CN106755221A - 一种米卡芬净母核fr179642的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种米卡芬净母核产生菌，通过在发酵过程中添加米卡芬净前体，对米卡芬净前体去酰化得到米卡芬净母核的方法，属于生物制药领域。在本发明中，米卡芬净母核FR179642菌株在培养基中发酵，在发酵过程中分两次添加米卡芬净前体FR901379并通过多阶段控温的方法，从而提高了米卡芬净母核FR179642的产量；发酵液经酸化破壁处理，用有机溶剂提取，大孔树脂吸附解析得解析液，再由解析液通过结晶得到米卡芬净母核粉末。本发明能够得用于合成米卡芬净母核FR179642，并且操作程序简单，方法稳定，重现性好。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及一种米卡芬净母核FR179642的制备方法。
背景技术
近年来，随着广谱抗菌药物和免疫抑制剂的大量应用、肿瘤化疗、器官移植以及艾滋病的蔓延等，导致免疫系统受到抑制的人群不断增多，深部真菌感染的发病率开始呈现明显的上升趋势，且随着抗真菌药物的运用，真菌的耐药性也越来越强，使得抗真菌药物的应用有迅猛增加的趋势。因此，抗深部真菌感染的药物已成为抗感染药的研究热点之一，日益引起人们的关注。
棘白菌素是一类新型的抗真菌药，与目前临床常用抗真菌药物的作用机制明显不同，是β-1，3-葡聚糖合成酶的抑制剂，作用于真菌的细胞壁。细胞壁是真菌与哺乳动物细胞之间最大的差别，所以干扰细胞壁的合成，影响细胞壁的完整性将导致真菌细胞死亡而对人无伤害，因此副作用较小，安全性较高。
米卡芬净是一种水溶性半合成棘白菌素类抗真菌药物，而FR179642是合成米卡芬净母核，CAS登录号：168110-44-9，化学式：C35H52N8O20S，分子量：936.90。FR179642的化学结构式如下所示：
目前，有关FR179642合成或者制备方面的报道仅见于公开号KR20140039753(A)的韩国发明专利中。其通过中间体FR901379经脱乙酰基反应，并以FR901379为起始物制备FR179642。具体的制备路线如下所示：
但是，上述现有技术存在制备成本高的缺陷。同时，现有技术中尚无针对FR179642发酵制备的相关报道，属于目前业界的空白技术。
发明内容
本发明的目的在于公开一种米卡芬净母核FR179642的制备方法，
为实现上述发明目的，本发明提供了米卡芬净母核FR179642的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)、取少量米卡芬净母核FR179642产生菌孢子悬液，接种于种子培养基上，于24～28℃下，培养40～50h；
步骤(2)、将种子培养基接种于发酵罐内并添加发酵培养基，当发酵罐内的菌浓达到稳定状态后添加米卡芬净前体FR901379，继续发酵40～60h后补加米卡芬净前体FR901379，所述步骤(2)中采用双阶段温控，发酵完成进行放罐以提取发酵液；
步骤(3)、向发酵液中添加酸使发酵液的pH呈3～4，板框过滤，然后添加极性溶剂进行抽提浓缩，得浓缩液；
步骤(4)、将浓缩液经大孔树脂吸附，使用极性溶剂解析，得到米卡芬净母核FR179642解析液；
步骤(5)、将米卡芬净母核FR179642解析液经结晶，干燥，得呈粉末状的米卡芬净母核FR179642。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(1)中的种子培养基的组分为：葡萄糖20～35g/L，酵母粉5～15g/L，黄豆饼粉5～15g/L，磷酸氢二钾0.5～1.5g/L，氯化钠0.1～1.0g/L，硫酸镁0.1～1.0g/L，碳酸钙0.1～0.5g/L，余量为水。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(2)中的发酵培养基的组分为：葡萄糖5～15g/L，酵母粉70～90g/L，黄豆饼粉6～10g/L，磷酸氢二钾1～5g/L，氯化钠1～5g/L，硫酸镁0.2～0.4g/L，碳酸钙0.1～0.5g/L，余量为水。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(2)中，发酵罐中的米卡芬净前体FR901379的浓度稳定在500～2000μg/mL之间。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(2)中，所述步骤(2)中，自初始状态到发酵罐内的菌浓达到稳定状态的发酵阶段中，发酵罐内的温度控制在30～34℃；发酵罐内的菌浓达到稳定状态至放罐阶段中，发酵罐内的温度控制在26～30℃。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(3)中的酸选自浓度为5～10wt％的稀硫酸、5～10wt％的稀硫酸或者5～10wt％的稀磷酸。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(4)中的极性溶剂选自C1～C4的醇；所述步骤(4)中的大孔树脂选自HP20大孔树脂、D1300大孔树脂或者SP207大孔树脂。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(5)中的结晶方式为溶剂沉降结晶或者浓缩结晶。
作为本发明的进一步改进，所述溶剂沉降结晶所使用的溶剂选自石油醚、正己烷或者环己烷。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(5)中的干燥方式为真空干燥，真空干燥的干燥温度为40～50℃，真空度为0.1～0.5MPa。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：在本发明中，米卡芬净母核FR179642菌株在培养基中发酵，在发酵过程中分两次添加米卡芬净前体FR901379并通过多阶段控温的方法，提高了米卡芬净母核FR179642的产量；发酵液经酸化破壁处理，用有机溶剂提取，大孔树脂吸附解析得解析液，再由解析液通过结晶得到米卡芬净母核粉末。本发明能够得用于合成米卡芬净母核FR179642，并且操作程序简单，方法稳定，重现性好。
具体实施方式
下面结合各实施方式对本发明进行详细说明，但应当说明的是，这些实施方式并非对本发明的限制，本领域普通技术人员根据这些实施方式所作的功能、方法、或者结构上的等效变换或替代，均属于本发明的保护范围之内。
除非说明书中有特殊说明，本发明中的各个实施例中的组分、原料均采用分析纯级别。另外，各实施例中的“g”为重量单位“克”；“h”为时间单位“小时”；“ml”为体积单位“毫升”；“室温”为23℃；“BV/H”：空间流速的表示,即是指柱内单位时间(小时)流经单位体积树脂平均液量。“HPLC”：高效液相色谱法。
实施例一：
该米卡芬净母核FR179642的制备方法，包括以下步骤。
步骤(1)、取少量米卡芬净母核FR179642产生菌孢子悬液，接种于种子培养基上，于24℃下，培养50h。该种子培养基中的组分为(单位：g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，黄豆饼粉5，磷酸氢二钾0.5，氯化钠0.1，硫酸镁0.1，碳酸钙0.1，余量为水。
步骤(2)、将种子培养基接种于发酵罐并添加发酵培养基，于24～28℃下培养60～70h。当发酵罐内的菌浓达到稳定状态后添加米卡芬净前体FR901379，继续发酵40h后，补加米卡芬净前体FR901379。在这两个发酵阶段中，自初始状态到发酵罐内的菌浓达到稳定状态的第一个发酵阶段，发酵罐内的温度控制在30℃。自发酵罐内的菌浓达到稳定状态至放罐的第二个发酵阶段中，发酵罐内的温度控制在26℃。该发酵培养基中的组分为(单位：g/L)：葡萄糖5，酵母粉70，黄豆饼粉6，磷酸氢二钾1，氯化钠1，硫酸镁0.2，碳酸钙0.1，余量为水。在本实施例中，在第二个发酵阶段中，发酵罐内的米卡芬净前体FR901379的浓度稳定在500μg/mL左右。
步骤(3)、发酵完成进行放罐后提取。提取发酵液时，先向发酵罐中添加浓度为5wt％的稀硫酸，以使发酵罐内发酵液的体系酸化至pH呈3，过板框后，加甲醇作为极性溶剂抽提浓缩，得米卡芬净母核FR179642浓缩液。
步骤(4)、将米卡芬净母核FR179642浓缩液使用装填有HP20的大孔树脂吸附柱进行吸附。吸附流速控制0.5～1.5BV/H，吸附完成后水洗，用浓度为60wt％甲醇作为极性溶剂进行解析，解析流速1～2BV/H，合并有效组分，得到米卡芬净母核FR179642解析液。
步骤(5)、米卡芬净母核FR179642解析液结晶，干燥，得呈粉状的米卡芬净母核FR179642。本实施例中，结晶方式为浓缩结晶，结晶温度为40℃。干燥方式为真空干燥，干燥温度40℃，真空干燥的真空度为0.1MPa。
本实施例所制得的米卡芬净母核FR179642经HPLC检测，归一化纯度85.5％。
实施例二：
该米卡芬净母核FR179642的制备方法，包括以下步骤。
步骤(1)、取少量米卡芬净母核FR179642产生菌孢子悬液，接种于种子培养基上，于28℃下，培养40h。该种子培养基中的组分为(单位：g/L)：葡萄糖35，酵母粉15，黄豆饼粉15，磷酸氢二钾1.5，氯化钠1.0，硫酸镁1.0，碳酸钙0.5，余量为水。
步骤(2)、将种子培养基接种于发酵罐并添加发酵培养基，于24～28℃下培养60～70h。
当发酵罐内的菌浓达到稳定状态后添加米卡芬净前体FR901379，继续发酵60h后，补加米卡芬净前体FR901379。在这两个发酵阶段中，自初始状态到发酵罐内的菌浓达到稳定状态的第一个发酵阶段，发酵罐内的温度控制在31℃。自发酵罐的菌浓达到稳定状态至放罐的第二个发酵阶段中，发酵罐内的温度控制在27℃。该发酵培养基组分中的组分为(单位：g/L)：葡萄糖15，酵母粉90，黄豆饼粉10，磷酸氢二钾5，氯化钠5，硫酸镁0.4，碳酸钙0.5，余量为水。在本实施例中，在第二个发酵阶段中，发酵罐内的米卡芬净前体浓度稳定在2000μg/mL左右。
步骤(3)、发酵完成进行放罐后提取。提取发酵液时，先向发酵罐中添加浓度为5wt％的稀盐酸，以使发酵罐内发酵液的体系酸化至pH呈3，过板框后，加乙醇作为极性溶剂进行抽提浓缩，得米卡芬净母核FR179642浓缩液。
步骤(4)、将浓缩液使用装填有SP207的大孔树脂吸附柱进行吸附。吸附流速控制0.5～1.5BV/H，吸附完成后水洗，用浓度为60wt％的乙醇作为极性溶剂进行解析，解析流速1～2BV/H，合并有效组分，得到米卡芬净母核FR179642解析液。
步骤(5)、将米卡芬净母核FR179642解析液结晶，干燥，得到呈粉状的米卡芬净母核FR179642。结晶方式为50℃浓缩结晶。干燥方式为真空干燥，，干燥温度50℃，真空度为0.5MPa。
本实施例所制得的米卡芬净母核FR179642经HPLC检测，归一化纯度85.7％。
实施例三：
该米卡芬净母核FR179642的制备方法，包括以下步骤。
步骤(1)、取少量的米卡芬净母核FR179642产生菌孢子悬液，接种于培养基上，于26℃下，培养48h。该种子培养基中的组分为(单位：g/L)：葡萄糖25，酵母粉10，黄豆饼粉10，磷酸氢二钾1，氯化钠0.5，硫酸镁0.5，碳酸钙0.2，余量为水。
步骤(2)、将种子培养基接种于发酵罐并添加发酵培养基，于24～28℃下培养60～70h。
当发酵罐内的菌浓达到稳定状态后添加米卡芬净前体FR901379。继续发酵50h后，补加米卡芬净前体FR901379。在这两个发酵阶段中，自初始状态到发酵罐内的菌浓达到稳定状态的第一个发酵阶段，发酵罐内的温度控制在33℃。自发酵罐内的菌浓达到稳定状态至放罐的第二个发酵阶段中，发酵罐内的温度控制在28℃。该发酵培养基中的组分为(单位：g/L)：葡萄糖10，酵母粉80，黄豆饼粉8，磷酸氢二钾2，氯化钠2，硫酸镁0.3，碳酸钙0.3，余量为水。在本实施例中，在第二个发酵阶段中，发酵罐内的米卡芬净前体FR901379的稳定在700μg/mL。
步骤(3)、发酵完成后进行放罐提取。提取发酵液时，先向发酵罐中添加浓度为5wt％的稀盐酸，以使发酵罐内发酵液的体系酸化至pH呈3.5，板框过滤，然后向发酵罐中添加浓度为60wt％的甲醇作为极性溶剂进行抽提浓缩，得米卡芬净母核FR179642解析液。
步骤(4)、将米卡芬净母核FR179642解析液使用装填有D1300大孔树脂吸附柱进行吸附，用浓度为60wt％的甲醇作为极性溶剂进行解析，解析流速1～2BV/H，合并有效组分，浓缩得到米卡芬净母核FR179642解析液。
步骤(5)、将米卡芬净母核FR179642解析液结晶，过滤，干燥，得到呈粉末状的米卡芬净母核FR179642。结晶方式为溶剂沉降结晶，并具体为：向米卡芬净母核FR179642解析液中加入15～20倍体积的环己烷。在本实施例中，干燥方式为真空干燥，干燥温度40℃，真空度为0.2MPa。
本实施例所制得的米卡芬净母核FR179642经HPLC检测，归一化纯度86.1％。
实施例四：
该米卡芬净母核FR179642的制备方法，包括以下步骤。
步骤(1)、取少量的FR179642产生菌孢子悬液，接种于培养基上，于26℃下，培养44h。该种子培养基中的组分为(单位：g/L)：葡萄糖20，酵母粉15，黄豆饼粉5，磷酸氢二钾0.5，氯化钠0.1，硫酸镁0.1，碳酸钙0.1，余量为水。
步骤(2)、将种子培养基接种于发酵罐内并添加发酵培养基，于24～28℃下培养60～70h。
当发酵罐内的菌浓达到稳定状态后添加米卡芬净前体FR901379，继续发酵55h后，补加米卡芬净前体FR901379。在这两个发酵阶段中，自初始状态至发酵罐内的菌浓达到稳定状态的一个发酵阶段，发酵罐内的温度控制在32℃。自发酵罐内的菌浓达到稳定状态至放罐的第二个发酵阶段中，发酵罐内的稳定控制在29℃。该发酵培养基组分中的组分为(单位：g/L)：葡萄糖5，酵母粉70，黄豆饼粉6，磷酸氢二钾1，氯化钠1，硫酸镁0.2，碳酸钙0.1，余量为水。在本实例中，在第二个发酵阶段中，发酵罐内的米卡芬净前体FR901379的浓度稳定在800μg/mL左右。
步骤(3)、发酵完成进行放罐后提取。提取发酵液时，先向发酵罐中添加浓度为5wt％的稀磷酸，以使发酵罐内发酵液的体系酸化至pH呈3，过板框后，加乙醇作为极性溶剂抽提浓缩，得到米卡芬净母核FR179642浓缩液。
步骤(4)、将米卡芬净母核FR179642浓缩液使用装填有D1300的大孔树脂吸附柱进行吸附。吸附流速控制0.5～1.5BV/H，吸附完成后水洗，用浓度为60wt％的乙醇作为极性溶剂进行解析，解析流速1～2BV/H，合并有效组分，得到米卡芬净母核FR179642解析液。
步骤(5)、将米卡芬净母核FR179642解析液结晶，干燥，得到呈粉末状的米卡芬净母核FR179642。结晶方式为溶剂沉降结晶，并具体为：向米卡芬净母核FR179642解析液中加入15～20倍体积的正己烷。结晶后过滤并干燥。具体的，干燥方式为真空干燥，干燥温度40℃，真空度为0.3MPa。
本实施例所制得的米卡芬净母核FR179642经HPLC检测，归一化纯度85.7％。
实施例五：
该米卡芬净母核FR179642的制备方法，包括以下步骤。
步骤(1)、取少量的FR179642产生菌孢子悬液，接种于培养基上，于26℃下，培养40h。该种子培养基中的组分为(单位：g/L)：葡萄糖35，酵母粉15，黄豆饼粉15，磷酸氢二钾1.5，氯化钠1.0，硫酸镁1.0，碳酸钙0.5，余量为水。
步骤(2)、将种子培养基接种于发酵罐内并添加发酵培养基，于24～28℃下培养60～70h。
当发酵罐内的菌浓达到稳定状态后添加米卡芬净前体FR901379，继续发酵60h后，补加米卡芬净前体FR901379。在这两个发酵阶段中，自初始状态至发酵罐内的菌浓达到稳定状态的一个发酵阶段，发酵罐内的温度控制在34℃。自发酵罐内的菌浓达到稳定状态至放罐的第二个发酵阶段中，发酵罐内的稳定控制在30℃。该发酵培养基组分中的组分为(单位：g/L)：葡萄糖15，酵母粉90，黄豆饼粉10，磷酸氢二钾5，氯化钠5，硫酸镁0.4，碳酸钙0.5，余量为水。在本实例中，在第二个发酵阶段中，发酵罐内的米卡芬净前体FR901379的浓度稳定在2000μg/mL左右。
步骤(3)、发酵完成进行放罐后提取；提取发酵液时，先向发酵罐中添加浓度为5wt％的稀盐酸，以使发酵罐内发酵液的体系酸化至pH呈3，过板框后，加甲醇作为极性溶剂抽提浓缩，得米卡芬净母核FR179642浓缩液。
步骤(4)、得到的米卡芬净母核FR179642浓缩液使用装填有D1300的大孔树脂吸附柱进行吸附。吸附流速控制0.5～1.5BV/H，吸附完成后水洗，用浓度为60wt％的甲醇进行解析，解析流速1～2BV/H，合并有效组分，得米卡芬净母核FR179642解析液。
步骤(5)、将米卡芬净母核FR179642解析液结晶，干燥，得到呈粉末状的米卡芬净母核FR179642。结晶方式为溶剂沉降结晶，并具体为：向米卡芬净母核FR179642解析液中加入15～20倍体积的石油醚。结晶后过滤并干燥。具体的，干燥方式为真空干燥，干燥温度40℃，真空度为0.4MPa。
本实施例所制得的米卡芬净母核FR179642经HPLC检测，归一化纯度86.3％。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (10)
1.米卡芬净母核FR179642的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)、取少量米卡芬净母核FR179642产生菌孢子悬液，接种于种子培养基上，于24～28℃下，培养40～50h；
步骤(2)、将种子培养基接种于发酵罐内并添加发酵培养基，当发酵罐内的菌浓达到稳定状态后添加米卡芬净前体FR901379，继续发酵40～60h后补加米卡芬净前体FR901379，所述步骤(2)中采用双阶段温控，发酵完成进行放罐以提取发酵液；
步骤(3)、向发酵液中添加酸使发酵液的pH呈3～4，板框过滤，然后添加极性溶剂进行抽提浓缩，得浓缩液；
步骤(4)、将浓缩液经大孔树脂吸附，使用极性溶剂解析，得到米卡芬净母核FR179642解析液；
步骤(5)、将米卡芬净母核FR179642解析液经结晶，干燥，得呈粉末状的米卡芬净母核FR179642。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的种子培养基的组分为：葡萄糖20～35g/L，酵母粉5～15g/L，黄豆饼粉5～15g/L，磷酸氢二钾0.5～1.5g/L，氯化钠0.1～1.0g/L，硫酸镁0.1～1.0g/L，碳酸钙0.1～0.5g/L，余量为水。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的发酵培养基的组分为：葡萄糖5～15g/L，酵母粉70～90g/L，黄豆饼粉6～10g/L，磷酸氢二钾1～5g/L，氯化钠1～5g/L，硫酸镁0.2～0.4g/L，碳酸钙0.1～0.5g/L，余量为水。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，发酵罐中的米卡芬净前体FR901379的浓度稳定在500～2000μg/mL之间。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，自初始状态到发酵罐内的菌浓达到稳定状态的发酵阶段中，发酵罐内的温度控制在30～34℃；发酵罐内的菌浓达到稳定状态至放罐阶段中，发酵罐内的温度控制在26～30℃。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中的酸选自浓度为5～10wt％的稀硫酸、5～10wt％的稀硫酸或者5～10wt％的稀磷酸。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中的极性溶剂选自C1～C4的醇；所述步骤(4)中的大孔树脂选自HP20大孔树脂、D1300大孔树脂或者SP207大孔树脂。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中的结晶方式为溶剂沉降结晶或者浓缩结晶。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂沉降结晶所使用的溶剂选自石油醚、正己烷或者环己烷。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中的干燥方式为真空干燥，真空干燥的干燥温度为40～50℃，真空度为0.1～0.5MPa。
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