CN115786379A - 固定化酶与制备方法以及固定化酶转化fr901379的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种固定化酶与制备方法以及固定化酶转化FR901379的方法，涉及构建大肠杆菌基因工程菌，发酵法获得菌体，采用超声破碎和十六烷基三甲基溴化铵浸提方法获得酶液，利用中空纤维膜浓缩酶液，然后与氨基型载体结合形成固定化酶，利用固定化酶转化FR901379获得FR179642。本发明制备的固定化酶转化FR901379的转化效率高，达到95％以上，转化时间短，产物易于分离提取，转化液色素较少，固定化酶可重复使用，有利于将来放大生产。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种固定化酶与制备方法以及固定化酶转化FR901379的方法。
背景技术
真菌感染始终是困扰人类健康的一种顽固性疾病。究其原因，主要是人类对抗生素药物的过度使用造成的真菌耐药和免疫系统损坏等造成的免疫抑制，使机体对真菌的抵抗能力降低，真菌能够趁虚而入。目前能有效治疗深部真菌感染尤其是免疫缺陷合并播散性真菌感染的药物尚不多。因此，开发新的安全有效的抗真菌药物迫在眉睫。
米卡芬净是由日本藤泽公司开发,于2002年12月在日本上市，并于2005年3月通过美国FDA认证，成为继卡泊芬净之后第2个应用于临床的棘白菌素类药物。米卡芬净能够非竞争性抑制1,3-β-D葡聚糖合成酶的活性从而抑制真菌细胞壁合成,由于哺乳动物细胞缺乏1,3-β-D葡聚糖合成酶,故该类化合物对真菌细胞具有较高的特异性,能迅速杀灭真菌,而对人体正常细胞影响不大。
米卡芬净是由酰基转移酶将FR901379去除亚油酰侧链，得到的环状六肽核经化学修饰后形成，FR179642是米卡芬净的前体，由FR901379转化而得，因此提高FR901379的转化率，将有效提高米卡芬净的产量。酰基转移酶需要微生物发酵获得，不能直接合成，已报道的酰基转移酶是游动放线菌发酵产生的，酶活比较低，且发酵周期较长。酰基转移酶转化FR901379形成的溶液中主要含有酰基转移酶、FR179642，将FR179642、酰基转移酶从溶液中分离，一方面可获得高纯度的FR179642，另一方面可重复利用酰基转移酶，但这种分离是非常困难的。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种固定化酶、固定化酶的制备方法以及固定化酶转化FR901379的方法，提高米卡芬净的产量，且能便于酰基转移酶重复利用。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：构建大肠杆菌基因工程菌，发酵法获得菌体，菌体浸提获得酶液，酶浓缩后与载体结合，形成固定化酶，利用固定化酶将FR901379转化成FR179642。
具体技术路线是这样的：
一种固定化酶转化FR901379的方法，涉及构建大肠杆菌基因工程菌，发酵法获得菌体，采用超声破碎和十六烷基三甲基溴化铵浸提方法获得酶液，利用中空纤维膜浓缩酶液，然后与氨基型载体结合形成固定化酶，利用固定化酶转化FR901379获得FR179642。
所述从菌体中获得粗酶液是指将粗酶液的温度控制在10℃以下，对菌体进行超声破碎，然后加入十六烷基三甲基溴化铵和硫酸铵，升温至40～45℃，维持1-3h，将酰基转移酶提取至胞外。
本发明所述的超声条件选择功率450～500W，超声时间5～10min，超声过程控制温度不超过10℃；十六烷基三甲基溴化铵浓度为0.5～1.0％，硫酸铵浓度为1.0～2.0％，浸提温度为40～45℃，浸提时间为1～2h，将酰基转移酶提取至胞外。硫酸铵作为沉淀剂，十六烷基三甲基溴化铵作为表面活性剂。
所述浓缩粗酶液是指通过中空纤维膜将粗酶液浓缩5～6倍，然后浓缩酶液与氨基型载体结合，形成固定化酶。本发明所述的中空纤维膜的截留分子量为5万分子量以上。
所述利用固定化酶转化FR901379时，将FR901379用水溶解，然后加入FR901379溶液3-7wt％的固定化酶，25-35℃转化10-20h。
本发明所述的固定化酶转化FR901379时，FR901379溶液中FR901379浓度优选为2～3g/L，转化温度优选为25～35℃,在此条件下转化率可达到95％以上。
本发明制备固定化酶所用的载体为氨基型载体，所述氨基型载体可以是LX-1000HA、ECR8409或LX-1000EPHA。
本发明所述的表达酰基转移酶的大肠杆菌基因工程菌的宿主菌为大肠杆菌BL21，分泌表达质粒为Pet28a，目的基因为RBS+OmpA+α亚基+RBS+OmpA+β亚基，目的基因的基因序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明获得了一种能够将FR901379转化成FR179642的固定化酶，它的制备方法是，利用表达酰基转移酶的大肠杆菌基因工程菌发酵获得菌体，从菌体中获得酶液，酶液与氨基型载体结合形成固定化酶，所述表达酰基转移酶的大肠杆菌基因工程菌的表达载体中具有SEQ ID NO:1所示的基因序列。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
固定化酶转化FR901379的转化效率高，达到95％以上，转化时间短，产物易于分离提取，转化液色素较少，固定化酶可重复使用，有利于将来放大生产。
附图说明
图1为工程菌的构建示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明的工艺流程为：
工程菌构建→发酵获得菌体→酶提取→酶固定化→将FR901379转化成FR179642。
工程菌的构建
以大肠杆菌BL21为宿主菌，以Pet28a为分泌表达质粒，目的基因结构为RBS+OmpA+α亚基+RBS+OmpA+β亚基，RBS为核糖结合位点，OmpA为分泌信号肽，构建大肠杆菌基因工程菌，如图1所示。
目的基因的序列(SEQ ID NO:1)如下：
TTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGAGAATTCATGAAGAAAACCGCGATCGCGATCGCGGTTGCGCTGGCGGGTTTCGCGACCGTTGCTCAGGCCGGTGAAGGTGAAGGCCATGATGGCGGTTATGCGGCGCTGATCCGTCGTGCGTCTTACGGCGTTCCGCACATCACCGCGGATGATTTCGGCAGCCTGGGCTTCGGCGTTGGCTACGTTCAGGCGGAAGATAACATCTGCGTTATCGCGGAAAGCGTTGTTACCGCGAACGGTGAACGTTCTCGTTGGTTCGGCGCGACCGGCCCGGATGATGCGGATGTTCGTTCTGACCTGTTCCACCGTAAAGCGATCGATGATCGTGTTGCGGAACGCCTGCTGGAAGGCCCGCGTGATGGCGTTCGTGCGCCGTCTGATGATGTTCGTGATCAGATGCGTGGTTTCGTTGCGGGCTACAACCACTTCCTGCGTCGTACCGGCGTTCACCGTCTGACCGATCCGGCGTGCCGTGGTAAAGCGTGGGTTCGTCCGCTGAGCGAAATCGATCTGTGGCGTACCAGCTGGGATAGCATGGTTCGTGCGGGTAGCGGCGCGCTGCTGGATGGCATCGTTGCGGCGACCCCGCCGACCGCGGCGGGCCCGGCGAGCGCGCCGGAAGCGCCGGATGCGTAACCATCTTAGTATTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGACCTAGGATGAAGAAAACCGCGATCGCGATCGCGGTTGCGCTGGCGGGTTTCGCGACCGTTGCTCAGGCCAGCAACGCGTATGGTCTGGGTGCGCAGGCGACCGTGAACGGTAGCGGTATGGTTCTGGCGAACCCGCACTTCCCGTGGCAGGGTGCGGCGCGTTTTTACCGTATGCACCTGAAAGTGCCGGGTCGTTATGACGTTGAGGGTGCGGCGCTGATCGGCGATCCGATCATTGGCATTGGTCACAACCGTACCGTTGCGTGGAGCCACACCGTTAGCACCGCGCGTCGTTTCGTGTGGCATCGTCTGAGCCTGGTTCCGGGTGACCCGACCAGCTACTATGTTGATGGTCGTCCGGAACGTATGCGTGCGCGTACCGTGACCGTTCAAACCGGTAGCGGTCCGGTTAGCCGTACCTTCCACGACACCCGTTACGGTCCGGTGGCGGTTATGCCGGGCACCTTTGATTGGACCCCGGCGACCGCGTATGCGATCACCGACGTTAACGCGGGTAACAACCGTGCGTTCGATGGTTGGCTGCGTATGGGCCAGGCGAAGGACGTGCGTGCGCTGAAAGCGGTTCTGGATCGTCACCAATTTCTGCCGTGGGTGAACGTTATTGCGGCGGATGCGCGTGGTGAGGCGCTGTACGGCGATCACAGCGTGGTTCCGCGTGTGACCGGTGCGCTGGCGGCGGCGTGCATTCCGGCGCCGTTTCAGCCGCTGTATGCGAGCAGCGGTCAAGCGGTTCTGGATGGTAGCCGTAGCGATTGCGCGCTGGGTGCGGACCCGGATGCGGCGGTGCCGGGCATCCTGGGTCCGGCGAGCCTGCCGGTGCGTTTCCGTGACGATTACGTTACCAACAGCAACGACAGCCATTGGCTGGCGAGCCCGGCGGCGCCGCTGGAAGGTTTTCCGCGTATCCTGGGTAACGAGCGTACCCCGCGTAGCCTGCGTACCCGTCTGGGTCTGGACCAGATTCAGCAACGTCTGGCGGGTACCGATGGTCTGCCGGGCAAGGGTTTCACCACCGCGCGTCTGTGGCAAGTGATGTTTGGTAACCGTATGCACGGCGCGGAACTGGCGCGTGACGATCTGGTTGCGCTGTGCCGTCGTCAACCGACCGCGACCGCGAGCAACGGTGCGATCGTGGATCTGACCGCGGCGTGCACCGCGCTGAGCCGTTTCGATGAACGTGCGGACCTGGATAGCCGTGGTGCGCACCTGTTCACCGAGTTTGCGCTGGCGGGTGGCATTCGTTTCGCGGACACCTTTGAAGTGACCGATCCGGTTCGTACCCCGCGTCGTCTGAACACCACCGACCCGCGTGTGCGTACCGCGCTGGCGGATGCGGTTCAACGTCTGGCGGGTATCCCGCTGGACGCGAAACTGGGCGACATTCACACCGATAGCCGTGGTGAACGTCGTATTCCGATTCATGGTGGCCGTGGCGAGGCGGGTACCTTCAACGTTATCACCAACCCGCTGGTGCCGGGCGTTGGTTACCCGCAGGTGGTTCACGGTACCAGCTTTGTGATGGCGGTGGAGCTGGGTCCGCATGGTCCGAGCGGTCGTCAGATTCTGACCTATGCGCAAAGCACCAACCCGAACAGCCCGTGGTACGCGGACCAAACCGTGCTGTATAGCCGTAAGGGCTGGGATACCATCAAATACACCGAAGCGCAGATTGCGGCGGACCCGAACCTGCGTGTGTATCGTGTTGCGCAACGTGGTCGTAAAAAGAAAAAGAAAAAATAA。
工程菌制备固定化酶及固定化酶的应用
实施例1
一、实验目的
从大肠杆菌工程菌中提取酰基转移酶。
二、实验材料
1、细胞破碎仪(JY98-IIIDN)、十六烷基三甲基溴化铵、硫酸铵，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，卡那霉素。
2、种子培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，卡那霉素100ug/mL，pH6.8～7.0。
3、发酵培养基：蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，甘油5g/L，KH2PO4 2.31g/L，K2HPO412.54g/L，卡那霉素100ug/mL，pH 7.0。
三、实验操作步骤
1、将配制好的种子培养基和发酵培养基，分别分装至500ml三角瓶中，装液量为200ml，在120～122℃下灭菌30min，冷却备用。
2、用接种环将斜面种子接种至种子培养基中，于37℃、220rpm培养12h，按3％种量接种至发酵培养中，于37℃、220rpm培养5h，加入0.6mmoL/L的IPTG，于20℃培养15h，收集菌丝体。
3、利用细胞破碎仪超声破碎，超声功率450W，超声时间10min，超声过程控制温度不超过10℃，收集菌体。
4、向菌体中依次缓慢加入0.5wt％十六烷基三甲基溴化铵和1wt％硫酸铵，控温40～45℃，维持1.5h。
5、固液分离后，收集滤液，即为粗酶液。
6、粗酶液在35℃、220rpm转化FR901379，15-17h后完成转化。
四、结果及结论
以上述实验操作步骤进行两次实验，得到粗酶液1#、2#样品，然后利用粗酶液1#、2#样品对FR901379溶液进行转化，FR901379溶液的溶剂是纯化水，FR901379初始浓度2.0mg/mL，FR901379溶液中添加粗酶液的量为10wt％，转化时间为15-17h(利用粗酶液1#转化15h，利用粗酶液2#转化17h)，转化完成后，采用HPLC方法进行检测，得到FR179642浓度，利用FR901379浓度、FR179642浓度计算FR901379转化率，结果如表1。
FR901379浓度检测方法(HPLC方法)：
色谱柱：phenomenex Gemini C18，250*4.6mm，5μm；
流动相：0.1mol/L磷酸二氢钠(磷酸调pH至3.0)-乙腈＝53：47；
流速：1.0ml/min，波长：210nm，柱温：40℃。
FR179642浓度检测方法(HPLC方法)：
色谱柱：AichromBond AQ-C18，250*4.6mm，5μm；
流动相：0.02mol/L磷酸二氢钾(磷酸调pH至3.0)-乙腈＝94：6；
流速：1.0ml/min，波长：210nm，柱温：35℃。
表1粗酶液对FR901379的转化率
| 样品名称 | FR901379浓度 | FR179642浓度 | FR901379转化率 |
| 粗酶液1# | 2.0mg/mL | 1.308mg/mL | 65.4％ |
| 粗酶液2# | 2.0mg/mL | 1.414mg/mL | 70.7％ |
注明：转化率(％)＝(FR179642浓度/FR901379浓度)×100％
从表1可以看出，粗酶液对FR901379的转化率可达65％以上。由于粗酶液分散在酶解后的溶液中，难以直接与产物分离，影响了FR179642的纯化及酰基转移酶的重复使用。
实施例2：固定化酶的制备及其对FR901379的转化率
一、实验目的
制备固定化酶并考察其对FR901379的转化效果。
二、实验材料
中空纤维膜(5万分子量)、氨基型载体LX-1000HA、FR901379
三、实验操作步骤
1、将实施例1得到的粗酶液通过蠕动泵打入中空纤维膜(5万分子量)，浓缩5倍。
2、收集浓缩酶液。
3、每100ml浓缩酶液添加0.5g氨基型载体，浓缩酶液与氨基型载体过夜结合，控温20～25℃。
4、过滤收集载体，即为固定化酶。
5、固定化酶在35℃转化FR901379。
四、结果及结论
以上述实验操作步骤进行两次实验，得到固定化酶1#、2#样品，然后利用固定化酶1#、2#样品对FR901379溶液进行转化，FR901379溶液的溶剂是纯化水，FR901379初始浓度2.0mg/mL，FR901379溶液中添加固定化酶的量为5wt％，转化时间为16h，转化完成后，采用HPLC方法进行检测，得到溶液中FR179642浓度，利用FR901379浓度、FR179642浓度计算FR901379转化率，结果如表2。
表2固定化酶对FR901379的转化率
| 样品名称 | FR901379浓度 | FR179642浓度 | FR901379转化率 |
| 固定化酶1# | 2.0mg/mL | 1.912mg/mL | 95.6％ |
| 固定化酶2# | 2.0mg/mL | 1.940mg/mL | 97.0％ |
注明：转化率(％)＝(FR179642浓度/FR901379浓度)×100％
从上表可以看出，固定化酶对FR901379的转化率可达95％以上。经过将酶固定在氨基型载体上，显著提高了酶对FR901379的转化率。同时由于酰基转移酶固定在氨基型载体上，因此在转化完成后可以通过过滤回收利用。
实施例3：固定化酶反复利用次数
一、实验目的
考察固定化酶可反复使用次数。
二、实验材料
固定化酶，FR901379
三、实验操作步骤
实施例2得到的2#固定化酶在35℃转化FR901379，向FR901379溶液添加5wt％固定化酶，每次转化时间为16h，回收固定化酶连续转化10次。每次转化完成后，采用HPLC方法进行检测，得到溶液中FR179642浓度，利用FR901379浓度、FR179642浓度计算FR901379转化率，结果如表3。
四、结果及结论
表3固定化酶连续转化FR901379的转化率
注明：转化率(％)＝(FR179642浓度/FR901379浓度)×100％
从表3可以看出，本发明制备的固定化酶可连续转化FR901379达10次以上，且转化率未出现下降，维持95％以上，通过对酰基转移酶的固定，提高了酰基转移酶的稳定性，同时便于连续回收利用。
尽管这里参照本发明的解释性实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。
Claims (10)
1.一种固定化酶转化FR901379的方法，其特征在于，先构建表达酰基转移酶的大肠杆菌基因工程菌，然后发酵获得菌体，从菌体中获得粗酶液，浓缩粗酶液，再将浓缩酶液与氨基型载体结合形成固定化酶，利用固定化酶转化FR901379获得FR179642。
2.根据权利要求1所述的固定化酶转化FR901379的方法，其特征在于，所述从菌体中获得粗酶液是指将粗酶液的温度控制在10℃以下，对菌体在功率450～500W进行超声破碎，超声时间5～10min，然后加入十六烷基三甲基溴化铵和硫酸铵，升温至40～45℃，维持1-2h，将酰基转移酶提取至胞外。
3.根据权利要求2所述的固定化酶转化FR901379的方法，其特征在于，所述十六烷基三甲基溴化铵的用量为菌体的0.5-1wt％，所述硫酸铵的用量为菌体的1.0-2.0wt％。
4.根据权利要求1所述的固定化酶转化FR901379的方法，其特征在于，所述浓缩粗酶液是指通过中空纤维膜将粗酶液浓缩5～6倍，然后浓缩酶液与氨基型载体结合，形成固定化酶。
5.根据权利要求4所述的固定化酶转化FR901379的方法，其特征在于，所述中空纤维膜是截留分子量为5万分子量以上的中空纤维膜。
6.根据权利要求1所述的固定化酶转化FR901379的方法，其特征在于，
每100ml所述浓缩酶液中添加0.2-0.7g氨基型载体，浓缩酶液与氨基型载体过夜结合，控温20～25℃。
7.根据权利要求1所述的固定化酶转化FR901379的方法，其特征在于，所述利用固定化酶转化FR901379时，将FR901379用水溶解，然后加入FR901379溶液3-7wt％的固定化酶，25-35℃转化10-20h。
8.根据权利要求1所述的固定化酶转化FR901379的方法，其特征在于，所述表达酰基转移酶的大肠杆菌基因工程菌的表达载体中具有SEQ ID NO:1所示的基因序列。
9.一种固定化酶的制备方法，其特征在于，由表达酰基转移酶的大肠杆菌基因工程菌发酵获得菌体，从菌体中获得酶液，酶液与氨基型载体结合形成固定化酶，所述表达酰基转移酶的大肠杆菌基因工程菌的表达载体中具有SEQ ID NO:1所示的基因序列。
10.根据权利要求9所述的制备方法得到的固定化酶。
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