CN112679343B - 一种利用香榧籽油制备高纯度金松酸乙酯的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用香榧籽油制备高纯度金松酸乙酯的方法。本发明涉及一种结合银离子络合耦合高速逆流色谱富集香榧籽油金松酸的方法。首先利用在高速逆流色谱中不同脂肪酸在两相中分配系数的不同实现初步分离，再结合银离子对于双键的络合能力不同进一步提高分离效率，一步除去饱和脂肪酸与单不饱和脂肪酸，实现金松酸的富集。本发明通过选择适宜的溶剂体系，优化银盐种类、银离子/不饱和双键摩尔比，实现了香榧金松酸与饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸高效分离。该富集方法具有设备简单、高效、金松酸回收率高、方法易于放大至工业化生产等优点，尤其适合从低浓度金松酸原料出发富集，一步实现高浓度金松酸高回收率制备。
Description
技术领域
本发明涉及一种高效逆流色谱耦合银离子络合技术利用香榧籽油制备高纯度金松酸乙酯的方法。
背景技术
香榧(Torreya grandis)是一种常绿针叶乔木，为裸子植物门、松杉纲、红豆杉科。榧树主要分布于中国江苏、福建、安徽、江西、湖南、浙江和贵州，以浙江最多。其种仁含丰富的营养成分，如脂肪、蛋白质、矿物元素、维生素等。香榧籽油中不饱和脂肪酸含量高达79％，且其中含有特殊的Δ5多不饱和脂肪酸——金松酸。金松酸具有抗辐射、抗炎、预防心脑血管疾病等多种保健功能。因此，对制备高纯度金松酸的需求在食用价值与科研价值上正在逐年上升。
目前，多不饱和脂肪酸富集、纯化主要有尿素包合法、分子蒸馏法、柱色谱法、超临界流体萃取法等。分子蒸馏法难于将碳原子数及沸点相近的脂肪酸分开；超临界流体萃取法对设备的要求苛刻，操作成本高，且仅适合分离饱和与不饱和脂肪酸；银离子色谱柱法和尿素包合法是当前分离多不饱和脂肪酸的最有效方法，但均存在载荷量低，操作繁琐、耗时，产品回收率低的缺陷。我们的结果：尿素包合法结合银离子，香榧油脂肪酸乙酯首先采用尿素包合法将金松酸的纯度从7％提升到50％，回收率为46％；在此基础上进一步利用银离子色谱将金松酸纯度提高到99％，回收率为40％。经过两步富集，虽然金松酸的纯度可达到99％，但金松酸总回收率为18.4％。
高速逆流色谱(High-speed Counter-current Chromatograph,HSCCC)是一种新型液液分配色谱技术。它是建立在一种特殊的流体动力学平衡的基础上，利用螺旋管的高速行星式运动产生一种不对称离心力，使互不相溶的两相溶剂不断混合，同时保留其中的一相(固定相)，利用恒流泵连续输入另一相(流动相)，此时在螺旋柱中任何一部分，两相溶剂反复进行着无限次的分配过程。与传统液-固色谱相比，其流动相、固定相都是液体，不需要固体支撑或载体而避免对样品的不可逆吸附；其次，它的分离效率高，分离时间短，一般一次分离只需几个小时；此外，它还具有操作便捷、液－液分配体系选择广泛、分离量大及重现性好等优点，易形成连续化和自动化。国内外应用HSCCC分离天然植物中活性物质的研究已有很多。如专利CN201310011888.4公开了一种利用高速逆流色谱法制备DHA的方法。在正庚烷:乙腈:乙酸:甲醇＝4:5:1:1的体系下，从DHA含量为50％的裂壶藻脂肪酸皂化液中提取得到纯度为99.54％的DHA。在此制备过程中起始物料DHA含量高，且其中结构类似的干扰脂肪酸EPA含量仅为0.42％，其它脂肪酸含量低，所以通过逆流色谱可以较易得到高纯度的DHA。专利CN110590545A公开了一种完全分离油酸和亚油酸的方法。在正己烷:乙腈:水＝6:6:2体系中，将70％-80％的高纯度油酸制备得到纯度高于99％的油酸。在分离原料中油酸含量较高、与亚油酸之间含量差别较大，且油酸与亚油酸之间不存在阻碍逆流色谱法分离的等效链长原则，较易实现分离。Hammann通过三步逆流色谱分离得到纯度为99％的金松酸，但其回收率仅为10％。尽管如此，本实验室经过一年多的重复试验依然无法重复出其分离效果，金松酸与亚油酸因“相同的有效碳数”而共洗脱的问题依然是瓶颈。在前期的实验中，研究发现银离子柱层析因柱效高可以很好的分离饱和度不同的脂肪酸，但其处理量小，回收率低，且对低起始浓度的目标脂肪酸分离效果不佳。而逆流色谱处理量大、回收率高，为了克服金松酸与亚油酸共洗脱的问题，本发明提出了逆流色谱耦合银离子络合技术，实现高纯度金松酸的高效分离。
发明内容
为了克服现有技术存在的上述缺陷，本发明提出一种高速逆流色谱耦合银离子络合技术分离富集香榧籽油中金松酸的方法，实现高纯度金松酸的高效分离。本发明着眼于一步实现香榧籽油中金松酸的富集，结合了逆流色谱效率高、分离速度快，同时结合了银离子对于双键的高选择性，实现高回收率的制备，具有产品回收率大，工艺简单、省时、经济、高效等诸多优点。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种利用香榧籽油制备高纯度金松酸乙酯的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)香榧籽油(即香榧油)与乙醇钠的无水乙醇溶液发生酯交换反应，制备含金松酸乙酯的脂肪酸乙酯样品；
(2)流动相和固定相的预平衡：固定相为乙腈或乙腈与二氯甲烷的混合溶液；所述流动相为正己烷；将所述流动相和固定相混溶于分液漏斗中，摇匀后静置一夜分层，分离，即得预平衡后的固定相和预平衡后的流动相；
(3)步骤(2)中所述预平衡后的固定相溶解银离子盐后，充满高速逆流色谱仪，设定恒温循环器的温度为15～25℃，开启高速逆流色谱仪主机，调节主机转速1000r/min，取步骤(2)所述方法制得的预平衡后的流动相A以1ml/min的流速泵入分离柱，至固定相-流动相体系达到动态平衡；所述银离子盐的质量为预平衡后的固定相质量的0.125～1％；所述银离子盐为硝酸银、三氟乙酸银、辛酸银或硬脂酸银中的一种或多种；
(4)将步骤(1)中含金松酸乙酯的脂肪酸乙酯样品溶于步骤(2)所述方法制得的预平衡后的流动相B中，由进样阀进样，根据紫外检测器或薄层色谱监测结果，收集含金松酸乙酯的流出组分；所述含金松酸乙酯的脂肪酸乙酯样品的质量以步骤(3)中预平衡后的固定相的体积计为0.2mg～2mg/mL。预平衡后的流动相B的体积足够溶解含金松酸乙酯的脂肪酸乙酯样品即可。
上述内容中的预平衡后的流动相A、预平衡后的流动相B都是步骤(2)中得到的预平衡后的流动相，无特殊含义，之所以用字母区分开，只是为了方便描述。
进一步，步骤(1)中所述含金松酸乙酯的脂肪酸乙酯样品的制备过程为：香榧籽油与乙醇钠的无水乙醇溶液在55℃下搅拌反应2小时，反应结束后，正己烷萃取，静置分相，取上相清液用蒸馏水洗涤并蒸干，即得所述含金松酸乙酯的脂肪酸乙酯样品；香榧籽油、乙醇钠与无水乙醇的质量比为1:0.016:0.25。
优选地，恒温循环器的温度为15℃。温度过高有机相压力大，因此在低温效果更好，但温度过低会导致溶剂黏度大，不利于上样。
进一步，步骤(2)中固定相为体积比为2:3的乙腈与二氯甲烷的混合溶液；
优选地，步骤(2)中所述固定相为乙腈。
优选地，步骤(4)中所述预平衡后的流动相B的体积以所述含金松酸乙酯的脂肪酸乙酯样品的质量计为2～10ml/g，更优选10mL/g。
优选地，所述含金松酸乙酯的脂肪酸乙酯样品的质量以步骤(3)中预平衡后的固定相的体积计为0.4mg/mL。
优选地，步骤(3)中所述银离子盐为硝酸银。
进一步优选地，步骤(3)中所述银离子盐的质量为预平衡后的固定相质量的0.25％。
进一步，步骤(3)中所述预平衡后的固定相在溶解银离子盐后，经过超声脱气再泵入高速逆流色谱仪。
通过上述方法得到高纯度金松酸乙酯后，通过常规酸解反应即可得到金松酸。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
(1)利用香榧籽油为原料，富集纯化金松酸。浙江香榧资源丰富，金松酸的富集纯化可以促进香榧产业的深度加工和综合利用，提高香榧的附加值。
(2)本发明的高速逆流色谱技术具有高效、大制备量，溶剂可回收再利用等优点。
(3)本发明条件下，一步去除香榧油中饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸以及部分多不饱和脂肪酸对金松酸的干扰，且金松酸纯度20-85％，回收率为50-95％。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
仪器：高速逆流色谱仪为上海同田生物技术股份有限公司生产的TBE-300B型号高速逆色谱仪
下述实施例中所用脂肪酸乙酯样品按如下方法制备：将香榧油(10g)，乙醇(2.5g)和乙醇钠(0.16g)的混合物在55℃搅拌2小时。反应结束后添加正己烷萃取静置分相，将上相清液用蒸馏水洗涤并蒸干，获得包含金松酸乙酯的混合脂肪酸乙酯样品，作为逆流色谱分离金松酸实验的初始原料，气相色谱检测所得原料中金松酸乙酯的浓度为7.76％。
前期实验数据，采用化学乙酯化结合尿素包合实现金松酸乙酯纯度从9.95％提高到64.17％。而酶法预富集结合尿素包合法金松酸乙酯纯度达80.14％；在此基础上，银离子络合色谱可进一步将金松酸乙酯纯度提升至99％，然而三步纯化的金松酸乙酯总收率不足20％。
文献：Meng,Xianghe；Xiao,Dan；Ye,Qin；等.Positional distribution of Delta5-olefinic acids in triacylglycerols from Torreya grandis seed oil:Isolationand purification of sciadonic acid.INDUSTRIAL CROPS AND PRODUCTS,2020,143,111917.
混合脂肪酸乙酯及分离后各组份中金松酸乙酯的纯度为其中金松酸乙酯的质量占总脂肪酸质量的百分比计。
金松酸乙酯的回收率为该组分中金松酸乙酯的质量占逆流色谱上样量中金松酸乙酯的质量的百分比。该组分金松酸的纯度乘以该组分中脂肪酸乙酯的质量(通过蒸干溶剂称重获得)即为该组分中金松酸乙酯的质量。
实施例1
将正己烷-二氯甲烷-乙腈(5:3:2,v/v)，共1000ml混溶于分液漏斗中，摇匀后静置一夜分层。分离上下相，上相为流动相(正己烷)，下相为固定相(二氯甲烷-乙腈)，在超声脱气后，先将相应的固定相泵入分离柱，设定恒温循环器的温度为15℃，然后开启高速逆流色谱仪主机，调节主机转速1000r/min，流动相以1ml/min流速泵入分离柱，至整个固定相-流动相体系建立动态平衡。
将200mg脂肪酸乙酯样品溶解于2ml流动相，由进样阀进样，开始洗脱。每5min收集1管流出组分，然后根据紫外检测器或者薄层色谱监测流出组分，收集含脂类的组分，进行气相色谱(GC)分析该组分脂肪酸乙酯组成，最高组份中金松酸乙酯纯度为10.27％(其中亚油酸乙酯纯度为88.12％)，脱去溶剂后混合脂肪酸乙酯质量为28.1mg，金松酸乙酯回收率为18.57％。
实施例2
将正己烷-乙腈(1:1,v/v)，共1000ml混溶于分液漏斗中，摇匀后静置一夜分层。分离上下相，上相正己烷为流动相，下相乙腈为固定相，在超声脱气后，先将相应的固定相泵入分离柱，设定恒温循环器的温度为15℃，然后开启高速逆流色谱仪主机，调节主机转速1000r/min，流动相以1ml/min流速泵入分离柱，至整个固定相-流动相体系建立动态平衡。
将200mg脂肪酸乙酯样品溶解于2ml流动相，由进样阀进样，开始洗脱。每5min收集1管流出组分，然后根据紫外检测器或者薄层色谱监测流出组分，收集含脂类的组分，进行气相色谱(GC)分析该组分脂肪酸乙酯组成，最高组份中金松酸乙酯纯度为23.73％(其中亚油酸乙酯含量为74.83％)，脱去溶剂后混合脂肪酸乙酯质量为32.7mg，金松酸乙酯回收率为50％。
实施例3
以正己烷-乙腈(1:1,v/v)为分离溶剂体系，共1000mL，混溶于分液漏斗中，摇匀后静置一夜分层。分相，上相正己烷为流动相，下相乙腈固定相中加入0.49g的硝酸银。在超声脱气后，先将相应的固定相泵入分离柱，设定恒温循环器的温度为15℃，然后开启高速逆流色谱仪主机，调节主机转速1000r/min，流动相以1ml/min流速泵入分离柱，至整个固定相-流动相体系建立动态平衡。
将200mg脂肪酸乙酯样品溶解于2ml流动相，由进样阀进样，开始洗脱。每5min收集1管流出组分，然后根据紫外检测器或者薄层色谱监测流出组分，收集含脂类的组分，进行气相色谱(GC)分析该组分脂肪酸乙酯组成，最高组份中金松酸乙酯纯度为17.83％(其中亚油酸乙酯纯度为82.17％)，脱去溶剂后混合脂肪酸乙酯质量为60.9mg,金松酸乙酯总回收率为70％。
实施例4
以正己烷-乙腈(1:1,v/v)为分离溶剂体系，除在下相(固定相)乙腈中加入3.93g的硝酸银(不饱和双键/银离子摩尔比为9.6:1)。其他操作同实施例3,紫外检测器及薄层色谱监测结果，GC分析不同组分的脂肪酸组成。最高组份中金松酸乙酯纯度17.42％(其中亚油酸乙酯纯度为82.58％)，脱去溶剂后混合脂肪酸乙酯质量为75.7mg,金松酸乙酯总回收率为85％。
实施例5
以正己烷-乙腈(1:1,v/v)为分离溶剂体系，除在下相(固定相)乙腈中加入0.98g的硝酸银(不饱和双键/银离子摩尔比为2.4:1)。其他操作同实施例3,紫外检测器及薄层色谱监测结果，GC分析不同组分的脂肪酸组成。最高组份中金松酸乙酯纯度18.26％(其中亚油酸乙酯纯度为82.58％)，脱去溶剂后混合脂肪酸乙酯质量为80.7mg,金松酸乙酯总回收率为95％。
实施例6
以正己烷-乙腈(1:1,v/v)为分离溶剂体系，除在下相(固定相)乙腈中加入0.98g的三氟乙酸银。其他操作同实施例3,紫外检测器及薄层色谱监测结果，GC分析不同组分的脂肪酸组成。最高组份中金松酸乙酯纯度18.77％(其中亚油酸乙酯纯度为77.93％)，脱去溶剂后混合脂肪酸乙酯质量为17.9mg，金松酸乙酯总回收率为89.62％。
实施例7
以正己烷-乙腈(1:1,v/v)为分离溶剂体系，除在下相(固定相)乙腈中加入1.08g的三氟乙酸银。其他操作同实施例3,紫外检测器及薄层色谱监测结果，GC分析不同组分的脂肪酸组成。最高组份中金松酸乙酯纯度28.77％(其中亚油酸乙酯纯度为69.93％)，脱去溶剂后混合脂肪酸乙酯质量为19.9mg，金松酸乙酯总回收率为89.62％。
实施例8
以正己烷-乙腈(1:1,v/v)为分离溶剂体系，除在下相(固定相)乙腈中加入1.2g的辛酸银。其他操作同实施例3,紫外检测器及薄层色谱监测结果，GC分析不同组分的脂肪酸组成。最高组份中金松酸乙酯纯度86.78％(其中亚油酸乙酯纯度为12.57％)，脱去溶剂后混合脂肪酸乙酯质量为144.4mg，金松酸乙酯总回收率为85.52％。
实施例9
以正己烷-乙腈(1:1,v/v)为分离溶剂体系，除在下相(固定相)乙腈中加入1.96g的硬脂酸银。其他操作同实施例3,紫外检测器及薄层色谱监测结果，GC分析不同组分的脂肪酸组成。最高组份中金松酸乙酯纯度56.78％(其中亚油酸乙酯纯度为39.27％)，脱去溶剂后混合脂肪酸乙酯质量为35.8mg，金松酸乙酯总回收率为90.52％。
Claims (8)
1.一种利用香榧籽油制备高纯度金松酸乙酯的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
（1）香榧籽油与乙醇钠的无水乙醇溶液发生酯交换反应，制备含金松酸乙酯的脂肪酸乙酯样品；
（2）流动相和固定相的预平衡：固定相为乙腈；所述流动相为正己烷；将所述流动相和固定相混溶于分液漏斗中，摇匀后静置一夜分层，分离，即得预平衡后的固定相和预平衡后的流动相；
（3）步骤（2）中所述预平衡后的固定相溶解银离子盐后，充满高速逆流色谱仪，设定恒温循环器的温度为15～25℃，开启高速逆流色谱仪主机，调节主机转速1000 r/min，取步骤（2）所述方法制得的预平衡后的流动相A以1 ml/min 的流速泵入分离柱，至固定相-流动相体系达到动态平衡；所述银离子盐的质量为预平衡后的固定相质量的0.125～1%；所述银离子盐为辛酸银或硬脂酸银；
（4）将步骤（1）中含金松酸乙酯的脂肪酸乙酯样品溶于步骤（2）所述方法制得的预平衡后的流动相B中，由进样阀进样，根据紫外检测器或薄层色谱监测结果，收集含金松酸乙酯的流出组分；所述含金松酸乙酯的脂肪酸乙酯样品的质量以步骤（3）中预平衡后的固定相的体积计为0.2mg～2mg/mL。
2.如权利要求1所述的利用香榧籽油制备高纯度金松酸乙酯的方法，其特征在于：步骤（1）中所述含金松酸乙酯的脂肪酸乙酯样品的制备过程为：香榧籽油与乙醇钠的无水乙醇溶液在55℃下搅拌反应2小时，反应结束后，正己烷萃取，静置分相，取上相清液用蒸馏水洗涤并蒸干，即得所述含金松酸乙酯的脂肪酸乙酯样品；香榧籽油、乙醇钠与无水乙醇的质量比为1:0.016:0.25。
3.如权利要求1所述的利用香榧籽油制备高纯度金松酸乙酯的方法，其特征在于：恒温循环器的温度为15℃。
4.如权利要求1所述的利用香榧籽油制备高纯度金松酸乙酯的方法，其特征在于：步骤（4）中所述预平衡后的流动相B的体积以所述含金松酸乙酯的脂肪酸乙酯样品的质量计为2～10ml/g。
5.如权利要求1所述的利用香榧籽油制备高纯度金松酸乙酯的方法，其特征在于：所述含金松酸乙酯的脂肪酸乙酯样品的质量以步骤（3）中预平衡后的固定相的体积计为0.4mg/mL。
6.如权利要求1所述的利用香榧籽油制备高纯度金松酸乙酯的方法，其特征在于：步骤（3）中所述银离子盐为辛酸银。
7.如权利要求1所述的利用香榧籽油制备高纯度金松酸乙酯的方法，其特征在于：步骤（3）中所述银离子盐的质量为预平衡后的固定相质量的0. 25%。
8.如权利要求1所述的利用香榧籽油制备高纯度金松酸乙酯的方法，其特征在于：步骤（3）中所述预平衡后的固定相在溶解银离子盐后，经过超声脱气再泵入高速逆流色谱仪。
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