CN107904198B - 一种高产杆菌肽a的地衣芽孢杆菌基因改组菌株及应用 - Google Patents
一种高产杆菌肽a的地衣芽孢杆菌基因改组菌株及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107904198B CN107904198B CN201711121738.3A CN201711121738A CN107904198B CN 107904198 B CN107904198 B CN 107904198B CN 201711121738 A CN201711121738 A CN 201711121738A CN 107904198 B CN107904198 B CN 107904198B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bacitracin
- medium
- strain
- bacillus licheniformis
- liquid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- CLKOFPXJLQSYAH-ABRJDSQDSA-N bacitracin A Chemical compound C1SC([C@@H](N)[C@@H](C)CC)=N[C@@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N[C@H](CCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2N=CNC=2)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCCCC1 CLKOFPXJLQSYAH-ABRJDSQDSA-N 0.000 title claims abstract description 46
- 108010016899 bacitracin A Proteins 0.000 title claims abstract description 41
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 title claims abstract description 24
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 22
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 22
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims abstract description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 21
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 8
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 abstract description 17
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 abstract description 17
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 9
- 108010001478 Bacitracin Proteins 0.000 abstract description 5
- 229960003071 bacitracin Drugs 0.000 abstract description 5
- 229930184125 bacitracin Natural products 0.000 abstract description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 abstract 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 32
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 3
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 2
- SMVZDCVZXKQERC-UHFFFAOYSA-N guanidine;nitrous acid Chemical compound ON=O.NC(N)=N SMVZDCVZXKQERC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000000799 fusogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
- C12R2001/10—Bacillus licheniformis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种高产杆菌肽A的地衣芽孢杆菌基因改组菌株及应用。本发明采取了育种新技术中的等离子体诱变技术，与传统物理、化学诱变方法相结合，并采用基因组改组技术，效果明显，产量提高显著。本发明提供的用于杆菌肽A高效发酵生产的基因改组菌株F2‑X1，降低了以地衣芽孢杆菌为发酵菌株，生产杆菌肽的成本。而且产量提高明显，经所述条件发酵后，杆菌肽A产量可达到1.7g/L,适用于大规模发酵生产杆菌肽A。本发明提供的以HPLC检测方法简单准确，是用于快速准确检测杆菌肽A产量。
Description
技术领域
本发明涉及一种高产杆菌肽A的地衣芽孢杆菌基因改组菌株及应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
杆菌肽是由是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌产生的一种对革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌有广泛抑制作用的环肽。根据氨基酸组成和位置的不同，现已发现15种同系物，其中杆菌肽 A，分子式为C66H103N17O16S，是其中主要的活性物质，生物活性也最强。由于杆菌肽高效、无残留及无毒副作用、并产生耐药性及交叉耐药性、排泄快等优点，广泛应用于饲料农业等。
由于自然筛选到的野生菌活力低，营养条件苛刻，产能较低，通过诱变及基因改组后，能有效提高微生物产能。
目前，除了传统的理化诱变技术外，近几年发展起来一种新的生物诱变育种技术：常压室温等离子体（ARTP）技术，由裸露金属电极结构的，大气压射频辉光放电等离子体发生器产生的活性粒子，如电子、离子、光子、处于激发态的中性粒子及一些自由基能作用于细胞的核酸或蛋白质，从而引起细胞基因突变或结构及通透性改变。与传统诱变技术相比，该技术操作简便，条件温和，适应范围广，而且诱变效果与其他诱变方法相结合能大大提高突变效果。ARTP技术虽然证明能有效引起基因突变，但是引起基因突变的机制还不清楚，产生的各种激发离子比例无法控制。
发明内容
技术问题
本发明为解决上述现有技术中所存在的技术缺陷，提供了一种高产杆菌肽A 的地衣芽孢杆菌基因改组菌株，目的在于，提高菌株发酵水平的同时降低发酵能耗和生产成本。
技术方案
为实现上述发明目的，采取的技术方案为：
一种高产杆菌肽A的地衣芽孢杆菌基因改组菌株，该菌株F2-X1保藏号为CGMCCNo. 14830。
所述高产杆菌肽A的地衣芽孢杆菌基因改组菌株的培养基为LB培养基。
所述高产杆菌肽A的地衣芽孢杆菌基因改组菌株可以在生产杆菌肽A方面得到应用。包括以下步骤：
（1） 斜面培养
地衣芽孢杆菌F2-X1在无菌条件下接种于固体斜面培养基上，37℃培养48h,其中所述的固体斜面培养基为LB培养基;
（2） 种子培养
将步骤（1）所培养的地衣芽孢杆菌在无菌条件下接种于液体种子培养基，37℃，180 rpm，培养12 h;其中所述的种子培养基为液体LB培养基;
（3） 发酵培养
将步骤(2)所述种子液在无菌条件下接种于培养基中，37℃，180 rpm，培养48 h;其中所述发酵培养基为LB液体培养基。
其中杆菌肽 A 含量检测包括:将步骤(3)所得发酵液离心除菌体，加入两倍体积无水乙醇，离心过膜后以HPLC检测杆菌肽A产量。
杆菌肽A的 HPLC检测方法为,以A：水+0.1%三氟乙酸；B：乙腈+0.1%三氟乙酸，为流动相进行梯度洗脱，其中，A相有30%线性增长为40%，时间为20 min,检测波长为220 nm，柱温35℃。
有益效果
本发明提供的LB培养基及其与之相适应用于杆菌肽A高效发酵生产的基因改组菌株F2-X1，大大降低了以地衣芽孢杆菌为发酵菌株，生产杆菌肽的成本。而且产量提高明显，经所述条件发酵后，杆菌肽A产量可达到1.7 g/L,适用于大规模发酵生产杆菌肽A。本发明提供的以HPLC检测方法简单准确，是用于快速准确检测杆菌肽A产量。
附图说明
图1 杆菌肽A标准曲线
图2 杆菌肽A液相检测图
图3 杆菌肽A检测结果
生物保藏
菌株F2-X1，分类命名为：地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）,于2017年10月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址 北京市朝阳区北辰西路1号院 中科院微生物研究所，保藏号为:CGMCC No. 14830。
具体实施方式：
下面结合菌体实施例对本发明做具体说明，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
1. 杆菌肽A高效液相检测方法
HPLC条件：以A：水+0.1%三氟乙酸；B：乙腈+0.1%三氟乙酸，为流动相进行梯度洗脱，洗脱条件：A相由30%线性增长为40%，时间为20 min。进样量20 μL，检测波长为220 nm，柱温35 ℃。
精密配制浓度为0.20、0.40、0.60、0.80、0.40、0.20g/L杆菌肽标（购自德国Dr.Ehrenstorfer公司）准溶液（杆菌肽A含量47.1%，），HPLC检测并计算峰面积，每个浓度检测3次。以杆菌肽A峰面积平均值为纵坐标，杆菌肽A浓度为横坐标绘制标准曲线。得到线性回归方程为y=23.45x-1.04，线性范围为0.094 -0.94 g/L，相关性系数为0.9992。标准曲线及检测结果见图1和图2。
2. 地衣芽孢杆菌菌株的诱变，以实验室保藏地衣芽孢杆菌为初始菌株。
（1）紫外诱变：地衣芽孢杆菌菌株的诱变，实验原始菌种为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），于实验室筛选保藏。原始地衣芽孢杆菌菌株接种于LB培养基，培养8h至对数中期，离心得菌体，无菌蒸馏水重悬，调节菌体浓度至OD600值为1.5，取5 ml重悬菌液于直径5 cm灭菌玻璃平皿中，放入灭菌的磁力搅拌棒，紫外灯下30 cm照射180 s，时间到关闭搅拌器，取1 ml处理后菌液梯度稀释至10-1和10-2，涂布于LB固体平板上，37℃培养24 h。挑取较大单菌落，接种于液体LB培养基中，37℃发酵48h，琼脂扩散法初筛，具体操作为：选择藤黄微球菌为指示菌，将藤黄微球菌液体种子液按10％ 的接种量接人已经融化好的LB固体培养基中，迅速摇匀，倒入水平平板上面，待其凝固，用灭菌后的5mm打孔器打孔，取50μL离心发酵上清液加入孔内，于37℃培养24 h后观察、比较抑菌圈直径大小，取20株抑菌圈直径大者为初筛菌株。HPLC法检测杆菌肽A产量复筛，检测结果见图3。选取产量最高的两株.
（2）亚硝酸胍诱变：菌株UV-2接种于LB培养基，培养8h至对数中期，离心得菌体，无菌蒸馏水重悬，调节菌体浓度至OD600值为1.5。重悬菌液加入亚硝酸胍母液，使终浓度调节为150 mg/ml，室温处理10 min，5000 rpm离心10 min终止反应，以无菌蒸馏水梯度稀释至10-1和10-2，涂布于LB培养基，37℃培养24 h。挑取较大单菌落，接种于液体LB培养基中，37℃发酵48 h，琼脂扩散法初筛，HPLC法检测杆菌肽 A产量复筛，具体操作见紫外诱变。选取产量最高的两株得M-1和M-2.（3）ARTP诱变：菌株M-2接种于LB培养基，培养8h至对数中期，离心得菌体，无菌蒸馏水重悬，调节菌体浓度至OD600值为1.5取10ul涂于铁片上，不致重叠效应影响诱变处理的均匀性。处理参数为：高纯氦气（99.999%）流量10SLM，射频功率200 W，处理时间210 s，距放射源距离5 mm。处理后，以无菌生理盐水洗下铁片上菌体，梯度稀释至10-1和10-2，涂布于固体LB培养基，37℃培养24 h。挑取较大单菌落，接种于液体LB培养基中，37℃发酵48h，琼脂扩散法初筛，HPLC法检测杆菌肽 A产量复筛，具体操作见紫外诱变。选取产量最高的两株。
3. 菌株诱变后的原生质体制备：A-2菌株接种于液体LB培养基中，37℃培养8 h，取5 ml发酵液，8000 rpm，10 min离心得菌体，无菌蒸馏水洗涤两次，最终悬浮于5 ml原生质体稳定液中，加入溶菌酶，使终浓度为5 mg/ml，37℃处理5 min。结束后，500 rpm，5 min收集原生质体，原生质体稳定液洗涤两次，最终重悬于1 ml原生质体稳定液中，得原生质体悬液。
4 原生质体灭活：将制得原生质体悬液平均分为两份，一份80℃水浴80 min，进行热灭活；另一份放入到灭菌的磁力搅拌器中，紫外灯25 cm下磁力搅拌照射20 min，进行紫外灭活。
5 原生质体融合：取热灭活与紫外灭活的原生质体等体积混合均匀，加入9倍体积40% PEG6000，室温保存10 min进行融合，融合结束后，迅速放入离心机中，5000 rpm，5 min收集原生质体，并用稳定液洗涤两次，重悬后得融合子，适当稀释，涂布于原生质体再生培养基上，37℃培养48 h得融合子单菌落。
6 基因改组菌株的筛选：挑取融合后较大单菌落，接种于液体LB培养基中，37℃发酵48 h，琼脂扩散法初筛，HPLC法检测杆菌肽 A产量复筛，具体操作见紫外诱变。选取高产菌株。
7遗传稳定性菌株筛选：取多轮改组后菌株传代10次，验证遗传稳定性，获得遗传稳定的多轮融合高产菌株F2-X1。
8 发酵验证产量：
（1） 斜面培养
地衣芽孢杆菌X-1在无菌条件下接种于斜面培养基上，37℃培养48h。
其中所述的固体斜面培养基为LB培养基。
（2） 种子培养
将步骤（1）所培养的地衣芽孢杆菌在无菌条件下接种于液体种子培养基，37℃，180 rpm，培养12 h。
其中所述的种子培养基为液体LB培养基。
（3） 发酵培养
将步骤2所述种子液在无菌条件下接种于培养基中，37℃，180 rpm，培养48 h。
其中所述发酵培养基为LB液体培养基。
（4） 杆菌肽 A 含量检测
将步骤3所得发酵液离心除菌体，加入两倍体积无水乙醇，离心过膜后以HPLC检测杆菌肽A产量。经所述条件发酵后，杆菌肽A产量可达到1.7 g/L。现有文献报道杆菌肽A产量在1g/L左右。
Claims (4)
1.一种高产杆菌肽A的地衣芽孢杆菌基因改组菌株，该菌株F2-X1保藏号为CGMCCNo.14830。
2.权利要求1所述高产杆菌肽A的地衣芽孢杆菌基因改组菌株F2-X1在生产杆菌肽A中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，包括以下步骤：
(1)斜面培养
地衣芽孢杆菌F2-X1在无菌条件下接种于固体斜面培养基上，37℃培养48h，其中所述的固体斜面培养基为LB培养基；
(2)种子培养
将步骤(1)所培养的地衣芽孢杆菌在无菌条件下接种于液体种子培养基，37℃，180rpm，培养12h，获得种子液；其中所述的液体种子培养基为液体LB培养基；
(3)发酵培养
将步骤(2)所述种子液在无菌条件下接种于发酵培养基中，37℃，180rpm，培养48h；其中所述发酵培养基为LB液体培养基。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，杆菌肽A含量检测包括:
将步骤(3)所得发酵液离心除菌体，加入两倍体积无水乙醇，离心过膜后以HPLC检测杆菌肽A产量，杆菌肽A的HPLC检测方法为：
以A：水+0.1％三氟乙酸；B：乙腈+0.1％三氟乙酸，为流动相进行梯度洗脱，其中，A相由30％线性增长为40％，时间为20min，检测波长为220nm，柱温35℃。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711121738.3A CN107904198B (zh) | 2017-11-14 | 2017-11-14 | 一种高产杆菌肽a的地衣芽孢杆菌基因改组菌株及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711121738.3A CN107904198B (zh) | 2017-11-14 | 2017-11-14 | 一种高产杆菌肽a的地衣芽孢杆菌基因改组菌株及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107904198A CN107904198A (zh) | 2018-04-13 |
| CN107904198B true CN107904198B (zh) | 2020-09-15 |
Family
ID=61844002
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201711121738.3A Expired - Fee Related CN107904198B (zh) | 2017-11-14 | 2017-11-14 | 一种高产杆菌肽a的地衣芽孢杆菌基因改组菌株及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107904198B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109444318B (zh) * | 2018-12-03 | 2021-04-27 | 上海市食品药品检验研究院 | 一种用于分析杆菌肽组分的高效液相色谱方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4946079B1 (zh) * | 1970-08-08 | 1974-12-07 | ||
| HU212363B (en) * | 1994-01-27 | 1996-07-29 | Phylaxia Oltoanyag | Method for preparation of a new bacillus strain producing bacitracin and the use of new strain in fermentation |
| WO2007136824A1 (en) * | 2006-05-19 | 2007-11-29 | Taro Pharmaceuticals U.S.A., Inc. | High-yield bacitracin-producing microorganism |
| CN105483064A (zh) * | 2016-02-23 | 2016-04-13 | 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 | 一种发酵生产杆菌肽的方法 |
-
2017
- 2017-11-14 CN CN201711121738.3A patent/CN107904198B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107904198A (zh) | 2018-04-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113215031B (zh) | 一种贝莱斯芽孢杆菌19573-3及其应用 | |
| CN104911120A (zh) | 一种枯草芽孢杆菌的发酵生产工艺 | |
| CN107815446B (zh) | 一种重组腈水合酶大肠杆菌基因工程菌的高密度发酵方法 | |
| CN102660461A (zh) | 一种缩短烟叶发酵周期的微生物制剂及其应用 | |
| CN113930347B (zh) | 一种能够合成褪黑素的绿色木霉工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN110951667B (zh) | 一株丰原素高产菌株lpb-18n及其选育和应用 | |
| CN103451133A (zh) | 一种环状芽孢杆菌及其在制备阿魏酸脱羧酶中的应用 | |
| CN102154162A (zh) | 一种解淀粉芽孢杆菌及其应用 | |
| CN103194398B (zh) | 一株柠檬酸高产菌株及其筛选方法 | |
| CN104726381B (zh) | 一株产l‑赖氨酸的菌株及其生产l‑赖氨酸的方法 | |
| CN107904198B (zh) | 一种高产杆菌肽a的地衣芽孢杆菌基因改组菌株及应用 | |
| CN101338291B (zh) | 一种制备冠菌素的方法及其专用菌株 | |
| CN110079470B (zh) | 一株具有抑菌活性的假单胞菌 | |
| CN102676406B (zh) | 一种用于发酵生产核糖核酸的热带假丝酵母菌及其应用 | |
| CN101215562A (zh) | 一种构建酿酒酵母乙醇高产菌株的方法 | |
| CN103233034B (zh) | 产生四环素单一组分的基因工程菌株的构建方法 | |
| CN103333909A (zh) | 淀粉酶产色链霉菌电击转化方法 | |
| CN104531798A (zh) | 一种提高四烯大环内酯类抗生素产量的方法 | |
| CN106755045A (zh) | 一种胶状溶杆菌oh17遗传操作系统的构建方法 | |
| CN105861343A (zh) | 一株利用甲醇制备高赖氨酸单细胞蛋白的多形汉逊酵母菌及其应用 | |
| CN106947757B (zh) | 一种耐高盐高产酯酵母融合子的制备方法 | |
| CN110564718A (zh) | 高通量诱变筛选高产两性霉素b结节链霉菌的方法及菌株 | |
| CN114874919A (zh) | 一株米卡芬净前体fr901379高产菌株及其应用 | |
| CN102660481A (zh) | 一株稳定高产2,3-丁二醇的细菌及利用低温等离子体和硫酸二乙酯复合诱变的方法 | |
| Chu et al. | Breeding of high daptomycin-producing strain by streptomycin resistance superposition |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20200915 |