CN103074403B - 微生物酶转化棘白菌素b的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种微生物酶转化棘白菌素B的方法，包括以下步骤：1)微生物发酵获得棘白菌素B脱酰酶；2)发酵完成后，往发酵液中添加磷酸盐，进行超声，离心取上清液，即为棘白菌素B脱酰酶粗酶液；3)纯化粗酶液，得到棘白菌素B脱酰酶酶液；4)将棘白菌素B溶于乙醇中，与脱酰酶酶液混合并搅拌使其转化为棘白菌素B母核，转化完成后，过滤，取滤液；5)滤液过大孔吸附树脂，棘白菌素B母核吸附于树脂上，用有机溶剂将棘白菌素B母核洗脱下来。本发明方法的摩尔转化率高，转化时间短，产物易于分离纯化，且ECB脱酰酶能够重复使用。

Description

微生物酶转化棘白菌素B的方法

技术领域

本发明涉及生物制药领域，更具体地，本发明涉及通过微生物酶将棘白菌素B转化为棘白菌素B母核的方法。

背景技术

上世纪70年代以来，真菌感染无论是其发生频率还是感染种类都在不断地增加，特别是在免疫抑制患者包括HIV感染者、器官移植者、肿瘤患者以及那些患有其它疾病而正进行免疫治疗的患者中。直到20世纪80年代末和90年代咪唑类及三唑类抗真菌药物的研发成功，临床方能有效而安全地控制真菌感染。虽然这些药物对控制临床深部真菌感染起到了重要的作用，但由于这些药物选择性差、耐药真菌的出现以及对诸如曲霉和白色念珠菌等真菌的敏感性不强等原因，深部真菌感染疾病的死亡率仍居高不下。因此，寻找一种新的安全有效的抗真菌药物就显得尤为重要。

众所周知，真菌细胞具有细胞壁而哺乳动物细胞没有细胞壁。因此，真菌细胞壁是新型抗真菌药物的理想靶点。棘白菌素类药物是20世纪70年代发现的一组天然产物，由相似的环状多肽核心和不同的脂肪酸侧链组成，该脂类侧链通过非竞争性作用机制抑制β-(1，3)-D-葡聚糖的合成，从而导致细胞壁葡聚糖的排空、渗透不稳定以及真菌细胞的溶解而发挥其抗真菌作用。其作用机制独特，不良发应率低，且对一些唑类和两性霉素B耐药的真菌具有很强的抗菌活性，尤其是对诸如曲霉和白色念珠菌等感染趋势上升的真菌具有良好的杀灭作用。棘白菌素类抗生素主要有三种类型：B，C和D。其中棘白菌素B(Echinocandin B，ECB)是最主要的类型。ECB，是于1974年Nyfeler R.等人发现的由曲霉菌属Aspergilus nidulans和Aspergilusrugulosus发酵产生的，但由于酰基侧链的存在，使其具有一定的溶血毒性。以ECB为先导化合物进行结构改造，可以得到一些具有临床应用价值的化合物，如西洛芬净(Cilofungin)、卡帕芬净(Caspofungin，MK991)、米卡芬净(Micafungin，FK463)、阿尼芬净(Anidulafungin，LY303366)。西洛芬净由于毒性和剂型问题终止了研究开发，但后三者已先后在美国(2001年)、日本(2002年)、美国(2006年)首次上市。

其中阿尼芬净是由礼来公司和Vicuron Pharmaceuticals公司联合研制开发，给药途径为静脉滴注。动物实验研究表明，同卡泊芬净和米卡芬净相比，阿尼芬净对烟曲霉菌活性更强，对白色念珠菌活性相对较弱。其制备过程包括以下两步：(1)通过微生物转化——游动放线菌发酵产生的脱酰化酶对棘白菌素B(Echinocandin B，ECB)进行催化，使侧链断裂，生成母核(EchinocandinB Nucleus，ECBN)和不饱和脂肪酸侧链。(2)在母核的基础上采用化学合成的方法加入新的侧链——戊氧-三苯羧基。其中母核的制备是关键步骤。目前对于ECB母核的制备，化学方法成本较高，微生物转化具有以下优点：反应条件温和、产物单一、高度的化学选择性、区域选择性和对映体选择性、易于纯化、不污染环境且能完成一些化学合成难以进行的反应。

美国专利US7785826B2详细介绍了ECB转化ECBN的工艺。此工艺主要流程包括：将ECB发酵完成以后，离心获得菌丝体，把菌丝体重新悬浮于水中然后加入脱酰酶进行转化。但此工艺转化耗时20～30h，且ECB脱酰酶仅利用一次。

因此，仍需开发微生物酶转化棘白菌素B的方法。

发明内容

鉴于现有技术的上述状况，本发明提供一种简单的将棘白菌素B(ECB)转化成棘白菌素B母核(ECBN)的方法，该方法包括以下步骤：

1)微生物发酵获得棘白菌素B脱酰酶；

2)发酵完成后，往发酵液中添加磷酸盐，进行超声，离心取上清液，即为棘白菌素B脱酰酶粗酶液；

3)纯化粗酶液，得到棘白菌素B脱酰酶酶液；

4)将棘白菌素B溶于乙醇中，与脱酰酶酶液混合并搅拌使其转化为棘白菌素B母核，转化完成后，过滤，取滤液；

5)滤液过大孔吸附树脂，棘白菌素B母核吸附于树脂上，用有机溶剂将棘白菌素B母核洗脱下来。

以下详细说明本发明方法的各步骤：

上述方法的步骤1)中，发酵所用菌株可以是天然产酶菌，例如犹他游动放线菌；也可以是基因工程菌，例如白色链霉菌基因工程菌株。可采用本领域技术人员熟知的条件进行棘白菌素B脱酰酶的发酵。

棘白菌素B脱酰酶为一种盐溶性蛋白，且结合在细胞膜上。棘白菌素B脱酰酶发酵完成后，在发酵液中添加一定量的磷酸盐以形成酸碱缓冲体系，使得磷酸盐的浓度为0.05M-0.15M，从而提供一定的离子强度以及稳定的pH环境，利于棘白菌素B脱酰酶的溶解和稳定。因此，在本发明的一个优选实施方式中，上述方法的步骤2)中，调节所述缓冲体系的pH为6-7。在本发明的另一个优选实施方式中，超声该酸碱缓冲体系1-2小时。超声有利于脱酰酶从细胞膜上脱离下来。离心取上清液，即得棘白菌素B脱酰酶粗酶液。

得到棘白菌素B脱酰酶粗酶液后，需对该粗酶液进行纯化。根据本发明一个优选的实施方式，所述纯化包括使粗酶液旋蒸浓缩并抽滤的步骤。旋蒸后有杂蛋白沉淀出现，抽滤以去除杂蛋白，所得滤液即棘白菌素B脱酰酶酶液。因此上述方法的步骤3)的主要作用是去除棘白菌素B脱酰酶粗酶液中的杂蛋白，并且使酶液得到一定程度的浓缩，提高酶转化效率。根据本发明的一个优选的实施方式，所述旋蒸温度为45-50℃，旋蒸时间为1-2小时；所述浓缩为将体积减少至原体积的50-80％。

由于棘白菌素B水溶性极差，已公开的转化方法多采用DMSO为助溶剂，本发明方法的步骤4)中用乙醇替代DMSO作为棘白菌素B助溶剂。乙醇与DMSO相比具有环境友好、无毒、价格低廉等优点，且意外发现利用乙醇作为棘白菌素B助溶剂转化效率更高。将溶于乙醇的棘白菌素B添加到脱酰酶酶液中配成反应体系，通常将配制好的反应体系置于转化反应器内，充分搅拌，转化完成后，抽滤，滤液即棘白菌素B母核。用HPLC定量检测滤液中棘白菌素B母核的含量。根据本发明的一个优选的实施方式，所述转化时间可以为6-12小时。根据本发明的另一个优选的实施方式，所述乙醇的浓度为大于或等于95％(体积)。

最后一步，滤液过大孔吸附树脂，棘白菌素B母核吸附于树脂上，然后用有机溶剂将棘白菌素B母核洗脱下来。转化产物棘白菌素B母核能够完全吸附于树脂上，而一些极性较大杂质则不能吸附。在本发明的一个优选实施方式中，上述方法的步骤5)中上柱后用浓度为30-60％的甲醇水溶液(体积)能够将棘白菌素B母核完全解析下来，液相纯度达到90％以上。根据本发明的一个优选的实施方式，所述大孔吸附树脂可以选自HP20或XAD18。

根据本发明的一个优选实施方式，上柱后脱酰酶酶液按步骤4)-5)可重复使用2-4次。棘白菌素B脱酰酶能够重复使用是其他已公开的工艺中所未报道的，重复使用棘白菌素B脱酰酶能够有效降低生产成本，减少能耗。

本发明将ECB转化为ECBN方法的摩尔转化率高，转化时间短，产物易于分离纯化，能够有效提高后期分离纯化的收率和纯度，ECB脱酰酶能够重复使用。因此适合大规模的工业生产，具有很好的商业价值。

附图说明

图1是实施例1第1次转化后HPLC图谱；

图2是实施例1第4次转化后HPLC图谱；

图3是实施例2第1次转化后HPLC图谱；

图4是实施例2第3次转化后HPLC图谱；

图5是实施例3第1次转化后HPLC图谱；

图6是实施例3第4次转化后HPLC图谱；

图7是实施例1第1次转化后转化液过柱后HPLC图谱；

图8是实施例2第1次转化后转化液过柱后HPLC图谱；

图9是实施例3第1次转化后转化液过柱后HPLC图谱。

具体实施方式

除非另有所指，实施例中的％为重量百分比。

以下实施例中，HPLC检测法的条件如下：

流动相：0.2％乙酸铵水溶液∶乙腈＝95∶5；

柱型号：C18，150×4.60mm，3μm；

柱温：40℃；

流速：0.7ml/min；

检测波长：222nm。

本发明实施例中所用试剂均可从市售获得。其中酵母粉(Yeastextract)购自英国Oxoid公司；蛋白胨(Trypton)购自英国Oxoid公司，麦芽浸粉购自上海源聚生物科技有限公司；蔗糖购自上海蓝平实业有限公司；葡萄糖购自上海西王淀粉糖有限公司；花生粕粉购自北京康明威培养基技术有限责任公司；燕麦粉购自天津化工经销部；其余生化试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。HP20树脂由日本三菱化学公司生产，XAD18树脂购自罗门哈斯公司。

实施例1：

1)、棘白菌素B脱酰酶的发酵

菌种：犹他游动放线菌(Actinoplanes utahensis NRRL12052)，购自美国农业研究菌种保藏中心。

培养基配方：

斜面培养基：酵母粉0.3％，麦芽浸粉0.3％，蛋白胨0.5％，葡萄糖1.0％，琼脂2.5％，pH 7.0-7.2，30℃培养5-7天

种子培养基：蔗糖2.5％，燕麦粉2％，酵母粉0.25％，K₂HPO₄0.1％，KCl 0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，FeSO₄·7H₂O 0.0002％，pH＝6.8，30℃培养4-5天

发酵培养基：蔗糖2.5％，花生粕粉1.2％，K₂HPO₄0.1％，MgSO₄·7H₂O0.3％，pH＝6.8，30℃培养3-4天

2)、发酵完成后，发酵液中添加Na₂HPO₄·12H₂O和NaH₂PO₄·2H₂O浓度分别为6.10g/L和5.8g/L，用HCl调节pH为6.0，超声1h，离心取上清，即为棘白菌素B脱酰酶粗酶液。

3)、粗酶液旋蒸浓缩至原体积80％，旋蒸温度为45℃，旋蒸时间为1h。旋蒸浓缩后有杂蛋白沉淀出现，抽滤去除部分杂蛋白，所得滤液即棘白菌素B脱酰酶酶液。

4)、将棘白菌素B溶于95％乙醇中，添加到脱酰酶酶液内配成反应体系，体系内棘白菌素B浓度控制在4mg/ml。将配制好的反应体系置于转化反应器内，充分搅拌，28℃，150rpm，转化12h。转化完成后，抽滤，取滤液HPLC定量检测棘白菌素B母核含量，并计算底物棘白菌素B的摩尔转化率为93％。

摩尔转化率％＝生成ECBN摩尔数/底物ECB摩尔数×100％

5)、转化后滤液过大孔吸附树脂HP20，棘白菌素B母核完全吸附于树脂上，用浓度为40％的甲醇水溶液将ECBN集中洗脱下来，由图7计算的液相纯度达到93.3％。

6)、上柱后酶液按步骤4)～5)重复使用3次，摩尔转化率分别为94％、90％、86％。

实施例2

1)、棘白菌素B脱酰酶的发酵

菌种：犹他游动放线菌(Actinoplanes utahensis NRRL12052)，购自美国农业研究菌种保藏中心。

培养基配方：

斜面培养基：酵母粉0.3％，麦芽浸粉0.3％，蛋白胨0.5％，葡萄糖1.0％，琼脂2.5％，pH 7.0-7.2，30℃培养5-7天

种子培养基：蔗糖2.5％，燕麦粉2％，酵母粉0.25％，K₂HPO₄0.1％，KCl 0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，FeSO₄·7H₂O 0.0002％，pH＝6.8，30℃培养4-5天

发酵培养基：蔗糖2.5％，花生粕粉1.2％，K₂HPO₄0.1％，MgSO₄·7H₂O0.3％，pH＝6.8，30℃培养3-4天

2)、发酵完成后，发酵液中添加Na₂HPO₄·12H₂O和NaH₂PO₄·2H₂O浓度分别为18.20g/L和15.15g/L，NaOH调pH为7.0，超声2h，离心取上清，即为棘白菌素B脱酰酶粗酶液。

3)、粗酶液旋蒸浓缩至原体积50％，旋蒸温度为45℃，旋蒸时间为2h。旋蒸浓缩后有杂蛋白沉淀出现，抽滤去除部分杂蛋白，所得滤液即为棘白菌素B脱酰酶酶液。

4)、将棘白菌素B溶于无水乙醇中，添加到脱酰酶酶液内配成反应体系，体系内棘白菌素B浓度控制在2mg/ml。将配制好的反应体系置于转化反应器内，充分搅拌，28℃，150rpm，转化6h。转化完成后，抽滤，取滤液HPLC定量检测棘白菌素B母核含量，并计算底物棘白菌素B的摩尔转化率为86％。

摩尔转化率％＝生成ECBN摩尔数/底物ECB摩尔数×100％

5)、转化后滤液过大孔吸附树脂，棘白菌素B母核完全吸附于树脂上，用浓度为60％的甲醇水溶液将ECBN集中洗脱下来，由图8计算的液相纯度达到90.7％。

6)、上柱后酶液按步骤4～5重复使用2次，棘白菌素B的摩尔转化率为90％、86％。

实施例3

1)、棘白菌素B脱酰酶的发酵

菌种：犹他游动放线菌(Actinoplanes utahensis NRRL12052)，购自美国农业研究菌种保藏中心。

培养基配方：

斜面培养基：酵母粉0.3％，麦芽浸粉0.3％，蛋白胨0.5％，葡萄糖1.0％，琼脂2.5％，pH 7.0-7.2，30℃培养5-7天

种子培养基：蔗糖2.5％，燕麦粉2％，酵母粉0.25％，K₂HPO₄0.1％，KCl 0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，FeSO₄·7H₂O 0.0002％，pH＝6.8，30℃培养4-5天

发酵培养基：蔗糖2.5％，花生粕粉1.2％，K₂HPO₄0.1％，MgSO₄·7H₂O0.3％，pH＝6.8，30℃培养3-4天

2)、发酵完成后，发酵液中添加Na₂HPO₄·12H₂O和NaH₂PO₄·2H₂O浓度分别为12.20g/L和10.15g/L，调节pH为6.8，超声1.5h，离心取上清，即为棘白菌素B脱酰酶粗酶液。

3)、粗酶液旋蒸浓缩至原体积70％，旋蒸温度为50℃，旋蒸时间为1.5h。旋蒸浓缩后有杂蛋白沉淀出现，抽滤去除部分杂蛋白，所得滤液即棘白菌素B脱酰酶酶液。

4)、将棘白菌素B溶于无水乙醇中，添加到脱酰酶酶液内配成反应体系，体系内棘白菌素B浓度控制在3mg/ml。将配制好的反应体系置于转化反应器内，充分搅拌，28℃，150rpm，转化12h。转化完成后，抽滤，取滤液HPLC定量检测棘白菌素B母核含量，并计算底物棘白菌素B的摩尔转化率为93％。

摩尔转化率％＝生成ECBN摩尔数/底物ECB摩尔数×100％

5)、转化后滤液过大孔吸附树脂XAD18，棘白菌素B母核完全吸附于树脂上，用浓度为50％的甲醇水溶液将ECBN集中洗脱下来，由图9计算的液相纯度达到92.6％。

6)、上柱后酶液按步骤4～5重复使用3次，棘白菌素B的摩尔转化率为90％、85％、85％。

Claims (3)

1.将棘白菌素B转化成棘白菌素B母核的方法，包括以下步骤：

1)发酵犹他游动放线菌(Actinoplanes utahensis)获得棘白菌素B脱酰酶；

2)发酵完成后，往发酵液中添加磷酸盐，使得磷酸盐的浓度为0.05M-0.15M，进行超声1-2h，离心取上清液，即为棘白菌素B脱酰酶粗酶液；

3)使粗酶液旋蒸浓缩并抽滤，旋蒸温度为45-50℃，旋蒸时间为1-2小时，得到棘白菌素B脱酰酶酶液；

4)将棘白菌素B溶于浓度大于或等于95％的乙醇中，与脱酰酶酶液混合并搅拌使其转化为棘白菌素B母核，转化6-12小时，过滤，取滤液；

5)滤液过大孔吸附树脂HP20或XAD18，棘白菌素B母核吸附于树脂上，用有机溶剂将棘白菌素B母核洗脱下来；

其中上柱后脱酰酶酶液按步骤4)-5)重复2-4次。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤2)中将所述发酵液的pH调节为6-7。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤3)中所述浓缩为将体积减少至原体积的50-80％。

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