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CN1696283A - 一种适合中国仓鼠卵巢细胞培养的无血清培养基 - Google Patents

一种适合中国仓鼠卵巢细胞培养的无血清培养基 Download PDF

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CN1696283A
CN1696283A CN 200410018258 CN200410018258A CN1696283A CN 1696283 A CN1696283 A CN 1696283A CN 200410018258 CN200410018258 CN 200410018258 CN 200410018258 A CN200410018258 A CN 200410018258A CN 1696283 A CN1696283 A CN 1696283A
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Abstract

本发明提供了一种用于CHO细胞培养的无血清培养基。所说的培养基是以DMEM/F12为基础培养基，并添加了转铁蛋白、胰岛素、乙醇胺和其他物质。本发明的无血清培养基能使CHO细胞旺盛生长、细胞密度和细胞活性皆可与有血清培养基相媲美，完全可以替代有血清的培养基用于CHO细胞的培养。

Description

一种适合中国仓鼠卵巢细胞培养的无血清培养基
技术领域
本发明涉及细胞培养领域。更具体地，本发明涉及用于CHO细胞培养的培养基和相应的培养方法。
背景技术
由于哺乳动物细胞具有转录后修饰的功能，利用哺乳动物细胞生产的外源蛋白比用原核生物生产的蛋白有无可比拟的优越性，该项技术得到了越来越广泛的重视。中国仓鼠卵巢细胞-CHO细胞(Chinese hamster ovary cell)是目前最为广泛使用的细胞，已被广泛用于生产各种基因工程蛋白产品，例如，人促红细胞生成素(rEPO)、人促血小板生成素(rTPO)、组织纤溶酶原激活物(tPA)、各种抗体等。
外源蛋白在CHO细胞中通常可通过两种不同的方式得到表达，即DHFR缺陷型(二氢叶酸还原酶缺陷型)和谷氨酰胺合成酶系统。通过谷氨酰胺合成酶系统表达的外源蛋白产量高，稳定，而受到重视。
CHO细胞的培养通常是在有血清的培养基中进行，虽然细胞密度和产物浓度较高，但由于血清中蛋白和其它大分子物质太复杂，影响了产物的分离和纯化，降低了产物的收率和纯度；同时，由于血清的添加也使成本大大提高。因此，许多科研工作者致力于开发低血清或无血清培养基。
Darfler等开发的CITTL无血清培养基是以DMEM/F12(1∶1)为基础培养基，添加5mg/L的过氧化氢酶，15mg/L胰岛素，1.5～3.0mg/L转铁蛋白，20nM亚硒酸钠，2nM睾酮，0.5mg/L二亚油酰磷脂酰胆碱和1.5mg/Lβ-甘油磷酸。这一培养基可支持昆虫细胞sf9细胞的克隆化生长，也可用于杂交瘤细胞的培养。然而，该培养基对CHO细胞不太合适。
Murakami等开发的无血清培养基也是以DMEM/F12为基础培养基，添加5mg/L胰岛素，2～35mg/L转铁蛋白，20μM乙醇胺和1nM亚硒酸钠，这就是现被广泛使用的DMEM/F12-ITES配方，可培养多种杂交瘤细胞。
Cleveland等开发的无蛋白培养基(美国专利4767704)主要就微量元素的添加进行了研究，通过对铜、铁、镁、锌、硅、锰、钒、镍、锡、铝、钙、溴、氯、碘、硒、锗等元素的添加和孕酮、腐胺、油酸、嘧啶等物质的添加，开发了一种无蛋白培养基。该发明最主要的贡献在于使人们认识到微量元素的重要性。
Darfler等于1990年开发的含有抗氧化剂的培养基(美国专利4927762)，阐明细胞在还原性的培养基中生长更适合，同时指出N-乙酰半胱氨酸、巯基乙醇等物质的添加可起到抗氧化的作用。
综上所述，各国科学工作者虽然开发了许多无血清培养基，但各培养基都只适用于一种或一类细胞生长，目前多数无血清培养基都含有白蛋白等大分子蛋白类添加剂，严重影响了产物的分离纯化，同时成本也较高。尤其是缺少适用于CHO细胞培养，且培养效果与有血清培养基相当或更佳的培养基。
因此，本领域迫切需要开发新的适合CHO细胞培养的、低蛋白含量的无血清培养基。
发明内容
本发明的目的就是提供一种新的培养CHO细胞的培养基，该培养基能使CHO细胞旺盛生长、细胞密度和细胞活性皆可与有血清培养基相媲美，完全可以替代有血清的培养基用于CHO细胞的培养。
本发明的另一目的是提供所述培养基的用途。
本发明人经过多年广泛而深入的研究，发现了在CHO细胞的无血清培养基中，除了添加普通培养基的一般成分以及胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、和亚硒酸钠之外，添加腐胺和维生素C可以有效地促进CHO细胞的生长，从而使得培养效果相当于或优于有血清培养基。在此基础上完成了本发明。
在本发明的第一方面，提供了一种用于中国仓鼠卵巢细胞的培养基，所述培养基是由基础培养基和添加物构成，其中添加物含有：
2-20mg/L转铁蛋白；
2-20mg/L胰岛素；
1-10mg/L乙醇胺；
0.005～0.05mg/L亚硒酸盐；
2-10mg/L腐胺；
5-30mg/L维生素C，按中国仓鼠卵巢细胞的培养基的总体积计。
在另一优选例中，所述的基础培养基是DMEM/F12，并且所述添加物还含有0-2.5mg/Lβ-巯基乙醇。
在另一优选例中，所述的添加物还含有选自下组的微量元素：Cu、Fe、Zn、Mg、Se、Co、Mo、Sn、Si。
在另一优选例中，所述的添加物含有以下微量元素：
    AgNO3                       0.01～0.05mg/L
    AlCl3·6H2O               0.3～3.0mg/L
    Ba(C2H3O2)2             0.01～0.1mg/L
    3CdSO4·8H2O              0.001～0.010mg/L
    CoCl2·6H2O               0.03～0.30mg/L
    CuSO4·5H2O               0.001～0.005mg/L
    FeSO4·7H2O               0.2～2.0mg/L
    KI                          0.0001～0.001mg/L
    KBr                         0.0001～0.001mg/L
    MnSO4 H2O                 0.0001～0.001mg/L
    NaF                         0.001～0.01mg/L
    Na2SiO3                    0.005～0.05mg/L
    NH4VO3                     0.01～0.1mg/L
    (NH4)6MoO24·4H2O      0.01～0.1mg/L
    NiCl2·6H2O               0.01～0.1mg/L
    SnCl2·2H2O               1.00～10.00mg/L
    ZnSO4                       0.2～2.0mg/L。
在另一优选例中，所述的添加物含有以下氨基酸：
    L-丙氨酸                  0～30mg/L
    L-天冬氨酸                0～10mg/L
    L-天冬酰胺                20～100mg/L
    L-精氨酸                  10～50mg/L
    L-谷氨酸             10～100mg/L
    L-谷氨酰胺           0～500mg/L
    L-甘氨酸             0～40mg/L
    L-组氨酸             0～50mg/L
    L-异亮氨酸           25～100mg/L
    L-亮氨酸             25～100mg/L
    L-赖氨酸             10～100mg/L
    L-蛋氨酸             10～50mg/L
    L-苯丙氨酸           10～60mg/L
    L-脯氨酸             10～30mg/L
    L-丝氨酸             0～100mg/L
    L-苏氨酸             0～100mg/L
    L-色氨酸             0～50mg/L
    L-缬氨酸             0～50mg/L
    L-酪氨酸             0～40mg/L。
在另一优选例中，所述的添加物含有以下维生素：
    叶酸                  0～10mg/L
    维生素B6              0～0.3mg/L
    维生素B12             00～0.88mg/L
    氯化胆碱              0～10mg/L
    异肌醇                0～30mg/L
    生物素                0～0.2mg/L
    烟酰胺                0～5.0mg/L
    核黄素                0～0.2mg/L
    硫胺素                0～5mg/L
    硫辛酸                0～5mg/L。
在另一优选例中，所述的添加物含有以下物质：
    β-巯基乙醇           0～2.5mg/L
    HEPES                 1000～2500mg/L
    丙酮酸钠              0～330mg/L
    Primatone             1000～5000mg/L
    类脂混合物            0.1～0.5％(v/v)
    还原型谷胱甘肽        0.3～3.0mg/L
    次黄嘌呤              0～5mg/L
    腺嘌呤                5～10mg/L
    鸟嘌呤                5～10mg/L
    尿嘧啶                5～10mg/L
    胸腺嘧啶              0.2～2mg/L
    胞嘧啶                5～10mg/L
    核糖                  1～10mg/L
    脱氧核糖              1～10mg/L
    氨基亚砜-蛋氨酸(MSX)  9～45mg/L
在另一优选例中，所述的类脂混合物含有以下成分：
    花生四稀酸            2mg/L
    胆固醇                220mg/L
    DL-醋酸α-生育酚      70mg/L
    亚油酸                10mg/L
    亚麻酸                10mg/L
    豆蔻酸                10mg/L
    油酸                  10mg/L
    棕榈稀酸              10mg/L
    棕榈酸                10mg/L
    硬脂酸                10mg/L
    吐温80                2200mg/L
    PluronicF-68          100000mg/L
按类脂混合物的总体积计。
在本发明的第二方面，提供了本发明所述培养基的用途，它被用于培养中国仓鼠卵巢细胞。
在另一优选例中，所述的中国仓鼠卵巢细胞是带有谷氨酰胺合成酶系统的中国仓鼠卵巢细胞。
在本发明的第三方面，还提供了一种培养CHO细胞的方法，包括步骤：在本发明所述培养基中接种CHO细胞，然后在适合生长的条件下(如37±2℃，5±1％二氧化碳下)培养CHO细胞一段时间(如5-20天)。
附图说明
图1显示了本发明的无血清培养基和现有技术的有血清培养基的CHO培养实验结果。图中：▲采用有血清培养基的细胞生长；△采用无血清培养基的细胞生长。
具体实施方式
为了开发CHO细胞(例如通过谷氨酰胺合成酶系统表达外源蛋白的CHO细胞)的无血清培养基，应当使培养基中蛋白含量尽量减少，以降低成本，有利于分离纯化，适于工业化生产的特点。
为了使细胞要在无血清培养基中生长，必需添加结合蛋白、激素、生长因子、低分子量营养物质如微量元素、脂类等。在许多基础培养基中，已经含有了许多微量元素、糖类等营养物质。例如，DMEM/F12就是细胞培养中常用的商品化的基础培养基。该培养基由葡萄糖、氨基酸、维生素、无机盐等多种物质组成。可从Sigma、GIBCO公司等处购买获得。为了适合CHO细胞的生长，宜在DMEM/F12的基础上添加如下物质：
(1)转铁蛋白：
结合铁的糖蛋白，与细胞表面专一受体作用，传递铁离子，协助铁的吸收，可络和有害离子，起解毒作用，同时还有生长因子的作用。
(2)激素和生长因子
胰岛素：促进葡萄糖和氨基酸通过细胞膜，以利于细胞的吸收和代谢；促进脂质和蛋白质的合成及代谢中间体的磷酸化。胰岛素在细胞分裂过程中和维持细胞在健康的生理代谢状态方面起重要作用。
(3)低分子量营养物质
微量元素：包括Cu、Fe、Zn、Mg、Se、Co、Mo、Sn、Si等等，主要起调节、传递和控制的作用。在无血清培养基中的作用尤为重要。
Fe：酶和血红素的辅基，是线粒体中呼吸链的组成部分。
Cu：超氧化物歧化酶的辅基，是线粒体中呼吸链的组成部分。
Mg：对ATP酶、激酶等起活化作用。
Zn：酶的辅基。
Co：B12的组成部分。
Se：谷胱甘肽氧化酶的组成部分，以硒代半胱氨酸的形式存在于多肽链中，构成酶的活性中心。谷胱甘肽过氧化物酶具有抗氧化的作用。
(4)维生素：
在细胞生长代谢过程中，维生素不作为能源，它是细胞组成成分；细胞的各种代谢活动，离开了维生素都无法进行，因此它是必需的。尤其是维生素C，它起到有效促进CHO细胞生长的作用。
(5)其它
乙醇胺：是无血清培养基的重要组成部分，与磷脂(磷脂酰乙醇胺)的合成有关。
腐胺：有效促进CHO生长。
在DMEM/F12的基础上补加上述物质，使CHO细胞可以旺盛生长，细胞密度和细胞活性相当于或优于有血清培养下的培养结果。
此外，在本发明的培养基中，还可添加以下成分：
脂肪酸对细胞生长都有一定的促进作用。优选的脂肪酸包括(但并不限于)：花生四稀酸、胆固醇、DL-醋酸a-生育酚、亚油酸、亚麻酸、豆蔻酸、油酸、棕榈烯酸、棕榈酸、硬脂酸等。通常，脂肪酸在培养基中的总含量为0.3-2mg/L。
β-巯基乙醇：促进胱氨酸的吸收，还可使谷胱甘肽处于还原状态，从而保护细胞免受过氧化氢的伤害。
具体而言，本发明优选的CHO培养基为一种组合物，是由基础培养基DMEM/F12和以下添加物组成(添加量均为mg/L)：
    转铁蛋白    2-20mg/L
    胰岛素      2-20mg/L
    乙醇胺      1-10mg/L
    亚硒酸盐    0.005～0.05mg/L
    腐胺        2-10mg/L
    维生素C     5-30mg/L
当转铁蛋白、胰岛素、乙醇胺、亚硒酸盐、腐胺、维生素C的含量分别在上述范围内时，可以协同地有效促进CHO细胞的生长。当它们的含量小于上述范围时，其促进作用不明显；当大于上述范围时，虽然仍然可以促进CHO细胞的生长，但进一步的促进作用不明显，反而会导致原料浪费。
更佳地，所述添加物包括以下成分：
第一部分：氨基酸
    L-丙氨酸     0～30mg/L
    L-天冬氨酸     0～10mg/L
    L-天冬酰胺     20～100mg/L
    L-精氨酸     10～50mg/L
    L-谷氨酸     10～100mg/L
    L-谷氨酰胺     0～500mg/L
    L-甘氨酸     0～40mg/L
    L-组氨酸     0～50mg/L
    L-异亮氨酸     25～100mg/L
    L-亮氨酸     25～100mg/L
    L-赖氨酸     10～100mg/L
    L-蛋氨酸     10～50mg/L
    L-苯丙氨酸     10～60mg/L
    L-脯氨酸     10～30mg/L
    L-丝氨酸     0～100mg/L
    L-苏氨酸     0～100mg/L
    L-色氨酸     0～50mg/L
    L-缬氨酸     0～50mg/L
    L-酪氨酸     0～40mg/L
第二部分微量元素
    AgNO3      0.01～0.05mg/L
    AlCl3·6H2O      0.3～3.0mg/L
  Ba(C2H3O2)2     0.01～0.1mg/L
  3CdSO4·8H2O     0.001～0.010mg/L
  CoCl2·6H2O     0.03～0.30mg/L
  CuSO4·5H2O     0.001～0.005mg/L
  FeSO4·7H2O     0.2～2.0mg/L
  KI     0.0001～0.001mg/L
  KBr     0.0001～0.001mg/L
  MnSO4 H2O     0.0001～0.001mg/L
  Na2SeO3     0.005～0.05mg/L
  NaF     0.001～0.01mg/L
  Na2SiO3     0.005～0.05mg/L
  NH4VO3     0.01～0.1mg/L
  (NH4)6MoO24·4H2O     0.01～0.1mg/L
  NiCl2·6H2O     0.01～0.1mg/L
  SnCl2·2H2O     1.00～10.00mg/L
  ZnSO4     0.2～2.0mg/L
第三部分：维生素
    叶酸     0～10mg/L
    维生素B6     0～0.3mg/L
    维生素B12     0～0.88mg/L
    氯化胆碱     0～10mg/L
    异肌醇     0～30mg/L
    生物素     0～0.2mg/L
    烟酰胺     0～5.0mg/L
    核黄素     0～0.2mg/L
    硫胺素     0～5mg/L
    硫辛酸     0～5mg/L
第四部分：其它成分
胰岛素     2～20mg/L
转铁蛋白     2～20mg/L
乙醇胺     1～10mg/L
β-巯基乙醇     0～2.5mg/L
HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸)     1000～2500mg/L
丙酮酸钠     0～330mg/L
Primatone(Sigma公司)     1000～5000mg/L
类脂混合物*     0.1～0.5％(v/v)
还原型谷胱甘肽     0.3～3.0mg/L
维生素C     5～30mg/L
腐胺     2～10mg/L
次黄嘌呤     0～5mg/L
腺嘌呤     5～10mg/L
鸟嘌呤     5～10mg/L
尿嘧啶     5～10mg/L
胸腺嘧啶     0.2～2mg/L
胞嘧啶     5～10mg/L
核糖     1～10mg/L
脱氧核糖     1～10mg/L
氨基亚砜-蛋氨酸(MSX)     9～45mg/L
*：类脂混合物为GIBCO公司生产的化学成分确定的脂质，成分见实施例1。
需要指出的是，氨基酸、无机盐、腺嘌呤等诸多物质的含量都是培养基领域中常用的含量。当氨基酸、无机盐、腺嘌呤等额外物质的含量在上述范围内时，可以更有利地促进细胞的生长。当氨基酸、无机盐、腺嘌呤等额外物质的含量小于上述范围时，其促进作用不明显；当大于上述范围时，会导致原料浪费。
本发明的CHO细胞培养基和培养方法的具有突出的优点，其中主要包括以下优点：
(1)不含血清且蛋白含量低，利于产物的分离和纯化。
(2)CHO细胞培养效果好。能使CHO细胞旺盛生长、细胞密度和细胞活性皆可与有血清培养基相媲美，完全可以替代有血清的培养基用于CHO细胞的培养。
实施例下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
正交法确定CHO细胞培养的最佳培养基
在初始培养基的基础上，改变维生素C、腐胺、脂类的浓度(见下表1)，配制不同的培养基。将相同数量的同一CHO细胞(2.0×105细胞/mL)接种于125ml方瓶中，瓶中装有10ml培养液，在37℃，CO2培养箱中培养8天左右，然后测量CHO细胞的数量。
初始培养基为DMEM/12培养基(购自Sigma公司)和微量元素等的混合液，并添加以下成分：
    成分     含量(mg/L)
    转铁蛋白     5
    胰岛素     5
    乙醇胺     2.5
    亚硒酸钠     0.01
                  表1正交试验表头
    A     B     C
    维生素C(mg/L)     腐胺(mg/L)     类脂混合物*(v/v％)
    1     5     2     0.1
    2     10     5     0.2
    3     30     10     0.5
*注：类脂混合物为GIBCO公司生产的化学成分确定的脂质，成分如下(mg/L)。
  花生四稀酸      2mg/L
  胆固醇      220mg/L
    DL-醋酸α-生育酚     70mg/L
    亚油酸     10mg/L
    亚麻酸     10mg/L
    豆蔻酸     10mg/L
    油酸     10mg/L
    棕榈烯酸     10mg/L
    棕榈酸     10mg/L
    硬脂酸     10mg/L
    吐温80     2200mg/L
    Pluronic F-68     100000mg/L
正交试验分析结果表明：
当维生素C为5-30mg/L，腐胺为2-10mg/L，类脂混合物为0.1-0.5％(v/v)时，可以有效地促进CHO细胞的生长，优于初始培养基20％-100％。
实施例2
培养基的制备和CHO细胞培养
(a)培养基配方：
DMEM/F12培养基(购自Sigma公司)并在其中同时添加以下添加物：
第一部分：氨基酸
    L-丙氨酸     9.0mg/L
    L-天冬氨酸     13mg/L
    L-天冬酰胺     85mg/L
    L-精氨酸     170mg/L
    L-谷氨酸     75mg/L
    L-甘氨酸     25mg/L
    L-组氨酸     62mg/L
    L-异亮氨酸     100mg/L
    L-亮氨酸     150mg/L
    L-赖氨酸     110mg/L
    L-蛋氨酸     50mg/L
    L-苯丙氨酸     86mg/L
    L-脯氨酸     34mg/L
    L-丝氨酸     76mg/L
    L-苏氨酸     43mg/L
    L-色氨酸     47mg/L
    L-缬氨酸     88mg/L
    L-酪氨酸     76mg/L
第二部分微量元素
    AgNO3     0.0194mg/L
    AlCl3·6H2O     1.00mg/L
    Ba(C2H3O2)2     0.0186mg/L
    CaCl2     77.7mg/L
    3CdSO4·8H2O     0.003mg/L
    CoCl2·6H2O     0.101mg/L
    CuSO4·5H2O     0.0038mg/L
    Fe(NO3)3·9H2O     0.15mg/L
    FeSO4·7H2O     1.25mg/L
    KCl     311.8mg/L
    KI     0.0002mg/L
    KBr     0.0001mg/L
    MgCl2     28.64mg/L
    MgSO4     48.84mg/L
    MnSO4 H2O     0.0001mg/L
    NaHCO3     2438.0mg/L
    NaCl     6400.0mg/L
    Na2HPO4     71.02mg/L
    NaH2PO4·2H2O     220mg/L
    Na2SeO3     0.01mg/L
    NaF     0.0042mg/L
    Na2SiO3     0.01mg/L
    NH4VO3     0.092mg/L
    (NH4)6MoO24·4H2O     0.033mg/L
    NiCl2·6H2O     0.035mg/L
    SnCl2·2H2O     1.5564mg/L
    ZnSO4     1.295mg/L
第三部分：维生素
    叶酸     2.65mg/L
    维生素B6     2.60mg/L
    维生素B12     1.12mg/L
    氯化胆碱     14.0mg/L
    异肌醇     30.0mg/L
    生物素     0.007mg/L
    烟酰胺     4.04mg/L
    核黄素     0.26mg/L
    硫胺素     4.34mg/L
    硫辛酸     2.50mg/L
第四部分：其它成分
    胰岛素     5.0mg/L
    转铁蛋白     5.0mg/L
    乙醇胺     2.5mg/L
    β-巯基乙醇     2.5mg/L
    HEPES     2000mg/L
    丙酮酸钠     330mg/L
    Primatone     1250mg/L
    类脂混合物     0.2％(v/v)
    还原型谷胱甘肽     0.75mg/L
    维生素C     6.25mg/L
    腐胺     7.0mg/L
    次黄嘌呤     2.0mg/L
    腺嘌呤     7.0mg/L
    鸟嘌呤     7.0mg/L
    尿嘧啶     7.0mg/L
    胸腺嘧啶     0.6mg/L
    胞嘧啶     7.0mg/L
    核糖     1.0mg/L
    脱氧核糖     1.0mg/L
    MSX     18.0mg/L
在125mL细胞培养方瓶中，各加入10mL如上配制的培养基，然后再加入带谷氨酰胺合成酶表达系统的CHO细胞，接种密度为2.0×105细胞/mL，每隔24小时取样计数。在37℃，CO2培养箱中培养细胞。细胞培养到第8天，活细胞密度达到最高，为1.1×106细胞/mL。
对比例1
采用与实施例2相同的培养方法，不同点仅在于所用的培养基是添加了5％(wt％)胎牛血清的DMEM/F12，其活CHO细胞密度最大为1.0×106细胞/mL。
结果如图1所示，本发明所说的培养基与有血清的培养基相比，没有明显差异，因此完全可以替代有血清的培养基用于带谷氨酰胺合成酶表达系统的CHO细胞的培养。
实施例3
野生型CHO细胞培养
重复实施例2和对比例1的实验，不同点在于用野生型的CHO细胞替换带谷氨酰胺合成酶表达系统的CHO细胞，且培养基中不添加氨基亚砜-蛋氨酸。
在有血清和无血清培养基中的最高活细胞密度分别为1.6×106cells/mL和1.8×106cells/mL，表明本发明的无血清培养基，因此完全可以替代有血清的培养基用于CHO细胞的培养。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种用于中国仓鼠卵巢细胞的培养基，其特征在于，所述培养基是由基础培养基和添加物构成，其中添加物含有：
2-20mg/L转铁蛋白；
2-20mg/L胰岛素；
1-10mg/L乙醇胺；
0.005～0.05mg/L亚硒酸盐；
2-10mg/L腐胺；
5-30mg/L维生素C，按中国仓鼠卵巢细胞的培养基的总体积计。
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的基础培养基是DMEM/F12，并且所述添加物还含有0-2.5mg/L β-巯基乙醇。
3.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的添加物还含有选自下组的微量元素：Cu、Fe、Zn、Mg、Se、Co、Mo、Sn、Si。
4.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的添加物含有以下微量元素：
AgNO3                 0.01～0.05mg/L
AlCl3·6H2O          0.3～3.0mg/L
Ba(C2H3O2)2       0.01～0.1mg/L
3CdSO4·8H2O         0.001～0.010mg/L
CoCl2·6H2O          0.03～0.30mg/L
CuSO4·5H2O          0.001～0.005mg/L
FeSO4·7H2O          0.2～2.0mg/L
KI                      0.0001～0.001mg/L
KBr                     0.0001～0.001mg/L
MnSO4 H2O            0.0001～0.001mg/L
NaF                     0.001～0.01mg/L
Na2SiO3              0.005～0.05mg/L
NH4VO3               0.01～0.1mg/L
(NH4)6MoO24·4H2O  0.01～0.1mg/L
NiCl2·6H2O           0.01～0.1mg/L
SnCl2·2H2O           1.00～10.00mg/L
ZnSO4                  0.2～2.0mg/L。
5.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的添加物含有以下氨基酸：
L-丙氨酸            0～30mg/L
L-天冬氨酸          0～10mg/L
L-天冬酰胺          20～100mg/L
L-精氨酸            10～50mg/L
L-谷氨酸            10～100mg/L
L-谷氨酰胺          0～500mg/L
L-甘氨酸            0～40mg/L
L-组氨酸            0～50mg/L
L-异亮氨酸          25～100mg/L
L-亮氨酸            25～100mg/L
L-赖氨酸            10～100mg/L
L-蛋氨酸            10～50mg/L
L-苯丙氨酸          10～60mg/L
L-脯氨酸            10～30mg/L
L-丝氨酸            0～100mg/L
L-苏氨酸            0～100mg/L
L-色氨酸            0～50mg/L
L-缬氨酸            0～50mg/L
L-酪氨酸            0～40mg/L。
6.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的添加物含有以下维生素：
叶酸                0～10mg/L
维生素B6           0～0.3mg/L
维生素B12          0～0.88mg/L
氯化胆碱            0～10mg/L
异肌醇              0～30mg/L
生物素              0～0.2mg/L
烟酰胺              0～5.0mg/L
核黄素            0～0.2mg/L
硫胺素            0～5mg/L
硫辛酸            0～5mg/L。
7.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的添加物含有以下物质：
β-巯基乙醇         0～2.5mg/L
HEPES               1000～2500mg/L
丙酮酸钠            0～330mg/L
Primatone           1000～5000mg/L
类脂混合物          0.1～0.5％(v/v)
还原型谷胱甘肽      0.3～3.0mg/L
次黄嘌呤            0～5mg/L
腺嘌呤              5～10mg/L
鸟嘌呤              5～10mg/L
尿嘧啶              5～10mg/L
胸腺嘧啶            0.2～2mg/L
胞嘧啶              5～10mg/L
核糖                1～10mg/L
脱氧核糖            1～10mg/L
氨基亚砜-蛋氨酸     9～45mg/L。
8.如权利要求7所述的培养基，其特征在于，所述的类脂混合物含有以下成分：
花生四稀酸          2mg/L
胆固醇              220mg/L
DL-醋酸α-生育酚    70mg/L
亚油酸              10mg/L
亚麻酸              10mg/L
豆蔻酸              10mg/L
油酸                10mg/L
棕榈稀酸            10mg/L
棕榈酸              10mg/L
硬脂酸              10mg/L
吐温80            2200mg/L
PluronicF-68      100000mg/L
按类脂混合物的总体积计。
9.权利要求1所述的培养基的用途，其特征在于，它被用于培养中国仓鼠卵巢细胞。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的中国仓鼠卵巢细胞是带有谷氨酰胺合成酶系统的中国仓鼠卵巢细胞。
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Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009127098A1 (zh) * 2008-04-18 2009-10-22 上海中信国健药业有限公司 一种浓缩培养液及其使用方法
CN101319200B (zh) * 2007-06-08 2010-05-19 中国科学院大连化学物理研究所 一种适用于微囊化cho细胞的无血清培养基及其应用
CN101126077B (zh) * 2007-08-31 2010-07-14 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 血清替代剂及无血清虹鳟胚胎细胞系培养基
CN101117624B (zh) * 2006-03-15 2010-12-08 上海国健生物技术研究院 一种适合大规模中国仓鼠卵巢细胞培养的无血清培养基
CN102443565A (zh) * 2010-09-30 2012-05-09 成都康弘生物科技有限公司 一种适于培养cho细胞的培养基及其培养工艺
CN103421736A (zh) * 2012-05-21 2013-12-04 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 Cho细胞培养中替代动物血清的培养基添加剂及其配制方法
CN104212769A (zh) * 2014-07-14 2014-12-17 北京益生合生物科技有限公司 一种用于高产单抗的细胞培养基添加剂
JP2016116521A (ja) * 2009-08-11 2016-06-30 ジェネンテック， インコーポレイテッド グルタミンフリー細胞培養培地におけるタンパク質の生産
CN108384747A (zh) * 2018-03-05 2018-08-10 安徽省农业科学院园艺研究所 表达狂犬抗体的cho细胞无血清悬浮培养方法
CN111019883A (zh) * 2019-12-24 2020-04-17 依科赛生物科技（太仓）有限公司 Cho细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基及其用途
CN111304169A (zh) * 2019-12-03 2020-06-19 北京亚东生物制药有限公司 一种培养基添加物、含有该添加物的细胞培养基及其应用
CN113151183A (zh) * 2021-04-21 2021-07-23 赵峻岭 一种促进蛋白表达的培养基添加物及其应用
US11958894B2 (en) 2019-12-06 2024-04-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-VEGF protein compositions and methods for producing the same

Cited By (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101117624B (zh) * 2006-03-15 2010-12-08 上海国健生物技术研究院 一种适合大规模中国仓鼠卵巢细胞培养的无血清培养基
CN101319200B (zh) * 2007-06-08 2010-05-19 中国科学院大连化学物理研究所 一种适用于微囊化cho细胞的无血清培养基及其应用
CN101126077B (zh) * 2007-08-31 2010-07-14 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 血清替代剂及无血清虹鳟胚胎细胞系培养基
EP2345713A4 (en) * 2008-04-18 2012-07-11 Shanghai Nat Engineering Res Ct Of Antibody Medicine Co Ltd CONCENTRATED CULTURE SOLUTION AND USE METHOD THEREOF
EP2345713A1 (en) * 2008-04-18 2011-07-20 Shanghai CP Guojian Pharmaceutical Co. Ltd A concentrated culture solution and application method thereof
WO2009127098A1 (zh) * 2008-04-18 2009-10-22 上海中信国健药业有限公司 一种浓缩培养液及其使用方法
CN102007207B (zh) * 2008-04-18 2012-05-30 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 一种浓缩培养液及其使用方法
JP2016116521A (ja) * 2009-08-11 2016-06-30 ジェネンテック， インコーポレイテッド グルタミンフリー細胞培養培地におけるタンパク質の生産
US10982003B2 (en) 2009-08-11 2021-04-20 Genentech, Inc. Production of proteins in glutamine-free cell culture media
US12103975B2 (en) 2009-08-11 2024-10-01 Genentech, Inc. Production of proteins in glutamine-free cell culture media
CN102443565B (zh) * 2010-09-30 2014-09-24 成都康弘生物科技有限公司 一种适于培养cho细胞的培养基及其培养工艺
CN102443565A (zh) * 2010-09-30 2012-05-09 成都康弘生物科技有限公司 一种适于培养cho细胞的培养基及其培养工艺
CN103421736A (zh) * 2012-05-21 2013-12-04 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 Cho细胞培养中替代动物血清的培养基添加剂及其配制方法
CN103421736B (zh) * 2012-05-21 2014-12-17 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 Cho细胞培养中替代动物血清的培养基添加剂及其配制方法
CN104212769A (zh) * 2014-07-14 2014-12-17 北京益生合生物科技有限公司 一种用于高产单抗的细胞培养基添加剂
CN104212769B (zh) * 2014-07-14 2017-05-10 北京益生合生物科技有限公司 一种用于高产单抗的细胞培养基添加剂
CN108384747A (zh) * 2018-03-05 2018-08-10 安徽省农业科学院园艺研究所 表达狂犬抗体的cho细胞无血清悬浮培养方法
CN111304169A (zh) * 2019-12-03 2020-06-19 北京亚东生物制药有限公司 一种培养基添加物、含有该添加物的细胞培养基及其应用
CN111304169B (zh) * 2019-12-03 2022-03-18 北京亚东生物制药有限公司 一种培养基添加物、含有该添加物的细胞培养基及其应用
US11958894B2 (en) 2019-12-06 2024-04-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-VEGF protein compositions and methods for producing the same
US12012444B2 (en) 2019-12-06 2024-06-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-VEGF protein compositions and methods for producing the same
US12012445B2 (en) 2019-12-06 2024-06-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-VEGF protein compositions and methods for producing the same
US12049489B2 (en) 2019-12-06 2024-07-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-VEGF protein compositions and methods for producing the same
US12054532B2 (en) 2019-12-06 2024-08-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-VEGF protein compositions and methods for producing the same
US12054533B2 (en) 2019-12-06 2024-08-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-VEGF protein compositions and methods for producing the same
US12077570B2 (en) 2019-12-06 2024-09-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-VEGF protein compositions and methods for producing the same
CN111019883A (zh) * 2019-12-24 2020-04-17 依科赛生物科技（太仓）有限公司 Cho细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基及其用途
CN113151183A (zh) * 2021-04-21 2021-07-23 赵峻岭 一种促进蛋白表达的培养基添加物及其应用

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