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CN112111482A - 高通量诱变筛选高产他克莫司筑波链霉菌的方法及菌株 - Google Patents

高通量诱变筛选高产他克莫司筑波链霉菌的方法及菌株 Download PDF

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CN112111482A
CN112111482A CN202010894220.9A CN202010894220A CN112111482A CN 112111482 A CN112111482 A CN 112111482A CN 202010894220 A CN202010894220 A CN 202010894220A CN 112111482 A CN112111482 A CN 112111482A
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吴晖
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徐金勇
范萍
金美英
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Zhejiang University of Technology ZJUT
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Zhejiang University of Technology ZJUT
Hangzhou Zhongmei Huadong Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

本发明涉及一种高通量诱变筛选高产他克莫司筑波链霉菌的方法，以及筛选到的诱变株及其在微生物发酵制备他克莫司中的应用。本发明筛选获得的一株高产他克莫司筑波链霉菌菌株——筑波链霉菌ZJBH1901(Streptomyces tsukubensis ZJBH1901)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2020年5月14日，保藏编号CCTCC NO：M 2020120，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。本发明的有益效果主要体现在：(1)通过抑菌圈法高通量筛选产他克莫司菌种，能够快速直观地反映菌种产他克莫司的能力，提高了诱变育种的筛选效率；(2)采用紫外‑ARTP复合诱变方法获得的筑波链霉菌ZJBH1901，相对原始菌株S1，他克莫司产量提高了200％，能够作为基因工程菌的原始菌株；(3)通过本发明方法可以得到发酵周期明显缩短的菌株，对于工业生产有着巨大的意义。

Description

高通量诱变筛选高产他克莫司筑波链霉菌的方法及菌株
(一)技术领域
本发明涉及一种高通量诱变筛选高产他克莫司筑波链霉菌的方法，以 及筛选到的一株诱变株及应用。
(二)背景技术
他克莫司(Tacrolimus，FK506)是一种23元大环内酯类抗生素，临 床上主要作为治疗器官移植后排斥反应的免疫抑制剂使用。1984年，日 本藤泽公司研究所从日本筑波山土壤中分离出的筑波链霉菌 (Streptomyces tsukubensis)发酵液中首次提取得到了他克莫司。
研究表明他克莫司与细胞内细胞溶质受体(主要是FKBP12-)相互 作用时，钙调神经磷酸酶的钙调蛋白依赖性丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性受 到抑制。在这种情况下，钙调神经磷酸酶不再能使转录因子(例如NFAT) 去磷酸化，而去磷酸化的转录因子是控制T细胞增殖所必需的。因此， 他克莫司具有高效的免疫抑制活性(其免疫机制示意图参见图1)。
在发现他克莫司之前，临床上常用环孢素A(CsA)作为免疫抑制剂 来治疗器官移植后的排斥反应。CsA也是一种CaN抑制剂，免疫抑制机 制与他克莫司类似，但他克莫司的作用效果是CsA的100倍左右。同时 他克莫司可预防各种因器官移植引起的排斥反应，且不良反应较环孢素A 少。1993年，他克莫司胶囊在日本首次批准上市，商品名是“普乐可复”。随后其经FDA获准后，相继在多个国家上市使用。他克莫司上市以来已 广泛用于肝、肾和骨髓移植的急慢性排斥治疗，已成为临床上肝、肾移植 后治疗排斥反应的一线药物。
当前全世界范围内由于肝病、肾病等原因需要移植器官的患者数量逐 年增加。中国每年需要器官移植的患者人数大概约有30万人。广阔的市 场前景使研究他克莫司提产具有巨大的医学意义和经济价值。他克莫司的 化学结构复杂，目前多采用微生物发酵法生产，因此筛选优秀的他克莫司 高产菌株是重要的一个前提工作。传统育种是提高菌株次级代谢产物产量 的切实有效的方法。传统育种分为物理诱变、化学诱变、复合诱变及其他 一些方法。通过诱变育种会得到大量经诱变的菌株，若一一通过发酵检测 其产量费时费力。因此传统育种方法需要一种高效便捷快速的高通量筛选 方法来初步筛选，以提高诱变育种的效率。
抑菌圈法又称扩散法，是利用待测药物在琼脂平板中扩散使其周围的 敏感菌生长受到抑制而形成透明圈，即抑菌圈。随后根据抑菌圈大小判定 待测药物抑菌效价的一种方法。抑菌圈法操作便捷、简单易行、成本低廉、 结果准确可靠，被广泛用于抗生素等代谢产物菌种筛选的初筛，工具菌一 般采用抗生素的敏感菌。若被检菌能分泌某些抑制工具菌生长的物质，如 抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈，很容易被鉴别出来，为高通量筛选提供了基础。
(三)发明内容
本发明目的本发明目的是一种高通量诱变筛选高产他克莫司筑波链 霉菌的方法，以及筛选到的高产他克莫司诱变株及应用。
本发明采用的技术方案是：
高通量诱变筛选高产他克莫司筑波链霉菌的方法，所述方法包括：
(1)采用GYM培养基对待测筑波链霉菌进行接种培养，培养完成后 洗脱得到孢子悬液；
(2)将孢子悬液稀释，取稀释后的孢子悬液进行紫外-ARTP复合诱 变，培养后或得突变株；
(3)采用GYM培养基培养突变株，保藏；
(4)将步骤(3)获得的突变单菌落转接至含有酿酒酵母的GYM培养 基进行抑菌检测，选取抑菌圈大于对照组(现有技术中已知产他 克莫司的菌株)的突变菌株为高产他克莫司筑波链霉菌。
具体的，步骤(4)中将抑菌圈大于对照组的突变菌株进行发酵，测 定他克莫司的产量，产量达100mg/L以上的，筛选为高产他克莫司筑波 链霉菌。
步骤(4)所获得的高产他克莫司筑波链霉菌，可重新作为初始菌株 重复步骤(1)～(4)进行下一轮筛选。
具体的，所述方法如下：
(1)将待测筑波链霉菌接种至GYM平板26～30℃培养5～7天，取颜 色为红色或白色的孢子洗脱至生理盐水中，将洗下的孢子悬液过滤、离心 后去除上清液，加入生理盐水重悬后，离心、重新洗脱一次，用生理盐水 重悬作为孢子悬液；
(2)孢子悬液稀释至浓度为107～108个/mL，取稀释后的孢子悬液置于 紫外灯管下20～30cm处照射1～2min后，接种于GYM培养基中，26～30℃ 避光培养24～32h，收集诱变后菌体，使用ARTP诱变仪处理，处理方式 如下：取菌体悬液5μL与等体积10％甘油混合于金属载片上并展开均匀， 在10℃、10L/min工作气流量条件下使用ARTP诱变仪处理60s，之后将整个金属载片投入到装有990μL生理盐水的1.5mL EP管中，充分振荡， 每个上述EP管中取100μL液体涂布于GYM固体培养基上，26～30℃避 光培养直至获得突变株；
(3)突变株涂布于GYM固体培养基上，26～30℃培养4～7天至能观测 到单菌落，将单菌落用无菌牙签棒戳刺，并且在新的GYM固体培养基， 按照顺序重新划单菌落用于培养，保藏；
(4)将酿酒酵母作为敏感菌株，接种于YPD液体培养基，26～30℃、 200rpm培养18～24小时后，涂布于GYM固体培养基；将步骤(3)筑波 链霉菌单菌落打孔分离整个培养基琼脂块，菌落朝下倒置于已涂布毕赤酵 母的固体培养基上，26～30℃培养18～24小时后，观测抑菌圈大小，挑选 抑菌圈大于对照的菌株进行摇瓶发酵，通过HPLC精确测定他克莫司产量，筛选摇瓶发酵他克莫司产量达100mg/L以上的，即为高产他克莫司 筑波链霉菌。
本发明利用抑菌圈方法，将酿酒酵母作为敏感菌株，在GYM琼脂平 板上进行初步筛选。挑选抑菌圈大于对照的菌株进行发酵并检测其他克莫 司产量，无需一一通过发酵检测诱变后每一个单菌落的他克莫司产量，从 而大大缩短了筛选时间并提高了筛选效率。
本发明还涉及一株筛选获得的高产他克莫司筑波链霉菌菌株——筑 波链霉菌ZJBH1901(Streptomyces tsukubensis ZJBH1901)，保藏于中国 典型培养物保藏中心，保藏日期2020年5月14日，保藏编号CCTCC NO： M 2020120，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。
本发明还涉及所述筑波链霉菌在微生物发酵制备他克莫司中的应用。
具体的，本发明还涉及一种利用筑波链霉菌微生物发酵制备他克莫司 的方法，所述方法包括：将所述筑波链霉菌ZJBH1901(Streptomyces tsukubensis ZJBH1901)接种至发酵培养基，28℃、220rpm发酵培养，获 得含他克莫司的发酵液，将发酵液经分离纯化，得到所述他克莫司；所述 发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖5～15g/L，淀粉20～30g/L，糊精30～40 g/L，酵母粉5～7g/L，蛋白胨4～5g/L，K2HPO4 1～2g/L，(NH4)2SO4 1～2g/L， MgSO41～2g/L，CaCO3 5～10g/L，溶剂为蒸馏水，pH 7.0。
优选的发酵培养基组成如下：所述发酵培养基组成为：葡萄糖10g/L， 淀粉24g/L，糊精35g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨4g/L，K2HPO4 1.5g/L， (NH4)2SO4 1g/L，MgSO4 1g/L，CaCO35g/L，溶剂为蒸馏水，pH 7.0。
所述产他克莫司的筑波链霉菌在发酵培养前通常需先进行种子培养 获得种子液，再将种子液以体积浓度5～10％的接种量接种至发酵培养基 进行发酵培养，所述种子培养基组成如下：甘油20～30g/L，淀粉5～15g/L， 酵母粉5～15g/L，CaCO3 1～2g/L，MgSO40.01～0.1g/L，NaCl 0.01～0.1g/L， K2HPO4 0.01～0.1g/L，FeSO4 0.0005～0.002g/L，溶剂为蒸馏水，pH 7.0。
优选的种子培养基组成如下：甘油25g/L，淀粉10g/L，酵母粉10g/L， CaCO3 1g/L，MgSO4 0.05g/L，NaCl 0.05g/L，K2HPO4 0.05g/L，FeSO4 0.001 g/L，溶剂为蒸馏水，pH 7.0
具体的，所述种子培养过程可如下：将产他克莫司的筑波链霉菌接种 至GYM平板，28℃培养7天，取颜色为白色或红色的孢子，使用棉花棒 将表面孢子洗脱至生理盐水中，将洗下的孢子悬液用八层纱布过滤，12000 rpm离心5min后弃上清液，沉淀加入生理盐水重悬后，12000rpm离心 5min重新洗脱一次，用生理盐水重悬作为孢子悬液；将孢子悬液接种至种子培养基中，28℃，220rpm培养48h，获得种子液；所述GYM平板 终浓度组成为：葡萄糖4g/L，酵母粉4g/L，麦芽提取物10g/L，碳酸钙 2g/L，琼脂18g/L，溶剂为水，pH 7.2；所述种子液培养基终浓度组成为： 甘油25g/L，淀粉10g/L，酵母粉10g/L，CaCO3 1g/L，MgSO4 0.05g/L，NaCl 0.05g/L，K2HPO4 0.05g/L，FeSO4 0.001g/L，溶剂为水，pH 7.0。
本发明的有益效果主要体现在：(1)通过抑菌圈法高通量筛选产他 克莫司菌种，能够快速直观地反映菌种产他克莫司的能力，提高了诱变育 种的筛选效率；(2)采用紫外-ARTP复合诱变方法获得的筑波链霉菌 ZJBH1901，相对原始菌株S1，他克莫司产量提高了200％，能够作为基 因工程菌的原始菌株；(3)通过本发明方法可以得到发酵周期明显缩短的菌株，对于工业生产有着巨大的意义。
(四)附图说明
图1为他克莫司免疫抑制机制示意图。
图2为本发明实施例1中他克莫司抑菌圈。
图3为他克莫司结构式；
图4为本发明实施例4他克莫司标准曲线；
图5为本发明实施例5紫外诱变致死率曲线；
图6为本发明实施例6ARTP诱变致死率曲线；
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此：
实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。
实施例1：高通量筛选方法构建
(1)将诱变后的孢子及对照菌株筑波链霉菌S1(实验室保藏)，于 GYM固体培养基上进行涂布或划线，于28℃培养7天，至可观测到单 菌落。利用无菌牙签或枪头，戳刺单菌落并于一块新的GYM固体培养基 平板进行划线。编号后于28℃培养4～7天用于保藏。进行保藏处理后的 平板用于抑菌圈实验。
(2)以酿酒酵母(实验室保藏)作为敏感菌株，于YPD固体培养基 上挑取单菌落，于YPD液体培养基培养20小时，取100μL涂布于GYM 固体培养基上。于(1)中已进行保藏处理的平板上，利用无菌打孔器或 枪头，挑取含单菌落的琼脂块，倒置于已涂布酵母的GYM固体培养基上， 编号。将处理好的平板，于28℃培养24小时。根据对照菌株，观察测 量抑菌圈直径大小，如图2。
实施例2：高产FK506的诱变菌株
(1)将筑波链霉菌(Streptomyces tsukubensis)S1(实验室保藏)接 种至GYM固体平板28℃培养7天，取颜色白色或红色的孢子，使用棉 花棒将表面孢子洗脱至10mL生理盐水中，将洗下的孢子悬液用八层纱 布过滤，过滤后的孢子12000rpm离心5min后去上清液，加入10mL生 理盐水重悬后，12000rpm离心5min重新洗脱一次，用5mL生理盐水 重悬作为孢子悬液。
(2)UV-ARTP诱变方法：取10mL稀释后的孢子悬液(稀释到孢 子浓度为107个/mL)置于紫外灯管(15W，254nm)下20cm处照射90s 后，接种于GYM培养基中，28℃避光培养26h，收集诱变后菌体，使 用ARTP仪处理，处理方式：每1mL菌体悬液取5μL与等体积10％甘油 混合于金属载片上展开均匀，在10℃、10L/min通气量条件下使用ARTP 诱变仪处理60s。处理结束后将整个金属载片投入到装有990μL生理盐水 的1.5mL EP管中，充分振荡。每个上述EP管中取100μL液体涂布于 GMY固体培养基上，28℃避光培养直至获得突变株。每次实验均采用3 组平行。对于每轮诱变所获得的高产菌株，重新作为初始菌株按相同步骤 进行下一轮筛选。突变次数、突变率和致死率如表1所示。
表1：紫外-ARTP复合诱变过程
Figure BDA0002657929660000061
对于每轮诱变获得的高产菌株，重新作为初始菌株按照上述方法进行 复合诱变。最终筛选获得摇瓶发酵他克莫司产量达150mg/L的突变株 H18，命名为筑波链霉菌(Streptomyces tsukubensis)ZJBH1901，保藏于 中国典型培养物保藏中心，保藏日期2020年5月14日，保藏编号CCTCC NO：M 2020120，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。
本发明不仅限于上述诱变方式。
其中YPD液体培养基的配制：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖 20g/L，溶剂为蒸馏水，115℃灭菌20min。
GYM固体培养基的配制：葡萄糖4g/L，酵母粉4g/L，麦芽提取物 10g/L，碳酸钙2g/L，琼脂18g/L，溶剂为蒸馏水，pH7.2，115℃灭菌 30min。
GYM液体培养基的配制：葡萄糖4g/L，酵母粉4g/L，麦芽提取物 10g/L，溶剂为蒸馏水，pH7.2，115℃灭菌30min。
实施例3：摇瓶发酵产他克莫司
(1)种子液的制备：将实施例2制备的高产他克莫司的筑波链霉菌 诱变菌(即CCTCC NO：M 2020120)划线至GYM平板，28℃培养4 天，挑选单菌落，接种至种子培养基中，28℃，220rpm培养48h，获得 种子液。
种子培养基按以下方法配制：甘油25g/L，淀粉10g/L，酵母粉10g/L， CaCO3 1g/L，MgSO4 0.05g/L，NaCl 0.05g/L，K2HPO4 0.05g/L，FeSO4 0.001 g/L，加水定容至1L，pH 7.0，115℃灭菌30min。
(2)发酵培养
500mL规格摇瓶装样80mL发酵培养基，发酵时按体积浓度10％接 种种子液，28℃，220rpm发酵培养144小时，发酵液中他克莫司产量可 达150mg/L。
发酵培养基组成：葡萄糖10g/L，淀粉24g/L，糊精35g/L，酵母粉 5g/L，蛋白胨4g/L，K2HPO4 1.5g/L，(NH4)2SO4 1g/L，MgSO4 1g/L， CaCO3 5g/L，溶剂为蒸馏水，pH 7.0，115℃灭菌30min。
实施例4：他克莫司的HPLC检测方法
取实施例3方法制备的发酵液，按发酵液：甲醇为1：1的体积比混 合，离心管平放至摇床中，28℃水浴210rpm离心振荡5h。振荡后的离心 管中取2mL于50℃水浴150min，每隔30min振荡一次。5000rpm离心 10min，取上清用0.22μm有机滤膜过膜后通过高效液相色谱(HPLC) 检测。
检测方法：色谱柱为C18柱(250×4.6mm，5μm)，柱温60℃，流 速0.9mL/min，进样量10μL，色谱保留时间22.5min，检测波长为210nm。 他克莫司的出峰时间为19.4min。
其中流动相配制方法：
乙腈：用0.45μm孔径的有机膜进行抽滤，再经过超声脱气20～30分 钟即可。
0.1％磷酸水溶液：取超纯水480mL，再加入磷酸480μL，然后用 0.45μm的微孔水膜进行抽滤，再经过超声脱气20～30分钟即可。
甲醇：用0.45μm孔径的有机膜进行抽滤，再经过超声脱气20～30分 钟即可。
最终流动相的配比为乙腈：0.1％磷酸水溶液：甲醇＝65：30：5。
他克莫司产量计算方法：从aladdin公司购买他克莫司的标准品，用 无水甲醇配制不同浓度(0mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L) 的他克莫司标准溶液，分别将上述标准液用HPLC检测出峰面积，根据 峰面积和他克莫司标准溶液的浓度计算出标准曲线为Y＝0.09512X +0.33036，R2＝0.9999(其中Y为他克莫司的浓度，X为峰面积)。将未 知浓度的他克莫司样品通过HPLC检测可以得到一个峰面积，带入上述 标准曲线公式得出浓度，标准曲线结果如图4所示。
实施例5：紫外最佳诱变时间的确定
紫外诱变时间的不同会影响正突变率的高低，故需确定一个最优的诱 变时间。
将实施例2中紫外照射时间分别改为30s、60s、90s、120s，其他 紫外诱变条件与实施例2相同。将诱变后的菌液取100μL涂布到GYM 固体平板上，于28℃培养4天，统计平板上的单菌落个数，分别计算不 同诱变时间的致死率，如图5所示。一般80％致死率左右的诱变条件下 正突变率最高，故选择紫外诱变时间为90s。
实施例6：ARTP最佳诱变时间的确定
ARTP诱变时间的不同会影响正突变率的高低，故需确定一个最优的 诱变时间。
将实施例2中ARTP仪处理时间分别改为15s、30s、45s、60s、75 s、90s、105s、120s，其他ARTP诱变条件与实施例2相同。将诱变后 的菌液取100μL涂布到GYM固体平板上，于28℃培养4天，统计平板 上的单菌落个数，分别计算不同诱变时间的致死率，如图6所示。一般80％致死率左右的诱变条件下正突变率最高，故选择ARTP诱变时间为 60s。

Claims (10)

1.高通量诱变筛选高产他克莫司筑波链霉菌的方法，所述方法包括：
(1)采用GYM培养基对待测筑波链霉菌进行接种培养，培养完成后洗脱得到孢子悬液；
(2)将孢子悬液稀释，取稀释后的孢子悬液进行紫外-ARTP复合诱变，培养后或得突变株；
(3)采用GYM培养基培养突变株，保藏；
(4)将步骤(3)获得的突变单菌落转接至含有酿酒酵母的GYM培养基进行抑菌检测，选取抑菌圈大于对照组的突变菌株为高产他克莫司筑波链霉菌。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)中将抑菌圈大于对照组的突变菌株进行发酵，测定他克莫司的产量，产量达100mg/L以上的，筛选为高产他克莫司筑波链霉菌。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)所获得的高产他克莫司筑波链霉菌，重新作为初始菌株重复步骤(1)～(4)进行下一轮筛选。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下：
(1)将待测筑波链霉菌接种至GYM平板26～30℃培养5～7天，取颜色为红色或白色的孢子洗脱至生理盐水中，将洗下的孢子悬液过滤、离心后去除上清液，加入生理盐水重悬后，离心、重新洗脱一次，用生理盐水重悬作为孢子悬液；
(2)孢子悬液稀释至浓度为107～108个/mL，取稀释后的孢子悬液置于紫外灯管下20～30cm处照射1～2min后，接种于GYM培养基中，26～30℃避光培养24～32h，收集诱变后菌体，使用ARTP诱变仪处理，处理方式如下：取菌体悬液5μL与等体积10％甘油混合于金属载片上并展开均匀，在10℃、10L/min工作气流量条件下使用ARTP诱变仪处理60s，之后将整个金属载片投入到装有990μL生理盐水的1.5mL EP管中，充分振荡，每个上述EP管中取100μL液体涂布于GYM固体培养基上，26～30℃避光培养直至获得突变株；
(3)突变株涂布于GYM固体培养基上，26～30℃培养4～7天至能观测到单菌落，将单菌落用无菌牙签棒戳刺，并且在新的GYM固体培养基，按照顺序重新划单菌落用于培养，保藏；
(4)将酿酒酵母作为敏感菌株，接种于YPD液体培养基，26～30℃、200rpm培养18～24小时后，涂布于GYM固体培养基；将步骤(3)筑波链霉菌单菌落打孔分离整个培养基琼脂块，菌落朝下倒置于已涂布毕赤酵母的固体培养基上，26～30℃培养18～24小时后，观测抑菌圈大小，挑选抑菌圈大于对照的菌株进行摇瓶发酵，通过HPLC精确测定他克莫司产量，筛选摇瓶发酵他克莫司产量达100mg/L以上的，即为高产他克莫司筑波链霉菌。
5.一株高产他克莫司筑波链霉菌菌株——筑波链霉菌ZJBH1901(Streptomycestsukubensis ZJBH1901)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2020年5月14日，保藏编号CCTCC NO：M 2020120，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。
6.如权利要求3所述筑波链霉菌ZJBH1901(Streptomyces tsukubensis ZJBH1901)在微生物发酵制备他克莫司中的应用。
7.一种利用筑波链霉菌微生物发酵制备他克莫司的方法，所述方法包括：将所述筑波链霉菌ZJBH1901(Streptomyces tsukubensis ZJBH1901)接种至发酵培养基，28℃、220rpm发酵培养，获得含他克莫司的发酵液，将发酵液经分离纯化，得到所述他克莫司；所述发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖5～15g/L，淀粉20～30g/L，糊精30～40g/L，酵母粉5～7g/L，蛋白胨4～5g/L，K2HPO4 1～2g/L，(NH4)2SO4 1～2g/L，MgSO4 1～2g/L，CaCO3 5～10g/L，溶剂为蒸馏水，pH 7.0。
8.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述发酵培养基组成为：葡萄糖10g/L，淀粉24g/L，糊精35g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨4g/L，K2HPO41.5g/L，(NH4)2SO4 1g/L，MgSO4 1g/L，CaCO3 5g/L，溶剂为蒸馏水，pH 7.0。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述筑波链霉菌ZJBH1901(Streptomycestsukubensis ZJBH1901)先接种至种子培养基，培养获得种子液再接种至发酵培养基进行发酵培养，所述种子培养基组成如下：甘油20～30g/L，淀粉5～15g/L，酵母粉5～15g/L，CaCO3 1～2g/L，MgSO4 0.01～0.1g/L，NaCl 0.01～0.1g/L，K2HPO4 0.01～0.1g/L，FeSO40.0005～0.002g/L，溶剂为蒸馏水，pH 7.0。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于所述种子培养基组成如下：甘油25g/L，淀粉10g/L，酵母粉10g/L，CaCO3 1g/L，MgSO4 0.05g/L，NaCl 0.05g/L，K2HPO4 0.05g/L，FeSO40.001g/L，溶剂为蒸馏水，pH 7.0。
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