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CN1193091C - 一种适于幼仓鼠肾细胞生长与维持的无血清培养基 - Google Patents

一种适于幼仓鼠肾细胞生长与维持的无血清培养基 Download PDF

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张元兴
易小萍
孙祥明
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East China University of Science and Technology
Shandong Dong E E Jiao Co Ltd
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Shandong Dong E E Jiao Co Ltd
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Abstract

本发明公开一种适于幼仓鼠肾(BHK)细胞高密度生长和维持的低蛋白无血清培养基，该培养基具有蛋白含量低、易于分离纯化及适于工业化生产的特点。

Description

一种适于幼仓鼠肾细胞生长与维持的无血清培养基
                        技术领域
本发明涉及一种适于幼仓鼠肾细胞高密度生长和维持的低蛋白无血清培养基。
                        背景技术
幼仓鼠肾(BHK)细胞是一种能无限传代的哺乳动物细胞系，已被广泛用于生产疫苗、诊断试剂以及医药等生物技术产品。
BHK细胞通常在有血清培养基中培养，但血清的添加存在诸多不利：第一，血清非常昂贵，血清的费用占到培养基总费用的50％以上，致使生产成本大幅度提高；第二，批与批之间血清质量的差异，会影响细胞生长，最终影响产品质量；第三，血清易被支原体和外来试剂污染；第四，血清蛋白增加了下游培养产物分离、纯化的难度，这些缺点使得血清在细胞大规模培养中的使用受到限制，致使人们展开了无血清培养基的开发和应用研究。
近年来，无血清培养基的研究开发发展很快，已报道了多种能支持不同种类细胞生长的无血清培养，例如Casser et al.(In Vitro Cell.Devel.Biol.，88，21：588 1985)开发了一种能支持CHO细胞生长的培养基。该培养基以DMEM/F12(1∶1)为基础，添加了转铁蛋白、胰岛素以及亚硒酸钠，这就是现被广泛采用的(基础培养基+ITS)无血清培养基基础配方。美国专利U.S.592107公开了一种无血清培养基，该培养基含有高水平氨基酸，且添加了不同生长因子和微量元素，能支持CHO细胞高密度悬浮培养。但这些培养基多限于杂交瘤细胞和CHO细胞培养，且一般蛋白含量仍较高，通常可达几十毫克至几克，致使下游产物分离纯化的难度和成本增加。而涉及适于幼仓鼠肾细胞长期培养的低蛋白无血清培养基未见报道。
                       发明内容
本发明公开一种适于幼仓鼠肾(BHK)细胞高密度生长和维持的低蛋白无血清培养基，该培养基具有蛋白含量低、易于分离纯化及适于工业化生产的特点。
本发明的构思：
替代血清的补充因子种类很多，通常包括一些人类所必需的生长因子、激素、脂质、结合蛋白和多种微量元素等。为了有效的替代血清，支持细胞的高密度生长，本发明在基础培养基DMEM的基础上，添加了以下成分：
(1)转铁蛋白：一种结合铁的糖蛋白，与细胞表面专一受体作用，传递铁离子。
(2)胰岛素：胰岛β细胞分泌的多肽激素，能促进细胞生长。
(3)维生素：细胞的组成成分，是细胞生长所必需物质，细胞自身无法合成，须从外界摄取。
(4)微量元素：如Cu，Fe，Zn，Se，Co，Mo，Sn，Si，V，Mn等，主要起细胞生理过程调节。
(5)β-巯基乙醇：促进胱氨酸的吸收，可使谷胱甘肽处于还原状态，从而保护细胞免受过氧化氢的损害。
(6)脂质：包括一些脂肪酸和类脂，能促进细胞生长。例如：亚油酸、亚麻酸、油酸以及胆固醇等。
本发明的技术方案：
本发明所述的培养基为一种组合物，由基础培养基DMEM和以下添加物组成(添加剂量的单位如无特别说明均为mg/L)：
L-天冬氨酸        0-20
L-谷氨酸          10-40
L-天冬酰胺        20-50
L-丝氨酸          0-10
L-谷氨酰胺        0-200
L-组氨酸          0-40
L-丙氨酸          0-40
L-精氨酸          50-150
L-蛋氨酸          10-50
L-色氨酸          0-50
L-苯丙氨酸        10-60
L-亮氨酸          20-60
L-赖氨酸          40-100
L-脯氨酸          10-30
NH4VO3         0.02-0.1
SnCl22H2O            1.00-2.00
Ba(C2H3O2)2       0.01-0.05
AgNO3                 0.01-0.05
AlCl36H2O            0.3-1.5
3CdSO48H2O           0.001-0.005
CoCl26H2O            0.03-0.15
(NH4)6MoO244H2O    0.01-0.05
NiCl26H2O            0.1-0.5
Na2SeO3              0.01-0.05
KBr                     0-0.0002
NaF                     0-0.005
KI                      0-0.0005
Na2SiO3              0.01-0.05
NaH2PO32H2O         0-100
FeSO47H2O            0.3-1.5
CuSO45H2O            0.001-0.005
ZnSO4                 0.3-1.5
HEPES                  1000-2500
胰岛素                 2-20
转铁蛋白               2-20
丙酮酸钠               0-150
Primatone              1000-2500
类脂混合物*              0.1％-0.5％(v/v)
还原型谷胱甘肽           0.3-1.5
维生素C                  3.5-13.5
维生素B6                0-0.06
维生素B12               0-0.68
氯化胆碱                 0-5
肌醇                     0-5
生物素(Biotin)           0-0.02
烟酰胺                   0-2.02
核黄素                   0-0.044
硫胺素                   0-2.17
次黄嘌呤                 0-2
硫辛酸                   0-0.1
β-巯基乙醇              0-2.5
*：为GIBCO生产的化学成分确定脂质浓缩液(附组成，mg/L)
花生四稀酸               2
胆固醇                   220
DL-醋酸α-生育酚         70
亚油酸                   10
亚麻酸                   10
豆蔻酸                   10
油酸                     10
棕榈稀酸                 10
棕榈酸                   10
Pluronic F-68            100000
硬脂酸                   10
吐温80                   2200
以上所述所有物质均为市售商品。
本发明所述的培养基采用常规的方法配制而成。
本发明所述的培养基使用方法为常规方法。
                  附图说明
图1为实施例1和对比例的试验结果图示。
其中：
●-采用无血清培养基的细胞密度(×105cells/mL)
▲-采用有血清培养基的细胞密度(×105cells/mL)
                  具体实施方法
下面将通过实施例对本发明作进一步的说明。
                    实施例1
按照下面的浓度配制无血清培养基(包括基础培养基DMEM成分，mg/L)然后在该培养基中接入BHK细胞(种子细胞为无血清培养细胞)，接种密度为1.4×105cells/mL，培养4天(96小时)后，细胞密度可达到1.4×106cells/mL。
第一部分：氨基酸
L-胱氨酸二盐酸        63
L-天冬氨酸            8
L-谷氨酸              19
L-天冬酰胺            31
甘氨酸                30
L-丝氨酸              44
L-谷氨酰胺            688
L-组氨酸              63
L-丙氨酸              12
L-精氨酸              190
L-蛋氨酸              48
L-色氨酸              28
L-苯丙氨酸            86
二水L-酪氨酸二钠      104
L-亮氨酸              147
L-异亮氨酸            105
L-赖氨酸              209
L-脯氨酸              17
L-苏氨酸              95
L-缬氨酸              94
第二部分微量元素
CaCl2                   200
Fe(NO3)3·9H2O       0.1
KCl                      400
NCl                      6400
NaHCO3                  3700
NH4VO3                 0.092
SnCl22H2O              1.556
Ba(C2H3O2)2         0.02
AgNO3                   0.02
AlCl3·6H2O            0.99
3CdSO4·8H2O           0.003
CoCl2·6H2O            0.101
MnSO4·H2O             97.67
(NH4)6MoO24·4H2 O   0.033
NiCl2·6H2O             0.35
Na2SeO3                  0.01
KBr                       0.0001
NaF                       0.0042
KI                        0.0002
Na2SiO3                0.01
NaH2PO3·2H2O         193.00
FeSO4·7H2O         0.834
CuSO4·5H2O         0.0025
ZnSO4                0.863
第三部分：维生素和其它成分
HEPES                 2000
胰岛素                5
转铁蛋白              5
酚红                  15
D-葡萄糖              4500
丙酮酸钠              193
类脂混合物*           0.2％(v/v)
Primatone             1250
还原型谷胱甘肽        0.75
β-巯基乙醇           2.5
D-泛酸钙              4
维生素C               6.25
维生素B6             4.06
维生素B12            0.68
氯化胆碱              9
肌醇                  12.2
叶酸                  4.00
生物素(Biotin)            0.02
烟酰胺                    6.02
核黄素                    0.44
硫胺素                    6.17
次黄嘌呤                  2.00
硫辛酸                    0.10
                     对比例
采用与实施例1相同的培养方法，所用的培养基为添加了5％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基，细胞密度最大为1.2×106cells/mL。
由上述的实施例对比可发现，在本发明的无血清培养基中培养BHK细胞，细胞生长明显优于有血清的培养基，完全可替代血清用于BHK细胞培养。

Claims (1)

1、一种适于幼仓鼠肾细胞生长与维持的无血清培养基，其特征为所述的培养基为一种组合物，由基础培养基DMEM和以下添加物组成，添加剂量的单位如无特别说明均为mg/L：
L-天冬氨酸         0-20
L-谷氨酸           10-40
L-天冬酰胺         20-50
L-丝氨酸           0-10
L-谷氨酰胺         0-200
L-组氨酸           0-40
L-丙氨酸           0-40
L-精氨酸           50-150
L-蛋氨酸           10-50
L-色氨酸           0-50
L-苯丙氨酸         10-60
L-亮氨酸           20-60
L-赖氨酸           40-100
L-脯氨酸           10-30
NH4VO3           0.02-0.1
SnCl2 2H2O       1.00-2.00
Ba(C2H3O2)2   0.01-0.05
AgNO3             0.01-0.05
AlCl3 6H2O            0.3-1.5
3CdSO4 8H2O           0.001-0.005
CoCl2 6H2O            0.03-0.15
(NH4)6MoO24 4H2O    0.01-0.05
NiCl2 6H2O            0.1-0.5
Na2SeO3               0.01-0.05
KBr                      0-0.0002
NaF                      0-0.005
KI                       0-0.0005
Na2SiO3               0.01-0.05
NaH2PO3 2H2O         0-100
FeSO4 7H2O            0.3-1.5
CuSO4 5H2O            0.001-0.005
ZnSO4                   0.3-1.5
HEPES                    1000-2500
胰岛素                   2-20
转铁蛋白                 2-20
丙酮酸钠                 0-150
Primatone                1000-2500
类脂混合物*              0.1％-0.5％v/v
还原型谷胱甘肽           0.3-1.5
维生素C                  3.5-13.5
维生素B6                  0-0.06
维生素B12                 0-0.68
氯化胆碱                   0-5
肌醇                       0-5
生物素(Biotin)             0-0.02
烟酰胺                     0-2.02
核黄素                     0-0.044
硫胺素                     0-2.17
次黄嘌呤                   0-2
硫辛酸                     0-0.1
β-巯基乙醇                0-2.5
*：为GIBCO生产的化学成分确定脂质浓缩液：组成如下，单位为mg/L
花生四稀酸                 2
胆固醇                     220
DL-醋酸α-生育酚           70
亚油酸                     10
亚麻酸                     10
豆蔻酸                     10
油酸                       10
棕榈稀酸                   10
棕榈酸                     10
Pluronic F-68           100000
硬脂酸                  10
吐温80                  2200
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