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CN1114619C - 小鼠杂交瘤株Hepama－1分泌的肝癌鼠源单克隆抗体的制备方法 - Google Patents

小鼠杂交瘤株Hepama－1分泌的肝癌鼠源单克隆抗体的制备方法 Download PDF

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Abstract

一类无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源单抗系以无血清无蛋白培养液为培养基质，采用细胞生物反应器高密度杂交瘤细胞连续培养，分离纯化制得。其细胞密度高达106/ml，抗体浓度高达1mg/ml且抗体蛋白中的组成比为100%。可用作为制备治疗肝癌制剂的原料药。可避免用腹水生产或以含血清培养液生产肝癌单抗安全性上的隐患及单抗在药物蛋白中组成比的不恒定所带来的药效上的不稳定性。

Description

小鼠杂交瘤株Hepama-1分泌的肝癌鼠源单克隆抗体的制备方法
本发明涉及单克隆抗体领域，尤其涉及一种小鼠杂交瘤株Hepama-1分泌的肝癌鼠源单克隆抗体的制备方法。
1975年Koehler和Milstein(Nature Vol.256，p495-497)用杂交瘤技术制备了世界上第一个鼠源单克隆抗体，为生物技术打开了一个全新的领域，随着生物技术的发展，单克隆抗体技术也有了很大的发展，各种整分子的、小分子的、人源化的、鸡尾酒的、双功能的以至抗独特性的单克隆抗体均陆续问世；各种单克隆抗体有各种不同的用途，治疗药用的、诊断药用的、分析用的、纯化用的、检验用的等。1985年中科院细胞所谢弘、姚鑫等研制成功抗人肝癌单克隆抗体Hepama-1(实验生物学报，Vol.18，p263-270)，这是国际上最早报道的肝癌的鼠源单克隆抗体之一。其中，该小鼠杂交瘤株Hepama-1在专利申请号为95111623.1的专利申请中已被保藏过，其保藏号为CCTCCNO：C95013。
鼠源单克隆抗体是由杂交瘤细胞分泌的，而杂交瘤细胞的生长和存活必须要有培养液来维持(Gillis S，Henney CS，J Immunol 1981 May，126(5)：1978-1984)，而胎牛血清或新生牛血清是培养液的必须成分。
鉴于血清的成分复杂，每批血清的质量不同，如果用来作为生物药物生产时的重要原料会对药物的安全带来问题，多年来人们一直希望能建立一种以无血清无蛋白培养液为基质的细胞培养方法。1965年后，经过Matsuya，Fuve等人的研究，细胞的无血清培养终于初步成功(MatsuyaY，Tohoku J Exp Med 1965 Jun25，86(1)：84-92；Fuve RM et.al，J Bacteriol1966 Oct，92(4)：1150-1153)。并找到了无血清培养基的最关键的成分是胰岛素，转铁蛋白，乙醇胺，硒等，并于九十年代后，形成以DME/F12或RDF为基础培养基的以胰岛素，转铁蛋白，乙醇胺，硒及各种生长因子等为主要成分的多种无血清培养基系列(Ozturk SS，et al.，J Biotechnol.1990Nov；16(3-4)：259-278；Shinohara K，et al.，Agric Biol Chem.1990 Oct，54(10)：2599-2603)。但胰岛素，转铁蛋白，生长因子等依然是蛋白质，且胰岛素还是一种激素，这对分离目标蛋白依然带来一定的困难。1976年Tsitologiia等首先报告用一种以无机成分为主体的无血清无蛋白培养基培养淋巴细胞获得成功(Voitenok，Tsitologiia，1976 Mar，18(3)：356-360)，嗣后，1984年Pinchuk等用无血清无蛋白培养基培养杂交瘤细胞获得成功(Pinchuk GV et.al，Eksp Onkol 1984，6(5)：74-75)。
但这些培养基大部分只能用作实验室研究。如所周知，现代生物技术产业化时，生物产品均必须由生物反应器中获得，目前，生物反应器分为两类，一类用于大量生产细菌的表达产品，即所谓发酵罐；另一类则用于大量生产细胞的分泌产品，即所谓细胞生物反应器。从技术角度来讲，细胞生物反应器的技术难度较大，成功的报道不多，Antoine等曾用4L的细胞生物反应器生产昆虫细胞Sf-9获得成功，其细胞密度达4～15×106/ml(Antoine et.al.，Biotechnology and Bioengineering，Vol.43，p881-891，1994)。单克隆抗体也是用细胞生物反应器来生产的，1988年我国台湾学者Meng MH等首先用中空纤维灌注式生物反应器生产抗乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体获得成功(Meng MH，et al.，Chung Hua MinKuo Wei Sheng Wu Chi Mien I Hsueh Tsa Chih.1988 Aug，21(3)：125-140)。1989年美国学者Heifetz首先以无血清培养液为基质，在中空纤维灌注式生物反应器中生产抗人纤维结合素鼠源单克隆抗体获得成功(HeifetzAH et.al.，Biotechniques 1989 Feb，7(2)：192-199)，但其产品的杂蛋白占5％。1991年捷克学者Franek首先以无血清、无蛋白培养液为基质，报道了在一种实验室的生物反应器中制备的单克隆抗体成功(Franek Fet.al.，Cytotechnology 1991 Sep，7(1)：33-38)，但所有这些报导不但仅只是实验室型的，也都是断续培养型的。迄今，未检索到以无血清、无蛋白培养液为基质，在生产型细胞生物反应器中以连续培养的方式规模生产鼠源单克隆抗体的报道。
目前世界各国所生产的鼠源单抗，无论是整分子还是小分子的，如果不是用无血清、无蛋白条件培养液作为培养基质，无论采用何种生产方法，所获得的产品均含有程度不等的内源性免疫球蛋白(小鼠的或牛的)，这种含有内源性免疫球蛋白的产品不但质量难以控制并标准化，而且还蕴藏着若干不安全的因素。但是，以无血清、无蛋白条件培养液为基质，在生物反应器中通过高密度培养小鼠杂交瘤细胞以制备无内源性免疫球蛋白的鼠源单克隆抗体因技术困难未见成功的报道。
本发明的目的是提供一类无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源单克隆抗体，是在生产型细胞生物反应器中以连续培养的方式制得的产物，单克隆抗体在抗体蛋白中的组成比可达100％，可用于制备治疗肝癌的药物。
本发明的无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源单克隆抗体是指绝对不含牛内源性免疫球蛋白及小鼠内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源单克隆抗体。(图1是抗牛IgG对杂交瘤细胞Hepama-1在DXL无血清、无蛋白培养液中培养上清的检测结果(sELISA)，证明杂交瘤细胞Hepama-1培养上清中不存在牛血清IgG)。
一类无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源单抗Hepama-1，Hepama-9403，Hepama-9501等是以DXL无血清无蛋白培养液为培养基质，采用细胞生物反应器高密度连续培养杂交瘤细胞而制得的，无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源单抗的整分子单抗和由之经常规酶切法制备的构成整分子的小分子片段单抗都可用于制备治疗肝癌的药物。
无内源性免疫球蛋白肝癌鼠源单克隆抗体的生产工艺分为二步，先用DXL无血清、无蛋白培养液在生物反应器中大量生产杂交瘤细胞，再用专门的色谱方法分离、纯化肝癌单克隆抗体。全部工艺均在无菌条件下进行。
生产流程步骤(表1)：
                 表1.生产流程步骤
流程                 说明             环境清洁度
生产细胞库      取出Hepama-1细胞      100,000级
    ↓
小量扩增        CO2培养箱            100,000级
    ↓
大量生产        生物反应器            100,000级
    ↓
收集培液        培液离心              100,000级
    ↓
   浓缩         低温汽化或升华        100,000级
    ↓
分离纯化        层析
    ↓
   浓缩         真空低压低温          100,000级
    ↓
                浓度，纯度
质量控制        鼠源DNA               100,000级
                内毒素，外源因子
    ↓
过滤分转                                 100级
配制DXL无血清无蛋白培养液：
其特点是用于培养细胞的培养液中不含任何血清和蛋白；也就是说，培养液中血清和蛋白的含量均为零。DXL无血清无蛋白培养液配方：                毫克/升
腺嘌呤                                 0.1-0.5
丙氨酸                                 5-10
氯化铝                                 0.0005-0.001
偏钒酸铵                               0.0005-0.001
精氨酸                                 100-500
天冬酰胺                               10-50
天冬氨酸                               5-30
氯化钡                                 0.001-0.005
生物素                                 0.05-0.5
氯化钙                                 10-100
氯化胆碱                               10-100
硫酸铬钾                               0.0005-0.005
柠檬酸                                 10-50
瓜氨酸                                 1-10
氯化钴                                 0.001-0.005
硫酸铜                                 0.001-0.01
半胱氨酸                               10-100
双亚油酸卵磷脂                         0.1-1
双硬脂酸卵磷脂                         0.1-1
乙醇胺                                 1-10
乙二胺四乙酸盐                         5-10
聚乙二醇                               0.5-4
硫酸亚铁                               0.5-5
原子铁                                 2-5
黄素腺嘌呤二核苷酸                     0.01-0.05
叶酸                                   1-5
二氧化锗                             0.0001-0.001
谷氨酸                               10-50
谷氨酰胺                             100-500
甘氨酸                               1-10
葡萄糖                               2000-10000
组氨酸                               10-100
次黄嘌呤                             1-10
异亮氨酸                             100-500
亮氨酸                               100-500
亚油酸                               0.01-0.1
氯化锂                               5-50
赖氨酸                               50-500
氯化镁                               50-500
氯化锰                               0.00005-0.0005
甲硫氨酸                             10-50
钼酸                                 0.00005-0.0005
MOPS                                 1000-10000
肌醇                                 10-50
烟酰胺                               1-10
硝酸镍                               0.0001-0.0005
鸟氨酸                               1-10
草酰乙酸                             1-10
泛酸                                 1-5
酚红                                 1-10
苯丙氨酸                             10-100
溴化钾                               0.00005-0.0005
氯化钾                               100-500
碘化钾                                0.00005-0.0005
脯氨酸                                10-100
黄体酮                                0.001-0.01
腐胺                                  0.1-0.5
吡哆辛                                0.1-0.5
丙酮酸                                100-500
核黄素                                0.01-0.05
氯化铷                                0.000005-0.00005
丝氨酸                                10-100
氯化银                                0.000001-0.00001
氯化钠                                5000-10000
氟化钠                                0.001-0.01
硝普钠                                1-10
磷酸氢二钠                            100-1000
亚硒酸钠                              0.01-0.05
精胺                                  0.1-1
氯化亚锡                              0.00005-0.0005
牛磺酸                                10-50
硫辛酸                                0.08-0.4
硫胺素                                0.1-0.8
苏氨酸                                8-18
胸腺嘧啶                              0.2-1.5
氯化钛                                0.0005-0.004
生育素                                0.05-4
色氨酸                                1-10
吐温80                                0.05-3
酪氨酸                                25-45
缬氨酸                                  70-120
维生素B12                              2-15
硫酸锌                                  0.6-5
用上述配制好的DXL无血清无蛋白培养液培养能分泌肝癌鼠源单克隆抗体的杂交瘤细胞。图2是杂交瘤细胞Hepama-1在DXL无血清、无蛋白培养液中的计数值，表明在DXL无血清、无蛋白培养液中杂交瘤细胞的密度不低于在含血清培养液中。
从生产细胞库中取出Hepama-1杂交瘤细胞经小量扩增，取对数期前细胞(接种细胞密度为A×104/mL)，移入细胞生物反应器培养，监控工艺条件(温度：30～40℃、转速：100-500RPM、pH：6.5～7.5、PO2：0.1-2巴、PCO2：0.1-2巴、PN2：0.1-2巴、空气流量：1-5升/小时、压力：1-5巴)，待细胞生物反应器中细胞长到密度为A×106/ml左右，抗体浓度约为0.5-1mg/ml时，收集培养液，低温升华法离心浓缩，得到初级产品。
再以HPLC分离纯化初级产品，以低压低温升华法浓缩产品，同时对产品进行质量控制，最后经过无菌过滤后获得无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源单抗的整分子单抗。
必要时，可用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等按常规酶切法将无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源单抗的整分子单抗制备成无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源小分子单抗Fab或(Fab)2。先将配制好的含酶消化液与相同体积的无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源整分子单抗37℃作用，酶切反应终止后，再用pH8.0磷酸缓冲液4℃透析12-20小时，最后再以HPLC分离纯化，获得无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源小分子单抗。
本发明无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源单克隆抗体的质量鉴定如下：
本发明单抗产品系经筛选获得的抗肝癌杂交瘤细胞株在无血清无蛋白培养液中所分泌的单克隆抗体，为无菌无病毒无热原溶液，含单抗浓度为标示值的80.0-120.0％。
[性状]  无色澄明液体。
[检查]pH值6.5-7.5(中国药典1995年版二部附录VIH)。
无菌  按生物制品规程(1995年版一部)进行检验，符合规定。
细菌内毒素  取本品适量，稀释10倍后依法(中国药典1995年版二部附录XIE)检查，本品每毫升含细菌内毒素小于5Eu。
支原体检查  经直接培养法检查，符合规定。
鼠源病毒检查  按照《人用鼠源性单克隆抗体制备及质量控制要点》检查，符合规定。
培养液中的残存鼠源DNA含量经地高辛标记的小鼠基因组DNA探针斑点杂交法测定，本品残存鼠源DNA含量每剂不超过100pg。
[无牛内源性免疫球蛋白的检定]
1.经椭偏成像生物显微技术判定：以无内源性免疫球蛋白Hepama-1单抗为固相，以肝癌细胞裂解液为液相，本发明单抗产品呈阳性(见图3)。
2.经椭偏成像生物显微技术判定：以抗牛IgG为固相，本发明单抗产品呈阴性，而含牛内源性免疫球蛋白的样品呈阳性。
[无小鼠内源性免疫球蛋白的检定]
1.经椭偏成像生物显微技术判定：以无内源性免疫球蛋白Hepama-1单抗为固相，以肝癌细胞裂解液为液相，本发明单抗产品呈阳性。
2.经辣根过氧化物酶组织化学染色法判定：对人体淋巴结组织切片进行染色，以PBS染色阴性为前提，无内源性免疫球蛋白Hepama-1单抗染色为阴性(见图4)，而作为对照的小鼠IgG为阳性(见图5)。
3.经椭偏成像生物显微技术判定：以无内源性免疫球蛋白Hepama-1单抗为固相，以淋巴细胞裂解液为液相，本发明单抗产品呈阴性。
4.经免疫结合试验，饱和结合本发明单抗产品的肝癌细胞上清液中不含任何蛋白，也不会有对人肝癌细胞的任何免疫活性，而饱和结合有小鼠内源性免疫球蛋白的样品的肝癌细胞上清液中则仍含有蛋白，仍存在对人肝癌细胞的免疫活性。
[单克隆抗体纯度]采用还原和非还原条件下的SDS-PAGE法测定单克隆抗体纯度，免疫球蛋白(单体及二聚体)含量不低于95.0％。
[单克隆抗体含量]采用Bradford法，以卵清蛋白为对照品，测定单克隆抗体含量。每毫升含单克隆抗体2.5mg。
[免疫活性]采用间接免疫荧光法，以BEL-7402或SMMC-7721肝癌细胞为抗原，免疫活性不高于2微克/毫升。
本发明系无内源性免疫球蛋白肝癌鼠源单克隆抗体，单克隆抗体在作为药物应用时的抗体蛋白中的组成比不但每批恒定，而且能达100％。保证了药品质量的稳定性。除去了安全性方面的隐患。本发明系用无血清、无蛋白培养液为基质，以高密度细胞生物反应器连续培养杂交瘤细胞的方法予以制备和生产。现已成功地制备了无内源性免疫球蛋白的整分子的肝癌鼠源单克隆抗体Hepama-1、Hepama-9403、Hepama-9501等、小分子的肝癌鼠源单克隆抗体sHepama-1、sHepama-9403、sHepama-9501等。以这些单克隆抗体为载体，经标记放射性同位素碘-131等，制得用于治疗肝癌的药物，并获得满意的临床效果，其中无内源性抗肝癌鼠源单抗介导的放射性131碘用于治疗晚期原发性巨块型肝癌32例，其中13例已健康存活8年，8年生存率高达40.2％。经动物试验，无内源性抗肝癌鼠源小分子单抗介导的放射性131碘以高、中、低剂量分别用于治疗载肝癌裸鼠的肿瘤，治疗后肿瘤体积均明显缩小，肿瘤抑制率均大于30％，显示该药品确有抑制肿瘤生长的作用。此种作用具有明显的剂量依赖性。因此这一类无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源单克隆抗体(整分子或小分子)是一种有前途的药物原料。
本发明的优点是所采用的原料是无血清、无蛋白培养液，所以制得的单克隆抗体中不含任何小鼠内源性免疫球蛋白及任何牛内源性免疫球蛋白，也不含任何杂蛋白，且单克隆抗体的抗体蛋白中的组成比为100％；与已有技术制备单抗相比，已有技术无论是整分子还是小分子，其原料来源不外乎含杂交瘤细胞的腹水及含杂交瘤细胞的常规培养液(含血清培养液)两种，均具质量不稳定、用药不安全的缺点。而本发明单抗产品正好避免了这两个对药品说来是致命的缺点。其技术关键在于采用无血清、无蛋白培养液为基质，在细胞生物反应器中经高密度(106/mL)连续培养所获得的产品(0.5-1mg/ml)；用这样的组合技术，能以生产规模来制备无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源单克隆抗体；以这些单克隆抗体为载体，经标记放射性同位素碘-131等，可制得用于治疗肝癌的药物制剂，并获得满意的临床效果，因此这些单克隆抗体是一种有前途的原料药。
附图说明：
图1：以sELISA法对杂交瘤细胞Hepama-1的DXL无血清、无蛋白的上清液、DXL无血清、无蛋白培养液、含20％小牛血清RPMI1640培养液的上清液的检测结果
左：抗牛IgG对杂交瘤细胞Hepama-1的DXL无血清、无蛋白的上清液的检测结果为阴性
中：抗牛IgG对DXL无血清、无蛋白培养液的检测结果为阴性
右：抗牛IgG对杂交瘤细胞的含20％小牛血清RPMI 1640培养液的上清液的检测结果为阳性。
图2：经72小时培养后，杂交瘤细胞Hepama-1在无血清、无蛋白培养液、含20％小牛血清1640培养液中的细胞计数值
左：杂交瘤细胞Hepama-1在DXL无血清、无蛋白培养液中的计数值为7.0×105个/毫升
右：杂交瘤细胞Hepama-1在含20％小牛血清1640培养液中的计数值为6.6×105个/毫升。
图3：无内源性免疫球蛋白Hepama-1单抗经椭偏成像生物显微技术对肝癌细胞裂解液特异性免疫结合的三维分布灰度图像(高度值对应灰度值)
图中：a：固体基底
b：无内源性免疫球蛋白Hepama-1单抗
c：无内源性免疫球蛋白Hepama-1单抗+肝癌细胞裂解液。
图4：无内源性免疫球蛋白Hepama-1单抗经辣根过氧化物酶组织化学染色法对人体淋巴结组织切片镜检的阴性显示图。
图5：小鼠免疫球蛋白IgG经辣根过氧化物酶组织化学染色法对人体淋巴结组织切片镜检的阳性显示图。
本发明一类无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源单克隆抗体Hepama-1、Hepama-9403、Hepama-9501(整分子及小分子)等等，制备方法类似，下面以无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源单克隆抗体Hepama-1的制得为实施例，进一步阐明本发明，但并不限制本发明的范围。
实施例1
制备无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源单克隆抗体Hepama-1：
配置DXL无血清无蛋白培养液10升：
需腺嘌呤3毫克、丙氨酸70毫克、氯化铝0.007毫克、偏钒酸铵0.007毫克、精氨酸3克、天冬酰胺300毫克、天冬氨酸150毫克、氯化钡0.025毫克、生物素2.5毫克、氯化钙500毫克、氯化胆碱500毫克、硫酸铬钾0.025毫克、柠檬酸300毫克、瓜氨酸50毫克、氯化钴0.025毫克、硫酸铜0.05毫克、半胱氨酸500毫克、双亚油酸卵磷脂5毫克、双硬脂酸卵磷脂5毫克、乙醇胺  50毫克、乙二胺四乙酸盐70毫克、聚乙二醇20毫克、硫酸亚铁25毫克、原子铁25毫克、黄素腺嘌呤二核苷酸0.25毫克、叶酸25毫克、二氧化锗0.005毫克、谷氨酸250毫克、谷氨酰胺2.5克、甘氨酸50毫克、葡萄糖60克、组氨酸500毫克、次黄嘌呤50毫克、异亮氨酸3克、亮氨酸3克、亚油酸0.5毫克、氯化锂250毫克、赖氨酸2.5克、氯化镁2.5克、氯化锰0.0025毫克、甲硫氨酸250毫克、钼酸0.0025毫克、MOPS50毫克、肌醇300毫克、烟酰胺50毫克、硝酸镍0.0025毫克、鸟氨酸50毫克、草酰乙酸50毫克、泛酸25毫克、酚红50毫克、苯丙氨酸500毫克、溴化钾0.0025毫克、氯化钾3克、碘化钾0.0025毫克、脯氨酸500毫克、黄体酮0.05毫克、腐胺2.5毫克、吡哆辛2.5毫克、丙酮酸2.5克、核黄素0.25毫克、氯化铷0.00025毫克、丝氨酸500毫克、氯化银0.00005毫克、氯化钠70克、氟化钠0.05毫克、硝普钠50毫克、磷酸氢二钠5克、亚硒酸钠0.25毫克、精胺5毫克、氯化亚锡0.0025毫克、牛磺酸250毫克、硫辛酸1.5毫克、硫胺素4毫克、苏氨酸130毫克、胸腺嘧啶7毫克、氯化钛0.02毫克、生育素20毫克、色氨酸50毫克、吐温8015毫克、酪氨酸350毫克、缬氨酸1克、维生素B1280毫克、硫酸锌28毫克，使之充分溶解于去离子水中，定容为10升。无菌过滤备用。
从生产细胞库中取出Hepama-1细胞，通过小量扩增后移入5升细胞生物反应器L1523(Bioengineering)中大量连续培养杂交瘤细胞Hepama-1。按如下反应器工艺条件，温度：37℃；转速：400RPM；pH：7.0；PO2：0.2巴；PCO2：0.4巴；PN2：0.2巴；空气流量：2升/小时；压力：1巴，进行高密度杂交瘤细胞连续培养。反应器中的细胞密度高达1.5×106/ml左右。抗体浓度高达0.7mg/ml。
再以HPLC(BECKMAN Biosys 2000)分离纯化初级产品，以真空低压低温浓缩(AES2010 Automatic Environmental SpeedVac)产品，按质量标准检定，符合标准，最后经过无菌过滤后获得无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源单抗的整分子单抗Hepama-1。
实施例2
以实施例1制得的无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源单克隆抗体Hepama-1为原料，用常规酶切法制备小分子单抗sHepama-1(Fab)：
先配制含0.1毫克/毫升木瓜蛋白酶的消化液(0.02摩尔乙二胺四乙酸二钠、0.02摩尔半胱氨酸)，将现配的含0.1毫克/毫升木瓜蛋白酶的消化液与相同体积的无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源整分子单抗37℃作用8小时，再加碘乙酰胺至终浓度0.3摩尔，以终止酶切反应，然后用pH8.0磷酸缓冲液4℃透析15小时，最后以HPLC分离纯化，获得无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源单抗的小分子单抗sHepama-1(Fab)。
按质量标准检定，符合标准。
实施例3
以实施例1制得的无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源单克隆抗体Hepama-1为载体，标记放射性同位素碘-131，制得用于治疗肝癌的药物制剂。
一男性病人，因患晚期原发性巨块型肝癌于1990年入院，经CT检查，肿块直径达20厘米，剖腹探察后无法手术，宣告“不治”，在自愿的前提下，经用无内源性肝癌鼠源单抗介导的放射性131碘25毫居里一次性治疗，肿块缩小至6厘米，残留肿瘤经病理分析全部坏死，患者迅即痊愈，健康存活至今，无复发迹象。
实施例4
以实施例1制得的无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源单克隆抗体Hepama-1为载体，标记放射性同位素碘-131，制得用于治疗肝癌的药物制剂。
一男性病人，因患晚期原发性巨块型肝癌于1990年入院，经CT检查，肿块直径达12厘米，剖腹探察后无法手术，宣告“不治”，在自愿的前提下，经用无内源性肝癌鼠源单抗介导的放射性131碘25毫居里一次性治疗，健康存活至今。
实施例5
以实施例2制得的无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源小分子单克隆抗体sHepama-1(Fab)为载体，标记放射性同位素碘-131，制得用于治疗肝癌的药物制剂，来治疗载肝癌裸鼠的肿瘤，治疗后肿瘤体积明显缩小，显示该药品确有抑制肿瘤生长的作用。每鼠注入50微居里，100微居里，500微居里的131I的小分子单抗标记物，在30天后，均可见到明确的实验疗效(见表2)，载瘤裸鼠的肿瘤抑制率均大于30％。表2.注射无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源小分子单克隆抗体sHepama-1(Fab)介导的放射性131碘后，载肝癌裸鼠的肿瘤平均体积的变化
  注射后天数                        组别    (n＝12/组)
   低剂量组      中剂量组        高剂量组        游离131I组     对照组(50μCi)      (100μCi)        (500μCi)
0        +              +               +                +              +
1        +              +               +                +              +
3        +              +               +            1.21±1.11     1.32±1.04
6    2.64±1.34         +               +            2.83±1.72     3.44±0.96
9  244.09±122.33   43.62±11.66   52.38±12.34     388.62±174.44  540.66±133.21
12 432.52±169.38   378.46±189.37 339.41±178.43   488.96±212.38  612.97±167.44
15 588.96±178.77   407.35±236.43 378.52±169.33   604.08±244.34  688.24±233.23
18 645.25±212.32   578.64±268.72 471.34±172.32   1222.46±484.34 1388.78±344.78
21 832.41±386.62   734.56±242.38 686.72±312.17   1296.20±323.32 1496.93±588.32
24 878.94±277.17   793.45±343.51 741.33±327.24   1424.66±515.24 1588.92±464.66
27 1033.34±534.33  823.86±443.63 787.45±388.34   1893.32±777.82 1998.94±932.23
30 1427.32±767.74 1231.48±817.48 1123.48±787.63  2448.46±1233.42 2643.55±1323.34
肿瘤抑制率(％)：    第12天    第21天    第30天
低剂量组            29.44     44.39     46.00
中剂量组：          38.26     50.93     53.42
高剂量组：          44.63     54.12     57.50
游离131I：         20.23     13.41     7.38以上各剂量组的肿瘤抑制率同生理盐水对照组及游离同位素组的相比，其P值均小于0.05。

Claims (2)

1.小鼠杂交瘤株Hepama-1分泌的肝癌鼠源单克隆抗体的制备方法，其特征在于以无血清无蛋白培养液为培养基质，采用细胞生物反应器高密度杂交瘤细胞连续培养法继以分离纯化制得；其中，无血清、无蛋白培养基质的配方如下：腺嘌呤0.1-0.5毫克/升、丙氨酸5-10毫克/升、氯化铝0.0005-0.001毫克/升、偏钒酸铵0.0005-0.001毫克/升、精氨酸100-500毫克/升、天冬酰胺10-50毫克/升、天冬氨酸5-30毫克/升、氯化钡0.001-0.005毫克/升、生物素0.05-0.5毫克/升、氯化钙10-100毫克/升、氯化胆碱10-100毫克/升、硫酸铬钾0.0005-0.005毫克/升、柠檬酸10-50毫克/升、瓜氨酸1-10毫克/升、氯化钴0.001-0.005毫克/升、硫酸铜0.001-0.01毫克/升、半胱氨酸10-100毫克/升、双亚油酸卵磷脂0.1-1毫克/升、双硬脂酸卵磷脂0.1-1毫克/升、乙醇胺1-10毫克/升、乙二胺四乙酸盐5-10毫克/升、聚乙二醇0.5-4毫克/升、硫酸亚铁0.5-5毫克/升、原子铁2-5毫克/升、黄素腺嘌呤二核苷酸0.01-0.05毫克/升、叶酸1-5毫克/升、二氧化锗0.0001-0.001毫克/升、谷氨酸10-50毫克/升、谷氨酰胺100-500毫克/升、甘氨酸1-10毫克/升、葡萄糖2000-10000毫克/升、组氨酸10-100毫克/升、次黄嘌呤1-10毫克/升、异亮氨酸100-500毫克/升、亮氨酸100-500毫克/升、亚油酸0.01-0.1毫克/升、氯化锂5-50毫克/升、赖氨酸50-500毫克/升、氯化镁50-500毫克/升、氯化锰0.00005-0.0005毫克/升、甲硫氨酸10-50毫克/升、钼酸0.00005-0.0005毫克/升、MOPS 1000-10000毫克/升、肌醇10-50毫克/升、烟酰胺1-10毫克/升、硝酸镍0.0001-0.0005毫克/升、鸟氨酸1-10毫克/升、草酰乙酸1-10毫克/升、泛酸1-5毫克/升、酚红1-10毫克/升、苯丙氨酸10-100毫克/升、溴化钾0.00005-0.0005毫克/升、氯化钾100-500毫克/升、碘化钾0.00005-0.0005毫克/升、脯氨酸10-100毫克/升、黄体酮0.001-0.01毫克/升、腐胺0.1-0.5毫克/升、吡哆辛0.1-0.5毫克/升、丙酮酸100-500毫克/升、核黄素0.01-0.05毫克/升、氯化铷0.000005-0.00005毫克/升、丝氨酸10-100毫克/升、氯化银0.000001-0.00001毫克/升、氯化钠5000-10000毫克/升、氟化钠0.001-0.01毫克/升、硝普钠1-10毫克/升、磷酸氢二钠100-1000毫克/升、亚硒酸钠0.01-0.05毫克/升、毫克/升、精胺0.1-1毫克/升、氯化亚锡0.00005-0.0005毫克/升、牛磺酸10-50毫克/升、硫辛酸0.08-0.4毫克/升、硫胺素0.1-0.8毫克/升、苏氨酸8-18毫克/升、胸腺嘧啶0.2-1.5毫克/升、氯化钛0.0005-0.004毫克/升、生育素0.05-4毫克/升、色氨酸1-10毫克/升、吐温80 0.05-3毫克/升、酪氨酸25-45毫克/升、缬氨酸70-120毫克/升、维生素B122-15毫克/升、硫酸锌0.6-5毫克/升。
2.如权利要求1所述的肝癌鼠源单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的细胞生物反应器高密度杂交瘤细胞连续培养法的工艺条件是温度：30～40℃、转速：100-500RPM、pH：6.5～7.5、PO2：0.1-2巴、PCO2：0.1-2巴、PN2：0.1-2巴、空气流量：1-5升/小时、压力：1-5巴。
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