CN114591927B - 甘薯薯块条筋发育相关蛋白IbPRX17及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了甘薯薯块条筋发育相关蛋白IbPRX17及其编码基因与应用。本发明具体地公开了氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在调控植物(如甘薯)条筋发育中的应用。本发明通过将该蛋白的编码基因(IbPRX17基因)导入到受体植物(甘薯栗子香)中，得到过表达IbPRX17基因的转基因植株，该转基因植株与野生型甘薯相比，条筋发育明显强于野生型，呈现出促进薯块条筋发育的表型。本发明所提供的IbPRX17蛋白及其编码基因在甘薯影响条筋发育研究中具有重要的理论意义和应用价值。

Description

甘薯薯块条筋发育相关蛋白IbPRX17及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及甘薯薯块条筋发育相关蛋白IbPRX17及其编码基因与应用。

背景技术

甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)是一种重要的粮食、饲料、工业原料及新型能源作物。中国是世界上最大的甘薯生产国。甘薯品种在土壤、水肥、种植密度、生育期长短等栽培条件的影响下，易使薯块次生韧皮部的薄壁细胞脱分化，形成新的分生组织，进一步发育出形成层，从而表现出条筋的表型。在薯块表皮的条筋发育，不仅影响薯块的外观品质，还严重降低了薯块的商品价值，减少甘薯的经济效益。因此，培育品相优良的甘薯新品种，成为促进甘薯产业发展的重要措施之一。

此外，甘薯具有自交不亲和、杂交后代不稳定，种质资源匮乏，育种周期长等问题，传统的杂交育种方法较难选育出品相优良的甘薯新品种，而运用基因编辑等基因工程手段能定向改良甘薯性状，是目前培育优质甘薯品种的一种可行途径。发掘引起条筋的甘薯基因，应用基因编辑的方法对其进行敲除、编辑，改良容易起筋的甘薯优良主栽品种，对甘薯产业的发展具有重要价值。本发明首次鉴定了与甘薯薯块条筋发育相关蛋白及其编码基因，为进一步阐明引起甘薯条筋的相关机理提供基础，为培育甘薯新品种提供科学依据，对甘薯的高产优收具有重要的理论指导意义和实践应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控或改善植物(如甘薯)的条筋发育。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质的应用，所述应用可为下述任一种：

D1)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在调控植物条筋发育中的应用；

D2)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备调控植物条筋发育的产品中的应用；

D3)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在培育条筋发育改变的植物中的应用；

D4)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备培育条筋发育改变的植物的产品中的应用；

D5)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在改良起筋甘薯品种或制备改良起筋甘薯品种的产品中的应用；

D6)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在植物育种中的应用；

所述蛋白质名称为IbPRX17，可为下述任一种：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。

所述标签蛋白包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His6标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质IbPRX17的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质IbPRX17的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质IbPRX17且具有蛋白质IbPRX17功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

本文中，调控所述蛋白质活性和/或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质IbPRX17。

上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

所述调控基因表达的物质具体可为下述B1)-B4)中任一所述的生物材料。

上述应用中，所述蛋白质IbPRX17可来源于甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)。

本发明还提供了与所述蛋白质IbPRX17相关的生物材料的应用，所述应用可为下述任一种：

E1)与所述蛋白质IbPRX17相关的生物材料在调控植物条筋发育中的应用；

E2)与所述蛋白质IbPRX17相关的生物材料在制备调控植物条筋发育的产品中的应用；

E3)与所述蛋白质IbPRX17相关的生物材料在培育条筋发育改变的植物中的应用；

E4)与所述蛋白质IbPRX17相关的生物材料在制备培育条筋发育改变的植物的产品中的应用；

E5)与所述蛋白质IbPRX17相关的生物材料在改良起筋甘薯品种或制备改良起筋甘薯品种的产品中的应用；

E6)与所述蛋白质IbPRX17相关的生物材料在植物育种中的应用；

所述生物材料可为下述B1)至B8)中的任一种：

B1)编码所述蛋白质IbPRX17的核酸分子；

B2)抑制或降低或沉默所述蛋白质IbPRX17的编码基因表达的核酸分子；

B3)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的表达盒；

B4)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的重组载体、或含有B3)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的重组微生物、或含有B3)所述表达盒的重组微生物、或含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B6)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B3)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B7)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B3)所述表达盒的转基因植物组织；

B8)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B3)所述表达盒的转基因植物器官。

上述应用中，B1)所述核酸分子可为下述任一种：

C1)编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子；

C2)核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子。

SEQ ID No.2所示的DNA分子(调控植物条筋发育的基因IbPRX17)编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质IbPRX17(甘薯薯块条筋发育相关蛋白IbPRX17)。

SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为蛋白质IbPRX17的编码基因(CDS)的核苷酸序列。本发明所述的蛋白质IbPRX17的基因(IbPRX17基因)可以为任意能够编码蛋白质IbPRX17的核苷酸序列。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

B1)所述核酸分子还可包括在SEQ ID No.2所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子。

所述核酸分子还包括与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列一致性为95％以上且来源相同种属的核酸分子。

本文所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如gRNA、mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。

本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒或病毒载体。具体可为pMD19-T载体和/或pCAMBIA1300载体。

可用现有的植物表达载体构建含有IbPRX17基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括但不限于如双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如包括但不限于农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮藏蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用IbPRX17基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，包括但不限于如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子,包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入包括但不限于可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的IbPRX17基因或基因的片段导入植物细胞或受体植物，可获得条筋发育增强的转基因细胞系及转基因植株。携带IbPRX17基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织,并将转化的植物组织培育成植株。

本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏菌(Erwinia)，根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)，产碱菌属(Alcaligenes)，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽孢杆菌属(Bacillus)等。具体可为大肠杆菌DH5α和/或根癌农杆菌EHA105。

所述重组载体具体可为重组载体pCAMBIA1300-IbPRX17。所述重组载体pCAMBIA1300-IbPRX17是将pCAMBIA1300载体的KpnI和SalI识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA片段，保持pCAMBIA1300载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。重组载体pCAMBIA1300-IbPRX17表达SEQ ID No.1所示的蛋白质IbPRX17。

本发明还提供了一种培育条筋发育改变的植物的方法，所述方法包括提高目的植物中所述蛋白质IbPRX17的含量和/或活性，得到条筋发育强于所述目的植物的条筋发育改变的植物。

上述方法中，所述提高目的植物中所述蛋白质IbPRX17的含量和/或活性通过提高目的植物中所述蛋白质IbPRX17的编码基因的表达量实现。

上述方法中，所述提高目的植物中所述蛋白质IbPRX17的编码基因的表达量通过将所述蛋白质IbPRX17的编码基因导入所述目的植物实现。

上述方法中，所述蛋白质IbPRX17的编码基因可为下述任一种：

H1)编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子；

H2)核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子。

具体地，在本发明的一个实施方案中，所述提高目的植物中所述蛋白质IbPRX17的编码基因的表达量通过将SEQ ID No.2所示的DNA分子导入所述目的植物实现。

在本发明的一个实施方案中，所述培育条筋发育改变的植物的方法包括如下步骤：

(1)构建包含SEQ ID NO.2所示DNA分子的重组表达载体；

(2)将步骤(1)构建的重组表达载体转入目的植物(如作物或甘薯)中；

(3)经筛选和鉴定获得条筋发育强于所述目的植物的条筋发育改变的植物。

所述导入指通过重组手段，包括但不限于农杆菌(Agrobacterium)介导的转化，生物射弹(biolistic)方法，电穿孔，in planta技术，等等导入。

本发明还提供了一种培育条筋发育改变的植物的方法，所述方法包括降低目的植物中所述蛋白质IbPRX17的含量和/或活性，得到条筋发育弱于所述目的植物的条筋发育改变的植物。

上述方法中，所述降低目的植物中所述蛋白质IbPRX17的含量和/或活性可通过降低目的植物中所述蛋白质IbPRX17的编码基因的表达量和/或活性实现。

上述方法中，所述降低目的植物中所述蛋白质IbPRX17的编码基因的表达量和/或活性可为利用基因突变、基因敲除、基因编辑或基因敲减技术使目的植物基因组中所述蛋白质IbPRX17的编码基因活性下降或失活。

本文中，所述植物可为下述任一种

G1)单子叶植物或双子叶植物；

G2)旋花科植物；

G3)甘薯属植物；

G4)甘薯组植物；

G5)甘薯。

所述蛋白质IbPRX17，和/或，所述核酸分子也在本发明的保护范围内。

本文中，所述调控植物条筋发育可为上调(增强或促进)植物条筋发育或下调(减弱或抑制)植物条筋发育。

本文中，所述条筋发育改变的植物可为条筋发育增强的植物或条筋发育减弱的植物。

条筋发育增强的植物可为多筋甘薯品种或有筋甘薯品种。

条筋发育减弱的植物可为少筋甘薯品种或无筋甘薯品种。

本发明中，所述条筋发育改变的植物理解为不仅包含将所述IbPRX17基因转化目的植物或将所述IbPRX17基因敲除得到的第一代转基因植物，也包括其子代。可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述抗逆植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

本发明所提供的IbPRX17基因编码一种过氧化物酶蛋白，将该基因导入甘薯中，得到过表达IbPRX17基因的转基因甘薯植株，转基因甘薯植株呈现出促进薯块条筋发育的表型。本发明所提供的IbPRX17蛋白及其编码基因在甘薯影响条筋发育研究中具有重要的理论意义和应用价值。

附图说明

图1为转基因植株的PCR检测。

图2为广州市种植的转基因薯块条筋表型观察。

图3为海口市种植的转基因薯块条筋表型观察。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的pMD19-T载体为宝生物工程(大连)公司产品，产品目录号为6013。pCAMBIA1300载体为Cambia公司产品。

下述实施例中的植物总RNA提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品，产品目录号为DP432。HiFiScript gDNA Removal RT MasterMix试剂盒为康为世纪生物科技(北京)有限公司产品，产品目录号为CW2020M。KpnI酶为赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品，产品目录号为FD0524。SalI酶为赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品，产品目录号为FD0644。大肠杆菌DH5α为深圳康体生命科技有限公司产品，产品目录号为KTSM101L，根癌农杆菌EHA105为北京擎科生物科技有限公司产品，产品目录号为TSC-A03。

下述实施例中的甘薯品种栗子香记载在如下文献中：王玉萍,刘庆昌,李爱贤,等.甘薯耐旱突变体的离体筛选与鉴定[J].中国农业科学,2003,36(9):1000-1005.，公众可从中国农业大学甘薯遗传育种研究室获得，以重复本实验。

下述实施例中的甘薯品种ND98记载在如下文献中：何绍贞.甘薯耐盐突变体的离体筛选及耐盐候选基因的克隆[D].中国农业大学博士学位论文，2008，公众可从中国农业大学甘薯遗传育种研究室获得，以重复本实验。

LB固/液体培养基，MS固/液体培养基均记载在如下文献中：张欢.甘薯耐盐转录组分析及抗逆相关基因IbBBX24和IbCPK28的克隆与功能验证[D]。中国农业大学博士学位论文，2017。

实施例1、IbPRX17基因的获得

1、甘薯总RNA提取：取1g甘薯品系ND98的幼嫩叶片在液氮中研磨成粉状，加入2mL离心管，用植物总RNA提取试剂盒对甘薯总RNA进行提取，使用HiFiScript gDNA RemovalRT MasterMix试剂盒反转录出第一链cDNA。

2、借助甘薯抗逆基因IbBBX24，通过甘薯酵母双杂交文库筛选得到互作基因IbPRX17，将其在Sweetpotato Garden库(http://sweetpotato-garden.kazusa.or.jp)中进行比对，获得序列表中SEQ ID No.3所示的EST序列。根据EST序列的核苷酸序列，设计并人工合成引物IbPRX17-F和IbPRX17-R，序列为：

IbPRX17-F：5’-ATGATGTATATAACGCTCGTCATCT-3’

IbPRX17-R：5’-TCAATATGAAGCAAACAACTTTGCAG-3’

3、以步骤1获得的cDNA为模板，以步骤2合成的IbPRX17-F和IbPRX17-R为引物，进行PCR扩增，获得约996bp的PCR扩增片段产物并测序。

结果表明，步骤3获得的PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示，将该序列所示的基因命名为IbPRX17基因，其编码的蛋白命名为IbPRX17蛋白或蛋白IbPRX17，氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。

实施例2、IbPRX17蛋白在调控甘薯薯块条筋发育中的应用

1、植物表达载体的构建

根据甘薯IbPRX17蛋白核苷酸的编码序列(SEQ ID No.2)，设计扩增出完整编码序列(CDS)的引物序列，正反向引物分别引入KpnI和SalI酶切位点，引物序列如下：

IbPRX17-FF-KpnI：5’-TACGAATTCGAGCTCGGTACCATGATGTATATAACGCTCGTCATCT-3’(下划线部分为KpnI酶切位点)

IbPRX17-RR-SalI：5’-CTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCAATATGAAGCAAACAACTTTGCAG-3’(下划线部分为SalI酶切位点)

以人工合成的SEQ ID No.2所示的双链DNA分子为模板，PCR扩增后，将产物连接到pMD19-T载体上，得到重组载体，命名为pMD-IbPRX17，进行M13-F/R的测序，保证甘薯IbPRX17蛋白核苷酸的阅读框及酶切位点的正确。

M13-F:5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’，

M13-R:5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’。

用限制性内切酶KpnI和SalI双酶切重组载体pMD-IbPRX17，回收约996bp的DNA片段1。

将pCAMBIA1300载体经过KpnI和SalI双酶切，回收载体大片段，将回收的载体大片段与DNA片段1连接，得到重组载体pCAMBIA1300-IbPRX17，即目的质粒。将目的质粒转化大肠杆菌DH5α，37℃培养20h，进行重组载体的PCR分析和酶切鉴定，并进行测序验证。测序结果表明，在载体pCAMBIA1300的KpnI和SalI酶切位点间插入了序列表中SEQ ID No.2所示的序列，说明重组载体构建正确。

重组载体pCAMBIA1300-IbPRX17是将pCAMBIA1300载体的KpnI和SalI识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA片段，保持pCAMBIA1300载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。重组载体pCAMBIA1300-IbPRX17表达SEQ IDNo.1所示的蛋白质IbPRX17。

重组载体pCAMBIA1300-IbPRX17具有一个表达盒，表达盒的核苷酸序列中有CaMV35S启动子、IbPRX17蛋白的编码基因和NOS终止子。

2、植物表达载体转化农杆菌

(1)于冰上融化根癌农杆菌EHA105感受态细胞，加入2μg提取的pCAMBIA1300-IbPRX17质粒，轻弹管壁混匀，冰浴10min；

(2)液氮速冻5min，37℃水浴10min，冰浴5min；

(3)加入600μL液体LB培养基，28℃，200rpm培养5h；

(4)将200μL菌液涂布于含100ug/ml卡那霉素及100ug/ml利福平的LB固体培养基上；

(5)28℃倒置暗培养2d，取适量农杆菌用液体LB培养基培养备用，即得到导入pCAMBIA1300-IbPRX17载体的农杆菌菌液，将重组农杆菌命名为

EHA105/pCAMBIA1300-IbPRX17。

3、甘薯的遗传转化及再生

用农杆菌介导的方法将EHA105/pCAMBIA1300-IbPRX17导入到甘薯品种栗子香中。具体方法如下：

(1)剥取甘薯品种栗子香的茎尖分生组织，置于含2.0mg/L 2,4-D的MS固体培养基上，27±1℃培养8周，获得胚性愈伤组织；

(2)将胚性愈伤组织放入含2.0mg/L 2,4-D的MS液体培养基中，置于摇床上水平振荡培养8周，获得直径为0.7-1.3mm的胚性细胞团；

(3)将胚性细胞团经过20目网筛筛选，较大的细胞团转移至30目网筛，轻轻研磨，使胚性细胞团出现创口，将研磨后的较大胚性细胞团振荡培养3天；

(4)采用农杆菌介导的方法将EHA105/pCAMBIA1300-IbPRX17转化胚性细胞团，然后置于共培养基(含30mg/L AS、2.0mg/L 2,4-D的MS固体培养基)上，28℃暗培养3d；

(5)将胚性细胞团用含400mg/L头孢噻肟钠(CS)和2.0mg/L 2,4-D的MS液体培养基中洗涤一次，然后在含有2.0mg/L 2,4-D的MS液体培养基中振荡培养1周；

(6)将胚性细胞团置于筛选培养基(含100mg/L CS、5mg/L潮霉素(Hyg)、2,4-D的MS固体培养基)上，28℃暗培养10-12周，其中每两周更换一次培养基；

(7)将胚性细胞团置于体细胞胚诱导培养基(含100mg/L CS、1.0mg/L ABA的MS固体培养基)上，28℃光暗交替培养2-4周，获得抗性愈伤组织；

(8)将抗性愈伤组织置于MS固体培养基上，28℃光暗交替培养4-8周，即获得14株待鉴定转基因植株(拟转基因植株)，依次命名为OE-P1、OE-P2、OE-P3、OE-P5、OE-P6、OE-P7、OE-P9、OE-P10、OE-P11、OE-P12、OE-P13、OE-P14、OE-P15、OE-P16。

(9)用CTAB法提取拟转基因植株叶片的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，水和野生型植株(栗子香)为阴性对照，质粒pCAMBIA1300-IbPRX17为阳性对照，以CaMV35S(5’–TGACGCACAATCCCACTATCCT–3’)和IbPRX17-RR-SalI为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；如果PCR扩增产物中含有约1234bp的条带，则相应的甘薯待鉴定转基因植株即为甘薯转基因阳性植株。

电泳检测扩增结果见图1(图1中，泳道M显示为Maker条带，泳道W显示为阴性对照(水)的条带；泳道P显示为阳性对照(重组质粒pCAMBIA1300-IbPRX17)的条带；泳道WT显示为甘薯栗子香植株的条带；泳道OE-P1、OE-P2、OE-P3、OE-P5、OE-P6、OE-P7、OE-P9、OE-P10、OE-P11、OE-P12、OE-P13、OE-P14、OE-P15、OE-P16显示为转化pCAMBIA1300-IbPRX17的甘薯拟转基因植株的条带，从图1中可见，泳道OE-P9、OE-P10、OE-P11、OE-P14、OE-P15、OE-P16和阳性对照扩增出1234bp的目标条带，表明IbPRX17基因已经整合到甘薯栗子香的基因组中，并证明这些再生植株为转基因阳性植株。将经鉴定为转基因阳性的甘薯植株(OE-P9、OE-P10、OE-P11、OE-P14、OE-P15、OE-P16)采用无性繁殖的方法扩繁，由一株转基因幼苗扩繁得到的植株作为一个株系，进一步进行薯块条筋发育表型观察。

4、转基因植株的薯块条筋发育表型观察

2020年从广东省广州市收获种植于隔离大田130天的甘薯薯块，观察薯块表型生长状况，并拍照进行记录。每个株系3个薯块，其中1个薯块条筋表型放大的结果见图2。结果表明，过表达IbPRX17基因的转基因薯块(株系号为OE-P14,OE-P15,OE-P16)每个薯块的条筋发育均明显强于野生型栗子香薯块(株系号为LZX)。

2021年从海南省海口市收获种植于隔离大田150天的甘薯薯块，观察薯块表型生长状况，并拍照进行记录。每个株系1株，取1个薯块条筋表型放大的结果见图3。结果表明过表达IbPRX17基因的转基因薯块(株系号为OE-P14,OE-P15,OE-P16)的每个薯块条筋发育均明显强于野生型栗子香薯块(株系号为LZX)。

以上结果表明，过表达IbPRX17基因的甘薯薯块表现出条筋发育明显的表型。

本发明的IbPRX17蛋白及其编码基因IbPRX17可以调控植物(如甘薯)的条筋发育，通过提高目的植物中IbPRX17蛋白质的含量和/或活性(如过表达IbPRX17基因)可以显著增强目的植物的条筋发育。反之，通过降低目的植物中IbPRX17蛋白质的含量和/或活性(如抑制IbPRX17基因的表达)可以显著减弱目的植物的条筋发育。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> 甘薯薯块条筋发育相关蛋白IbPRX17及其编码基因与应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 331

<212> PRT

<213> 甘薯（Ipomoea batatas (L.) Lam.）

<400> 1

Met Met Tyr Ile Thr Leu Val Ile Phe Phe Leu Leu Asn Leu Gly Ala

1               5                   10                  15

Ile Gln Ala Glu Ile Val Glu Leu Arg Pro Gly Phe Tyr Ser Asp Thr

            20                  25                  30

Cys Pro Glu Ala Glu Asp Ile Val Arg Gly Val Ile Lys Arg Asn Met

        35                  40                  45

Glu Arg Glu Pro Arg Ser Ala Ala Ser Val Met Arg Leu Gln Phe His

    50                  55                  60

Asp Cys Phe Val Asn Gly Cys Asp Ala Ser Leu Leu Leu Asp Asp Thr

65                  70                  75                  80

Pro Glu Met Leu Gly Glu Lys Leu Cys Leu Ser Asn Ile Asn Ser Leu

                85                  90                  95

Arg Ser Tyr Glu Val Val Asp Glu Ala Lys Glu Ala Val Glu Met Ala

            100                 105                 110

Cys Pro Gly Val Val Ser Cys Ala Asp Ile Ile Ile Met Ala Ala Arg

        115                 120                 125

Asp Ala Val Val Leu Ser Gly Gly Pro Asn Trp Glu Val Lys Leu Gly

    130                 135                 140

Arg Ile Asp Ser Leu Thr Ala Ser Gln Glu Asp Ala Asp Asn Ile Met

145                 150                 155                 160

Pro Ser Pro Arg Ala Asn Ala Asp Thr Leu Ile Asp Leu Phe Asn Arg

                165                 170                 175

Phe Asn Leu Ser Val Lys Asp Leu Val Ala Leu Ser Gly Ser His Ser

            180                 185                 190

Ile Gly Gln Gly Arg Cys Phe Ser Ile Val Phe Arg Leu Tyr Asn Gln

        195                 200                 205

Ser Gly Thr Gly Arg Pro Asp Pro Thr Ile Glu Pro Asn Phe Arg Glu

    210                 215                 220

Lys Leu Asp Asn Leu Cys Pro Leu Gly Gly Asp Gly Asn Val Thr Gly

225                 230                 235                 240

Asp Leu Asp Ala Thr Pro Gln Val Phe Asp Asn Gln Tyr Phe Lys Asp

                245                 250                 255

Leu Val Asn Gly Arg Gly Phe Leu Asn Ser Asp Glu Thr Leu Phe Thr

            260                 265                 270

Asn Pro Glu Thr Arg Gly Tyr Val Val Gln Tyr Arg Arg Asn Glu Ser

        275                 280                 285

Ala Phe Phe Glu Ala Phe Val Glu Gly Met Ile Lys Met Gly Asp Leu

    290                 295                 300

Gln Ser Gly Arg Pro Gly Glu Ile Arg Arg Asn Cys Arg Val Val Asn

305                 310                 315                 320

Ser Trp Glu Pro Ala Lys Leu Phe Ala Ser Tyr

                325                 330

<210> 2

<211> 996

<212> DNA

<213> 甘薯（Ipomoea batatas (L.) Lam.）

<400> 2

atgatgtata taacgctcgt catcttcttc ctcctcaact tgggcgcgat ccaggcggag 60

atcgtggagc tccggcccgg attttactcc gatacgtgtc cagaagcgga ggatatcgtg 120

aggggcgtga tcaagaggaa catggaaaga gaacccagga gcgccgcctc agtgatgcgc 180

ttgcagtttc acgattgctt tgttaacgga tgcgatgcgt cgttgttgtt ggatgatacg 240

ccggagatgt tgggagagaa gctttgtttg tcgaatataa attcgctgag gtcgtatgaa 300

gttgttgatg aagctaagga agctgtggag atggcctgtc ctggtgttgt ttcctgtgct 360

gatatcataa tcatggctgc cagagatgct gttgttctga gtggaggacc taactgggaa 420

gtaaagctgg gaaggataga cagcttaaca gcaagccaag aagatgcaga caatatcatg 480

ccaagcccaa gagcaaatgc agacaccctc attgatctgt ttaacagatt caatctgtca 540

gtgaaagatc tggtggcact ttcagggtct cactccattg gccagggaag gtgtttttcc 600

atcgtgtttc ggctctacaa ccagtcggga acaggccggc ctgacccgac catcgagcca 660

aacttcagag aaaaactgga caacctttgc ccgctgggcg gggatggaaa tgtaacgggg 720

gacttggacg caacccctca agtattcgac aaccagtact tcaaggactt ggtgaatggg 780

agaggatttc tgaactcaga tgaaacactt ttcactaacc ctgagaccag agggtatgtg 840

gtgcagtata gaagaaatga gagtgcattc tttgaggcat ttgttgaggg gatgataaaa 900

atgggtgatc ttcaatctgg gaggcctgga gagattagga gaaactgcag agtggtcaat 960

agctgggaac ctgcaaagtt gtttgcttca tattga 996

<210> 3

<211> 996

<212> DNA

<213> 甘薯（Ipomoea batatas (L.) Lam.）

<400> 3

atgatgtata taacgctcgt catcttcttc ctcctcaact tgggcgcgat ccaggcggag 60

atcgtggagc tccggcccgg attttactcc gagacgtgtc cagaagcgga ggatatcgtg 120

aggggcgtga tcaagaggaa catggaaaga gaacccagga gcgccgcctc agtgatgcgc 180

ttgcagtttc acgattgctt tgttaacgga tgcgatgcgt cgttgttgtt ggatgatacg 240

ccggagatgt tgggagagaa gctttgtttg tcgaatataa attcgctgag gtcatatgaa 300

gttgttgatg aagctaagga agctgtggag atggcctgtc ctggtgttgt ttcctgtgct 360

gatatcataa tcatggctgc cagagatgct gttgttctga gtggaggacc taactgggaa 420

gtaaagctgg gaaggataga cagcttaaca gcaagccaag aagatgcaga caatatcatg 480

ccaagcccaa gagcagatgc aaccaccctc attgatctgt ttagcaaatt caatctgtca 540

gtgaaagatc tggtggcact ttcagggtct cactccattg gccagggaag gtgtttttcc 600

atcgtgtttc gcctctacaa ccagtcgggg acaggccggc ctgacccgac catcgagcca 660

aacttcagag aaaaactgga caacctttgc ccgctgggcg gggatgggaa tgtaacgggg 720

gacttggacg caacccctca agtattcgac aaccagtact tcaaggactt ggtgaatggg 780

agaggatttc tgaactcaga tgaaacactt ttcactaacc ctgagaccag agggtatgtg 840

gtgcagtata gaagaaatga gagtgcattc tttgaggcat ttgttgaggg gatgataaaa 900

atgggtgatc ttcaatctgg gaggcctgga gagattagga gaaactgcag agtggtcaat 960

agctgggaac ctgcaaagtt gtttgcttca tattga 996

Claims (11)

1.蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：

D1）蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在调控植物条筋发育中的应用；

D2）蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备调控植物条筋发育的产品中的应用；

D3）蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在培育条筋发育改变的植物中的应用；

D4）蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备培育条筋发育改变的植物的产品中的应用；

D5）蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在改良起筋甘薯品种或制备改良起筋甘薯品种的产品中的应用；

D6）蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在植物育种中的应用;

所述蛋白质为下述任一种：

A1）氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

A2）在A1）的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；

所述调控所述蛋白质活性和/或含量的物质为编码所述蛋白质的基因；所述植物为甘薯属植物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述甘薯属植物为甘薯组植物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述甘薯组植物为甘薯。

4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于，所述蛋白质来源于甘薯。

5.与权利要求1-4中任一所述蛋白质相关的生物材料的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：

E1）与权利要求1-4中任一所述蛋白质相关的生物材料在调控植物条筋发育中的应用；

E2）与权利要求1-4中任一所述蛋白质相关的生物材料在制备调控植物条筋发育的产品中的应用；

E3）与权利要求1-4中任一所述蛋白质相关的生物材料在培育条筋发育改变的植物中的应用；

E4）与权利要求1-4中任一所述蛋白质相关的生物材料在制备培育条筋发育改变的植物的产品中的应用；

E5）与权利要求1-4中任一所述蛋白质相关的生物材料在改良起筋甘薯品种或制备改良起筋甘薯品种的产品中的应用；

E6）与权利要求1-4中任一所述蛋白质相关的生物材料在植物育种中的应用;

所述生物材料为下述B1）至B7）中的任一种：

B1）编码权利要求1-4中任一所述蛋白质的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；

B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；

B5）含有B1）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2）所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6）含有B1）所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2）所述表达盒的转基因植物组织；

B7）含有B1）所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2）所述表达盒的转基因植物器官；

所述植物为甘薯属植物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述甘薯属植物为甘薯组植物。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述甘薯组植物为甘薯。

8.根据权利要求5-7中任一所述的应用，其特征在于，B1）所述核酸分子为下述任一种：

C1）编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子；

C2）核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子。

9.一种培育条筋发育改变的植物的方法，其特征在于，所述方法包括提高目的植物中权利要求1-4中任一所述蛋白质的编码基因的表达量，得到条筋发育强于所述目的植物的条筋发育改变的植物，所述提高目的植物中权利要求1-4中任一所述蛋白质的编码基因的表达量通过将权利要求1-4中任一所述蛋白质的编码基因导入所述目的植物实现，所述植物为甘薯属植物。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述甘薯属植物为甘薯组植物。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述甘薯组植物为甘薯。

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