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CN106319016B - 一种制备11α,17α-羟基黄体酮的方法 - Google Patents

一种制备11α,17α-羟基黄体酮的方法 Download PDF

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CN106319016B
CN106319016B CN201610834523.5A CN201610834523A CN106319016B CN 106319016 B CN106319016 B CN 106319016B CN 201610834523 A CN201610834523 A CN 201610834523A CN 106319016 B CN106319016 B CN 106319016B
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hydroxyprogesterone
fermentation
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magnetic nano
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李迎光
管世敏
蔡保国
李茜茜
张硕
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Shanghai Institute of Technology
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    • C12P33/06—Hydroxylating
    • C12P33/08—Hydroxylating at 11 position
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Abstract

本发明公开了一种发酵法制备11α,17α‑羟基黄体酮的方法，以17α‑羟基黄体酮为底物，通过在培养基中添加磁性纳米四氧化三铁粉，利用赭曲霉发酵法制备11α,17α‑羟基黄体酮。本发明具有如下优点：（1）投料浓度高，底物摩尔转化率高。投料浓度可达到30g/L，最高摩尔转化率可达到91.9%。（2）磁性纳米四氧化三铁粉可回收循环利用。本发明所采用磁性纳米四氧化三铁粉，可大幅度提高羟基转化率，工艺简单，生产成本低，具有较高的工业应用前景。

Description

一种制备11α,17α-羟基黄体酮的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种甾体中间体，特别是一种制备11α,17α-羟基黄体酮的方法。
背景技术
甾体化合物(Steroids)又称类固醇，是一类含有环戊烷多氢菲母核的化合物。其基本结构如下图所示，由三个六元环和一个五元环组成，分别称为A、B、C、D环，一般在甾体母核的第10和13位上有角甲基(-CH3)，第3、11位可能有羟基(-OH)或酮基(-C＝O)，A环或B环存在部分双键，第17位上有长短不同的侧链。由于甾体母核上取代基、双键位置或立体构型等的不同，形成了一系列具有独特生理功能的化合物。
Figure BDA0001117247570000011
甾体化合物结构通式
甾体类药物是医药行业中产量仅次于抗生素的第二大类药物，甾体类药物具有抗过敏、抗休克、抗炎症、抗变态反应等多种功效，被广泛用于治疗支气管哮喘、风湿性关节炎、湿疹、贫血以及促进骨折和伤口的愈合，也被用于治疗艾迪森氏等内分泌疾病，对机体发展、免疫调节、皮肤疾病治疗及生育控制方面有重要的作用。甾体类药物对激素依赖型肿瘤的治疗有一定的疗效。随着甾体化学的迅速发展，甾体激素类药物己成为医药领域的重要门类,在临床上的应用非常广泛。
11α,17α-羟基黄体酮是合成甾体类药物醋酸泼尼松龙的重要中间体，一般11α,17α-羟基黄体酮的制备可以17α-羟基黄体酮为底物，通过霉菌发酵对其C11位上羟基来获得，但到目前为止利用发酵法生产11α,17α-羟基黄体酮的相关专利和研究报道却比较少。
由于甾体类药物极低的水溶性，而羟基化反应基本在胞内完成。所以，甾体底料进入菌体胞内的速率是影响羟基化反应速率的主要制约因素。
目前采用较多的方法是在发酵液中加入有机溶剂或表面活性剂对底物进行有效分散，来提高甾体底料与菌体细胞的接触面积、从而提高羟基化反应速率。然而在发酵液中添加有机溶剂或表面活性剂有如下缺点：①对菌体具有损伤作用。②一定程度上抑制羟基化酶的酶活。③一次性投入，无法循环使用。
随着纳米技术的飞速发展，现被运用材料和制备、微电子和计算机技术、医学与健康、航天和航空、环境和能源、生物技术和农产品等方面，但是在甾体药物的生物转化领域的应用仍较少。
发明内容
针对现有技术中的上述问题，本发明提供一种制备11α,17α-羟基黄体酮的方法，所述的这种制备11α,17α-羟基黄体酮的方法解决了现有技术中制备11α,17α-羟基黄体酮过程中摩尔转化率较低、底物投料量较低的技术难题。
本发明提供了一种制备11α,17α-羟基黄体酮的方法，以17α-羟基黄体酮为底物，通过在发酵液中添加磁性纳米四氧化三铁粉，利用赭曲霉微生物发酵制备11α,17α-羟基黄体酮。
进一步的，所述的赭曲霉(Aspergillus ochraceus)的保藏号为CICC 40239，来自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
进一步的，上述的一种制备11α,17α-羟基黄体酮的方法，包括如下步骤：
1)一个配制发酵培养基的步骤，所述培养基由葡萄糖、玉米浆、酵母膏和水组成，在所述的培养基中，葡萄糖的浓度为20-40g/L，玉米浆的浓度为20-40g/L，酵母膏的浓度为10-20g/L，pH5.0-7.0；
2)一个接种赭曲霉的步骤，将斜面培养的赭曲霉接种于种子培养基中，培养温度为28℃，培养0-36h后，再按照10％接种量将种子液接入发酵培养基，培养温度28℃；
3)在所述的发酵培养液中，待培养时间为18h时，先加入磁性纳米四氧化三铁粉，加入后的磁性纳米四氧化三铁粉在培养基中的浓度为5-10g/L，搅拌均匀后，再加入17α-羟基黄体酮，加入后的17α-羟基黄体酮在培养基中的浓度为20-30g/L，发酵60-100h；
4)一个产物提取的步骤，发酵结束后，将发酵液90℃灭活，冷却至室温后，板框压滤，取滤饼进行萃取，再经过过滤、脱色、蒸馏和精制步骤，得到11α,17α-羟基黄体酮。
进一步的，17α-羟基黄体酮的平均粒径为30μm，磁性纳米四氧化三铁粉的平均粒径范围为30-80nm。
进一步的，1在菌体萃取结束后，将菌体重悬于水中，利用磁性分离器回收四氧化三铁。
本发明以17α-羟基黄体酮为底物，利用赭曲霉(Aspergillus ochraceus)发酵制备11α,17α-羟基黄体酮，在发酵培养基中添加磁性纳米四氧化三铁粉，对17α-羟基黄体酮进行生物转化，能够让17α-羟基黄体酮的最高投料浓度达到30g/L，最高摩尔转化率达到91.9％。
本发明的优点在于：(1)该材料的加入可以较大幅度的提高投料浓度和摩尔转化率。投料浓度可达到30g/L，最高摩尔转化率可达到91.9％。(2)磁性纳米四氧化三铁粉可回收循环利用。该材料可以利用磁性分离器进行回收再利用，很大程度上节约了生产成本，有利于工业化的推广应用。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明所采用磁性纳米四氧化三铁粉，可大幅度提高羟基转化率，工艺简单，生产成本低，具有较高的工业应用前景。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进一步阐述，但不限制本发明。
本发明采用的赭曲霉(Aspergillus ochraceus)(CICC 40239)是公开销售的微生物，来自中国工业微生物菌种保藏管理中心，该机构的地址为：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼(100015)，可以通过电话购买，也可以通过网站订购(http://www.china-cicc.org)，任何人只要支付相关的费用均可以购买。
实施例1
赭曲霉(Aspergillus ochraceus)通过斜面培养，得到发酵所需要的菌种。
一、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)斜面菌种及种子液制备
(1)斜面培养
斜面培养基：去皮马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，自然pH，121℃湿热灭菌30min。
将甘油管中保藏的菌种于无菌操作下吸取一定量菌液均匀涂布于斜面培养基中，28℃恒温培养4-6天。
(2)种子培养
种子培养基：葡萄糖10g/L，玉米浆10g/L，酵母膏10g/L，自然pH值7.0，121℃湿热灭菌30min。
将步骤(1)培养的菌株，在无菌条件下用接种环挑取6环孢子于装有100ml种子培养基中，按照同样方式接种4瓶，并于28℃条件下，200r/min培养24h，制得种子液。
二、发酵培养
发酵培养基：葡萄糖20g/L，玉米浆20g/L，酵母膏10g/L，pH值5.0。将装有发酵培养基的发酵罐于121℃高压蒸汽灭菌15min。
使用5L发酵罐进行生物转化，装液量3.5L(70％)，将种子液按照10％接种量转接入发酵培养基中，温度28℃，根据菌浓情况、搅拌效果和溶氧水平，调整通气比和搅拌转速，通气比控制范围为0.7～1.2v/v/min，转速控制范围为200～600r/min。当培养时间为18h时，加入底物17α-羟基黄体酮20g/L，期间每隔12h取样TLC检测转化情况，若间隔12h的取样点在硅胶板上的17α-羟基黄体酮斑点颜色深度及大小没有变化，即终止发酵。
样品用3倍乙酸乙酯进行萃取，离心收集上清液，萃取3次，合并3次萃取液液进行HPLC分析检测，在发酵90h后，最终发酵液中产物11α,17α-羟基黄体酮的含量为15.8g/L，17α-羟基黄体酮的含量为4.1g/L，17α-羟基黄体酮的摩尔转化率为75.4％。
发酵结束后，将发酵液90℃灭活，冷却至25℃后，板框压滤，滤饼用三氯甲烷萃取，再经过滤、脱色及蒸馏等工序得到11α,17α-羟基黄体酮粗品。后将含有四氧化三铁粉的菌体重悬于水中，在磁性分离器中对磁性纳米四氧化三铁粉进行回收，回收物用水清洗干净，烘干待用。
上述粗品再用氯仿-甲苯打浆精制，最终得到11α,17α-羟基黄体酮精品43.6g，总收率为62.3％，纯度为97.8％。
实施例2
将赭曲霉Aspergillus ochraceus菌株制成种子液(方法同实施例1)，然后进行发酵培养。
发酵培养基：葡萄糖20g/L，玉米浆20g/L，酵母膏10g/L，pH值5.0。将装有发酵培养基的发酵罐于121℃高压蒸汽灭菌15min。
使用5L发酵罐进行生物转化，装液量3.5L(70％)，将种子液按照10％接种量转接入发酵培养基中，温度28℃，根据菌浓情况、搅拌效果和溶氧水平，调整通气比和搅拌转速，通气比控制范围为0.7～1.2v/v/min，转速控制范围为200～600r/min。当培养时间为18h时，加入二甲基甲酰胺(DMF)5g/L，底物17α-羟基黄体酮20g/L，期间每隔12h取样TLC检测转化情况，若间隔12h的取样点在硅胶板上的17α-羟基黄体酮斑点颜色深度及大小没有变化，即终止发酵。
样品用3倍乙酸乙酯进行萃取，离心收集上清液，萃取3次，合并3次萃取液液进行HPLC分析检测，在发酵90h后，最终发酵液中产物11α,17α-羟基黄体酮的含量为16.4g/L，17α-羟基黄体酮的含量为3.6g/L，17α-羟基黄体酮的摩尔转化率为78.2％。
发酵结束后，将发酵液90℃灭活，冷却至25℃后，板框压滤，滤饼用三氯甲烷萃取，再经过滤、脱色及蒸馏等工序得到11α,17α-羟基黄体酮粗品。后将含有四氧化三铁粉的菌体重悬于水中，在磁性分离器中对磁性纳米四氧化三铁粉进行回收，回收物用水清洗干净，烘干待用。
上述粗品再用氯仿-甲苯打浆精制，最终得到11α,17α-羟基黄体酮精品46.5g，总收率为66.4％，纯度为98.0％。
实施例3
将赭曲霉Aspergillus ochraceus菌株制成种子液(方法同实施例1)，然后进行发酵培养。
发酵培养基：葡萄糖20g/L，玉米浆20g/L，酵母膏10g/L，pH值5.0。将装有发酵培养基的发酵罐于121℃高压蒸汽灭菌15min。
使用5L发酵罐进行生物转化，装液量3.5L(70％)，将种子液按照10％接种量转接入发酵培养基中，温度28℃，根据菌浓情况、搅拌效果和溶氧水平，调整通气比和搅拌转速，通气比控制范围为0.7～1.2v/v/min，转速控制范围为200～600r/min。当培养时间为18h时，加入平均粒径为30nm的纳米四氧化三铁粉5g/L，底物17α-羟基黄体酮20g/L。期间每隔12h取样TLC检测转化情况，若间隔12h的取样点在硅胶板上的17α-羟基黄体酮斑点颜色深度及大小没有变化，即终止发酵。
样品用3倍乙酸乙酯进行萃取，离心收集上清液，萃取3次，合并3次萃取液进行HPLC分析检测，在发酵90h后，最终发酵液中产物11α,17α-羟基黄体酮的含量为19.2g/L，17α-羟基黄体酮的含量0.9g/L，17α-羟基黄体酮的的摩尔转化率为91.6％。
发酵结束后，将发酵液90℃灭活，冷却至25℃后，板框压滤，滤饼用三氯甲烷萃取，再经过滤、脱色及蒸馏等工序得到11α,17α-羟基黄体酮粗品。后将含有四氧化三铁粉的菌体重悬于水中，在磁性分离器中对磁性纳米四氧化三铁粉进行回收，回收物用水清洗干净，烘干待用。
上述粗品再用氯仿-甲苯打浆精制，最终得到11α,17α-羟基黄体酮精品55.7g，总收率为79.6％，纯度为98.2％。
实施例4
将赭曲霉Aspergillus ochraceus菌株制成种子液(方法同实施例1)，然后进行发酵培养。
发酵培养基：葡萄糖20g/L，玉米浆20g/L，酵母膏10g/L，pH值5.0。将装有发酵培养基的发酵罐于121℃高压蒸汽灭菌15min。
使用5L发酵罐进行生物转化，装液量3.5L(70％)，将种子液按照10％接种量转接入发酵培养基中，温度28℃，根据菌浓情况、搅拌效果和溶氧水平，调整通气比和搅拌转速，通气比控制范围为0.7～1.2v/v/min，转速控制范围为200～600r/min。当培养时间为18h时，加入平均粒径为30nm的纳米四氧化三铁粉5g/L，底物17α-羟基黄体酮25g/L，期间每隔12h取样TLC检测转化情况，若间隔12h的取样点在硅胶板上的17α-羟基黄体酮斑点颜色深度及大小没有变化，即终止发酵。
样品用3倍乙酸乙酯进行萃取，离心收集上清液，萃取3次，合并3次萃取液进行HPLC分析检测，在发酵90h后，最终发酵液中产物11α,17α-羟基黄体酮的含量为23.9g/L，17α-羟基黄体酮的含量为1.5g/L，17α-羟基黄体酮的的摩尔转化率为91.2％。
发酵结束后，将发酵液90℃灭活，冷却至25℃后，板框压滤，滤饼用三氯甲烷萃取，再经过滤、脱色及蒸馏等工序得到11α,17α-羟基黄体酮粗品。后将含有四氧化三铁的菌体重悬于水中，在磁性分离器中对磁性纳米四氧化三铁粉进行回收，回收物用水清洗干净，烘干待用。
上述粗品再用氯仿-甲苯打浆精制，最终得到11α,17α-羟基黄体酮精品69.4g，总收率为79.3％，纯度为98.1％。
实施例5
将赭曲霉(Aspergillus ochraceus)菌株制成种子液(方法同实施例1)，然后进行发酵培养。
发酵培养基：葡萄糖20g/L，玉米浆20g/L，酵母膏10g/L，pH值5.0。将装有发酵培养基的发酵罐于121℃高压蒸汽灭菌15min。
使用5L发酵罐进行生物转化，装液量3.5L(70％)，将种子液按照10％接种量转接入发酵培养基中，温度28℃，根据菌浓情况、搅拌效果和溶氧水平，调整通气比和搅拌转速，通气比控制范围为0.7～1.2v/v/min，转速控制范围为200～600r/min。当培养时间为18h时，加入平均粒径为30nm的纳米四氧化三铁粉5g/L，底物17α-羟基黄体酮30g/L，期间每隔12h取样TLC检测转化情况，若间隔12h的取样点在硅胶板上的17α-羟基黄体酮斑点颜色深度及大小没有变化，即终止发酵。
样品用3倍乙酸乙酯进行萃取，离心收集上清液，萃取3次，合并3次萃取液进行HPLC分析检测，在发酵90h后，最终发酵液中产物11α,17α-羟基黄体酮的含量为28.4g/L，17α-羟基黄体酮的含量为1.3g/L，17α-羟基黄体酮的的摩尔转化率为90.3％。
发酵结束后，将发酵液90℃灭活，冷却至25℃后，板框压滤，滤饼用三氯甲烷萃取，再经过滤、脱色及蒸馏等工序得到11α,17α-羟基黄体酮粗品。后将含有四氧化三铁粉的菌体重悬于水中，在磁性分离器中对磁性纳米四氧化三铁粉进行回收，回收物用水清洗干净，烘干待用。
上述粗品再用氯仿-甲苯打浆精制，最终得到11α,17α-羟基黄体酮精品83.0g，总收率为79.0％，纯度为98.1％。
实施例6
将赭曲霉Aspergillus ochraceus菌株制成种子液(方法同实施例1)，然后进行发酵培养。
发酵培养基：葡萄糖30g/L，玉米浆30g/L，酵母膏15g/L，pH值6.0。将装有发酵培养基的发酵罐于121℃高压蒸汽灭菌15min。
使用5L发酵罐进行生物转化，装液量3.5L(70％)，将种子液按照10％接种量转接入发酵培养基中，温度28℃，根据菌浓情况、搅拌效果和溶氧水平，调整通气比和搅拌转速，通气比控制范围为0.7～1.2v/v/min，转速控制范围为200～600r/min。当培养时间为18h时，加入平均粒径为50nm的纳米四氧化三铁粉8g/L，底物17α-羟基黄体酮30g/L，期间每隔12h取样TLC检测转化情况，若间隔12h的取样点在硅胶板上的17α-羟基黄体酮斑点颜色深度及大小没有变化，即终止发酵。
样品用3倍乙酸乙酯进行萃取，离心收集上清液，萃取3次，合并3次萃取液进行HPLC分析检测，在发酵96h后，最终发酵液中产物11α,17α-羟基黄体酮的含量为28.9g/L，17α-羟基黄体酮的含量为0.9g/L，17α-羟基黄体酮的的摩尔转化率为91.9％。
发酵结束后，将发酵液90℃灭活，冷却至25℃后，板框压滤，滤饼用三氯甲烷萃取，再经过滤、脱色及蒸馏等工序得到11α,17α-羟基黄体酮粗品。后将含有四氧化三铁的菌体重悬于水中，在磁性分离器中对磁性纳米四氧化三铁粉进行回收，回收物用水清洗干净，烘干待用。
粗品再用氯仿-甲苯打浆精制，最终得到11α,17α-羟基黄体酮精品85.0g，总收率为81.0％，纯度为98.3％。
实施例7
将赭曲霉Aspergillus ochraceus菌株制成种子液(方法同实施例1)，然后进行发酵培养。
发酵培养基：葡萄糖40g/L，玉米浆40g/L，酵母膏20g/L，pH值7.0。将装有发酵培养基的发酵罐于121℃高压蒸汽灭菌15min。
使用5L发酵罐进行生物转化，装液量3.5L(70％)，将种子液按照10％接种量转接入发酵培养基中，温度28℃，根据菌浓情况、搅拌效果和溶氧水平，调整通气比和搅拌转速，通气比控制范围为0.7～1.2v/v/min，转速控制范围为200～600r/min。当培养时间为18h时，加入平均粒径为80nm的纳米四氧化三铁粉10g/L，底物17α-羟基黄体酮30g/L，期间每隔12h取样TLC检测转化情况若间隔12h的取样点在硅胶板上的17α-羟基黄体酮斑点颜色深度及大小没有变化，即终止发酵。
样品用3倍乙酸乙酯进行萃取，离心收集上清液，萃取3次，合并3次萃取液进行HPLC分析检测，在发酵90h后，最终发酵液中产物11α,17α-羟基黄体酮的含量为28.5g/L，17α-羟基黄体酮的含量为1.1g/L，17α-羟基黄体酮的摩尔转化率为90.6％。
发酵结束后，将发酵液90℃灭活，冷却至25℃后，板框压滤，滤饼用三氯甲烷萃取，再经过滤、脱色及蒸馏等工序得到11α,17α-羟基黄体酮粗品。后将含有四氧化三铁的菌体重悬于水中，在磁性分离器中对磁性纳米四氧化三铁粉进行回收，回收物用水清洗干净，烘干待用。
上述粗品再用氯仿-甲苯打浆精制，最终得到11α,17α-羟基黄体酮精品83.3g，总收率为79.3％，纯度为98.1％。
通过实施例可知，通过在发酵液中加入磁性纳米四氧化三铁粉的方法具有以下优点：
1、有助于提高17α-羟基黄体酮的摩尔转化率。如实施例1、2、3所述，实施例1中未加入有机溶剂或磁性纳米四氧化三铁粉，在投料浓度为20g/L的情况下，底物摩尔转化率为75.4％；实施例2中加入有机溶剂DMF，在投料20g/L的情况下，底物的摩尔转化率仅提高到78.2％；在发酵培养液中添加磁性纳米四氧化三铁粉，在投料浓度为20g/L的情况下，底物摩尔转化率提升至91.6％。
2、有助于提高17α-羟基黄体酮的投料浓度。如实施例5、6和7所述，通过在发酵培养液中添加磁性纳米四氧化三铁粉，在投料浓度为30g/L的情况下，底物最高摩尔转化率可以达到91.9％。
3、磁性纳米四氧化三铁粉可回收循环使用，有助于降低生产成本。
上述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种制备11α,17α-羟基黄体酮的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)一个配制发酵培养基的步骤，所述培养基由葡萄糖、玉米浆、酵母膏和水组成，在所述的培养基中，葡萄糖的浓度为20-40g/L，玉米浆的浓度为20-40g/L，酵母膏的浓度为10-20g/L，pH5.0-7.0；
2)一个接种赭曲霉的步骤，将斜面培养的赭曲霉接种于种子培养基中，培养温度为28℃，培养0-36h后，再按照10％接种量将种子液接入发酵培养基，培养温度28℃；
3)在所述的发酵培养液中，待培养时间为18h时，先加入磁性纳米四氧化三铁粉，加入后的磁性纳米四氧化三铁粉在培养基中的浓度为5-10g/L，搅拌均匀后，再加入17α-羟基黄体酮，加入后的17α-羟基黄体酮在培养基中的浓度为20-30g/L，发酵60-100h；
4)一个产物提取的步骤，发酵结束后，将发酵液90℃灭活，冷却至室温后，板框压滤，取滤饼进行萃取，再经过过滤、脱色、蒸馏和精制步骤，得到11α,17α-羟基黄体酮。
2.根据权利要求1所述的一种制备11α,17α-羟基黄体酮的方法，其特征在于：17α-羟基黄体酮的平均粒径为30μm，磁性纳米四氧化三铁粉的平均粒径范围为30-80nm。
3.根据权利要求2所述的一种制备11α,17α-羟基黄体酮的方法，其特征在于：在菌体萃取结束后，将菌体重悬于水中，利用磁性分离器回收四氧化三铁。
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