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CN112795609B - 高效制备环缩肽的方法、环缩肽及应用 - Google Patents

高效制备环缩肽的方法、环缩肽及应用 Download PDF

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CN112795609B
CN112795609B CN202110087292.7A CN202110087292A CN112795609B CN 112795609 B CN112795609 B CN 112795609B CN 202110087292 A CN202110087292 A CN 202110087292A CN 112795609 B CN112795609 B CN 112795609B
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Abstract

本申请涉及药用化合物制备领域，尤其涉及一种高效制备环缩肽的方法、环缩肽及应用。该方法包括：将蝙蝠粪生真菌Amphichorda guana LC5815接种于培养基中发酵，得到发酵培养物；从所述发酵培养物中，分离得到环缩肽化合物。

Description

高效制备环缩肽的方法、环缩肽及应用
技术领域
本申请涉及药用化合物制备领域，尤其涉及一种高效制备环缩肽的方法、环缩肽及应用。
背景技术
真菌杀虫剂是利用真菌作为生物防治手段，控制自然界中有害昆虫的生物活性制剂。目前主要的真菌杀虫剂有球孢白僵菌、绿僵菌、淡紫拟青霉菌等。虽然真菌杀虫剂杀虫谱广，并具有能在靶标害虫间传播等优点，但长期以来真菌杀虫剂产业发展缓慢，除产业政策，施放理念，工业生产等问题外，高产的菌株也至关重要。
已有许多文献报道，环缩肽isariins化合物具有杀虫活性，如对恶性疟原虫(Plasmodium falciparum),大蜡螟幼虫(Galleria mellonella larvae),象虫属(Sitophilus spp.)均具有杀虫活性。环缩肽isaridins化合物具有抗细菌，抗植物病原真菌，抑制炎症因子等作用。到目前为止，已发现isariins及isaridins环缩肽20余种，主要分离于棒束孢属Isaria cretacea和I.felina及海洋真菌Beauveria felina。
目前，环缩肽的产率较低，提高环缩肽的产率，对生物防治具有重要意义。
发明内容
本申请提供了一种高效制备环缩肽的方法、环缩肽及应用，可以高效制备活性环缩肽。
第一方面，本申请提供了一种制备环缩肽化合物的方法，包括：将蝙蝠粪生真菌Amphichorda guana LC5815接种于培养基中发酵，得到发酵培养物；从所述发酵培养物中，分离得到环缩肽化合物。
在一个实施例中，所述培养基由每1kg大米混合1.5L水得到。
在一个实施例中，所述将蝙蝠粪生真菌Amphichorda guana LC5815接种于培养基中发酵，包括：
将蝙蝠粪生真菌Amphichorda guana LC5815接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，25-28℃培养5-7天，以得到活化菌株；
用0.1％(w/v)Tween-80收取所述活化菌株的孢子，得到种子液；
将所述种子液接种到所述培养基，25-28℃培养25-35天，以进行发酵。
在一个实施例中，所述环缩肽化合物包括结构式如式(1)-(8)所示的环缩肽中的一种或多种；
Figure GDA0003082999260000021
。
在一个实施例中，所述环缩肽化合物的结构式如式(5)所示；
Figure GDA0003082999260000022
所述从所述发酵培养物中，分离得到环缩肽化合物，包括：
向所述发酵培养物中，加入乙酸乙酯，进行浸泡，得到浸提液；
将所述浸提液在真空下蒸发干燥，得到粗提物；
将所述粗提物用200-300目硅胶柱进行层析分离，用丙酮进行洗脱，并将得到流分在真空下蒸发干燥，得到干物质；
使用小孔树脂纯化所述干物质；其中，使用甲醇水溶液进行洗脱，得到第一洗脱产物；在所述甲醇水溶液中，甲醇和水的体积比为7：3；
使用高效液相色谱柱分离纯化第一洗脱产物；其中，使用乙腈水溶液进行梯度洗脱，并收集保留时间为26.7min的色谱峰，得到式(5)所示环缩肽；在所述乙腈水溶液中，乙腈和水的体积比为85：15。
在一个实施例中，所述环缩肽化合物的结构式如式(1)所示；
Figure GDA0003082999260000031
所述从所述发酵培养物中，分离得到环缩肽化合物，包括：
向所述发酵培养物中，加入乙酸乙酯，进行浸泡，得到浸提液；
将所述浸提液在真空下蒸发干燥，得到粗提物；
将所述粗提物用200-300目硅胶柱进行层析分离，用丙酮进行洗脱，并将得到流分在真空下蒸发干燥，得到干物质；
使用小孔树脂纯化所述干物质；其中，使用甲醇水溶液进行洗脱，得到第一洗脱产物；在所述甲醇水溶液中，甲醇和水的体积比为9：1；
使用高效液相色谱柱分离纯化所述第一洗脱产物；其中，使用乙腈水溶液进行梯度洗脱，并收集保留时间为17.5min的色谱峰，得到式(1)所示环缩肽；在所述乙腈水溶液中，乙腈和水的体积比为85：15。
第二方面，本申请提供了一种环缩肽、其药物学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，所述环缩肽的结构式如式(1)所示：
Figure GDA0003082999260000041
在一个实施例中，所述环缩肽是以蝙蝠粪生真菌Amphichorda guana LC5815为发酵菌进行发酵得到；所述发酵的发酵培养基由每1kg的大米混合1.5L水得到。
第三方面，本申请提供了第二方面所述的环缩肽在制备真菌杀菌剂或细菌杀菌剂中的用途。
第四方面，本申请提供了蝙蝠粪生真菌Amphichorda guana LC5815在生产环缩肽化合物中应用。
本申请实施例采用蝙蝠粪生真菌Amphichorda guana LC5815为发酵菌株，大米培养基为发酵培养基，进行发酵，可以生产多种环缩肽，特别是环缩肽iso-isariin B的产率超过14％；并且可以生产具有真菌和细菌抑制能力的新的环缩肽isaridin H。
说明书附图
图1为本申请中蝙蝠粪生真菌Amphichorda guana LC5815固体发酵培养物的液质联用色谱检测结果；
图2为本申请利用蝙蝠粪生真菌Amphichorda guana LC5815生产的活性环缩肽成分高效液相色谱分析结果；
图3为本申请中制备的环缩肽isariin A的高效液相色谱-串联质谱联用分析结果；
图4为本申请中制备的环缩肽iso-isariin B的高效液相色谱-串联质谱联用分析结果；
图5为不同培养基中蝙蝠粪生真菌Amphichorda guana LC5815的次级代谢产物的分析结果；
图6出示了本申请制备的环缩肽化合物的抗真菌能力；
图7出示了本申请制备的环缩肽化合物的抗细菌能力。
具体实施方式
下面在具体实施例中，对本说明书提供的方案进行举例描述。
生长在特殊环境中的真菌往往具有特殊的生理和代谢特征，如内生真菌、海洋真菌和粪生真菌。一些报道表明，内生真菌能够生物合成重要的药用“植物化学物质”，并且从海洋真菌中也发现了许多新的具有生物活性的天然产物。如，来自内生真菌Taxomycesandreanae的紫杉醇和来自海洋真菌Beauveria felina的破坏素destruxin，它们在制药和农用化学品中发挥了重要作用。鉴于短命动物粪便中固有的微生物竞争，粪生真菌是丰富天然产物的来源。近年来，粪生真菌因广泛存在和研究方便而受到越来越多的关注。Amphichorda guana LC5815是生长在蝙蝠粪便上的真菌，目前Amphichorda属仅有Amphichorda felina与Amphichorda guana两个物种，已有研究报道从Amphichordafelina中分离到了活性环缩肽免疫抑制剂环孢菌素，而我们首次研究了这个稀有真菌Amphichorda guana LC5815的化学成分，并从中挖掘到8个活性环缩肽化合物，包括一个新环缩肽和一个产量超过14％的具强杀虫活性的环缩肽iso-isariin B。因此这种活性环缩肽化合物高产菌株的发现，势必对农业及医药领域有着极其重要的作用。
本申请实施例提供了一种活性环缩肽高产菌株，其为蝙蝠粪生真菌Amphichordaguana LC5815。该菌株分离自中国贵州绥阳，宽阔水国家自然保护区，无名洞穴。该菌株的营养菌丝透明，有隔，光滑，直径1.5-3.5μm，有时膨大至7.0μm。联丝体产生于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato Dextrose Agar(Medium)，PDA)平板上菌落中心，高度可达15mm，宽1-3mm，白色，圆柱形，被绒毛，顶端偶有分枝。分生孢子梗侧生于菌丝，直或略弯曲。产孢细胞多着生于分生孢子梗，偶尔轮生于菌丝，梭形或椭圆形，直或不规则弯曲，7-10x 2-3μm。分生孢子外生芽殖型，单生或簇生，透明，光滑，宽椭球形到近球形，单细胞。
蝙蝠粪生真菌Amphichorda guana LC5815已于2016年1月29日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC3.17908。
在下文中，蝙蝠粪生真菌Amphichorda guana LC5815可以简称为蝙蝠粪生真菌A.guana，或，蝙蝠粪生真菌，或，A.guana。
本申请实施例利用蝙蝠粪生真菌Amphichorda guana LC5815进行发酵获得了结构式依次如式(1)-式(8)所示的8个环缩肽。
Figure GDA0003082999260000061
具体而言，式(1)所示的化合物称为isaridin H，式(2)所示的化合物称为desmethylisaridin E，式(3)所示的化合物称为isaridin E，式(4)所示的化合物称为isariin A，式(5)所示的化合物称为iso-isariin B，式(6)所示的化合物称为iso-isariinD，式(7)所示的化合物称为isariin E，式(8)所示的化合物称为nodupetide。
接下来，对环缩肽的生产过程以及特性进行介绍。
实施例1，液相色谱质谱联用(LC-MS)初步分析蝙蝠粪生真菌Amphichorda guanaLC5815固体发酵物
将蝙蝠粪生真菌A.guana接种到葡萄糖琼脂培养基(PDA)上进行菌种活化，培养条件是28℃,5至7天。用0.1％(w/v)Tween-80收取所述活化菌株的孢子，接种适量种子液进行固体发酵，所述固体发酵采用的培养基由20g大米和30mL水组成，所述固体发酵的培养条件为28℃，避光静置培养7天。为方便描述，可以将每20g大米混合30mL水组成的培养基称为大米培养基。以上实验3个重复。用乙酸乙酯萃取发酵物(具体而言，每1kg发酵培养基用7.5L乙酸乙酯分三次萃取。发酵培养结束后，直接加入乙酸乙酯。在实验中采用250mL的三角瓶，每瓶20g大米，用50mL乙酸乙酯萃取，重复3次，共需150mL乙酸乙酯)，超声处理1个小时后，用玻璃漏斗过滤，收集滤液，用旋转真空浓缩仪进行干燥，用1.5mL甲醇溶解干燥物，取1mL于HPLC液相分析瓶，进行LC-MS液质分析。以乙腈和水的混合液为流动相，进行洗脱，具体分析方法如表1所示。其中，表1所示的为乙腈和水的体积比。
表1
时间(分钟) 乙腈％ 水％
5.0 95.0
5.00 5.0 95.0
35.00 100.0 0.0
40.00 100.0 0.0
40.10 5.0 95.0
45.00 5.0 95.0
LC-MS分析结果图如图1所示。结果表明本申请实施例所用菌株Amphichordaguana LC5815可以产生丰富的大分子量次级代谢产物。采用高效液相色谱-串联质谱联用仪(high performance liquid chromatography-electrospray tandem massspectrometry，LC-MS-MS)对发酵培养产物分析，进一步证实了m/z 637.4[M+H]+和m/z596.4[M+H]+处有氨基酸的连续裂解。其中，通过氨基酸离子碎片指认，m/z 637.4[M+H]+为环缩肽isariin A的离子峰(图3所示)，m/z 596.4[M+H]+为环缩肽iso-isariinB的离子峰(图4所示)。
本申请的发明人进行了以PDA培养基为发酵培养基，使用Amphichorda guanaLC5815进行发酵，以及马铃薯葡萄糖肉汤(Potato Dextrose Broth，PDB)培养基为发酵培养基，使用Amphichorda guana LC5815进行发酵。发酵条件如上所述。
发酵结束后，进行高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)分析以PDA培养基、PDB培养基、大米培养基为发酵培养基的发酵产物，结果如图5所示。其中，LC5815-PDB-7d表示以PDB培养基为发酵培养基的发酵产物的分析结果，LC5815-PDB-7d表示以PDA培养基为发酵培养基的发酵产物的分析结果，LC5815-Rice-7d表示以大米培养基为发酵培养基的发酵产物的分析结果。如图5所示，以PDA培养基、PDB培养基为发酵培养基的发酵产物中没有检测到图1所示的大分子次级代谢产物。由此，证实了大米培养基是产生图1所示的大分子次级代谢产物的适用培养基。
实施例2，活性环缩肽成分分离和纯化
经实施例1的LC-MS初步分析A.guana LC5815的大米发酵产物，已表明其可产生丰富的大分子量化合物。将该菌培养在20kg大米培养基(20kg大米和30L水混合得到)中进行大规模发酵，28℃避光静置培养30天，得到大米发酵培养物。向所述大米发酵培养物中加入乙酸乙酯提取3次，每次浸泡过夜，得到浸提液。具体而言，按照每1kg大米用7.5L乙酸乙酯的比例，进行萃取，培养结束后，直接加入乙酸乙酯。在具体实验时，因为用的250mL的三角瓶，每瓶20g大米，每瓶用50mL乙酸乙酯萃取，重复3次，共需150mL乙酸乙酯。
将得到的浸提液在真空下蒸发干燥，得到约60g粗提物。
将得到的粗提物用200-300目硅胶柱进行层析分离，用二氯甲烷，乙酸乙酯，丙酮，甲醇4种不同极性的洗脱剂分别进行洗脱，得到4种流分。将得到的4种流分在真空下蒸发干燥，分别得到8g干物质A，21g干物质B，15g干物质C，10.2g干物质D。将丙酮流分中得到的干物质C经小孔树脂(MCI)进一步纯化,以甲醇和水混合液为洗脱剂，按照溶剂中甲醇和水的体积比依次是5：5、7：3、9：1、10：0的洗脱梯度进行洗脱，收集4个洗脱梯度的洗脱产物。
将上述70％甲醇及90％甲醇洗脱产物经制备HPLC柱分离纯化，以乙腈-水(体积比为85：15)为洗脱液，流速2mL/min,进行梯度洗脱。经85％乙腈进一步分离，从上述70％甲醇的洗脱产物中分离到5个环缩肽化合物。收集保留时间为11.9min的色谱峰，旋转蒸发后得到25mg环缩肽iso-isariin D；收集保留时间为13.1min的色谱峰，旋转蒸发后得到10mg环缩肽desmethylisaridin E；收集保留时间为17.5min的色谱峰，旋转蒸发后得到30mg环缩肽isariin E；收集保留时间为20.1min的色谱峰，，旋转蒸发后得到35mg环缩肽nodupetide；收集保留时间为26.7min的色谱峰，经甲醇中结晶得到8.5g环缩肽iso-isariin B。从上述90％甲醇的洗脱产物中分离到3个环缩肽化合物，其中包括一个出峰时间为17.5min的新环缩肽isaridin H 25mg；一个出峰时间为19.2min的环缩肽isaridin E10mg；一个出峰时间为25.6min的环缩肽isariin A。
特别是，从60g的粗提物中，可分离得到8.5g环缩肽iso-isariin B。也就是说，采用本申请实施例提供的方案，环缩肽iso-isariin B的产率超过14％，实现了环缩肽iso-isariin B的高效制备。
实施例3，验证实施例2制备的环缩肽的生物活性
3.1，验证抗植物病原真菌活性
用含10mL PDA培养基的90mm培养皿测定其抗真菌活性，以如下3种植物病原真菌Alternaria solani,Botrytis cinerea，Fusarium oxysporum为指示菌，用PDA培养基培养植物病原真菌，当其直径生长约2cm后，将相同大小(直径0.625cm)的无菌空白滤纸片放置在距离菌丝菌落边缘1cm处。分布用二甲基亚砜(DMSO)溶解实施例2制备的isaridin H、desmethylisaridin E、isaridin E，各自得到终浓度为1mg/mL的样品，分别取10uL加至滤纸片上。其中，图6中纸片1加isaridin H，纸片2加desmethylisaridin E，纸片3加isaridinE。将培养皿放置于28℃，避光培养，3天后测量菌丝直径，按下述计算公式计算菌丝抑制率。计算结果如表2所示。
Figure GDA0003082999260000101
表2.Isaridin H(1)的抗真菌活性
Figure GDA0003082999260000102
表2和图6展示的结果表明，实施例2制备的新环缩肽化合物isaridin H(1)对Alternaria solani和Botrytis cinerea有明显抑制能力。
3.2，采用滤纸片扩散法验证抗细菌活性
3.2.1，采用滤纸片
用直径90mm含溶菌肉汤Luria-Bertani(LB)固体培养基的平板活化测试细菌(枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)，37℃过夜培养，取活化好的测试细菌单菌落接种于含5mL LB液体培养基的试管中，37℃，200rpm，摇床过夜培养。分别往20mL温度为55℃的LB培养基中加入10μL测试细菌悬浮液(1010cfu mL-1),混合均匀后，将含有细菌的培养基倒入直径90mm的培养皿中。4个无菌滤纸片(直径0.625cm)放在含上述混合物的培养皿上，用移液枪分别向滤纸片添加10μL浓度为1mg mL-1的从该菌中分离到的isaridins环缩肽(isaridin H(图7中纸片1),desmethylisaridin E(图7中纸片2),isaridin E(图7中纸片3))，以10uL二甲基亚砜作为阴性对照(图7中“-”指示的纸片)，10uL浓度为1mg mL-1的氨苄霉素作为阳性对照(图7中“+”指示的纸片)，37℃过夜培养，记录抑菌圈大小。每个实验3个重复，结果表明，新环缩肽化合物isaridin H对枯草芽孢杆菌有抗细菌活性(图7)。
3.2.2，MIC值测定——倍比稀释法
用96孔板进行最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)测试，采用倍比稀释法，以枯草芽孢杆菌为指示菌株，以氨苄霉素为阳性对照,二甲基亚砜作为阴性对照。将用于测试的环缩肽化合物isaridn H配成下列浓度的母液10.24mg mL-1，5.12mgmL-1，2.56mg mL-1，1.28mg mL-1，0.64mg mL-1，0.32mg mL-1，0.16mg mL-1，0.08mg mL-1，各取5uL于含95uL LB液体培养基的96孔板中。于37℃培养，分别在培养12h和24h时用酶标仪检测吸光值。每个实验3个重复，数据如表3所示。
表3.环缩肽isaridin H的抗细菌作用
Figure GDA0003082999260000121
结果表明，当isaridin H的浓度≥8μg/mL时，对枯草芽孢杆菌有抑菌作用。
本申请实施例采用蝙蝠粪生真菌Amphichorda guana LC5815为发酵菌株，大米培养基为发酵培养基，进行发酵，可以生产多种环缩肽，特别是环缩肽iso-isariin B的产率超过14％；并且可以生产具有真菌和细菌抑制能力的新的环缩肽isaridin H。
以上所述的具体实施方式，对本申请的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本申请的具体实施方式而已，并不用于限定本申请的保护范围，凡在本申请的技术方案的基础之上，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本申请的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种制备环缩肽iso-isariin B的方法，包括：
接种适量的蝙蝠粪便寄生真菌Amphichorda guana LC5815种子液进行固体发酵，所述固体发酵采用的培养基由20kg大米和30L水组成，所述固体发酵的培养条件为28℃，避光静置培养30天，得到大米发酵培养物；
向所述大米发酵培养物中加入乙酸乙酯提取3次，每次浸泡过夜，得到浸提液；
将得到的浸提液在真空下蒸发干燥，得到粗提物；
将得到的粗提物用200-300目硅胶柱进行层析分离，用丙酮进行洗脱，得到干物质C；
使用小孔树脂(MCI)，以70％甲醇为洗脱剂，对干物质C进行进一步分离纯化；
将70％甲醇的洗脱产物，经制备HPLC柱分离纯化，以乙腈-水为洗脱液，流速2mL/min，进行梯度洗脱；其中，乙腈-水中乙腈和水的体积比为85∶15；
收集保留时间为26.7min的色谱峰，经甲醇中结晶得到环缩肽iso-isariin B；所述环缩肽iso-isariin B的结构式如式(5)所示，
Figure FDA0003587832670000021
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Establishment of a Genetic Transformation System in Guanophilic Fungus Amphichorda guana;Min Liang等;《J Fungi (Basel)》;20210228;第7卷(第2期);全文 *
吴洪波.2株真菌中新颖代谢产物的发现.《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（硕士）基础科学辑（月刊）》.2019,(第11期),第2.1节、第2.2节和图2-2、第2.1.1-2.1.3节、第17页及其参考文献67、. *

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