CN103288571A - 一种混合生育酚中角鲨烯的分离提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种混合生育酚中角鲨烯的分离提取方法，包括将100-200目粗孔硅胶装入层析柱，采用洗脱溶剂洗脱压实粗孔硅胶，然后将混合生育酚以一定的比例上样至层析柱，利用柱层析法分离天然维生素E中的角鲨烯。采用本发明的分离提取方法，工艺流程简单，梯度洗脱法能最大程度上提高角鲨烯纯度和回收率，用甲醇等强极性溶剂可以很好的使硅胶柱再生，溶剂用量大但回收容易且损耗小，对环境污染很小。
Description
技术领域
本发明涉及一种角鲨烯的分离提取方法，尤其涉及从天然维生素E中分离提取角鲨烯的方法。
背景技术
维生素E（Vitamin E），又名生育酚，是指具有α－生育酚生物活性的一类物质，是一种脂溶性维生素，易溶于脂肪和乙醇等有机溶剂中，不溶于水，对热、酸稳定，对碱不稳定，对氧敏感，对热不敏感，是最主要的抗氧化剂之一。生育酚对人体最重要的生理功能是促进生殖。它能促进性激素分泌，保护T淋巴细胞、保护红细胞、抗自由基氧化、抑制血小板聚集从而降低心肌梗死和脑梗塞的危险性。还对烧伤、冻伤、毛细血管出血、更年期综合症、美容、及血液循环等方面有很好的改善作用。
角鲨烯又名鲨烯、三十碳六烯、鱼肝油萜，化学名为2，6，10，15，19，23–六甲基–2，6，10，14，18，22–二十四碳六烯，是一种高度不饱和烃类化合物，具有提高体内超氧化物歧化酶(SOD)活性、增强机体免疫能力、改善性功能、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤等多种生理功能，是一种无毒性的具有防病治病作用的海洋生物活性物质。角鲨烯主要来自深海鲨鱼肝油，占脂质含量90%以上，同时还少量存在于油脂不皂化物中，尤其在橄榄油、棕榈油及其脱臭馏出物中，含量较多。植物油角鲨烯大部分随油脂脱臭时进入脱臭馏出物，在脱臭馏出物中以生育酚―角鲨烯、甾醇―角鲨烯聚集化合物形式存在，由于这些组分间性质相似，分离十分困难，目前尚无理想方法。角鲨烯因含六个双键，极不稳定，易氧化，在空气中放置会产生特殊气味，易在镍、铂等金属作用下加氢形成另一种生物活性物质―角鲨烷。角鲨烯常温下为无色油状液体，不溶于水，难溶于甲醇、乙醇和冰醋酸，易溶于乙醚、石油醚、丙酮、四氯化碳等有机溶剂。因此，角鲨烯可用有机溶剂有效提取，根据其在不同溶剂中溶解性，可采用冷冻结晶而分离。
现有的角鲨烯提取方法主要采用皂化分离法、分子蒸馏法、超临界萃取法、吸附分离法、溶剂萃取法。
皂化分离法一次性去除脂肪酸和甘油酯效果明显，使角鲨烯含量明显提高，但操作过程复杂，反应过程中需大量低级醇，且在碱性条件下进行，对目的产物破坏性大；
分子蒸馏法特别适用于实验室分离，也易于工业化，但成本较高，且原料中目的产物含量较低的，提取效果不明显，需经预处理；
超临界萃取法为直接萃取，环保性好，无污染，但原料中的组分在超临界二氧化碳中溶解度都较大，故分离效率不高，并且投资较大，操作费用较大；
吸附分离法分离效果好，产品纯度高，适用于产品的精制但分离规模小，分离成本高，有些洗脱剂易污染产品，吸附剂的再生较困难；
溶剂萃取法工艺过程和设备简单，操作费用低，但角鲨烯在天然产物中极性非常小，溶剂萃取法富集效果明显，溶剂用量大（6-10倍于原料体积），造成回收困难和环境污染。
有鉴于此，怎样克服上述分离方法中的不足，简化操作步骤、提高分离效率、提高产品含量、提高回收率，已成为一项亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术从天然维生素E中分离提取角鲨烯方法的局限性，本发明提供一种混合生育酚中角鲨烯的分离提取方法。
本发明提供一种混合生育酚中角鲨烯的分离提取方法，包括以下步骤：
1）上样：将100-200目粗孔硅胶装入层析柱，采用洗脱溶剂洗脱压实粗孔硅胶，然后将与适量洗脱溶剂混合溶解后的混合生育酚上样至层析柱，粗孔硅胶与混合生育酚的质量比为10-20:1；
2）梯度洗脱：上样完成后，先用3-5倍于层析柱体积的洗脱溶剂洗脱，然后用第一洗脱溶剂与第二洗脱溶剂的混合溶剂洗脱，其中，第一洗脱溶剂与第二洗脱溶剂的体积比为5-20：1，接着分段收集洗脱液，检测洗脱液，去除洗脱液中的有机溶剂，再经浓缩后得角鲨烯成品，鉴定成品含量，制得角鲨烯精品，并对装有粗孔硅胶的层析柱再生回收。
优选地，角鲨烯分离提取方法中混合生育酚的纯度为10%-50%；
优选地，角鲨烯分离提取方法步骤1）中，混合生育酚与洗脱溶剂的质量比为1:0.5-1；
优选地，角鲨烯分离提取方法步骤1）中，粗孔硅胶装入层析柱，以及混合生育酚上样至层析柱的方法采用湿法上柱法或干法上柱法；
优选地，角鲨烯分离提取方法的洗脱溶剂为极性溶剂，包括第一洗脱溶剂和第二洗脱溶剂，第一洗脱溶剂的极性弱于第二洗脱溶剂的极性，其中，第一洗脱溶剂为正己烷、石油醚、环己烷或正庚烷；第二洗脱溶剂为乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙醇、甲醇或丙酮；
优选地，角鲨烯分离提取方法步骤2）中的洗脱溶剂为第一洗脱溶剂；
优选地，角鲨烯分离提取方法步骤2）中的第一洗脱溶剂为正己烷或环己烷；第二洗脱溶剂为乙酸乙酯或丙酮；
优选地，角鲨烯分离提取方法步骤2）中的第一洗脱溶剂与第二洗脱溶剂的体积比为15:1；
优选地，角鲨烯分离提取方法步骤2）中对装有粗孔硅胶的层析柱再生回收的步骤还包括：采用2-3倍于层析柱体积的第二洗脱溶剂冲洗层析柱；
优选地，角鲨烯分离提取方法步骤2）中采用TLC法定性分析所述洗脱液中物质组分，采用GC法确定成品中角鲨烯含量。
本发明的有益效果在于：利用本发明的方法分离提取天然维生素E中的角鲨烯，克服了现有角鲨烯提取方法中成本高、操作步骤繁杂，分离规模小，分离成本高，对目的产物破坏性大，回收困难及污染环境等不足，简化了操作流程，提高了规模利用效率，降低了分离成本，采用粗孔硅胶作为吸附剂，并结合梯度洗脱法，能大大提高对原料的吸附及分离效果，有效解决单一溶剂无法得到纯度高的角鲨烯，且分离效率低下的情况，梯度洗脱可以最大程度提高分离效率，保证角鲨烯的纯度和回收率；
样品上柱量的控制，避免了过高的上样比造成角鲨烯在硅胶柱中的分离效果差，从而无法得到高纯度的角鲨烯且无法保障收率的问题，及过低上样比引起生产规模变小，成本升高的问题；
硅胶柱的再生采用单一溶剂洗脱的方法，简单易行，溶剂用量虽大但回收容易且损耗小，对环境污染很小；
最终产品角鲨烯含量可以达到90%-95%，回收率达到80%-90%。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明的技术内容，下面对本发明的实施方式作进一步的详细描述。
层析分离，是一种以分配平衡为机理的分配方法。体系包含两个相，一个是固定相，一个是流动相，当两相相对运动时，反复多次利用混合物所含各组分分配平衡性质差异，最后达到彼此分离目的。
洗脱溶剂采用极性溶剂，包括第一洗脱溶剂和第二洗脱溶剂，第一洗脱溶剂的极性弱于第二洗脱溶剂的极性，其中，第一洗脱溶剂为正己烷、石油醚、环己烷或正庚烷；第二洗脱溶剂为乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙醇、甲醇或丙酮。
混合生育酚中角鲨烯的分离提取方法中，首先，将100-200目粗孔硅胶装入层析柱，装柱方法可采用湿法上柱或采用干法上柱。用极性相对较弱的第一洗脱溶剂洗脱压实粗孔硅胶，然后将纯度为10%-50%的混合生育酚与洗脱溶剂混合至混合生育酚完全溶解，混合生育酚与洗脱溶剂的质量比优选1:0.5-1。接着，将混合溶解后的混合生育酚以与粗孔硅胶质量比为1：10-20的上样量上样至层析柱，上柱方法可采用湿法上柱或干法上柱。上样完成后，先用3-5倍于层析柱体积的单一第一洗脱溶剂洗脱，然后用极性较弱的第一洗脱溶剂正己烷、环己烷等与极性较强的第二洗脱溶剂乙酸乙酯、丙酮等的混合溶剂洗脱，其中，第一洗脱溶剂与第二洗脱溶剂的体积比为5-20：1，接着分段收集洗脱液，采用TLC法定性分析所述洗脱液中物质组分，将洗脱液去除有机溶剂，经旋转蒸发仪浓缩后得角鲨烯成品，采用GC法确定成品中角鲨烯含量。采用2-3倍于层析柱体积的第二洗脱溶剂冲洗层析柱，回收利用。
实施例1
取100-200目粗孔硅胶70g，加入少量正己烷，填装入层析柱，用3倍于层析柱体积的正己烷洗脱压实硅胶，将5g50%混合生育酚与正己烷按2:1（m/m）溶解上样，上样完毕后先用3倍体积正己烷洗脱，然后用3倍于层析柱体积的正己烷和乙酸乙酯的混合溶剂洗脱，正己烷与乙酸乙酯的体积比为15:1。分段收集洗脱液，经浓缩得角鲨烯产品，含量92.56%，收率87.7%，硅胶柱用2倍体积甲醇冲洗再生。
实施例2
取100-200目粗孔硅胶70g，加入少量环己烷，填装入层析柱，用3倍于层析柱体积的环己烷洗脱压实硅胶，将6.5g50%混合生育酚与环己烷按2:1（m/m）溶解，加入5g硅胶搅拌均匀后加入到硅胶柱顶端，先用3倍体积环己烷洗脱，然后用3倍于层析柱体积的环己烷和乙酸乙酯的混合溶剂洗脱，环己烷与乙酸乙酯的体积比为10:1。分段收集洗脱液，经浓缩得角鲨烯产品，含量90.28%，收率84.6%，硅胶柱用2倍体积乙酸乙酯冲洗再生。
实施例3
取100-200目粗孔硅胶100g，加入少量石油醚，填装入层析柱，用3倍于层析柱体积的石油醚洗脱压实硅胶，将7g30%混合生育酚与石油醚按2:1（m/m）溶解上样，上样完毕后先用3倍体积石油醚洗脱，然后用3倍于层析柱体积的石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂洗脱，石油醚与乙酸乙酯的体积比为12:1。分段收集洗脱液，经浓缩得角鲨烯产品，含量90.8%，收率86.6%，硅胶柱用2倍体积甲醇冲洗再生。
实施例4
取100-200目粗孔硅胶100g，加入少量正己烷，填装入层析柱，用3倍于层析柱体积的正己烷洗脱压实硅胶，将5g30%混合生育酚与正己烷按2:1（m/m）溶解，加入5g硅胶搅拌均匀后加入到硅胶柱顶端，先用3倍体积正己烷洗脱，然后用3倍于层析柱体积的正己烷和丙酮的混合溶剂洗脱，正己烷与丙酮的体积比为15:1。分段收集洗脱液，经浓缩得角鲨烯产品，含量94.77%，收率87.5%，硅胶柱用2倍体积丙酮冲洗再生。
实施例5
取100-200目粗孔硅胶100g，加入少量石油醚，填装入层析柱，用3倍于层析柱体积的石油醚洗脱压实硅胶，将7g10%混合生育酚与石油醚按2:1（m/m）溶解上样，上样完毕后先用3倍体积石油醚洗脱，然后用3倍于层析柱体积的石油醚和甲醇的混合溶剂洗脱，石油醚与甲醇的体积比为10:1。分段收集洗脱液，经浓缩得角鲨烯产品，含量91.39%，收率86.6%，硅胶柱用2倍体积甲醇冲洗再生。
采用本发明的一种混合生育酚中角鲨烯的分离提取方法，对混合生育酚中角鲨烯的分离纯化效果优于现有技术，采用的工艺流程简单，梯度洗脱法能最大程度上提高角鲨烯纯度和回收率，用甲醇等强极性溶剂可以很好的使硅胶柱再生，溶剂用量大但回收容易且损耗小，对环境污染很小。
上文中描述了本发明的具体实施方式。但是，在本领域中的普通技术人员能够理解，不偏离本发明的精神和范围的情况下，还可以对本发明的具体实施方式作各种变更和替换。这些变更和替换都落在本发明权利要求书限定的范围内。
Claims (10)
1.一种混合生育酚中角鲨烯的分离提取方法，其特征在于，所述分离提取方法采用以下步骤：
1）上样：将100-200目粗孔硅胶装入层析柱，采用洗脱溶剂洗脱压实所述粗孔硅胶，然后将与适量洗脱溶剂混合溶解后的混合生育酚上样至层析柱，所述粗孔硅胶与所述混合生育酚的质量比为10-20:1；
2）梯度洗脱：上样完成后，先用3-5倍于所述层析柱体积的洗脱溶剂洗脱，然后用第一洗脱溶剂与第二洗脱溶剂的混合溶剂洗脱，其中，所述第一洗脱溶剂与第二洗脱溶剂的体积比为5-20：1，接着分段收集洗脱液，检测所述洗脱液，去除所述洗脱液中的有机溶剂，经浓缩后得角鲨烯成品，鉴定成品含量，制得角鲨烯精品，并对装有所述粗孔硅胶的层析柱再生回收。
2.如权利要求1所述的角鲨烯的分离提取方法，其特征在于，所述混合生育酚的纯度为10%-50%。
3.如权利要求1所述的角鲨烯的分离提取方法，其特征在于，所述步骤1）中，所述混合生育酚与所述洗脱溶剂的质量比为1:0.5-1。
4.如权利要求1所述的角鲨烯的分离提取方法，其特征在于，所述步骤1）中，所述粗孔硅胶装入层析柱，以及所述混合生育酚上样至层析柱的方法采用湿法上柱法或干法上柱法。
5.如权利要求1所述的角鲨烯的分离提取方法，其特征在于，所述洗脱溶剂为极性溶剂，包括第一洗脱溶剂和第二洗脱溶剂，所述第一洗脱溶剂的极性弱于所述第二洗脱溶剂的极性，其中，所述第一洗脱溶剂为正己烷、石油醚、环己烷或正庚烷；所述第二洗脱溶剂为乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙醇、甲醇或丙酮。
6.如权利要求1或5所述的角鲨烯的分离提取方法，其特征在于，所述步骤2）中的洗脱溶剂为第一洗脱溶剂。
7.如权利要求1或5所述的角鲨烯的分离提取方法，其特征在于，所述步骤2）中的第一洗脱溶剂为正己烷或环己烷；第二洗脱溶剂为乙酸乙酯或丙酮。
8.如权利要求1所述的角鲨烯的分离提取方法，其特征在于，所述步骤2）中第一洗脱溶剂与第二洗脱溶剂的体积比为15:1。
9.如权利要求1所述的角鲨烯的分离提取方法，其特征在于，所述步骤2）中对装有所述粗孔硅胶的层析柱再生回收的步骤还包括：采用2-3倍于所述层析柱体积的第二洗脱溶剂冲洗所述层析柱。
10.如权利要求1所述的角鲨烯的分离提取方法，其特征在于，所述步骤2）中采用TLC法定性分析所述洗脱液中物质组分，采用GC法确定成品中角鲨烯含量。
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