CN116120416A - SlWRKY57基因及其编码蛋白在调控番茄耐盐性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了SlWRKY57基因及其编码蛋白在调控番茄耐盐性中的应用。具体地公开了氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质SlWRKY57或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在调控植物耐盐性中的应用。本发明对SlWRKY57基因进行了基于CRISPR‑Cas9系统的敲除，得到SlWRKY57基因编辑株系。实验证明，在盐胁迫条件下，SlWRKY57基因编辑植株的萎蔫程度显著降低、鲜重显著增加，表明其对盐胁迫的耐受性显著增加。本发鉴定的SlWRKY57基因及其编码蛋白具有调控植物耐盐性的作用，对培育耐盐番茄新品种、促进商业化番茄育种进程、保证番茄的高产稳产具有重要意义和广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及SlWRKY57基因及其编码蛋白在调控番茄耐盐性中的应用。
背景技术
番茄(Solanum lycopersicum)作为营养价值和风味品质都较高的果蔬之一，愈发受到人们的喜爱，种植面积与日俱增。近年来，由于温室、大棚等栽培过程中不科学的水肥管理措施导致设施番茄盐胁迫问题日益严重，番茄的产量和质量都有所下降，严重制约了我国农业的可持续发展和菜篮子的稳定性。人们曾试图通过合理灌溉、淡水洗涤和施用化学改良剂等方法来改造盐胁迫问题，但因成本高昂、见效慢而难以推广。提高番茄本身的耐盐性，挖掘重要的耐盐遗传资源，对于培育耐盐性番茄品种起着关键的作用，耐盐番茄的开发和利用具有无法估量的生态效益、经济效益和社会效益。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何调控植物的耐盐性。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质的应用，所述应用可为下述任一种：
A1)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在调控植物耐盐性中的应用；
A2)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备调控植物耐盐性的产品中的应用；
A3)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在培育耐盐植物中的应用；
A4)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备培育耐盐植物的产品中的应用；
A5)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在植物育种或植物种质资源改良中的应用；
所述蛋白质名称为SlWRKY57，可为下述任一种：
B1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
B2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
B3)在B1)或B2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
上述应用中，所述蛋白质可来源于番茄(Solanum lycopersicum)。
进一步地，所述蛋白质SlWRKY57可为番茄耐盐相关蛋白。
为了使B1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。
所述标签蛋白包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His6标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质SlWRKY57的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质SlWRKY57的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质SlWRKY57且具有蛋白质SlWRKY57功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gapcost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述85％以上的同一性可为至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述90％以上的同一性可为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述95％以上的同一性可为至少95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本文中，调控所述蛋白质活性和/或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质SlWRKY57。
上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(包括对所述基因的转录产物的修饰、剪接和/或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(包括对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(包括对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控，如对蛋白质前体的加工、蛋白质的转运、蛋白质的降解和/或蛋白质的折叠等进行的调控)。
所述调控基因表达的物质具体可为本文E1)-E4)中任一所述的生物材料。
进一步地，所述调控基因表达的物质可为抑制或降低或下调所述蛋白质SlWRKY57的编码基因表达的物质(包括核酸分子或载体)。所述抑制或降低或下调所述蛋白质SlWRKY57的编码基因表达的物质可为敲除所述基因(SlWRKY57基因)的试剂，如通过CRISPR-Cas9敲除所述基因的试剂，或通过同源重组敲除所述基因的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可以包含靶向所述基因的多核苷酸，例如siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。
进一步地，所述调控基因表达的物质还可为提高或上调所述蛋白质SlWRKY57的编码基因表达的物质(包括核酸分子或载体)。
本发明还提供了与所述蛋白质SlWRKY57相关的生物材料的应用，所述应用可为下述任一种：
D1)与所述蛋白质SlWRKY57相关的生物材料在调控植物耐盐性中的应用；
D2)与所述蛋白质SlWRKY57相关的生物材料在制备调控植物耐盐性的产品中的应用；
D3)与所述蛋白质SlWRKY57相关的生物材料在培育耐盐植物中的应用；
D4)与所述蛋白质SlWRKY57相关的生物材料在制备培育耐盐植物的产品中的应用；
D5)与所述蛋白质SlWRKY57相关的生物材料在植物育种或植物种质资源改良中的应用；
所述生物材料可为下述任一种：
E1)编码所述蛋白质SlWRKY57的核酸分子；
E2)抑制或降低所述蛋白质SlWRKY57的编码基因表达的核酸分子；
E3)含有E1)和/或E2)所述核酸分子的表达盒；
E4)含有E1)和/或E2)所述核酸分子的重组载体、或含有E3)所述表达盒的重组载体；
E5)含有E1)和/或E2)所述核酸分子的重组微生物、或含有E3)所述表达盒的重组微生物、或含有E4)所述重组载体的重组微生物；
E6)含有E1)和/或E2)所述核酸分子的重组宿主细胞、或含有E3)所述表达盒的重组宿主细胞、或含有E4)所述重组载体的重组宿主细胞；
E7)含有E1)和/或E2)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有E3)所述表达盒的转基因植物组织；
E8)含有E1)和/或E2)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有E3)所述表达盒的转基因植物器官。
进一步地，E3)所述表达盒、E4)所述重组载体、E5)所述重组微生物、E6)所述重组宿主细胞、E7)所述转基因植物组织和E8)所述转基因植物器官均表达E1)和/或E2)所述核酸分子。
上述应用中，E1)所述核酸分子可为下述任一种：
F1)编码序列是SEQ ID No.3的第178-1161位的DNA分子；
F2)核苷酸序列是SEQ ID No.3的第178-1161位或SEQ ID No.3的DNA分子；
F3)核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子。
SEQ ID No.3的第178-1161位所示的DNA分子可为SlWRKY57基因的编码序列(CDS)。
SEQ ID No.3的第178-1161位所示的DNA分子编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质SlWRKY57。
SEQ ID No.2所示的DNA分子可为SlWRKY57基因的基因组核苷酸序列。
SEQ ID No.3所示的DNA分子可为SlWRKY57基因的cDNA序列。
SlWRKY57基因可为番茄耐盐相关基因。
D1)所述核酸分子还可包括在SEQ ID No.3的第178-1161位所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子。
D1)所述核酸分子还包括与SEQ ID No.3的178-1161位、SEQ ID No.3或SEQIDNo.2所示的核苷酸序列一致性为95％以上且来源相同种属的核酸分子。
本发明所述的蛋白质SlWRKY57基因的编码序列(CDS)可以为任意能够编码蛋白质SlWRKY57的核苷酸序列。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
进一步地，所述E2)可为降低所述SlWRKY57基因表达量的核酸分子。
E2)所述核酸分子可为sgRNA、microRNA、siRNA、shRNA和/或反义寡核苷酸。
进一步地，所述sgRNA、microRNA、siRNA、shRNA和/或反义寡核苷酸用于抑制SlWRKY57基因的表达。
进一步地，E2)所述核酸分子可为sgRNA。
进一步地，所述sgRNA的靶序列可为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5。
进一步地，所述sgRNA用于敲除SlWRKY57基因。
本领域技术人员熟知，除了利用基因编辑技术可以抑制SlWRKY57基因的表达，还可以利用基因敲减(基因敲低，gene knock-down)技术从转录后水平或翻译水平使SlWRKY57基因表达失活或基因沉默。所述基因敲减技术包括RNA干扰、Morpholino干扰、反义核酸、核酶或显性负抑制突变但不限于此。此外，利用病毒(如慢病毒、腺相关病毒)表达的shRNA或siRNA抑制SlWRKY57基因的表达，进行SlWRKY57基因的沉默也是本领域技术人员所熟知的。
本文所述表达盒包括启动子、编码所述蛋白质SlWRKY57的核酸分子和终止子，所述启动子可为CaMV35S启动子、NOS启动子或OCS启动子，所述终止子可为NOS终止子或OCSpolyA终止子。
本文所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如gRNA、mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。
本文所述载体是指能够把外源DNA或目的基因运载进入宿主细胞进行扩增和表达的载体，所述载体可以是克隆载体也可以是表达载体，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒、病毒载体(如逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒等)。在本发明的一个或多个实施方案中，所述载体为pCBSG012和pSG-SlU6。
本文所述微生物可为细菌、真菌、放线菌、原生动物、藻类或病毒。其中，所述细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia sp.)、欧文氏菌属(Erwinia sp.)、土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)、黄杆菌属(Flavobacterium sp.)、产碱菌属(Alcaligenes sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、芽胞杆菌属(Bacillus sp.)等但不限于此，例如所述细菌可为大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。所述真菌可为酵母，所述酵母可来自酵母属(如酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae)、克鲁维酵母属(如乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis)、毕赤酵母属(如巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris)、裂殖酵母属(如非洲粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe)、汉逊酵母属(如多态汉逊酵母Hansenula polymorpha)等但不限于此。所述真菌还可来自镰刀菌属(Fusarium sp.)、丝核菌属(Rhizoctonia sp.)、轮枝菌属(Verticillium sp.)、青霉属(Penicillium sp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)、头孢霉属(Cephalosporium sp.)等但不限于此。所述放线菌可来自链霉菌属(Streptomycessp.)、诺卡菌属(Nocardia sp.)、小单孢菌属(Micromonospora sp.)、链孢囊菌属(Streptosporangium sp.)、游动放线菌属(Actinoplanes sp.)、高温放线菌属(Thermoactinomyces sp.)等但不限于此。所述藻类可来自墨角藻属(Fucus sp.)、曲壳藻属(Achnanthes sp.)、茧形藻属(Amphiprora sp.)、双眉藻属(Amphora sp.)、纤维藻属(Ankistrodesmus sp.)、星胞藻属(Asteromonas sp.)、黄金色藻属(Boekeloviasp.)等但不限于此。所述病毒可为轮状病毒、疱疹病毒、流感病毒、腺病毒等但不限于此。在本发明的一个或多个实施方案中，所述微生物为根癌农杆菌GV3101。
本文所述宿主细胞(也称为受体细胞)可为植物细胞或动物细胞。所述宿主细胞可理解为不仅是指特定的受体细胞，而且也指这种细胞的后代，且由于天然的、偶然的或有意的突变和/或改变，该子代可以不必与原始的亲代细胞完全一致，但仍包括在宿主细胞的范围中。合适的宿主细胞为本领域已知的，其中：所述植物细胞可为拟南芥(Arabidopsisthaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)、玉米(Zea mays)、水稻(Oryzasativa)、小麦(Triticum aestivum)等植物细胞但不限于此；所述动物细胞可为哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)、幼仓鼠肾细胞(BHK细胞)、小鼠乳腺癌细胞(C127细胞)、人胚胎肾细胞(HEK293细胞)、人HeLa细胞、成纤维细胞、骨髓细胞系、T细胞或NK细胞等)、禽类细胞(例如鸡或鸭细胞)、两栖类细胞(例如非洲爪蟾(Xenopuslaevis)细胞或大鲵(Andriasdavidianus)细胞)、鱼类细胞(例如草鱼、鲤鱼、虹鳟鱼或鲶鱼细胞)、昆虫细胞(例如Sf21细胞或Sf-9细胞)等但不限于此。
本文所述重组载体是指将外源目的基因或核酸分子与载体在体外连接构建而成的重组DNA分子。
本文所述重组微生物(或重组宿主细胞)是指对目的微生物(或目的宿主细胞)的基因进行操作和修饰，从而得到功能发生变化的重组微生物(或功能发生变化的重组宿主细胞)。如将外源目的基因或重组载体导入目的微生物(或目的宿主细胞)后得到的重组微生物(或重组宿主细胞)，或直接对目的微生物(或目的宿主细胞)的内源基因进行基因编辑后得到的重组微生物(或重组宿主细胞)。所述重组微生物(或重组宿主细胞)可理解为不仅是指特定的重组微生物(或重组宿主细胞)，而且也指这种细胞的后代，且由于天然的、偶然的或有意的突变和/或改变，该子代可以不必与原始的亲代细胞完全一致，但仍包括在重组微生物(或重组宿主细胞)的范围中。
E4)所述重组载体可为重组载体CRISPR/Cas9-SlWRKY57。
所述重组载体CRISPR/Cas9-SlWRKY57含有两个编辑靶点(SEQ ID No.4和SEQIDNo.5)和Cas9蛋白的编码基因，导入受体后，转录的两个向导RNA通过碱基互补配对可以靶向受体基因组PAM附近的目标序列，即靶向SlWRKY57基因，Cas9蛋白使SlWRKY57基因上下游的DNA双链断裂，通过生物体自身的DNA损伤修复应答机制，将断裂上下游两端的序列连接起来，从而实现对SlWRKY57基因的敲除。
所述重组载体CRISPR/Cas9-SlWRKY57的制备方法包括如下步骤：
以中间载体pSG-SlU6为模板，利用引物F(5’-caatggtctcatgattgcttgattcagtagtagcgcgttttagagctagaaata-3’)和引物R(5’-ttggggtctctaaacgcgcgaacatctctatttccaaactacactgttagattt-3’)进行PCR扩增，得到的PCR产物(含有SEQ ID No.4和SEQ ID No.5双靶点)克隆到载体pCBSG012中，得到SlWRKY57基因编辑载体，即所述重组载体CRISPR/Cas9-SlWRKY57，用于基因敲除。
E5)所述重组微生物可为重组根癌农杆菌GV3101/CRISPR/Cas9-SlWRKY57。
所述GV3101/CRISPR/Cas9-SlWRKY57是将所述重组载体CRISPR/Cas9-SlWRKY57导入根癌农杆菌GV3101得到的重组微生物。
所述导入可为通过重组手段，包括但不限于农杆菌介导的转化，生物射弹(biolistic)方法，电穿孔，in planta技术，冻融法等等导入。
本发明还提供了一种培育耐盐植物的方法，所述方法可包括降低目的植物中所述蛋白质SlWRKY57的含量和/或活性，得到耐盐性高于所述目的植物的耐盐植物。
上述方法中，所述降低目的植物中所述蛋白质SlWRKY57的含量和/或活性可为通过降低目的植物中所述蛋白质SlWRKY57的编码基因的表达量和/或活性实现。
上述方法中，所述降低目的植物中所述蛋白质SlWRKY57的编码基因的表达量和/或活性可为利用基因突变、基因敲除、基因编辑或基因敲减技术使目的植物基因组中所述蛋白质SlWRKY57的编码基因的活性下降或失活。
上述方法中，所述利用基因编辑技术使目的植物基因组中权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的活性下降或失活可利用CRISPR/Cas9系统进行，所述CRISPR/Cas9系统包括表达靶向所述蛋白质的编码基因的sgRNA的载体，所述sgRNA的靶序列可为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5。
本发明所述培育耐盐植物的方法，可包括如下步骤：对目的植物中能够表达SlWRKY57蛋白的核酸分子进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述目的植物相比耐盐性提高。其中，所述对目的植物中能够表达SlWRKY57蛋白的核酸分子进行抑制表达可通过任何能够实现这一目的的技术手段实现，如通过序列特异核酸酶(如CRISPR/Cas9核酸酶)对所述核酸分子进行特异性剪切，从而降低其在所述目的植物中的表达。所述培育耐盐植物的方法可以通过杂交手段实现，也可以通过转基因手段实现。
在本发明的一个实施方案中，所述培育耐盐植物的方法包括如下步骤：
(1)构建靶向SEQ ID No.4和SEQ ID No.5的CRISPR/Cas9基因编辑载体；
(2)将步骤(1)构建的CRISPR/Cas9基因编辑载体导入目的植物中；
(3)经筛选和鉴定获得耐盐性高于所述目的植物的耐盐植物。
上述方法中，所述CRISPR/Cas9基因编辑载体可为所述重组载体CRISPR/Cas9-SlWRKY57。
上述方法中，所述目的植物可为番茄，具体可为番茄品种Solanum lycopersicumcvCastlemart(CM)。
上述方法中，所述导入包括但不限于：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转染植物细胞或组织，并将转染的植物细胞或组织培育成植株。
上述方法中，所述导入具体可为农杆菌介导法。
本发明还提供了一种制备耐盐性提高的番茄的方法，所述方法可包括如下步骤：将番茄基因组中的序列表中的SEQ ID No.2所示的SlWRKY57基因突变为SlWRKY57/+1bp基因或SlWRKY57/-1bp基因，得到耐盐性提高的番茄；所述SlWRKY57/+1bp基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述SlWRKY57/-1bp基因的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
本发明还提供了所述SlWRKY57/+1bp基因或SlWRKY57/-1bp基因，或所述SlWRKY57/+1bp基因或SlWRKY57/-1bp基因在提高番茄耐盐性中的应用。
SlWRKY57基因突变体SlWRKY57/+1bp基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，其是第一个靶点不变，在第二个靶点插入一个碱基“C”。
SlWRKY57基因突变体SlWRKY57/-1bp基因的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，其是第一个靶点缺失一个碱基“G”，第二个靶点不变。
本文中，所述植物可为作物(如农作物)。
本文中，所述植物可为下述任一种：
G1)单子叶植物或双子叶植物；
G2)茄科植物；
G3)茄属植物；
G4)番茄。
进一步地，所述番茄具体可为番茄品种Solanum lycopersicum cv Castlemart(CM)。
本发明还提供了所述培育耐盐植物的方法在创制耐盐植物和/或植物育种和/或植物种质资源改良中的应用。
本文所述SlWRKY57基因可为番茄耐盐相关基因。
本文所述植物育种可为作物耐盐育种，具体可为番茄耐盐育种，所述育种的目的可为选育耐盐能力提高的番茄。
本文所述植物育种可为利用本发明所述SlWRKY57基因和/或蛋白SlWRKY57提高作物耐盐性的分子育种。
本文所述调控植物耐盐性可为提高(上调)植物耐盐性或降低(下调)植物耐盐性。进一步地，所述提高(上调)植物耐盐性体现为：在盐胁迫条件下增加植物的鲜重和/或降低植物的萎蔫程度和/或增加植物的鲜重。所述降低(下调)植物耐盐性体现为：在盐胁迫条件下减少植物的鲜重和/或增加植物的萎蔫程度和/或减少植物的鲜重。
本文中，所述耐盐植物理解为不仅包含将所述SlWRKY57基因敲除得到的第一代转基因植物，也包括其子代。所述耐盐植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
本文所述耐盐植物可为耐盐番茄。
所述耐盐植物与所述受体植物(目的植物)相比对盐胁迫耐受性提高。所述对盐胁迫耐受性提高可体现为：降低受体植物中所述SlWRKY57蛋白的表达量和/或活性后，植株的鲜重高于野生型，萎蔫程度低于野生型。
本发明以番茄SlWRKY57基因为研究对象，通过体外构建CRISPR/Cas9-SlWRKY57表达载体，并将其通过农杆菌介导法导入受体植物番茄野生型CM获得番茄SlWRKY57基因编辑植株slwrky57-cr-1和slwrky57-cr-2。通过“四叶一心”时期300mmol NaCl处理30天后观察植物表型，称量鲜重，分析基因敲除前后番茄野生型CM植株对盐胁迫耐受性的差异。结果显示：300mmol NaCl处理30天后，slwrky57-cr-1和slwrky57-cr-2株系对盐胁迫的耐受性增加，植株鲜重显著增加。本发明丰富了番茄在抗盐调控中的相关基因，为番茄育种和在非生物逆境中提高产量提供参考。
本发明鉴定到的SlWRKY57基因及其编码的SlWRKY57蛋白可以调控植物的耐盐性，通过降低目的植物中SlWRKY57蛋白质的含量和/或活性(如对SlWRKY57基因进行基因敲除)可以显著提高目的植物的耐盐性。通过提高目的植物中SlWRKY57蛋白质的含量和/或活性(如过表达SlWRKY57基因)可以显著降低目的植物的耐盐性。本发明首次发现了SlWRKY57基因及其编码蛋白在提高番茄耐盐性中的应用，对于培育耐盐番茄新品种、克服传统育种的短板、促进商业化番茄育种进程、保证番茄的高产稳产具有重要意义和广泛的应用前景。
附图说明
图1为以番茄CM野生型为背景，通过CRISPR/Cas9双靶点敲除，构建CRISPR/Cas9-SlWRKY57表达载体获得SlWRKY57基因编辑株系的不同编辑类型。T1、T2分别为靶点1和靶点2，靶点1位于ATG下游74-96bp、碱基序列为5’-CCGGCGCTACTACTGAATCAAGC-3’，靶点2位于ATG下游211-233bp、碱基序列为5’-GGAAATAGAGATGTTCGCGCCGG-3’，PAM序列分别为CCG和CGG。
图2为不同番茄株系“四叶一心”时期300mmol NaCl处理30天后植物表型观察结果。CM为番茄野生型植株；slwrky57-cr-1和slwrky57-cr-2为SlWRKY57基因编辑植株。
图3为不同番茄株系“四叶一心”时期300mmol NaCl处理30天后植株鲜重统计结果。CM为番茄野生型植株；slwrky57-cr-1和slwrky57-cr-2为SlWRKY57基因编辑植株。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例采用ANOVA统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用邓肯多重范围检验方法，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异,不同字母表示差异有统计学意义。以下实施例中的定量实验，如无特别说明，均设置三次重复，结果取平均值。
下述实施例中的番茄品种Solanum lycopersicum cv Castlemart(CM)记载于如下文献中：Huang Huang,Wenchao Zhao,Hui Qiao,Chonghua Li,Lulu Sun,Rui Yang,Xuechun Ma,Jilin Ma,Susheng Song,and Shaohui Wang.SlWRKY45 interactswithjasmonate-ZIM domain proteins to negatively regulate defense against theroot-knotnematode Meloidogyne incognita in tomato.2022.Horticulture Research,9:uhac197，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的KT为激动素(Kinetin)，2，4-D为2，4二氯苯氧乙酸，IAA为吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic acid)，ZT为玉米素(Zeatin)。
下述实施例中的Kan为卡那霉素(kanamycin)，Rif为利福霉素(rifampicin)，Hyg为潮霉素B(Hygromycin B)。
下述实施例中的A1培养基为含有1mg/L IAA和1.75mg/L ZT的MS固体培养基，A2抗性培养基为含有1.0mg/L IAA、1.75mg/L ZT和5mg/L Hyg的MS固体培养基，A3培养基为含有1.0mg/L IAA、1.75mg/L ZT和5mg/L Hyg的MS固体培养基，A4培养基为含有5mg/L Hyg的MS固体培养基。
下述实施例中的pCBSG012载体和质粒pSG-SlU6记载于如下文献中：HuangHuang,Wenchao Zhao,Hui Qiao,Chonghua Li,Lulu Sun,Rui Yang,Xuechun Ma,JilinMa,Susheng Song,and Shaohui Wang.SlWRKY45 interacts with jasmonate-ZIMdomainproteins to negatively regulate defense against the root-knotnematodeMeloidogyne incognita in tomato.2022.Horticulture Research,9:uhac197。公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、SlWRKY57基因及其编码蛋白
本发明人经过广泛而深入的研究，发现SlWRKY57基因及其编码蛋白可以调控植物的耐盐性。SlWRKY57基因组的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，全长3383bp，SlWRKY57 cDNA序列如SEQ ID No.3所示，长度为1306bp，SlWRKY57基因的编码序列(CDS)的核苷酸序列如SEQ ID No.3的第178-1161位所示，长度为984bp，并编码327个氨基酸，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。SlWRKY57基因编码的蛋白质命名为SlWRKY57蛋白，SlWRKY57蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNo.1。
实施例2、基因编辑番茄的构建及鉴定
一、构建CRISPR/Cas9-SlWRKY57表达载体
通过以番茄CM野生型为背景，从SlWRKY57基因的CDS(SEQ ID No.3的第178-1161位)区选取两个20bp左右的靶点进行CRISPR/Cas9双靶点敲除，构建CRISPR/Cas9-SlWRKY57表达载体。设计的两个靶序列如下所示：
靶点1：5’-CCGGCGCTACTACTGAATCAAGC-3’(SEQ ID No.4)，
靶点2：5’-GGAAATAGAGATGTTCGCGCCGG-3’(SEQ ID No.5)。
靶点1位于ATG下游74-96bp，靶点2位于ATG下游211-233bp，PAM序列分别为CCG和CGG。
构建CRISPR/Cas9-SlWRKY57表达载体步骤如下：
使用CRISPR-P选择两个靶向SlWRKY57第一个外显子的sgRNAs。以质粒pSG-SlU6作为模板，以下面引物对进行PCR扩增。
F：5’-caatggtctcatgattgcttgattcagtagtagcgcgttttagagctagaaata-3’，
R：5’-ttggggtctctaaacgcgcgaacatctctatttccaaactacactgttagattt-3’。
PCR产物包含Bsa I酶切位点、两个靶点、gRNA scaffold、TTTTTT终止信号和番茄U6启动子。pCBSG012载体和PCR产物同时用Bsa I进行酶切，纯化回收后连接，重组得到CRISPR/Cas9-SlWRKY57表达载体。载体构建过程和涉及的相关载体出自文献Huang Huang,Wenchao Zhao,Hui Qiao,Chonghua Li,Lulu Sun,Rui Yang,XuechunMa,Jilin Ma,Susheng Song,and Shaohui Wang.SlWRKY45 interacts withjasmonate-ZIM domainproteins to negatively regulate defense against the root-knotnematodeMeloidogyne incognita in tomato.2022.Horticulture Research,9:uhac197。
上述得到的SlWRKY57基因编辑载体(即重组载体，用于基因敲除)，命名为CRISPR/Cas9-SlWRKY57。
重组载体CRISPR/Cas9-SlWRKY57含有两个编辑靶点(SEQ ID No.4和SEQ IDNo.5)和Cas9蛋白的编码基因，导入受体后，转录的两个向导RNA通过碱基互补配对可以靶向受体基因组PAM附近的目标序列，即靶向SlWRKY57基因，Cas9蛋白使SlWRKY57基因上下游的DNA双链断裂，通过生物体自身的DNA损伤修复应答机制，将断裂上下游两端的序列连接起来，从而实现对SlWRKY57基因的敲除。
二、转化农杆菌
测序正确的重组载体CRISPR/Cas9-SlWRKY57利用电击法转入根癌农杆菌GV3101菌株中，得到重组根癌农杆菌GV3101/CRISPR/Cas9-SlWRKY57。菌液PCR验证无误后保菌备用。
三、番茄遗传转化
1、播种
使用75％乙醇消毒处理种子4分钟，然后使用无菌水清洗4-5遍，用3％次氯酸钠溶液消毒8分钟左右，然后用无菌水冲洗8-10遍，将种子播在1/2MS培养基中，在组培室中培养5-7d至子叶展开而未冒出真叶。
2、外植体剪切
用灭菌的镊子和剪刀剪去子叶尖端和末端部分，形成1cm左右的外植体，将剪好的外植体放入MS液(加入1mg/L KT和1mg/L 2，4-D)中浸泡0.5h，转移到A1培养基(MS固体培养基+1mg/L IAA+1.75mg/L ZT)上，正面朝上，预培养1-2d。
3、侵染菌液的准备
选择单克隆阳性菌落(重组根癌农杆菌GV3101/CRISPR/Cas9-SlWRKY57)，使用2ml含有抗生素(50mg/L Kan和50mg/L Rif)的YEB液体培养基培养，侵染当天，使用20ml含有抗生素(50mg/L Kan和50mg/L Rif)的YEB液体培养基加入上述小摇的菌液(菌液大约OD600＝1)，在28℃摇床，200rpm约4h扩大培养，得到农杆菌菌液，OD600＝1-2。
4、侵染外植体
步骤3中得到的农杆菌菌液4000rpm，室温离心10分钟弃上清，收集菌体后使用YEB液体培养基悬浮，4000rpm离心10分钟，弃上清后用MS盐溶液再次重悬菌体，调节OD600＝0.3-0.5，将外植体浸泡在重悬液中培养15分钟，无菌滤纸吸干多余液体后，将外植体移至A1培养基中，外植体背面朝上，暗培养2d。
5、培养
共培养(暗培养)两天后，将子叶转到A2抗性培养基(MS固体培养基+1.0mg/LIAA+1.75mg/L ZT+5mg/L Hyg)上，26℃(16h光照)/18℃(8h黑暗)培养。每周更换新鲜A2抗性培养基，直至形成愈伤。愈伤形成后，将其转移到A3培养基(MS固体培养基+1.0mg/L IAA+1.75mg/L ZT+5mg/L Hyg)上诱导出芽成苗。将小苗转移到A4培养基(MS固体培养基+5mg/LHyg)上进行生根筛选。最终获得T0代转基因番茄植株(即SlWRKY57基因编辑番茄)。
6、鉴定
取T0代转基因番茄植株叶片提取DNA，以基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物送生工测序筛选阳性转化苗，鉴定引物如下。
SlWRKY57-F：5’-TTCAATTTTTTCTCTCTCCGC-3’；
SlWRKY57-R：5’-GTGATTTTCTCCGTCACCGTC-3’。
扩增产物测序后与野生型序列进行比较，鉴定出的有效突变株系，分别命名为slwrky57-cr-1和slwrky57-cr-2。其中：
slwrky57-cr-1是第一个靶点不变，在第二个靶点插入一个碱基“C”，造成翻译提前终止，从而将SlWRKY57基因敲除而得到的突变株系，相应地得到SlWRKY57基因的突变体，命名为SlWRKY57/+1bp基因。SlWRKY57/+1bp基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.6所示。
slwrky57-cr-2是第一个靶点缺失一个碱基“G”，第二个靶点不变，造成翻译提前终止，从而将SlWRKY57基因敲除而得到的突变株系，相应地得到SlWRKY57基因的突变体，命名为SlWRKY57/-1bp基因。SlWRKY57/-1bp基因的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
SlWRKY57基因突变株系鉴定结果如图1所示。
实施例3、不同株系的SlWRKY57基因编辑植株耐盐性功能验证
供试番茄：对照组(CM)番茄和实施例2中获得的经过PCR鉴定阳性的试验组slwrky57-cr-1株系和slwrky57-cr-2株系番茄，每个株系20株。
1、对不同株系的植株进行盐胁迫处理观察表型
不同供试番茄长至“四叶一心”时期，用300mmol NaCl处理，每48h单株浇灌30mL，30天后进行植株表型观察。
结果如图2所示，slwrky57-cr-1和slwrky57-cr-2基因编辑株系萎蔫程度明显低于野生型(图2)。可见在盐胁迫条件下，SlWRKY57基因编辑番茄相比于野生型番茄表现出了更强的耐受性，表明抑制或降低SlWRKY57基因的表达(如敲除SlWRKY57基因)可以提高番茄的耐盐性。
2、对不同株系的植株进行盐胁迫处理测量鲜重
不同供试番茄长至“四叶一心”时期，用300mmol NaCl处理(方法同步骤1中的处理方法)，30天后测量不同供试番茄的鲜重。
如图3所示，slwrky57-cr-1和slwrky57-cr-2基因编辑株系植株的鲜重显著高于野生型。结果进一步证明了抑制或降低SlWRKY57基因的表达(如敲除SlWRKY57基因)提高了番茄的耐盐性。
综上，本发明鉴定到的SlWRKY57基因及其编码的SlWRKY57蛋白可以调控植物耐盐性(如提高或降低植物的耐盐性)，通过降低目的植物中SlWRKY57蛋白质的含量和/或活性(如抑制SlWRKY57基因的表达)可以显著降低目的植物的耐盐性，通过提高目的植物中SlWRKY57蛋白质的含量和/或活性(如过表达SlWRKY57基因)可以显著提高目的植物的耐盐性。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
本文中所涉及的序列如下所示：
MDENDKQVDNDPLPGGGGGGAAEFTGATTESSWSLGGGDDESDNVYFFGTSSTDRESSILTEFGWNFQPHGNRDVRAGGDGSRFDRIDEDLAGNSTTTTASVSASVSITEPTVTEKITDEPVSSSCSDDPPEKSTASGSSSASRPPSDTASKVKKKGQKRIRQPRFAFMTKSEVDHLEDGYRWRKYGQKAVKNSPFPRSYYRCTNTKCTVKKRVERSSEDSSIVITTYEGQHCHHTVGFPRGGLINHEAFTSQLTPLPSQFYHPSGVQYPHELVPMSSPAAPESHTMPGETGPEPIRLPETSQPDATQQPTDEGLLGDIVPPGMRSR(SEQ ID No.1)
tctatactatttttctgagtgtcttctcaccaattgccattgacacgacaaagctttcaaatcccccaaaaaagtttctaattaaatattccaaactctttacgcgtttatcttctccttctctataaaccctagcttcaattttttctctctccgcgtaaaattcactctgtaactatggatgaaaacgataagcaggttgataatgatccattacctggtggtggtggtggtggtgcagcggagttcaccggcgctactactgaatcaagctggtcactcggtggtggagatgatgaatcggataatgtttacttcttcggtactagtagtactgatagagagagcagtatattaaccgaattcggctggaattttcaaccgcacggaaatagagatgttcgcgccggtggtgacggtagtcgatttgatcggatcgatgaggatttggcgggaaatagtactacaactactgcttctgtttctgcttctgtttctattactgaaccgacggtgacggagaaaatcaccgacgaacctgtttcatctagctgttctgatgatcccccggagaaatctacagcttccggtagctcctccgcctctcgaccgccgtccgatacagcgtgagtcatgtgtttatcatcgacttctctctaagtatgtctaaattcgtaattaactgcgatttgaaatggtaaaaataaggagtaaaacgccattaacgtgtccgtacgtaggtgtagaaaaaatgtcaagtggttcacgcaagttgagggaagagaagagaggtattatcgtaattttaatcatcaaggatgggcttttcggtatttgctcacttttctgtggctttaaaacagccgtcgttgcggcgggaatggcgtggatgaattttttcctctaaaattaaatatcgtaataataattaaaattaactgttaaggaaaagtattttttttaaaatttctttttatataaaaaagtaacttgcgataactcttccctaataatggtttaggtgtaatctcttacaaaattagtttcttctacttcattatttcgtggtccattgcttcgtacattagtatttaaagaaagaaaaaaggaataggtacaatgtggaaacttttaactgttaaagcaataataaagttatcttagtgtgatagatctgctaaaattgtaaaattagtcatcaatatagcttttagtccgttttcatatgaatacagaatactttgtgcaaattactgataaataaatgaattttggtttgtgtgaactctcaaggttcattgcatgcatttctcttcgttgtggtctgcattgttcttgtagtataacctaattatacaagcccaagtgaacttttgtttttttgttttttaaacatttaatatatttcgttaataataaattgaactaaggtagagttacttaaagcaaacaaacatgaagagaatttggatacgtttttataagtattaagttcaactgcagactcttcaattttttatgttgcatccgtatcggattcttcaaaaatacactatgtttggcgaatccaatacgcacctattgacctttttgaagagttcgagcaactgtactactattttgatgttgtttagtagtattacgctgcccactatatttataagggtttctaaatttcaactaagtttgagcagctagataaacataacttgttacttatcaatatataacaagaatcagaggtatataataccaggtaatttctttctatctgttatagtcttggatatggtaagatagatattctgtgaaactagccccaggggttggatacccaaaaatataaaaccaatttataatattcttcatgtctataacttcattaaaagaataaatacccattctttttcaattgaaagatattttgtttattacaaagatttactaattggaaactagattggtttgtattaaatgatgcattgagtttcttagttataaagaaaat gcaagtgtaccaggaattataattttttaaaatattttctagtactatagtatatatattatgtaatataagatgaaggaatcacattcctaatgttactttaggttgaatattccacagaagcaaggttaaaaagaagggtcagaaacgaatcaggcagccccgctttgcattt atgaccaaaagtgaagttgatcatcttgaagatggctatagatggaggaaatatggccaaaaagctgttaaaaacagtccatttccaaggtatgttggaatgaatttaaattttatgaatttctaacgaattatttgaagtatatttagttattatgttcaaaattcaacattgagaaaattgtttaataaaacaaaccattagatgtacatgtacttaactaaattactcttaattctaccttatatacctgagt aattatttgttatatgcctttttggaatagtatggaagttgttttcaagaaatttttttttttcttcttggggattttagaagtgatagattaaatatttggacaaaaattgtttgactaaagtgatggtataataaataggatagggtagtacttttcgtatatctaatcctaattcctgtccttatatcctattgaaacatatacatgtatcttaacgagttatgtatatcttgattaattttatgaattactt tattacaatcaccaataaataggtatcagataattattcacaaagatttaaacagataaaatcatgtatttcttcatttcaatttgtatgatgtagtctgggttgataaaagttgaaataattactcatgatgaatatatatgacttgtcaggagttattatcgttgtacaaatacaaagtgtacagtaaagaaaagagtggagagatcctctgaagattcctcaattgtaatcacaacatatgaaggacaacattgtcaccatacagttggatttcctagaggtggacttatcaatcacgaagcatttacatctcaattaacacctttaccctcacaattctatcatccatccggtgttcaataccctcatgaattagttcctatgagtagccccgctgcaccagaatcacatacaatgcctggtgaaaccggacccgaacctattagattgccagaaacaagtcaaccagatgctacacaacaaccaactgatgaaggattgcttggagatattgtacctcctgggatgcgaagcagataatataaagggtaatatattccgtttcttaatttgcattaatttacatatatttttttatttcatcaatgacatagtatttgaacgttacacgagtgcgcctacacaagtgtaagtgtatgtgttttatttaaaaagaaatttctgt(SEQ ID No.2)
tctatactatttttctgagtgtcttctcaccaattgccattgacacgacaaagctttcaaatcccccaaaaaagtttctaattaaatattccaaactctttacgcgtttatcttctccttctctataaaccctagcttcaattttttctctctccgcgtaaaattcactctgtaactatggatgaaaacgataagcaggttgataatgatccattacctggtggtggtggtggtggtgcagcggagttcaccggcgctactactgaatcaagctggtcactcggtggtggagatgatgaatcggataatgtttacttcttcggtactagtagtactgatagagagagcagtatattaaccgaattcggctggaattttcaaccgcacggaaatagagatgttcgcgccggtggtgacggtagtcgatttgatcggatcgatgaggatttggcgggaaatagtactacaactactgcttctgtttctgcttctgtttctattactgaaccgacggtgacggagaaaatcaccgacgaacctgtttcatctagctgttctgatgatcccccggagaaatctacagcttccggtagctcctccgcctctcgaccgccgtccgatacagcaagcaaggttaaaaagaagggtcagaaacgaatcaggcagccccgctttgcatttatgaccaaaagtgaagttgatcatcttgaagatggctatagatggaggaaatatggccaaaaagctgttaaaaacagtccatttccaaggagttattatcgttgtacaaatacaaagtgtacagtaaagaaaagagtggagagatcctctgaagattcctcaattgtaatcacaacatatgaaggacaacattgtcaccatacagttggatttcctagaggtggacttatcaatcacgaagcatttacatctcaattaacacctttaccctcacaattctatcatccatccggtgttcaataccctcatgaattagttcctatgagtagccccgctgcaccagaatcacatacaatgcctggtgaaaccggacccgaacctattagattgccagaaacaagtcaaccagatgctacacaacaaccaactgatgaaggattgcttggagatattgtacctcctgggatgcgaagcagataatataaagggtaatatattccgtttcttaatttgcattaatttacatatatttttttatttcatcaatgacatagtatttgaacgttacacgagtgcgcctacacaagtgtaagtgtatgtgttttatttaaaaagaaatttctgt(SEQ ID No.3)
CCGGCGCTACTACTGAATCAAGC(SEQ ID No.4)
GGAAATAGAGATGTTCGCGCCGG(SEQ ID No.5)
tctatactatttttctgagtgtcttctcaccaattgccattgacacgacaaagctttcaaatcccccaaaaaagtttctaattaaatattccaaactctttacgcgtttatcttctccttctctataaaccctagcttcaattttttctctctccgcgtaaaattcactctgtaactatggatgaaaacgataagcaggttgataatgatccattacctggtggtggtggtggtggtgcagcggagtt caccggcgctactactgaatcaagctggtcactcggtggtggagatgatgaatcggataatgtttacttcttcggtactagtagtactgatagagagagcagtatattaaccgaattcggctggaattttcaaccgcacggaaatagagatgttcgccgccggtggtgacggtagtcgatttgatcggatcgatgaggatttggcgggaaatagtactacaactactgcttctgtttctgcttctgtttctattactgaaccgacggtgacggagaaaatcaccgacgaacctgtttcatctagctgttctgatgatcccccggagaaatctacagcttccggtagctcctccgcctctcgaccgccgtccgatacagcgtgagtcatgtgtttatcatcgacttctctctaagtatgtctaaattcgtaattaactgcgatttgaaatggtaaaaataaggagtaaaacgccattaacgtgtccgtacgtaggtgtagaaaaaatgtcaagtggttcacgcaagttgagggaagagaagagaggtattatcgtaattttaatcatcaaggatgggcttttcggtatttgctcacttttctgtggctttaaaacagccgtcgttgcggcgggaatggcgtggatgaattttttcctctaaaattaaatatcgtaataataattaaaattaactgttaaggaaaagtattttttttaaaatttctttttatataaaaaagtaacttgcgataactcttccctaataatggtttaggtgtaatctcttacaaaattagtttctt ctacttcattatttcgtggtccattgcttcgtacattagtatttaaagaaagaaaaaaggaataggtacaatgtggaaacttttaactgttaaagcaataataaagttatcttagtgtgatagatctgctaaaattgtaaaattagtcatcaatatagcttttagtccgttttcatatgaatacagaatactttgtgcaaattactgataaataaatgaattttggtttgtgtgaactctcaaggttcattgcatgcatttctcttcgttgtggtctgcattgttcttgtagtataacctaattatacaagcccaagtgaacttttgtttttttgttttttaaacatttaatatatttcgttaataataaattgaactaaggtagagttacttaaagcaaacaaacatgaagagaatttggatacgtttttataagtattaagttcaactgcagactcttcaattttttatgttgcatccgtatcggattcttcaaaaatacactatgtttggcgaatccaatacgcacctattgacctttttgaagagttcgagcaactgtactactattttgatgttgtttagtagtattacgctgcccactatatttataagggtttctaaatttcaactaagtttgagcagctagataaacataacttgttacttatcaatatataacaagaatcagaggtatataataccaggtaatttctttctatctgttatagtcttggatatggtaagatagatattctgtgaaactagccccaggggttggatacccaaaaatataaaaccaatttataatattcttcatgtctataacttcattaaaagaataaatacccattctttttcaattgaaagatattttgtttattacaaagatttactaattggaaactagattggtttgtattaaatgatgcattgagtttcttagttat aaagaaaatgcaagtgtaccaggaattataattttttaaaatattttctagtactatagtatatatattatgtaatataagatgaaggaatcacattcctaatgttactttaggttgaatattccacagaagcaaggttaaaaagaagggtcagaaacgaatcaggcagccccgctttgcatttatgaccaaaagtgaagttgatcatcttgaagatggctatagatggaggaaatatggccaaaaagctgttaaaaacagtccatttccaaggtatgttggaatgaatttaaattttatgaatttctaacgaattatttgaagtatatttagttattatgttcaaaattcaacattgagaaaattgtttaataaaacaaaccattagatgtacatgtacttaactaaattactcttaattctaccttatatacctgagtaattatttgttatatgcctttttggaatagtatggaagttgttttcaagaaatttttttttttcttcttggggattttagaagtgatagattaaatatttggacaaaaattgtttgactaaagtgatggtataataaataggatagggtagtacttttcgtatatctaatcctaattcctgtccttatatcctattgaaacatatacatgtatcttaacgagttatgtatatcttgattaattttatgaattactttattacaatcaccaataaataggtatcagataattattcacaaagatttaaacagataaaatcatgtatttcttcatttcaatttgtatgatgtagtctgggttgataaaagttgaaataattactcatgatgaatatatatgacttgtcaggagttattatcgttgtacaaatacaaagtgtacagtaaagaaaagagtggagagatcctctgaagattcctcaattgtaatcacaacatatgaaggacaacattgtcaccatacagttggatttcctagaggtggacttatcaatcacgaagcatttacatctcaattaacacctttaccctcacaattctatcatccatccggtgttcaataccctcatgaattagttcctatgagtagccccgctgcaccagaatcacatacaatgcctggtgaaaccggacccgaacctattagattgccagaaacaagtcaaccagatgctacacaacaaccaactgatgaaggattgcttggagatattgtacctcctgggatgcgaagcagataatataaagggtaatatattccgtttcttaatttgcattaatttacatatatttttttatttcatcaatgacatagtatttgaacgttacacgagtgcgcctacacaagtgtaagtgtatgtgttttatttaaaaagaaatttctgt(SEQ ID No.6)
tctatactatttttctgagtgtcttctcaccaattgccattgacacgacaaagctttcaaatcccccaaaaaagtttctaattaaatattccaaactctttacgcgtttatcttctccttctctataaaccctagcttcaattttttctctctccgcgtaaaattcactctgtaactatggatgaaaacgataagcaggttgataatgatccattacctggtggtggtggtggtggtgcagcggagttcaccggcctactactgaatcaagctggtcactcggtggtggagatgatgaatcggataatgtttacttcttcggtactagtagtactgatagagagagcagtatattaaccgaattcggctggaattttcaaccgcacggaaatagagatgttcgcgccggtggtgacggtagtcgatttgatcggatcgatgaggatttggcgggaaatagtactacaactactgcttctgtttctgcttctgtttctattactgaaccgacggtgacggagaaaatcaccgacgaacctgtttcatctagctgttctgatgatcccccggagaaatctacagcttccggtagctcctccgcctctcgaccgccgtccgatacagcgtgagtcatgtgtttatcatcgacttctctctaagtatgtctaaattcgtaattaactgcgatttgaaatggtaaaaataaggagtaaaacgccattaacgtgtccgtacgtaggtgtagaaaaaatgtcaagtggttcacgcaagttgagggaagagaagagaggtattatcgtaattttaatcatcaaggatgggcttttcggtatttgctcacttttctgtggctttaaaacagccgtcgttgcggcgggaatggcgtggatgaattttttcctctaaaattaaatatcgtaataataattaaaattaactgttaaggaaaagtattttttttaaaatttctttttatataaaaaagtaacttgcgataactcttccctaataatggtttaggtgtaatctcttacaaaattagtttcttctacttcattatttcgtggtccattgcttcgtacattagtatttaaagaaagaaaaaaggaataggtacaatgtggaaacttttaactgttaaagcaataataaagttatcttagtgtgatagatctgctaaaattgtaaaattagtcatcaatatagcttttagtccgttttcatatgaatacagaatactttgtgcaaattactgataaataaatgaattttggtttgtgtgaactctcaaggttcattgcatgcatttctcttcgttgtggtctgcattgttcttgtagtataacctaattatacaagcccaagtgaacttttgtttttttgttttttaaacatttaatatatttcgttaataataaattgaactaaggtagagttacttaaagcaaacaaacatgaagagaatttggatacgtttttataagtattaagttcaactgcagactcttcaattttttatgttgcatccgtatcggattcttcaaaaatacactatgtttggcgaatccaatacgcaccta
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caagtgtaagtgtatgtgttttatttaaaaagaaatttctgt(SEQ ID No.7)。
Claims (10)
1.蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：
A1)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在调控植物耐盐性中的应用；
A2)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备调控植物耐盐性的产品中的应用；
A3)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在培育耐盐植物中的应用；
A4)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备培育耐盐植物的产品中的应用；
A5)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在植物育种或植物种质资源改良中的应用；
所述蛋白质为下述任一种：
B1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
B2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
B3)在B1)或B2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白质来源于番茄。
3.与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：
D1)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在调控植物耐盐性中的应用；
D2)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在制备调控植物耐盐性的产品中的应用；
D3)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在培育耐盐植物中的应用；
D4)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在制备培育耐盐植物的产品中的应用；
D5)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在植物育种或植物种质资源改良中的应用；
所述生物材料为下述任一种：
E1)编码权利要求1或2中所述蛋白质的核酸分子；
E2)抑制或降低权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因表达的核酸分子；
E3)含有E1)和/或E2)所述核酸分子的表达盒；
E4)含有E1)和/或E2)所述核酸分子的重组载体、或含有E3)所述表达盒的重组载体；
E5)含有E1)和/或E2)所述核酸分子的重组微生物、或含有E3)所述表达盒的重组微生物、或含有E4)所述重组载体的重组微生物；
E6)含有E1)和/或E2)所述核酸分子的重组宿主细胞、或含有E3)所述表达盒的重组宿主细胞、或含有E4)所述重组载体的重组宿主细胞；
E7)含有E1)和/或E2)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有E3)所述表达盒的转基因植物组织；
E8)含有E1)和/或E2)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有E3)所述表达盒的转基因植物器官。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，E1)所述核酸分子为下述任一种：
F1)编码序列是SEQ ID No.3的第178-1161位的DNA分子；
F2)核苷酸序列是SEQ ID No.3的第178-1161位或SEQ ID No.3的DNA分子；
F3)核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子。
5.一种培育耐盐植物的方法，其特征在于，所述方法包括降低目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的含量和/或活性，得到耐盐性高于所述目的植物的耐盐植物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述降低目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的含量和/或活性为通过降低目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量和/或活性实现。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述降低目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量和/或活性为利用基因突变、基因敲除、基因编辑或基因敲减技术使目的植物基因组中权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的活性下降或失活。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述利用基因编辑技术使目的植物基因组中权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的活性下降或失活是利用CRISPR/Cas9系统进行，所述CRISPR/Cas9系统包括表达靶向所述蛋白质的编码基因的sgRNA的载体，所述sgRNA的靶序列为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5。
9.一种制备耐盐性提高的番茄的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将番茄基因组中的序列表中的SEQ ID No.2所示的SlWRKY57基因突变为SlWRKY57/+1bp基因或SlWRKY57/-1bp基因，得到耐盐性提高的番茄；所述SlWRKY57/+1bp基因的核苷酸序列如SEQID No.6所示，所述SlWRKY57/-1bp基因的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
10.权利要求9中所述的SlWRKY57/+1bp基因或SlWRKY57/-1bp基因，或所述SlWRKY57/+1bp基因或SlWRKY57/-1bp基因在提高番茄耐盐性中的应用。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117088957A (zh) * | 2023-10-17 | 2023-11-21 | 山东省烟台市农业科学研究院(山东省农业科学院烟台市分院) | 番茄SlMYB13蛋白及其编码基因在调控植物耐盐、耐旱性中的应用 |
| CN117904142A (zh) * | 2024-03-18 | 2024-04-19 | 浙江大学海南研究院 | SlMYB52基因在提高番茄盐胁迫抗性中的应用 |
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2023
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| CN117088957B (zh) * | 2023-10-17 | 2024-01-02 | 山东省烟台市农业科学研究院(山东省农业科学院烟台市分院) | 番茄SlMYB13蛋白及其编码基因在调控植物耐盐、耐旱性中的应用 |
| CN117904142A (zh) * | 2024-03-18 | 2024-04-19 | 浙江大学海南研究院 | SlMYB52基因在提高番茄盐胁迫抗性中的应用 |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20230516 |