CN115197307A

CN115197307A - 调控植物抗逆性的蛋白IbGER5及其编码基因与用途

Info

Publication number: CN115197307A
Application number: CN202210581770.4A
Authority: CN
Inventors: 何绍贞; 张欢; 刘庆昌; 翟红; 高少培; 赵宁; 王祯
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2022-05-26
Filing date: 2022-05-26
Publication date: 2022-10-18
Anticipated expiration: 2042-05-26
Also published as: CN115197307B

Abstract

本发明公开了调控植物抗逆性的蛋白IbGER5及其编码基因与用途。具体地公开了氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质、相关生物材料，及其在调控植物耐盐性和/或抗旱性中的应用。本发明通过将来源于甘薯的IbGER5基因导入到受体对照栗子香中，得到了过表达和干扰表达IbGER5基因的转基因甘薯植株，实验表明，在逆境胁迫(如盐胁迫和/或干旱胁迫)条件下，过表达IbGER5基因的转基因甘薯植株的耐盐抗旱性显著降低，干扰表达IbGER5基因(RNAi)的转基因甘薯植株的耐盐抗旱性显著提高，表明本发明所提供的IbGER5蛋白及其编码基因具有调控植物耐盐性和/或抗旱性的功能，可广泛应用于甘薯抗逆转基因育种。

Description

调控植物抗逆性的蛋白IbGER5及其编码基因与用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及调控植物抗逆性的蛋白IbGER5及其编码基因与用途。

背景技术

甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)是一种重要的粮食、饲料及工业燃料作物，兼具保健作用和药用价值，在我国各地广泛种植。随着耕地面积的不断减少，甘薯主要种植在干旱或盐渍化等边际土地，而我国盐碱化土地的含盐量在0.6-10％，干旱地区范围广，耕地的盐渍化和水资源缺乏严重影响了作物的正常生长，给甘薯生产的进一步发展也带来极大的困难。因此，培育耐盐抗旱性强的优质甘薯新品种，成为促进甘薯产业发展的重要措施之一。

虽然常规甘薯育种技术在品种改良中发挥了重要作用，但由于甘薯具有自交不亲和、杂交后代不稳定，种质资源匮乏，育种周期长等问题，传统的杂交育种方法较难选育出耐盐抗旱性强的甘薯新品种，而运用基因工程手段可克服常规育种中存在的物种隔离和基因连锁等妨碍，能够从分子水平上定向改良甘薯性状，是目前培育优质甘薯品种的一种可行途径，对甘薯品种选育和生产具有潜在的推动意义。挖掘重要的耐盐抗旱遗传资源，对于培育耐盐抗旱植物新品种起着关键的作用，耐盐抗旱植物的开发和利用具有无法估量的生态效益、经济效益和社会效益。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控植物(如甘薯)的抗逆性。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质的应用，所述应用可为下述任一种：

D1)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在调控植物抗逆性中的应用；

D2)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备调控植物抗逆性的产品中的应用；

D3)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在培育抗逆植物中的应用；

D4)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备培育抗逆植物的产品中的应用；

D5)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在植物育种中的应用；

所述蛋白质名称为IbGER5，可为下述任一种：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。

所述标签蛋白包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His6标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质IbGER5的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质IbGER5的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质IbGER5且具有蛋白质IbGER5功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

本文中，调控所述蛋白质活性和/或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质IbGER5。

上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

所述调控基因表达的物质具体可为下述B1)-B3)中任一所述的生物材料。

进一步地，所述调控基因表达的物质可为提高或上调所述蛋白质IbGER5的编码基因表达的物质(包括核酸分子或载体)。

进一步地，所述调控基因表达的物质还可为抑制或降低或下调所述蛋白质IbGER5的编码基因表达的物质(包括核酸分子或载体)。

上述应用中，所述蛋白质IbGER5可来源于甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)。

进一步地，所述蛋白质IbGER5可为调控植物抗逆性的蛋白IbGER5。

进一步地，所述蛋白质IbGER5可为调控植物耐盐抗旱性的蛋白IbGER5。

本发明还提供了与所述蛋白质IbGER5相关的生物材料的应用，所述应用可为下述任一种：

E1)与所述蛋白质IbGER5相关的生物材料在调控植物抗逆性中的应用；

E2)与所述蛋白质IbGER5相关的生物材料在制备调控植物抗逆性的产品中的应用；

E3)与所述蛋白质IbGER5相关的生物材料在培育抗逆植物中的应用；

E4)与所述蛋白质IbGER5相关的生物材料在制备培育抗逆植物的产品中的应用；

E5)与所述蛋白质IbGER5相关的生物材料在植物育种中的应用；

所述生物材料可为下述B1)至B8)中的任一种：

B1)编码权利要求1或2中所述蛋白质的核酸分子；

B2)抑制或降低权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因表达的核酸分子；

B3)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的表达盒；

B4)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的重组载体、或含有B3)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的重组微生物、或含有B3)所述表达盒的重组微生物、或含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B6)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B3)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系；

B7)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B3)所述表达盒的转基因植物组织；

B8)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B3)所述表达盒的转基因植物器官。

上述应用中，所述核酸分子可为下述任一种：

C1)编码序列是SEQ ID No.2或SEQ ID No.2的第1-204位所示的DNA分子；

C2)核苷酸序列是SEQ ID No.2或SEQ ID No.2的第1-204位所示的DNA分子。

SEQ ID No.2所示的DNA分子(IbGER5基因)编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质IbGER5。

SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为蛋白质IbGER5编码基因(CDS)的核苷酸序列。

B1)所述核酸分子还可包括在SEQ ID No.2所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子。

B1)所述核酸分子还包括与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列一致性为95％以上且来源相同种属的核酸分子。

本发明所述的蛋白质IbGER5的基因(IbGER5基因)可以为任意能够编码蛋白质IbGER5的核苷酸序列。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

所述表达盒包括启动子、编码所述蛋白IbGER5的核酸分子和终止子，所述启动子可为CaMV35S启动子、NOS启动子或OCS启动子，所述终止子可为NOS终止子或OCS polyA终止子。

本文所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如gRNA、mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。

本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒或病毒载体。具体可为pMD19-T载体和/或pCAMBIA1300载体和/或pFGC5941载体。

可用现有的植物表达载体构建含有IbGER5基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括但不限于如双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如包括但不限于农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮藏蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用IbGER5基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，包括但不限于如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入包括但不限于可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的IbGER5基因或基因的片段导入植物细胞或受体植物，可获得抗逆性改变的转基因植株。携带IbGER5基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏菌(Erwinia)，根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)，产碱菌属(Alcaligenes)，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽孢杆菌属(Bacillus)等。具体可为大肠杆菌DH5α和/或根癌农杆菌EHA105。

所述重组载体具体可为重组载体pCAMBIA1300-GFP-IbGER5和/或pFGC5941-IbGER5。

所述重组载体pCAMBIA1300-GFP-IbGER5是将pCAMBIA1300-GFP载体的KpnI和SalI识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA片段，保持pCAMBIA1300-GFP载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。重组载体pCAMBIA1300-GFP-IbGER5表达序列表中SEQ ID No.1所示的蛋白质IbGER5。重组载体pCAMBIA1300-GFP-IbGER5具有一个表达盒，表达盒的核苷酸序列中有CaMV35S启动子、IbGER5蛋白的编码基因(SEQ ID No.2)和绿色荧光蛋白(GFP)的编码基因。

其中pCAMBIA1300-GFP载体是以pCAMBIA1300为基础载体，在pCAMBIA1300载体的EcoRI和SacI识别位点之间插入了CaMV 35S片段，在pCAMBIA1300载体的SalI和PstI识别位点之间插入了GFP片段构建而成。

所述重组载体pFGC5941-IbGER5是将pFGC5941载体的XhoI和SwaI识别序列间的小片段替换为序列表中SEQ ID No.2自5’末端起第1至204位所示的DNA分子片段，将限制性内切酶BamHI和XbaI识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2自5’末端起第1至204位所示的DNA分子的反向互补序列，保持pFGC5941载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。重组载体pFGC5941-IbGER5干扰表达序列表中SEQ ID No.1所示的蛋白质IbGER5。重组载体pFGC5941-IbGER5具有一个表达盒，表达盒的核苷酸序列中有CaMV35S启动子、IbGER5蛋白的编码基因片段和OCS polyA终止子。所述重组微生物可通过将所述重组载体导入出发微生物得到。

所述重组微生物具体可为重组农杆菌EHA105/pCAMBIA1300-GFP-IbGER5和/或EHA105/pFGC5941-IbGER5。

所述重组农杆菌EHA105/pCAMBIA1300-GFP-IbGER5是将所述重组载体pCAMBIA1300-GFP-IbGER5导入根癌农杆菌EHA105得到的重组菌。

所述重组农杆菌EHA105/pFGC5941-IbGER5是将所述重组载体pFGC5941-IbGER5导入根癌农杆菌EHA105得到的重组菌。

本发明还提供了一种培育转基因植物的方法，所述方法包括提高和/或降低目的植物中所述蛋白质IbGER5的含量和/或活性，得到所述转基因植物。

上述方法中，所述提高目的植物中所述蛋白质IbGER5的含量和/或活性可通过提高目的植物中所述蛋白质IbGER5的编码基因的表达量实现。

上述方法中，所述提高目的植物中所述蛋白质IbGER5的编码基因的表达量可通过将所述蛋白质IbGER5的编码基因导入所述目的植物实现。

上述方法中，所述降低目的植物中所述蛋白质IbGER5的含量和/或活性通过降低目的植物中所述蛋白质IbGER5的编码基因的表达量实现。

上述方法中，所述降低目的植物中所述蛋白质IbGER5的编码基因的表达量可为利用基因突变、基因敲除、基因编辑或基因敲减技术使目的植物基因组中所述蛋白质IbGER5的编码基因活性下降或失活。

进一步地，所述利用基因敲除技术使目的植物基因组中所述蛋白质IbGER5的编码基因活性下降或失活可为利用RNA干扰载体进行，所述RNA干扰载体含有核苷酸序列是SEQID No.2的第1-204位所示的DNA分子。

上述方法中，所述转基因植物可为抗逆性改变的植物，进一步地，所述抗逆性改变的植物可为抗逆性(如耐盐性和/或抗旱性)降低(下调)和/或提高(上调)的转基因植物。

所述抗逆性降低的转基因植物是抗逆性低于所述目的植物的转基因植物。

所述抗逆性提高的转基因植物是抗逆性高于所述目的植物的转基因植物(抗逆植物)。

上述方法中，所述蛋白质IbGER5的编码基因可为下述任一种：

F1)编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子；

F2)核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子；

F3)编码序列是SEQ ID No.2自5’末端起第1至204位所示的DNA分子；

F4)核苷酸序列是SEQ ID No.2自5’端起第1至204位所示的DNA分子。

具体地，在本发明的一个实施方案中，所述提高目的植物中所述蛋白质IbGER5的编码基因的表达量通过将SEQ ID No.2所示的DNA分子导入所述目的植物实现。

具体地，在本发明的一个实施方案中，所述降低目的植物中所述蛋白质IbGER5的编码基因的表达量通过将SEQ ID No.2所示的自5’末端起第1至204位的DNA分子和反向互补序列的DNA分子导入所述目的植物实现。

在本发明的一个实施方案中，所述培育转基因植物的方法包括如下步骤：

(1)构建包含SEQ ID NO.2所示DNA分子的重组载体；

(2)将步骤(1)构建的重组载体导入目的植物(如作物或甘薯)中；

(3)经筛选和鉴定获得所述转基因植物。

所述导入指通过重组手段，包括但不限于农杆菌(Agrobacterium)介导的转化，生物射弹(biolistic)方法，电穿孔，in planta技术，等等导入。

在本发明的一个实施方案中，所述培育转基因植物(抗逆植物，如抗旱植物和/或耐盐植物)的方法包括如下步骤：

(1)构建抑制靶基因IbGER5基因表达的RNA干扰载体pFGC5941-IbGER5；

(2)将步骤(1)构建的RNA干扰载体pFGC5941-IbGER5导入目的植物(如作物或甘薯)中；

(3)经筛选和鉴定获得抗逆性高于所述目的植物的抗逆植物。

上述方法中，所述植物可为下述任一种：

G1)单子叶植物或双子叶植物；

G2)旋花科植物；

G3)甘薯属植物；

G4)甘薯组植物；

G5)甘薯。

所述甘薯具体可为甘薯品种栗子香。

所述蛋白质IbGER5，和/或，所述生物材料也在本发明的保护范围内。

本文中，所述抗逆性可为耐盐性和/或抗旱性。

本文中，所述植物可为作物(如农作物)。

本发明还提供了所述培育转基因植物的方法在创制抗逆性改变的植物中的应用，和/或，在植物育种或植物种质资源改良中的应用。

所述抗逆性改变的植物可为抗逆性提高或降低的植物，如抗旱植物、耐盐植物等但不限于此。

本文所述调控植物抗逆性可为上调(增加)或下调(降低)植物抗逆性。

进一步地，所述调控植物抗逆性可为上调(增加)或下调(降低)甘薯的耐盐性和/或抗旱性。

本文中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述IbGER5基因转化目的植物或将所述IbGER5基因敲除得到的第一代转基因植物，也包括其子代。可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

本发明通过将来源于甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)的调控植物抗逆性的IbGER5基因导入到受体植物甘薯品种栗子香中，得到了过表达IbGER5基因的转基因甘薯植株，将转基因植株进行耐盐抗旱性鉴定，综合各项生理生化指标测定结果表明，与未转基因的对照甘薯品种栗子香(WT)相比，过表达IbGER5基因的转基因甘薯植株在盐胁迫和/或干旱胁迫条件下，无论是离体鉴定、水培鉴定还是土壤栽培鉴定结果均显著降低了甘薯的抗逆性，即过表达IbGER5基因的转基因甘薯植株的耐盐抗旱性显著降低。

本发明通过将来源于甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)的调控植物抗逆性的IbGER5基因片段导入到受体植物甘薯品种栗子香中，得到了干扰IbGER5基因表达的转基因甘薯植株，将转基因植株进行耐盐抗旱性鉴定，综合各项生理生化指标测定结果表明，与未转基因的对照甘薯品种栗子香(WT)相比，干扰表达IbGER5基因的转基因甘薯植株在盐胁迫和/或干旱胁迫条件下，离体鉴定提高了甘薯的抗逆性，即干扰表达IbGER5基因的转基因甘薯植株的耐盐抗旱性提高。

综上，本发明的IbGER5蛋白及其编码基因IbGER5可以调控植物的抗逆性(如耐盐性和/或抗旱性)，可通过降低目的植物中IbGER5蛋白质的含量和/或活性(如抑制IbGER5基因表达)来培育耐盐和/或抗旱的植物。本发明所提供的IbGER5蛋白及其编码基因在调控甘薯耐盐抗旱性中具有重要的理论意义和应用价值。

附图说明

图1为转基因植株的PCR检测电泳图。其中，泳道M为Maker条带，泳道W为阴性对照(水)的条带；泳道P为阳性对照(重组质粒pCAMBIA1300-GFP-IbGER5(图1中A)或pFGC5941-IbGER5(图1中B))的条带；泳道WT为对照甘薯栗子香植株的条带；泳道OE-G1、OE-G2、OE-G4、OE-G34、OE-G53为转化pCAMBIA1300-GFP-IbGER5的甘薯拟转基因植株的条带；泳道Ri-G6、Ri-G7为转化pFGC5941-IbGER5甘薯拟转基因植株的条带。

图2为离体培养下转基因植株的耐盐抗旱性鉴定结果图。

图3为水培条件下转基因植株的耐盐抗旱性鉴定结果图。

图4为土壤栽培条件下转基因植株的抗旱性鉴定结果图。

图5为盐胁迫和干旱胁迫处理后转基因植株的生理生化指标测定结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的甘薯品系栗子香和ND98记载于如下文献中：张欢.甘薯耐盐转录组分析及抗逆相关基因IbBBX24和IbCPK28的克隆与功能验证.中国农业大学博士学位论文，2017。公众可从中国农业大学甘薯遗传育种研究室获得，以重复本实验。

下述实施例中的pMD19-T载体为宝生物工程(大连)公司产品，产品目录号为6013。pCAMBIA1300载体为上海联迈生物工程有限公司产品，产品目录号为LM1375。pFGC5941载体为北京华越洋生物科技有限公司产品，产品目录号为VECT0360。

下述实施例中EcoRI酶为赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品，产品目录号为FD0274。SacI酶为赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品，产品目录号为FD1133。KpnI酶为赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品，产品目录号为FD0524。SalI酶为赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品，产品目录号为FD0644。PstI酶为赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品，产品目录号为FD0614。XhoI酶为赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品，产品目录号为FD0694。SwaI酶为赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品，产品目录号为FD1244。BamHI酶为赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品，产品目录号为FD0054。XbaI酶为赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品，产品目录号为FD0684。大肠杆菌DH5α为深圳康体生命科技有限公司产品，产品目录号为KTSM101L，根癌农杆菌EHA105为北京擎科生物科技有限公司产品，产品目录号为TSC-A03。

下述实施例采用SPSS统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用T检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异，采用单因素方差分析，不同字母表示差异有统计学意义。

下述实施例中的定量试验，如无特别说明，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、蛋白质IbGER5在调控甘薯抗逆性中的应用

本申请的发明人，从甘薯品系ND98中分离克隆出一个甘薯基因，将其命名为IbGER5。基因IbGER5的编码序列(CDS)的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；基因IbGER5编码氨基酸序列是SEQ ID NO.1的蛋白质IbGER5，SEQ ID NO.1由283个氨基酸残基组成。

1、植物表达载体的构建

A、重组载体pCAMBIA1300-GFP-IbGER5的构建

根据甘薯IbGER5蛋白核苷酸的编码序列(SEQ ID NO.2)，设计扩增出完整编码序列的引物序列，正反向引物分别引入KpnI和SalI酶切位点，引物序列如下：

IbGER5-OE-KpnI：

5’-TACGAATTCGAGCTCGGTACCATGGAGCCAAAAGGAGAAGAAT-3’(下划线部分为KpnI酶切位点)，

IbGER5-OE-SalI：

5’-CTTGCATGCCTGCAGGTCGACGTTAGCAGTAGCAGGTTGTGACA-3’(下划线部分为SalI酶切位点)。

以人工合成的序列表中SEQ ID NO.2所示的双链DNA分子为模板，以IbGER5-OE-KpnI和IbGER5-OE-SalI为引物进行PCR扩增后，将产物连接到pMD19-T载体上，得到重组载体，命名为pMD-IbGER5，进行M13-F/R(5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’/5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’)的测序，保证甘薯IbGER5蛋白核苷酸的阅读框及酶切位点的正确。

用限制性内切酶EcoRI和SacI双酶切植物表达载体pCAMBIA1300，回收约8948bp大小的片段，设计引物(5’-CGAGCTCTCTCTATCTAAACATCTCTCTCTGACC-3’和5’-CGGAATTCGCTGTGAGAGCAGATGAGGTTC-3’)从载体pCAMBIA1300上克隆携带EcoRI和SacI酶切位点的770bp大小CaMV 35S片段，回收片段后将两个片段连接，获得重组质粒pCAMBIA1300-1。

用限制性内切酶SalI和PstI双酶切重组质粒pCAMBIA1300-1，回收约9708bp大小的片段，设计引物(5’-GCGTCGACATGGTGAGCAAGGGCGAG-3’和5’-AACTGCAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’)克隆携带SalI和PstI酶切位点的720bp大小GFP片段，回收片段后将两个片段连接，获得重组质粒pCAMBIA1300-GFP。

将pCAMBIA1300-GFP重组载体经过KpnI和SalI双酶切，回收载体大片段，用限制性内切酶KpnI和SalI双酶切重组载体pMD-IbGER5，回收约852bp的DNA小片段，将回收的载体大片段与DNA小片段连接，得到重组载体pCAMBIA1300-GFP-IbGER5，即目的质粒。将目的质粒转化大肠杆菌DH5α，37℃培养20h，进行重组载体pCAMBIA1300-GFP-IbGER5的PCR分析和酶切鉴定，并进行测序验证。测序结果表明，在载体pCAMBIA1300-GFP的KpnI和SalI酶切位点间插入了序列表中SEQ ID No.2所示的序列，说明重组载体构建正确。

重组载体pCAMBIA1300-GFP-IbGER5是将pCAMBIA1300-GFP载体的KpnI和SalI识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA片段，保持pCAMBIA1300-GFP载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。重组载体pCAMBIA1300-GFP-IbGER5表达序列表中SEQ ID No.1所示的蛋白质IbGER5。

重组载体pCAMBIA1300-GFP-IbGER5具有一个表达盒，表达盒的核苷酸序列中有CaMV35S启动子、IbGER5蛋白的编码基因(SEQ ID No.2)和绿色荧光蛋白(GFP)的编码基因。

B、重组载体pFGC5941-IbGER5的构建

以人工合成的序列表中SEQ ID NO.2所示的双链DNA分子为模板，以IbGER5-Ri-UF(XhoI)：5’-TTTGGAGAGGACACGCTCGAGATGGAGCCAAAAGGAGAAG AATCA-3’(下划线为限制性内切酶XhoI的识别序列)和IbGER5-Ri-UR(SwaI)：5’-AAGAAATTCTTACACATTTAAATAGGTTGAGGGTGGAAATCTTGG-3’(下划线为限制性内切酶SwaI的识别序列)为引物进行PCR扩增后，回收约200bp的小片段，用限制性内切酶XhoI和SwaI双酶切植物表达载体pFGC5941，回收约10kb的载体大片段，将回收的载体大片段与DNA小片段连接，得到重组载体pFGC5941-IbGER5-U1。

以人工合成的序列表中SEQ ID NO.2所示的双链DNA分子为模板，以IbGER5-Ri-DF(BamHI)：5’-AATTTGCAGGTATTTGGATCCAGGTTGAGGGTGGAAATCTTGG-3’(下划线为限制性内切酶BamHI的识别序列)和IbGER5-Ri-DR(XbaI)：5’-GGTCTTAATTAACTCTCTAGAATGGAGCCAAAAGGAGAAGAATCA-3’(下划线为限制性内切酶XbaI的识别序列)为引物进行PCR扩增后，回收约200bp的小片段，用限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切植物表达载体pFGC5941-IbGER5-U1，回收约10kb的载体大片段，将回收的载体大片段与DNA小片段连接，得到重组载体pFGC5941-IbGER5，即目的质粒。测序结果表明，在载体pFGC5941的XhoI和SwaI酶切位点间插入了序列表中SEQ ID No.2所示的序列自5’末端起第1至204位所示的DNA分子，BamHI和XbaI酶切位点间插入了序列表中SEQ ID No.2所示的序列自5’末端起第1至204位所示的DNA分子反向互补序列。

重组载体pFGC5941-IbGER5是将pFGC5941载体的XhoI和SwaI识别序列间的小片段替换为序列表中SEQ ID No.2自5’末端起第1至204位所示的DNA分子片段，将限制性内切酶BamHI和XbaI识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2自5’末端起第1至204位所示的DNA分子的反向互补序列，保持pFGC5941载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。重组表达载体pFGC5941-IbGER5干扰表达序列表中SEQ ID No.1所示的蛋白质IbGER5。

重组载体pFGC5941-IbGER5具有一个表达盒，表达盒的核苷酸序列中有CaMV35S启动子、IbGER5蛋白的编码基因片段和OCS polyA终止子。

2、植物表达载体转化农杆菌

(1)于冰上融化制备的农杆菌EHA105感受态细胞，加入2μg提取的pCAMBI A1300-GFP-IbGER5或pFGC5941-IbGER5质粒，轻弹管壁混匀，冰浴10min；

(2)液氮速冻5min，37℃水浴10min，冰浴5min；

(3)加入600μL液体LB培养基，28℃，200rpm培养5h；

(4)将200μL菌液涂布于含100ug/mL卡那霉素及100ug/mL利福平的LB固体培养基上；

(5)28℃倒置暗培养2天，取适量农杆菌用液体LB培养基培养备用，即得到导入pCAMBIA1300-GFP-IbGER5或pFGC5941-IbGER5载体的农杆菌菌液，将重组农杆菌命名为EHA105/pCAMBIA1300-GFP-IbGER5或EHA105/pFGC5941-IbGER5。

3、甘薯的遗传转化及再生

A、甘薯过表达转基因阳性植株的转化及再生

用农杆菌介导的方法将EHA105/pCAMBIA1300-GFP-IbGER5导入到甘薯品种栗子香中。具体方法如下：

(1)剥取甘薯品种栗子香的茎尖分生组织，置于含2.0mg/L 2，4-D的MS固体培养基上，27±1℃培养8周，获得胚性愈伤组织；

(2)将胚性愈伤组织放入含2.0mg/L 2，4-D的MS液体培养基中，置于摇床上水平振荡培养8周，获得直径为0.7-1.3mm的胚性细胞团；

(3)将胚性细胞团经过20目网筛筛选，较大的细胞团转移至30目网筛，轻轻研磨，使胚性细胞团出现创口，将研磨后的较大胚性细胞团振荡培养3天；

(4)采用农杆菌介导的方法将EHA105/pCAMBIA1300-GFP-IbGER5转化胚性细胞团，然后置于共培养基(含30mg/L AS、2.0mg/L 2，4-D的MS固体培养基)上，28℃暗培养3天；

(5)将胚性细胞团用含400mg/L头孢噻肟钠(cefotaxime sodium，CS)和2.0mg/L2，4-D的MS液体培养基中洗涤一次，然后在含有2.0mg/L 2，4-D的MS液体培养基中振荡培养1周；

(6)将胚性细胞团置于筛选培养基(含100mg/L CS、5mg/L潮霉素(Hyg)、2，4-D的MS固体培养基)上，28℃暗培养10-12周，其中每两周更换一次培养基；

(7)将胚性细胞团置于体细胞胚诱导培养基(含100mg/L CS、1.0mg/L ABA的MS固体培养基)上，28℃光暗交替培养2-4周，获得抗性愈伤组织；

(8)将抗性愈伤组织置于MS固体培养基上，28℃光暗交替培养4-8周，即可获得5株待鉴定过表达转基因植株(即拟过表达转基因植株)，分别命名为OE-G1、OE-G2、OE-G4、OE-G34、OE-G53。

(9)用CTAB法提取拟过表达转基因植株(OE-G1、OE-G2、OE-G4、OE-G34、OE-G53)叶片的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，水和对照栗子香植株为阴性对照，质粒pCAMBIA1300-GFP-IbGER5为阳性对照，以35S-F和IbGER5-R为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；如果PCR扩增产物中含有约1090bp的条带，则相应的甘薯待鉴定转基因植株即为甘薯过表达转基因阳性植株。引物35S-F和IbGER5-R序列如下所示：

35S-F：5’-TGACGCACAATCCCACTATCCT-3’

IbGER5-R：5’-GTTAGCAGTAGCAGGTTGTGACA-3’

电泳检测扩增结果见图1中A(图1中A，泳道M显示为Maker条带，泳道W显示为阴性对照(水)的条带；泳道P显示为阳性对照(重组质粒pCAMBIA1300-GFP-IbGER5)的条带；泳道WT显示为甘薯栗子香植株的条带；泳道OE-G1、OE-G2、OE-G4、OE-G34、OE-G53显示为转化pCAMBIA1300-GFP-IbGER5的甘薯拟过表达转基因植株的条带，从图1中A可见，泳道OE-G1、OE-G2、OE-G4、OE-G34、OE-G53和阳性对照均扩增出852bp的目标条带，表明IbGER5基因已经整合到甘薯栗子香的基因组中，并证明这些再生植株为过表达转基因植株。将经鉴定为过表达转基因的甘薯植株采用无性繁殖的方法扩繁(由一株转基因幼苗扩繁得到的植株作为一个株系)，进行耐盐抗旱的抗性鉴定。

B、甘薯RNAi阳性植株的转化及再生

用农杆菌介导的方法将EHA105/pFGC5941-IbGER5导入到甘薯品种栗子香中。

(1)按照A中步骤(1)至(8)的方法，将EHA105/pCAMBIA1300-GFP-IbGER5替换为EHA105/pFGC5941-IbGER5，筛选培养基替换为含100mg/L CS、0.3mg/L除草剂(PPT)、2，4-D的MS固体培养基，其它步骤均不变，获得2株甘薯待鉴定干扰转基因植株(即拟RNAi植株)，依次命名Ri-G6、Ri-G7。

(2)提取拟RNAi植株(Ri-G6、Ri-G7)叶片基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，水和对照栗子香植株为阴性对照，质粒pFGC5941-IbGER5为阳性对照，以int-F(5’-CAACCACAAAAGTATCTATGAGCCT-3’)和int-R(5’-TTCACATGTCAGAAACATTCTGATG-3’)为引物进行PCR扩增得到PCR扩增产物；如果PCR扩增产物中含有约888bp的条带，则相应的甘薯待鉴定转基因植株即为甘薯RNAi阳性植株。

电泳检测扩增结果见图1中B(图1中B，泳道M显示为Maker条带，泳道W显示为阴性对照(水)的条带；泳道P显示为阳性对照(重组质粒pFGC5941-IbGER5)的条带；泳道WT显示为甘薯栗子香植株的条带；泳道Ri-G6、Ri-G7显示为转化pFGC5941-IbGER5的甘薯拟RNAi植株的条带，从图1中B可见，泳道Ri-G6、Ri-G7和阳性对照均扩增出888bp的目标条带，表明pFGC5941-IbGER5载体已经转入到甘薯栗子香的基因组中，并证明这些再生植株为RNAi植株。将经鉴定为RNAi的甘薯植株采用无性繁殖的方法扩繁(由一株转基因幼苗扩繁得到的植株作为一个株系)，进行耐盐抗旱的抗性鉴定。

4、转基因植株的耐盐性鉴定

受试植株：甘薯品种栗子香作对照植株(WT)；株系号分别为OE-G1、OE-G2、OE-G4、OE-G34、OE-G53、Ri-G6、Ri-G7的植株，每个株系3个植株。

将IbGER5转基因株系(株系号为OE-G1、OE-G2、OE-G4、OE-G34、OE-G53、Ri-G6、Ri-G7)植株和栗子香对照植株(WT)分别在正常MS培养基及含150mM NaCl的MS培养基上胁迫培养4周后，观察植株的生长状况，并对植株的根长进行测量，结果见图2中A、B、D和E(图2中A为正常生长条件下甘薯植株生长状况、图2中B为盐胁迫下甘薯植株生长状况，图2中D为正常生长条件下甘薯植株根长统计结果，图2中E为盐胁迫下甘薯植株根长统计结果)。可以发现，盐胁迫处理(150mM NaCl)后，过表达转基因植株(OE-G1、OE-G2、OE-G4、OE-G34、OE-G53)的根长明显低于对照栗子香(WT)，而RNAi植株(Ri-G6、Ri-G7)的根长高于对照栗子香(WT)，离体鉴定结果表明过表达转基因植株的耐盐性显著降低，RNAi植株的耐盐性提高，IbGER5基因或蛋白质IbGER5可以调控植物的耐盐性。

进一步验证在水培条件下过表达IbGER5基因能否提高转基因甘薯的耐盐性。从隔离大田取回过表达IbGER5基因的转基因株系(株系号为OE-G1、OE-G2、OE-G4、OE-G34、OE-G53)的植株和对照栗子香植株(WT)的茎段，每段剪切成25cm，保证一个茎节分别置入正常霍格兰溶液及含150mM NaCl的霍格兰溶液中，胁迫处理4周，每7天更换一次培养基，观察植株的生长状况，测量植株的根长结果见图3中A、B、D和E(图3中A、B中左图为甘薯植株在霍格兰溶液中生长状况，右图为从溶液中取出洗净后的甘薯植株，图3中A为正常生长条件下甘薯植株生长状况、图3中B为盐胁迫下甘薯植株生长状况，图3中D为正常生长条件下甘薯植株根长统计结果，图3中E为盐胁迫下甘薯植株根长统计结果)。可以发现，盐胁迫处理(150mM NaCl)后，过表达转基因植株的根长明显短于对照栗子香(WT)，水培鉴定结果表明过表达转基因植株的耐盐性显著降低，过表达IbGER5基因可显著降低植物的耐盐性，IbGER5基因或蛋白质IbGER5具有调控植物的耐盐性的功能。

5、转基因植株的抗旱性鉴定

将IbGER5转基因株系(株系号为OE-G1、OE-G2、OE-G4、OE-G34、OE-G53、Ri-G6、Ri-G7)的植株和对照栗子香植株(WT)在含20％PEG6000的模拟干旱胁迫的MS培养基上胁迫培养4周后，观察植株的生长状况，并对植株的根长进行测量，结果见图2中C和图2中F(图2中C为干旱胁迫下甘薯植株生长状况，图2中F为干旱胁迫下甘薯植株根长统计结果)。可以发现，干旱胁迫处理(20％PEG6000)后，过表达转基因植株的根长明显低于对照栗子香(WT)，生长状态明显比对照植株变差，而RNAi植株(Ri-G6、Ri-G7)的根长高于对照栗子香(WT)，生长状态良好，离体鉴定结果表明过表达转基因植株的抗旱性显著降低，RNAi植株的抗旱性提高，过表达IbGER5基因可显著降低植物的抗旱性，干扰IbGER5基因表达可提高植物的抗旱性，IbGER5基因或蛋白质IbGER5可以调控植物的抗旱性。

进一步验证在水培条件下过表达IbGER5基因能否提高转基因甘薯的抗旱性。从隔离大田取回过表达IbGER5基因的转基因株系(株系号为OE-G1、OE-G2、OE-G4、OE-G34、OE-G53)的植株和对照栗子香植株(WT)的茎段，每段剪切成25cm，保证一个茎节置入含20％PEG6000的霍格兰溶液中，模拟干旱胁迫处理2周后复水培养2周，每7天更换一次培养基，观察植株的生长状况，测量植株的根长，结果见图3中C和图3中F(图3中C中左图为甘薯植株在干旱胁迫下的生长状况，右图为从溶液中取出洗净后的甘薯植株，图3中F为干旱胁迫下甘薯植株根长统计结果)。可以发现，干旱胁迫处理(20％PEG6000)后，转基因植株的根长明显短于对照栗子香(WT)，生长状态明显比对照植株变差，表现为比对照更严重的萎蔫，水培鉴定结果表明转基因植株的抗旱性显著降低，过表达IbGER5基因可显著降低植物的抗旱性，IbGER5基因或蛋白质IbGER5具有调控植物的抗旱性的功能。

进一步验证在土壤栽培条件下过表达IbGER5基因能否提高转基因甘薯的抗旱性。从隔离大田取回过表达IbGER5基因的转基因株系(株系号为OE-G1、OE-G2、OE-G4)的植株和对照栗子香植株(WT)的茎段，每段剪切成20cm，保证一个茎节插入土中，浇水2周至茎段正常生长后进行干旱处理(即连续8周不浇水)，8周后观察植株的生长状态，测量植株根长及根数，结果见图4(图4中A为甘薯植株在旱池中生长状况，图4中B为从土中取出后的甘薯植株，图4中C为统计的甘薯植株表型指标)。可以发现，干旱胁迫处理后，转基因植株的根长明显短于对照栗子香(WT)，根数较少，生长状态明显比对照植株变差，表现为比对照更严重的萎蔫，旱池结果表明转基因植株的抗旱性显著降低，过表达IbGER5基因可显著降低植物的抗旱性，IbGER5基因或蛋白质IbGER5具有调控植物的抗旱性的功能。

6、生理生化指标的测定

受试植株：甘薯品种栗子香作对照植株(WT)；株系号分别为OE-G1、OE-G2、OE-G4、Ri-G6、Ri-G7的植株，每个株系3个植株。

(1)H₂O₂含量测定

H₂O₂是植物体内最常见的活性氧分子，可以直接或间接地氧化细胞内核酸、蛋白质等生物大分子，使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。因此，H₂O₂含量越高，植物受逆境伤害的程度就越大。

参考文献(Zhang H，Gao X，Zhi Y，et al.A non-tandem CCCH-type zinc-fingerprotein，IbC3H18，functions as a nuclear transcriptional activator and enhancesabiotic stress tolerance in sweet potato[J].New Phytologist，2019，223:1918-1936)的DAB和NBT染色法，对甘薯叶片分别进行DAB、NBT染色。利用苏州科铭生物技术有限公司的过氧化氢含量(H₂O₂)试剂盒检测甘薯植株中的H₂O₂含量。染色甘薯叶片为耐盐抗旱离体处理10天的材料，含量测定植株为耐盐抗旱离体鉴定处理4周后的植株。实验重复3次，结果取平均值。

结果见图5中A、B、C、D和E(图5中A为DAB染色结果，图5中B为利用imageJ软件统计的DAB染色斑点的相对强度，以正常MS培养基中对照栗子香植株的斑点强度作为100％，图5中C为NBT染色结果，图5中D为利用imageJ软件统计的NBT染色斑点的相对强度，以正常MS培养基中对照栗子香植株的斑点强度作为100％，图5中E为H₂O₂含量统计结果)。可以发现，在150mM NaCl的盐胁迫处理和20％PEG6000模拟干旱胁迫处理后，过表达IbGER5基因的转基因植株(株系号为OE-G1，OE-G2，OE-G4)的H₂O₂含量显著高于对照栗子香植株，而RNAi植株(株系号为Ri-G6、Ri-G7)的H₂O₂含量显著低于对照栗子香植株。

(2)丙二醛(MDA)含量测定

植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往氧自由基会作用于脂质的不饱和脂肪酸，生成过氧化脂质，而MDA是过氧化脂质的最终分解产物，其含量可反映植物遭受逆境伤害的程度。因此，MDA含量越高，植物遭受逆境上海的程度越大。

利用苏州科铭生物技术有限公司的丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量试剂盒检测甘薯植株中的MDA含量。甘薯植株为耐盐抗旱离体鉴定处理4周后的植株。实验重复3次，结果取平均值。

结果见图5中F。可以发现，在150mM NaCl的盐胁迫处理和20％PEG6000模拟干旱胁迫处理后，过表达IbGER5基因的转基因植株(株系号为OE-G1，OE-G2，OE-G4)的MDA含量显著高于对照栗子香植株，而RNAi植株(株系号为Ri-G6、Ri-G7)的MDA含量显著低于对照栗子香植株。

(3)脯氨酸(Pro)含量测定

脯氨酸广泛存在于植物中，在逆境条件下，植物体内的脯氨酸含量显著增加，增加量在一定程度上反映了抗逆性。因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。

利用苏州科铭生物技术有限公司的脯氨酸(PRO)含量测定试剂盒检测甘薯植株中的脯氨酸含量。甘薯植株为耐盐抗旱离体鉴定处理4周后的植株。实验重复3次，结果取平均值。

结果见图5中G。可以发现，在150mM NaCl的盐胁迫处理和20％PEG6000模拟干旱胁迫处理后，过表达IbGER5基因的转基因植株(株系号为OE-G1，OE-G2，OE-G4)的脯氨酸含量显著低于对照栗子香植株，而RNAi植株(株系号为Ri-G6、Ri-G7)的脯氨酸含量显著高于对照栗子香植株。

(4)过氧化物酶(Peroxidase，POD)活性测定

POD(EC 1.11.1.7)广泛存在于植物中，可作为植物抗逆性的一项生化指标。POD的活性越低，植物遭受逆境伤害的程度越大。

利用苏州科铭生物技术有限公司的过氧化物酶(Peroxidase，POD)试剂盒检测甘薯植株中的POD含量。甘薯植株为耐盐抗旱离体鉴定处理4周后的植株。实验重复3次，结果取平均值。

结果见图5中H。可以发现，在150mM NaCl盐胁迫处理和20％PEG6000模拟干旱胁迫处理后，过表达IbGER5基因的转基因植株(株系号为OE-G1，OE-G2，OE-G4)的POD活性显著低于对照栗子香植株，而RNAi植株(株系号为Ri-G6、Ri-G7)的POD活性显著高于对照栗子香植株。

综上，在150mM NaCl的盐胁迫处理和20％PEG6000模拟干旱胁迫处理条件下，过表达IbGER5基因显著增加了H₂O₂和MDA含量、降低了脯氨酸(Pro)含量和POD活性，抗氧化酶类的活性降低，从而增加了盐胁迫和干旱胁迫对转基因植株造成的氧化损伤，大大降低了过表达转基因植株对逆境胁迫的耐受性，而干扰IbGER5基因表达显著降低了H₂O₂和MDA含量、增加了脯氨酸(Pro)含量和POD活性，抗氧化酶类的活性提高，从而降低了盐胁迫和干旱胁迫对转基因植株造成的氧化损伤，大大提高了RNAi植株对逆境胁迫的耐受性。

以上结果表明，在甘薯中过表达IbGER5基因会显著降低甘薯植株的耐盐抗旱性，干扰表达IbGER5基因会显著提高甘薯植株的耐盐抗旱性。本发明的IbGER5蛋白及其编码基因IbGER5可以调控植物的抗逆性(如耐盐性和/或抗旱性)，通过提高目的植物中IbGER5蛋白质的含量和/或活性(如过表达IbGER5基因)可以显著降低目的植物的抗逆性，通过降低目的植物中IbGER5蛋白质的含量和/或活性(如干扰表达IbGER5基因)可以显著提高目的植物的抗逆性。

实施例2、调控甘薯抗逆性的蛋白IbGER5及其编码基因的获得

实验材料：以甘薯品系ND98为实验材料。

1、甘薯总RNA提取：取1g甘薯品系ND98的幼嫩叶片在液氮中研磨成粉状，加入2mL离心管中，用TransZol法对甘薯总RNA进行提取，使用PrimeScript^TMRT reagent Kit withgDNA Eraser试剂盒(康为世纪生物科技(北京)有限公司产品)反转录出第一链cDNA。

2、在已发表的甘薯耐盐转录组中，获得序列表中SEQ ID No.3所示的EST序列，通过在Sweetpotato Garden库中查找进行比对，获得序列表中SEQ ID No.4所示的同源序列。根据同源比对获得的核苷酸序列(SEQ ID No.4)，设计并人工合成引物IbGER5-F和IbGER5-R，序列为：

IbGER5-F：5’-ATGGAGCCAAAAGGAGAAGAAT-3’

IbGER5-R：5’-GTTAGCAGTAGCAGGTTGTGACA-3’

3、以步骤1获得的cDNA为模板，以步骤2合成的IbGER5-F和IbGER5-R为引物，进行PCR扩增，获得约852bp的PCR扩增片段产物并测序。

结果表明，步骤3获得的PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示，将该序列所示的基因命名为IbGER5基因，其编码的蛋白命名为IbGER5蛋白或蛋白IbGER5，氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> 调控植物抗逆性的蛋白IbGER5及其编码基因与用途

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 283

<212> PRT

<213> 甘薯（Ipomoea batatas (L.) Lam.）

<400> 1

Met Glu Pro Lys Gly Glu Glu Ser Glu Pro His Lys Pro Leu Ser Ser

1 5 10 15

Ser Ser Ser Glu Ser Gln Ala Pro Ala Glu Met Asp Pro Gln Lys Trp

20 25 30

Gly Thr His Val Met Gly Arg Pro Ala Val Pro Thr Thr His Pro Asp

35 40 45

Asn Gln Lys Ala Ala Leu Trp Arg Ser Glu Asp Gln His Gln Asp Phe

50 55 60

His Pro Gln Pro Tyr Val Val Tyr Ser Pro Val Asp Arg Pro Pro Ser

65 70 75 80

Asn Asn Pro Phe Glu Ser Val Cys His Met Phe Asn Ser Trp Ser His

85 90 95

Arg Ala Glu Thr Val Ala Arg Asn Val Trp His Asn Leu Lys Thr Ala

100 105 110

Pro Ser Val Ser Glu Ala Ala Trp Gly Lys Leu Asn Met Thr Ala Lys

115 120 125

Ala Ile Thr Glu Gly Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Lys Gln Ile Phe Ala

130 135 140

Thr Asp Pro Tyr Glu Lys Leu Lys Lys Thr Tyr Ala Cys Tyr Leu Ser

145 150 155 160

Thr Thr Thr Gly Pro Val Ala Gly Thr Leu Tyr Leu Ser Thr Thr Lys

165 170 175

Val Ala Phe Cys Ser Asp Arg Pro Leu Thr Phe Thr Ala Pro Ser Gly

180 185 190

Gln Glu Ala Trp Ser Tyr Tyr Lys Ile Ala Val Pro Leu Ala Asn Ile

195 200 205

Ala Ala Val Asn Pro Val Val Met Arg Glu Asn Pro Gln Glu Lys Tyr

210 215 220

Ile Gln Leu Val Thr Val Asp Gly His Asp Phe Trp Phe Met Gly Phe

225 230 235 240

Val Asn Phe Glu Lys Ala Thr His Asn Leu Leu Asp Gly Leu Ser Ser

245 250 255

Phe Arg Ala Tyr Gly Asn Asn Asn Ala Ala Gly Gln Ser Val Ser Gly

260 265 270

His Ala Asn Val Ser Gln Pro Ala Thr Ala Asn

275 280

<210> 2

<211> 852

<212> DNA

<213> 甘薯（Ipomoea batatas (L.) Lam.）

<400> 2

atggagccaa aaggagaaga atcagagccc cataaaccct tgtcatcatc ttcttctgaa 60

tcccaagcac ctgcagaaat ggaccctcag aaatggggaa ctcatgtgat gggtcgtcct 120

gcagtcccca ccacccaccc ggataaccag aaggcggcct tgtggaggtc tgaagatcag 180

caccaagatt tccaccctca accttacgtc gtctattctc ccgtggatcg gccccccagc 240

aacaacccct ttgaatcagt gtgccacatg ttcaattctt ggagccatag agctgagact 300

gtagctcgta acgtatggca caacttgaaa actgcgccat ctgtatcaga agctgcttgg 360

ggaaagctga acatgactgc caaggcaata acagaaggtg gatttgaggc attttacaag 420

caaatctttg caaccgatcc ttatgagaag ctaaagaaga cgtatgcttg ttacctttca 480

acaacaaccg gccctgttgc cgggaccctc tatttgtcaa ccaccaaggt tgctttctgc 540

agtgatcgcc ctttgacctt cacagctcct tctggccagg aggcttggag ctactacaag 600

attgcagtac ctttggcaaa tatagcagca gtgaatccgg tggtaatgag agagaatcca 660

caagagaagt acattcagtt agtgacagtt gatggtcatg acttctggtt catggggttt 720

gtgaattttg agaaagcaac ccataatctc ctagacggct tgtcaagttt tagagcatat 780

ggaaataaca atgcagcagg gcagtctgtt agtggacatg cgaatgtgtc acaacctgct 840

actgctaact ag 852

<210> 3

<211> 1736

<212> DNA

<213> 甘薯（Ipomoea batatas (L.) Lam.）

<400> 3

taattaataa ttaaaattga tatatgtatc ttggataaat acgaagtgga tggccggaaa 60

acccacacct ggaaacttcg ctatcatcta ttcaacggct ccacttgttg acacataaat 120

taagaaacaa ttactagcaa taataaatta gtaatataac gacgaacctt gttacttcta 180

cgcgtaatct cacgcttgtt ctagaacgat gctaaggttt ctattctgat cttaccagat 240

ttcttttccg gcccaattaa ccttcatctc aaagaaacca tcttcaatta atcctataaa 300

ttgcagtgtt ccgatcccca tctctatcta tctcaccact tctttaccaa agtatattct 360

tgccttcatt ccaattcaga aagatattcc cataagtccc caaataatgg agccaaaagg 420

agaagaatca gagccccata aacccttgtc atcatcttct tctgaatccc aagcacctgc 480

agaaatggac cctcagaaat ggggaactca tgtgatgggt cgtcctgcag tccccaccac 540

ccacccagat aaccagaagg ctgccttgtg gaggtctgag gatcattacc aagagttcca 600

ccctcaacct tacgtcgtct attctcccgt ggatcggccc cccagcaaca acccctttga 660

atcagtgtgc cacatgttca attcttggag ccatagagct gagactgtag ctcgtaacgt 720

atggcacaac ttgaaaactg cgccatctgt atcagaagct gcttggggaa agctgaacat 780

gactgccaag gcaataacag aaggtggatt tgaggcatat tacaagcaaa tctttgcaac 840

cgatccttat gagaagctaa agaagacgta tgcttgttac ctttcaacaa caaccggccc 900

tgttgccggg accctctatt tgtcaaccac caaggttgct ttctgcagtg atcgcccttt 960

gaccttcaca gctccttctg gccaggaggc ttggagctac tacaagattg cagtaccttt 1020

ggcaaatata gcagcagtga atccggtggt aatgagagag aatccacaag agaagtacat 1080

tcagttagtg acagttgatg gtcatgactt ctggttcatg gggtttgtga attttgagaa 1140

agcaacccat aatctcctag acggcttgtc aataaatttt agagcatatg gaaataataa 1200

tgcagcaggg cagtctgtga gtggacatgg gaatgtgtca caacttgcta gtgctaacta 1260

gcaataaagt agtatttcac cattcaactc ctcttacttg agttgtcttt ctgccatata 1320

cacagttatt gtattacttt gtgtgcttaa ttgcttggag tgtatccatg tatattgtta 1380

gttgttgttg ttggatgcat tatagatttt tcccttctgg gtatcgagga tgaggttgta 1440

ggcaatctgt gtagagaatt ttcaatataa actaaggggg tttcgtacat attctttagc 1500

ttaataatta cattgtttaa ttcgaagaaa ttacaattcc acggaattgt aacttcttct 1560

ttttgttgta ttgaaattca tactttcata tgaattctaa acaatgaagc atggaaaaga 1620

aaaagagaag agaaagattt gtttatcaat gaagcatgga aaagaaaaag agaagagaaa 1680

gatttgttta tcaatgaagc atggaaaaga aaaagagaag agaaagattt gtttat 1736

<210> 4

<211> 918

<212> DNA

<213> 甘薯（Ipomoea batatas (L.) Lam.）

<220>

<221> misc_feature

<222> (555)..(555)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 4

atggagccaa aaggagaaga atcagagccc cataaaccct tgtcagaaat ggaccctcag 60

aaatggggaa ctcatgtgat gggtcgtcct gcagtcccca ccacccaccc ggataaccag 120

aaggctgcct tgtggaggtc tgaggatcag caccaagatt tccaccctca accttacgtc 180

gtctattctc ccgtggatcg gccccccagc aacaacccct ttgaatcagt gtgccacatg 240

ttcaattctt ggagccatag agctgagacc gtagctcgta acgtatggca caactcacaa 300

gagtcaatat tgactccact aaggctcgaa accaccaccc ctcttgaagc acaagagtcg 360

gtattgtctt cactgaggct ccacctcccg tataaaggaa aggtgaaaac tgcgccatcc 420

gtatcagaag ctgcttgggg aaagctgaac atgactgcca aggcaataac agaaggtgga 480

tttgaggcat attacaagca aatctttgca accgatccta atgagaagct aaagaagacc 540

tccttctggc caggnggccc tgttgccggg accctctatt tgtcaaccac caaggttgct 600

ttctgcagtg atcgcccttt gaccttcaca gctccttctg gccaggaggc ttggagctac 660

tacaagattg cagtaccttt ggcaaatata gcagcagtga atccggtggt aatgagagag 720

aatccacaag agaagtacat tcagatagtg acagttgatg gtcatgactt ctggttcatg 780

gggtttgtga attttgataa agcaacccat aatctcctag acggcttgtc aaattttaga 840

gcatatggaa ataataatgc agcagggcat tctgtgagtg gacatgcgaa tgtgtcacaa 900

cctgctactg ctaactag 918

Claims

1.蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：

所述蛋白质为下述任一种：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白质来源于甘薯。

3.与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：

E1)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在调控植物抗逆性中的应用；

E2)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在制备调控植物抗逆性的产品中的应用；

E3)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在培育抗逆植物中的应用；

E4)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在制备培育抗逆植物的产品中的应用；

E5)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在植物育种中的应用；

所述生物材料为下述B1)至B8)中的任一种：

B1)编码权利要求1或2中所述蛋白质的核酸分子；

B3)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的表达盒；

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述核酸分子为下述任一种：

C1)编码序列是SEQ ID No.2或SEQ ID No.2的第1-204位所示的DNA分子；

5.一种培育转基因植物的方法，其特征在于，所述方法包括提高和/或降低目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的含量和/或活性，得到所述转基因植物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述提高目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的含量和/或活性通过提高目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量实现。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述提高目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量通过将权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因导入所述目的植物实现。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述降低目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的含量和/或活性通过降低目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量实现。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述降低目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量为利用基因突变、基因敲除、基因编辑或基因敲减技术使目的植物基因组中权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因活性下降或失活。

10.权利要求1或2中所述蛋白质，和/或，权利要求3中所述的生物材料。