CN110628807B

CN110628807B - 盐角草SePSS蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN110628807B
Application number: CN201810538242.4A
Authority: CN
Inventors: 李银心; 郭杰; 台方; 吕素莲
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2018-05-30
Filing date: 2018-05-30
Publication date: 2021-06-18
Anticipated expiration: 2038-05-30
Also published as: CN110628807A

Abstract

本发明公开了一种盐角草SePSS蛋白及其编码基因与应用。本发明首次通过实验证明，盐角草SePSS基因受盐诱导表达，200mM NaCl处理12h和800mM NaCl处理24h时表达量最高。用SePSS基因互补拟南芥atpss突变体，互补株系的PS含量、细胞质膜极性、叶绿体含量、鲜重和根长等表型都得到恢复，与AtPSS基因的恢复效果相同。150mM NaCl处理下，SePSS过表达株系的鲜重显著高于野生型拟南芥。结果证明，SePSS具有PS合成功能，对细胞质膜的极性维持非常重要，且过表达SePSS基因能提高拟南芥的抗盐性。本工作为抗逆作物遗传改良提供了理论基础和基因资源。

Description

盐角草SePSS蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种盐角草SePSS蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

土壤盐渍化问题在全球范围内普遍存在。盐碱土地对农业生产造成严重的威胁，制约着经济的发展。人们采取了许多措施对盐碱土地进行改良，包括利用水利工程等传统农业手段，但效果不显著。随着生物科学技术的发展，利用基因工程技术对农作物进行改良，提高农作物的耐盐性成为利用盐碱土地的一种有效方法。

细胞质膜是细胞内外物质交换的屏障，在维持稳定的胞内环境、营养吸收、细胞识别和信号传递等方面都发挥着重要的作用。细胞质膜一般保持内负外正的极化状态。当细胞受到盐胁迫时，外界Na⁺大量流入细胞，这些Na⁺所带的正电荷会中和掉细胞质膜近胞质一侧的负电荷，从而导致细胞质膜生发去极化(depolarization)。细胞质膜发生去极化之后，膜上的离子通道被打开，失去了专一性，导致细胞内离子浓度发生变化，破坏了细胞内部的离子平衡，从而对细胞造成渗透胁迫和离子毒害。而质膜上的极性带负电脂类如磷酯酰丝氨酸(PS，phosphatidylserine)和磷脂酰肌醇(PI，phosphatidylinosital)，可以中和掉外界流入的Na⁺所带的正电荷，一定程度上可能减缓细胞膜的去极化，增加植物抵抗盐胁迫的能力。

PS存在于细菌、酵母、植物、哺乳动物细胞中，四种来源的细胞中的PS合酶和PS合成的原理存在一定的差异。PS在植物膜脂中占的比例很小。在绿豆(Vigna radiate L.)中，PS分别占质膜和液泡膜上甘油糖脂的3.1％和4.3％。在许多植物中，PS含有较大比例的长链脂肪酸，这些含有长链脂肪酸的PS分子通过与囊泡结合，保证囊泡从内质网向外运动过程中的稳定性。逆境条件下，植物的PS含量会发生变化，这可能是植物响应逆境的方式之一。低糖和干旱胁迫条件下，胡萝卜(Daucus carota)悬浮细胞和燕麦(Avena sativa)根中的PS含量显著的升高。而对玉米(Zea mays)进行150mM NaCl处理，发现PS含量提高36％。盐生植物狐米草(Spartina patens)进行170mM和340mM NaCl处理后，PS含量增加4倍。

盐角草(Salicornia europaea)是藜科的一种肉质化真盐生植物，广泛分布在沿海和内陆盐湖附近，能够积累高到干重50％的NaCl，被认为是世界上最耐盐的一种高等植物。

发明内容

本发明的目的是提供一种盐角草SePSS蛋白及其编码基因与应用。

本发明提供了一种培育转基因植物的方法(方法甲)，是将磷酯酰丝氨酸合酶的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物耐盐性高于目的植物。

所述方法甲中，所述磷酯酰丝氨酸合酶的编码基因可以通过重组表达载体导入目的植物。所述重组表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到目的植物中。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。使用所述基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用所述基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。

所述重组表达载体具体可为在载体pCAMBIA1301载体或pCAMBIA1300-35S::GFP载体的多克隆位点中插入了磷酯酰丝氨酸合酶的编码基因得到的重组质粒。

所述重组表达载体具体可为将pCAMBIA1301载体的BglⅡ酶切位点之间插入了磷酯酰丝氨酸合酶的编码基因得到的重组质粒。

所述重组表达载体具体可为pCAMBIA1300-35S::GFP载体的BamHΙ酶切位点之间插入了磷酯酰丝氨酸合酶的编码基因得到的重组质粒。

本发明还保护所述方法甲在植物育种中的应用。

所述植物育种是为了选育耐盐性高的植物。

本发明还提供了一种提高植物耐盐性的的方法(方法乙)，是提高目的植物中磷酯酰丝氨酸合酶表达量和/活性，提高植物耐盐性。

本发明还保护所述方法乙在植物育种中的应用。

所述植物育种是为了选育耐盐性高的植物。

本发明还保护磷酯酰丝氨酸合酶，或磷酯酰丝氨酸合酶的编码基因，在调控植物耐盐性中的应用。

本发明还保护磷酯酰丝氨酸合酶，或磷酯酰丝氨酸合酶的编码基因在植物育种中的应用。

所述植物育种是为了选育耐盐性高的植物。

以上任一所述磷酯酰丝氨酸合酶为磷酯酰丝氨酸合酶SePSS或磷酯酰丝氨酸合酶AtPSS1或磷酯酰丝氨酸合酶AtPSS2。

所述磷酯酰丝氨酸合酶SePSS为如下(a1)或(a2)：

(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐盐性相关的由序列1衍生的蛋白质。

为了使(a1)中的磷酯酰丝氨酸合酶SePSS便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(a2)中的磷酯酰丝氨酸合酶SePSS可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(a2)中的磷酯酰丝氨酸合酶SePSS的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

所述磷酯酰丝氨酸合酶AtPSS1为如下(b1)或(b2)：

(b1)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b2)将序列5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐盐性相关的由序列5衍生的蛋白质。

为了使(b1)中的磷酯酰丝氨酸合酶AtPSS1便于纯化和检测，可在由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

上述(b2)中的磷酯酰丝氨酸合酶AtPSS1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b2)中的磷酯酰丝氨酸合酶AtPSS1的编码基因可通过将序列表中序列4所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

所述磷酯酰丝氨酸合酶AtPSS2为如下(c1)或(c2)：

(c1)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(c2)将序列7的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐盐性相关的由序列7衍生的蛋白质。

为了使(c1)中的磷酯酰丝氨酸合酶AtPSS2便于纯化和检测，可在由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

上述(c2)中的磷酯酰丝氨酸合酶AtPSS2可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(c2)中的磷酯酰丝氨酸合酶AtPSS2的编码基因可通过将序列表中序列6所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

以上任一所述磷酯酰丝氨酸合酶的编码基因为SePSS基因或AtPSS1基因或AtPSS2基因。

所述SePSS基因为如下(d1)-(d4)中任一所述的DNA分子：

(d1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

(d2)序列表中序列2所示的DNA分子；

(d3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且编码与植物耐盐性相关蛋白的DNA分子；

(d4)与(1)或(2)或(3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码与植物耐盐性相关蛋白的DNA分子。

所述AtPSS1基因为如下(e1)-(e4)中任一所述的DNA分子：

(e1)编码区如序列表中序列4所示的DNA分子；

(e2)序列表中序列4所示的DNA分子；

(e3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且编码与植物耐盐性相关蛋白的DNA分子；

(e4)与(1)或(2)或(3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码与植物耐盐性相关蛋白的DNA分子。

所述AtPSS2基因为如下(f1)-(f4)中任一所述的DNA分子：

(f1)编码区如序列表中序列6所示的DNA分子；

(f2)序列表中序列6所示的DNA分子；

(f3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且编码与植物耐盐性相关蛋白的DNA分子；

(f4)与(1)或(2)或(3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码与植物耐盐性相关蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

所述任一所述植物具体可为双子叶植物或单子叶植物。

所述双子叶植物可为山柑目植物。所述山柑目植物可为十字花科植物。所述十字花科植物可为南芥族植物。所述南芥族植物可为拟南芥属植物。所述拟南芥属植物具体可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。

所述双子叶植物可为藜科植物。所述藜科植物可为盐角草属植物。所述盐角草属植物具体可为盐角草(S.europeae)。

本发明首次通过实验证明，盐角草SePSS基因受盐诱导表达，200mM NaCl处理12h和800mM NaCl处理24h时表达量最高。用SePSS基因互补拟南芥atpss突变体，互补株系的PS含量、细胞质膜极性、叶绿体含量、鲜重和根长等表型都得到恢复，与AtPSS基因的恢复效果相同。150mM NaCl处理下，SePSS过表达株系的鲜重显著高于野生型拟南芥。这些结果说明，SePSS具有PS合成功能，对细胞质膜的极性维持非常重要，且过表达SePSS基因能提高拟南芥的抗盐性。本工作为抗逆作物遗传改良提供了理论基础和基因资源。

附图说明

图1为盐处理下SePSS基因表达模式分析。

图2为SePSS蛋白的亚细胞定位。

图3为拟南芥突变体和部分转基因株系的PSS基因转录本相对含量。

图4为拟南芥不同株系细胞和质膜PS含量。

图5为NaCl处理下拟南芥野生型、突变体、过表达和互补株系质膜极性测定。

图6为拟南芥野生型、突变体和互补株系对NaCl的耐受能力。

图7为拟南芥野生型和过表达株系对NaCl的耐受能力。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

盐角草(S.europeae)种子：江苏省大丰市晶隆海洋产业发展有限公司。

pCAMBIA1300-35S::GFP载体：参考文献：Juanjuan Feng,Pengxiang Fan,PingJiang,Sulian Lv,Xianyang Chen,Yinxin Li(2013)Chloroplast-targeted Hsp90playsessential roles in plastid development and embryogenesis in Arabidopsispossibly linking with VIPP1.Physiologia Plantarum,150(2):292-307.；公众可以从中国科学院植物研究所获得。

pCAMBIA2300载体：请提供购买途径或文献。长沙赢润生物技术有限公司

C58农杆菌：参考文献：Hongmiao Song,Pengxiang Fan,Yinxin Li(2009)Overexpression of Organellar and Cytosolic AtHSP90in Arabidopsis thalianaImpairs Plant Toleranceto Oxidative Stress.Plant Mol Biol Rep,27:342–349.；公众可以从中国科学院植物研究所获得。

本生烟草(Nicotiana benthamiana)：参考文献：Xianyang Chen,HexigedulengBao,Jie Guo,Weitao Jia,Fang Tai,Lingling Nie,Ping Jiang,Juanjuan Feng,SulianLv,Yinxin Li(2014)Na⁺/H⁺exchanger 1participates in tobacco disease defenceagainst Phytophthora parasitica var.nicotianae by affecting vacuolar pH andpriming the antioxidative system.J Exp Bot,65:6107-6122.；公众可以从中国科学院植物研究所获得。

pCAMBIA1301载体：北京华越洋生物公司。

野生型拟南芥(Col-0)：参考文献：Juanjuan Feng,Pengxiang Fan,Ping Jiang,Sulian Lv,Xianyang Chen,Yinxin Li(2013)Chloroplast-targeted Hsp90playsessential roles in plastid development and embryogenesis in Arabidopsispossibly linking with VIPP1.PhysiologiaPlantarum,150(2):292-307.；公众可以从中国科学院植物研究所获得。

拟南芥功能缺失突变体atpss(SALK_128223)：Arabidopsis BiologicalResource Center(ARBC)。经全基因组测序，拟南芥功能缺失突变体除atpss基因以外的序列均同哥伦比亚生态型拟南芥。

实施例1、盐角草SePSS蛋白及其编码基因的发现

提取盐角草地上部分的总RNA，并反转录为cDNA。经过大量序列分析、表达量分析与功能验证，从cDNA中发现了一个磷酯酰丝氨酸合酶的DNA编码序列，如序列表的序列2所示，其编码的蛋白质如序列表的序列1所示。

将序列表的序列1所示的蛋白质命名为SePSS蛋白，由425个氨基酸残基组成，该蛋白具有九个跨膜区域，无信号肽。将编码SePSS蛋白的基因命名为SePSS基因，其CDS全长1728bp。

实施例2、SePSS基因的表达分析

将盐角草种子播种30天后，取长势一致的幼苗，分别用含有不同浓度NaCl(0、200或800mM)的1/2Hoagland营养液培养不同时间(0、3、6、12、24、72或168小时)，取地上部分用于基因表达检测。

提取地上部分的总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板，采用实时定量PCR(Real-time quantitative PCR，qRT-PCR)的方法检测SePSS基因的表达情况(使用引物SePSS-qPCR-Forward和引物SePSS-qPCR-Reversed组成的引物对进行检测)，用α-tubulin基因作为内参(使用引物α-tubulin-qPCR-Forward和引物α-tubulin-qPCR-Reversed组成的引物对进行检测)。

α-tubulin-qPCR-Forward：5'-CGAAAGTTGGGGGCTCGAAG-3'；

α-tubulin-qPCR-Reversed：5'-CCCCGGAACCCAAAGACTTTG-3'；

SePSS-qPCR-Forward：5'-GCGATGATGCTCGGTTGTTC-3'；

SePSS-qPCR-Reversed：5'-TTCGTCAAAGACTGTGTCATAA-3'。

结果如图1所示。结果表明，200和800mM NaCl处理时，SePSS基因在盐角草地上部分的表达量呈现先升高后降低的趋势。200mM NaCl处理12h和800mM NaCl处理24h时SePSS表达量最高。

实施例3、SePSS蛋白亚细胞定位

1、pCAMBIA1300-35S::SePSS-GFP载体：将序列表的序列2所述的双链DNA分子插入pCAMBIA1300-35S::GFP载体的BamHΙ酶切位点之间，得到pCAMBIA1300-35S::SePSS-GFP载体(已经测序验证)。

2、pCAMBIA2300-35S::HDEL-mCherry载体：采用序列表的序列3(HDEL-mCherry片段)所述的双链DNA分子替换pCAMBIA2300载体的SalΙ和HindⅢ酶切位点之间的片段，得到pCAMBIA2300-35S::HDEL-mCherry载体(已经测序验证)。

3、将pCAMBIA1300-35S::SePSS-GFP载体导入C58农杆菌，得到重组菌35S::SePSS-GFP。将重组菌35S::SePSS-GFP接种于含有20μM AS、10mM MES、100μM Kan和100μM Rif的LB液体培养基中振荡培养(28℃，180rpm)至OD₆₀₀＝1.8。将培养体系离心后收集菌体，用含有200μM AS、10mM MgCl₂和10mM MES的蒸馏水重悬菌体至菌液OD_600nm＝1.4-1.6，静置5-6h，得到重组菌35S::SePSS-GFP菌液。

4、将pCAMBIA2300-35S::HDEL-mCherry载体导入C58农杆菌，得到重组菌35S::HDEL-mCherry。将重组菌35S::HDEL-mCherry接种于含有20μM AS、10mM MES、100μM Kan和100μM Rif的LB液体培养基中振荡培养(28℃，180rpm)至OD₆₀₀＝1.8。将培养体系离心后收集菌体，用含有200μM AS、10mM MgCl₂和10mM MES的蒸馏水重悬菌体至菌液OD_600nm＝1.4-1.6，静置5-6h，得到重组菌35S::HDEL-mCherry菌液。

5、将1体积份的重组菌35S::SePSS-GFP菌液和1体积份的重组菌35S::HDEL-mCherry菌液混合后注射到本生烟草叶片中，烟草正常培养2天后，用激光扫描共聚焦显微镜观察蛋白亚细胞定位。

结果如图2所示。结果表明，GFP融合蛋白发出的绿色荧光与mCherry融合蛋白发出的红色荧光重叠，说明SePSS蛋白定位在内质网上。

实施例4、SePSS蛋白及其编码基因的应用

一、表达载体的构建

1、pCAMBIA1301-35S::SePSS载体：将序列表的序列2所示的双链DNA分子(SePSS1基因)插入pCAMBIA1301载体的BamHΙ酶切位点之间，得到pCAMBIA1301-35S::SePSS1载体(已经测序验证)。

2、pCAMBIA1301-35S::AtPSS1载体：将序列表的序列4所示的双链DNA分子(AtPSS1基因)插入pCAMBIA1301载体的BglⅡ酶切位点之间，得到pCAMBIA1301-35S::AtPSS1载体(已经测序验证)。

3、pCAMBIA1301-35S::AtPSS2载体：将序列表的序列6所示的双链DNA分子(AtPSS2基因)插入pCAMBIA1301载体的BglⅡ酶切位点之间，得到pCAMBIA1301-35S::AtPSS2载体(已经测序验证)。

AtPSS1和AtPSS2为拟南芥中磷酯酰丝氨酸合酶基因的两个转录本。

序列表的序列4所示的双链DNA分子编码序列表的序列5所示的蛋白质(AtPSS1蛋白)。

序列表的序列6所示的双链DNA分子编码序列表的序列7所示的蛋白质(AtPSS2蛋白)。

二、转基因拟南芥的构建

1、将pCAMBIA1301-35S::SePSS载体导入C58农杆菌，得到重组菌35S::SePSS。将重组菌35S::SePSS利用农杆菌介导的浸花法转化野生型拟南芥(Col-0)，得到T₀代转SePSS拟南芥。将T₀代转SePSS拟南芥的种子经表面灭菌后均匀地撒播于含50mg/L Hyg的1/2MS固体培养基上，首先4℃暗培养2天，然后22℃光照(16h光照/8h黑暗)培养5-10天后，将存活苗移至培养土中生长至种子成熟。重复此步骤，直到获得T₃代转基因纯合株系(OES1、OES2和OES3)。

2、将pCAMBIA1301-35S::SePSS载体导入C58农杆菌，得到重组菌35S::SePSS。将重组菌35S::SePSS利用农杆菌介导的浸花法转化拟南芥功能缺失突变体atpss，得到T₀代SePSS互补拟南芥。将T₀代SePSS互补拟南芥的种子经表面灭菌后均匀地撒播于含50mg/LHyg的1/2MS固体培养基上，首先4℃暗培养2天，然后22℃光照(16h光照/8h黑暗)培养5-10天后，将存活苗移至培养土中生长至种子成熟。重复此步骤，直到获得T₃代转基因纯合株系(CS)。

3、将pCAMBIA1301-35S::AtPSS1载体导入C58农杆菌，得到重组菌35S::AtPSS1。将重组菌35S::AtPSS1利用农杆菌介导的浸花法转化野生型拟南芥(Col-0)，得到T₀代转AtPSS1拟南芥。将T₀代转AtPSS1拟南芥的种子经表面灭菌后均匀地撒播于含50mg/L Hyg的1/2MS固体培养基上，首先4℃暗培养2天，然后22℃光照(16h光照/8h黑暗)培养5-10天后，将存活苗移至培养土中生长至种子成熟。重复此步骤，直到获得T₃代转基因纯合株系(OEA1-1、OEA1-2和OEA1-3)。

4、将pCAMBIA1301-35S::AtPSS1载体导入C58农杆菌，得到重组菌35S::AtPSS1。将重组菌35S::AtPSS1利用农杆菌介导的浸花法转化拟南芥功能缺失突变体atpss，得到T₀代AtPSS1互补拟南芥。将T₀代AtPSS1互补拟南芥的种子经表面灭菌后均匀地撒播于含50mg/LHyg的1/2MS固体培养基上，首先4℃暗培养2天，然后22℃光照(16h光照/8h黑暗)培养5-10天后，将存活苗移至培养土中生长至种子成熟。重复此步骤，直到获得T₃代转基因纯合株系(CA1)。

5、将pCAMBIA1301-35S::AtPSS2载体导入C58农杆菌，得到重组菌35S::AtPSS2。将重组菌35S::AtPSS2利用农杆菌介导的浸花法转化野生型拟南芥(Col-0)，得到T₀代转AtPSS2拟南芥。将T₀代转AtPSS2拟南芥的种子经表面灭菌后均匀地撒播于含50mg/L Hyg的1/2MS固体培养基上，首先4℃暗培养2天，然后22℃光照(16h光照/8h黑暗)培养5-10天后，将存活苗移至培养土中生长至种子成熟。重复此步骤，直到获得T₃代转基因纯合株系(OEA2-1、OEA2-2和OEA2-3)。

6、将pCAMBIA1301-35S::AtPSS2载体导入C58农杆菌，得到重组菌35S::AtPSS2。将重组菌35S::AtPSS2利用农杆菌介导的浸花法转化拟南芥功能缺失突变体atpss，得到T₀代AtPSS2互补拟南芥。将T₀代AtPSS2互补拟南芥的种子经表面灭菌后均匀地撒播于含50mg/LHyg的1/2MS固体培养基上，首先4℃暗培养2天，然后22℃光照(16h光照/8h黑暗)培养5-10天后，将存活苗移至培养土中生长至种子成熟。重复此步骤，直到获得T₃代转基因纯合株系(CA2)。

7、采用pCAMBIA1301载体替代pCAMBIA1301-35S::SePSS载体，分别按照步骤1和步骤2进行操作，分别得到转空载体对照1和转空载体对照2。

三、转基因拟南芥的基因表达检测

待测植株：野生型拟南芥(Col-0)、拟南芥功能缺失突变体atpss、T₃代转基因纯合株系(OES1、OES2和OES3)、T₃代转基因纯合株系(CS)、T₃代转基因纯合株系(OEA1-1、OEA1-2和OEA1-3)、T₃代转基因纯合株系(CA1)、T₃代转基因纯合株系(OEA2-1、OEA2-2和OEA2-3)、T₃代转基因纯合株系(CA2)、和T₃代转空载体对照1和2。

将待测植株的种子表面灭菌后，播种于1/2MS固体培养基上，4℃暗培养2天，然后22℃光照培养(16h光照/8h黑暗)三周。每个株系各取10株(约100ng)，提取总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板，采用实时定量PCR(Real-time quantitative PCR，qRT-PCR)的方法检测SePSS基因的表达情况(使用引物SePSS-qPCR-Forward和引物SePSS-qPCR-Reversed组成的引物对进行检测)或AtPSS1基因的表达情况(使用引物AtPSS1-qPCR-Forward和引物AtPSS1-qPCR-Reversed组成的引物对进行检测)或AtPSS2基因的表达情况(使用引物AtPSS2-qPCR-Forward和引物AtPSS2-qPCR-Reversed组成的引物对进行检测)，用α-tubulin基因作为内参(使用引物α-tubulin-qPCR-Forward和引物α-tubulin-qPCR-Reversed组成的引物对进行检测)，通过2^-ΔΔCt的方法对基因表达进行相对定量。

actin-qPCR-Forward：5'-ATATGCCTATCTACAGGGTT-3'；

actin-qPCR-Reversed：5'-ATACAATTTCCCGTTCTGCTGT-3'；

SePSS-qPCR-Forward：5'-GCGATGATGCTCGGTTGTTC-3'；

SePSS-qPCR-reversed：5'-TTCGTCAAAGACTGTGTCATAA-3'；

AtPSS1-qPCR-Forward：5'-TGAAGTTTCTCCACCCTGACC-3'；

AtPSS1-qPCR-reversed：5'-TTGAAAGCACCCAAAGAAGC-3'；

AtPSS2-qPCR-Forward：5'-GGCTCTTCCAGATGTTGTTAC-3'；

AtPSS2-qPCR-reversed：5'-CGCAGTGGCAGTTGAGTTAT-3'。

结果如图3所示。结果表明，所有转基因株系的PSS基因表达量都发生了不同程度的上调，表明SePSS、AtPSS1和AtPSS2基因已经转入拟南芥，并能稳定表达，而atpss则发生了显著的下调，说明了T-DNA插入导致了拟南芥的PSS基因在转录水平上受到了抑制。转空载体对照1株系中SePSS、AtPSS1和AtPSS2基因表达量与野生型相比均无变化，转空载体对照2株系的SePSS、AtPSS1和AtPSS2基因表达量与突变体atpss相比均无变化。

四、转基因拟南芥的质膜蛋白含量、PS含量及极性检测

待测植株：野生型拟南芥(WT)、拟南芥功能缺失突变体atpss、T₃代转基因纯合株系(OES1、OES2和OES3)、T₃代转基因纯合株系(CS)、T₃代转基因纯合株系(OEA1-1、OEA1-2和OEA1-3)、T₃代转基因纯合株系(CA1)、T₃代转基因纯合株系(OEA2-1、OEA2-2和OEA2-3)和T₃代转基因纯合株系(CA2)和T₃代转空载体对照1和2。

1、将待测植株的种子表面灭菌后，播种于1/2MS固体培养基上，4℃暗培养2天，然后22℃光照培养(16h光照/8h黑暗)三周。参照文献：Tang W(2012)Quantitative analysisof plasma membrane proteome using two-dimensional difference gelelectrophoresis.Plant Signalling Networks,Springer,67-82.中的方法提取质膜，使用Modified Bradford Protein Assay Kit(生工生物公司)测定质膜蛋白含量。使用PlantPS ELISA KIT(R&D_Systems，USA)测定细胞和质膜PS含量。结果见图4。结果表明，无论在细胞还是质膜当中，与野生型拟南芥相比，过表达株系和互补株系的PS含量变化不大；而突变体株系中的PS含量显著的低于野生型。转空载体对照1株系的检测结果与野生型无显著差异，转空载体对照2株系的检测结果与突变体无显著差异。

2、取3周大的待测植株幼苗的叶片，用含有NaCl(0或200mM)和1μM DiBAC4(3)(Molecular Probes，USA)的溶液染色10min后，用莱卡激光扫描共聚焦显微镜观察DiBAC4(3)荧光，激发光为488nm，发射光为500-550nm(参照文献：Konrad KR and Hedrich R(2008)The use of voltage-sensitive dyes to monitor signal-induced changes inmembrane potential-ABA triggered membrane depolarization in guard cells.PlantJournal,55(1):161-73.)。

结果见图5。结果显示未进行盐处理时，野生型、突变体、过表达和互补株系幼苗的质膜均没有绿色荧光产生，说明它们没有发生明显的去极化现象；而200mM NaCl处理下，所有株系幼苗的质膜均有不同程度的绿色荧光产生，说明此时所有株系均发生了不同程度的去极化现象，尤其是突变体幼苗，其发出的荧光最强，说明其发生了很强的去极化作用。过表达株系、互补株系和野生型幼苗的发出的绿色荧光水平比较一致，说明了它们质膜的去极化水平相似。转空载体对照1株系的检测结果与野生型无显著差异，转空载体对照2株系的检测结果与突变体无显著差异。

五、转基因拟南芥的耐盐性检测

待测植株：野生型拟南芥(WT)、拟南芥功能缺失突变体atpss、T₃代转基因纯合株系(OES1、OES2和OES3)、T₃代转基因纯合株系(CS)、T₃代转基因纯合株系(OEA1-1、OEA1-2和OEA1-3)、T₃代转基因纯合株系(CA1)、T₃代转基因纯合株系(OEA2-1、OEA2-2和OEA2-3)和T₃代转基因纯合株系(CA2)、T₃代转空载体对照1和2。

将待测植株的种子表面灭菌后，播种于1/2MS固体培养基上，4℃暗培养2天，然后22℃光照培养(16h光照/8h黑暗)三周。挑取生长一致的小苗分别转到含有0和150mM NaCl的1/2MS培养基上进行竖直培养。处理7天后，测定植株主根长、鲜重及叶绿素含量。

叶绿素含量检测方法：用80％丙酮浸提法提取叶片叶绿素，分光光度计法分别测定D645和D663，按以下公式计算叶绿素含量：C_T＝20.29D₆₄₅+8.05D₆₆₃。)。

结果见图6和图7。结果表明，野生型、突变体和转基因株系在1/2MS培养基上的生长状况基本一致，而在150mM NaCl胁迫条件下则有很大的区别。在盐胁迫下，野生型、突变体和转基因幼苗生长都受到了抑制。其中互补株系在总叶绿素含量，地上部分鲜重和根长方面与野生型表型表现一致，无显著性差异；而突变体则在总叶绿素含量，地上部分鲜重和根长方面显著的低于野生型和互补株系。过表达株系在总叶绿素含量和根长方面方面与野生型相比没有显著性差异，但地上部分鲜重则显著的大于野生型，说明过表达拟南芥的抗盐性有一定程度增强。转空载体对照1株系的检测结果与野生型无显著差异，转空载体对照2株系的检测结果与突变体无显著差异。

序列表

<110> 中国科学院植物研究所

<120> 盐角草SePSS蛋白及其编码基因与应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 425

<212> PRT

<213> 盐角草(S. europeae)

<400> 1

Met Glu Pro Asp Ser Cys Arg Arg Ile Ser Arg Lys Asp Ile Asn His

1 5 10 15

Thr Asn Gly Asp Ala Ser Tyr Ser Cys Ala Asp Asp Glu Leu Asp Pro

20 25 30

Trp Thr Ala Trp Ala Tyr Lys Pro Arg Thr Ile Thr Leu Leu Phe Ile

35 40 45

Gly Ala Cys Phe Leu Ile Trp Ala Ser Gly Ala Leu Asp Pro Asp Ser

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Asp Val Val Thr Ser Val Lys Arg Gly Val Trp Ala

65 70 75 80

Met Ile Ala Val Phe Leu Thr Tyr Cys Leu Leu Gln Ala Pro Ser Thr

85 90 95

Val Leu Ile Arg Pro His Pro Ala Ile Trp Arg Leu Val His Gly Ile

100 105 110

Ala Val Ile Tyr Leu Val Ala Leu Thr Phe Leu Leu Phe Gln Lys Arg

115 120 125

Asp Asp Ala Arg Leu Phe Met Lys Tyr Leu His Ser Asp Leu Gly Val

130 135 140

Glu Leu Pro Glu Arg Ser Tyr Gly Ser Asp Cys Arg Ile Tyr Val Pro

145 150 155 160

Glu Asp Pro Thr Asn Arg Phe Arg Asn Leu Tyr Asp Thr Val Phe Asp

165 170 175

Glu Phe Phe Leu Ala His Ile Leu Gly Trp Trp Gly Lys Ala Ile Met

180 185 190

Ile Arg Asn Gln Pro Leu Cys Trp Val Leu Ser Ile Gly Phe Glu Met

195 200 205

Met Glu Val Thr Phe Arg His Met Leu Pro Asn Phe Asn Glu Cys Trp

210 215 220

Trp Asp Ser Ile Ile Leu Asp Ile Leu Leu Cys Asn Trp Phe Gly Ile

225 230 235 240

Trp Thr Gly Met Arg Thr Val Lys Tyr Phe Asp Gly Lys Thr Tyr Glu

245 250 255

Trp Val Gly Ile Ser Arg Gln Pro Asn Ile Met Gly Lys Val Lys Arg

260 265 270

Thr Leu Gly Gln Phe Thr Pro Ala Arg Trp Asp Lys Asp Glu Trp His

275 280 285

Pro Leu Leu Gly Pro Trp Arg Phe Val Gln Val Leu Phe Leu Cys Leu

290 295 300

Val Phe Leu Thr Val Glu Leu Asn Thr Phe Phe Leu Lys Phe Cys Leu

305 310 315 320

Trp Ile Pro Pro Ser Asn Pro Ile Ile Thr Tyr Arg Leu Ile Leu Trp

325 330 335

Trp Leu Ile Ala Val Pro Thr Ile Arg Glu Tyr Asn Ser Tyr Leu Gln

340 345 350

Asp Arg Lys Gln Val Lys Lys Val Gly Ala Leu Cys Trp Leu Ala Leu

355 360 365

Ala Ile Cys Ile Val Glu Leu Leu Ile Cys Ile Lys Phe Gly His Gly

370 375 380

Leu Tyr Pro Asn Leu Met Pro Ile Trp Leu Val Ile Phe Trp Ser Ser

385 390 395 400

Phe Gly Val Val Leu Leu Met Phe Leu Val Ile Trp Thr Trp Lys Leu

405 410 415

His Lys Tyr Ser Glu Lys Lys Lys Gln

420 425

<210> 2

<211> 1278

<212> DNA

<213> 盐角草(S. europeae)

<400> 2

atggaacctg atagttgtag gaggatcagc cgaaaggata tcaaccatac aaatggcgat 60

gcaagctact catgtgctga tgatgaactt gatccttgga ctgcttgggc ttataagcct 120

cgcacaataa ctttgttgtt tattggtgct tgtttcctta tctgggctag tggagctctt 180

gatcctgaca gcagcagatc tggtgatgtg gttacatcag tcaaaagggg tgtatgggca 240

atgattgcag tttttcttac ttactgcttg ttacaagcac catcaacggt ccttatacga 300

ccacatcctg caatttggcg cttagttcac ggaattgctg ttatttacct tgttgctctg 360

acgtttttgc ttttccagaa gcgcgatgat gctcggttgt tcatgaaata tctccattca 420

gatttaggtg ttgaacttcc tgaaagatct tatggctcag attgccgaat atatgttcct 480

gaagacccca ccaacaggtt tagaaacctt tatgacacag tctttgacga atttttccta 540

gctcatattc tcggatggtg gggcaaggca atcatgattc ggaatcaacc tttgtgctgg 600

gtattatcaa ttggttttga aatgatggag gtcaccttcc gtcatatgct accaaatttc 660

aacgagtgtt ggtgggacag tattattctg gacatcctgc tctgcaattg gtttggcatt 720

tggactggta tgcgtactgt gaagtatttc gatgggaaaa catatgagtg ggtaggaata 780

agtcgccagc caaatataat gggcaaggta aaacgtactt tggggcaatt cacacctgca 840

cgatgggata aagatgaatg gcatccgcta cttggtcctt ggcgttttgt ccaagttctg 900

ttcctttgcc ttgtgttttt gacagtggag ttgaatacat tttttctgaa gttttgtctc 960

tggattcctc ccagcaatcc tattatcact tataggttaa ttttatggtg gctaattgct 1020

gttcctacta tccgagaata taattcctat ctacaggaca gaaaacaagt aaagaaggta 1080

ggggcattat gttggcttgc cttggctatt tgcattgttg agctactcat ctgtattaag 1140

tttgggcatg gattataccc aaatctaatg cctatatggt tggtgatttt ttggtcatca 1200

tttggagtag tacttctgat gtttttggta atatggacat ggaaattgca caagtattca 1260

gaaaagaaga aacaatga 1278

<210> 3

<211> 734

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catgatgagc ttatggtgag caagggcgag gaggataaca tggccatcat caaggagttc 60

atgcgcttca aggtgcatat ggagggctcc gtgaacggcc acgagttcga gatcgagggc 120

gagggcgagg gccgccccta cgagggcacc cagaccgcca agctgaaggt gaccaagggt 180

ggccccctgc ccttcgcctg ggacatcctg tcccctcagt tcatgtacgg ctccaaggcc 240

tacgtgaagc accccgccga catccccgac tacttgaagc tgtccttccc cgagggcttc 300

aagtgggagc gcgtgatgaa cttcgaggac ggcggcgtgg tgaccgtgac ccaggactcc 360

tccctgcagg acggcgagtt catctacaag gtgaagctgc gcggcaccaa cttcccctcc 420

gacggccccg taatgcagaa gaagaccatg ggctgggagg cctcctccga gcggatgtac 480

cccgaggacg gcgccctgaa gggcgagatc aagcagaggc tgaagctgaa ggacggcggc 540

cactacgacg ctgaggtcaa gaccacctac aaggccaaga agcccgtgca gctgcccggc 600

gcctacaacg tcaacatcaa gttggacatc acctcccaca acgaggacta caccatcgtg 660

gaacagtacg aacgcgccga gggccgccac tccaccggcg gcatggacga gctgtacaag 720

tagagatcca ctag 734

<210> 4

<211> 1362

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 4

atggaaccca atgggtacag gaaagaaaga agaaaggaac aacatttggg gagaatgaat 60

ggtggtggtg gtgatgttga gactgatctt gatccatgga ctgcatgggc ttacaagcct 120

cgcactatct ctcttctcct tattggcgct tgttttctca tttgggctag tggagctctt 180

gatcctgaca gcactacatc tgatgatctt gtcacttctg tcaaaagggg agtgtgggct 240

atgatcgctg tctttcttgc ttactctttg ctccaggccc cttcaacggt tctaatcagg 300

ccccatcctg caatctggcg cttagttcat ggaatggccg tcatttactt agttgcactt 360

acttttttgc tctttcagag acgtgatgat gcacggcagt tcatgaagtt tctccaccct 420

gaccttggaa tagaacttcc tgagaaatca tacggtgctg attgccgtat atatgtgcct 480

gatcacccaa caaacaggtt taagaatctt tatgacacag tatttgatga gtttttcttg 540

gctcacatct ttggttggtg ggggaaagca attctgatcc ggaaccagcc gcttctttgg 600

gtgctttcaa ttggttttga gttattggag gttacttttc ggcatatgtt accaaatttc 660

aacgagtgct ggtgggacag tattgttctt gatatcttga tatgcaactg gtttggtatc 720

tgggcaggaa tgtatacagt tcgatatttt gatggaaaaa catatgagtg ggttggcatt 780

agccgccagc ctaacattat tggcaaagtg aaaaggacac tggggcagtt cacaccagct 840

cactgggaca aagacgagtg gcatccgctg cagggacctt ggcgttttat tcaagtactc 900

actctttgca tcatattctt gacagtggag ctgaacacat tctttctcaa gtttagcctg 960

tggatccccc ctcgaaaccc agtgattctc tataggctga tcttgtggtg gctcatagcg 1020

ataccaacaa cacgggagta caattcatat cttcaagaca gaaaacctgt gaaaaaggtg 1080

ggagcattct gttggctgtc actggggata tgcatagtag aacttctcat ctgcatcaag 1140

tttggaagtg gtaggattgt acccaacaga aatgccattg tgggtagtga cactatgggg 1200

aagtgtggga cttggacttg tggccttctt gctgtcttgg acatggaaga tccagaagat 1260

cctcgcgcaa aagagacgtt aagcgcatca ttattgttgc agcagagacg agagagaaat 1320

agaggtgaga cagtgaaatg ccattgtggt ttttttttgt aa 1362

<210> 5

<211> 453

<212> PRT

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 5

Met Glu Pro Asn Gly Tyr Arg Lys Glu Arg Arg Lys Glu Gln His Leu

1 5 10 15

Gly Arg Met Asn Gly Gly Gly Gly Asp Val Glu Thr Asp Leu Asp Pro

20 25 30

Trp Thr Ala Trp Ala Tyr Lys Pro Arg Thr Ile Ser Leu Leu Leu Ile

35 40 45

Gly Ala Cys Phe Leu Ile Trp Ala Ser Gly Ala Leu Asp Pro Asp Ser

50 55 60

Thr Thr Ser Asp Asp Leu Val Thr Ser Val Lys Arg Gly Val Trp Ala

65 70 75 80

Met Ile Ala Val Phe Leu Ala Tyr Ser Leu Leu Gln Ala Pro Ser Thr

85 90 95

Val Leu Ile Arg Pro His Pro Ala Ile Trp Arg Leu Val His Gly Met

100 105 110

Ala Val Ile Tyr Leu Val Ala Leu Thr Phe Leu Leu Phe Gln Arg Arg

115 120 125

Asp Asp Ala Arg Gln Phe Met Lys Phe Leu His Pro Asp Leu Gly Ile

130 135 140

Glu Leu Pro Glu Lys Ser Tyr Gly Ala Asp Cys Arg Ile Tyr Val Pro

145 150 155 160

Asp His Pro Thr Asn Arg Phe Lys Asn Leu Tyr Asp Thr Val Phe Asp

165 170 175

Glu Phe Phe Leu Ala His Ile Phe Gly Trp Trp Gly Lys Ala Ile Leu

180 185 190

Ile Arg Asn Gln Pro Leu Leu Trp Val Leu Ser Ile Gly Phe Glu Leu

195 200 205

Leu Glu Val Thr Phe Arg His Met Leu Pro Asn Phe Asn Glu Cys Trp

210 215 220

Trp Asp Ser Ile Val Leu Asp Ile Leu Ile Cys Asn Trp Phe Gly Ile

225 230 235 240

Trp Ala Gly Met Tyr Thr Val Arg Tyr Phe Asp Gly Lys Thr Tyr Glu

245 250 255

Trp Val Gly Ile Ser Arg Gln Pro Asn Ile Ile Gly Lys Val Lys Arg

260 265 270

Thr Leu Gly Gln Phe Thr Pro Ala His Trp Asp Lys Asp Glu Trp His

275 280 285

Pro Leu Gln Gly Pro Trp Arg Phe Ile Gln Val Leu Thr Leu Cys Ile

290 295 300

Ile Phe Leu Thr Val Glu Leu Asn Thr Phe Phe Leu Lys Phe Ser Leu

305 310 315 320

Trp Ile Pro Pro Arg Asn Pro Val Ile Leu Tyr Arg Leu Ile Leu Trp

325 330 335

Trp Leu Ile Ala Ile Pro Thr Thr Arg Glu Tyr Asn Ser Tyr Leu Gln

340 345 350

Asp Arg Lys Pro Val Lys Lys Val Gly Ala Phe Cys Trp Leu Ser Leu

355 360 365

Gly Ile Cys Ile Val Glu Leu Leu Ile Cys Ile Lys Phe Gly Ser Gly

370 375 380

Arg Ile Val Pro Asn Arg Asn Ala Ile Val Gly Ser Asp Thr Met Gly

385 390 395 400

Lys Cys Gly Thr Trp Thr Cys Gly Leu Leu Ala Val Leu Asp Met Glu

405 410 415

Asp Pro Glu Asp Pro Arg Ala Lys Glu Thr Leu Ser Ala Ser Leu Leu

420 425 430

Leu Gln Gln Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gly Glu Thr Val Lys Cys His

435 440 445

Cys Gly Phe Phe Leu

450

<210> 6

<211> 1419

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 6

atggcttcta caggtggtgg gaaagatgga tctaaaggtt ttgtgaagag ggttacatca 60

actttctcca ttaggaaaaa gaagaacaca acaagtgatc caaaactact tcttcctcga 120

tcgaaatcaa ccggtgctaa ctatgaatct atgaggctac ctcaggggaa aaaggctctt 180

ccagatgttg ttacaacaaa agacacaaag agaaccaaat ctgcaggtgt ttcgccacaa 240

ccaagacgtg aaaagattga tgaatccggt aaacagttta tgaaggtgag atgttttgat 300

gacagtgact ccatttggtt atcttcagat tgtgcctctc ctacgtctct tttagaggaa 360

cgtagattat ctgtctcgtt tcatttctca gtagacgaaa agatcgtctc gtggttgtcc 420

agtgtggcta actcttctct gtctttaaat caagaatcca ccagctcaaa caaagagaat 480

catcatcaaa aaagttcaaa gaacacaaaa acttctttag aaaacgttcg aaaagatgga 540

aaagtttgca actcatcagc tgggaaagct cgtggtactg gttctgcaaa gccgtcttta 600

ccagaaagca acaacaagac ttgtcctcag aaacaatgtg aagagtcatc tatttccaac 660

agatttgtga ctcttgaaga aaagaaagtt agcttctcag tagcaaaaac agagaagtct 720

ccttcaccag ataactcaac tgccactgcg acatcatcat taaagaagag tgcagagatt 780

ggggtcacaa agagtaagat tgttgtggag ccactttttt ggccatttga gcagaagttt 840

gattggacac cagaggatat tttaaagcat ttttcaatgt ctccgaggag aaagaagtcg 900

ctaggatcca agattgcagg tacctctcca agatcaatga gggcacaact ccaaacaaga 960

aagctagatc taaaagaagg gtgtaagaga aagctcatgt tcaacggtcc tggatcaaat 1020

tcaaaaccaa caagaatccc agaactaaac agaacaatca gcaatagcag caacaatagt 1080

agcatgaaga aaaccgagat cagcaagaac caacaaccta taaggaacag tgtgaagaga 1140

aacaaaagtt taccgtcgag gttgagaaaa tcgagcaaaa tatcttcaaa ggtggtacct 1200

attgaagctg cggaagagag tggagaaata gttaaagagc aaaaaacacc taagaagctc 1260

atcatgaccc gcaagtccag gacattctta gaagatgact ttgctttaat gaatgatttc 1320

tctatagaaa aggcggtcgg gctttgcgag tttaagggaa gagaaggcat agattcagat 1380

ttcaacactg atggtttctt gttcgacgat tctctatga 1419

<210> 7

<211> 472

<212> PRT

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 7

Met Ala Ser Thr Gly Gly Gly Lys Asp Gly Ser Lys Gly Phe Val Lys

1 5 10 15

Arg Val Thr Ser Thr Phe Ser Ile Arg Lys Lys Lys Asn Thr Thr Ser

20 25 30

Asp Pro Lys Leu Leu Leu Pro Arg Ser Lys Ser Thr Gly Ala Asn Tyr

35 40 45

Glu Ser Met Arg Leu Pro Gln Gly Lys Lys Ala Leu Pro Asp Val Val

50 55 60

Thr Thr Lys Asp Thr Lys Arg Thr Lys Ser Ala Gly Val Ser Pro Gln

65 70 75 80

Pro Arg Arg Glu Lys Ile Asp Glu Ser Gly Lys Gln Phe Met Lys Val

85 90 95

Arg Cys Phe Asp Asp Ser Asp Ser Ile Trp Leu Ser Ser Asp Cys Ala

100 105 110

Ser Pro Thr Ser Leu Leu Glu Glu Arg Arg Leu Ser Val Ser Phe His

115 120 125

Phe Ser Val Asp Glu Lys Ile Val Ser Trp Leu Ser Ser Val Ala Asn

130 135 140

Ser Ser Leu Ser Leu Asn Gln Glu Ser Thr Ser Ser Asn Lys Glu Asn

145 150 155 160

His His Gln Lys Ser Ser Lys Asn Thr Lys Thr Ser Leu Glu Asn Val

165 170 175

Arg Lys Asp Gly Lys Val Cys Asn Ser Ser Ala Gly Lys Ala Arg Gly

180 185 190

Thr Gly Ser Ala Lys Pro Ser Leu Pro Glu Ser Asn Asn Lys Thr Cys

195 200 205

Pro Gln Lys Gln Cys Glu Glu Ser Ser Ile Ser Asn Arg Phe Val Thr

210 215 220

Leu Glu Glu Lys Lys Val Ser Phe Ser Val Ala Lys Thr Glu Lys Ser

225 230 235 240

Pro Ser Pro Asp Asn Ser Thr Ala Thr Ala Thr Ser Ser Leu Lys Lys

245 250 255

Ser Ala Glu Ile Gly Val Thr Lys Ser Lys Ile Val Val Glu Pro Leu

260 265 270

Phe Trp Pro Phe Glu Gln Lys Phe Asp Trp Thr Pro Glu Asp Ile Leu

275 280 285

Lys His Phe Ser Met Ser Pro Arg Arg Lys Lys Ser Leu Gly Ser Lys

290 295 300

Ile Ala Gly Thr Ser Pro Arg Ser Met Arg Ala Gln Leu Gln Thr Arg

305 310 315 320

Lys Leu Asp Leu Lys Glu Gly Cys Lys Arg Lys Leu Met Phe Asn Gly

325 330 335

Pro Gly Ser Asn Ser Lys Pro Thr Arg Ile Pro Glu Leu Asn Arg Thr

340 345 350

Ile Ser Asn Ser Ser Asn Asn Ser Ser Met Lys Lys Thr Glu Ile Ser

355 360 365

Lys Asn Gln Gln Pro Ile Arg Asn Ser Val Lys Arg Asn Lys Ser Leu

370 375 380

Pro Ser Arg Leu Arg Lys Ser Ser Lys Ile Ser Ser Lys Val Val Pro

385 390 395 400

Ile Glu Ala Ala Glu Glu Ser Gly Glu Ile Val Lys Glu Gln Lys Thr

405 410 415

Pro Lys Lys Leu Ile Met Thr Arg Lys Ser Arg Thr Phe Leu Glu Asp

420 425 430

Asp Phe Ala Leu Met Asn Asp Phe Ser Ile Glu Lys Ala Val Gly Leu

435 440 445

Cys Glu Phe Lys Gly Arg Glu Gly Ile Asp Ser Asp Phe Asn Thr Asp

450 455 460

Gly Phe Leu Phe Asp Asp Ser Leu

465 470

Claims

1.一种培育转基因植物的方法，是将磷酯酰丝氨酸合酶SePSS的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物耐盐性高于目的植物；

所述磷酯酰丝氨酸合酶SePSS为序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述植物为拟南芥。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述磷酯酰丝氨酸合酶SePSS 的编码基因为序列表中序列2所示的DNA分子。

3.一种提高植物耐盐性的方法，是提高目的植物中磷酯酰丝氨酸合酶SePSS表达量，提高植物耐盐性；

所述植物为拟南芥。

4.权利要求1-3中任一所述的磷酯酰丝氨酸合酶SePSS或权利要求1或2中所述的磷酯酰丝氨酸合酶SePSS的编码基因在调控植物耐盐性中的应用；所述植物为拟南芥。

5.权利要求1-3任一所述的方法或权利要求1-3中任一所述的磷酯酰丝氨酸合酶SePSS或权利要求1或2中所述的磷酯酰丝氨酸合酶SePSS的编码基因在植物育种中的应用；

所述育种的目的为选育耐盐性高的植物；

所述植物为拟南芥。