CN108456652B - 一种鞘氨醇单胞菌基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鞘氨醇单胞菌基因工程菌，为导入了抗逆基因的鞘氨醇单胞菌，所述抗逆基因来自于极端微生物。本发明还公开了通过三亲本结合的方法构建鞘氨醇单胞菌基因工程菌的方法。本发明还公开了鞘氨醇单胞菌基因工程菌在发酵制备威兰胶或结冷胶中的应用。本发明的鞘氨醇单胞菌基因工程菌显著提高了鞘氨醇单胞菌的温度耐受性和酸碱耐受性，耐受温度范围为30～42℃，耐受pH范围为4.0～10.0；用于发酵制备威兰胶，不外源调控pH的条件下，微生物多糖产量达到20～30g/L；用于发酵制备结冷胶时，不外源调控pH的条件下，微生物多糖产量达到15～22g/L；增强了结冷胶、威兰胶等微生物多糖的生产效率。

Description

一种鞘氨醇单胞菌基因工程菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及基因工程菌及其构建方法与应用，具体涉及一种鞘氨醇单胞菌基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

微生物多糖是一类典型的微生物发酵产物，对人类生活和工业生产至关重要。早在1969年黄原胶被FDA批准作为重要的食品添加剂；1998年结冷胶被报道为治疗眼疾的最主要药品；1992年威兰胶被报道为深海采油不可替代的驱动剂。美国Kelco公司为全球最大的微生物多糖生产供应商，开发了黄原胶和新型微生物多糖即结冷胶类多糖(如结冷胶、威兰胶、鼠李糖胶、S88、S7)等多种微生物多糖。研究发现这些多糖具有结构多样性、独特流变学、物理学特性和安全无毒等特点，广泛应用于食品、医药、农业、化妆品、建筑和石油工业等多个领域。因此国内外研究者一直致力于微生物多糖的生产研究，目前全球微生物多糖年产量约为30万吨，年产值可达近200亿美元，应用前景十分广阔。

目前为止，微生物多糖中除了黄原胶生产规模较大，结冷胶、威兰胶、鼠李糖胶生产规模均不大，而国内直到近两年才开始威兰胶生产，低生产率和高生产成本是限制其大规模产业化的主要障碍。主要原因是微生物多糖生产鞘氨醇单胞菌对温度极度敏感，而发酵过程中产生机械搅拌热以及代谢热，需要大量冷却水来控制温度，过程耗能大，成本高；发酵过程中后期，随着威兰胶的大量积累，发酵液呈现弱酸性的特征，pH值成为微生物生长及次级代谢产物合成的重要限制因素。开发高抗逆性生产鞘氨醇单胞菌是解决上述问题的关键，但是目前该方面的研究呈空白状态。

发明内容

发明目的：为了解决现有的生产微生物多糖鞘氨醇单胞菌对温度和pH耐受性差的问题，本发明提供了一种鞘氨醇单胞菌基因工程菌，本发明进一步的目的是提供鞘氨醇单胞菌基因工程菌的构建方法，本发明更进一步的目的是提供鞘氨醇单胞菌基因工程菌在发酵生产多糖中的应用。

基因转录水平调节是微生物为了维持正常细胞活动以及应对环境变化必不可少的调控机制。转录调控因子(transcriptional regulators)通过调节基因表达、修复DNA或蛋白质大分子、促进形成生物膜等途径影响一系列生物途径，在微生物生长代谢中起到了至关重要的作用。操作此类转录调控因子，使其在微生物中发挥调控作用，通过复杂但是高效的转录调控网络，微生物可对外界环境压力(如pH、温度、营养物质、渗透压等)及时做出响应，并优化代谢强度来适应新的环境。此外，温度明显改变或有重金属、毒性化合物、氧化剂存在以及致病微生物感染等不利条件下，生物共有的一种分子水平上的适应性变化是基因表达谱的明显改变，其中重要的一类称之为热休克蛋白(Heat shock proteins，Hsps)的蛋白质家族合成显著性增加，作为一种分子伴侣，Hsps参与蛋白的正确折叠、聚合、转运和信号传递等重要生理过程。它们的大量合成可保证在应激条件下细胞的存活，否则将导致细胞的不可逆损伤并导致死亡。由于在极端环境下的长期适应性进化，极端微生物具有明显优于其他鞘氨醇单胞菌的抗逆性能；利用分子生物学手段将来源于极端微生物的热休克蛋白应用于工业微生物耐受性能改造具有理论可行性。

技术方案：本发明所述一种鞘氨醇单胞菌基因工程菌，为导入了抗逆基因的鞘氨醇单胞菌，所述抗逆基因来自于极端微生物；其中，所述抗逆基因为编码热休克蛋白的基因或编码全局转录调控因子的基因。

构建的鞘氨醇单胞菌基因工程菌耐受温度范围为30～42℃，耐受pH范围为4.0～10.0。

所述极端微生物为腾冲热互养菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)、火色杆菌(Flammeovirga sp.)或耐辐射奇异球菌(Deinococcus radiodurans)，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。

优选地，所述抗逆基因具体为如下(1)至(5)中任一所述的基因：

(1)编码热休克蛋白GroES的GroES基因；

(2)编码热休克蛋白GroEL的GroEL基因；

(3)编码热休克蛋白DnaK的DnaK基因；

(4)编码热休克蛋白DnaJ的DnaJ基因；

(5)编码全局转录调控因子IrrE的IrrE基因。

所述GroES基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述GroEL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述DnaK基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述DnaJ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述IrrE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

本发明进一步地提供所述鞘氨醇单胞菌基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：

首先从NCBI数据库筛选极端微生物来源的热休克蛋白、全局转录调控因子等基因序列；

(1)以pET28a为出发质粒，PCR扩增抗逆基因，构建含抗逆基因的重组pET28a质粒；

(2)以步骤(1)得到的重组pET28a质粒为模板，PCR扩增得到携带T7启动子的抗逆基因片段；

(3)以pBBR1MCS-5为出发质粒，将步骤(2)得到的携带T7启动子的抗逆基因片段和pBBR1MCS-5质粒连接，构建重组pBBR1MCS-5质粒；

(4)将重组pBBR1MCS-5质粒导入E.coli DH5α感受态细胞中，得到重组E.coliDH5α；

(5)以鞘氨醇单胞菌为受体菌，步骤(4)得到的重组E.coli DH5α为供体菌，E.coliHB101/pRK2013为协助菌，通过三亲本结合的方法，构建得到鞘氨醇单胞菌基因工程菌。

步骤(5)中所述鞘氨醇单胞菌为Alcaligenes sp.CGMCC2428或Sphingomonassp.CGMCC31461；鞘氨醇单胞菌属是1990年日本学者Yabuuchi等首次提出的新属，早期研究认为威兰胶生产菌株属于产碱杆菌属(Alcaligenes sp.)，后重新鉴定将其归于鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)，因此本专利申请中Alcaligenes sp.CGMCC2428为鞘氨醇单胞菌。

本发明进一步地提供所述的鞘氨醇单胞菌基因工程菌在发酵制备多糖中的应用。

当受体菌为Alcaligenes sp.CGMCC2428时，用于发酵制备威兰胶；所述发酵阶段发酵温度为30～42℃，发酵pH为4.0～10.0，发酵过程不添加外源物调控pH。发酵培养基配方如下：碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉、糖蜜和淀粉水解液中的任意一种或几种的混合物，浓度为20～70g/L；所述氮源为蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆粕粉、棉籽饼粉、尿素、(NH₄)₂SO₄和NH₄Cl中的任意一种或几种的混合物，浓度为1～10g/L；所述无机盐为钾盐、镁盐、磷酸盐和硫酸盐中的任意一种或几种混合物，浓度为0.1～10g/L，溶剂为水。

当受体菌为Sphingomonas sp.CGMCC31461时，用于发酵制备结冷胶；所述发酵阶段发酵温度为30～42℃，发酵pH为4.0～10.0，发酵过程不添加外源物调控pH。发酵培养基配方如下：碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉、糖蜜和淀粉水解液中的任意一种或几种的混合物，浓度为20～70g/L；所述氮源为蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆粕粉、棉籽饼粉、尿素、(NH₄)₂SO₄和NH₄Cl中的任意一种或几种的混合物，浓度为1～10g/L；所述无机盐为钾盐、镁盐、磷酸盐和硫酸盐中的任意一种或几种混合物，浓度为0.1～10g/L，溶剂为水。

有益效果：本发明的鞘氨醇单胞菌基因工程菌可应用于结冷胶类多糖的生产中，显著提高了发酵鞘氨醇单胞菌的温度耐受性和酸碱耐受性，耐受温度范围从30～36℃扩大到30～42℃，耐受pH范围由7.0左右扩大到4.0～10.0；用于发酵制备威兰胶，不外源调控pH的条件下，威兰胶产量达到20～30g/L；用于发酵制备结冷胶时，不外源调控pH的条件下，结冷胶产量达到15～22g/L；增强了结冷胶、威兰胶等微生物多糖的生产效率，提高工艺过程的经济性。

附图说明

图1为重组表达载体构建示意图；

图2为重组鞘氨醇单胞菌不同温度下的存活率；

图3为重组鞘氨醇单胞菌不同pH下的存活率；

图4为抗逆型威兰胶生产鞘氨醇单胞菌(重组鞘氨醇单胞菌)在42℃、自然pH条件下发酵过程曲线；

图5为抗逆型结冷胶生产鞘氨醇单胞菌(重组鞘氨醇单胞菌)在42℃、自然pH条件下发酵过程曲线。

具体实施方式

实施例1含抗逆腾冲热互养菌GroES基因的重组鞘氨醇单胞菌构建

步骤一、抗逆基因扩增

以腾冲热互养菌(CGMCC5161)基因组为模板，使用软件CE Design V1.0引物设计软件设计合成引物(引物序列见表1)，克隆抗逆GroES基因，GroES基因的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。GroES基因的PCR条件：1)94℃变性5min；2)按如下参数循环30次：94℃变性1min，60℃退火60s，72℃延伸1min；3)最后72℃延伸10min。PCR反应结束后取产物2μL，然后在浓度为1g/100mL的琼脂糖凝胶中，进行电泳分析。经凝胶成像系统成像确认片段大小正确后，采用DNA纯化回收试剂盒(TaKaRa，9761)回收目的片段用于重组表达载体的构建。

表1抗逆基因引物及其核苷酸序列

步骤二、含抗逆基因的重组大肠杆菌构建

1、重组pET28a质粒构建

以pET-28a(+)(Novagen，69864-3)为出发质粒，用Nco I(TaKaRa,1160A)/Not I(TaKaRa,1166A)双酶切。步骤一得到的目的片段及线性化载体用DNA凝胶回收试剂盒(TaKaRa,9762)来进行纯化、回收。连接目的片段与载体通过同源重组试剂盒(诺唯赞，C112-1)来连接，以此得到pET-groes重组质粒。

2、重组pBBR1MCS-5质粒构建

以重组的pET28a质粒为模板，设计引物(引物序列见表1)扩增克隆得到携带T7启动子的抗逆基因片段。以pBBR1MCS-5(森淼生物，P0309)为出发质粒，用Hind III(TaKaRa,1060A)/BamH I(TaKaRa,1010A)双酶切后回收载体片段，利用诺唯赞同源重组试剂盒与步骤1中得到的携带T7启动子的GroEs片段连接，构建得到质粒命名pBBR-groes。将10μL的连接产物加入100μL的大肠杆菌DH5α感受态细胞中：1)冰上放置30min，42℃热激90s；2)冰上放置2min；3)加入预热的0.45mL LB培养基，220rpm、37℃搅拌1h；4)将200μL菌液加入含有30μg/mL的庆大霉素的LB平板上，37℃过夜培养12～16h，得到重组菌E.coli DH5α(含重组pBBR质粒)，所得鞘氨醇单胞菌分别命名为：E.coli GroES，构建过程见图1。

LB培养基：NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，溶剂为水。

步骤三、含抗逆基因的重组鞘氨醇单胞菌构建

通过三亲本接合的方法，以帮助质粒pRK2013为介导，实现重组pBBR1MCS-5质粒与重组鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.；S.sp.)之间的接合转移。

1、菌体培养：供体菌E.coli GroES(含重组pBBR1MCS-5质粒)，帮助菌E.coliHB101(森淼生物，P1446)/pRK2013(森淼生物，P0469)，接种到加有相应抗生素的LB培养基中37℃培养8h，受体菌S.sp.在鞘氨醇单胞菌种子培养基中30℃培养16h，培养时间约达其对数生长中期，此时各鞘氨醇单胞菌生命活动旺盛，比较适合进行接合实验；

其中，帮助菌E.coli HB101/pRK2013构建方法参考《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社，2016年1月，93-97页)中大肠杆菌转化方法部分。

其中，培养供体菌E.coli GroES的LB培养基中庆大霉素的浓度为50μg/mL，培养帮助菌E.coli HB101/pRK2013的LB培养基中链霉素的浓度为100μg/mL。

鞘氨醇单胞菌种子培养基：葡萄糖20g/L，酵母膏1g/L，蛋白胨3g/L，K₂HPO₄·3H₂O2g/L，MgSO₄ 0.1g/L，pH 7.2～7.4。

其中，受体菌鞘氨醇单胞菌为Alcaligenes sp.CGMCC2428或Sphingomonassp.CGMCC31461。

2、三亲本接合：取上述受体亲本菌液2mL，离心收集菌体，生理盐水洗涤2～3次，倒掉上清液，加入2.0mL的帮助菌，混匀后离心倾去上清，加入2mL供体菌，离心后LB培养基清洗3次后混匀，取一部分液体涂布至无抗性鞘氨醇单胞菌平板/斜面培养基，30℃过夜培养。

鞘氨醇单胞菌平板/斜面培养基：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl5g/L，琼脂20g/L，调节pH至7.2～7.4。

3、接合子筛选：将培养过夜的结合菌体用无菌水从固体培养基上洗下来，涂布到含有庆大霉素和链霉素的双抗性的筛选培养基上，培养2～4天，筛选重组子获得表达菌S.sp.GroEs。

筛选培养基配方如下：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，庆大霉素50μg/mL，链霉素100μg/mL，调节pH至7.2～7.4。

实施例2含抗逆GroEL基因的重组鞘氨醇单胞菌构建

构建方法同实施例1，不同的是抗逆基因为GroEL基因，来源于嗜热栖热菌(CGMCC15059)，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，引物序列表见表1，得到S.sp.GroEL

实施例3含抗逆IrrE基因的重组鞘氨醇单胞菌构建

构建方法同实施例1，不同的是抗逆基因为IrrE基因，来源于耐辐射奇异球菌(CGMCC633)，核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，引物序列表见表1，得到S.sp.IrrE。

实施例4含抗逆DnaK基因的重组鞘氨醇单胞菌构建

构建方法同实施例1，不同的是抗逆基因为DnaK基因，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

实施例5含抗逆DnaJ基因的重组鞘氨醇单胞菌构建

构建方法同实施例1，不同的是抗逆基因为DnaJ基因，核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

实施例6重组鞘氨醇单胞菌不同温度存活率考察

将重组鞘氨醇单胞菌(受体菌为Alcaligenes sp.CGMCC2428)S.sp.GroES，S.sp.GroEL，S.sp.IrrE为研究对象，分别收集2mL菌液，用生理盐水洗涤2～3次，倒掉上清液，加入一定体积生理盐水，梯度稀释成相同的OD值，取200uL稀释液涂加入相应浓度的庆大霉素和链霉素平板培养基(配方参照实施例1中“筛选培养基”)放置培养箱培养72h，并设置对照组(即Alcaligenes sp.CGMCC2428)，分别记录30℃、33℃、36℃、39℃、42℃、45℃不同温度下鞘氨醇单胞菌活菌数。结果见图2，温度低于36℃时，抗逆基因的表达对鞘氨醇单胞菌存活率没有明显影响；当温度高于39℃后，对照组活菌数严重减少甚至全部死亡，而表达了抗逆基因的鞘氨醇单胞菌存活率显著高于对照组，表现出明显的生长优势。此外，就温度耐受效果来说，表达全局转录因子的鞘氨醇单胞菌S.sp.IrrE效果最为明显，可将鞘氨醇单胞菌耐受温度提高至42℃。

实施例7重组鞘氨醇单胞菌不同pH存活率考察

方法同实施例6，将菌液分别稀释涂布在pH4.0、7.0、10.0的平板上，放置在30℃培养箱培养72h，记录活菌数。结果见图3，对照组在较高或低pH条件下，鞘氨醇单胞菌存活率明显降低，而抗逆基因的表达可将鞘氨醇单胞菌的pH耐受范围扩大到pH4.0～10.0。

实施例8抗逆型重组鞘氨醇单胞菌用于威兰胶发酵生产

分别将重组鞘氨醇单胞菌(受体菌为Alcaligenes sp.CGMCC2428)S.sp.GroES，S.sp.GroEL，S.sp.IrrE和对照组Alcaligenes sp.CGMCC2428接种于鞘氨醇单胞菌平板/斜面培养基(配方参照实施例1)，30℃培养24h。接一环菌于装有135mL种子培养基(配方参照实施例1)的1000mL三角瓶中，转速200r/min，30℃培养16h。将培养好的种子液按体积百分比为3％的接种量接入装有4L发酵培养基的7.5L发酵罐中，于42℃、自然pH下培养72h。通过对高温、自然pH条件下威兰胶合成能力考察发现，对照原始鞘氨醇单胞菌在上述条件下不能大量合成威兰胶，而经基因改造的重组鞘氨醇单胞菌的威兰胶产量均达到20g/L以上，其中S.sp.IrrE的威兰胶产量最高，达到25.7±0.25g/L(图4)。实际工业发酵过程中，最理想的状态是鞘氨醇单胞菌的最适生长温度范围向高温延伸，并且具有较宽的生长pH范围，因此重组鞘氨醇单胞菌能够更好的满足工业生产需求。

鞘氨醇单胞菌发酵培养基配方如下：葡萄糖50g/L，酵母提取物8g/L，K₂HPO₄·3H₂O3g/L，MgSO₄ 0.4g/L。

实施例9抗逆型重组鞘氨醇单胞菌用于结冷胶发酵生产

方法同实施例8，不同的是重组鞘氨醇单胞菌(受体菌为S.sp.CGMCC31461)S.sp.GroES，S.sp.GroEL，S.sp.IrrE，对照组为S.sp.CGMCC31461。考察42℃，自然pH发酵条件下，重组鞘氨醇单胞菌发酵生产结冷胶的情况。结果见图5，对照组原始鞘氨醇单胞菌不能大量合成结冷胶，而表达了抗逆基因的重组鞘氨醇单胞菌表现出良好的生产性能，结冷胶产量最高可达18.1±0.16g/L，显著优于对照组。

其中，鞘氨醇单胞菌发酵培养基为：K₂PO₄1.5g/L，KH₂PO₄1g/L，MgSO₄0.6g/L，酵母膏0.2g/L，大豆蛋白粉2g/L，蔗糖30g/L，泡敌0.1％(v/v)。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一种鞘氨醇单胞菌基因工程菌及其构建方法与应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtcacaag taaacattaa acccctagca gatagagttt taattgagcc tgcagctgca 60

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<210> 2

<211> 1641

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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tctgagaagc aattaaaaga gtatggcgat aagctttctg aaggtaacaa aactgctatc 1680

gaggcagcat tgaaagactt gaaagaagct cacgctgctc aagatttgga taaaatccaa 1740

cctgctttag acgcattaaa tgcggcatgg caagcggctt ctcaagagat gtaccaagct 1800

acaggtggtg acgctgcagg tgcagctggt gctgatccta acgctgctca aggtggtgca 1860

caacaaggtg gtaacgacgc tgatgacgtt actgacgttg acttcgaaga agtaaaataa 1920

<210> 4

<211> 1086

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgcgaaatt actacgatat tttaggtata gatcaacgag ctgataagcg acagataaaa 60

aaagcctact taacactagc aaaaaaatat catcctgatc ttcatggtaa tgatgaagaa 120

ttaggtgaaa aatttaaaga ggtcaacgaa gcctatgaga ccttgagtga tgatagtaag 180

aaatttcact atgatcatgg cttaacttcg ttcactacat tttcgaatac ccctactcca 240

acagaggtgg ctgaggaaga aattcgaaca caaagaaaat ctgaagtaaa agaagagatt 300

tttaaagaaa aagctaagga gaaaaaaagt aaaaagtttt tcgttccttt tactgtaggt 360

gtatttacct tagtagttgg tgggatgatc tcttttttcg ttcaacgcca gagtaaactg 420

gctgcatcta cctttgaaga tgcaacaaca aaccttgaat tgaaagattt taatgctgtt 480

aaaggtaata ttgatgtctt atatcactta gaatctcctc ttcttgcaga tattattgag 540

gctggtttat acgtccaact caaccaaagt aatgaagcta ttgatctatt agaaccaaaa 600

ttatatatga ttaatgagga acctaaaaat attgtttctc aagcatatct ctatttaggt 660

attgcctact atcaaagaaa attagggaat aaggcagttg attatttaga gaaatcaatt 720

tcttacaata acaaaaacaa acaagtttat tattggttag gagtcactta ctcagaactt 780

aatttaaact atcaagaagc tatcaatgct ttagaaaaag cgaaaagtgt tttgggttat 840

gaaaaccaat ctattttaag tttaggaata gcatatcaac gttccggaca atataatgct 900

gcccaagata attttgagct tttattattc aaccctgatt ttaaaaagga agccaactat 960

tatatgggtt ggaattattt cctaagtaac aaaaacacta ataaagcttg ccttttatgg 1020

gagaaagctg ctaaaatggg ttctcaagaa gctagatatc aagtgcagag gcattgtggt 1080

aactag 1086

<210> 5

<211> 987

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtgcccagtg ccaacgtcag ccccccttgc ccctctgggg taaggggcgg ggggatgggg 60

ccaaaagcta aagctgaagc ctccaagccc cacccccaaa tccctgttaa gctcccattc 120

gtgaccgccc ccgacgccct cgccgccgcc aaagccagga tgcgcgacct ggcggcggcc 180

tacgtggcgg ccctgcccgg acgcgacacc cacagcctga tggcgggggt gcccggcgta 240

gacctcaaat tcatgccgct cggctggcgc gacggggcgt tcgaccccga gcacaacgtc 300

atcctcatca actcggcggc ccgccccgaa cgccagcgct tcaccctcgc ccacgaaatc 360

gggcacgcga ttttactcgg cgacgacgac ctgctctccg acatccacga cgcctacgag 420

ggcgagcggc tcgaacaggt catcgaaacg ctgtgcaacg tggcggcggc ggcgattttg 480

atgcccgaac ccgtcatcgc ggaaatgctg gaacgcttcg gccccaccgg gcgcgccctc 540

gccgaactcg ccaagcgggc cgaagtcagc gcgtcgtcgg cgctctacgc cctgaccgag 600

cagaccccgg tgcccgtcat ctacgcggtc tgtgcgccgg gcaagcctcc gcgtgagcag 660

gccgcaagcg acgaggacgc tggcccaagc acagaaaaag tcctgacggt ccgcgccagc 720

agctcgacgc ggggcgtcaa gtacaccctg gcgagcggca cgccggtacc cgccgaccac 780

ccggcggcgc ttgccctcgc cacgggcatg gaagtgcgcg aggaaagcta cgtgcccttt 840

cgctcgggcc ggaaaatgaa ggcggaggtg gacgcctacc cgtcgcgcgg catcgtggcc 900

gtcagtttcg agttcgaccc cgcccgcctg ggccgcaagg acagcgagca ggccgaccgg 960

gacgagccgc aggacgctgc acagtga 987

Claims (5)

1.一种鞘氨醇单胞菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为导入了抗逆基因的鞘氨醇单胞菌，所述抗逆基因来自于极端微生物；其中，所述抗逆基因为编码全局转录调控因子的基因；

所述极端微生物为耐辐射奇异球菌(Deinococcus radiodurans)；

所述抗逆基因为编码全局转录调控因子IrrE的IrrE基因；

所述IrrE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；

宿主菌鞘氨醇单胞菌为Alcaligenes sp.CGMCC2428或Sphingomonas sp.CGMCC31461。

2.权利要求1所述鞘氨醇单胞菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以pET28a为出发质粒，PCR扩增抗逆基因，构建含抗逆基因的重组pET28a质粒；

(2)以步骤(1)得到的重组pET28a质粒为模板，PCR扩增得到携带T7启动子的抗逆基因片段；

(3)以pBBR1MCS-5为出发质粒，将步骤(2)得到的携带T7启动子的抗逆基因片段和pBBR1MCS-5质粒连接，构建重组pBBR1MCS-5质粒；

(4)将重组pBBR1MCS-5质粒导入E.coli DH5α感受态细胞中，得到重组E.coliDH5α；

(5)以鞘氨醇单胞菌为受体菌，步骤(4)得到的重组E.coli DH5α为供体菌，E.coliHB101/pRK2013为协助菌，通过三亲本结合的方法，构建得到鞘氨醇单胞菌基因工程菌。

3.权利要求1所述的鞘氨醇单胞菌基因工程菌在发酵制备多糖中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵制备的多糖为威兰胶，所述发酵阶段发酵温度为30～42℃，发酵pH为4.0～10.0。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵制备的多糖为结冷胶，所述发酵阶段发酵温度为30～42℃，发酵pH为4.0～10.0。

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