CN117106820A - 一种通过基因组编辑创制番茄少侧枝的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过基因组编辑创制番茄少侧枝的方法及其应用。本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通过基因组编辑创制番茄少侧枝的方法及其应用。本发明提供了蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物侧枝发育中的应用，蛋白质WRKY‑B的氨基酸序列为序列3，通过调控WRKY‑B蛋白的表达可以调控番茄侧枝数目，获得无/少侧枝的番茄新种质，为番茄株型育种提供材料积累，为番茄农业生产的提供新策略、新方向。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通过基因组编辑创制番茄少侧枝的方法及其应用。
背景技术
番茄(Solanum lycopersicum)又名西红柿，酸甜可口，具有较高的食用价值和营养价值，在我国“菜篮子”工程和产业结构调整中占有重要地位，已经成为我国乃至世界最重要的蔬菜作物之一。在番茄生产的过程中，番茄侧枝是重要的农艺性状之一。由于番茄侧芽萌发力强，分枝力极强，每个叶腋都能抽生侧枝，往往多个侧枝同时生长。根据食用方式分类，番茄可以分为加工和鲜食番茄两种类型。对于加工番茄来讲，适量的侧枝分生有利于提高番茄的单株产量；而对于鲜食番茄来讲，过多的侧枝生长，则会直接影响番茄营养生长和生殖生长的平衡关系，最终影响番茄产量。为了解决这一生产问题，生产上主要通过整枝打杈的方式，维持番茄整株的优良长势从而保证番茄的优质高产。而频繁的整枝打杈是番茄栽培生产中极为耗时耗力的一项工作，且无法适应大规模种植的需求，所以生产者更倾向于选择少侧枝或无侧枝类型的番茄品种。因此，通过生物技术手段培育无/少侧枝的番茄品种还将大大节省番茄生产中的人力财力，对番茄生产及番茄新株型塑造具有一定的变革及原始性的创新意义。
在作物从野生种到栽培种的驯化过程中，分枝性状的驯化发挥至关重要的作用。例如从野生大刍草到栽培玉米的驯化过程中，其株型由多侧枝到无侧枝的革命性转变是由于单基因TB1(Teosinte Branched1)的突变完成的。水稻野生种一般表现为匍匐、多分蘖株型，与野生种相比，栽培种水稻则产生较少的枝梗和小穗，这主要是由于水稻通过MOC1降解调节分枝，最终通过对株型的塑造从而影响水稻谷粒产量。植物的侧枝主要是从植株顶端分生组织(Shoot apical meristem，SAM)分化而来，SAM会产生叶、节间以及叶腋分生组织(Axillary meristem，AM)三部分。由SAM分化而来的AM早期具有同SAM一样发育成为侧枝的能力。由AM成为侧枝主要经历两个阶段：AM的早期形成以及AM的后期生长，并且它具有直接生长发育成为侧枝或者进入休眠状态成为暂时性休眠芽的可能性，两种模式可以在适宜条件下相互转换。在相互转换的过程中，周边各种环境、发育信号因子以及各类激素相互作用决定腋芽的活性状态。
近年来，人们相继从水稻、拟南芥、豌豆等植物中鉴定出一系列可以调控侧芽形成以及后期生长的关键基因。番茄作为典型的合轴分枝作物，其主干是由许多腋芽发育形成的侧枝联合组成，是一种较为进化的分枝类型。近年来，单个调控侧枝发育的关键基因已被陆续报道。比如番茄BRANCHED1(BRC1a/b)是玉米TB1的同源基因，在腋芽中特异性表达，与玉米相类似，TB1/BRC1主要控制主茎侧枝的外生，其中BRC1b的沉默可促进主茎侧芽的外生，而BRC1a的效果不明显，并揭示栽培番茄中BRC1a表达量的下降以及侧芽更易外生可能是驯化选择的结果。番茄中的LS(SUPPRESSOR)基因(拟南芥LAS、水稻MOC1同源基因)编码一个GRAS家族的VHIID转录因子，而BL则是R2R3类MYB转录因子家族的一员。ls和bl突变体中侧枝均不能正常形成，不同的是ls仅抑制主茎营养生长时期(第一花序之前)侧枝的形成，而bl突变体中合轴分生组织的形成也被阻止，导致合轴单元无法正常形成，花序形成后即封顶。此外，由于目前这些基因调控机制仍不清楚，再加上突变体对番茄的其他生长发育过程有一定的影响，使得它们在实际育种过程中很难被应用。因此，挖掘可应用在番茄育种中的调控侧枝发育、但不影响番茄其他生长发育过程的基因具有重要的现实意义。
近年来，基因编辑技术取得了突破性进展，CRISPR/Cas9、TALEN和ZFN等方法在世界上已经成为基因编辑技术的手段。基因编辑技术是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。基因编辑技术将会广泛应用于所有农产品生产领域，将打破现有转基因技术主要应用于人类不直接食用的玉米、大豆、棉花和油菜籽等的局限，育种效率和精准性更高，可以显著地缩短研发和培育品种时间，延长优良品种性状退化时间。更为重要的，通过基因编辑技术生产的粮食能够更好地满足消费者对品质的多样化需求。因此，基因编辑技术对粮食安全具有更加全面和长远的影响。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何调控侧枝发育，而不影响番茄其他生长发育过程。
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物侧枝发育中的应用。
本发明提供的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在下述任一种中的应用：
1)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物侧枝发育中的应用；
2)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在制备调控植物侧枝发育的产品中的应用；
3)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在培育侧枝发育改变的植物中的应用；
4)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在制备培育侧枝发育改变的植物的产品中的应用；
5)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在植物育种中的应用；
所述蛋白质为如下任一所示蛋白质：
a1)氨基酸序列为SEQ ID No.3的蛋白质；
a2)将SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
a3)a1)-a2)中任一所限定的氨基酸序列具有75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
a4)a1)-a3)中任一所限定的蛋白质的末端连接标签后得到的融合蛋白。
上述a1)所述蛋白质的名称为WRKY-B。
为了使a1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。
上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
所述标签蛋白包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His6标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质WRKY-B的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质WRKY-B的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质WRKY-B且具有蛋白质WRKY-B功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本文中，所述90％以上的同一性可为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
上述应用中，所述蛋白质来源于番茄(Solanum lycopersicum)。
本文中，调控所述蛋白质活性和/或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质WRKY-B。
上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
本发明中，所述调控可为上调或增强或提高。所述调控也可为下调或减弱或降低。
本文中，所述调控所述蛋白质的编码基因的表达可为抑制或降低或下调所述编码基因表达。抑制或降低或下调所述编码基因表达可通过基因敲除或基因沉默实现。
所述基因敲除(gene knock-out)是指通过基因编辑技术使特定靶基因失活的现象。基因敲除通过DNA序列的改变使特定靶基因失活，包括且不限于基于锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases，ZFN)，转录激活因子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)和CRISPR/Cas系统，CRISPR(clustered regulatoryinterspaced short palindromic repeat)即成簇的规律间隔的短回文重复序列，是基因组中一个含有多个短重复序列的位点，Cas9蛋白在RNA的介导下能够对crRNA–tracrRNA识别的靶序列进行切割。
所述基因沉默是指在不损伤原有DNA的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变DNA序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活，包括反义RNA、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、RNA干扰(RNAi)和微小RNA(miRNA)介导的翻译抑制等。
上述应用中，所述调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质可为与前文所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料可为下述任一种：
c1)编码前文所述蛋白的核酸分子；
c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；
c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；
c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物；
c5)含有c1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有c2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
c6)含有c1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有c2)所述表达盒的转基因植物组织；
c7)含有c1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有c2)所述表达盒的转基因植物器官；
e1)抑制或降低或沉默前文所述蛋白编码基因表达的核酸分子；
e2)含有e1)所述核酸分子的表达盒；
e3)含有e1)所述核酸分子的重组载体、或含有e2)所述表达盒的重组载体；
e4)含有e1)所述核酸分子的重组微生物、或含有e2)所述表达盒的重组微生物、或含有e3)所述重组载体的重组微生物；
e5)含有e1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有e2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
e6)含有e1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有e2)所述表达盒的转基因植物组织；
e7)含有e1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有e2)所述表达盒的转基因植物器官。
上述应用中，c1)所述核酸分子可为如下任一所示的DNA分子，
d1)核苷酸序列是SEQ ID NO.1所示的DNA分子；
d2)编码区序列是序列表中SEQ ID NO.2所示的DNA分子；
d3)与d1)或d2)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，且编码前文所述蛋白的DNA分子；
d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码前文所述蛋白的DNA分子。
上述应用中，e3)所述的重组载体可为核苷酸序列是SEQ ID No.4和和SEQ IDNo.5组成的DNA分子。
上述应用中，所述重组载体为重组载体PV58-K-Wrky-B，是由16571bp组成的双链DNA，重组载体PV58-K-Wrky-B的一条链的第1-15000位的核苷酸序列是SEQ ID No.4的1-15000位，第15001位-16571位的核苷酸序列是SEQ ID No.5的1-1571位。
本文所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如gRNA、mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。
c2)和e2)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述基因的DNA，该DNA不但可包括启动基因转录的启动子，还可包括终止基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)PlantPhysiol 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5,187,267)；四环素诱导型启动子(美国专利5,057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利2007 1 0099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒或病毒载体。
可用现有的植物表达载体构建含有WRKY-B基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括但不限于如双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如包括但不限于农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮藏蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能。
使用WRKY-B基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，包括但不限于如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入包括但不限于可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的WRKY-B基因或基因的片段导入植物细胞或受体植物，可获得侧枝发育改变的转基因细胞系及转基因植株。携带WRKY-B基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
可选地，e3)所述的重组载体为PV58-K-Wrky-B，所述重组载体的序列为SEQ IDNo.4和和SEQ ID No.5组成的DNA分子。
重组表达载体PV58-K-Wrky-B的结构描述如下：在出发载体PV58-K的限制性内切酶KPN1插入含有sgRNA1、sgRNA2的表达盒序列，保持空载PV58-K的其他序列不变得到的重组载体PV58-K-Wrky-B。
本发明还提供了一种抑制植物侧枝发育的方法，所述方法包括步骤P，所述步骤P为抑制或降低或沉默目的植物中前文所述蛋白的活性和/或含量，或/和，抑制或降低或沉默前文所述蛋白的编码基因的表达量，来抑制植物侧枝发育。
本发明还提供了一种增强植物侧枝发育的方法，所述方法包括步骤M，所述步骤M为增强、提高或上调目的植物中前文所述蛋白的活性和/或含量，或/和，增强、提高或上调前文所述蛋白的编码基因的表达量，来增强植物侧枝发育。
上述方法中，所述降低目的植物中所述蛋白质WRKY-B的编码基因的表达量和/或活性可为利用基因突变、基因敲除、基因编辑或基因敲减技术使目的植物基因组中所述蛋白质WRKY-B的编码基因活性下降或失活。
在一个具体的实施例中，所述抑制植物侧枝发育的方法可包括如下步骤：
A)用CRISPR/Cas9系统对受体番茄中的所述WRKY-B蛋白的编码基因WRKY-B进行基因编辑，且使所述WRKY-B基因发生突变导致翻译蛋白提前终止，得到目的番茄；
B)所述目的番茄自交，得到纯合番茄，即为目的番茄，所述侧枝发育受到抑制的番茄的侧枝数少于所述受体番茄。
所述WRKY-B基因是如下的DNA分子：
d1)核苷酸序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子；
d2)编码区序列是序列表中SEQ ID No.2所示的DNA分子；
d3)与d1)或d2)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，且编码前文所述蛋白的DNA分子；
d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码前文所述蛋白的DNA分子。
本发明提供一种培育侧枝发育受到抑制的植物的方法，包括抑制或降低或沉默目的植物中上述蛋白的编码基因的表达和/或上述蛋白的含量和/或活性，或/和抑制或降低或沉默上述蛋白质的编码基因的活性和/或含量，得到侧枝发育受到抑制的植物，所述侧枝发育受到抑制的植物的侧枝数少于所述受体植物。
在本发明的一个实施方案中，所述培育侧枝发育受到抑制植物的育种方法包括如下步骤：
(1)构建抑制或降低或沉默前文所述蛋白质的编码基因的重组表达载体；
(2)将步骤(1)构建的重组表达载体转入受体植物中，获得侧枝数少于所述受体植物的植物。
上述方法中，所述抑制或降低或沉默目的植物中所述蛋白质WRKY-B的编码基因的表达量和/或活性可为利用基因突变、基因敲除、基因编辑或基因敲减技术使目的植物基因组中所述蛋白质WRKY-B的编码基因活性下降或失活。
上述方法中，所述基因敲除通过CRISPR/Cas9系统实现。
上述方法中，所述CRISPR/Cas9系统基因编辑的靶点1为序列1第89-108位或对应序列2的第89-108位。
上述方法中，所述CRISPR/Cas9系统基因编辑的靶点2为序列1第216-235位或对应序列2的第216-235位。
上述方法中，敲除目的番茄所述蛋白质的编码基因可为将番茄基因组中的序列3所示的所述蛋白质的编码基因进行下述至少一种突变：
1)用5’-TATTAAGCACGATTCCAA-3’替换番茄基因组DNA中的所述蛋白质的编码基因中的5’-TATTAAGCACGATTCTTCAA-3’，从而将编码WRKY-B蛋白的基因敲除。
2)用5’-TTTGATTTTCAACACTTTC-3’替换番茄基因组DNA中的所述蛋白质的编码基因中的5’-TTTGGATTTTCAACACTTTC-3’，从而将编码WRKY-B蛋白的基因敲除。
本发明中，所述植物育种的目的可包括培育侧枝发育受到抑制的植物。
前文所述的蛋白质和/或所述的生物材料也属于本发明要求保护的范围。
本文中，所述植物可为如下任一种：
N1)双子叶植物：
N2)茄目植物；
N3)茄科植物；
N4)茄属植物；
N5)番茄。
本发明利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对番茄侧枝发育相关蛋白WRKY-B编码基因进行特定靶点的定点突变或敲除，与野生型比较，突变体wrky-B表现出侧枝减少的表型，说明Wrky-B正向调控番茄侧枝发育，为侧枝发育受到抑制的番茄品种选育提供新材料，对加快改良番茄品种具有积极的作用，为番茄农业生产的提供新策略、新方向。
附图说明
图1为转化再生植株PCR检测。其中M代表marker，B代表空白对照，N代表阴性对照，P代表阳性对照。
图2为番茄基因编辑植株T0代突变类型图。
图3为纯合突变体测序峰图。
图4为番茄野生型和突变体wrky-B侧枝形成表型研究。其中：A为野生型植株WT和突变体wrky-B不同时间点侧枝的表型；B为WT和突变体wrky-B在生育过程中侧枝形成情况的统计分析；其中每列表示番茄单株，每个小方格表示番茄的一个分枝，左列数字代表番茄植株分枝数量；不同颜色表示侧枝形成的不同情况，绿色表示腋芽刚形成，橙色表示无腋芽和侧枝的形成，红色表示腋芽已经形成侧枝。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量实验，如无特别说明，均设置三次重复实验。
下述实施例中的PV58-K质粒来源于原始载体pkse401(陈其军实验室保存)，已记载于：Xing HL,et al.,A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing inplants.BMC Plant Biol.2014Nov 29；14:327.(doi:10.1186/s12870-014-0327-y.)。由武汉天问生物科技有限公司进行对其抗性位点进行改造，从而得到实施例中的pv58-K载体。具体改造信息如下：与pKSE401相比，pv58-k载体含有TRNA(核苷酸序列为pv58-k载体的第699-775位)，含有KpnI酶切位点(核苷酸序列为pv58-k载体的第776-781位)，含有P2A序列(核苷酸序列为pv58-k载体的第6237-6293位)，含有潮霉素标签(核苷酸序列为pv58-k载体的第6294-7319位)。公众可从申请人处或武汉天问生物科技公司获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的番茄品种AC由东北农业大学番茄遗传育种实验室保存，已记载于：Yiyao Zhang,Aining Zhang,Wenhui Yang,Xinyi Jia,Qingjun Fu,Tingting Zhao,Jingbin Jiang,Jingfu Li,Huanhuan Yang and Xiangyang Xu.Transcriptome Analysisand Screening of Genes Associated with Flower Size in Tomato(Solanumlycopersicum)Int.J.Mol.Sci.2022,23(24),15624。公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、针对WRKY-B基因CRISPR-Cas9的sgRNA设计与重组载体WRKY-B-Cas9的构建
番茄WRKY-B(WRKY-BRANCHED，Solyc02g071130)基因在番茄数据库的基因组序列为序列表中序列1，WRKY-B基因在番茄的编码序列(CDS)是序列表中序列2，编码氨基酸序列是序列表中序列3的WRKY-B蛋白。序列1的第1-457位为第一外显子，第538-681位为第二外显子，第1104-1605位为第三外显子。
1.CRISPR载体构建步骤如下：
根据提供的mRNA序列及对应的基因组序列信息，设计2个CRISPR靶位点，以提高基因打靶效率。根据靶位点设计靶位点PCR扩增引物。引物合成后，PCR扩增出含有靶位点的片段，含有靶位点的PCR片段利用重组酶ClonExpress IIOne Step Cloning Kit(南京诺维赞生物科技有限公司，货号C112-01)克隆至最终的CRISPR表达载体。将构建的CRISPR载体电转入大肠杆菌TOP10，通过菌落PCR及测序筛选阳性克隆子。具体步骤如下：
(1)CRISPR靶位点及靶位点接头引物设计
依据Solyc02g071130的CDS序列与基因组序列设计靶位点sgRNA1和sgRNA2，以及载体构建的PCR引物(表1)，靶位点在基因组区域的位置如下所示：
sgRNA1：5’-TATTAAGCACGATTCTTCAA-3’(针对的靶点序列为SEQ ID No.1的第89-108位和SEQ ID No.2的第89-108位)；
sgRNA2：5’-TTTGGATTTTCAACACTTTC-3’(针对的靶点序列为SEQ ID No.1的第216-235位和SEQ ID No.2的第216-235位)。
(2)靶点接头制备
载体酶切体系及条件(回收较大质量载体时需同时酶切2-4份，以确保回收到足够量的线性化载体)。单酶切(所用均为Takara快切酶)体系50ul：KpnI 1μL；10×buffer5ul；质粒DNA 2ug；ddH2O补足至50μL。混匀后，37℃水浴30min。配制1.5％的琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化目的片段。在目的基因两侧各添加一条18bp的同源臂在做同源重组时就会跳过KpnI酶切位点识别序列，达到缺失酶切位点的目的。
(3)同源重组
体系(20μL体系)如下：插入基因片段的加入体积＝片段大小×0.04/浓度(1μL≈10/11.6)(注：插入片段扩增产物的使用量应在10-200ng之间，由于193×0.04＝7.72<10，所以直接选择最低使用量)；线性化载体的加入体积＝载体大小×0.02/浓度(6μL≈200/32.2)(注：线性化克隆载体的使用量应在50-200ng之间，由于16384×0.02＝327.68>200，所以直接选择最高使用量)；5×CE II Buffer 4μL；Exnase II 2μL；ddH2O补足至20μL。枪头吹打混匀后，37℃连接30min，立即置于冰上。转化至大肠感受态细胞内。
(4)大肠杆菌转化与靶点检测
将上述构建的重组表达载体转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞中，具体步骤为：冰浴静置30分钟，轻轻取出，42℃热激60秒，置于冰上2分钟；加入600μl LB液体培养基，37℃150rpm复苏培养1小时后铺板，取适量菌液涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃过夜培养。挑取阳性单克隆，采用引物WRKY-B-F2：5’-ACCTTCTTTACAAAAGTGGGGTCTACATC-3’，WRKY-B-R2：5’-AGAGTGAAGTTGATCATCTTGAAGATGGA-3’进行菌落PCR检测，并送测序，分析靶点序列是否存在。
菌落PCR检测体系如下：细菌菌液2μL；10×Buffer 2μL；dNTP Mixture(2mM)
2μL；PrimerF(10μM)0.3μL；PrimerR(10μM)0.3μL；Taq(5U/μL)
0.2μL；ddH2O补足至20μL。PCR程序如下：98℃3min；94℃30sec；58℃30sec；72℃30sec；72℃8min；，30个循环；25℃1min。
如两个靶点序列均存在于重组表达载体中，则表明该重组载体表达sgRNA1和sgRNA2成功转入空载PV58-K中，并将上述构建的重组表达载体命名为PV58-K-Wrky-B。重组表达载体PV58-K-Wrky-B的核苷酸序列是序列表中的SEQ ID No.4和SEQ ID No.5。重组载体PV58-K-Wrky-B是由16571bp组成的双链DNA，一条链的第1-15000位的核苷酸序列是SEQID No.4的1-15000位，第15001位-16571位的核苷酸序列是SEQ ID No.5的1-1571位。
重组表达载体PV58-K-Wrky-B的结构描述如下：在出发载体PV58-K的限制性内切酶KPN1插入含有sgRNA1、sgRNA2的表达盒，保持空载PV58-K的其他序列不变得到的重组载体PV58-K-Wrky-B。
实施例2、番茄遗传转化及阳性转基因植株的筛选
1.番茄遗传转化
番茄种子消毒，播种于1/2MS培养基中暗培养至种子发芽，然后转入光照条件培养6-8d；无菌苗子叶，预培养2d；在含50mg/L的卡那霉素培养基上活化农杆菌GV3101，得到重组农杆菌GV3101-Wrky-B。
农杆菌GV3101-Wrky-B侵染番茄品种AC，然后暗培养条件，共培养2d；转入筛选培养基(配制方法(1L)如下：30g/L蔗糖+15g/L琼脂+2.0mg/6-BA+2.0mg/ZT+0.2mg/IAA，含50mg/L的卡那霉素，余量为水)，2周继代一次，直至出现绿色芽点；将卡那霉素抗性芽转入生根培养基(配制方法(1L)如下：30g/L蔗糖+15g/L琼脂+0.2mg/IAA+50mg/L卡那霉素，余量为水)，光照培养，2-3周生根；剪取再生植株叶片，利用CTAB法抽提DNA，利用筛选标记基因特异性引物进行PCR检测。
PCR检测反应体系如下：DNA样品1μL；10×PCR buffer 2μL；dNTP mixture(2mmol/L each)0.4μL；上游引物:5’-ACTGGGCACAACAGACAATCG-3’(10μmol/L)0.2μL；下游引物:5’-GCATCAGCCATGATGGATACTTT-3’(10μmol/L)0.2μL；rTaq DNA polymerase(1U/μL)0.2μL；ddH2O补足至20μL。
PCR反应程序：94℃3min；94℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，72℃10min进行30个循环；25℃1min。
通过种子萌发、子叶预培养、农杆菌介导的遗传转化、筛选培养及分化、抗性芽生根等过程共获得23棵转化再生植株。用Kana引物(上游引物：5’-ACTGGGCACAACAGACAATCG-3’，下游引物：5’-GCATCAGCCATGATGGATACTTT-3’)对23株转化植株进行PCR检测，其中12株为阳性转化植株，株系号为1、3、4、6、8、9、11、12、14、16、19、23(图1)。Kana引物序列来源：农业部1782号公告-2-2012，长度为289bp。
2、阳性转化植株突变体的创制及编辑位点检测
1)植株培养
提取野生型番茄品种AC植株和步骤1获得的抗性植株株系号为1、2、3、4、6、8、9、11、12、14、16、19、23的T0植株叶片DNA，以野生型番茄品种AC植株DNA为阴性对照。
2)靶基因的编辑位点检测
通过在2个特异的靶点序列位点上下游设计引物，对转基因阳性植株1、2、3、4、6、8、9、11、12、14、16、19、23进行PCR扩增，产物纯化回收后测序，对WRKY-B基因进行编辑位点检测。靶点检测引物如下：
靶点检测上游引物：5’-ACCTTCTTTACAAAAGTGGGGTCTACATC-3’
靶点检测下游引物：5’-AGAGTGAAGTTGATCATCTTGAAGATGGA-3’
靶点附近的PCR产物测序结果显示：存在如下两种突变事件Wrky-c-1和Wrky-c-2，事件Wrky-c-1和Wrky-c-2的靶基因Wrky-B被成功编辑(图2)。
突变体Wrky-B-c-1与野生型相比，对于WRKY-B基因发生了如下突变：WRKY-B基因中的序列1第220位的一个碱基G缺失(对应于SEQ ID No.2的第220位)。这个核苷酸的缺失造成WRKY-B蛋白功能缺失，从而将WRKY-B基因敲除，该突变位点及其周边核苷酸的测序结果见图2。
突变体Wrky-B-c-2与野生型相比，对于WRKY-B基因发生了如下突变：WRKY-B基因中的序列1第104-105位的两个碱基TT缺失(对应于SEQ ID No.2的第104-105位)，同时序列1第220位的一个碱基G缺失(对应于SEQ ID No.2的第220位)。上述核苷酸的缺失造成WRKY-B蛋白功能缺失，从而将WRKY-B基因敲除，该突变位点及其周边核苷酸的测序结果见图2。
实施例3、番茄转化植株的表型鉴定
待测植株为：野生型番茄品种AC植株和步骤1获得的抗性植株株系Wrky-B-c-1#和Wrky-B-c-2#的T3代植株。番茄野生型和突变型种植在温度25-28℃，16光照8小时黑暗，湿度为75％的人工气候室内。
以待测番茄的基因组DNA为模板，用序列F：5’-ACCTTCTTTACAAAAGTGGGGTCTACATC-3’和序列R：5’AGAGTGAAGTTGATCATCTTGAAGATGGA-3’特异引物进行PCR扩增，得到扩增产物进行测序，纯合突变体测序峰图如图3。
纯合突变体植株Wrky-c-1#与野生型AC相比，对于WRKY-B基因发生了如下突变：WRKY-B基因中的序列1第220位的一个碱基G缺失(对应于SEQ ID No.2的第217位)。这个核苷酸的缺失造成WRKY-B蛋白功能缺失，从而将WRKY-B基因敲除，该突变位点及其周边核苷酸的测序结果见图3。
通过突变体wrky-B和野生型WT侧枝形成的表型观察结果表明(图4中A)：野生型WT在21天叶腋处开始萌发出侧芽，而突变体wrky-B则无腋芽形成；在28天时野生型WT的侧芽不断生长，突变体wrky-B有小腋芽的出现；在35天时，野生型WT侧枝生长明显，而wrky-B叶腋处的腋芽生长不明显。图4中B显示，与野生型WT相比，突变体wrky-B在第8叶腋处仅有腋芽的形成，其侧枝形成明显受到了抑制。因此，表明WRKY-B正向调控番茄侧枝的发育。敲除WRKY-B基因可使番茄侧枝受到抑制。
本发明利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术快速创制番茄少侧枝材料。本发明所述创制番茄番茄少侧枝材料的方法和检测番茄少侧枝材料的方法，可应用于其他番茄品系。与传统的杂交育种相比，1-2年内将骨干亲本由普通多侧枝番茄材料转育为少侧枝番茄材料，且无连锁累赘等不良效应，具有极大的育种应用前景和经济价值。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在下述任一种中的应用：
1)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物侧枝发育中的应用；
2)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在制备调控植物侧枝发育的产品中的应用；
3)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在培育侧枝发育改变的植物中的应用；
4)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在制备培育侧枝发育改变的植物的产品中的应用；
5)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在植物育种中的应用；
所述蛋白质为如下任一所示蛋白质：
a1)氨基酸序列为SEQ ID No.3的蛋白质；
a2)将SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
a3)与a1)-a2)中任一所限定的氨基酸序列具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
a4)在a1)-a3)中任一所限定的蛋白质的末端连接标签后得到的融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述蛋白质来源于番茄(Solanumlycopersicum)。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质为与权利要求1或2所述应用中所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为下述任一种：
c1)编码所述蛋白的核酸分子；
c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；
c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；
c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物；
c5)含有c1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有c2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
c6)含有c1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有c2)所述表达盒的转基因植物组织；
c7)含有c1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有c2)所述表达盒的转基因植物器官；
e1)抑制或降低或沉默所述蛋白编码基因表达的核酸分子；
e2)含有e1)所述核酸分子的表达盒；
e3)含有e1)所述核酸分子的重组载体、或含有e2)所述表达盒的重组载体；
e4)含有e1)所述核酸分子的重组微生物、或含有e2)所述表达盒的重组微生物、或含有e3)所述重组载体的重组微生物；
e5)含有e1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有e2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
e6)含有e1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有e2)所述表达盒的转基因植物组织；
e7)含有e1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有e2)所述表达盒的转基因植物器官。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：c1)所述核酸分子为如下任一所示的DNA分子，
d1)核苷酸序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子；
d2)编码区序列是序列表中SEQ ID No.2所示的DNA分子；
d3)与d1)或d2)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白的DNA分子；
d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白的DNA分子。
5.一种降低植物侧枝发育的方法，其特征在于：所述方法包括步骤P，所述步骤P为抑制或降低或沉默目的植物中权利要求1或2中所述蛋白的活性和/或含量，或/和，抑制或降低或沉默权利要求1或2中所述蛋白的编码基因的表达量，来抑制植物侧枝发育。
6.一种提高植物侧枝发育的方法，其特征在于：所述方法包括步骤M，所述步骤M为增强、提高或上调目的植物中权利要求1或2中所述蛋白的活性和/或含量，或/和，增强、提高或上调权利要求1或2中所述蛋白的编码基因的表达量，来增强植物侧枝发育。
7.一种培育侧枝发育受到抑制的植物的育种方法，其特征在于：包括抑制或降低或沉默目的植物中权利要求要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达量，和/或，所述蛋白质的活性和/或含量得到侧枝发育受到抑制的植物，所述侧枝发育受到抑制的植物的侧枝数少于所述受体植物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)构建抑制或降低或沉默权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的重组表达载体；
(2)将步骤(1)构建的重组表达载体转入受体植物中，获得植物侧枝数少于所述受体植物的植物。
9.权利要求1或2中所述的蛋白质和/或权利要求3或4中所述的生物材料。
10.权利要求1-4中任一权利要求所述的应用，和/或，权利要求5-8任一所述的方法，其特征在于：所述植物为如下任一种：
N1)双子叶植物：
N2)茄目植物；
N3)茄科植物；
N4)茄属植物；
N5)番茄。
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| CN117904142A (zh) * | 2024-03-18 | 2024-04-19 | 浙江大学海南研究院 | SlMYB52基因在提高番茄盐胁迫抗性中的应用 |
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