CN114874919A - 一株米卡芬净前体fr901379高产菌株及其应用 - Google Patents
一株米卡芬净前体fr901379高产菌株及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114874919A CN114874919A CN202210496769.1A CN202210496769A CN114874919A CN 114874919 A CN114874919 A CN 114874919A CN 202210496769 A CN202210496769 A CN 202210496769A CN 114874919 A CN114874919 A CN 114874919A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- strain
- fermentation
- cgmcc
- micafungin
- beijing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108010018980 FR 901379 Proteins 0.000 title claims abstract description 35
- 108010021062 Micafungin Proteins 0.000 title claims description 17
- 229960002159 micafungin Drugs 0.000 title claims description 17
- PIEUQSKUWLMALL-YABMTYFHSA-N micafungin Chemical compound C1=CC(OCCCCC)=CC=C1C1=CC(C=2C=CC(=CC=2)C(=O)N[C@@H]2C(N[C@H](C(=O)N3C[C@H](O)C[C@H]3C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N3C[C@H](C)[C@H](O)[C@H]3C(=O)N[C@H](O)[C@H](O)C2)[C@H](O)CC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](O)C=2C=C(OS(O)(=O)=O)C(O)=CC=2)[C@@H](C)O)=O)=NO1 PIEUQSKUWLMALL-YABMTYFHSA-N 0.000 title claims description 17
- 239000002243 precursor Substances 0.000 title description 7
- 241001587826 Coleophoma empetri Species 0.000 claims abstract description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 26
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 25
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 4
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 claims description 3
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 claims description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 241000221662 Sclerotinia Species 0.000 claims 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims 1
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 claims 1
- 239000002068 microbial inoculum Substances 0.000 claims 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 claims 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 12
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 12
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 10
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 8
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 6
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 6
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 4
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 3
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 2
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 2
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 2
- 108010049047 Echinocandins Proteins 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical group 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 125000004284 isoxazol-3-yl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=NO1 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- QPJVMBTYPHYUOC-UHFFFAOYSA-N methyl benzoate Chemical group COC(=O)C1=CC=CC=C1 QPJVMBTYPHYUOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 241000207965 Acanthaceae Species 0.000 description 1
- 108010064760 Anidulafungin Proteins 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 229920002498 Beta-glucan Polymers 0.000 description 1
- 108010020326 Caspofungin Proteins 0.000 description 1
- 241000223203 Coccidioides Species 0.000 description 1
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 206010028400 Mutagenic effect Diseases 0.000 description 1
- 241000223503 Platysma Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- PMZXXNPJQYDFJX-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;2,2,2-trifluoroacetic acid Chemical compound CC#N.OC(=O)C(F)(F)F PMZXXNPJQYDFJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229960003348 anidulafungin Drugs 0.000 description 1
- JHVAMHSQVVQIOT-MFAJLEFUSA-N anidulafungin Chemical compound C1=CC(OCCCCC)=CC=C1C1=CC=C(C=2C=CC(=CC=2)C(=O)N[C@@H]2C(N[C@H](C(=O)N3C[C@H](O)C[C@H]3C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N3C[C@H](C)[C@H](O)[C@H]3C(=O)N[C@H](O)[C@H](O)C2)[C@@H](C)O)[C@H](O)[C@@H](O)C=2C=CC(O)=CC=2)[C@@H](C)O)=O)C=C1 JHVAMHSQVVQIOT-MFAJLEFUSA-N 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 150000003851 azoles Chemical class 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- JYIKNQVWKBUSNH-WVDDFWQHSA-N caspofungin Chemical compound C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N3CC[C@H](O)[C@H]3C(=O)N[C@H](NCCN)[C@H](O)C[C@@H](C(N[C@H](C(=O)N3C[C@H](O)C[C@H]3C(=O)N2)[C@@H](C)O)=O)NC(=O)CCCCCCCC[C@@H](C)C[C@@H](C)CC)[C@H](O)CCN)=CC=C(O)C=C1 JYIKNQVWKBUSNH-WVDDFWQHSA-N 0.000 description 1
- 229960003034 caspofungin Drugs 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 238000012214 genetic breeding Methods 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000243 mutagenic effect Toxicity 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 244000039328 opportunistic pathogen Species 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000007362 sporulation medium Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- RZLVQBNCHSJZPX-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O RZLVQBNCHSJZPX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/145—Fungal isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/50—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link
- C07K7/54—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring
- C07K7/56—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring the cyclisation not occurring through 2,4-diamino-butanoic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02W—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES RELATED TO WASTEWATER TREATMENT OR WASTE MANAGEMENT
- Y02W30/00—Technologies for solid waste management
- Y02W30/40—Bio-organic fraction processing; Production of fertilisers from the organic fraction of waste or refuse
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Botany (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一株高产FR901379的菌株，所述菌株为岩高兰鞘茎点霉(Coleophoma empetri)H40‑23,所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.40075，保藏日期为2022年1月29日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，电话：010‑64807355；本发明还提供了上述菌株在生产FR901379中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及微生物育种技术领域，尤其涉及一种米卡芬净前体FR901379高产菌株及其应用。
背景技术
棘白菌素类药物是一种新型抗真菌药物，通过抑制β-1,3-葡聚糖合成酶活性来干扰真菌细胞壁的合成，哺乳动物细胞没有细胞壁，因此该类药物的毒副作用小，且安全性高，对念珠菌属、曲霉菌属及部分对唑类耐药的真菌类均有抗菌活性。现已获得批准上市的棘白菌素类药物包括卡泊芬净(2004年在美国上市)、米卡芬净(2005年在日本上市)和阿尼芬净(2006年在美国上市)，它们都具有相似的非核糖体六元环肽类母核结构，差异仅在于侧链基团、氨基酸连接顺序和后修饰基团的不同。其中，由于米卡芬净前体FR901379具有磺酰基基团，具有极好的水溶性，进而提高了其生物利用度，具有广阔的市场前景。
米卡芬净的工业生产包括三步：首先由Coleophomaempetri发酵产生FR901379，然后经游他游动链霉菌发酵水解掉脂肪酸侧链，最后通过化学修饰加上4-(5-(4-(戊基氧基)苯基)异噁唑-3-基)苯甲酸甲酯侧链最终生成米卡芬净。其中，棘腔孢霉发酵合成米卡芬净前体FR901379是工业生产的第一步，也是整个工艺的关键核心。高性能的发酵菌株是生产成本控制的关键因素，也是限制该行业准入的技术门槛。生物合成核心途径的代谢工程改造是遗传育种的常用策略，但是，系统分析发现核心途径中可供理性改造的靶点非常有限，且转录组数据显示合成途径中的关键基因相对转录水平都很高，在调控机制不明的情况下，强化关键基因表达的策略很难全面提高合成途径的代谢通量。而菌株的综合发酵性能亟待提高，相关理性改造需要理论指导。相较于理性改造，诱变育种的随机性特点在菌株综合发酵性能改良时更能发挥出优势，尤其是对于相对复杂的多细胞微生物，所以目前工业生产使用的绝大多数放线菌和丝状真菌菌株都是通过诱变育种获得的。重离子辐照具有非常高效的致突变作用，与紫外等其它常用物理诱变源相比，在物理学效应和生物学效应上有很大的不同，具有穿透力强、可处理样品丰富、诱变图谱广泛的独特优势，是一种非常高效的诱变手段。本发明通过重离子辐照诱变、抑菌圈法初筛和摇瓶发酵复筛获得了一株高产、稳定性强的菌株。
发明内容
本发明提供了一种通过诱变得到的高产FR901379的菌株，所述菌株为岩高兰鞘茎点霉(Coleophomaempetri)H40-23,所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.40075，保藏日期为2022年1月29日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，电话：010-64807355。
另一方面，本发明还提供了一种菌剂，所述菌剂包括上述菌株。
在一个实施方式中，所述菌剂为液体制剂或固体制剂。
另一方面，本发明还提供了一种发酵上述菌株的方法，所述方法包括利用培养基对上述菌株进行发酵的步骤。
在一个实施方式中，上述发酵的温度为20℃-40℃，优选，25℃；上述发酵的时间为24h-96h，例如，40h、48h。
在一个实施方式中，所述培养基的成分包括玉米淀粉，蛋白胨，(NH4)2SO4，KH2PO4，FeSO4·7H2O，ZnSO4·7H2O和CaCO3。
另一方面，本发明还提供了上述菌株或菌剂在生产FR901379中的应用。
另一方面，本发明还提供了一种制备FR901379的方法，所述方法包括对上述菌株进行发酵的步骤。
进一步的，所述制备FR901379的方法还包括分离/纯化所述FR901379的步骤。
另一方面，本发明还提供了一种制备米卡芬净的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)利用本发明所述的菌株制备FR901379；
(2)利用步骤(1)得到的FR901379制备米卡芬净。
在一个实施方式中，上述步骤(2)可通过以下方式实现：由FR901379经游他游动链霉菌发酵水解掉脂肪酸侧链，最后通过化学修饰加上4-(5-(4-(戊基氧基)苯基)异噁唑-3-基)苯甲酸甲酯侧链最终生成米卡芬净。
进一步的，上述制备米卡芬净的方法还包括分离/纯化米卡芬净的步骤。
本发明公开了一种米卡芬净前体FR901379高效诱变和快速筛选的方法。首先通过重离子辐照诱变进行了诱变，通过抑菌圈法筛选初筛和摇瓶发酵复筛获得了一株高产、稳定性强的菌株H40-23，该菌株FR901379产量为587.8mg/L，比对照菌株(365.2mg/L)高222mg/L，比诱变前提高了60.8％。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
在附图中：
图1.米卡芬净前体FR901379生产菌株高通量筛选流程图。
图2.辐照剂量对出发菌株CGMCC 21058(MK01)致死率的影响。
图3.重离子辐照突变体库中菌落形态多样性。
图4.重离子辐照突变菌株FR901379抑菌圈直径初筛结果，其中，图中横线位置为野生型对照菌株的抑菌圈直径。
图5.重离子辐照突变菌株FR901379复筛发酵产量，其中，图中横线位置为野生型对照菌株的FR901379产量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
PDA固体培养基：39g/L马铃薯土豆培养基PDA干粉(BD公司产品，产品目录号：633840)，余量为去离子水，115℃高压灭菌30min，待冷却至约60℃制备平板。
PDAS产孢培养基：39g/L马铃薯土豆培养基PDA干粉(BD公司产品，产品目录号：633840)，36.7g/L山梨醇，余量为去离子水，115℃高压灭菌30min，待冷却至约60℃制备平板。
软琼脂培养基：24g/L马铃薯土豆培养基PDB干粉(BD公司产品，产品目录号：7114771)，5g/L琼脂粉，余量为去离子水，115℃高压灭菌30min后50℃保温。
种子培养基：15g/L可溶性淀粉，10g/L蔗糖，5g/L棉籽饼粉，10g/L蛋白胨，1g/LKH2PO4，2g/L CaCO3。
发酵培养基：30g/L玉米淀粉，30g/L蛋白胨，6g/L(NH4)2SO4，1g/L KH2PO4，0.3g/LFeSO4·7H2O，0.01g/L ZnSO4·7H2O，2g/L CaCO3。
实施例1.米卡芬净前体FR901379生产菌株高通量筛选方法的建立
以ColeophomaempetriMK01野生菌株为出发菌株，首先是从-80℃冰箱取出一冻存甘油管，稀释后涂布PDA平板，25℃倒置培养3～5d，待单菌落大小合适后用无菌牙签挑取点15cm PDA平板，25℃倒置培养4d，然后取8～14h处于对数生长期的白色念珠菌液，用无菌水将其稀释到OD600＝0.6～1左右，取500μL于不烫手的软琼脂中混匀后覆盖平板，24h后即可测量抑菌圈的直径，且随着时间的延长抑菌圈直径不会发生改变(图1)。其中将单菌落挑取点板生长代替涂布平板后直接喷洒白色念珠菌会防止漏筛，因为单菌落在平板中分布均匀是一种理想状态，通常是很多单菌落连成一片；其次将白色念珠菌混匀到软琼脂中覆盖平板代替用喷壶直接喷洒白色念珠菌会减小误差、防止染菌，另外白色念珠菌是条件致病菌，覆盖代替喷洒会更安全。
实施例2.利用重离子辐照诱变对ColeophomaempetriMK01进行诱变
从-80℃冰箱取出一冻存甘油管，稀释后涂布PDAS平板，25℃倒置培养5～8d，使菌株孢子处于成熟状态。取2～3mL无菌生理盐水于PDA平板中，用无菌小毛笔刷洗下孢子，将洗下的孢子用300～500目滤布过滤，收集孢子悬浮液并用无菌生理盐水洗涤2～3次，孢子计数仪计数并将其稀释至104～106CFU/mL的孢子悬浮液。
吸取1mL孢子悬浮液均匀平铺在无菌的35mm辐照培养皿中，平区辐照，辐照剂量分别为0Gy、40Gy、80Gy、100Gy、120Gy、140Gy、160Gy、200Gy、500Gy、800Gy，每个剂量做三个平行。
对辐照诱变后的孢子悬浮液保藏20％～50％甘油管-80℃冻存。从-80℃冰箱取出一冻存甘油管，取100～200μL均匀涂布到PDA培养基表面，25℃培养5～8d进行平板计数，确定致死率随诱变剂量的变化数值关系。如图2所示，随着诱变剂量的增加，致死率越来越大，在诱变剂量为160Gy时致死率为94％。
实施例3.诱变后菌株的FR901379抑菌圈直径测定初筛
由于ColeophomaempetriMK01菌株本身的萌发率就比较低，我们将不同诱变剂量下的菌株稀释到1×10-3CFU/mL梯度后，取100μL～200μL全部均匀涂到PDA培养基表面，25℃培养4～6d，在不同的诱变剂量下获得了形态各异的突变菌株，将这些菌株点板后主要出现了三种菌落形态，一种与对照菌株菌落形态一样，另外两种菌落形态分别为小黑而结实、小黑而干瘪(图3)。
用无菌牙签挑选单菌落点15cm的PDA平板，25℃培养3～4d，将对数生长期的白色念珠菌稀释到OD600＝0.6～1，取OD600＝0.6～1的白色念珠适量于不烫手的软琼脂培养基中混匀后覆盖平板，25℃培养1～7d后检测诱变菌株抑菌圈直径。如图4所示，结果表明通过4批次初筛可以得到90株诱变菌株的抑菌圈直径比出发菌株大(图4A、图4B、图4C、图4D)。
实施例4.抑菌圈初筛FR901379高产菌株发酵验证
选取81株诱变菌株和对照菌株ColeophomaempetriMK01接种于PDA固体平板上，25℃培养5～8d。挑取少量的菌丝，利用核酸提取仪
对菌丝进行破碎，将破碎后的菌丝接种于50mLColeophomaempetri的种子培养基，25℃，220rpm，摇床培养40～48h。将上述培养的种子液取5mL～50mLColeophomaempetri的发酵培养基，25℃，220rpm，摇床培养8d，每个菌株设置3个平行。从每一瓶发酵液中取1mL，加入等体积的甲醇，超声萃取1h，离心，取上清。用0.22μm的有机滤器过滤处理样品，并通过HPLC对处理后的样品进行分析。
HPLC分析方法为：液相色谱柱为Agilent C-18反向柱883975-902(4.6×150mm，5μm)；流动相为A：0.05％(体积比)三氟乙酸水溶液，流动相B：0.05％(体积比)三氟乙酸乙腈溶液，流速为1mL/min，紫外检测波长：210nm，30℃，总洗脱时间为37min。梯度洗脱条件：0-5min，流动相B占流动相的体积由5％线性上升到24％，5-35min，流动相B占流动相的体积由24％线性上升到62％，35-37min，流动相B占流动相的体积由62％线性上升到100％。结果如图5所示，对以上突变体库中的菌株分为四批次进行了发酵复筛，一批次摇瓶发酵FR901379产量比对照菌株高的有4株(图5A)；二批次摇瓶发酵FR901379产量比对照菌株高的有2株(图5B)；三批次摇瓶发酵FR901379产量比对照菌株高的只有1株，FR901379产量为587.8mg/L，比对照菌株(365.2mg/L)高222mg/L，且其形态为小黑而结实(图5C)；四批次发酵FR901379产量比对照菌株高的有0株(图5D)。我们将第三批次筛选的高产菌株命名为岩高兰鞘茎点霉(Coleophomaempetri)H40-23,其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.40075，保藏日期为2022年1月29日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，电话：010-64807355，该菌株发酵产FR901379产量为587.8mg/L，比野生型对照菌株(365.2mg/L)高222mg/L，且其单菌落形态为小黑而结实，发酵液不黏稠，菌球形态规则，更加有利于产业化。
上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一株高产FR901379的菌株，所述菌株为岩高兰鞘茎点霉(Coleophoma empetri)H40-23,所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.40075，保藏日期为2022年1月29日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，电话：010-64807355。
2.包含权利要求1所述菌株的菌剂。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为固体制剂或液体制剂。
4.权利要求1所述的菌株或权利要求2所述的菌剂在生产FR901379中的应用。
5.一种发酵权利要求1所述菌株的方法，其特征在于，所述方法包括利用培养基对所述菌株进行发酵的步骤。
6.一种制备FR901379的方法，所述方法包括对权利要求1所述的菌株进行发酵的步骤。
7.一种制备米卡芬净的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)利用权利要求1所述的菌株发酵制备FR901379；
(2)利用步骤(1)得到的FR901379制备米卡芬净。
8.根据权利要求5-7任一所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为20℃-40℃。
9.根据权利要求5-7任一所述的方法，其特征在于，所述发酵的时间为24h-96h。
10.根据权利要求5-7任一所述的方法，其特征在于，所述发酵的培养基的成分包括玉米淀粉，蛋白胨，(NH4)2SO4，KH2PO4，FeSO4·7H2O，ZnSO4·7H2O和CaCO3。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210496769.1A CN114874919B (zh) | 2022-05-09 | 2022-05-09 | 一株米卡芬净前体fr901379高产菌株及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210496769.1A CN114874919B (zh) | 2022-05-09 | 2022-05-09 | 一株米卡芬净前体fr901379高产菌株及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114874919A true CN114874919A (zh) | 2022-08-09 |
| CN114874919B CN114874919B (zh) | 2023-06-27 |
Family
ID=82672846
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210496769.1A Active CN114874919B (zh) | 2022-05-09 | 2022-05-09 | 一株米卡芬净前体fr901379高产菌株及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114874919B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116496911A (zh) * | 2023-04-23 | 2023-07-28 | 浙江昊清生物科技有限公司 | 一种米卡芬净中间体fr901379高产菌株及其应用 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1051757A (zh) * | 1989-11-13 | 1991-05-29 | 藤泽药品工业株式会社 | 新的多肽化合物及其制备方法 |
| WO1997032975A1 (fr) * | 1996-03-08 | 1997-09-12 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Processus de deacylation de lipopeptides cycliques |
| WO1997047738A1 (fr) * | 1996-06-13 | 1997-12-18 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Acylase des lipopeptides cycliques |
| WO2001002585A1 (fr) * | 1999-07-02 | 2001-01-11 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Gene codant pour une acylase des lipopeptides cycliques et expression dudit gene |
| CN102952179A (zh) * | 2011-08-24 | 2013-03-06 | 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 | 一种高纯度米卡芬净前体化合物的制备方法 |
| CN106755221A (zh) * | 2016-11-28 | 2017-05-31 | 无锡福祈制药有限公司 | 一种米卡芬净母核fr179642的制备方法 |
| CN108753880A (zh) * | 2018-05-30 | 2018-11-06 | 博瑞生物医药（苏州）股份有限公司 | 米卡芬净钠前体的新的制备方法 |
-
2022
- 2022-05-09 CN CN202210496769.1A patent/CN114874919B/zh active Active
Patent Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1051757A (zh) * | 1989-11-13 | 1991-05-29 | 藤泽药品工业株式会社 | 新的多肽化合物及其制备方法 |
| US5502033A (en) * | 1989-11-13 | 1996-03-26 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Antimicrobial polypeptide compound a pharmaceutical composition comprising the same, and a method for treating infectious diseases |
| WO1997032975A1 (fr) * | 1996-03-08 | 1997-09-12 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Processus de deacylation de lipopeptides cycliques |
| CN1218507A (zh) * | 1996-03-08 | 1999-06-02 | 藤泽药品工业株式会社 | 环脂肽物的脱酰化方法 |
| WO1997047738A1 (fr) * | 1996-06-13 | 1997-12-18 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Acylase des lipopeptides cycliques |
| US20020115133A1 (en) * | 1996-06-13 | 2002-08-22 | Fujisawa Pharmaceutical Co. Ltd. | Cyclic lipopeptide acylase |
| WO2001002585A1 (fr) * | 1999-07-02 | 2001-01-11 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Gene codant pour une acylase des lipopeptides cycliques et expression dudit gene |
| CN1371423A (zh) * | 1999-07-02 | 2002-09-25 | 藤泽药品工业株式会社 | 编码环状脂肽酰基转移酶的基因及其表达 |
| CN102952179A (zh) * | 2011-08-24 | 2013-03-06 | 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 | 一种高纯度米卡芬净前体化合物的制备方法 |
| CN106755221A (zh) * | 2016-11-28 | 2017-05-31 | 无锡福祈制药有限公司 | 一种米卡芬净母核fr179642的制备方法 |
| CN108753880A (zh) * | 2018-05-30 | 2018-11-06 | 博瑞生物医药（苏州）股份有限公司 | 米卡芬净钠前体的新的制备方法 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116496911A (zh) * | 2023-04-23 | 2023-07-28 | 浙江昊清生物科技有限公司 | 一种米卡芬净中间体fr901379高产菌株及其应用 |
| CN116496911B (zh) * | 2023-04-23 | 2023-12-26 | 浙江昊清生物科技有限公司 | 一种米卡芬净中间体fr901379高产菌株及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114874919B (zh) | 2023-06-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Jiao et al. | Bacillus amyloliquefaciens YN201732 produces lipopeptides with promising biocontrol activity against fungal pathogen Erysiphe cichoracearum | |
| CN106978350A (zh) | 一株黑曲霉及其在普洱茶素类化合物的制备中的应用 | |
| CN115851483B (zh) | 湿地链霉菌菌株及其发酵液在抑制抗苯醚甲环唑的大豆炭疽病菌中的应用 | |
| Zhao et al. | Study on the preparation and regeneration of protoplast from taxol-producing fungus Nodulisporium sylviforme | |
| Tang et al. | Improving the production of a novel antifungal alteramide B in Lysobacter enzymogenes OH11 by strengthening metabolic flux and precursor supply | |
| WO2021255181A1 (en) | Bacteria | |
| CN112111482A (zh) | 高通量诱变筛选高产他克莫司筑波链霉菌的方法及菌株 | |
| CN105039168B (zh) | 一株橘绿木霉及其用途 | |
| CN114874919B (zh) | 一株米卡芬净前体fr901379高产菌株及其应用 | |
| CN112795609B (zh) | 高效制备环缩肽的方法、环缩肽及应用 | |
| CN103232940B (zh) | 淡色生赤壳菌Bo-1菌株及其培养物和在拮抗病原细菌中的应用 | |
| CN118421539B (zh) | 一株贝莱斯芽孢杆菌e16及其作为生防菌在防治植物病害中的应用 | |
| CN102676406B (zh) | 一种用于发酵生产核糖核酸的热带假丝酵母菌及其应用 | |
| CN113278533B (zh) | 一种高产喜树碱内生菌株及其应用 | |
| CN116784353B (zh) | 野尻链霉菌菌株及其发酵液在抑制抗咪鲜胺锰盐的双孢蘑菇疣孢霉菌中的应用 | |
| CN101892163B (zh) | 一种沙门柏干酪青霉及其应用 | |
| CN103468579A (zh) | 一种对柑橘木虱具致病力的蜡蚧菌属真菌新种 | |
| CN112877237B (zh) | 一株武夷菌素高产菌株、发酵方法及应用 | |
| CN104480134A (zh) | 高效生防重组利迪链霉菌及其构建方法与应用 | |
| CN114907989B (zh) | 一种阿尼芬净前体棘白菌素b高产菌株及其应用 | |
| CN115806897A (zh) | 一株乳酸链霉菌及其在抗青枯病中的应用 | |
| CN108587969A (zh) | 可防治棉花黄萎病的大丽轮枝菌的菌株 hcx-01的制备及其应用 | |
| CN101486974B (zh) | 一种产紫杉醇的内生真菌 | |
| CN114854603B (zh) | 一株高产棘白菌素b的菌株及其应用 | |
| CN107904198B (zh) | 一种高产杆菌肽a的地衣芽孢杆菌基因改组菌株及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |