25-100nm、25-80nm，或40-80nm。

在一些实施方案中，LNP可以由阳离子、阴离子或中性脂质制成。在一些实施方案中，LNP可以包含中性脂质(诸如促融合的磷脂1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)或膜组分胆固醇)作为辅助脂质以增强转染活性和纳米颗粒稳定性。在一些实施方案中，LNP可以包含疏水性脂质、亲水性脂质，或疏水性脂质和亲水性脂质二者。本领域已知的任何脂质或脂质组合都可用于产生LNP。用于产生LNP的脂质的实例包括但不限于DOTMA(N[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵)、DOSPA(N,N-二甲基-N-([2-精胺甲酰氨基]乙基)-2,3-双(二油酰氧基)-1-丙铵五盐酸盐)、DOTAP(1,2-二油酰基-3-三甲基丙烷铵)、DMRIE(N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基-1-溴丙铵)、DC-胆固醇(3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基]胆固醇)、DOTAP-胆固醇、GAP-DMORIE-DPyPE、和GL67A-DOPE-DM PE(,2-双(二甲基膦基)乙烷)-聚乙二醇(PEG)。阳离子脂质的实例包括但不限于98N12-5、C12-200、DLin-KC2-DMA(KC2)、DLin-MC3-DMA(MC3)、XTC、MD1和7C1。中性脂质的实例包括但不限于DPSC、DPPC(二棕榈酰磷脂酰胆碱)、POPC(1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DOPE和SM(鞘磷脂)。经PEG修饰的脂质的实例包括但不限于PEG-DMG(二肉豆蔻酰甘油)、PEG-CerC14和PEG-CerC20。在一些实施方案中，脂质可以以任何数量的摩尔比组合以产生LNP。在一些实施方案中，多核苷酸可以与一种或多种脂质以大范围的摩尔比组合以产生LNP。

除非另外指出，否则术语“经取代(的)”是指给定结构中的一个或多个氢基团被指定取代基的基团替代，该指定取代基包括但不限于：卤素、烷基、烯基、炔基、芳基、杂环基、巯基、烷硫基、氧代、硫氧基、芳硫基、烷硫基烷基、芳硫基烯丙基(arylthioallcyl)、烷基磺酰基、烷基磺酰基烷基、芳基磺酰基烷基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、氨基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、卤代烷基、氨基、三氟甲基、氰基、硝基、烷基氨基、芳基氨基、烷基氨基烷基、芳基氨基烷基、氨基烷基氨基、羟基、烷氧基烷基、羧基烷基、烷氧基羰基烷基、氨基羰基烷基、酰基、芳烷氧基羰基、羧酸、磺酸、磺酰基、膦酸、芳基、杂芳基、杂环和脂肪族基团。应理解，取代基可以进一步被取代。示例性取代基包括氨基、烷基氨基等。

如本文所用，术语“取代基”意指在指定原子位置处被取代的核心分子的原子上的位置性变量(positional variables)，其替代该指定原子上的一个或多个氢，条件是不超过该指定原子的正常化合价并且取代产生稳定的化合物。仅当取代基和/或变量的组合产生稳定化合物时，才可允许此类组合。本领域普通技术人员应注意，具有如本文所描述或所示出的看似未满足的化合价的任何碳以及杂原子被假定为具有足够数量的氢原子以满足所描述或所示出的化合价。在某些情况下，具有双键(例如，“氧代”或“＝O”)作为附接点的一种或多种取代基在本文中可能被描述、示出或列出在取代基组内，其中该结构可以仅显示出单键作为与式(I)的核心结构的附接点。本领域普通技术人员将理解，虽然仅显示出单键，但双键也意图用于那些取代基。

术语“烷基”是指具有一至二十个碳原子的直链或支链烃链基团，其通过单键与分子的其余部分附接。包含至多10个碳原子的烷基被称为C₁-C₁₀烷基，同样，例如包含至多6个碳原子的烷基是C₁-C₆烷基。包含其他数目的碳原子的烷基(和本文定义的其他部分)被类似地表示。烷基包括但不限于C₁-C₁₀烷基、C₁-C₉烷基、C₁-C₈烷基、C₁-C₇烷基、C₁-C₆烷基、C₁-C₅烷基、C₁-C₄烷基、C₁-C₃烷基、C₁-C₂烷基、C₂-C₈烷基、C₃-C₈烷基和C₄-C₈烷基。代表性的烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、异丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基乙基(叔丁基)、3-甲基己基、2-甲基己基、1-乙基-丙基等。在一些实施方案中，烷基是甲基或乙基。在一些实施方案中，烷基是-CH(CH₃)₂或-C(CH₃)₃。除非说明书中另外具体说明，否则烷基可以如下所述任选地被取代。“亚烷基”或“亚烷基链”是指将分子的其余部分与基团连接的直链或支链二价烃链。在一些实施方案中，亚烷基是-CI-12-、-CH₂CH₂-或-CH₂CH₂CH₂-。在一些实施方案中，亚烷基是-CH₂-。在一些实施方案中，亚烷基是-CH₂CH₂-。在一些实施方案中，亚烷基是-CH₂CH₂CH₂-。

术语“烯基”是指其中存在至少一个碳-碳双键的一类烷基。在一个实施方案中，烯基具有式-C(R)＝CR²，其中R是指烯基的其余部分，这些部分可以相同或不同。在一些实施方案中，R是H或烷基。在一些实施方案中，烯基选自乙烯基(ethenyl)(即乙烯基(vinyl))、丙烯基(即烯丙基)、丁烯基、戊烯基、戊二烯基等。烯基的非限制性实例包括-CH＝CH₂、-C(CH₃)＝CH₂、-CH＝CHCH₃、-C(CH₃)＝CHCH₃和-CH₂CH＝CH₂。

术语“环烷基”是指单环或多环非芳香族基团，其中形成环的每个原子(即骨架原子)均是碳原子。在一些实施方案中，环烷基是饱和的或部分不饱和的。在一些实施方案中，环烷基是螺环或桥接的化合物。在一些实施方案中，环烷基与芳香环稠合(在这种情况下，环烷基通过非芳香环碳原子键合)。环烷基包括具有3至10个环原子的基团。代表性的环烷基包括但不限于具有三至十个碳原子、三至八个碳原子、三至六个碳原子或三至五个碳原子的环烷基。单环环烷基基团包括例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。在一些实施方案中，单环环烷基是环丙基、环丁基、环戊基或环己基。在一些实施方案中，单环环烷基是环戊烯基或环己烯基。在一些实施方案中，单环环烷基是环戊烯基。多环基团包括例如金刚烷基、1,2-二氢萘基、1,4-二氢萘基、四氢化萘基、十氢化萘基、3,4-二氢萘基-1(2H)-酮、螺[2.2]戊基、降冰片基(norbomyl)和双环[1.1.1]戊基。除非说明书中另有具体说明，否则环烷基可以任选地被取代。根据结构，环烷基可以是单价或二价(即环亚烷基)。

术语“杂环”或“杂环的”是指包含至少一个选自氮、氧和硫的杂原子的杂芳香环(也被称为杂芳基)和杂环烷基(也被称为杂脂环基)，其中每个杂环基在其环体系中具有3至12个原子，条件是任何环都不含两个相邻的O或S原子。“杂环基”是通过从杂环化合物的任何环原子上去除氢原子而形成的单价基团。在一些实施方案中，杂环是单环、双环、多环、螺环或桥接的化合物。非芳香族杂环基团(也被称为杂环烷基)包括在其环体系中具有3至12个原子的环，并且芳香族杂环基团包括在其环体系中具有5至12个原子的环。杂环基团包括苯并稠合环体系。非芳香族杂环基团的实例是吡咯烷基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、噁唑烷酮基、四氢吡喃基、二氢吡喃基、四氢噻喃基、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、噻噁烷基(thioxanyl)、哌嗪基、吖丙啶基(aziridinyl)、吖丁啶基(azetidinyl)、氧杂环丁基(oxetanyl)、硫杂环丁基(thietanyl)、高哌啶基(homopiperidinyl)、氧杂环庚基、硫杂环庚基、氧氮杂卓基(oxazepinyl)、二氮杂卓基、硫氮杂卓基、1,2,3,6-四氢吡啶基、吡咯啉-2-基、吡咯啉-3-基、二氢吲哚基、2H-吡喃基、4H吡喃基、二氧杂环己烷基(dioxanyl)、1,3-二氧杂环戊基(1,3-dioxolanyl)、吡唑啉基、二噻吩基、二硫杂环戊基(dithiolanyl)、二氢吡喃基、二氢噻吩基、二氢呋喃基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、3-氮杂双环[3.1.0]己基1,3-氮杂双环[4.1.0]庚基、3h-吲哚基、二氢吲哚-2-酮基、异二氢吲哚-1-酮基、异二氢吲哚-1,3-二酮基、3,4-二氢异喹啉-1(2H)-酮基、3,4-二氢喹啉-2(1H)-酮基、异二氢吲哚-1,3-二亚硫酰基、苯并[d]噁唑-2(3H)-酮基、1H-苯并[d]咪唑-2(3H)-酮基、苯并[d]噻唑-2(3H)-酮基和喹嗪基。芳香族杂环基团的实例是吡啶基、咪唑基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基(futyl)、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、喹啉基、异喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、噌啉基(cinnolinyl)、吲唑基(indazolyl)、吲嗪基(indolizinyl)、酞嗪基、哒嗪基、三嗪基、异吲哚基、蝶啶基(pteridinyl)、嘌呤基、噁二唑基、噻二唑基、呋咱基(furaz.anyl)、苯并呋咱基(benzofuraz.anyl)、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基(naphthyridinyl)和呋喃吡啶基(furopyridinyl)。在可能的情况下，前述基团是C-附接的(或C连接的)或N-附接的。例如，衍生自吡咯的基团包括吡咯-1-基(N-附接的)或吡咯-3-基(C-附接的)。此外，衍生自咪唑的基团包括咪唑-1-基或咪唑-3-基(均是N-附接的)或者咪唑-2-基、咪唑-4-基或咪唑-5-基(都是C-附接的)。杂环基团包括苯并稠合环体系。非芳香族杂环任选地被一或两个氧代(＝O)部分取代，诸如吡咯烷-2-酮。在一些实施方案中，双环杂环的两个环中的至少一个环是芳香族的。在一些实施方案中，双环杂环的两个环均是芳香族的。

术语“杂环烷基”是指包含至少一个选自氮、氧和硫的杂原子的环烷基。除非说明书中另有具体说明，否则杂环烷基基团可以是单环或双环环体系，其可以包括稠合(当与芳基或杂芳基环(heterowyl ring)稠合时，该杂环烷基通过非芳香环原子键合)或桥接的环体系。杂环基基团中的氮、碳或硫原子可以任选地被氧化。氮原子可以任选地被季铵化。杂环烷基基团是部分或完全饱和的。杂环烷基基团的实例包括但不限于二氧杂环戊基、噻吩基[1,3]二噻烷基(thienyl[1,3]dithiany l)、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎宁环基(quinuclidinyl)、噻唑烷基、四氢呋喃基、三噻烷基(trithianyl)、四氢吡喃基、硫代吗啉基、硫吗啉基(thiamorpholinyl)、1-氧代硫代吗啉基、1,1-二氧代-硫代吗啉基。术语杂环烷基还包括碳水化合物的所有环形式，包括但不限于单糖、二糖和寡糖。除非另有说明，否则杂环烷基具有位于环中的2至12个碳。在一些实施方案中，杂环烷基具有位于环中的2至10个碳。在一些实施方案中，杂环烷基具有位于环中的2至10个碳并且具有1或2个N原子。在一些实施方案中，杂环烷基具有位于环中的2至10个碳并且具有3或4个N原子。在一些实施方案中，杂环烷基具有位于环中的2至12个碳、0-2个N原子、0-2个O原子、0-2个P原子和0-1个S原子。在一些实施方案中，杂环烷基具有位于环中的2至12个碳、1-3个N原子、0-1个O原子和0-1个S原子。应理解，当提及杂环烷基中的碳原子数时，杂环烷基中的碳原子数与构成杂环烷基的原子(包括杂原子)(即，杂环烷基环的骨架原子)的总数不同。除非说明书中另有具体说明，否则杂环烷基可以任选地被取代。如本文所用，术语“四环亚烷基”可以是指二价杂环烷基。

术语“杂芳基”是指包含一个或多个选自氮、氧和硫的环杂原子的芳基。杂芳基是单环或双环的。单环杂芳基的示例性实例包括吡啶基、咪唑基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、哒嗪基、三嗪基、噁二唑基、噻二唑基、呋咱基、中氮茚、吲哚、苯并呋喃、苯并噻吩、吲唑、苯并咪唑、嘌呤、喹嗪、喹啉、异喹啉、噌啉、酞嗪、喹唑啉、喹喔啉、1,8-萘啶和蝶啶。单环杂芳基的示例性实例包括吡啶基、咪唑基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、哒嗪基、三嗪基、噁二唑基、噻二唑基和呋咱基。双环杂芳基的示例性实例包括中氮茚、吲哚、苯并呋喃、苯并噻吩、吲唑、苯并咪唑、嘌呤、喹嗪、喹啉、异喹啉、噌啉、酞嗪、喹唑啉、喹喔啉、1,8-萘啶和蝶啶。在一些实施方案中，杂芳基是吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、噻唑基、噻吩基、噻二唑基或呋喃基。在一些实施方案中，杂芳基含有位于环中的0-6个N原子。在一些实施方案中，杂芳基含有位于环中的1-4个N原子。在一些实施方案中，杂芳基含有位于环中的4-6个N原子。在一些实施方案中，杂芳基含有位于环中的0-4个N原子、0-1个O原子、0-1个P原子和0-1个S原子。在一些实施方案中，杂芳基含有位于环中的1-4个N原子、0-1个O原子和0-1个S原子。在一些实施方案中，杂芳基是C₁-C₉杂芳基。在一些实施方案中，单环杂芳基是C₁-C₅杂芳基。在一些实施方案中，单环杂芳基是5元或6元杂芳基。在一些实施方案中，双环杂芳基是C₆-C₉杂芳基。在一些实施方案中，杂芳基被部分还原以形成本文定义的杂环烷基。在一些实施方案中，杂芳基被完全还原以形成本文定义的杂环烷基。

如本文所用，氨基脂质可以含有至少一个在4至14的pH范围之间可质子化(或可电离)的伯胺、仲胺或叔胺部分。在一些实施方案中，一个或多个胺部分起到氨基脂质的亲水性头基的作用。当核酸-脂质纳米颗粒制剂中的一种氨基脂质(或多种氨基脂质)的一个或多个胺部分中的大部分在生理pH下质子化时，则纳米颗粒可以被称为阳离子脂质纳米颗粒(cLNP)。当核酸-脂质纳米颗粒制剂中的一种氨基脂质(或多种氨基脂质)的一个或多个胺部分中的大部分在生理pH下不质子化但可以在酸性pH(例如内体pH)下质子化时，可以被称为可电离脂质纳米颗粒(iLNP)。构成cLNP的氨基脂质通常可以被称为阳离子氨基脂质(cLipid)。构成iLNP的氨基脂质可以被称为可电离氨基脂质(iLipid)。在生理pH下，氨基脂质可以是iLipid或cLipid。

如本文所用，LNP组合物或制剂的尺寸通常为微米或更小数量级，并且可以包含脂质双层。纳米颗粒组合物涵盖脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体脂质囊泡)和脂质复合物，纳米颗粒组合物是具有直径为500nm或更小的脂质双层的脂质体。本文所述的LNP的平均直径可以为约1nm至约2500nm、约10nm至约1500nm、约20nm至约1000nm、约30nm至约150nm、约40nm至约150nm、约50nm至约150nm、约60nm至约130nm、约70nm至约110nm、约70nm至约100nm、约80nm至约100nm、约90nm至约100nm、约70至约90nm、约80nm至约90nm，或约70nm至约80nm。本文所述的LNP的平均直径可以为约30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm、150nm或更大。本文所述的LNP可以是基本上无毒的。

如本文所用，“磷脂”可以是指包含磷酸酯部分和一个或多个碳链(诸如不饱和脂肪酸链)的脂质。磷脂可以包含一个或多个多重键(例如，双键或三键)。在一些实施方案中，磷脂可以促进与膜的融合。例如，阳离子磷脂可以与膜(例如细胞膜或细胞内膜)的一种或多种带负电荷的磷脂相互作用。磷脂与膜的融合可以允许LNP的一种或多种组成部分穿过该膜，即将该一种或多种组成部分递送至细胞。

有效载荷

本文所述的LNP可以被设计成将有效载荷(诸如一种或多种治疗剂或一种或多种药物物质)递送至靶细胞或目标器官。在一些实施方案中，本文所述的LNP包裹如本文所述的碱基编辑器系统的一种或多种组分。例如，LNP可以包裹以下中的一种或多种：指导RNA、编码指导RNA的核酸、编码指导RNA的载体、碱基编辑器融合蛋白、编码碱基编辑器融合蛋白的核酸、可编程DNA结合结构域、编码可编程DNA结合结构域的核酸、脱氨酶、编码脱氨酶的核酸，或者它们中的全部或它们的任何组合。在一些实施方案中，该核酸是DNA。在一些实施方案中，该核酸是RNA，例如mRNA和/或指导RNA。在一些实施方案中，所述一种或多种核酸是经化学修饰的。

在一些实施方案中，有效载荷包含一种或多种核酸(即一种或多种核酸分子实体)。在一些实施方案中，该核酸是单链核酸。在一些实施方案中，该单链核酸是DNA。在一些实施方案中，该单链核酸是RNA。在一些实施方案中，该核酸是双链核酸。在一些实施方案中，该双链核酸是DNA。在一些实施方案中，该双链核酸是RNA。在一些实施方案中，该双链核酸是DNA-RNA杂交体。在一些实施方案中，该核酸是信使RNA(mRNA)、微RNA、不对称干扰RNA(aiRNA)、小发夹RNA(shRNA)、反义寡核苷酸或Dicer底物dsRNA。在一些实施方案中，该单链核酸形成二级结构，例如一个或多个茎环。在一些其他实施方案中，该单链核酸在分子内含有一个或多个茎环和单链区域。

试剂盒

本文考虑到本文公开的治疗剂或药物物质是本文所述的试剂盒的一部分。因此，本公开的一方面涉及试剂盒，该试剂盒包括用于治疗或预防疾患的包含如本文提供的单指导RNA的组合物、如本文提供的碱基编辑器系统和复合物、如本文提供的组合物、和/或如本文提供的脂质纳米颗粒制剂。试剂盒可以进一步包括用于治疗或预防疾患的一种或多种另外的治疗方案或剂。

在某些实施方案中，本文还公开了用于与本文所述的一种或多种方法一起使用的试剂盒和制品。此类试剂盒包括载体、包装或容器，该载体、包装或容器被区室化以容纳一个或多个容器(诸如小瓶、管等)，该一个或多个容器中的每一个容器均包含要在本文所述的方法中使用的分开的组成部分中的一个组成部分。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。在一个实施方案中，容器由多种材料(诸如玻璃或塑料)形成。

本文提供的制品含有包装材料。药物包装材料的实例包括但不限于泡罩包装、瓶、管、袋、容器、瓶以及适合于所选制剂和预期施用和治疗方式的任何包装材料。

例如，该一个或多个容器包括如本文所述的组合物，并且任选地此外具有本文公开的治疗方案或剂。此类试剂盒任选地包括与其在本文所述的方法中的使用相关的标识描述或标签或说明。

试剂盒通常包括列出内容物和/或使用说明的标签，以及带有使用说明的包装插页。通常还会包括一组说明书。

在实施方案中，标签位于容器上或与容器相关联。在一个实施方案中，当形成标签的字母、数字或其他字符附着、模制或蚀刻到容器本身中时，标签位于容器上；当标签存在于也容置容器的器皿(receptacle)或载体内时，该标签与该容器相关联，例如作为包装插页。在一个实施方案中，标签被用于指示内容物将用于特定的治疗应用。标签还指示内容物诸如在本文描述的方法中的使用说明。

给药

技术人员将意识到，某些因素可以影响有效治疗受试者所需的施用剂量和频率，该因素包括但不限于疾病或病症的严重程度、既往治疗、受试者的一般特征(包括受试者的健康状况、性别、体重和/或年龄)以及存在的其他疾病。此外，使用治疗有效量的组合物治疗受试者可以包括单次治疗，或优选地，可以包括一系列治疗。还将意识到，本公开的组合物用于治疗的有效剂量可以在具体治疗过程中增加或减少。剂量的改变可以由如本文所述的诊断测定的结果产生并且从如本文所述的诊断测定的结果变得明显。治疗有效剂量通常取决于施用时患者的状态。精确的量可以通过常规实验确定，但是可能最终取决于临床医生的判断，例如通过监测患者的疾病体征并相应地调整治疗。

施用频率可以在疗法过程中确定和调整，并且通常但不一定是基于疾病的治疗和/或压制和/或改善和/或延迟。可替代地，多肽或多核苷酸的持续连续释放制剂可能是适当的。用于实现持续释放的各种制剂和装置是本领域已知的。在一些实施方案中，剂量是每天、每隔一天、每三天、每四天、每五天或每六天。在一些实施方案中，给药频率为每周一次、每2周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每9周一次或每10周一次；或每月一次、每2个月一次，或每3个月一次，或更长时间一次。通过常规技术和测定容易监测这种疗法的进程。

给药方案(包括本文公开的组合物)可以随时间变化。在一些实施方案中，考虑到对于正常体重的成年受试者，可以施用范围为约0.01至1000mg/kg的剂量。在一些实施方案中，该剂量在1至200mg之间。在一些实施方案中，该剂量可以在0.03mg/kg至3mg/kg之间或为其间的任何值。具体的剂量方案(即剂量、时间安排和重复)将取决于具体受试者和该受试者的病史，以及多肽或多核苷酸的特性(诸如多肽或多核苷酸的半衰期和本领域众所周知的其他考虑因素)。

如本文所述的组合物的适当治疗剂量将取决于所使用的特定剂(或其组合物)、施用的制剂和途径、疾病的类型和严重程度、是出于预防性目的还是出于治疗性目的施用多肽或多核苷酸、既往疗法、受试者的临床病史和对拮抗剂的反应、以及主治医师的判断。通常，临床医生将施用多肽直至达到实现所需结果的剂量。

一种或多种组合物的施用可以是连续的或间歇的，这取决于例如接受者的生理状况、施用的目的是治疗性的还是预防性的、以及技术人员已知的其他因素。组合物的施用可以在预选的时间段内基本上连续，或可以以一系列间隔剂量(例如在疾病发生之前、期间或之后)进行。

本文所述的本公开的方法和组合物(包括其实施方案)可以与可以共施用于哺乳动物的一种或多种另外的治疗方案或剂或治疗一起施用。“共施用”意指在时间上足够接近地施用一种或多种另外的治疗方案或剂或治疗和本公开的组合物以增强一种或多种另外的治疗剂的效果，或反之亦然。在这方面，本文所述的本公开的组合物可以与一种或多种另外的治疗方案或剂或治疗同时、在不同的时间或按照完全不同的治疗方案(例如，第一治疗可以是每天的，而该另外的治疗是每周的)施用。例如，在实施方案中，第二治疗方案或剂或治疗与本公开的组合物同时、在本公开的组合物之前或之后施用。

在实施方案中，将编码碱基编辑器融合蛋白的多核苷酸和指导RNA施用于受试者。在实施方案中，编码碱基编辑器融合蛋白的多核苷酸是mRNA。在实施方案中，组合的编码碱基编辑器融合蛋白的多核苷酸和指导RNA的剂量为0.01mg/kg至10mg/kg，诸如0.5mg/kg至5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg等。在实施方案中，将包含此类量的编码碱基编辑器融合蛋白的多核苷酸和指导RNA的LNP施用于受试者。在实施方案中，受试者是灵长类动物。在实施方案中，受试者是非人灵长类动物。在实施方案中，非人灵长类动物是食蟹猴。

在实施方案中，将指导RNA和编码碱基编辑器融合蛋白的多核苷酸施用于非人灵长类动物(诸如食蟹猴)导致如通过下一代测序测量的20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多，或60％或更多的全肝细胞中发生碱基改变。在实施方案中，当向受试者施用0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg或3mg/kg组合剂量的指导RNA和编码碱基编辑器融合蛋白的多核苷酸时，实现此类碱基改变百分比。在实施方案中，此类剂量以LNP形式施用。在实施方案中，此类施用导致血清TTR水平降低。

本发明通过以下实施例说明。应理解，具体实例、材料、量和程序应根据本文阐述的本发明的范围和精神来广义地解释。

实施例

实施例1

用于TTR基因的腺嘌呤碱基编辑的指导物

通过这个实施例，鉴定出gRNA序列，该gRNA序列允许ABE8.8(以及含有化脓性链球菌Cas9的其他ABE变体，诸如ABE7.10，或含有可以使用NGG PAM的另一种Cas蛋白的其他ABE变体)经由其编辑窗口(DNA的20-nt原间隔区区域中的大约4位至7位)内的A→G编辑来：1)破坏起始密码子，或2)破坏剪接位点(无论是供体还是受体)。在整个人TTR基因中鉴定出5个序列(表1)。合成了与原间隔区序列中的每个原间隔区序列相匹配并且在其他方面符合标准100-nt化脓性链球菌CRISPR gRNA序列的gRNA，其中每种gRNA分子均具有最小程度的化学修饰(表1中指出)。经由MessengerMax试剂(Lipofectamine)使用各种稀释度(2500、1250、625ng/RNA/mL)将该gRNA中的每种gRNA与等量的在体外转录的ABE8.8 mRNA(按分子量计1:1比率)共转染到原代人肝细胞中，以评估不同浓度测试物品(test article)的编辑活性。

表1.TTR指导物

对于对应食蟹猴TTR基因序列的正交原间隔区序列，还将每种gRNA与等量的ABE8.8 mRNA(按分子量计1:1比率)以5000、2500、1250、625、312.5和156.25ng/RNA/mL转染到原代食蟹猴肝细胞中。所使用的ABE8.8(MA004)的mRNA序列和对应氨基酸序列在下表11中示出。转染后三天，从肝细胞中收获基因组DNA，并通过对靶剪接位点周围生成的PCR扩增子进行下一代测序来评估该基因组DNA的碱基编辑。数个位点显示出高编辑效率。特别是，GA457(GA458是食蟹猴等效物)、GA460和GA461在人和食蟹猴原代肝细胞中均显示出高编辑活性。参见图5A-图5C、图6和表2-表3。

表2.在人原代肝细胞中的编辑活性

表3.在食蟹猴原代肝细胞中的编辑活性

表2和表3中呈现的结果应理解为代表根据本文提供的教导可以实现的结果。根据本发明的用于编辑TTR基因的组合物可以产生与表2或表3中列出的活性相差10％或更多、20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多，或100％或更多的编辑活性。在一些实施方案中，该组合物提供了在如表2或表3中列出的活性的100％以内、90％以内、80％以内、70％以内、60％以内、50％以内、40％以内、30％或更多以内、20％或更多以内，或10％或更多以内的编辑活性。

实施例2

脱靶分析

为了确定碱基编辑疗法在体内敲低人肝中TTR的安全性，在原代人肝细胞中评估了脱靶诱变分析。遵循PCT/US19/27788(“Highly Sensitive in vitro Assays to DefineSubstrate Preferences and Sites of Nucleic-Acid Binding,Modifying,andCleaving Agents”)中详述的ONE-seq程序，评估了人肝细胞中的脱靶编辑。使用ONE-seq程序进行脱靶分析的简化流程图在图7中示出。使用体外生化测定ONE-seq来生成候选脱靶位点列表并确定包含ABE8.8碱基编辑器蛋白和三种原间隔区指导序列(GA457、GA460和GA461)中的每一种原间隔区指导序列的核糖核蛋白切割文库中的寡核苷酸的倾向。对针对GA457、GA460和GA461生成的文库进行的ONE-seq分析的结果示于表8-表10中，其中列出了候选脱靶位点。

ONE-seq的方法如下：ONE-seq文库的设计从计算机鉴定参考基因组中与在靶位点具有序列同源性的位点开始。对于人ONE-seq文库，使用Cas-Designer v1.2(http://www.rgenome.net/cas-designer/)搜索了参考人基因组(GRCh38，Ensembl v98，染色体ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-98/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCh38.dna.chromosome.{1-22,X,Y,MT}.fa and ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-98/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCh38.dna.nonchromosomal.fa)的与上述原间隔区序列具有至多6个错配的潜在脱靶位点，以及具有至多4个错配和至多2个DNA或RNA凸起的位点。

具有至多6个错配且没有凸起的位点使用X<错配数><凸起数>代码来提及。因此，在靶位点被标记为X00；与在靶位点具有1个错配且没有凸起的位点被标记为X10，依此类推。具有DNA凸起的位点使用类似的命名法，DNA<错配数><凸起数>来提及。因此，与在靶位点具有4个错配且具有2个DNA凸起的位点被标记为DNA42。RNA凸起使用相同的命名法，但是这些凸起被编码为RNA<错配数><凸起数>。

利用来自相应参考基因组的相邻序列(这些区域在本文中被称为基因组背景(genomic context))使所鉴定的原间隔区序列在两侧延伸10个核苷酸(nt)。然后用另外的序列填充这些经延伸的序列，直到最终长度为约200nt，包括6个不同核苷酸组成和序列长度的预定义恒定区；2个14-nt位点特异性条形码的拷贝，中央原间隔区序列的每一侧各一个；和2个不同的11-nt独特分子标识符(UMI)，中央原间隔区序列的每一侧各一个。UMI被用于校正来自PCR扩增的偏差，并且该条形码允许在分析期间明确鉴定每个位点。这些条形码是从在其序列中既不含有CC也不含有GG的668,420个条形码的初始列表中选择的，并且每个条形码与任何其他条形码的汉明(Hamming)距离为2。使用定制Python脚本来设计最终文库。

最终的寡核苷酸文库由商业供应商(Agilent Technologies)合成。每个文库均经受PCR扩增并经受1.25×AMPure XP珠粒纯化(Beckman Coulter)。在CutSmart缓冲液(NewEngland Biolabs)中于25℃下孵育10分钟后，将包含769nM重组ABE8.8-m蛋白和1.54μMgRNA的RNP与100ng经纯化的文库混合，并于37℃下孵育8小时。RNP剂量源自分析，该分析证明了该RNP剂量为超饱和剂量，即高于在生化测定中实现最大量的在靶编辑的剂量。

添加蛋白酶K(New England Biolabs)以在37℃下淬灭反应物45分钟，然后进行2×AMPure XP珠粒纯化。然后，将反应物连续地与核酸内切酶V(New England Biolabs)一起在37℃下孵育30分钟，与Klenow片段(New England Biolabs)一起在37℃下孵育30分钟，以及与NEBNext Ultra II末端制备酶混合物(New England Biolabs)一起在20℃下孵育30分钟并随后在65℃下孵育30分钟，每次孵育后均进行2×AMPure XP珠粒纯化。将反应物与退火的转接子(adaptor)寡核苷酸双链体在20℃下连结1小时以促进经切割的文库产物的PCR扩增，并随后进行2×AMPure XP珠粒纯化。在PippinHT系统(Sage Sciences)上进行经连结的反应物的尺寸选择，以在3％琼脂糖凝胶盒上分离150至200bp的DNA，并随后进行2轮PCR扩增以生成条形码文库，该文库经历如上所述的在Illumina MiSeq系统上进行的配对末端测序(paired-end sequencing)。

在ONE-seq实验中获得了两种切割产物。PROTO侧包含切割位置上游的寡核苷酸部分，而PAM侧包含切割位置下游的寡核苷酸部分。在ABE实验中，仅PROTO侧提供编辑活性信息(A→G取代)；因此，仅这一侧被测序。

使用trimmomatic v0.39(Bolger等人，2014年)采用定制Nextera转接子(PrefixPE/1:5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCG ATCT-3’(SEQ ID NO:30)；PrefixPE/2:5’-GTGACTGGAGTTCAG ACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’(SEQ ID NO:31)；如文件中指定)和参数“ILLUMINACLIP:NEB_custom.fa:2:30:10:1:true LEADING:0TRAILING:0SLIDINGWINDOW:4:30MINLEN:36”来针对测序转接子修剪配对末端读段。对于测序质量较低的实验(VOL014)，这些参数设置为“ILLUMINACLIP NEB_custom.fa:2:30:10:1:true LEADING:2TRAILING:0SLIDINGWINDOW:30:30MINLEN:36”。然后使用FLASH v1.2.11(Magoc和Salzberg，2011年)采用参数“--最大-错配-密度＝0.25--最大-重叠＝160”合并读段。对经合并的读段进行扫描以查找每个位点特有的恒定序列、条形码和原间隔区序列，并将经合并的读段过滤为在编辑窗口(定义为原间隔区的1-10个PAM最远端位置)中具有A→G取代证据的那些。重复的读段被丢弃。

对于每个位点，将经编辑的读段的总数针对分配到在靶位点的经编辑的读段的总数作归一化，并且这种比率定义了该位点的ONE-seq得分。根据ONE-seq得分对位点进行排名，并选择得分等于或大于0.001的那些位点进行验证。等于或大于0.001的得分涵盖了在生化测定中编辑活性与在靶位点的编辑相比下降减少1000倍的位点。这种阈值是基于这样的前提，即在细胞中，如果存在100％的在靶编辑，则少1/1000倍的编辑活性将转化为<0.1％的脱靶编辑，这低于NGS检测编辑的下限。序列计数较高的寡核苷酸反映出体外Cas9/gRNA切割的倾向较高，并且因此在细胞中脱靶诱变潜力更大。

在人原代肝细胞中分析数个候选脱靶位点的脱靶编辑。表4示出了来自对来自经由MessengerMax试剂(Lipofectamine)与gRNA和等量的在体外转录的ABE8.8 mRNA(按分子量计1:1比率)共转染到原代人肝细胞中的细胞的指导RNA GA457的47个候选脱靶位点进行验证的结果。在靶位点具有高编辑效率，而所有脱靶位点几乎没有编辑(净编辑低于0.4％)。

表4.在人原代肝细胞中针对47个潜在脱靶候选位点的GA457验证

还类似地评估了GA459、GA460和GA461的脱靶编辑，分别如表5、表6和表7中所示。虽然与对照组相比，每个指导物的在靶位点在处理组中显示出高的编辑效率，但是在候选脱靶位点处几乎没有观察到脱靶编辑。

表5.在人原代肝细胞中针对6个潜在脱靶候选位点的GA459验证

表6.在人原代肝细胞中针对3个潜在脱靶候选位点的GA460验证

表7.在人原代肝细胞中针对4个潜在脱靶候选位点的GA461验证

表8提供了使用GA457指导物进行脱靶编辑的一些结果。

表9提供了使用GA460指导物进行脱靶编辑的一些结果。

表10提供了使用GA461指导物进行脱靶编辑的一些结果。

表4、表6、表7、表8、表9和表10中呈现的结果应理解为代表根据本文提供的教导可以实现的结果。根据本发明的用于编辑TTR基因的组合物可以产生与表4、表6、表7、表8、表9或表10中列出的或关于GA457、460或461讨论的活性有差异的总脱靶编辑活性。例如，对于表4、表6、表7、表8、表9或表10中列出的或关于GA457、460或461讨论的一个或多个脱靶位点，该组合物可以产生与表4、表6、表7、表8、表9或表10中列出的或关于GA457、460或461讨论的活性相差10％或更多、20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多，或100％或更多的总脱靶编辑活性。在一些实施方案中，对于表4、表6、表7、表8、表9或表10中列出的或关于GA457、460或461讨论的一个或多个位点，该组合物提供在表4、表6、表7、表8、表9或表10中列出的或关于GA457、460或461讨论的活性的100％以内、90％以内、80％以内、70％以内、60％以内、50％以内、40％以内、30％或更多内、20％或更多内，或10％以内的总脱靶编辑活性。在一些实施方案中，对于表4、表6、表7、表8、表9或表10中列出的或关于GA457、460或461讨论的一个或多个位点，该组合物产生小于或等于表4、表6、表7、表8、表9或表10中列出的或关于GA457、460或461讨论的活性的脱靶编辑活性。在一些实施方案中，对于表4、表6、表7、表8、表9或表10中列出的或关于GA457、460或461讨论的一个或多个位点，该组合物不产生脱靶编辑活性。

表8.一些GA457候选脱靶位点

GA457脱靶位点的另外实例呈现在2022年3月21日提交的美国临时专利申请号63/322,182中。GA457脱靶位点可以包括SEQ ID NO:92-1073中的任一个。

表9.一些GA460候选脱靶位点

GA460脱靶位点的另外实例呈现在2022年3月21日提交的美国临时专利申请号63/322,182中。GA460脱靶位点可以包括SEQ ID NO:1074-3725中的任一个。

表10.一些GA461候选脱靶位点

GA461脱靶位点的另外实例呈现在2022年3月21日提交的美国临时专利申请号63/322,182中。GA461脱靶位点可以包括SEQ ID NO:3726-5745中的任一个。

表11.ABE变体序列

其他ABE变体可用于实现人TTR基因的编辑。此类ABE变体的实例描述在2021年4月9日提交的名称为BASE EDITING OF PCSK9 AND METHODS OF USING SAME FOR TREATMENTOF DISEASE且指定Verve Therapeutics,Inc.为申请人的国际专利申请PCT/US21/26729中。

实施例3

TTR基因的体内非人灵长类动物(NHP)碱基编辑

在此实施例中，制备了对应于上述人GA457和GA460 sgRNA的NHP替代sgRNA(GA519和GA520)，并将其与前述的ABE8.8 mRNA一起配制，包封在脂质纳米颗粒(LNP)中，并静脉内给药至NHP。该研究涉及两个不同的方面。

NHP在体内研究的第一方面涉及评价LNP1和LNP2，LNP1和LNP2的不同之处仅在于LNP1被配制成包封GA519和ABE8.8mRNA，而LNP2被配制成包封GA520和ABE8.8 mRNA。研究的第二方面涉及配制和评价第三LNP(LNP3)。LNP3与LNP1一样，被配制成包封GA519和ABE8.8mRNA。然而，LNP3与LNP1的不同之处在于LNP3包含GalNAc部分成分。在该研究的每个方面，在对NHP进行输注后的多个时间评价碱基编辑效率、TTR蛋白表达、安全性谱和药代动力学，如下文进一步详述的和附图中所图示的。

A部分：使用非GalNAc LNP的GA519和GA520的体内NHP评价

LNP制备

在NHP研究的此第一方面，配制了两种LNP(LNP1和LNP2)，其中LNP1包封GA519和ABE8.8 mRNA，而LNP2包封GA520和ABE8.8 mRNA。该LNP中的每种LNP的成分由如下表12中所述的且处于下表12中所指示的比率下的可电离氨基脂质(iLipid)、中性辅助脂质、PEG-脂质和固醇脂质组成。

表12.LNP1/LNP2组分

*描述在国际公布专利申请WO 2021/178725 A1中

应理解，表12中的脂质可以被所列类别中的其他合适的脂质取代。在一些实施方案中，例如，LNP包含国际公布专利申请WO 2022/060871A1中描述的氨基脂质VL422。例如，氨基脂质可以是VL422或其药学上可接受的盐或溶剂合物：

应进一步理解，表12中的脂质的mol％可以被调整，并且表12中所包括的mol％是LNP的目标赋形剂百分比(其旨在表示在给定批次中配制的所有LNP的合计mol％)，并且批次内的特定LNP可以具有不同的mol％。因此，本文考虑到表12中列出的LNP组分中的一种或多种或全部LNP组分的mol％可以被调整，例如+/-1％-5％、+/-5％-10％或+/-10％-20％。本文进一步考虑到，表12中列出的LNP组分中的一种或多种或全部LNP组分相对于根据所需目标赋形剂百分比配制的在给定批次的LNP中配制的特定LNP的mol％可以与目标mol％有差异，例如相差+/-1％-5％、+/-5％-10％或+/-10％-20％，或甚至大于+/-20％。进一步地，应理解，可以将另外的LNP组分(包括非脂质组分)添加到表12中列出的LNP组分中。如表13中列出的，LNP1是用sgRNA GA519配制并且LNP2是用GA520配制，它们分别对应于前面描述的sgRNA GA457和GA460。GA519和GA520是化学合成的，并且GA519和GA520的序列和化学修饰在表13中指出。

表13.GA519和GA520 TTR基因靶向的指导物

序列中的字母：A＝腺苷；C＝胞苷；G＝鸟苷；U＝尿苷；a＝2’-O-甲基腺苷；c＝2’-O-甲基胞苷；g＝2’-O-甲基鸟苷；u＝2’-O-甲基尿苷；s＝硫代磷酸酯(PS)骨架键联。C＝NHP中与人TTR序列不同的核苷酸。gRNA序列中的粗体表示对应于原间隔区的间隔区序列。

值得注意的是，与GA457相比，GA519在参考食蟹猴基因组(macFas5)的外显子1的50,681,581位至50,681,603位之间杂交，并编辑50,681,584位处的腺苷，通过使甲硫氨酸转化为苏氨酸氨基酸并禁止蛋白质翻译来导致全长TTR蛋白序列的破坏(图8)。GA519是人GA457 gRNA的食蟹猴替代物并且映射到人TTR基因座的类似区域，如在如前所述的图4中。食蟹猴GA519 gRNA与GA457的不同之处在于原间隔区的17位处的单个核苷酸，并且在表13的原间隔区列中用下划线突出显示。此外，GA519和GA457彼此的不同之处在于GA519的tracr区域掺有化学修饰(在表13中详述的)。该化学修饰被设计用于改善体内稳定性或者被设计成能够改善体内稳定性。

类似地，与GA460相比，GA520在参考食蟹猴基因组(macFas5)的外显子3的50,678,305位至50,678,327位之间杂交，并编辑50,678,324位处的腺苷，导致剪接受体破坏，产生截短的非功能性TTR蛋白(图9)。GA520的原间隔区区域与人GA460同一并且映射到人TTR基因座的类似区域，如在如前所述的图4中。GA520和GA460在tracr区域不同并且掺有化学修饰(如上表中详述的)，该化学修饰被设计用于改善体内稳定性或者被设计成能够改善体内稳定性。

对于参考，用于碱基编辑的被靶向核苷酸在图8和图9中以粗体突出显示。图8和图9还标识了GA519和GA520的间隔区相对于如前所述的TTR基因的位置。

分别地使用ABE 8.8 mRNA以及GA519和GA520配制LNP1和LNP2，其中sgRNA:mRNA重量比为1:1。换句话说，用与mRNA等量(按重量计)的指导RNA配制LNP。使用0.2微米过滤器过滤所得包封sgRNA和ABE 8.8mRNA的LNP，并将其在-80℃下冷冻。表14中总结了配制的LNP的物理特性。

表14.LNP1/LNP2表征

LNP	平均LNP尺寸(nm)	PDI	RNA包载(％)
				1	68.6	0.022	95.7
2	68.6	0.029	96.2

PDI是多分散指数

本领域普通技术人员将理解，表14中列出的平均LNP尺寸、PDI和RNA包载值受到测量误差或准确性的影响。本文还考虑到，表14中列出的LNP尺寸、PDI和RNA包载值可以变化+/-1％-5％、+/-5％-10％或+/-10％-20％。

NHP研究设计

在研究的这一方面，使用柬埔寨来源的雌性食蟹猴作为研究动物。在第-1天(给药前约24小时)和在第1天(给药前)在测试物品剂量施用前30至60分钟，向所有动物施用包含地塞米松以及H1和H2抗组胺药的前驱用药方案。在研究的第1天，通过以3mg组合的sgRNA和mRNA/kg动物体重的剂量水平并且以6mL/kg的剂量体积进行的单次IV输注，向三只猴给药LNP1并向3只猴给药LNP2(n＝3/组)。

给药前从所有动物中采集血液样品用于基线测量，并且给药后在第1天至第15天的各种时间点从所有动物中采集血液样品，以评估生物标志物、细胞因子、血浆iLipid和PEG-脂质药代动力学以及血清安全性参数。

在第16天对所有动物进行尸检。采集肝活检样品以评估TTR基因编辑。

编辑效率分析

使用先前所述的方法(Musunuru等人,Nature 593,第7859期(2021年5月):429-34.https://doi.org/10.1038/s41586-021-03534-y)通过对从提取自动物肝的基因组DNA衍生的TTR靶位点处的靶向聚合酶链式反应(PCR)扩增子进行下一代测序(NGS)来评价肝中基因编辑的量。编辑百分比被报告为在靶腺嘌呤处含有非参考等位基因的所有读段的百分比。

图10图示了与LNP2相比LNP1的TTR编辑效率。值得注意的是，如图10所图示，与LNP2(29％)相比，用LNP1处理的NHP中的平均肝TTR编辑效率更高(52％)。

血清中TTR蛋白表达的量化

在输注前第-10、-7、-5天以及在LNP输注后第7和14天从所有动物中采集血清用于TTR蛋白分析。使用两种方法来量化血清TTR。初始使用定制的TTR夹心ELISA来量化TTR蛋白水平，从该分析中获得的数据在图11中示出。对第-10、-7和-5天的值进行平均以获得基线值。值得注意的是，与LNP2处理的动物(在第14天相对于基线变化了3％)相比，LNP1处理的动物显示出更高的肝TTR编辑，还显示出更大的血浆TTR降低(在第14天相对于基线变化了-63％)。还使用液相色谱质谱法(LC-MS)对从血清中采集的TTR蛋白进行定量，其中从每个样品时间点对四个独特的血清TTR肽片段进行定量，并报告结果的平均值。使用LC-MS的LC-MS血清TTR定量分析在图12中列出，并且与从ELISA量化获得的数据显著地一致，因为它还证明与LNP2(在第14天相对于基线变化了-21％)相比，LNP1显示出更大的血浆TTR降低(在第14天相对于基线变化了-73％)。

因此，如图10、图11和图12所图示，在NHP中输注LNP1和LNP2导致肝中TTR基因的编辑，其中LNP1显示出比LNP2更高的编辑。LNP1 NHP的更高编辑对应于血清中血清TTR浓度降低的相称增加。

安全性分析

在输注前第-10、-7、-5天和在LNP输注后6、24、48、96、168、240和336小时从所有动物中采集血清用于安全性分析，特别是旨在观察肝酶和细胞因子水平的变化。在BeckmanCoulter AU680分析仪上直接测量血清样品的血清化学参数。对第-10、-7和-5天的值进行平均以获得基线值。被给药了LNP1和LNP2的动物都显示出短暂的丙氨酸转氨酶(图13A)升高，其在输注结束后48小时达到峰值并且在输注结束后168小时返回到基线水平。LNP1和LNP2处理也均升高了天冬氨酸转氨酶水平(如图13B所图示)，其在输注结束后6小时达到峰值并且在输注结束后96小时返回到基线水平。血清乳酸脱氢酶浓度(如图14A所图示)和谷氨酸脱氢酶浓度(如图14B所图示)还被发现在施用LNP1或LNP2后不久升高，在输注结束后96-168小时返回到基线水平。LNP1或LNP2输注没有改变γ-谷氨酰转移酶的血清浓度(如图15A所图示)和碱性磷酸酶的血清浓度(如图15B所示)。另外，LNP1和LNP2处理不影响血清总胆红素浓度，如图16所图示。被给药了LNP1和LNP2的动物也各自显示出升高的血清肌酸激酶浓度(如图17所图示)，该浓度在每种情况下均在输注结束后6小时时达到峰值并且到输注结束后168小时完全返回到基线水平。

在治疗前第-10、-7、-5天以及在LNP输注后24、168和336小时从所有动物中采集血清用于血清细胞因子分析。使用多重夹心免疫测定来测量细胞因子，其中使用来自MesoScale Diagnostics(Rockville,MD)的U-PLEX生物标志物组1(猴)测定同时从血清样品对四种(MCP-1、IL-6、IP-10、IL-1RA)细胞因子进行定量。对第-10、-7和-5天的值进行平均以获得基线值。被给药了LNP1和LNP2的动物都显示出在相似程度上升高的血清IL-6浓度(如图18所图示)，其在输注结束后6小时达到峰值并且到输注结束后24小时返回到基线。如图18进一步图示的，被给药了LNP1和LNP2的动物都显示出增加的血清IL-1RA，其在6小时达到峰值并且到336小时完全返回到基线。另外，如图18所图示，LNP1和LNP2对血清MCP-1或IP-10浓度均没有任何可测量的显著影响。

总体而言，对前述参数的分析表明，在猴中输注LNP1和LNP2导致肝酶和细胞因子的短暂增加，其迅速消退。

药代动力学(PK)评价

获得血液样品(K₂EDTA)用于血浆PK分析和确定构成LNP1和LNP2的iLipid和PEG脂质赋形剂的浓度。输注结束后，在LNP输注后0.25、2、6、24、48、96、168、240和336小时采集血浆样品。使用合格的LC-MS测定测量iLipid和PEG脂质的浓度，其在图19A中示出。该图中不包括脂质低于定量限的时间点。如图19A所图示，被给药了LNP1和LNP2的动物的血清iLipid浓度持续下降，直至在LNP输注后96小时接近定量下限(LLOQ)。类似地，如图19B所图示，被给药了LNP1和LNP2的动物的血清PEG-脂质浓度也迅速下降，在输注结束后24小时达到LLOQ。

B部分：使用GalNAc LNP的GA519的体内NHP评价

在GA519的进一步评价中，将另外的LNP(LNP3)配制成以1:1的重量比包封相同的GA519和ABE8.8 mRNA，并如前所述的静脉内给药至NHP。LNP3与LNP1的不同之处在于LNP3是用另外的GalNAc配体赋形剂配制的，如下文更详细地描述。

LNP制备

针对本研究的这一方面配制的GalNAc LNP(LNP3)包含与结合LNP1/LNP2描述的相同的iLipid、中性辅助脂质、PEG-脂质和固醇脂质，但是与LNP1/LNP2不同，LNP3还包含GalNAc缀合的脂质。LNP3的每个构成组分的摩尔比描述在表15中。

表15.LNP3组分

*描述在国际公布专利申请WO 2021/178725 A1中

应理解，表15中的脂质可以被所列类别中的其他合适的脂质取代。例如，氨基脂质可以是以下氨基脂质或其盐：

应进一步理解，表13中的脂质的mol％可以被调整，并且表13中所包括的mol％是LNP的目标赋形剂百分比(其旨在表示在给定批次中配制的所有LNP的合计mol％)，并且批次内的特定LNP可以具有不同的mol％。因此，本文考虑到表13中列出的LNP组分中的一种或多种或全部LNP组分的mol％可以被调整，例如+/-1％-5％、+/-5％-10％或+/-10％-20％。本文进一步考虑到，表13中列出的LNP组分中的一种或多种或全部LNP组分相对于根据所需目标赋形剂百分比配制的在给定批次的LNP中配制的特定LNP的mol％可以与目标mol％有差异，例如相差+/-1％-5％、+/-5％-10％或+/-10％-20％，或甚至大于+/-20％。进一步地，应理解，可以将另外的LNP组分(包括非脂质组分)添加到表13中列出的LNP组分中。

在配制LNP3时，将GalNAc-脂质与表15中提及的其他LNP赋形剂预混合，之后与GA519 sgRNA和ABE 8.8mRNA(以1:1重量比)在线混合以形成LNP3。Rajeev等人的WO2021178725包括GalNAc脂质的合成和表征的描述。与LNP1/LNP2一样，使用0.2微米过滤器过滤所得GalNAc-LNP(LNP3)，并将其在-80℃下冷冻。表16中总结了配制的LNP3的物理特性。

表16.LNP3表征。

LNP	平均LNP尺寸(nm)	PDI	RNA包载
				3	61.92	0.055	98.7

本领域普通技术人员将理解，表16中列出的平均LNP尺寸、PDI和RNA包载值受到测量误差或准确性的影响。本文还考虑到，表16中列出的LNP尺寸、PDI和RNA包载值可以变化+/-1％-5％、+/-5％-10％或+/-10％-20％。

NHP研究设计

在本研究的这一方面，使用柬埔寨来源的雄性食蟹猴。在第-1天(给药前约24小时)和在第1天(给药前)在测试物品剂量施用前30至60分钟之间，向所有动物施用包含地塞米松以及H1和H2抗组胺药的前驱用药方案。在研究的第1天，通过以以下剂量水平对两个3只猴的组进行IV输注来施用LNP3给药制剂：(i)对于第一组的3只猴，2mg组合的sgRNA和mRNA/kg动物体重且剂量体积为6mL/kg(n＝3/组)，以及(ii)对于第二组的3只猴，3mg组合的sgRNA和mRNA/kg动物体重且剂量体积为6mL/kg(n＝3/组)。

给药前从所有动物中采集血液样品用于基线测量，并且输注后在第1天至第35天的各种时间点从所有动物中采集血液样品，以评估生物标志物、血浆iLipid和PEG药代动力学以及血清安全性参数。

在第36天进行尸检。从所有动物中采集肝组织样品以评估肝中的TTR基因编辑。

编辑效率分析

如先前所述(Musunuru等人,Nature 593,第7859期(2021年5月):429-34.https://doi.org/10.1038/s41586-021-03534-y)通过对从提取自肝的基因组DNA衍生的TTR靶位点处的靶向聚合酶链式反应(PCR)扩增子进行下一代测序(NGS)来评价肝中基因编辑的量。编辑百分比被报告为在靶腺嘌呤处含有非参考等位基因的所有读段的百分比。

如图20所示，与被给药了3mg/kg的猴(63％)相比，LNP3在被给药了2mg/kg的猴中产生相似的肝TTR编辑效率水平(60％)。

血清中TTR蛋白表达的量化

在输注前第-10、-7、-5天和在输注结束后7、14、21、28和35天采集血清用于TTR蛋白分析。初始使用定制的TTR夹心ELISA来量化血清TTR，从该分析中获得的数据呈现在图21中。对第-10、-7和-5天的值进行平均以获得基线值。如图21所图示，两组被给药了LNP3的动物在给药后的第一个时间点(第7天)都显示出血清TTR蛋白的显著降低。这些降低在研究持续时间内得以维持，在第28天达到对于2mg/kg和3mg/kg猴组分别为相对于基线变化了-84％和-91％的最大降低。为了确认ELISA结果，还通过LC-MS对TTR蛋白进行定量，其中在每个时间点对血清中的4个独特的TTR肽片段进行定量，并报告该4个结果的平均值。LC-MS血清TTR定量(如图22所图示)确认了TTR在第7天在动物输注后的第一个时间点降低，并被维持直至第35天尸检。对于被给药了2mg/kg LNP3的动物，在第35天达到TTR蛋白的最大降低(相对于基线变化了-82％)，而对于3mg/kg组，在第28天达到TTR蛋白的最大降低(相对于基线变化了-87％)。

因此，如上文所述和前述参考图中所图示，被给药了2mg/kg和3mg/kg LNP3的NHP都导致显著相对快速的肝TTR基因编辑以及蛋白质中血清TTR浓度的对应降低。

安全性分析

在输注前第-10、-7、-5天和在输注结束后6小时、24小时、48小时、96小时、168小时、336小时、第21天、第28天和第35天从研究中的每只动物中采集血清用于安全性分析，特别是旨在观察肝酶和细胞因子水平变化。在Beckman Coulter AU680分析仪上直接测量血清样品的血清化学参数。对第-10、-7和-5天的值进行平均以获得基线值。被给药了LNP3的动物显示出剂量依赖性的短暂的丙氨酸转氨酶升高(如图23A所图示)，其在输注结束后24-48小时达到峰值并且在输注结束后336小时返回到基线水平。2mg/kg和3mg/kg LNP3剂量也在相似程度上升高了天冬氨酸转氨酶水平(如图23B所图示)，其在输注结束后6小时达到峰值并且在输注结束后168小时返回到基线水平。如图24A所图示，2mg/k和3mg/kg LNP3剂量都升高了血清乳酸脱氢酶浓度，其到输注结束后168小时返回到基线水平。LNP3还以剂量依赖性方式升高了谷氨酸脱氢酶浓度(如图24B所图示)，其在输注结束后24小时达到峰值并且在输注结束后336小时返回到基线水平。这两种LNP剂量中的任一种均没有显著改变γ-谷氨酰转移酶和碱性磷酸酶的血清浓度(分别地如图258A和图25B所图示)。另外，LNP3处理没有显著影响血清总胆红素浓度，如图26所图示。LNP3升高了血清肌酸激酶浓度(如图27所图示)，其在输注结束后6小时达到峰值，然后在输注结束后168小时返回到基线水平。

在体内NHP研究的这一方面对前述安全性参数的分析与该研究的先前方面是一致的，因为它们证明这两种剂量的LNP3都导致肝酶的短暂增加，其在对受试者给药后2周内迅速消退。

药代动力学(PK)评价

从所有动物中获得血液样品(K₂EDTA)用于血浆PK分析和确定构成LNP3的可电离氨基脂质(iLipid)和PEG脂质的浓度。输注结束后，在LNP3输注后0.25、2、6、24、48、96、168、240和336小时采集血浆样品。使用合格的LC-MS测定测量iLipid和PEG-脂质的浓度。观察到剂量依赖性的iLipid血浆暴露(如图28A所图示)，其到输注结束后96小时下降至低于LLOQ。还观察到PEG脂质的剂量依赖性血浆暴露(如图28B所图示)，其到输注结束后24小时达到LLOQ。

本文引用的所有专利、专利申请和出版物以及可以电子方式获得的材料(包括：例如，例如GenBank和RefSeq中的核苷酸序列提交，以及例如SwissProt、PIR、PRF、PDB中的氨基酸序列提交以及来自GenBank和RefSeq中带注释的编码区的翻译)的完整公开内容以引用方式并入。在本申请的公开内容与以引用方式并入本文的任何文献的公开内容之间存在任何不一致的情况下，应以本申请的公开内容为准。前述详细描述和实施例仅为了清楚地理解而给出。由此不应理解不必要的限制。本发明不限于所示和所述的具体细节，对于本领域技术人员显而易见的变化将被包括在由权利要求书限定的本发明内。

其他实施方案

从前述描述中将显而易见的是，可以对本文所述的公开内容作出变化和修改以将该公开内容应用于各种用途和条件。此类实施方案也在所附权利要求书的范围内。

本文中变量的任何定义中的组成部分列表的叙述包括对呈以下形式的该变量的定义：任何单个组成部分或所列组成部分的组合(或子组合)。对本文中实施方案的叙述包括呈以下形式的该实施方案：任何单个实施方案、该实施方案的任何部分，或与任何其他实施方案或其任何部分的组合。

如本文所述，将意识到本公开包括：用于在基因中实现核碱基改变的碱基编辑系统及使用该碱基编辑系统治疗疾病的方法的具体实施方案和实例，包括包含此类碱基编辑系统的组合物、对其进行的设计和修改；以及描述了单独的和呈组合的形式(包括作为用于治疗疾病和用于在所描述的条件下将活性剂在体内和在体外递送至哺乳动物细胞的药物组合物)的前述物的合成、制备、用途和功效的具体实例和实施方案。

虽然已经提供了具体实例和许多实施方案来说明前述物的方面和方面的组合，但是应意识到并应理解，示例性或公开的实施方案的任何方面或其组合可以从中被排除以不受限制地构成另一实施方案，并且考虑到任何此种实施方案可以构成单独且独立的权利要求。类似地，应意识到并应理解，一个或多个实施方案的任何方面或方面的组合也可以与一个或多个实施方案的任何方面或方面的组合一起被包含或组合在一起，并且本文考虑到它们的所有此类组合都落入在本公开的范围内，并且可以不受限制地呈现为单独且独立的权利要求。因此，应意识到，一项权利要求中呈现的任何特征可以被包含在另一项权利要求中；一项权利要求中呈现的任何特征可以从该权利要求中被删除以构成没有该特征的权利要求；并且一项权利要求中呈现的任何特征可以与另一项权利要求中的任何特征组合，其中每个特征都在本文中被考虑。以下列举的条款是前述实施方案和实例的方面和方面的组合的进一步说明性实例：

以下是列举的条款的实例：

1.一种经分离的多核苷酸或编码其的核酸，所述多核苷酸包含含有约17至约23个核苷酸的5’-间隔区序列，所述5’-间隔区序列与编码甲状腺素转运蛋白(TTR)的基因内的被靶向原间隔区序列同源，所述被靶向原间隔区序列与基因组内的NGG原间隔区相邻基序(PAM)序列相邻；所述经分离的多核苷酸用作用于引导碱基编辑器系统在TTR基因中实现核碱基改变的指导多核苷酸。

2.如条款1所述的经分离的多核苷酸或编码其的核酸，其进一步包含所述5’间隔区的3’的tracrRNA结构域，其中tracrRNA被配置成结合碱基编辑器蛋白。

3.如条款1或2所述的经分离的多核苷酸或编码其的核酸，其中所述原间隔区序列包含所述TTR基因的起始密码子或剪接位点。

4.如前述条款中任一项所述的经分离的多核苷酸或编码其的核酸，其中在所述TTR基因中实现的所述核碱基改变包括起始密码子的破坏或内含子外显子剪接位点的破坏。

5.如前述条款中任一项所述的经分离的多核苷酸或编码其的核酸，其中在所述TTR基因中实现的所述核碱基改变包括内含子外显子剪接位点的破坏。

6.如前述条款中任一项所述的经分离的多核苷酸或编码其的核酸，其中所述经分离的多核苷酸或由编码其的核酸编码的多核苷酸包含与以下序列至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％，或至少约95％同一的间隔区序列：

5’-GCCAUCCUGCCAAGAAUGAG-3’(SEQ ID NO:1)(GA457)；

5’-GCCAUCCUGCCAAGAACGAG-3’(SEQ ID NO:2)(GA519)；

5’-GCCAUCCUGCCAAGAACGAG-3’(SEQ ID NO:2)(GA458)；

5’-GCAACUUACCCAGAGGCAAA-3’(SEQ ID NO:3)(GA459)；

5’-UAUAGGAAAACCAGUGAGUC-3’(SEQ ID NO:4)(GA460/GA520)；或

5’-UACUCACCUCUGCAUGCUCA-3’(SEQ ID NO:5)(GA461)。

7.如条款6所述的经分离的多核苷酸或编码其的核酸，其中所述经分离的多核苷酸或由编码其的核酸编码的多核苷酸包含具有以下序列之一的间隔区序列：

5’-GCCAUCCUGCCAAGAAUGAG-3’(SEQ ID NO:1)(GA457)；

5’-GCCAUCCUGCCAAGAACGAG-3’(SEQ ID NO:2)(GA519)；

5’-GCCAUCCUGCCAAGAACGAG-3’(SEQ ID NO:2)(GA458)；

5’-GCAACUUACCCAGAGGCAAA-3’(SEQ ID NO:3)(GA459)；

5’-UAUAGGAAAACCAGUGAGUC-3’(SEQ ID NO:4)(GA460/GA520)；或

5’-UACUCACCUCUGCAUGCUCA-3’(SEQ ID NO:5)(GA461)。

8.如前述条款中任一项所述的经分离的多核苷酸或编码其的核酸，其中所述经分离的多核苷酸或由编码其的核酸编码的多核苷酸包含指导RNA。

9.一种组合物，其包含前述条款中任一项所述的经分离的多核苷酸或编码其的核酸。

10.一种组合物，其包含前述条款中任一项所述的经分离的多核苷酸或编码其的核酸以及编码碱基编辑器融合蛋白的核酸。

11.如条款10所述的组合物，其中所述碱基编辑器融合蛋白包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶。

12.如条款11所述的组合物，其中所述脱氨酶包括胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶。

13.如条款10至12中任一项所述的组合物，其中所述可编程DNA结合结构域包含催化受损的Cas9蛋白。

14.如条款13所述的组合物，其中所述催化受损的Cas9蛋白包括催化受损的化脓性链球菌Cas9蛋白。

15.如条款11至14中任一项所述的组合物，其中所述脱氨酶包括ABE8.8。

16.如条款11至14中任一项所述的组合物，其中所述脱氨酶由包含表11中的MA004mRNA序列的mRNA编码。

17.如条款11至14中任一项所述的组合物，其中所述脱氨酶由包含与如表11中所示的MA004 mRNA具有95％或更大序列同一性的序列的mRNA编码。

18.如条款11至14中任一项所述的组合物，其中所述脱氨酶由包含与如表11中所示的MA004 mRNA具有96％或更大序列同一性的序列的mRNA编码。

19.如条款11至14中任一项所述的组合物，其中所述脱氨酶由包含与如表11中所示的MA004 mRNA具有97％或更大序列同一性的序列的mRNA编码。

20.如条款11至14中任一项所述的组合物，其中所述脱氨酶由包含与如表11中所示的MA004 mRNA具有98％或更大序列同一性的序列的mRNA编码。

21.如条款11至14中任一项所述的组合物，其中所述脱氨酶由包含与如表11中所示的MA004 mRNA具有99％或更大序列同一性的序列的mRNA编码。

22.一种药物组合物，其包含条款1至8中任一项所述的经分离的多核苷酸或编码其的核酸或者条款9至21中任一项所述的组合物。

23.一种脂质纳米颗粒(LNP)，其包含权利要求1至8中任一项所述的经分离的多核苷酸或编码其的核酸、条款9至21中任一项所述的组合物，或者条款22所述的药物组合物。

24.如条款23所述的LNP，其包含具有以下结构的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂合物：

25.如条款23所述的LNP，其包含具有以下结构的氨基脂质或其药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂合物：

26.如条款24或25所述的LNP，其进一步包含中性辅助脂质、PEG-脂质和固醇脂质。

27.如条款24或25所述的LNP，其包含表12中列出的组分。

28.如条款27所述的LNP，其中表12中列出的所述组分以表12中列出的摩尔百分比(Mol％)的10％至20％以内的Mol％存在于LNP中。

29.如条款27所述的LNP，其中表12中列出的所述组分以表12中列出的摩尔百分比(Mol％)的5％至10％以内的Mol％存在于LNP中。

30.如条款27所述的LNP，其中表12中列出的所述组分以表12中列出的摩尔百分比(Mol％)的1％至5％以内的Mol％存在于LNP中。

31.如条款27所述的LNP，其中表12中列出的所述组分以表12中列出的摩尔百分比(Mol％)存在于LNP中。

32.如条款27至31中任一项所述的LNP，其中所述LNP包含受体靶向缀合物，所述受体靶向缀合物包含式(V)的化合物：

其中，

多个A是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或 或它们的衍生物；

每个L¹、L²、L³、L⁴、L⁵、L⁶、L⁷、L⁸、L⁹、L¹⁰和L¹²均独立地是经取代或未经取代的C₁-C₁₂亚烷基、经取代或未经取代的C₁-C₁₂杂亚烷基、经取代或未经取代的C₂-C₁₂亚烯基、经取代或未经取代的C₂-C₁₂亚炔基、-(CH₂CH₂O)_m-、-(OCH₂CH₂)_m-、-O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)₂-、-S(＝O)(＝NR¹)-、-C(＝O)-、-C(＝N-OR¹)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)C(＝O)-、-C(＝O)NR¹-、-NR¹C(＝O)-、-OC(＝O)NR¹-、-NR¹C(＝O)O-、-NR¹C(＝O)NR¹-、-C(＝O)NR¹C(＝O)-、-S(＝O)₂NR¹-、-NR¹S(＝O)₂-、-NR¹-，或-N(OR¹)-；

L¹¹是经取代或未经取代的-(CH₂CH₂O)_n-、经取代或未经取代的-(OCH₂CH₂)_n-或者经取代或未经取代的–(CH₂)_n-；

每个R¹均独立地是H或者经取代或未经取代的C₁-C₆烷基；

R是脂质；

m是选自1至10的整数；以及

n是选自1至200的整数。

33.一种药物组合物，其包含条款23至32中任一项所述的LNP。

34.一种在细胞中的TTR基因中实现一个或多个核碱基改变的方法，所述方法包括使所述细胞与条款1至8中任一项所述的多核苷酸或核酸、条款9至21中任一项所述的组合物、条款22或33所述的药物组合物，或者条款23至32中任一项所述的LNP接触。

35.如条款34所述的方法，其中所述TTR基因的一个或多个等位基因被沉默。

36.一种在受试者的甲状腺素转运蛋白(TTR)基因中实现一个或多个核碱基改变的方法，所述方法包括向所述受试者施用如条款1至8中任一项所述的多核苷酸或核酸、条款9至21中任一项所述的组合物、条款22或33所述的药物组合物，或者条款23至32中任一项所述的脂质纳米颗粒。

37.如条款36所述的方法，其中当通过下一代测序测量时，所述碱基改变发生在所述受试者的25％或更多的全肝细胞中。

38.如条款36所述的方法，其中当通过下一代测序测量时，所述碱基改变发生在所述受试者的40％或更多的全肝细胞中。

39.如条款36所述的方法，其中当通过下一代测序测量时，所述碱基改变发生在所述受试者的50％或更多的全肝细胞中。

40.如条款36至39中任一项所述的方法，其中所述碱基改变导致血清TTR水平降低。

41.如条款36至40中任一项所述的方法，其中所述TTR基因的一个或多个等位基因被沉默。

42.如条款36至41中任一项所述的方法，其中所述受试者是非人灵长类动物。

43.如条款36至41中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

44.如条款43所述的方法，其中所述多核苷酸或核酸、所述组合物、所述药物组合物或所述LNP被施用至的受试者是有需要的受试者。

45.如条款44所述的方法，其中施用所述多核苷酸或核酸、所述组合物、所述药物组合物或所述LNP包括施用治疗有效量的所述多核苷酸、所述组合物、所述药物组合物或所述LNP。

46.如条款45所述的方法，其中所述受试者由于所述TTR基因中的一个或多个突变而患有遗传性甲状腺素转运蛋白淀粉样变性(hATTR)或者处于患遗传性甲状腺素转运蛋白淀粉样变性(hATTR)的风险中。

47.如条款46所述的方法，其中所述受试者患有心肌病(hATTR-CM)和/或多发性神经病(hATTR-PN)，或者处于患心肌病(hATTR-CM)和/或多发性神经病(hATTR-PN)的风险中。

48.如条款45所述的方法，其中所述受试者患有以所述TTR基因的野生型等位基因(ATTRwt)为特征的老年性心脏淀粉样变性或者处于患该老年性心脏淀粉样变性的风险中。

49.如条款36至48中任一项所述的方法，其中静脉内施用所述多核苷酸或核酸、所述组合物、所述药物组合物或所述LNP。

50.一种用于编辑TTR基因的组合物，其包含：

(a)mRNA，其编码具有编辑窗口的碱基编辑器蛋白；以及

(b)指导RNA，其包含用作所述碱基编辑器蛋白的结合支架的tracr序列和用于将所述碱基编辑器蛋白引导到所述TTR基因上的原间隔区序列的间隔区序列；

其中所述间隔区序列至少部分地与所述TTR基因的剪接位点或起始密码子互补。

51.如条款50所述的组合物，其中所述碱基编辑器蛋白包含胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶。

52.如条款50所述的组合物，其中所述碱基编辑器蛋白包含含有切口酶和胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶的融合蛋白。

53.如条款50所述的组合物，其中所述碱基编辑器蛋白包含含有D10A切口酶Cas9和胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶的融合蛋白。

54.如条款51至53中任一项所述的组合物，其中其中所述胞苷脱氨酶是脱氧胞苷脱氨酶。

55.如条款51至53中任一项所述的组合物，其中其中所述腺苷脱氨酶是脱氧腺苷脱氨酶。

56.如条款50所述的组合物，其中所述碱基编辑器蛋白包含含有腺嘌呤碱基编辑器ABE8.8的融合蛋白。

57.如条款60至56中任一项所述的组合物，其中所述间隔区序列与选自表1的原间隔区序列同源。

58.如条款50至56中任一项所述的组合物，其中所述间隔区序列选自下表：

其中：A是腺苷；C是胞苷；G是鸟苷；U是尿苷；a是2’-O-甲基腺苷；c是2’-O-甲基胞苷；g是2’-O-甲基鸟苷；u是2’-O-甲基尿苷并且s是硫代磷酸酯(PS)骨架键联。

59.如条款50至56中任一项所述的组合物，其中所述间隔区序列与下表中呈现的间隔区序列具有大于80％的序列同一性：

gRNA间隔区序列(5’-3’)
	GCCAUCCUGCCAAGAAUGAG(SEQ ID NO:1)
GCCAUCCUGCCAAGAACGAG(SEQ ID NO:2)
	GCAACUUACCCAGAGGCAAA(SEQ ID NO:3)
UAUAGGAAAACCAGUGAGUC(SEQ ID NO:4)
	UACUCACCUCUGCAUGCUCA(SEQ ID NO:5)
GCCAUCCUGCCAAGAACGAG(SEQ ID NO:2)

其中：A是经修饰或未经修饰的腺苷；C是经修饰或未经修饰的胞苷；G是经修饰或未经修饰的鸟苷；并且U是经修饰或未经修饰的尿苷。

60.如条款50至56中任一项所述的组合物，其中所述指导RNA选自下表：

其中：A是腺苷；C是胞苷；G是鸟苷；U是尿苷；a是2’-O-甲基腺苷；c是2’-O-甲基胞苷；g是2’-O-甲基鸟苷；u是2’-O-甲基尿苷并且s是硫代磷酸酯(PS)骨架键联，并且其中粗体表示间隔区序列。

61.如条款50至60中任一项所述的组合物，其中所述间隔区序列与选自下表的指导RNA序列具有大于80％的序列同一性：

62.如条款50至61中任一项所述的组合物，其中所述组合物能够产生在从中排除GA459的表2中列出的编辑活性的50％以内的编辑活性，或能够产生在表3中列出的编辑活性的50％以内的编辑活性。

63.如条款50至62中任一项所述的组合物，其中所述组合物能够在表4、表6、表7、表8、表9或表10中列出的一个或多个潜在脱靶位点处产生总脱靶编辑活性的50％以内的脱靶编辑活性，或小于或等于所观察到的脱靶编辑活性的脱靶编辑活性，或者不产生脱靶编辑活性。

64.如条款50至63中任一项所述的组合物，其中所述组合物被包封在脂质纳米颗粒内。

65.如条款50至64中任一项所述的组合物，其中所述组合物在体内施用于受试者。

通过回顾本公开还将意识到，考虑到在一项或一组相关条款中提出的一个或多个方面或特征也可以被包含在其他条款中或者与其他条款中的一个或多个方面或特征组合。

Claims (44)

1.一种经分离的多核苷酸或编码其的核酸，所述多核苷酸包含含有约17至约23个核苷酸的5’-间隔区序列，所述5’-间隔区序列与编码甲状腺素转运蛋白(TTR)的基因内的被靶向原间隔区序列同源，所述被靶向原间隔区序列与基因组内的NGG原间隔区相邻基序(PAM)序列相邻；

所述经分离的多核苷酸用作用于引导碱基编辑器系统在所述TTR基因中实现核碱基改变的指导多核苷酸。

2.如权利要求1所述的经分离的多核苷酸或编码其的核酸，其进一步包含所述5’间隔区的3’的tracrRNA结构域，其中所述tracrRNA被配置成结合碱基编辑器蛋白。

3.如权利要求1或2所述的经分离的多核苷酸或编码其的核酸，其中所述原间隔区序列包含所述TTR基因的起始密码子或剪接位点。

4.如前述权利要求中任一项所述的经分离的多核苷酸或编码其的核酸，其中在所述TTR基因中实现的所述核碱基改变包括起始密码子的破坏或内含子外显子剪接位点的破坏。

5.如前述权利要求中任一项所述的经分离的多核苷酸或编码其的核酸，其中在所述TTR基因中实现的所述核碱基改变包括内含子外显子剪接位点的破坏。

6.如前述权利要求中任一项所述的经分离的多核苷酸或编码其的核酸，其中所述经分离的多核苷酸或由编码其的核酸编码的多核苷酸包含与以下序列至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％，或至少约95％同一的间隔区序列：

5’-GCCAUCCUGCCAAGAAUGAG-3’(SEQ ID NO:1)(GA457)；

5’-GCCAUCCUGCCAAGAACGAG-3’(SEQ ID NO:2)(GA519)；

5’-GCCAUCCUGCCAAGAACGAG-3’(SEQ ID NO:2)(GA458)；

5’-GCAACUUACCCAGAGGCAAA-3’(SEQ ID NO:3)(GA459)；

5’-UAUAGGAAAACCAGUGAGUC-3’(SEQ ID NO:4)(GA460/GA520)；或

5’-UACUCACCUCUGCAUGCUCA-3’(SEQ ID NO:5)(GA461)。

7.如权利要求6所述的经分离的多核苷酸或编码其的核酸，其中所述经分离的多核苷酸或由编码其的核酸编码的多核苷酸包含具有以下序列之一的间隔区序列：

5’-GCCAUCCUGCCAAGAAUGAG-3’(SEQ ID NO:1)(GA457)；

5’-GCCAUCCUGCCAAGAACGAG-3’(SEQ ID NO:2)(GA519)；

5’-GCCAUCCUGCCAAGAACGAG-3’(SEQ ID NO:2)(GA458)；

5’-GCAACUUACCCAGAGGCAAA-3’(SEQ ID NO:3)(GA459)；

5’-UAUAGGAAAACCAGUGAGUC-3’(SEQ ID NO:4)(GA460/GA520)；或

5’-UACUCACCUCUGCAUGCUCA-3’(SEQ ID NO:5)(GA461)。

8.如前述权利要求中任一项所述的经分离的多核苷酸或编码其的核酸，其中所述经分离的多核苷酸或由编码其的核酸编码的多核苷酸包含指导RNA。

9.一种组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的经分离的多核苷酸或编码其的核酸。

10.一种组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的经分离的多核苷酸或编码其的核酸以及编码碱基编辑器融合蛋白的核酸。

11.如权利要求10所述的组合物，其中所述碱基编辑器融合蛋白包含可编程DNA结合结构域和脱氨酶。

12.如权利要求11所述的组合物，其中所述脱氨酶包括胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶。

13.如权利要求10至12中任一项所述的组合物，其中所述可编程DNA结合结构域包含催化受损的Cas9蛋白。

14.如权利要求13所述的组合物，其中所述催化受损的Cas9蛋白包括催化受损的化脓性链球菌Cas9蛋白。

15.如权利要求11至14中任一项所述的组合物，其中所述脱氨酶包括ABE8.8。

16.一种药物组合物，其包含权利要求1至8中任一项所述的经分离的多核苷酸或编码其的核酸或者权利要求9至15中任一项所述的组合物。

17.一种脂质纳米颗粒(LNP)，其包含权利要求1至8中任一项所述的经分离的多核苷酸或编码其的核酸、权利要求9至15中任一项所述的组合物，或者权利要求16所述的药物组合物。

18.一种药物组合物，其包含权利要求17所述的LNP。

19.一种在细胞中的TTR基因中实现一个或多个核碱基改变的方法，所述方法包括使所述细胞与权利要求1至8中任一项所述的多核苷酸或核酸、权利要求9至15中任一项所述的组合物、权利要求16或18所述的药物组合物，或者权利要求17所述的LNP接触。

20.一种在受试者的甲状腺素转运蛋白(TTR)基因中实现一个或多个核碱基改变的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求1至8中任一项所述的多核苷酸或核酸、权利要求9至15中任一项所述的组合物、权利要求16或18所述的药物组合物，或者权利要求17所述的脂质纳米颗粒。

21.如权利要求19或20所述的方法，其中所述TTR基因的一个或多个等位基因被沉默。

22.如权利要求20或21所述的方法，其中所述受试者是人。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述多核苷酸或核酸、所述组合物、所述药物组合物或所述LNP被施用至的所述受试者是有需要的受试者。

24.如权利要求23所述的方法，其中施用所述多核苷酸或核酸、所述组合物、所述药物组合物或所述LNP包括施用治疗有效量的所述多核苷酸、所述组合物、所述药物组合物或所述LNP。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述受试者由于所述TTR基因中的一个或多个突变而患有遗传性甲状腺素转运蛋白淀粉样变性(hATTR)或处于患遗传性甲状腺素转运蛋白淀粉样变性(hATTR)的风险中。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述受试者患有心肌病(hATTR-CM)和/或多发性神经病(hATTR-PN)，或者处于患心肌病(hATTR-CM)和/或多发性神经病(hATTR-PN)的风险中。

27.如权利要求24所述的方法，其中所述受试者患有以所述TTR基因的野生型等位基因(ATTRwt)为特征的老年性心脏淀粉样变性或处于患该老年性心脏淀粉样变性的风险中。

28.如权利要求20至27中任一项所述的方法，其中静脉内施用所述多核苷酸或核酸、所述组合物、所述药物组合物或所述LNP。

29.一种用于编辑TTR基因的组合物，其包含：

(a)mRNA，其编码具有编辑窗口的碱基编辑器蛋白；以及

(b)指导RNA，其包含用作所述碱基编辑器蛋白的结合支架的tracr序列和用于将所述碱基编辑器蛋白引导到所述TTR基因上的原间隔区序列的间隔区序列；

其中所述间隔区序列至少部分地与所述TTR基因的剪接位点或起始密码子互补。

30.如权利要求29所述的组合物，其中所述碱基编辑器蛋白包含胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶。

31.如权利要求29所述的组合物，其中所述碱基编辑器蛋白包含含有切口酶和胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶的融合蛋白。

32.如权利要求29所述的组合物，其中所述碱基编辑器蛋白包含含有D10A切口酶Cas9和胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶的融合蛋白。

33.如权利要求30至32中任一项所述的组合物，其中所述胞苷脱氨酶是脱氧胞苷脱氨酶。

34.如权利要求30至32中任一项所述的组合物，其中所述腺苷脱氨酶是脱氧腺苷脱氨酶。

35.如权利要求29所述的组合物，其中所述碱基编辑器蛋白包含含有腺嘌呤碱基编辑器ABE8.8的融合蛋白。

36.如权利要求29至35中任一项所述的组合物，其中所述间隔区序列与选自表1的原间隔区序列同源。

37.如权利要求29至35中任一项所述的组合物，其中所述间隔区序列选自下表：

gRNA间隔区序列(5’-3’) gscscsAUCCUGCCAAGAAUGAG(SEQ ID NO:6) gscscsAUCCUGCCAAGAACGAG(SEQ ID NO:7) gscsasACUUACCCAGAGGCAAA(SEQ ID NO:8) usasusAGGAAAACCAGUGAGUC(SEQ ID NO:9) usascsUCACCUCUGCAUGCUCA(SEQ ID NO:10) gscscsAUCCUGCCAAGAACGAG(SEQ ID NO:7)

其中：A是腺苷；C是胞苷；G是鸟苷；U是尿苷；a是2’-O-甲基腺苷；c是2’-O-甲基胞苷；g是2’-O-甲基鸟苷；u是2’-O-甲基尿苷并且s是硫代磷酸酯(PS)骨架键联。

38.如权利要求29至35中任一项所述的组合物，其中所述间隔区序列与下表中呈现的间隔区序列具有大于80％的序列同一性：

gRNA间隔区序列(5’-3’) GCCAUCCUGCCAAGAAUGAG(SEQ ID NO:1) GCCAUCCUGCCAAGAACGAG(SEQ ID NO:2) GCAACUUACCCAGAGGCAAA(SEQ ID NO:3) UAUAGGAAAACCAGUGAGUC(SEQ ID NO:4) UACUCACCUCUGCAUGCUCA(SEQ ID NO:5) GCCAUCCUGCCAAGAACGAG(SEQ ID NO:2)

其中：A是经修饰或未经修饰的腺苷；C是经修饰或未经修饰的胞苷；G是经修饰或未经修饰的鸟苷；并且U是经修饰或未经修饰的尿苷。

39.如权利要求29至35中任一项所述的组合物，其中所述指导RNA选自下表：

其中：A是腺苷；C是胞苷；G是鸟苷；U是尿苷；a是2’-O-甲基腺苷；c是2’-O-甲基胞苷；g是2’-O-甲基鸟苷；u是2’-O-甲基尿苷并且s是硫代磷酸酯(PS)骨架键联，并且其中粗体表示所述间隔区序列。

40.如权利要求29至35中任一项所述的组合物，其中所述间隔区序列与选自下表的指导RNA序列具有大于80％的序列同一性：

41.如权利要求29至40中任一项所述的组合物，其中所述组合物能够产生在从中排除GA459的表2中列出的编辑活性的50％以内的编辑活性，或能够产生在表3中列出的编辑活性的50％以内的编辑活性。

42.如权利要求29至41中任一项所述的组合物，其中所述组合物能够在表4、表6、表7、表8、表9或表10中列出的一个或多个潜在脱靶位点处产生总脱靶编辑活性的50％以内的脱靶编辑活性，或小于或等于所观察到的脱靶编辑活性的脱靶编辑活性，或者不产生脱靶编辑活性。

43.如权利要求29至42中任一项所述的组合物，其中所述组合物被包封在脂质纳米颗粒内。

44.如权利要求29至43中任一项所述的组合物，其中所述组合物在体内施用于受试者。