CN108753880A - 米卡芬净钠前体的新的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种FR179642的制备方法，该方法包括：1)、发酵FR901379的培养基的制备；2)、将菌株Coleophoma empetri种子培养液接种于发酵培养基进行发酵；3)、在发酵培养24～72h后，向发酵液中补加棕榈酸甲酯和二甲基硅油混合物；4)、当发酵160h后，FR901379的浓度不再增长时，发酵结束；5)、将上一步得到的FR901379与脱酰酶交联酶聚体反应，转化为FR179642。

Description

米卡芬净钠前体的新的制备方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及抗真菌的发酵半合成药物前体的制备，更具体涉及米卡芬净钠前体FR179642的发酵方法。

背景技术

近年来，由于免疫低下患者逐年增多，真菌感染发病率明显升高，尤其是深部真菌感染的发病率和病死率显著增加。棘白菌素类抗生素是20世纪70年代发现的一组天然产物，具有类似的环状多肽核心和不同的脂肪酸侧链，能够非竞争性地抑制真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖合成酶的活性，从而达到抗真菌的目的。与传统抗真菌药物相比，该类药物具有作用机制独特，毒副作用低，且对一些唑类和两性霉素B耐药的真菌具有很强的抗菌活性，是目前临床治疗深部真菌感染的常用药物。FDA已批准上市的这类药物包括卡泊芬净(Caspofungin)、米卡芬净(Micafungin)和阿尼芬净(Anidulafungin)。米卡芬净药用盐为米卡芬净钠。

FR901379是合成米卡芬净类药物的重要前体物质，由C.empetri经突变后获得的高产菌株发酵所得。FR901379通过脱酰酶脱除侧链后得到米卡芬净母核FR179642，FR179642经过化学修饰得到米卡芬净钠。

FR901379的结构如下：

FR179642的结构如下：

USP5502033、EP0431350A1公布了使用Coleophoma empetri F-11899发酵生产FR901379的过程，发酵培养基包含基本的碳氮源、无机盐，单位100mg/L。CN201010571797.2公开了一种使用Coleophoma empetri F-11899发酵生产FR901379的培养基，优化了碳源和有机氮源，单位提高到300～400mg/L。但现行的发酵生产FR901379的技术中，仍然存在由于发酵液中丝状菌的生长特性，发酵液黏度过高，氧传递效果较差，溶氧偏低，从而抑制了菌体次级代谢，导致FR901379发酵单位偏低的问题。

201010571797.2提供了一种用于菌株Coleophoma empetri F-11899或其变体生产FR901379的发酵培养基，所述发酵培养基含有碳源、有机氮源、无机盐、和金属离子。发酵效价为300～400mg/L。

201611019780.X提供了一种发酵生产FR901379的培养基及其方法，该培养基的组成为果糖、玉米蛋白粉、干酪素、酵母蛋白胨、硫酸镁、磷酸氢二钾、碳酸钙、消泡剂、水，进一步包括在发酵过程中补加果糖和双氧水，经过对发酵培养基的改良，FR901379的产量较高，单位达到3.0～3.4g/L。但是该方法发酵液营养过于丰富，放罐菌体生物量大，分离纯化成本较高。

中国专利91104847.2公开了将FR901379通过菌丝体游动放线菌属utahensisIFO-13244在37℃脱酰基得到FR179642的钠盐。

中国专利CN102443050披露了以一种环脂肽化合物为前体通过酶解掉侧链得到FR179642，并报道了该种前体环脂肽化合物的分离提纯方法。此外还有文献中报道由FR179642制备米卡芬净的合成方法(Ueda,S.；Ezaki,M.；Tanaka,M.；et al.Studies on anovellipopeptide acylase from Streptomyces spp.for production of FR179642,akey intermediate of antifungal lipopeptide drug FK463.38th Intersci ConfAntimicrob Agents Chemother(Sept 24 1998,San Diego)1998,Abst F-145)。

中国专利CN106755221公开了一种FR179642的制备方法，FR179642菌株在培养基中发酵，在发酵过程中分两次添加米卡芬净前体FR901379，并通过多阶段控温的方法，提高FR179642的产量。

但长期以来FR179642的发酵一直停留在一个很低的水平，尽管人们都在为寻找一个廉价，高产的培养基而努力，但收效甚微。这就使得FR179642化合物的制备难度加大，成本提高，从而间接使米卡芬净钠长期处于一个较高的价位。因此人们迫切需要一种廉价高效合成FR179642的方法。

中国专利CN106544382公开了一种将FR901379转化成FR179642的方法，该方法通过控制转化液中FR901379的起始浓度以及转化过程中温度和pH控制，显著提高了酶的转化效率，转化率可高达83％，但该专利所公开的方法是收集菌体进行转化，转化体系存在大量微生物，转化速度较慢，酶的稳定性差，分离纯化步骤复杂，成本高。

华东理工大学硕士学位论文“棘白菌素脱酰酶基因工程菌的构建及应用研究”公开了一种ECB脱酰酶的固定化研究，由于游离的ECB脱酰酶存在储存时间短，回收利用难等缺点，该论文作者对LX-1000HA树脂进行戊二醛交联，将其用于EBC脱酰酶的固定化。通过该方法，虽然转化率较高，但操作复杂，成本较高，固定化过程的化学反应容易导致酶部分失活。

2000年荷兰Delft理工大学的Cao等在交联酶和交联酶晶体的基础上提出一种新型的固定化酶技术，交联酶聚体(cross-linked enzyme aggregates，CLEAs)。此通过改变性质使酶分子靠近而形成聚集体从溶剂中沉淀出来，之后将聚集体进行交联，形成交联酶聚体。交联酶聚体是酶本身作为载体的固定化酶，单位体积酶浓度高，稳定、可回收、催化活性高，生产成本低，具有潜在的应用前景。

目前报道的交联酶聚体使用的酶包括水解酶、裂合酶、氧化还原酶，目前未见在发酵半合成药物的发酵领域有报道，也未见将此技术应用于脱酰酶的报道。

基于对扩大生产，降低成本的需要，在米卡芬净的生产领域，仍然需要更优的FR179642的制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种全新的FR179642的制备方法。该方法包括两个主要步骤：第一步，在发酵FR901379的培养液中加入棕榈酸甲酯；第二步，FR901379与脱酰酶交联酶聚体反应，得到FR179642。

更具体地，本发明包括如下步骤：

(1)将菌株Coleophoma empetri F-11899种子培养液接种于发酵培养基进行发酵；

(2)在发酵培养24～72h后，向发酵液中补加3～10％质量体积比的棕榈酸甲酯和二甲基硅油混合物。所述棕榈酸甲酯和二甲基硅油混合物中，二甲基硅油所占质量体积比为5％～10％；

(3)发酵160h后，FR901379的浓度不再增长时，发酵结束；

(4)FR901379和脱酰酶交联酶聚体反应，转化为FR179642。

其中，步骤(1)中，发酵培养基可采用本领域技术人员熟知的条件进行发酵培养基的制备，例如，包括但不限于201010571797.2中公开的发酵培养基。

步骤(4)中，脱酰酶交联酶聚体是通过如下方法制备的：发酵能将棘白菌素B脱酰酶表达在胞外的基因工程菌，获得棘白菌素B脱酰酶粗酶，脱酰酶粗酶制备为脱酰酶交联酶聚体。

更详细的来说，

脱酰酶粗酶是由产生菌发酵制得，粗酶产生菌的发酵可使用表达在胞外的基因工程菌株，例如白色链霉菌基因工程菌株(Streptomyces albus)，(参见“EfficientBioconversion of Echinocandin B to Its Nucleus by Overexpression of DeacylaseGenes in Different Host Strains[J].Appl Environ Microbiol,2013Feb；79(4):1126-33)，采用本领域技术人员熟知的条件进行发酵制备，例如包括但不限于CN102618606中公开的发酵方法。

按照上述方法制备得到的脱酰酶发酵液过滤或离心，向上清液加入硫酸铵进行盐析，通入空气，搅拌后静置，过滤或离心，收集沉淀，得到脱酰酶粗酶。

其中，所述的硫酸铵的用量为发酵上清液的40～80％(w/v)，优选50％；通入空气的每分钟流量相当于加入硫酸铵后料液总体积的10～30％(v/v)，优选20％；搅拌时间为20～60分钟，优选30分钟；搅拌速度为50～150rpm；静置条件为温度4～15℃、时间8～16小时，优选的静置条件为8℃静置12小时。

脱酰酶交联酶聚体制备的具体方法为：将制备得到的脱酰酶粗酶加入磷酸缓冲液后，再加入牛血清白蛋白(BSA)作为交联保护剂，通入空气，搅拌后静置。再向上述反应液中加入交联剂戊二醛，搅拌，以形成脱酰酶交联酶聚体。

其中，所述的磷酸缓冲液含磷酸二氢钾2～2.5g/L，磷酸氢二钠1～1.5g/L，pH调节至5.5～6.5；优选磷酸二氢钾2.24g/L，磷酸氢二钠1.24g/L，pH为6.0。粗酶的加入量为1～3％(w/v)，优选粗酶加入量2％。

所述的牛血清白蛋白(BSA)的加入量为1～3g/L，优选2g/L，通入空气的每分钟流量相当于料液体积的10～30％(v/v)，优选20％；搅拌时间为20～60分钟，优选30分钟；搅拌速度为50～150rpm；静置条件为温度4～15℃、时间0.5～2小时，优选的静置条件为8℃静置1小时。

所述的戊二醛加入量为10～30mmol/L，优选20mmol/L；搅拌温度为28～32℃；搅拌速度为50～150rpm，优选100rpm，搅拌时间1～3小时，优选2小时。

向上述步骤得到的反应液中加入米卡芬净前体FR901379，搅拌，使米卡芬净前体FR901379转化为米卡芬净母核，监测转化体系中米卡芬净前体FR901379和米卡芬净母核浓度，当米卡芬净前体FR901379浓度不再减少，米卡芬净母核浓度不再增加时，结束转化。

其中，所述的米卡芬净前体FR901379的加入量为5～20g/L，优选20g/L，搅拌温度为28～32℃，搅拌速度为50～150rpm，优选100rpm，转化时间为6～24小时，结束转化的指标为HPLC检测反应体系中米卡芬净前体FR901379浓度不再减少，米卡芬净母核浓度不再增加。

本发明方法在FR901379发酵过程中加入棕榈酸甲酯作为FR901379脂肪酸侧链前体物质，促进FR901379的生物合成。同时在发酵液中引入与反应液不相溶的二甲基硅油，棕榈酸甲酯除了作为发酵前体，也和二甲基硅油一起作为发酵体系中的氧载体，减少气液传氧阻力，解决了现有技术发酵过程溶氧不足的问题，提高了FR901379的发酵产量，降低了生产成本。

另一方面，本发明在FR901379转化为FR179642的过程中，采用交联酶聚体技术，通过添加牛血清白蛋白(BSA)作为交联保护剂，同时控制空气的流量和搅拌速度、时间，形成粒径大小合适的酶聚体，既避免了交联酶聚体粒径过大使得内部的酶分子不能很好地和底物接触，又避免了酶分子过多暴露在有机溶剂体系中导致失活。本发明脱酰酶交联后酶活更高，FR901379转化为FR179642的转化率更高。本发明成本低廉，操作简便，降低分离纯化的成本。

具体实施例

在下面将对本发明进行详细描述。然而，本发明可能具体体现为许多不同的形式，而且它不应该被局限于此处所描述的实施例中，提供这些实施例中的目的是使所披露内容更完整与全面。所用试剂和原料，除了提供制备方法的除外，其余均为市售。除非另有定义，否则本文中所有科技术语具有的含义与权利要求主题所属技术领域人员通常理解的含义相同。

实施例1

将培养好的种子以5％(v/v)比例转入30L的120℃灭菌30min后冷却至24-26℃的发酵培养基中，该发酵培养基组成，质量(g)/体积(L)比为：葡萄糖50、棉籽饼粉20、酵母粉10、蛋白胨10、硫酸镁2、磷酸氢二钾1、碳酸钙4、消泡剂1，其余为水。

发酵过程中控制温度24-26℃，通气量1VVM，初始转速150rpm，过程中调控转速150～600rpm之间使溶氧不低于20％。

将棕榈酸甲酯和二甲基硅油按照二甲基硅油所占质量体积比为10％配制成溶液120℃灭菌30min后待用。

在发酵培养48h后，向发酵液中补加3％质量体积比的棕榈酸甲酯和二甲基硅油混合物。

发酵周期为8天，测定FR901379放罐浓度为3.27g/L。

实施例2

将培养好的种子以5％(v/v)比例转入30L的120℃灭菌30min后冷却至24-26℃的发酵培养基中，该发酵培养基组成，质量(g)/体积(L)比为：葡萄糖50、棉籽饼粉20、酵母粉10、蛋白胨10、硫酸镁2、磷酸氢二钾1、碳酸钙4、消泡剂1，其余为水。

发酵过程中控制温度24-26℃，通气量1VVM，初始转速150rpm，过程中调控转速150～600rpm之间使溶氧不低于20％。

将棕榈酸甲酯和二甲基硅油按照二甲基硅油所占质量体积比为5％配制成溶液120℃灭菌30min后待用。

在发酵培养48h后，向发酵液中补加10％质量体积比的棕榈酸甲酯和二甲基硅油混合物。

发酵周期为8天，测定FR901379放罐浓度为3.39g/L。

实施例3

将培养好的种子以5％(v/v)比例转入30L的120℃灭菌30min后冷却至24-26℃的发酵培养基中，该发酵培养基组成，质量(g)/体积(L)比为：葡萄糖50、棉籽饼粉20、酵母粉10、蛋白胨10、硫酸镁2、磷酸氢二钾1、碳酸钙4、消泡剂1，其余为水。

发酵过程中控制温度24-26℃，通气量1VVM，初始转速150rpm，过程中调控转速150～600rpm之间使溶氧不低于20％。

将棕榈酸甲酯和二甲基硅油按照二甲基硅油所占质量体积比为8％配制成溶液120℃灭菌30min后待用。

在发酵培养48h后，向发酵液中补加8％质量体积比的棕榈酸甲酯和二甲基硅油混合物。

发酵周期为8天，测定FR901379放罐浓度为3.40g/L。

实施例4

菌种：白色链霉菌(Streptomyces albus)，保藏号：ATCC21725；-80℃冷冻管保存；

种子培养基：热炸黄豆饼粉0.5％(w/v，下同)，酵母粉0.5％，蛋白胨0.5％，葡萄糖1％，pH约6.8～7.2，30℃培养1～2天；

发酵培养基：热炸黄豆饼粉1％，酵母粉1％，蛋白胨1％，葡萄糖3％，氯化钠0.5％，七水硫酸镁0.2％，磷酸氢二钾0.1％，pH约6.8～7.2，30℃培养2～3天；

将白色链霉菌基因工程菌株接种于种子培养基，30℃培养1～2天，然后按照发酵体积的5％接种于发酵培养基，30℃培养2～3天；

发酵完成后，将发酵液过滤得到上清液，按照上清液体积的50％加入硫酸铵，通入空气，每分钟流量相当于料液体积的20％，同时搅拌30分钟，8℃静置12小时，过滤收集沉淀，得到粗酶。

实施例5

在反应罐内配制磷酸盐缓冲液1000L，含磷酸二氢钾2.24g/L和磷酸氢二钠1.24g/L，用盐酸或氢氧化钠调节pH为6.0。

向磷酸缓冲液中加入20kg粗酶，2kg牛血清白蛋白(BSA)，通入空气，每分钟流量为200L，同时搅拌30分钟，搅拌速度为80rpm，8℃静置1小时。

向反应液中加入戊二醛20mmol/L，30℃搅拌2小时，搅拌速度为100rpm。

向反应液中加入20kg实施例3制备得到的米卡芬净前体FR901379，，30℃搅拌反应6～24小时，搅拌的速度为100rpm，转化过程中HPLC监测转化体系中米卡芬净前体FR901379和米卡芬净母核浓度，当米卡芬净前体FR901379浓度不再减少，米卡芬净母核浓度不再增加时，结束转化。反应液过滤，取滤液HPLC定量检测米卡芬净母核含量，计算摩尔转化率为95.16％。

实施例6

在反应罐内配制磷酸盐缓冲液1000L，含磷酸二氢钾2.24g/L和磷酸氢二钠1.24g/L，用盐酸或氢氧化钠调节pH为6.0。

向磷酸缓冲液中加入20kg粗酶，2kg牛血清白蛋白(BSA)，通入空气，每分钟流量为100L，同时搅拌60分钟，搅拌速度为150rpm，8℃静置1小时。

向反应液中加入戊二醛20mmol/L，30℃搅拌2小时，搅拌速度为100rpm。

向反应液中加入20kg实施例3制备得到的米卡芬净前体FR901379，，30℃搅拌反应6～24小时，搅拌的速度为100rpm，转化过程中HPLC监测转化体系中米卡芬净前体FR901379和米卡芬净母核浓度，当米卡芬净前体FR901379浓度不再减少，米卡芬净母核浓度不再增加时，结束转化。反应液过滤，取滤液HPLC定量检测米卡芬净母核含量，计算摩尔转化率为94.07％。

实施例7

在反应罐内配制磷酸盐缓冲液1000L，含磷酸二氢钾2.24g/L和磷酸氢二钠1.24g/L，用盐酸或氢氧化钠调节pH为6.0。

向磷酸缓冲液中加入20kg实施例3制备得到的粗酶，2kg牛血清白蛋白(BSA)，通入空气，每分钟流量为300L，同时搅拌20分钟，搅拌速度为50rpm，8℃静置1小时。

向反应液中加入戊二醛20mmol/L，30℃搅拌2小时，搅拌速度为100rpm。

向反应液中加入20kg米卡芬净前体FR901379，30℃搅拌反应6～24小时，搅拌的速度为100rpm，转化过程中HPLC监测转化体系中米卡芬净前体FR901379和米卡芬净母核浓度，当米卡芬净前体FR901379浓度不再减少，米卡芬净母核浓度不再增加时，结束转化。反应液过滤，取滤液HPLC定量检测米卡芬净母核含量，计算摩尔转化率为91.64％。

Claims (11)

1.一种FR179642的制备方法，该方法包括：

1)、发酵FR901379的培养基的制备；

2)、将菌株Coleophoma empetri种子培养液接种于发酵培养基进行发酵；

3)、在发酵培养24～72h后，向发酵液中补加棕榈酸甲酯和二甲基硅油混合物；

4)、当发酵160h后，FR901379的浓度不再增长时，发酵结束；

5)、将上一步得到的FR901379与脱酰酶交联酶聚体反应，转化为FR179642。

2.如权利要求1所述的方法，向发酵液中加入棕榈酸甲酯和二甲基硅油混合物的质量体积比为3～10％。

3.如权利要求2所述的方法，棕榈酸甲酯和二甲基硅油混合物中，二甲基硅油所占质量体积比为5～10％。

4.如权利要求1所述的方法，发酵培养基的组成为：葡萄糖、棉籽饼粉、酵母粉、蛋白胨、硫酸镁、磷酸氢二钾、碳酸钙、消泡剂、水。

5.如权利要求1所述的方法，其中，脱酰酶交联酶聚体的制备方法为将脱酰酶粗酶与交联保护剂牛血清白蛋白、交联剂戊二醛反应，以形成脱酰酶交联酶聚体。

6.如权利要求5所述的方法，脱酰酶交联酶聚体的制备方法为将脱酰酶粗酶加入磷酸缓冲液后，再加入牛血清白蛋白作为交联保护剂，通入空气，搅拌后静置，再向上述反应液中加入交联剂戊二醛，搅拌，以形成脱酰酶交联酶聚体。

7.如权利要求6所述的方法，磷酸缓冲液含磷酸二氢钾2～2.5g/L，磷酸氢二钠1～1.5g/L，pH为5.5～6.5，粗酶的加入量为1～3％，牛血清白蛋白的加入量为1～3g/L，通入空气的每分钟流量相当于料液体积的10～30％，搅拌时间为20～60分钟，搅拌速度为50～150rpm，静置条件为温度4～15℃、时间0.5～2小时，戊二醛加入量为10～30mmol/L，加入戊二醛后的搅拌条件为温度28～32℃、时间1～3小时。

8.如权利要求7所述的方法，磷酸缓冲液含磷酸二氢钾2.24g/L，磷酸氢二钠1.24g/L，pH为6.0。

9.如权利要求7所述的方法，粗酶的加入量为2％。

10.如权利要求7所述的方法，牛血清白蛋白的加入量为2g/L。

11.如权利要求7所述的方法，戊二醛加入量为20mmol/L。