CN105585623B - 抗病转TaMYB-KW基因小麦的培育方法及相关生物材料与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了抗病转TaMYB‑KW基因小麦的培育方法及相关生物材料与应用。本发明公开的TaMYB‑KW蛋白质为：A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。实验证明，TaMYB‑KW及其编码基因可以提高植物的抗病性，TaMYB‑KW基因是一种与纹枯病抗性密切相关的小麦抗病蛋白基因，可用于植物的遗传改良。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中抗病转TaMYB-KW基因小麦的培育方法及相关生物材料与应用。
背景技术
小麦(Triticuma aestivum)是人类赖以生存的四大作物之一，世界上1/3以上的人口以小麦为主食，小麦的产量与品质直接影响着人类的生存与生活质量。随着耕作制度、肥水条件和气候条件等因素的改变，土传病害纹枯病、根腐病在我国小麦生产区呈加重发生态势,已成为制约小麦高产、稳产的重要因素之一。
小麦纹枯病，也称为小麦尖眼斑病(wheat sharp eyespot)，是一种世界性小麦土传真菌病害,主要是由腐生营养型病原真菌禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)CAG-1或立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)AG4、AG5融合群引起。我国小麦纹枯病主要病原菌为禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)。纹枯病一般可使小麦减产10％～30％，严重地块则使小麦减产50％以上。据全国农技推广站报道，2005—2015年我国小麦纹枯病每年发生面积约1-1.2亿亩，经济损失达数十亿元以上，已成为我国小麦主产区小麦第一大病害。因此，选育和推广抗性的小麦品种是防治小麦病害流行的最经济、安全和有效的途径，对于保证我国小麦高产、稳产非常重要。然而，由于小麦纹枯病抗性均由多基因控制，缺乏理想的小麦抗病种质资源，常规育种方法在选育对纹枯病抗性小麦品种方面的研究进展缓慢。分子生物学和基因工程的发展为植物抗性育种开辟了一条新途径。植物抗性蛋白基因的分离克隆与功能分析，对阐明植物抗性机制、有效地进行分子育种研究十分必要，已成为国内外植物科学研究的热点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗病性。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了名称为抗病相关蛋白(TaMYB-KW)的蛋白质，该蛋白质为如下A1)、A2)或A3)：
A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；
A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
其中，序列2由243个氨基酸残基组成。
为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述A2)中的TaMYB-KW蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述A2)中的TaMYB-KW蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述A2)中的TaMYB-KW蛋白质的编码基因可通过将序列1的第99-830位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
为解决上述技术问题，本发明还提供了与TaMYB-KW相关的生物材料，该生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：
B1)编码TaMYB-KW的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
B8)降低TaMYB-KW表达的核酸分子；
B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
上述生物才料中，B1)所述核酸分子可为如下b1)-b4)中任一种：
b1)其编码序列是序列表中序列1的第99-830位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；
b2)其编码序列是序列表中序列1的第1-1028位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；
b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码TaMYB-KW的cDNA分子或基因组DNA分子；
b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码TaMYB-KW的cDNA分子或基因组DNA分子；
B8)所述核酸分子为与序列表中序列1所示的DNA分子中任一片段反向互补的DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，序列1由1028个核苷酸组成，其中序列1的第99-830位核苷酸所示的DNA分子编码序列2所示的蛋白质。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码TaMYB-KW的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的TaMYB-KW的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码TaMYB-KW且具有TaMYB-KW功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述生物材料中，B2)所述的含有编码TaMYB-KW的核酸分子的表达盒(TaMYB-KW基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达TaMYB-KW的DNA，该DNA不但可包括启动TaMYB-KW基因转录的启动子，还可包括终止TaMYB-KW基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)PlantPhysiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic AcidRes.,15:9627)。
可用现有的表达载体构建含有所述TaMYB-KW基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pMD18-T或pAHC25。所述病毒载体具体可为BMSV病毒的载体，如γ载体。
B3)所述重组载体可含有序列1的第99-830位所示的用于编码TaMYB-KW的DNA序列；进一步B3)所述重组载体具体可为pA25-TaMYB-KW。所述pA25-TaMYB-KW为将pAHC25载体的Spe I和EcolCR I识别位点间的DNA序列替换为序列1的第99-830位所示的DNA序列，保持其它DNA序列不变，得到表达序列2所示的TaMYB-KW的重组载体。
上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia),欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium),产碱菌属(Alcaligenes),假单胞菌属(Pseudomonas),芽胞杆菌属(Bacillus)等。
上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
上述生物材料中，B8)所述核酸分子具体可为与序列表中序列1的第576-836位核苷酸所示的DNA分子反向互补的DNA分子。
为解决上述技术问题，本发明还提供了植物抗病剂。所述植物抗病剂含有TaMYB-KW或所述生物材料。
上述植物抗病剂中，所述植物抗病剂可以以所述TaMYB-KW作为活性成分，还可以将TaMYB-KW和其它抗病性物质进行组合得到的组合物作为活性成分。
上述植物抗病剂中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体可为小麦。所述小麦可为小麦种质资源CI12633或扬麦16。
上述植物抗病剂中，所述抗病性可为抗纹枯病。所述纹枯病可由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)引起。所述禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)可为禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)R0301。
为解决上述技术问题，本发明还提供了TaMYB-KW、或所述生物材料在下述1)-3)中任一种中的应用：
1)调控植物抗病性；
2)制备植物抗病性产品；
3)培育抗病性植物。
上述应用中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体可为小麦。所述小麦可为小麦种质资源CI12633或扬麦16。
上述应用中，所述抗病性可为抗纹枯病。所述纹枯病可由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)引起。所述禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)可为禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)R0301。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育抗病性转基因植物的方法，该方法包括向受体植物中导入TaMYB-KW的编码基因得到抗病性高于所述受体植物的抗病性转基因植物。
在本发明的实施例中，所述TaMYB-KW的编码基因(即序列1的第99-830位核苷酸所示的DNA分子)通过含有TaMYB-KW基因表达盒的TaMYB-KW基因重组表达载体导入目的植物中。所述TaMYB-KW基因表达盒中，启动TaMYB-KW基因转录的启动子为玉米Ubiquitin启动子。
上述培育抗病性转基因植物的方法中，其中所述TaMYB-KW基因可先进行如下修饰，再导入受体种子植物中，以达到更好的表达效果：
1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述TaMYB-KW基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；
2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。
所述TaMYB-KW基因表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
所述方法还包括从导入序列2所示的TaMYB-KW的编码基因的植株中筛选表达所述编码基因的植株，得到所述转基因小麦。
上述培育抗病性转基因植物的方法中，所述受体植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体可为小麦。所述小麦可为小麦种质资源CI12633扬麦16。
上述培育抗病性转基因植物的方法中，所述抗病性可为抗纹枯病。所述纹枯病可由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)引起。所述禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)可为禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)R0301。
上述培育抗病性转基因植物的方法中，所述TaMYB-KW的编码基因的编码序列可为序列表中序列1的第99-830位的DNA分子。
为解决上述技术问题，本发明还提供了培育抗病性降低的转基因植物的方法，该方法包括降低目的植物中TaMYB-KW的编码基因的表达，得到抗病性低于所述目的植物的转基因植物。
上述培育抗病性降低的转基因植物的方法中，所述目的植物可为单子叶植物。所述单子叶植物具体可为小麦。所述小麦可为小麦种质资源CI12633或扬麦16。
上述培育抗病性降低的转基因植物的方法中，所述抗病性可为抗纹枯病。所述纹枯病可由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)引起。所述禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)可为禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)R0301。
上述培育抗病性降低的转基因植物的方法中，降低目的植物中TaMYB-KW的编码基因的表达是通过将与序列表中序列1的第576-836位核苷酸所示的DNA片段反向互补的DNA分子导入所述目的植物实现的。
在本发明的一个实施例中，与序列表中序列1的第576-836位核苷酸所示的DNA片段反向互补的DNA分子通过BMSV病毒的γ载体导入所述目的植物中。
本发明中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述TaMYB-KW基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
实验证明，在接种禾谷丝核菌后，TaMYB-KW基因在抗纹枯病小麦CI12633中的表达量显著升高，TaMYB-KW及其编码基因可以提高植物的抗病性：植物中的TaMYB-KW基因降低表达后，对小麦纹枯病的抗病性下降；将TaMYB-KW基因转入植物中得到的转TaMYB-KW基因植物的病情指数为20.00-36.00，转TaMYB-KW基因植物的纹枯病病级为1.00-1.67，转TaMYB-KW基因植物的病情指数和病级均极显著低于野生型植株。说明TaMYB-KW基因是小麦抗纹枯病反应所需的抗病基因，正向参与小麦抗纹枯病反应。TaMYB-KW基因是一种与纹枯病抗性密切相关的小麦抗病蛋白基因，对植物育种具有重大价值。本发明的培育抗病性提高的转基因植物的方法具有重要的理论及实际意义，在植物的遗传改良中将发挥重要作用。
附图说明
图1为小麦TaMYB-KW基因在抗病小麦CI12633中的表达模式。其中，a表示接种第4天和第10天TaMYB-KW基因的表达量显著高于接种第0天；b表示接种第10天TaMYB-KW基因的表达量显著高于接种第4天。
图2接种BSMV病毒的小麦植株中TaMYB-KW基因的表达分析结果。其中，BSMV:GFP表示接种BSMV:GFP小麦；接种BSMV:TaMYB-KW-1～3表示三株接种BSMV:TaMYB-KWKW的小麦。
图3TaMYB-KW基因沉默的小麦CI12633植株及其对照的纹枯病表型。其中，BSMV:GFP表示接种BSMV:GFP小麦；接种BSMV:TaMYB-KW-1～3表示三株接种BSMV:TaMYB-KW的小麦。
图4为转TaMYB-KW基因小麦的PCR检测结果。其中，a为TO代，b为T1代，c为T2代；P表示pA25-TaMYB-KW；WT表示扬麦16；H2O:空对照；MO1～MO5均表示转基因植株。
图5为T0-T2代转TaMYB-KW基因小麦的定量PCR检测结果。其中，WT表示扬麦16，MO1～5均表示转基因植株。**转基因株系与WT有极显著差异(P<0.01)。
图6抗纹枯病转基因小麦植株和扬麦16的表型比较结果。其中，其中，WT表示扬麦16，MO1～MO5均表示转基因植株。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
小麦种质资源CI12633抗纹枯病，小麦品种扬麦16中感纹枯病。抗病小麦材料—小麦CI 12633来自于江苏农业科学院种质资源库，小麦品种扬麦16来自于江苏里下河地区农业科学研究所，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验。
小麦纹枯病致病菌-禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)R0301(冷苏凤，张爱香，李伟，陈怀谷.江苏省小麦新品种(系)对纹枯病的抗性分析.江苏农业学报，2010，26(6)：1176-1180；Chen Liang,Zhang Zengyan(Correspondance),Liang Hongxia,Liu Hongxia,Du Lipu,Xu Huijun,Xin Zhiyong.2008.Overexpression of TiERF1enhancesresistance to sharp eyespot in transgenic wheat.Journal of ExperimentalBotany.59:4195-4204)，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
单子叶植物表达载体pAHC25(pAHC25由pUC8改造而成，含有2个表达盒，第1个表达盒具有玉米Ubiquitin启动子、Exon、Intron、GUS、Nos终止子，GUS两端具有SmaI和SacI酶切位点，第2个表达盒具有玉米Ubiquitin启动子、Exon、Intron、Bar、Nos终止子：(参考文献：Christensen and Quail,1996；Ubiquitin promoter-based vectors for high-levelexpression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonousplants.Transgenic Research，5,213–218)。公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验。pAHC25由pUC8改造而成，含有2个表达盒，第1个表达盒具有玉米Ubiquitin启动子、Exon、Intron、GUS、Nos终止子，GUS两端具有SmaI和SacI酶切位点，第2个表达盒具有玉米Ubiquitin启动子、Exon、Intron、Bar、Nos终止子。
BSMV-γ(BMSV病毒的γ载体)(Holzberg S,Brosio P,Gross C,PogueGP.2002.Barley stripe mosaic virus-induced gene silencing in a monocotplant.The Plant Journal 30,315-327)公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验。BSMV-α和BSMV-β及BSMV-γ-GFP(Holzberg S,Brosio P,Gross C,Pogue GP.2002.Barley stripe mosaic virus-induced gene silencing in a monocotplant.The Plant Journal 30,315-327)公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验。其中，BSMV-γ-GFP是将GFP(绿色荧光蛋白)编码区全长DNA插入BSMV-γ载体的多克隆酶切位点中得到可表达GFP的重组载体。
下述实施例中的pMD18-T为宝生物工程(大连)有限公司产品。
实施例1、小麦抗病蛋白TaMYB-KW及其编码基因的克隆
本申请的发明人，从抗纹枯病小麦CI12633中分离克隆出一个小麦抗病蛋白，将其命名为TaMYB-KW。TaMYB-KW基因的具体克隆方法如下：
取用小麦纹枯病菌接种的小麦CI12633幼苗的叶片，液氮处理，按照InvitrogenTRIZOL Reagent总RNA提取试剂说明书的方法提取叶片的总RNA。根据Invitrogen公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，将提取的RNA样品反转录合成第一链cDNA，作为基因克隆的模板。
为了获得TaMYB-KW基因全长的cDNA序列，利用两对引物,采用RACE和巢式PCR方法进行扩增。利用引物对TaMYB-KWA-U1(5’-GCAGCATTTACCTTCGGAC-3’)和AUAP(5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3')通过第一轮PCR扩增，PCR扩增体系为：2×GC BufferⅠ(TaKaRa)10μL,cDNA 2.0μL(50ng),2.5mM dNTPs(TaKaRa)1.0μl,10μmol/L TaMYB-KW A-43U1 0.5μL,10μmol/L TaMYB-KW A-1038L1 0.5μL,5U/μl TaKaRa Prime STAR 0.2μl，ddH2O补至20μL；PCR扩增程序为：先95℃预变性3分钟；然后98℃45秒，59℃7秒，72℃90秒，共30个循环；再72℃延伸10分钟。然后，利用TaMYB-KWA-U2(5’-CGTCAACACACTGAGCAATC-3’)和AUAP(5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3')引物和一轮PCR产物稀释液(50倍)做模板，进行二轮PCR扩增，扩增体系为：2×GC BufferⅠ(TaKaRa)10μL,一轮PCR产物50倍稀释液2.0μL,2.5mM dNTPs(TaKaRa)1.0μl,10μmol/L TaMYB-KWA-U2 0.5μL,10μmol/L TaMYB-KWA-L2 0.5μL,5U/μlTaKaRa Prime STAR 0.2μl，ddH2O补至20μL；PCR扩增程序为：先95℃预变性3分钟；然后98℃45秒，58℃7秒，72℃90秒，共30个循环；再72℃延伸10分钟。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果扩增得到一条的片段，将该PCR产物连接到pMD18-T载体上并测序。测序结果表明,该PCR扩增产物的核苷酸序列如序列的序列1(第1-1028位核苷酸)所示，其编码序列是序列表中序列1的第99-830位核苷酸；编码序列2所示的抗病蛋白TaMYB-KW。
实施例2、TaMYB-KW基因受小麦纹枯病致病菌的诱导表达分析
为了研究TaMYB-KW基因表达量与小麦纹枯病抗性是否相关，利用Q-RT-PCR分析TaMYB-KW基因在禾谷丝核菌接种4天和10天的抗纹枯病小麦CI12633中的表达情况。
用小麦纹枯病致病菌-禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)R0301菌丝牙签、麦粒接种于小麦CI12633分蘖期幼苗的叶鞘与茎间；于接种4天和21天后取小麦茎，液氮速冻后储存于－80℃超低温冰箱备用。
分别提取各小麦茎的总RNA(每个样品约5μg总RNA)，根据Invitrogen公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，反转录成cDNA。利用组成性表达的actin基因作为内参，将样品cDNA浓度均一化。然后用TaMYB-KW基因的特异引物进行实时定量RT-PCR分析，用2-△ΔCT法(Livak KJ,Schmittgen TD.2001.Analysis of relative gene expression data usingreal-time quantitative PCR and the 2-△ΔCT method.Methods.25:402-408)分析TaMYB-KW基因在小麦纹枯病菌处理下的表达情况，每组样品重复3次。
内参基因actin的引物对：
WActinF：5’-CACTGGAATGGTCAAGGCTG-3’；WActinR：5’-CTCCATGTCAT CCCAGTTG-3’。
TaMYB-KW基因的特异定量引物对：
TaMYB-KW-QF:5’-CGACTCGTCCTCGTCCAAG-3'；TaMYB-KW-QR:5’-CGACGACGGCATCGAGTAAT-3’
从图1的对接种禾谷丝核菌前后的CI12633的TaMYB-KW基因表达量分析结果可以看出,TaMYB-KW基因响应纹枯病菌侵染、表现为上调表达；在接种禾谷丝核菌4天和10天时，TaMYB-KW基因在抗纹枯病小麦CI12633中的表达量均显著升高。
实施例3、TaMYB-KW沉默小麦的获得和抗病性鉴定
一、重组表达载体的构建
1、用禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)R0301接种小麦CI12633茎与叶鞘，4天后提取RNA，反转录为cDNA；以cDNA为模板，用TaMYB-KW-VIGS-F和TaMYB-KW-VIGS-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(携带NheI位点的TaMYB-KW片段)。
TaMYB-KW-VIGS-F:5’-ACAGCTAGCTCGTCCGCCACCGATTACT-3’(下划线标注为NheI酶识别位点)；
TaMYB-KW-VIGS-R:5’-GGCGCTAGCCTCTGCCTAAATCTGAGACAAAC-3’(下划线标注为NheI酶识别位点)。
PCR反应程序：先94℃预变性3min；然后94℃30s，56℃30s，72℃1min，15个循环；94℃30s，60℃30s，72℃1min，20个循环；最后72℃10min补平末端。
2、回收PCR扩增产物。
3、用限制性内切酶NheI酶切步骤2的回收产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶NheI酶切BSMV-γ-GFP载体质粒DNA，回收载体骨架。
5、将步骤3回收的片段和步骤4回收的载体骨架进行连接，得到连接产物。
6、将步骤5获得的连接产物进行测序，取将序列表中序列1的第576-836位所示的DNA分子反向插入BSMV-γ-GFP载体的克隆，即得到BSMV-γ-TaMYB-KW重组载体。
二、BSMV载体的线性化和体外转录
将用于BSMV侵染的BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ-GFP及BSMV-γ-TaMYB-KW进行酶切，其中BSMV-α、BSMV-γ-GFP及步骤一的BSMV-γ-TaMYB-KW用限制性内切酶Mlu I进行酶切；BSMV-β用限制性内切酶Spe I进行酶切。酶切反应结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测载体是否酶切完全。如果载体被完全酶切，则回收、纯化线性化的载体备用。
参照RiboMAX Large Scale RNA Production Systems-T7kit(Promega)说明书，进行体外转录反应，体系如下：
体外转录反应于37℃恒温条件下进行2h，得到转录反应液。
三、BSMV接种小麦植株
吸取线性化的BSMV-α、线性化的BSMV-β及线性化的BSMV-γ-TaMYB-KW各10μl置于1.5ml离心管中，混匀后，加入60μl的用RNase-free ddH2O稀释，得到的90μl液体，再在上述90μl混合物中加入90μl的GKP溶液(50mM Glycine；30mM K2HPO4,pH＝9.2；1％Bentonite；1％Celite)，共得到180μl的BSMV病毒混合液。
按照上述方法，将线性化的BSMV-γ-TaMYB-KW替换为线性化的BSMV-γ-GFP，其他步骤均不变，得到180μl的对照病毒混合液。
按照上述方法，将线性化的BSMV-γ-TaMYB-KW替换为RNase-free ddH2O，其他步骤均不变，得到180μl的Mock对照混合液。
待小麦幼苗生长至二叶一心期时，吸取10μl的BSMV病毒混合液摩擦接种于小麦幼苗的第二个叶片上。在接种后的小麦叶片表面喷施0.1％的DEPC水溶液，于22℃-23℃条件下保湿2天，得到接种BSMV:TaMYB-KW小麦。分别用对照病毒混合液和Mock对照混合液进行实验，分别得到接种BSMV:GFP小麦和Mock对照小麦。
四、沉默效果检测及抗病鉴定
分别于小麦植株生长至分蘖期时对接种BSMV:TaMYB-KW小麦、接种BSMV:GFP小麦和Mock对照小麦接种禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)R0301，并于接种第14天，剪取第四叶片液氮速冻后提取总RNA。以TaMYB-KW基因特异的定量引物：
TaMYB-KW-QF:5’-CGACTCGTCCTCGTCCAAG-3'
TaMYB-KW-QR:5’-CGACGACGGCATCGAGTAAT-3’
利用定量RT-PCR(Q-RT-RCR)分析TaMYB-KW基因的表达量。结果如图2，与接种BSMV:GFP病毒的植株相比，接种BSMV:TaMYB-KW病毒的植株叶片中TaMYB-KW基因表达量明显下调，说明接种BSMV:TaMYB-KW可引起CI12633植株中TaMYB-KW基因表达的沉默。
于小麦分蘖期接种禾谷丝核菌，接种后30天观察病症，结果如图3所示,按照表2的小麦纹枯病病级标准，确定病级。接种BSMV:GFP病毒的CI12633植株的病级为1.2级，表现抗纹枯病表型；三株接种BSMV:TaMYB-KW的小麦病级分别为3.8级、3.2级、2.8级，出现了典型的小麦纹枯病病斑，表现为感纹枯病病表型；以上结果说明TaMYB-KW基因是小麦CI12633防御纹枯病反应所需的基因，正向调控抗纹枯病小麦CI12633对禾谷丝核菌的防御反应。
表2、小麦纹枯病病级标准
实施例4、TaMYB-KW过表达转基因小麦的获得和抗病性鉴定
一、重组表达载体的构建
1、用禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)R0301接种小麦CI12633的叶鞘和茎，4天后提取RNA，反转录为cDNA；以cDNA为模板，用TaMYB-KW-P25-U和TaMYB-KW-P25-L组成的引物对和高保真扩增酶PRIMERSTAR(TAKARA公司)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(携带SpeI位点的TaMYB-KW基因)。
TaMYB-KW-P25-U:5’-CAAACTAGTATGGGGAGGTCTCCTTGC-3’(下划线标注为SpeI酶识别位点)；
TaMYB-KW-P25-L:5’-CTAAATCTGAGACAAACT-3’。
PCR反应程序：先94℃预变性3min；然后94℃30s，56℃30s，72℃1min，15个循环；94℃30s，58℃30s，72℃1min，20个循环；最后72℃10min补平末端。
2、回收PCR扩增产物TaMYB-KW-P。
3、用限制性内切酶SpeI酶切TaMYB-KW-P回收产物，回收酶切产物中约737bp的片段。
4、用限制性内切酶SpeI和EcoICRI(与SacI识别酶切序列一致的同裂酶,但EcoICRI酶切后产生平末端)酶切单子叶植物转基因表达载体pAHC25，回收载体骨架。
5、将步骤3回收的DNA片段和步骤4回收的载体骨架进行连接，得到连接产物。
6、将步骤5获得的连接产物进行测序，测序结果表明骨架载体为单子叶植物表达载体pAHC25的一部分，在SpeI和EcoICRI识别位点之间插入了SEQ ID No.2的第99-830位所示的TaMYB-KW蛋白的编码基因，将该重组载体命名为pA25-TaMYB-KW。pA25-TaMYB-KW为将pAHC25载体的SpeI和EcoICRI识别位点(与SacI识别酶切序列一致为同裂酶,但EcoICRI酶切后产生平末端)酶切位点之间插入了序列表中序列1的5′末端的第99位至第830位核苷酸所示的TaMYB-KW基因；TaMYB-KW基因受Ubiquitin启动子控制；质粒还具有1个受Ubiquitin启动子控制的Bar基因表达盒，可为后续工作中利用除草剂双丙氨膦(Bialaphos)筛选转化再生植株提供抗性标记。
二、转基因植物的获得
1、将1736块扬麦16的幼胚愈伤组织作为基因枪轰击的受体，用基因枪将重组质粒pA25-TaMYB-KW轰击到愈伤组织。
2、将被基因枪轰击后的愈伤组织在渗透压培养基上后处理16h。
3、然后将愈伤组织转移到SD2培养基(MS培养基的无机盐成分中添加VB1 1mg/L，天冬门酰胺150mg/L,2,4-D 2mg/L)上，恢复培养2周(26℃，暗培养)。
4、将恢复培养后的愈伤组织转移到分化筛选培养基中(1/2MS培养基+萘乙酸1mg/L+激动素1mg/L+双丙氨膦2-5mg/L)，24-26℃光照培养14d；将愈伤组织分化小苗后转移到生长筛选培养基中(1/2MS培养基+双丙氨膦2-3mg/L)，24-26℃光照培养；获得了44株再生植株。
5、将再生植株转移到壮苗培养基(1/2MS培养基+0.5mg/L萘乙酸)上，将苗高7-8cm且根系发达的转化苗移栽到花盆,在移栽到温室3周以后，有44株植株成活。
6、分子鉴定
PCR检测
在4叶期，将步骤5得到的44株植株每株取1个叶片提取基因组DNA，将基因组DNA作为模板，利用TaMYB-KW基因ORF序列特异的一段序列作为上游引物(TaMYB-KW-ZJF1和TaMYB-KW-ZJF2)，载体pA25-TaMYB-KW特异的一段序列作为下游引物(TaMYB-KW-ZJR)进行巢式PCR。以重组表达质粒pA25-TaMYB-KW为阳性对照，扬麦16的基因组DNA为阴性对照，预期扩增产物片段为375bp。
TaMYB-KW-ZJF1：5’-CGGACAACGAGATCAAGAAC-3’；
TaMYB-KW-ZJF2：5’-AGCTTTACATCGGAGGAGTTTCAG-3’；
TaMYB-KW-R-ZJR：5’-AAAACCCATCTCATAAATAACG-3’。
第一轮PCR扩增体系(25μl)：2×Taq MasterMix(康为世纪)12.5μl，TaMYB-KW-R-ZJF1(10μM)1μl，TaMYB33-R-ZJR(10μM)1μl，模板DNA 100ng，补ddH2O至25μl。PCR扩增程序：94℃8min；30×(94℃45s，61℃30s，72℃30s)，72℃8min；16℃保存。
然后，利用TaMYB-KW-ZJF2、TaMYB-KW-ZJR引物和一轮PCR产物稀释液做模板，进行二轮PCR扩增，扩增体系(25μl)：2×Taq MasterMix(康为世纪)12.5μl，TaMYB-KW-ZJF2(10μM)1μl，TaMYB-KW-ZJR(10μM)1μl，一轮PCR产物40倍稀释液1.0μL，补ddH2O至25μl。PCR扩增程序：94℃8min；30×(94℃45s，48℃30s，72℃30s)，72℃8min；16℃保存。
PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，紫外拍照，记录结果。
44株植株(T0代)中，PCR阳性植株(即为转基因植株)19株。
7、T1代单株及其分子鉴定
PCR检测
将获得的19株PCR阳性植株自交后得到T1代单株，将T1代单株进行分子鉴定，方法同上述步骤6，以重组载体pA25-TaMYB-KW为阳性对照，扬麦16的基因组DNA为阴性对照，预期扩增产物片段为374bp。结果表明在149株转基因T1代植株中，检测出阳性植株50株，分属12个株系，阳性率33.56％。部分植株PCR检测结果见图4。5个转基因株系在T1代转基因株系(MO1～MO5)及其T2代均为阳性株系。
利用TaMYB-KW基因特异的定量引物(TaMYB-KW-QF:5’-CGACTCGTCCTCGTCCAAG-3',TaMYB-KW-QR:5’-CGACGACGGCATCGAGTAAT-3’)和qRT-PCR技术分析了T2代5个转基因株系(MO1～MO5)中TaMYB-KW基因的相对表达量。结果表明转基因植株中TaMYB-KW基因的相对表达量明显高于未转基因小麦，但各转基因株系间的表达量有所差异，TaMYB-KW基因在转基因株系MO1中的表达量最高、在MO2中的表达量最低(图5)。
三、转空载体植物的获得
用载体pAHC25代替重组质粒pA25-TaMYB-KW，其它同步骤二，得到转空载体植株，作为转基因植株的对照。
四、转基因植物的纹枯病抗性鉴定
按照下述方法鉴定T1代5个转基因株系(MO1～MO5)以及从这5个T1代转基因株系中每株系选出的10株后代(即T2代)的纹枯病抗性，并用扬麦16(WT)和转空载体植株作为对照，具体方法如下：
转TaMYB-KW基因小麦植株的禾谷丝核菌接种方法采用麦粒接种法。在小麦分蘖盛期，用消毒镊子夹取长满禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)R0301的麦粒，轻轻地放入麦粒茎基部，每株放5粒麦粒，保湿3天。
于小麦收获期调查小麦单株的纹枯病发病情况，根据表2将纹枯病的严重程度划分为0～5级，并计算纹枯病病情指数(表3)。
病情指数(DI)＝[(Σ各级病株数×各级代表值)/(总株数×最高级代表值)]×100
表3、转基因小麦植株与对照纹枯病病情调查的结果
注：WT:未转基因扬麦16；**表示在P<0.01水平上各转基因株系与对照扬麦16有显著差异。WT的“T1代病级”、“T1代病情指数”分别表示与T1代转基因植株同时种植的野生型植株扬麦16的病级与病情指数；WT的“T2代病级”、“T2代病情指数”分别表示与T2代转基因植株同时种植的野生型植株扬麦16的病级与病情指数；转空载体植株的“T1代病级”、“T1代病情指数”分别表示与T1代转基因植株同时种植的野生型植株扬麦16的病级与病情指数；转空载体植株的“T2代病级”、“T2代病情指数”分别表示与T2代转基因植株同时种植的野生型植株扬麦16的病级与病情指数。
转空载体对照与扬麦16的病情指数与病级基本无差异。转基因植株T1代的纹枯病抗性提高，病情指数为20.00-36.00,病情指数均极显著低于受体野生型植株扬麦16，病级为1.00-1.43，病级均极显著低于受体野生型植株扬麦16；转基因植株T2代的纹枯病抗性提高，病情指数为20.00-33.40,病情指数均极显著低于受体野生型植株扬麦16，病级为1.00-1.67，病级均极显著低于受体野生型植株扬麦16。一株抗纹枯病阳性转基因植株和一株野生型扬麦16植株的照片见图6。结果表明，TaMYB-KW基因超量表达增强了转TaMYB-KW基因小麦对纹枯病的抗性。
Claims (5)
1.蛋白质相关的生物材料在培育抗纹枯病小麦中的应用；所述生物材料为下述B1)至B4)中的任一种：
B1)编码蛋白质的核酸分子，所述蛋白质的氨基酸序列是序列2；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b1)或b2)：
b1)其编码序列是序列表中序列1的第99-830位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；
b2)其编码序列是序列表中序列1的第1-1028位核苷酸的cDNA分子或DNA分子。
3.一种培育抗纹枯病转基因小麦的方法，包括向受体小麦中导入蛋白质的编码基因，得到对纹枯病抗性高于所述受体小麦的转基因小麦；所述蛋白质的氨基酸序列是序列2。
4.根据权利要求权利要求3所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因的编码序列是序列表中序列1的第99-830位。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述纹枯病由禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)引起。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20190308 |