CN113980106B

CN113980106B - 调控植物种子和器官大小的小肽及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN113980106B
Application number: CN202111263865.3A
Authority: CN
Inventors: 张学琴; 曾月娟; 申思敏; 陈立群; 叶德
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2021-10-27
Filing date: 2021-10-27
Publication date: 2023-03-21
Anticipated expiration: 2041-10-27
Also published as: CN113980106A

Abstract

本发明公开了调控植物种子和器官大小的小肽及其编码基因和应用。本发明具体地公开了氨基酸序列是SEQ ID No.1的多肽AtZSP1(AtZSP1小肽)及其编码基因在调控植物种子和器官大小中的应用。本发明利用T‑DNA插入突变体库，采用反向遗传学的方法，依据生物信息学分析，首次成功鉴定了一个参与调控拟南芥种子和器官大小的基因，命名为AtZSP1基因，并通过基因工程的方法增加了植物种子和/或器官的大小，获得了AtZSP1超表达植株，为小肽的开发和应用领域丰富了优质的基因资源，可以很好地应用于作物品种的改良，提高作物产量，对植物育种工作具有重要的实用价值。

Description

调控植物种子和器官大小的小肽及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及调控植物种子和器官大小的小肽及其编码基因和应用。

背景技术

种子大小是影响作物产量的主要因素之一，直接决定作物的产量，长期以来一直是很多作物育种改良的重要目标。此外，植物器官的大小也是农学、园艺、草业等科学的重要性状。因此种子和器官大小的调控机制的研究已成为植物科学的一个重要研究领域。植物器官的大小由细胞增殖和细胞扩展共同决定，前者通过细胞分裂增加细胞数目，后者通过细胞生长增加细胞大小。目前已鉴定出许多参与调节细胞增殖和细胞生长从而影响植物器官大小的基因(Zhang X,Guo W,Du D,Pu L,Zhang C.Ove rexpression of a maize BRtranscription factor ZmBZR1 in Arabidopsis enlar ges organ and seed size ofthe transgenic plants.Plant Sci.2020；292:110378.)。在这些基因中，有一类小肽也参与此过程，如ROTUNDIFOLIA4(ROT4)调控拟南芥茎顶端的细胞增殖，ROT4过表达降低分生组织的大小，从而使叶片减小(Ikeuch i M,Yamaguchi T,Kazama T,Ito T,Horiguchi G,Tsukaya H.ROTUNDIFOLIA4 regulates cell proliferation along the body axis inArabidopsis shoot.Plan t Cell Physiol.2011；52(1):59-69.)。Phytosulfokine-α(PSK-α)通过调控细胞扩展影响根生长，PSK受体基因Atpskr1-T突变体主要是由于减小的细胞大小使根长变短(Kutschmar A,Rzewuski G,Stuhrwohldt N,Beemster GT,Inze D,Saute r M.PSK-alpha promotes root growth in Arabidopsis.New Phytol.2009；181(4):820-31.)。尽管已鉴定出许多影响植物器官大小的基因，但是其遗传学和分子生物学机制的研究仍然有限。

小肽(small peptide)，宽泛地是指在长度上少于250个氨基酸的蛋白，但也有人定义为5-60个氨基酸长度(Matsubayashi Y.Posttranslationally modified small-peptide signals in plants.Annu Rev Plant Biol.2014；65:385-413.)。小肽参与了细胞增殖、根系发育、花粉育性、气孔开关、矿质元素的吸收和调控、抵御病虫害等生长发育和非生物胁迫的应答等诸多过程。根据N端有无信号肽序列的特点，小肽主要可分为两大类：分泌型，即分泌到胞外发挥作用的小肽(N端含有信号肽)；非分泌型，即在胞内发挥作用的小肽(N端无信号肽)。目前，已鉴定到多个小肽参与植物的生长发育，如CLAVATA3调控SAM的大小(Rojo E,Sharma V K,Kovaleva V,et al.CLV3 Is Localized to theExtracellular Space,Where It Activates the Arabidopsis CLAVATA Stem CellSignaling Pathway[J].Plant Cell,2002,14(5):969-977.)；LURE将花粉管引导至胚囊(Okuda S,Tsutsui H,Shiina K,Sprunck S,Takeuchi H,Yui R,et al.Defensin-likepolypeptide LUREs are pollen tube attractants secreted from synergidcells.Nature.2009；458(7236):357-61.)；RALFs蛋白家族在植物的营养生长和生殖生长中发挥重要功能等(Bedinger PA,Pearce G,Covey PA.RALFs:peptide regulators ofplant growth.Plant Signal Behav.2010；5(11):1342-6.；Qu LJ,Li L,Lan Z,Dresselhaus T.Peptide signalling during the pollen tube journey and doublefertilization.J Exp Bot.2015；66(17):5139-50.)。然而，植物中仍然有大量的未知功能小肽没有被鉴定，并且由于植物小肽数量多、生物学功能研究难度大，极大地限制了小肽的开发和应用。研究表明，基于“生物信息学预测-突变体鉴定–基因功能鉴定”这一套综合的方法，不仅可以有效鉴定小肽而且可以验证小肽的生物学功能，成功克服了由于基因功能冗余和丰度低对小肽鉴定带来的障碍，同时也避免了传统生化分析技术的繁琐、耗时、技术要求高的缺点。

植物小肽的开发和应用是一个新兴的、极具前景的研究领域，植物中还有大量的小肽有待挖掘，正如人类对土壤微生物的认知，有更多的空白等待去填补。因此，鉴定植物中的未知小肽并挖掘其功能具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控植物种子和/或器官的大小。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了调控植物种子和/或器官大小的多肽或调控所述多肽活性或含量的物质的应用，所述应用可为下述任一种：

D1)多肽或调控所述多肽活性或含量的物质在调控植物种子和/或器官大小中的应用；

D2)多肽或调控所述多肽活性或含量的物质在制备调控植物种子和/或器官大小的产品中的应用；

D3)多肽或调控所述多肽活性或含量的物质在培育种子和/或器官大小增加或降低的植物中的应用；

D4)多肽或调控所述多肽活性或含量的物质在制备培育种子和/或器官大小增加或降低的植物的产品中的应用；

D5)多肽或调控所述多肽活性或含量的物质在植物育种中的应用；

所述多肽名称为AtZSP1，可为如下任一种：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的多肽；

A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的多肽具有80％以上的同一性且具有调控植物种子和/或器官大小功能的多肽；

A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的融合多肽。

A4)氨基酸序列是SEQ ID No.8的多肽；

A5)将SEQ ID No.8所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A4)所示的多肽具有80％以上的同一性且具有调控植物种子和/或器官大小功能的多肽；

A6)在A4)或A5)的N端和/或C端连接标签得到的融合多肽。

为了使多肽便于纯化，可在所述多肽的氨基末端和/或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1：标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述A2)中的AtZSP1多肽，可为与SEQ ID No.1所示多肽的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的多肽。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

上述A2)中的AtZSP1多肽可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A2)中的AtZSP1多肽可为由57个氨基酸组成的小肽。所述小肽命名为AtZSP1小肽。

上述A2)中的AtZSP1多肽的编码基因可通过将SEQ ID No.2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

其中，SEQ ID No.2所示的DNA分子编码SEQ ID No.1所示的AtZSP1多肽。

本发明还提供了与AtZSP1多肽相关的生物材料的应用，所述应用可为下述任一一种：

E1)与AtZSP1多肽相关的生物材料在调控植物种子和/或器官大小中的应用；

E2)与AtZSP1多肽相关的生物材料在制备调控植物种子和/或器官大小的产品中的应用；

E3)与AtZSP1多肽相关的生物材料在培育种子和/或器官大小增加或降低的植物中的应用；

E4)与AtZSP1多肽相关的生物材料在制备培育种子和/或器官大小增加或降低的植物的产品中的应用；

E5)与AtZSP1多肽相关的生物材料在植物育种中的应用；

所述生物材料可为下述任一种：

B1)编码AtZSP1多肽的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

D1)抑制或降低AtZSP1多肽编码基因表达的核酸分子；

D2)含有D1)所述核酸分子的表达盒；

D3)含有D1)所述核酸分子的重组载体、或含有D2)所述表达盒的重组载体；

D4)含有D1)所述核酸分子的重组微生物、或含有D2)所述表达盒的重组微生物、或含有D3)所述重组载体的重组微生物；

D5)含有D1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有D2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

D6)含有D1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有D2)所述表达盒的转基因植物组织；

D7)含有D1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有D2)所述表达盒的转基因植物器官。

上述应用中，B1)所述核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：

b1)编码序列(CDS)是SEQ ID No.2所示的DNA分子或cDNA分子；

b2)核苷酸序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子或cDNA分子；

b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码AtZSP1多肽的DNA分子或cDNA分子；

b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码AtZSP1多肽的DNA分子或cDNA分子。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码AtZSP1多肽的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的AtZSP1多肽的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码AtZSP1多肽且具有AtZSP1多肽功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述应用中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

上述应用中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。

上述应用中，调控所述多肽活性或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述AtZSP1多肽。

上述应用中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的多肽的活性进行调控)。

所述调控基因表达的物质具体可为B1)-B3)和D1)-D3)中任一所述的生物材料。

上述应用中，B2)所述表达盒(AtZSP1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达AtZSP1多肽的DNA，该DNA不但可包括启动AtZSP1基因转录的启动子，还可包括终止AtZSP1基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcSE9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)PlantCell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

可用现有的表达载体构建含有所述AtZSP1基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述应用中，所述载体可为质粒载体、黏粒载体、噬菌体载体、病毒载体或人工微小染色体载体。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia),欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium),产碱菌属(Alcaligenes),假单胞菌属(Pseudomonas),芽胞杆菌属(Bacillus)等。所述细菌具体可为大肠杆菌。

本发明所述多肽，包括肽、多肽或小肽，无论是天然存在的还是合成的。

本发明还提供了一种增加植物种子和/或器官大小的方法，所述方法包括通过提高或增加植物中AtZSP1多肽的表达和/或活性来增加植物种子和/或器官大小。

上述方法中，所述提高或增加植物中AtZSP1多肽的表达和/或活性通过提高或增加植物中所述多肽的编码基因的表达量实现。

进一步地，所述提高或增加植物中AtZSP1多肽的表达和/或活性可为在植物中过表达AtZSP1多肽的编码基因。

进一步地，所述方法包括以下步骤：

M1)构建含有AtZSP1多肽的编码基因的过表达载体；

M2)将M1)所述的过表达载体直接导入或利用农杆菌介导导入受体植物，得到含有过表达AtZSP1多肽的编码基因的转基因植株。

所述过表达载体含有强启动子，所述强启动子驱动AtZSP1多肽的编码序列在受体植物中过表达。

所述强启动子可为一个35s启动子，也可以是两个以上的35s启动子，或一个35s启动子再加一个Ubi启动子。

进一步地，本发明的一个实施方案中，所述植物为拟南芥。

本发明还提供了降低植物种子和/或器官大小的方法，所述方法包括通过抑制或降低植物中AtZSP1多肽编码基因的表达和/或AtZSP1多肽的活性来降低植物种子和/或器官大小。

上述方法中，抑制或降低植物中AtZSP1多肽编码基因的表达和/或AtZSP1多肽的活性的方法可为将所述植物基因组中的SEQ ID No.2的第31-58位核苷酸缺失。

本发明还提供了增加或降低植物种子和/或器官大小的方法在培育种子和/或器官大小增加或降低的植物中的应用。

本发明还提供了增加或降低植物种子和/或器官大小的方法在植物育种中的应用。

所述植物育种可为增加或降低作物种子和/或器官大小的转基因育种。

所述调控植物种子和/或器官大小可为增加或降低植物种子和/或器官大小。

上文中，所述植物可为下述任一种：

F1)单子叶植物或双子叶植物；

F2)白花菜目植物、禾本目植物或豆目植物；

F3)十字花科植物、禾本科植物或豆科植物；

F4)拟南芥属植物、芸苔属植物、玉蜀黍属、稻属植物、狗尾草属植物、高粱属植物或大豆属植物；

F5)拟南芥、油菜、大白菜、玉米、水稻、谷子、高粱或大豆。

本发明利用T-DNA插入突变体库，采用反向遗传学的方法，依据生物信息学分析，对拟南芥的未知小肽蛋白进行分类，在对其氨基酸长度小于100个的单拷贝基因进行鉴定时，从中发现了一个编码57个氨基酸的基因，将该小肽基因命名为AtZSP1。对该基因的T-DNA插入突变体进行鉴定，筛选出纯合突变体。并利用CRISPR/Cas9技术获得了另一个纯合突变体，两个突变体均为完全敲除突变体。利用反向遗传学的思路对纯合突变体进行一系列的基因功能的研究。基因敲除所产生的突变表型，是该基因缺失后的表型，因而直接表明了该基因的功能与表型的关系，由此可以直接快速的检测得到基因的功能。

本发明经过对纯合突变体的表型进行观察，结果表明，突变体的种子大小和百粒重均明显小于野生型，且植株矮小，叶片大小、花苞数目和主茎上的角果数目均少于野生型。说明AtZSP1基因的缺失影响拟南芥的种子和器官大小。另外，对获得的纯合过表达植株进行表型观察，发现过表达植株的表型与突变体完全相反。由于植物器官大小是由细胞数目和细胞大小共同决定的，因此对野生型和突变体的子叶细胞数目和细胞大小进行了统计，结果表明，突变体的子叶总的细胞数目显著下降，且突变体子叶的平均细胞大小也小于野生型。说明AtZSP1基因可能通过控制细胞增殖和细胞扩展来影响器官的大小。此外，该基因编码的多肽在油菜、玉米、水稻、大白菜、大豆、谷子和高粱等作物中均有同源蛋白，并且这些蛋白的序列在这些物种中比较保守，暗示AtZSP1在作物品种改良中有良好的前景。

本发明首次成功鉴定了一种AtZSP1小肽，克隆了AtZSP1基因，验证基因功能，并通过基因工程的方法增加了植物种子和/或器官的大小，获得了AtZSP1超表达植株，为小肽的开发和应用领域丰富了优质的基因资源，可以很好地应用于作物品种的改良，提高作物产量，对植物育种工作具有重要的实用价值。

附图说明

图1为atzsp1-1纯合突变体鉴定电泳图。

图2为AtZSP1基因的结构示意图及T-DNA插入位点。atzsp1-1突变体是T-DNA插入在AtZSP1基因第一个外显子上距ATG 27bp处。

图3为CRISPR/Cas9技术构建的atzsp1-2突变体靶点的选择及突变形式示意图。突变体atzsp1-2是在两个靶点之间缺失28bp的纯合突变，导致提前在118bp后出现了终止密码子TGA，使蛋白翻译提前终止。

图4为无cas9载体的atzsp1-2突变体。1/2MS Medium表示在1/2MS培养基上的生长情况，1/2MS+Hyg Medium表示在含潮霉素的培养基上的生长情况。

图5为突变体中AtZSP1基因表达量分析结果图。Col表示野生型拟南芥对照。

图6为突变体及互补植株的叶片及鲜重分析结果图。

图7为互补克隆载体的构建示意图。其中pCAMBIA1300为基础载体；gAtZSP1(1948bp)为全长AtZSP1基因，包括1184bp的启动子，25bp的5’非编码序列，278bp的基因编码序列(外显子+内含子)及461bp的3’非编码序列；BamHI和PstI为构建互补载体时所用的两个单一酶切位点；Kan表示kanamycin，为抗生素卡那霉素抗性筛选基因。

图8为过表达载体的构建示意图。

图9为突变体和过表达植株中AtZSP1基因表达量分析结果图。

图10为突变体和过表达植株的种子大小及百粒重分析结果图。

图11为突变体和过表达植株的成熟胚胎分析结果图。

图12为土中生长17天的突变体和过表达植株的叶片分析结果图。

图13为突变体和过表达植株的植株高度、花苞数目及角果数目分析结果图。

图14为突变体的子叶细胞数目和细胞大小分析结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的野生型拟南芥(WT，Col)为哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0)，Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)。

下述实施例中的pCBC-DT1T2由中国农业大学陈其军教授实验室惠赠(Lei Zhu,Liang-Cui Chu,Yan Liang,Xue-Qin Zhang,Li-Qun Chen,De Ye1.The ArabidopsisCrRLK1L protein kinases BUPS1 and BUPS2 are required for normal growth ofpollen tubes in the pistil.The Plant Journal(2018)95,474–486)，公众可从中国农业大学获得，以重复本发明的实验用。

下述实施例中的pHEC401由中国农业大学陈其军教授实验室惠赠(Lei Zhu,Liang-Cui Chu,Yan Liang,Xue-Qin Zhang,Li-Qun Chen,De Ye1.The Arabidops isCrRLK1L protein kinases BUPS1 and BUPS2 are required for normal growth ofpollen tubes in the pistil.The Plant Journal(2018)95,474–486)，公众可从中国农业大学获得，以重复本发明的实验用。

下述实施例中的pSuper1300由中国农业大学巩志忠实验室惠赠(Yanglin Ding，Jian Lv，Yiting Shi，Junping Gao，Jian Hua，Chunpeng Song，Zhizhong Gong，ShuhuaYang.EGR2 phosphatase regulates OST1 kinase activity and freezing tolerancein Arabidopsis.The EMBO Journal(2019)38:e99819)，公众可从中国农业大学获得，以重复本发明的实验用。

实施例1 atzsp1突变体的筛选及AtZSP1基因的鉴定

1.atzsp1突变体的筛选

本发明首先对拟南芥中氨基酸长度小于150的未知小肽进行筛选和分类，共有3698个未被鉴定的基因。为了获得有效突变体的效率，进一步缩小范围，从中鉴定到了氨基酸长度小于100的单拷贝基因，并从TAIR官网(http://www.arabidopsi s.org/)上订购了插入在外显子上的T-DNA插入突变体。通过PCR筛选到纯合突变体后，进行初步的表型观察，从中鉴定到了一个参与调控拟南芥种子和器官大小的基因，命名为AtZSP1基因。AtZSP1基因编码氨基酸序列是序列表中的SEQ ID No.1所示的多肽AtZSP1。AtZSP1的基因组基因是序列表中的SEQ ID No.3所示的双链DN A，第1-1184位核苷酸为启动子，第1185-1209位核苷酸为5'UTR，第1210-1277位核苷酸为第一外显子，第1278-1381位核苷酸为第一内含子，第1382-1487位核苷酸为第二外显子，第1488-1948位核苷酸为3'UTR。AtZSP1的cDNA基因是序列表中的SEQ ID No.4所示的双链DNA，第26-199位核苷酸为编码序列(CDS)。

AtZSP1基因突变后，种子、叶片、根长、花序和植株高度均小于野生型，而过表达植株的种子和叶片、根长、花序及植株高度均比野生型大。另外，通过植物基因组序列的搜索和生物信息学的研究，在拟南芥中没有与AtZSP1同源的蛋白，其蛋白序列在玉米、水稻、油菜、大白菜和大豆等作物中高度保守，意味着本发明鉴定的AtZSP1基因广泛适用于其中存在具有相似功能的直系同源的AtZSP1基因的其他植物物种。

2.atzsp1突变体及AtZSP1基因的鉴定

(1)atzsp1-1突变体

将从TAIR官网上订购的T-DNA插入突变体(SALK_11106C)命名为atzsp1-1,用AtZSP1基因上的两个特异引物及T-DNA上的特异的引物对该突变体进行PCR鉴定，结果显示，该突变体为纯合突变体(图1)。图1中LP和RP为AtZSP1基因上的引物，LBb1.3为T-DNA上的特异引物。测序结果表明，T-DNA插入在AtZSP1基因第一个外显子上距ATG 27bp处(图2)。

(2)atzsp1-2突变体

利用CRISPR/Cas9技术构建第二个突变体，具体过程是：首先构建双靶点载体，选择该基因上从起始密码子ATG数起第24-46bp位置和53-75bp位置的序列为两个靶点，即图3中Target1和Target2所示的序列。Target1的序列为：CCAAACAGTGGCAATCTCCGGCG，Target2的序列为CCGCCGTCTCATGCTGGTGAGTG。以pCBC-DT1T2为模板，用引物进行PCR扩增Target1-Target2编码DNA，将得到的PCR产物(PCR产物序列如SEQ ID No.5所示)回收后，在酶切-连接反应体系中同时加入PCR产物、pHEC401载体和BsaI限制性内切酶和T4 Ligase连接酶进行酶切和连接，将连接后的产物转入大肠杆菌感受态DH5α细胞，经过菌落PCR及测序，将连接正确的质粒命名为pHEC401-ZSP1-cas9。pHEC401-ZSP1-cas9是将pHEC401的两个BsaI识别位点间的片段替换为SEQ ID No.5的第13-第614位所示的DNA片段，保持pHEC401的其它序列不变，得到表达靶向Target1和Target2这两个靶点的sgRNA1和sgRNA2和cas9的重组表达载体。

将pHEC401-ZSP1-cas9转入根癌农杆菌GV3101，将鉴定正确的重组农杆菌命名为GV-ZSP1-cas9。GV-ZSP1-cas9通过农杆菌浸染法转入野生型拟南芥花序；将收获的T0代转基因植株所结的种子(T0代种子)在含潮霉素的培养基上进行筛选，对筛选到的T1代阳性小苗进行测序，分析AtZSP1基因的突变形式。从中鉴定到了两个靶点之间缺失28bp的纯合突变，导致提前在118bp(缺失之前的序列)后出现了终止密码子TGA,使蛋白翻译提前终止，将该突变体命名为atzsp1-cas9(图3)。为了清除该突变体中的CRISPR/Cas9载体，将atzsp1-cas9突变体自交一代，从后代植株中分离出无载体的突变体，此突变体在含潮霉素的培养基(1/2MS+50μg/mL潮霉素)上均不能生长，说明已清除了载体，将该突变体命名为atzsp1-2(图4)。atzsp1-cas9中的AtZSP1突变基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，编码序列如SEQ ID No.7的1-93位核苷酸所示，AtZSP1突变多肽氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。

(3)表达量分析

对atzsp1-1和atzsp1-2这两个纯合突变体进行表达量分析：分别提取野生型拟南芥和两个突变体在光下生长10d的幼苗的RNA，并反转录为cDNA，用引物(5’-CGTTCTCGTTGATCCAAACAG-3’)和引物(5’-GTGGAATCAGAATTGGAGCCT-3’)进行qRT-PCR分析。以野生型拟南芥的表达量为1，结果显示，两个突变体中均检测不到AtZSP1基因的表达，说明这两个突变体均为完全敲除突变体(图5)。

3.AtZSP1基因的克隆和atzsp1-1突变体的回补实验

初步观察atzsp1-1和atzsp1-2这两个突变体表型一致，均具有叶片小的表型，对土中生长17d的小苗测量其地上部分的鲜重和叶片表面大小，结果显示，突变体的叶片鲜重及叶表面大小均显著小于野生型(图6)。为了确定atzsp1-1突变体的表型是由AtZSP1基因缺失导致的，构建了atzsp1-1突变体的回补克隆(图7)，并进行了回补实验。

具体过程为：

(1)以野生型拟南芥的基因组DNA(AtZSP1基因全长包括1184bp的启动子，25bp的5’非编码序列，278bp的基因序列及461bp的3’非编码序列)为模板，用AtZSP1基因上特异的引物(分别含有BamHI和PstI两个限制性内切酶位点)(5’-CGG GGATCCAAACGGGCATCGGTATGAAG-3’和5’-CGA CTGCAG TTTCCCACATAGGTACAT ACA-3’)进行PCR扩增，PCR产物经过纯化回收酶切后连接到pCAMBIA1300载体上，将克隆测序正确的重组回补表达载体命名为pAtZSP1::AtZSP1(图7)。pAtZSP1::AtZSP1是将pCAMBIA1300的BamHⅠ和PstⅠ的识别位点间的片段(小片段)替换为序列表中SEQ ID No.3所示的DNA片段，保持pCAMBIA1300的其它序列不变，得到的重组表达载体。

将该重组质粒pAtZSP1::AtZSP1通过电击法转入农杆菌GV3101，并将鉴定正确的重组农杆菌命名为GV-pAtZSP1::AtZSP1。通过农杆菌介导的浸染花序的方法转入atzsp1-1突变体中，获得T0代转基因拟南芥种子。

(2)将步骤(1)获得的T0代转基因拟南芥种子播种于含有潮霉素的培养基(1/2MS+50μg/mL潮霉素)上，能够正常生长的拟南芥即为T1代转基因阳植株，T1代转基因阳性植株收获的种子即为T1代转基因拟南芥种子。

对于某一T1代植株来说，如果满足如下两个条件，该T1代植株即为单拷贝插入的转基因植株：①该T1代植株为潮霉素抗性植株；②该T1代植株自交得到的T2代植株中，潮霉素抗性植株与潮霉素敏感植株的数量比基本符合3:1。

对于某一T2代植株来说，如果满足如下三个条件，该T2代植株及其自交后代为一个纯合的转基因株系：①该T2代植株为潮霉素抗性植株；②其T1代植株为单拷贝插入的转基因植株；③其抽样检测的T3代植株均为潮霉素抗性植株。

通过PCR鉴定到了66株T1代转基因阳性植株，在T2代筛到单拷贝植株，收获这些单拷贝植株所结的种子，在含有潮霉素的培养基(1/2MS+50μg/mL潮霉素)上进行纯合体的筛选，共筛选到9株纯合的回补植株，其中两株T2代植株分别命名为atzsp1-comp-1和atzsp1-comp-2。采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用t-test检验，P＜0.01(**)表示与野生型拟南芥相比具有显著性差异，P＜0.001(***)表示与野生型拟南芥相比具有极显著性差异。通过表型观察，发现回补植株的叶片大小与野生型的大小较为一致，对土中培养17d的小苗测量其地上部分的鲜重及最大叶片的表面大小，其大小也恢复至野生型水平。说明在atzsp1-1突变体植株中导入AtZSP1基因能够回补atzsp1-1突变体器官小的表型，并且atzsp1-1突变体器官小的表型确实是由AtZSP1基因缺失导致的(图6)。

实施例2AtZSP1基因超表达植株的获得

为了进一步研究AtZSP1基因的功能，构建了AtZSP1基因的过表达植株。

具体过程为：

(1)过表达载体的构建

以野生型拟南芥的cDNA为模板，用引物5’-CGA CTGCAG ATGCAAAAATCGTTCTCGTTG-3’和5’-GAG ACTAGT GGAATGGGGAGTGGAATCAG-3’(分别含有PstI和SpeI两个限制性内切酶位点)进行PCR扩增，PCR产物经过纯化回收、PstI和SpeI双酶切后连接到pSuper1300载体上(图8)。将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α细胞，在含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上培养，菌落PCR后进行测序，得到正确的克隆。将该重组过表达载体命名为p35S::AtZSP1。p35S::AtZSP1是将pSuper1300载体的PstⅠ和SpeⅠ的识别位点间的片段(小片段)替换为序列表中SEQ ID No.2所示的DNA片段(去掉TGA)，保持pSuper1300载体的其它序列不变，得到的AtZSP1基因重组表达载体。将p35S::AtZSP1转入农杆菌GV3101，将鉴定正确的重组农杆菌命名为GV-p35S::AtZSP1。

(2)AtZSP1基因超表达植株的获得

分别取培养好的、GV-p35S::AtZSP1(含有过表达载体的重组农杆菌)农杆菌菌液3mL转入150mL三抗LB培养基(Rif+Gen+Kan)中，于28℃、250rpm过夜培养至橘黄色，使菌液OD600nm值为1.6-1.8；将菌液转移至离心瓶中，4℃、3,000rpm离心15min；弃上清，加入1/2MS培养液(0.22g MS粉和2g蔗糖，加水溶解后，调节pH至5.8，用ddH₂O定容至100mL后，加入12ml Silwet L-77试剂，搅拌均匀)，将菌沉淀悬起来，并调节pH至0.6-0.8；在浸染前剪掉角果，将处于盛花期的野生型拟南芥植株的花序放在盛有菌液的培养皿中浸染10s；将浸好的植株平放在托盘中，于黑暗环境中培养18-24h后恢复正常光照培养。收集T0代转基因植株(p35S::AtZSP1转基因植株)所结的种子(T0代种子)。T0代种子种下去长成的植株为T1代，依此类推，T2、T3分别表示转基因植株第2代和第3代。

将T0代种子消毒后，铺在1/2MS+50μg/mL潮霉素固体培养基(Murashige andSkoog basal medium，0.8％琼脂粉，pH5.8，50μg/mL潮霉素)上，4℃低温处理2d，移至22℃，光照(16h光照/8h黑暗)条件下培养8-10d，挑取抗性植株种在土中，在光照条件下继续培养。提取叶片的基因组DNA，用引物(F:5’-ATGCAAAAATCGTTCTCGTTG-3’和R:5’-CTTATCGTCATCGTCCTTGT-3’)进行PCR扩增AtZSP1-Flag片段，经过PCR鉴定，进一步确定阳性植株(PCR产物约240bp)。

(3)AtZSP1基因超表达植株的鉴定

Trizol法提取野生型拟南芥、atzsp1-1和p35S::AtZSP1转基因植株幼苗的总RNA，经过反转录合成cDNA(具体方法参照Genestar反转录试剂盒说明书)，-20℃保存备用。使用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)进行表达量的检测。以AtZSP1基因编码区特异引物1和引物2进行扩增。

引物1：5’-CGTTCTCGTTGATCCAAACAG-3’

引物2：5’-GTGGAATCAGAATTGGAGCCT-3’

PCR反应体系如下：

2X power SYBR Green PCR Master Mix：10μL；

引物1(10μmol/L)：0.2μL；

引物2(10μmol/L)：0.2μL；

cDNA：1μL；

ddH2O：8.6μL。

Real-time PCR反应程序：预变性95℃5min；94℃25sec，60℃30sec，72℃30sec，40个循环，然后72℃2min。以ACTIN2基因为内参对照，其引物序列为

ACTIN2-F：5’-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3’

ACTIN2-R：5’-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’

用ΔΔCt算法进行表达量的分析。

经PCR鉴定，在T1代获得了36株转p35S::AtZSP1转基因阳性植株，并在T3代获得了11株纯合植株用于后续分析。qRT-PCR结果显示，在纯合的过表达植株中AtZSP1基因的表达量均显著高于未转基因的野生型，说明转基因植株中AtZSP1基因的表达确实增强了(图9)。

对于p35S::AtZSP1过表达转基因植株，经过T2代筛选出分离比为3：1的单拷贝植株(根据遗传学原理，单拷贝插入之后自交后代会产生3:1的分离比。结合统计学的方法，统计抗生素培养基上抗性苗和非抗性苗的数量。用分离比方法鉴定出转基因植株为单拷贝插入的株系，从而用于纯合体的筛选)，经过T3代筛选出p35S::AtZSP1转基因纯合植株，将其中的两个株系分别命名为株系p35S::AtZSP1#1和株系p35S::AtZSP1#2，用于进行下面的实验。

实施例3atzsp1突变体和AtZSP1基因过表达植株的表型观察

1、突变体、过表达植株种子大小

实验重复三次，每次重复每个株系取30粒种子。

通过体式镜观察，株系atzsp1-1和株系atzsp1-2突变体的种子大小明显较野生型小，相反，过表达p35S:AtZSP1的株系p35S::AtZSP1#1和株系p35S::AtZSP1#2的种子比野生型明显增大。为了量化种子变化的程度，我们统计了各个株系种子的面积，结果表明，突变体株系atzsp1-1和株系atzsp1-2的种子面积比野生型小，同样，过表达p35S:AtZSP1的株系p35S::AtZSP1#1和株系p35S::AtZSP1#2的种子均比野生型的大。结果如图10所示。此外，统计了每个株系单株种子的百粒重，统计结果如图10所示，野生型种子的百粒重为1.70mg，突变体单株种子的百粒重比野生型小，仅为1.30mg和1.33mg，分别减少了24％和22％；而过表达植株种子的百粒重较野生型明显升高，为2.73mg和2.53mg，分别增加了38％和33％。图中标尺为1mm。采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用t-test检验，P＜0.05(*)表示与野生型拟南芥相比具有显著性差异，P＜0.01(**)表示与野生型拟南芥相比具有显著性差异，P＜0.001(***)表示与野生型拟南芥相比具有极显著性差异。

2、突变体、过表达植株成熟胚胎大小

实验重复三次，每次重复每个株系取10-15个成熟胚胎。

由于种子突变体的种子大小变小，因此观察了突变体和过表达植株的成熟胚胎并对其大小进行了面积测量。结果如图11所示，突变体的成熟胚胎明显比野生型的小，野生型的成熟胚胎面积为95.7×10³μm²，突变体株系atzsp1-1的成熟胚胎面积为71.8×10³μm²、突变体株系atzsp1-2的成熟胚胎面积为78.6×10³μm²，分别比野生型的减小了25.0％和17.9％，而过表达株系p35S::AtZSP1#1的成熟胚胎面积为143.3×10³μm²、过表达株系p35S::AtZSP1#2的成熟胚胎面积为162.8×10³μm²，分别比野生型的增加了33.2％和41.2％。图中标尺为500μm。采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用t-test检验，P＜0.05(*)表示与野生型拟南芥相比具有显著性差异，P＜0.01(**)表示与野生型拟南芥相比具有显著性差异，P＜0.001(***)表示与野生型拟南芥相比具有极显著性差异。

3、突变体、过表达植株幼苗大小

实验重复三次，每次重复每个株系取10-15个植株幼苗。

将五个株系的种子同时播种在MS(Murashige and Skoog basal medium，0.8％琼脂粉，pH5.8)固体培养基上，于4℃低温处理3天，转移到22℃培养箱培养8d后移栽到土中，14d后，对幼苗的地上部分进行拍照，并选取五个株系每个幼苗上的最大叶片面积进行测量，结果显示，野生型的叶片面积为1.01cm²，突变体株系atzsp1-1和突变体株系atzsp1-2的叶片面积分别为0.62cm²和0.63cm²，分别减少了39％和38％；同时，过表达植株的叶片面积比野生型明显增大，过表达株系p35S::AtZSP1#1和过表达株系p35S::AtZSP1#2的叶片面积分别为1.25cm²和1.24cm²，分别增加了19.2％和18.5％。同时，测量了这五个株系的地上部分鲜重，结果显示，野生型的地上部分鲜重为0.11g，突变体株系atzsp1-1和突变体株系atzsp1-2的地上部分鲜重分别为0.068g和0.063g，分别减少了38.2％和42.7％，过表达株系p35S::AtZSP1#1和过表达株系p35S::AtZSP1#2的地上部分鲜重分别为0.152g和0.150g，分别增加了27.6％和26.7％(图12)。图中标尺为1cm。采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用t-test检验，P＜0.05(*)表示与野生型拟南芥相比具有显著性差异，P＜0.01(**)表示与野生型拟南芥相比具有显著性差异，P＜0.001(***)表示与野生型拟南芥相比具有极显著性差异。

4、突变体、过表达植株开花期植株高度、角果数目及花序大小

实验重复三次，每次重复每个株系取25个植株。

将上述步骤3中的幼苗在土中生长28d后，每个株系选取25个植株，进行拍照和株高度统计，结果如图中所示(图13)，野生型的株高为26.35cm，突变体株系atzsp1-1和突变体株系atzsp1-2的株高分别为18.87cm和19.91cm，分别下降28.4％和24.4％；过表达株系p35S::AtZSP1#1和过表达株系p35S::AtZSP1#2的株高比野生型升高，分别为31.02cm和30.04cm，分别增加了15.1％和12.3％。图中标尺为1cm。采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用t-test检验，P＜0.05(*)表示与野生型拟南芥相比具有显著性差异，P＜0.01(**)表示与野生型拟南芥相比具有显著性差异，P＜0.001(***)表示与野生型拟南芥相比具有极显著性差异。

另外，对各个株系主茎上的角果个数和花的数目进行统计，结果显示，野生型主茎上的角果数目为14.43个，突变体株系atzsp1-1和突变体株系atzsp1-2的植株主茎上的角果个数分别为7.93个和8.87个，分别减少了45.0％和38.5％；过表达株系p35S::AtZSP1#1和过表达株系p35S::AtZSP1#2的植株主茎上的角果个数比野生型明显增多，分别为18.12个和17.19个，分别增加了20.4％和16.1％。对同一时期花的数目的统计结果显示，野生型的花苞数量为11.76个，突变体株系atzsp1-1和突变体株系atzsp1-2的花苞数量分别为8.63和9.19个，较野生型相比分别减少了26.6％和21.9％；而过表达株系p35S::AtZSP1#1和过表达株系p35S::AtZSP1#2的花苞数量比野生型的多，分别为15.81个和13.79个，分别增加了25.6％和14.7％。如图13所示。图中标尺为2mm。采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用t-test检验，P＜0.05(*)表示与野生型拟南芥相比具有显著性差异，P＜0.01(**)表示与野生型拟南芥相比具有显著性差异，P＜0.001(***)表示与野生型拟南芥相比具有极显著性差异。

5、突变体、过表达植株叶片细胞大小和细胞数目

实验重复三次，每次重复每个株系取10-15个植株。

由于器官大小是由细胞数目和细胞大小共同决定的，因此对光下培养6d的野生型和突变体的子叶进行观察，首先在体视镜下对子叶面积进行拍照，测量结果表明，野生型的子叶面积为19.31mm²，突变体株系atzsp1-1和突变体株系atzsp1-2的子叶面积分别为12.16mm²和11.10mm²。接着在显微镜下观察子叶的的栅栏细胞并进行测量，结果表明(图14)，野生型每个子叶总的细胞数目为11.2×10³个，突变体株系atzsp1-1和突变体株系atzsp1-2的子叶中总的细胞数目分别为8.5×10³和7.8×10³个，突变体的子叶中细胞数目明显下降，分别下降了24.1％和30.3％；对子叶的平均细胞大小进行统计，结果表明，野生型子叶的平均细胞大小为1.75×10³μm²，而突变体株系atzsp1-1和突变体株系atzsp1-2的平均细胞大小为分别为1.43×10³μm²和1.44×10³μm²，分别减少了18.3％和17.7％。以上结果表明，AtZSP1基因可能通过细胞增殖和细胞扩展影响叶片的大小。采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用t-test检验，P＜0.05(*)表示与野生型拟南芥相比具有显著性差异，P＜0.01(**)表示与野生型拟南芥相比具有显著性差异，P＜0.001(***)表示与野生型拟南芥相比具有极显著性差异。

本发明对拟南芥的未知小肽蛋白进行分类，在对其氨基酸长度小于100个的单拷贝基因进行鉴定时，从中发现了一个编码57个氨基酸的基因，将该基因命名为AtZSP1。对该基因的T-DNA插入突变体进行鉴定，并利用CRISPR/Cas9技术获得了另一个纯合突变体，两个突变体均为完全敲除突变体。对突变体的表型进行观察，结果表明，突变体的种子大小和百粒重均明显小于野生型，且植株矮小，叶片大小、花苞数目和主茎上的角果数目均少于野生型。说明AtZSP1基因的缺失影响拟南芥的种子和器官大小。另外，对获得的纯合过表达植株进行表型观察，发现过表达植株的表型与突变体完全相反。由于植物器官大小是由细胞数目和细胞大小共同决定的，因此对野生型和突变体的子叶细胞数目和细胞大小进行了统计，结果表明，突变体的子叶总的细胞数目显著下降，且突变体子叶的平均细胞大小也小于野生型。说明AtZSP1基因可能通过控制细胞增殖和细胞扩展来影响器官的大小。此外，该基因编码的多肽在油菜、玉米、水稻、大白菜、大豆、小米和高粱等作物中均有同源蛋白，并且这些蛋白的序列在这些物种中比较保守，暗示AtZSP1基因可能在作物品种改良中有良好的前景。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> 调控植物种子和器官大小的小肽及其编码基因和应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 57

<212> PRT

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 1

Met Gln Lys Ser Phe Ser Leu Ile Gln Thr Val Ala Ile Ser Gly Val

1 5 10 15

Phe Ser Ala Val Ser Cys Trp Tyr Gly Phe Met Phe Gly Arg Glu Ser

20 25 30

Ala Arg Lys Glu Leu Gly Gly Leu Ile Glu Glu Leu Arg Arg Gly Gly

35 40 45

Ser Asn Ser Asp Ser Thr Pro His Ser

50 55

<210> 2

<211> 174

<212> DNA

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 2

atgcaaaaat cgttctcgtt gatccaaaca gtggcaatct ccggcgtatt ctccgccgtc 60

tcatgctggt atggattcat gttcggtaga gaatcagcga gaaaagagct cggaggtttg 120

atcgaagagc tccgtcgtgg aggctccaat tctgattcca ctccccattc ctga 174

<210> 3

<211> 1948

<212> DNA

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 3

aaacgggcat cggtatgaag gagcctggca tgaggggaga aggcaaggac ttggtatgta 60

cacgttcagg aatggtgaga cacaggcagg ccattgggaa gacggagttc ttaactgtcc 120

taccgagcag accactcgcc ctgattcatc gttttccatc agtcattcca aggttgtcga 180

cactgtccag gtaccttata atttatctta ctgctgctca tatatattaa gttagagttt 240

agatctttaa gaaattatct tactgctgcc aatgattgag tacccacatg agatttgatc 300

ctgctccctc tctctctttg atcaacagca agcaaggaaa gcagccaaga aagcacgcga 360

agttgtgaaa gttgaagaga gagtgaacag agcagtgatg gtcgcaaacc gagcagcaaa 420

tgctgctaga gttgctgcta caaaggctgt ccaaacccaa acatttcatt gtagtagtgg 480

tgacgatccc ttgtgagttc ctgcggcaaa gattttgaca taatcgcagt catgacctta 540

cctcgaactt ctacgaagac agaagagtga aagagagatg tttagagaac agcgtcagaa 600

ttcgcaatct ccgttgagat tttcttgaag gtgaaccact tggaaccaat gtcgagatct 660

cataagtaat aagtaagaga tctggctatg gagcaagtat tacaggttta ctttttcttt 720

tctcccactt gttttatgag caggctggtt taaaactgta catatgttgt tgaagagtaa 780

gcaatgtgtg ttaacaaaag atctttgtaa caagcgtaac ccatgtaaga gaagtaacaa 840

aacattgttt tacttttaca acgtgttgaa aataacacct tttttttact agatttctat 900

ggatagaaat tagaaaatga catgagaatt ccagattcaa atcaacttga caaaaccaac 960

aagggaaaga gtaaagatat ctggtctgtg acaaggtcca agtagagacg aattacagat 1020

catctaggta actgtgctta tggttcttca aaccctttca gcaaatccta gcagccagcc 1080

tttgtgtttg attaaagtgg gctgggctaa aatattggcc gaggcccatc aagtgattct 1140

ctcccgctca agtcttttaa tccttgagga gaaaatggac tggaaaattc acggaacttt 1200

aacagaaaga tgcaaaaatc gttctcgttg atccaaacag tggcaatctc cggcgtattc 1260

tccgccgtct catgctggtg agtgattgtt cccgtctttc aagctcttct tcttcaattc 1320

tcgtcttctt ctctttccat gtctcatctt tagggtttaa gctgccttac tcaatttcca 1380

ggtatggatt catgttcggt agagaatcag cgagaaaaga gctcggaggt ttgatcgaag 1440

agctccgtcg tggaggctcc aattctgatt ccactcccca ttcctgagtt aggcattcca 1500

atttcccagg acggaggagg ttcttcgtta tccgttgcta agttagtttc cgatttcgat 1560

taatgttcat gaaaattgat caattgttgt ataaaccgat gtgtttgaca aatcctttga 1620

gttaattcaa gtatgaaaga ttatcgtttg aacgagagat gcatattgat tgatgataag 1680

agaaactcac attgattgag ataatataaa actgtaggag aaaaatgcat agtatttgag 1740

attaagagta tgaagatgat gtacaaggaa aactcatagg aaacatctaa gtgtacatca 1800

tcttgatttt gcttctcttt gctctgactc tgacccagaa ttgtgcaaat ctatagcttt 1860

aacactctta ctggtttgat ctctctagtt atttatcaga caggaataca ataaacacca 1920

cactatatgt atgtacctat gtgggaaa 1948

<210> 4

<211> 660

<212> DNA

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 4

aaattcacgg aactttaaca gaaagatgca aaaatcgttc tcgttgatcc aaacagtggc 60

aatctccggc gtattctccg ccgtctcatg ctggtatgga ttcatgttcg gtagagaatc 120

agcgagaaaa gagctcggag gtttgatcga agagctccgt cgtggaggct ccaattctga 180

ttccactccc cattcctgag ttaggcattc caatttccca ggacggagga ggttcttcgt 240

tatccgttgc taagttagtt tccgatttcg attaatgttc atgaaaattg atcaattgtt 300

gtataaaccg atgtgtttga caaatccttt gagttaattc aagtatgaaa gattatcgtt 360

tgaacgagag atgcatattg attgatgata agagaaactc acattgattg agataatata 420

aaactgtagg agaaaaatgc atagtatttg agattaagag tatgaagatg atgtacaagg 480

aaaactcata ggaaacatct aagtgtacat catcttgatt ttgcttctct ttgctctgac 540

tctgacccag aattgtgcaa atctatagct ttaacactct tactggtttg atctctctag 600

ttatttatca gacaggaata caataaacac cacactatat gtatgtacct atgtgggaaa 660

<210> 5

<211> 626

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 5

atatatggtc tcgattggcc ggagattgcc actgttgttt tagagctaga aatagcaagt 60

taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gctttttttt 120

gcaaaatttt ccagatcgat ttcttcttcc tctgttcttc ggcgttcaat ttctggggtt 180

ttctcttcgt tttctgtaac tgaaacctaa aatttgacct aaaaaaaatc tcaaataata 240

tgattcagtg gttttgtact tttcagttag ttgagttttg cagttccgat gagataaacc 300

aatattaatc caaactactg cagcctgaca gacaaatgag gatgcaaaca attttaaagt 360

ttatctaacg ctagctgttt tgtttcttct ctctggtgca ccaacgacgg cgttttctca 420

atcataaaga ggcttgtttt acttaaggcc aataatgttg atggatcgaa agaagagggc 480

ttttaataaa cgagcccgtt taagctgtaa acgatgtcaa aaacatccca catcgttcag 540

ttgaaaatag aagctctgtt tatatattgg tagagtcgac taagagattg actcaccagc 600

atgagacggg tttagagacc aataat 626

<210> 6

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 6

atgcaaaaat cgttctcgtt gatccaaaca tctcatgctg gtgagtgatt gttcccgtct 60

ttcaagctct tcttcttcaa ttctcgtctt cttctctttc catgtctcat ctttagggtt 120

taagctgcct tactcaattt ccaggtatgg attcatgttc ggtagagaat cagcgagaaa 180

agagctcgga ggtttgatcg aagagctccg tcgtggaggc tccaattctg attccactcc 240

ccattcctga 250

<210> 7

<211> 146

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 7

atgcaaaaat cgttctcgtt gatccaaaca tctcatgctg gtatggattc atgttcggta 60

gagaatcagc gagaaaagag ctcggaggtt tgatcgaaga gctccgtcgt ggaggctcca 120

attctgattc cactccccat tcctga 146

<210> 8

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 8

Met Gln Lys Ser Phe Ser Leu Ile Gln Thr Ser His Ala Gly Met Asp

1 5 10 15

Ser Cys Ser Val Glu Asn Gln Arg Glu Lys Ser Ser Glu Val

20 25 30

Claims

1.多肽的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：

D1）多肽在调控植物种子和/或器官大小中的应用；

D2）多肽在制备调控植物种子和/或器官大小的产品中的应用；

D3）多肽在培育种子和/或器官大小增加或降低的植物中的应用；

D4）多肽在制备培育种子和/或器官大小增加或降低的植物的产品中的应用；

D5）多肽在植物育种中的应用；

所述多肽为如下任一种：

A1）氨基酸序列是SEQ ID No.1的多肽；

A2）在A1）的N端和/或C端连接标签得到的融合多肽；

A3）氨基酸序列是SEQ ID No.8的多肽；

A4）在A3）的N端和/或C端连接标签得到的融合多肽。

2.生物材料的应用，其特征在于，所述应用为下述任一一种：

E1）在调控植物种子和/或器官大小中的应用；

E2）在制备调控植物种子和/或器官大小的产品中的应用；

E3）在培育种子和/或器官大小增加或降低的植物中的应用；

E4）在制备培育种子和/或器官大小增加或降低的植物的产品中的应用；

E5）在植物育种中的应用；

所述生物材料为下述任一种：

B1）编码权利要求1中所述多肽的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；

B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；

B5）含有B1）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2）所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6）含有B1）所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2）所述表达盒的转基因植物组织；

B7）含有B1）所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2）所述表达盒的转基因植物器官；

D1）抑制或降低权利要求1中所述多肽编码基因表达的核酸分子；

D2）含有D1）所述核酸分子的表达盒；

D3）含有D1）所述核酸分子的重组载体、或含有D2）所述表达盒的重组载体；

D4）含有D1）所述核酸分子的重组微生物、或含有D2）所述表达盒的重组微生物、或含有D3）所述重组载体的重组微生物；

D5）含有D1）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有D2）所述表达盒的转基因植物细胞系；

D6）含有D1）所述核酸分子的转基因植物组织、或含有D2）所述表达盒的转基因植物组织；

D7）含有D1）所述核酸分子的转基因植物器官、或含有D2）所述表达盒的转基因植物器官。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，B1）所述核酸分子为如下b1）或b2）所示的DNA分子：

b1）编码序列（CDS）是SEQ ID No.2所示的DNA分子或cDNA分子；

b2）核苷酸序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子或cDNA分子。

4.一种增加植物种子和/或器官大小的方法，其特征在于，所述方法包括通过提高或增加植物中权利要求1中所述多肽的表达和/或活性来增加植物种子和/或器官大小。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述提高或增加植物中权利要求1中所述多肽的表达和/或活性通过提高植物中所述多肽的编码基因的表达量实现。

6.一种降低植物种子和/或器官大小的方法，其特征在于，所述方法包括通过抑制或降低植物中权利要求1中所述多肽编码基因的表达和/或权利要求1中所述多肽的活性来降低植物种子和/或器官大小。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述抑制或降低植物中权利要求1中所述多肽编码基因的表达和/或权利要求1中所述多肽的活性的方法为将所述植物基因组中的SEQ ID No.2的第31-58位核苷酸缺失。

8.根据权利要求1-3任一所述的应用或权利要求4-7任一所述的方法，其特征在于，所述植物为下述任一种：

F1）单子叶植物或双子叶植物；

F2）白花菜目植物、禾本目植物或豆目植物；

F3）十字花科植物、禾本科植物或豆科植物；

F4）拟南芥属植物、芸苔属植物、玉蜀黍属、稻属植物、狗尾草属植物、高粱属植物或大豆属植物；

F5）拟南芥、油菜、大白菜、玉米、水稻、谷子、高粱或大豆。

9.权利要求4-7任一所述的方法在培育种子和/或器官大小增加或降低的植物中的应用。

10.权利要求4-7任一所述的方法在植物育种中的应用。