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CN118931976A - 一种体外合成4-Deoxygadusol的方法 - Google Patents

一种体外合成4-Deoxygadusol的方法 Download PDF

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CN118931976A CN202411229063.4A CN202411229063A CN118931976A CN 118931976 A CN118931976 A CN 118931976A CN 202411229063 A CN202411229063 A CN 202411229063A CN 118931976 A CN118931976 A CN 118931976A
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Abstract

本发明提供了一种体外合成4‑Deoxygadusol的方法，属于生物技术领域，是以S7P（景天庚酮糖‑7‑磷酸）为底物，以来自于藻株Nostoc linkia NIES‑25的MAAs合成酶MysA3、MysB3为催化酶，体外催化合成4‑Deoxygadusol；其中，所述MysA3、MysB3编码基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NOs.5~6所示。本发明成功体外催化合成了MAAs的合成前体物质4‑Deoxygadusol，对探索新的MAAs合成途径具有重要的意义。

Description

一种体外合成4-Deoxygadusol的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是一种体外合成4-Deoxygadusol的方法。
背景技术
地球大气层中分布着厚度仅有0.3cm的臭氧层，臭氧层几乎吸收了到达大气层全部的 UV-C和90%左右的UV-B辐射，然而，现代工业生产和人们的生活中大量使用的氟氯烃和哈龙等卤素有机化合物，再加上两极地区极端气候，导致了臭氧层的严重破坏。臭氧层的破坏致使到达地表的UV-B辐射增强。经大量研究证实，UV-B辐射会对生物造成不同程度的伤害， 高强度的UV-B辐射可以直接伤害细胞中的DNA、蛋白质、脂类和色素，还会激发产生自由基的活性物质，这些物质会进一步对细胞造成更大的伤害。
生活在南极的藻类为应对高强度的UV-B辐射形成了一系列的防御机制，类菌胞素氨基酸(MAAs)是其中重要的紫外防御物质。目前，已经在多种海藻中发现MAAs，短波长的辐射会刺激MAAs的合成，它在海藻中主要发挥紫外防护和生长调控的作用。Sinha在对红藻(Gracilaria cornea)的研究中发现，MAAs对UV-B和高温等环境胁迫因子具有较高的稳定性。除了良好的抗紫外辐射活性，许志恒及贺庆梅等发现紫菜和江蓠中的MAAs还具有很好的抗氧化活性。良好的抗紫外辐射和抗氧化活性使得天然的紫外吸收化合物MAAs可作为护肤品中的防紫外剂。有研究表明，加入了5% MAAs(主要含有Prophyra-334和Shinorine)的面霜，其防紫外效力相当于1%UV-A滤光片和4%UV-B滤光片的效力，远远超过人们日常所需的紫外保护。但是，MAAs合成酶在生物体内的含量极少，这使得直接从生物体中分离纯化MAAs合成酶并进行其结构、功能活性和作用机制的研究极为困难。
MAAs的基本骨架是环己烯酮，4-deoxygadusol (4-DG)是MAAs的合成前体物质，可以与不同氨基酸发生缩合反应，从而产生多种类型的MAAs。目前，关于4-deoxygadusol 的合成途径及方法，并未有过具体的相关研究和报道。
体外多酶级联反应体系是由多种酶或辅酶在特定条件下协同作用，执行多种复杂的生物转化过程，从而实现目标产物的高效生产，具有反应速率快、选择性高、易于操作等显著优势，在生物合成领域展现出巨大的应用前景。为了进一步优化MAAs的产量，本发明首次尝试运用体外多酶级联反应体系进行体外合成4-Deoxygadusol，为后续合成MAAs提供新的途径。
发明内容
本发明提供了一种体外合成4-Deoxygadusol的方法，使用来自于藻株Nostoc linkiaNIES-25的MAAs合成酶MysA3、MysB3作为催化酶催化S7P底物，成功体外催化合成了MAAs的合成前体物质4-Deoxygadusol，这对探索新的MAAs合成途径具有重要的意义。
本发明技术方案如下：
一种体外合成4-Deoxygadusol的方法，是以景天庚酮糖-7-磷酸为底物，以MysA3、MysB3为催化酶，体外催化合成4-Deoxygadusol；
其中，所述MysA3编码基因mysA 3的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述MysB3编码基因mysB 3的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
优选的，所述体外合成4-Deoxygadusol的方法，包括如下步骤：
（1）配置景天庚酮糖-7-磷酸溶液；
（2）配置含有MysA3和MysB3的复合酶液；
（3）向步骤（1）的景天庚酮糖-7-磷酸溶液中加入步骤（2）的复合酶液，35~37℃条件下振荡反应4~5h，得含有4-Deoxygadusol的反应液。
优选的，步骤（1）中所述景天庚酮糖-7-磷酸溶液的浓度为4~6mM。
优选的，步骤（2）中所述复合酶液的制备方法为：将浓度为1~2mg/mL的MysA3酶液与浓度为1.6~2.2mg/mL的MysB3酶液按照4:（2.9~3.1）的体积比例混合，得复合酶液。
优选的，步骤（3）中所述景天庚酮糖-7-磷酸溶液与复合酶液之间的体积比例为1:（0.9~1.1）。
优选的，所述MysA3、MysB3的制备方法，包括如下步骤：
S1，将mysA 3、mysB 3分别通过载体导入到大肠杆菌中，分别得重组大肠杆菌；
S2，将重组大肠杆菌接种于LB液体培养基中进行35~37℃活化培养，将活化后的重组大肠杆菌菌液按照1~3%（v/v）的比例接种至新的LB液体培养基中，培养至OD600为0.5~0.7，然后添加终浓度为0.1~0.5mM的IPTG，于25~30℃的培养温度下诱导培养20~36h，得发酵液；
S3，对发酵液中的蛋白进行纯化，分别得MysA3、MysB3。
优选的，步骤S1中所述载体为pET28b质粒。
优选的，步骤S2中所述活化培养的条件为：将重组大肠杆菌接种于LB液体培养基中进行35~37℃活化培养1~10h。
优选的，步骤S2中所述诱导培养的时间为20~36h。
优选的，步骤S3中所述纯化的方法为镍柱纯化。
有益效果：
本发明将三套关键酶基因mysA、mysB分别克隆并构建重组大肠杆菌，通过检测各个基因的蛋白表达效果，筛选出表达量最高的2个关键酶MysA3、MysB3进行后续的纯化工作；获得高纯度的关键酶后，依据4-Deoxygadusol的生物合成途径，以景天庚酮糖-7-磷酸作为起始底物使用MysA3、MysB3作为催化酶催化，开展一锅法多酶级联反应制备4-Deoxygadusol，这对探索新的MAAs合成途径具有重要的意义。
附图说明
图1为MysA3、MysB3的蛋白表达情况；
图2为MysA3、MysB3的蛋白纯化情况；
图3为体外多酶级联反应中4-Deoxygadusol的代谢途径示意图；
图4为体外多酶级联反应底物及产物的HPLC和LC-MS检测图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例进行说明：
（1）实验材料来源说明：
pET28b、E. coliXL1-Blue、E. coliBL21：均为常规市售产品，来源于齐鲁工业大学生物实验室。
景天庚酮糖-7-磷酸（S7P）：购自cayman chemical公司。
（2）以下实施例所用到培养基和主要试剂的配制：
LB液体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠。
LB固体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，15g/L琼脂。
结合缓冲液：20mM PB，0.5M NaCl，pH 7.4。
洗杂缓冲液：20mM PB，0.5M NaCl，20mM 咪唑，pH7.4。
洗脱缓冲液：20mM PB，0.5MNaCl，500mM 咪唑，pH7.4。
染色液：100mL冰醋酸，200mL无水乙醇，1.0g考马斯亮蓝。
脱色液：100mL冰醋酸，250mL无水乙醇，700mL蒸馏水。
PBS缓冲液：8.0g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4，0.24g KH2PO4，1000mL蒸馏水，HCl调节pH至7.4。
SDS PAGE loading buffer：取1.25mL 1M Tris-HCl缓冲液、0.5g十二烷基硫酸钠、0.025g 溴酚蓝、2.5mL甘油、0.25mL β-巯基乙醇，加ddH2O至25mL。
实施例1：单酶质粒的构建
一、MAAs合成基因
发明人挑选了3种MAAs合成基因簇，分别来自于Nostoc punctiformeATCC 29133、Anabaena variabilisATCC 29413、Nostoc linkiaNIES-25，将MAAs合成基因簇中的6个关键酶基因送至派森诺生物科技公司进行密码子优化和基因合成。
其中，6个关键酶基因的信息如下：
mysA 1、mysB 1：来自于Nostoc punctiformeATCC 29133中的MAAs合成基因簇为基因簇1，其核苷酸序列分别如SEQ ID NOs.1~2所示。
mysA 2、mysB 2：来自于Anabaena variabilisATCC 29413中的MAAs合成基因簇为基因簇2，其核苷酸序列分别如SEQ ID NOs.3~4所示。
mysA 3、mysB 3：来自于Nostoc linkiaNIES-25中的MAAs合成基因簇为基因簇3，其核苷酸序列分别如SEQ ID NOs.5~6所示。
二、重组质粒的构建
将pET28b质粒使用NdeI和XhoI进行双酶切处理并纯化回收后，得pET28b载体片段；
使用ClonExpress Ⅱ一步克隆试剂盒，将pET28b载体片段分别与上述6个关键酶基因进行连接，得6个重组质粒。
三、重组大肠杆菌的构建
将6个重组质粒分别转化至E. coliXL1-Blue中，具体操作方法如下：
将感受态细胞E. coliXL1-Blue从超低温冰箱取出，置于冰上备用；吸取10μL重组质粒分别加入到感受态细胞中，轻吹混匀，随后置于冰上冰浴30min，然后42℃水浴锅热激90s，立即置于冰上冰浴2min，得转化液。向转化液中加入LB液体培养基900μL，37℃摇床复苏1h，6000rpm离心3min，吸掉500μL上清液，将剩余上清液和菌体轻轻混匀，得菌悬液，吸取100μL菌悬液涂布到含有50μg/mL Kan、50μg/mL Amp的LB固体培养基上，37℃培养12h，至长出单菌落。
挑取单菌落进行菌落PCR初步验证，随后提取质粒进行测序，将测序成功的重组质粒转化至E. coliBL21中，转化方法同上，得6株重组大肠杆菌，即：E. coliBL21/pET28b-mysA 1、E. coliBL21/pET28b-mysB 1、E. coliBL21/pET28b-mysA 2、E. coliBL21/pET28b-mysB 2、E. coliBL21/pET28b-mysA 3、E. coliBL21/pET28b-mysB 3。
实施例2：酶的表达与纯化
一、酶的表达
将实施例1中的6株重组大肠杆菌分别接种至LB液体培养基中进行37℃活化培养1h，将活化后的菌液按照1%（v/v）的比例分别接种至含有50μg/mL Kan的LB液体培养基中，培养至OD600为0.6；添加终浓度为0.2mM的IPTG，于25℃下诱导培养20h，得发酵液。
将上述发酵液于10000rpm离心5min，收集菌体沉淀，用PBS缓冲液洗涤2次并重悬，使用超声破碎机对重悬液进行破碎（超声4s暂停4s），功率400w，超声20min。
超声结束后，吸取超声后的液体加入SDS PAGE Loading buffer，制得全细胞样品；将超声后的液体进行10000rpm离心10min，上清液中加入SDS PAGE Loading buffer，制得全胞内样品。
通过12% SDS-PAGE分析全细胞样品和全胞内样品中的蛋白表达情况，结果如图1所示，其中，泳道M为180kDa Prestained Protein Marker，泳道1~2分别为空白对照E. coliBL21的全细胞和胞内蛋白表达示意图，泳道3~6分别为MysA1、MysB1的全细胞和胞内蛋白表达结果图，泳道7~10分别为MysA2、MysB2的全细胞和胞内蛋白表达结果图，泳道11~14分别为MysA3、MysB3的全细胞和胞内蛋白表达结果图。
由图1可得，所有蛋白均为可溶性蛋白，不产生或产生少量包涵体，这表明所选用的诱导条件是适宜的；在蛋白表达水平方面，MysA3的表达量稍高于MysA2，MysB2产生少量包涵体，MysB3表达量最高。综上可见，MysA3、MysB3蛋白表达效果最好，从蛋白表达水平上来看，Nostoc linkiaNIES-25来源的MAAs合成基因簇具有更强的生产能力，其效果优于Nostoc punctiformeATCC 29133和Anabaena variabilisATCC 29413。
二、酶的纯化
将重组大肠杆菌E. coliBL21/pET28b-mysA 3、E. coliBL21/pET28b-mysB 3进行37℃活化培养1h，将活化后的菌液按照1%（v/v）的比例分别接种至含有50μg/mL Kan的LB液体培养基中，培养至OD600为0.6；添加终浓度为0.2mM的IPTG，于25℃下诱导培养20h，得发酵液。
将上述发酵液于10000rpm离心5min，收集菌体沉淀，用PBS缓冲液洗涤2次并重悬，使用超声破碎机对重悬液进行破碎（超声4s暂停4s），功率400w，超声20min。将超声后的液体进行10000rpm离心10min，上清液中加入SDS PAGE Loading buffer，制得全胞内样品。
按照以下步骤对胞内样品进行镍柱纯化：
（1）样品准备：将胞内样品用0.22μm的滤膜过滤；
（2）水洗：用5mL纯水清洗树脂；
（3）平衡：用5mL结合缓冲液平衡；
（4）上样：上样，在镍柱中孵育30min，收集穿透液；
（5）洗杂：用10mL洗杂缓冲液洗杂；
（6）洗脱：用5mL洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液。
透析袋提前用纯水浸泡软化，将收集的洗脱液转移到透析袋中，透析袋对应的分子量是14kD，两端用塑料夹夹紧，于PBS缓冲液中4℃低温透析6h，期间更换透析液。将透析得到的蛋白加入SDS PAGE Loading buffer，制得蛋白样品，通过12% SDS-PAGE分析蛋白表达情况，其中染色液染色3h，脱色液脱色1h，脱色期间更换3次脱色液。
将纯化后的酶通过SDS-PAGE进行纯度分析，纯化结果如图2所示，其中，泳道M为180kDa Prestained Protein Marker，泳道1~2分别为MysA3、MysB3的蛋白纯化结果。由图2可得，纯化得到的MysA3、MysB3的分子量分别约为45kDa、31kDa；经测定，MysA3酶液、MysB3酶液中的蛋白浓度分别为1.001mg/mL、1.676mg/mL。
实施例3：体外多酶级联反应合成4-Deoxygadusol
将纯化后的MysA3、MysB3通过体外多酶级联反应进行体外合成4-Deoxygadusol，合成示意图如图3所示，具体为：底物S7P（景天庚酮糖-7-磷酸）在MysA、MysB的作用下生成4-Deoxygadusol。
体外多酶级联反应如下：
（1）以超纯水为溶剂，配置浓度为5mM的S7P溶液。
（2）将蛋白浓度为1.001mg/mL的MysA3酶液和蛋白浓度为1.676mg/mL的MysB3酶液按照体积比例为4:3的比例混合，得复合酶液。
（3）实验组：将1mL S7P溶液与1mL复合酶液于37℃条件下振荡反应4h，得反应液；空白对照组：与实验组不同的是，对MysA3酶液和MysB3酶液进行煮沸5min失活，制备成复合酶液，其它条件不变。
（4）反应完成后，将反应液用沸水加热10min终止反应，然后10000rpm离心10min，取上清液，使用0.22μm滤膜过滤，制得样品。对样品中的产物进行HPLC检测。
HPLC检测结果如图4所示，其中A图为底物S7P的HPLC检测图谱，B图为失活后MysA3、MysB3的HPLC检测图谱，C图为空白对照组中样品的HPLC检测图谱，D图为实验组中样品的HPLC检测图谱，E图为4-Deoxygadusol的二级质谱和结构。
由图4可得，图A中底物S7P的出峰时间为5.08min，图C中在5.213min左右出现非常小的底物峰，图C、D中的其它峰与图B中的出峰时间非常接近，这说明空白对照组和实验组样品中的绝大部分杂峰都由酶的自身存在体系（PBS缓冲液）带来；图D在10.428min处有新物质生成，经LC-MS鉴定为目标物质4-Deoxygadusol（图E），该结果表明，通过上述体外多酶级联反应体系，成功合成了4-Deoxygadusol。
综上，本发明以来自于藻株Nostoc linkiaNIES-25的MAAs合成酶MysA3、MysB3为催化酶，通过开展一锅法多酶级联反应，成功体外催化合成了MAAs的合成前体物质4-Deoxygadusol，这对探索新的MAAs合成途径具有重要的意义。

Claims (10)

1.一种体外合成4-Deoxygadusol的方法，其特征在于，是以景天庚酮糖-7-磷酸为底物，以MysA3、MysB3为催化酶，体外催化合成4-Deoxygadusol；
其中，所述MysA3编码基因mysA 3的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述MysB3编码基因mysB 3的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）配置景天庚酮糖-7-磷酸溶液；
（2）配置含有MysA3和MysB3的复合酶液；
（3）向步骤（1）的景天庚酮糖-7-磷酸溶液中加入步骤（2）的复合酶液，35~37℃条件下振荡反应4~5h，得含有4-Deoxygadusol的反应液。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述景天庚酮糖-7-磷酸溶液的浓度为4~6mM。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述复合酶液的制备方法为：将浓度为1~2mg/mL的MysA3酶液与浓度为1.6~2.2mg/mL的MysB3酶液按照4:（2.9~3.1）的体积比例混合，得复合酶液。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述景天庚酮糖-7-磷酸溶液与复合酶液之间的体积比例为1:（0.9~1.1）。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述MysA3、MysB3的制备方法，包括如下步骤：
S1，将mysA 3、mysB 3分别导入到大肠杆菌中，分别得重组大肠杆菌；
S2，将重组大肠杆菌接种于LB液体培养基中进行35~37℃活化培养，将活化后的重组大肠杆菌菌液按照1~3%（v/v）的比例接种至新的LB液体培养基中，培养至OD600为0.5~0.7，然后添加终浓度为0.1~0.5mM的IPTG，于25~30℃的培养温度下诱导培养20~36h，得发酵液；
S3，对发酵液中的蛋白进行纯化，分别得MysA3、MysB3。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述载体为pET28b质粒。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述活化培养的条件为：将重组大肠杆菌接种于LB液体培养基中进行35~37℃活化培养1~10h。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述诱导培养的时间为20~36h。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S3中所述纯化的方法为镍柱纯化。
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CN119193457A (zh) * 2024-11-29 2024-12-27 浙江大学海南研究院 一种生产类菌胞素代谢物的链霉菌重组工程菌株及其构建方法与应用

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