CN1180080C - 一种改进的肝癌鼠源单克隆抗体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种改进的肝癌鼠源单克隆抗体的制备方法，本方法以改良型的DXL无血清培养液为培养基质，即在DXL无血清、无蛋白培养液中添加了各种生长因子，如神经细胞生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子或胚胎生长因子等，含量各为0.01-0.1毫克/升。采用填充床式生物反应器高密度杂交瘤细胞连续培养，工艺条件是，温度为30～40℃，转速为300-480RPM，pH为6.8～7.25，PO2为0.5-1.95巴，PCO2为0.5-1.95巴，PN2为0.5-1.95巴，空气流量为0.1-2/小时、压力为2-5巴。其细胞密度高达108/ml，每升培养液的单克隆抗体的得率达到1000-1500mg。
Description
技术领域
本发明涉及的是单克隆抗体生产领域，尤其涉及一种通过改变生物反应器的工作方式和工艺和改良培养基配方的肝癌鼠源单克隆抗体的制备方法。
背景技术
本发明的申请人与上海梅山生物技术有限公司已于1999年6月25日申请了一份关于无内源性免疫球蛋白肝癌单克隆抗体的产品、方法和应用的专利，专利申请号为99113824.4，发明名称为：无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源单抗、制备方法及其应用。
当时，世界各国所生产的鼠源单克隆抗体，无论是整分子还是小分子的，如果不是无血清、无蛋白培养液作为培养基质，无论采用何种生产方法，所获得的产品均含有程度不等的内源性免疫球蛋白(小鼠的或牛的)，这种含有内源性免疫球蛋白的产品不但质量难以控制并标准化，而且还蕴藏着若干不安全因素。
99113824.4号专利申请成功地提供了以无血清无蛋白培养液为基质，在生物反应器中通过高密度培养小鼠杂交瘤细胞制备无内源性免疫球蛋白的鼠源肝癌单克隆抗体的方法，所得的细胞密度为104-6/ml，抗体浓度高达1mg/ml且抗体蛋白中的组成比为100％。可用作为制备治疗肝癌制剂的原料药。可避免用腹水生产或以含血清培养液生产肝癌单抗安全性上的隐患及单抗在药物蛋白中组成比的不恒定所带来的药效上的不稳定性，就我们所知，这是第一次用生物反应器技术成功地获得的无内源性免疫球蛋白的鼠源肝癌单克隆抗体。
本发明是在前专利的基础上作了改进，选择了更加适合的反应器，同时优化了反应条件，此外我们在培养液中还添加了若干种细胞生长因子，其目的是进一步提高细胞密度及抗体得率。任何体外培养的目标都是模拟生物的体内环境，使细胞得以最大限度的生长，而体内环境又复杂多变，各种因素环环相扣，难以完全复制，这也就是体外细胞培养很难达到体内细胞密度的最关键的一个原因。生长因子本来是一种体内环境特有的关键因素，在体外环境中加入，可以明显提高细胞的存活率，细胞形态得以改善，进而提高细胞密度和抗体得率。以前，人们使用的比较少，是因为细胞生长因子也是一种蛋白质，到最后分离的时候就多了一重顾虑。但是现在，可以通过Protein A或G的纯化过程中完全分离掉这些蛋白质因子，因此，添加这些细胞生长因子是必要及可行的。
发明内容
本发明秉承了99113824.4号专利申请的技术路线，目的是提供一种产率更高的生产无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源单抗的方法。
因此，发明人在99113824.4专利的基础上进行了改进，采用填充床式连续培养反应器，相应地改变了反应器的工艺条件。温度为30～40℃，转速为300-480 RPM，pH为6.8～7.25，PO2为0.5-1.95巴，PCO2为0.5-1.95巴，PN2为0.5-1.95巴，空气流量为0.1-2/小时、压力为2-5巴。最重要的是，本发明采用改良型DXL无血清培养液，即在前专利的DXL无血清、无蛋白培养基质的配方中添加了一种或几种生长因子，包括神经细胞生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、胚胎生长因子等，各种生长因子的含量为0.01-0.1毫克/升，这些生长因子在嗣后的Protein A或G的纯化过程中可以完全分离。
本发明的生产流程步骤见表1：
表1.生产流程步骤
流程 说明 环境清洁度
生产细胞库 取出Hepama-1细胞 100,000级
↓
小量扩增 CO2培养箱 100,000级
↓
大量生产 填充床式反应器 100,000级
↓
收集培液 培液离心 100,000级
↓
浓缩 低温汽化或升华 100,000级
↓
分离纯化 层析
↓
浓缩 真空低压低温 100,000级
↓
浓度，纯度
质量控制 鼠源DNA 100,00级
内毒素，外源因子
↓
过滤分装 100级
配制改良型DXL无血清培养液：
其特点是在DXL培养液的基础上添加了一种或几种生长因子，其含量为0.01-0.1毫克/升。
改良型DXL无血清培养液配方： 毫克/升
腺嘌呤 0.1-0.5
丙氨酸 5-10
氯化铝 0.0005-0.001
偏钒酸铵 0.0005-0.001
精氨酸 100-500
天冬酰胺 10-50
天冬氨酸 5-30
氯化钡 0.001-0.005
生物素 0.05-0.5
氯化钙 10-100
氯化胆碱 10-100
硫酸铬钾 0.0005-0.005
柠檬酸 10-50
瓜氨酸 1-10
氯化钴 0.001-0.005
硫酸铜 0.001-0.01
半胱氨酸 10-100
双亚油酸卵磷脂 0.1-1
双硬脂酸卵磷脂 0.1-1
乙醇胺 1-10
乙二胺四乙酸盐 5-10
聚乙二醇 0.5-4
硫酸亚铁 0.5-5
原子铁 2-5
黄素腺嘌呤二核苷酸 0.01-0.05
叶酸 1-5
二氧化锗 0.0001-0.001
谷氨酸 10-50
谷氨酰胺 100-500
甘氨酸 1-10
葡萄糖 2000-10000
组氨酸 10-100
次黄嘌呤 1-10
异亮氨酸 100-500
亮氨酸 100-500
亚油酸 0.01-0.1
氯化锂 5-50
赖氨酸 50-500
氯化镁 50-500
氯化锰 0.00005-0.0005
甲硫氨酸 10-50
钼酸 0.00005-0.0005
MOPS 1000-10000
肌醇 10-50
烟酰胺 1-10
硝酸镍 0.0001-0.0005
鸟氨酸 1-10
草酰乙酸 1-10
泛酸 1-5
酚红 1-10
苯丙氨酸 10-100
溴化钾 0.00005-0.0005
氯化钾 100-500
碘化钾 0.00005-0.0005
脯氨酸 10-100
黄体酮 0.001-0.01
腐胺 0.1-0.5
吡哆辛 0.1-0.5
丙酮酸 100-500
核黄素 0.01-0.05
氯化铷 0.000005-0.00005
丝氨酸 10-100
氯化银 0.000001-0.00001
氯化钠 5000-10000
氟化钠 0.001-0.01
硝普钠 1-10
磷酸氢二钠 100-1000
亚硒酸钠 0.01-0.05
精胺 0.1-1
氯化亚锡 0.00005-0.0005
牛磺酸 10-50
硫辛酸 0.08-0.4
硫胺素 0.1-0.8
苏氨酸 8-18
胸腺嘧啶 0.2-1.5
氯化钛 0.0005-0.004
生育素 0.05-4
色氨酸 1-10
吐温 800.05-3
酪氨酸 25-45
缬氨酸 70-120
维生素B12 2-15
硫酸 0.6-5
添加：
表皮生长因子、神经细胞生长因子、成纤维细胞生长因子或胚胎生长因子等各种生长因子中的一种或几种各0.01-0.1毫克/升。
用上述配制好的改良型DXL培养液培养能分泌肝癌鼠源单克隆抗体的杂交瘤细胞。
从生产细胞库中取出Hepama-1杂交瘤细胞经小量扩增，取对数期前细胞(接种细胞密度为A×105/ml)移入填充床式细胞生物反应器培养，监控工艺条件(温度：30～40℃、转速：300-480 RPM、pH：6.8～7.25、PO2：0.5-1.95巴、PCO2：0.5-1.95巴、PN2：0.5-1.95巴、空气流量：0.1-2升/小时、压力：2-5巴)，待抗体浓度约为1-1.5mg/ml或细胞生物反应器中细胞长到密度为A×108/ml左右时，收集培养液，低温升华法离心浓缩，得到初级产品。
再以HPLC分离纯化初级产品，以低压低温升华法浓缩产品，同时对产品进行质量控制，最后经过无菌过滤后获得无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源单抗的整分子单抗。此步骤中使用Protein G或Protein A柱子将添加的生长因子分离完全。
必要时，可用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等按常规酶切法将无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源单抗的整分子单抗制备成无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源小分子单抗Fab或Fab)2。先将配制好的含酶消化液与相同体积的无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源整分子单抗37℃作用，酶切反应终止后，再用pH8.0磷酸缓冲液4℃透析12-20小时，最后再以HPLC分离纯化，获得无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源小分子单抗。
由于采用了如上的技术方案，因此，与前专利相比，本专利有着如下显著的优点：
1、采用填充床式连续培养反应器。其最大特点是，细胞在罐内分布集中，有效体积内密度大，减少了在低密度时细胞生长缓慢或者完全不长的风险，且细胞都吸附在微载体上，游离到培养液中的非常少，便于产品的收集。因此，在所有培养细胞，尤其是动物细胞和杂交瘤细胞的生物反应器中，微载体填充床式生物反应器优势显著，越来越成为细胞培养装置中的主流。
2、采用了改良型DXL无血清培养液，在DXL培养液的基础上增加了生长因子，有助于提高得率，而且，由于这些生长因子能够在嗣后的Protein A或G的纯化过程中完全分离，因此，不影响产物抗体的性质。
3、改进了生物反应器的工艺条件。
总的来说，本方法生产的单克隆抗体，其中不含任何小鼠内源性免疫球蛋白及任何牛内源性免疫球蛋白，单克隆抗体的抗体蛋白中的组成比为100％，而且得率高，细胞密度为106-8/ml，每升培液内的单克隆抗体的得率达到1000-1500mg，符合大规模生产的要求。
本发明一类无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源单克隆抗体Hepama-1、Hepama-9403、Hepama-9501(整分子及小分子)等等，制备方法类似，下面以无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源单克隆抗体Hepama-1的制得为实施例，进一步阐明本发明，但并不限制本发明的范围。
附图说明
图1为间接免疫酶联吸附法(sELISA法)测定牛IgG。
如图所示，CUT-OFF值为0.5。图的左边为反应器产物单克隆抗体，中间为改良型DCL培养液，右边为含20％新生牛血清1640培养液。反应器产物单克隆抗体不含牛IgG(内源性球蛋白)。
图2为反应器产物单克隆抗体的活性测试(间接免疫荧光法)。
图2(1)为反应器产物单克隆抗体的活性，图2(2)为免疫球蛋白的阴性对照，图2(3)为多克隆抗体的阳性对照。
图3改良的DXL培养液无血清的测试结果。
图左为改良的DXL培养液染色阴性；图右为含10％新生牛血清的1640培养液，Coomassie Brilliant Blue G250染色强阳性。
具体实施方式
实施例1
制备无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源单克隆抗体Hepama-1：
配置改良型DXL无血清培养液10升：
需腺嘌呤3毫克、丙氨酸70毫克、氯化铝0.007毫克、偏钒酸铵0.007毫克、精氨酸3克、天冬酰胺300毫克、天冬氨酸150毫克、氯化钡0.025毫克、生物素2.5毫克、氯化钙500毫克、氯化胆碱500毫克、硫酸铬钾0.025毫克、柠檬酸300毫克、瓜氨酸50毫克、氯化钴0.025毫克、硫酸铜0.05毫克、半胱氨酸500毫克、双亚油酸卵磷脂5毫克、双硬脂酸卵磷脂5毫克、乙醇胺50毫克、乙二胺四乙酸盐70毫克、聚乙二醇20毫克、硫酸亚铁25毫克、原子铁25毫克、黄素腺嘌呤二核苷酸0.25毫克、叶酸25毫克、二氧化锗0.005毫克、谷氨酸250毫克、谷氨酰胺2.5克、甘氨酸50毫克、葡萄糖60克、组氨酸500毫克、次黄嘌呤50毫克、异亮氨酸3克、亮氨酸3克、亚油酸0.5毫克、氯化锂250毫克、赖氨酸2.5克、氯化镁2.5克、氯化锰0.0025毫克、甲硫氨酸250毫克、钼酸0.0025毫克、MOPS 50毫克、肌醇300毫克、烟酰胺50毫克、硝酸镍0.0025毫克、鸟氨酸50毫克、草酰乙酸50毫克、泛酸25毫克、酚红50毫克、苯丙氨酸500毫克、溴化钾0.0025毫克、氯化钾3克、碘化钾0.0025毫克、脯氨酸500毫克、黄体酮0.05毫克、腐胺2.5毫克、吡哆辛2.5毫克、丙酮酸2.5克、核黄素0.25毫克、氯化铷0.00025毫克、丝氨酸500毫克、氯化银0.00005毫克、氯化钠70克、氟化钠0.05毫克、硝普钠50毫克、磷酸氢二钠5克、亚硒酸钠0.25毫克、精胺5毫克、氯化亚锡0.0025毫克、牛磺酸250毫克、硫辛酸1.5毫克、硫胺素4毫克、苏氨酸130毫克、胸腺嘧啶7毫克、氯化钛0.02毫克、生育素20毫克、色氨酸50毫克、吐温80 15毫克、酪氨酸350毫克、缬氨酸1克、维生素B1280毫克、硫酸锌28毫克、表皮生长因子300微克、神经细胞生长因子300微克，使之充分溶解于去离子水中，定容为10升。无菌过滤备用。
从生产细胞库中取出Hepama-1细胞，通过小量扩增后移入10升填充床式细胞生物反应器中大量连续培养杂交瘤细胞Hepama-1。按如下反应器工艺条件，温度：37℃；转速：420RPM；pH：7.0；PO2：1.25巴；PCO2：1.25巴；PN2：1.25巴；空气流量：0.8升/小时；压力：3.5，进行高密度杂交瘤细胞连续培养。反应器中的细胞密度高达1.1×108/ml左右。抗体浓度高达1.2mg/ml。
再以HPLC(BECKMAN Biosys 2000)分离纯化初级产品，采用ProteinA柱子分离添加的生长因子，以真空低压低温浓缩(AES2010 AutomaticEnvironmental SpeedVac)产品，按质量标准检定，符合标准，最后经过无菌过滤后获得无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源单抗的整分子单抗Hepama-1。
实施例2
以实施例1制得的无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源单克隆抗体Hepama-1为原料，用常规酶切法制备小分子单抗sHepama-1(Fab)：
先配制含0.1毫克/毫升木瓜蛋白酶的消化液(0.02摩尔乙二胺四乙酸二钠、0.02摩尔半胱氨酸)，将现配的含0.1毫克/毫升木瓜蛋白酶的消化液与相同体积的无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源整分子单抗37℃作用8小时，再加碘乙酰胺至终浓度0.3摩尔，以终止酶切反应，然后用pH8.0磷酸缓冲液4℃透析15小时，最后以HPLC分离纯化，获得无内源性免疫球蛋白的肝癌鼠源单抗的小分子单抗sHepama-1(Fab)。
Claims (2)
1.一种改进的肝癌鼠源单克隆抗体的制备方法，其特征在于，以改良型DXL无血清培养液为培养基质，采用填充床式生物反应器，高密度杂交瘤细胞连续培养法继以分离纯化制得，其中：
所述改良型DXL无血清培养液是在DXL无血清、无蛋白培养液的基础上，添加了神经细胞生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子或胚胎生长因子中的一种或几种，各种生长因子的含量各为0.01-0.1毫克/升；
所述DXL无血清、无蛋白培养液如下：
腺嘌呤 0.1-0.5毫克/升
丙氨酸 5-10毫克/升
氯化铝 0.0005-0.001毫克/升
偏钒酸铵 0.0005-0.001毫克/升
精氨酸 100-500毫克/升
天冬酰胺 10-50毫克/升
天冬氨酸 5-30毫克/升
氯化钡 0.001-0.005毫克/升
生物素 0.05-0.5毫克/升
氯化钙 10-100毫克/升
氯化胆碱 10-100毫克/升
硫酸铬钾 0.0005-0.005毫克/升
柠檬酸 10-50毫克/升
瓜氨酸 1-10毫克/升
氯化钴 0.001-0.005毫克/升
硫酸铜 0.001-0.01毫克/升
半胱氨酸 10-100毫克/升
双亚油酸卵磷脂 0.1-1毫克/升
双硬脂酸卵磷脂 0.1-1毫克/升
乙醇胺 1-10毫克/升
乙二胺四乙酸盐 5-10毫克/升
聚乙二醇 0.5-4毫克/升
硫酸亚铁 0.5-5毫克/升
原子铁 2-5毫克/升
黄素腺嘌呤二核苷酸 0.01-0.05毫克/升
叶酸 1-5毫克/升
二氧化锗 0.0001-0.001毫克/升
谷氨酸 10-50毫克/升
谷氨酰胺 100-500毫克/升
甘氨酸 1-10毫克/升
葡萄糖 2000-10000毫克/升
组氨酸 10-100毫克/升
次黄嘌呤 1-10毫克/升
异亮氨酸 100-500毫克/升
亮氨酸 100-500毫克/升
亚油酸 0.01-0.1毫克/升
氯化锂 5-50毫克/升
赖氨酸 50-500毫克/升
氯化镁 50-500毫克/升
氯化锰 0.00005-0.0005毫克/升
甲硫氨酸 10-50毫克/升
钼酸 0.00005-0.0005毫克/升
MOPS 1000-10000毫克/升
肌醇 10-50毫克/升
烟酰胺 1-10毫克/升
硝酸镍 0.0001-0.0005毫克/升
鸟氨酸 1-10毫克/升
草酰乙酸 1-10毫克/升
泛酸 1-5毫克/升
酚红 1-10毫克/升
苯丙氨酸 10-100毫克/升
溴化钾 0.00005-0.0005毫克/升
氯化钾 100-500毫克/升
碘化钾 0.00005-0.0005毫克/升
脯氨酸 10-100毫克/升
黄体酮 0.001-0.01毫克/升
腐胺 0.1-0.5毫克/升
吡哆辛 0.1-0.5毫克/升
丙酮酸 100-500毫克/升
核黄素 0.01-0.05毫克/升
氯化铷 0.000005-0.00005毫克/升
丝氨酸 10-100毫克/升
氯化银 0.000001-0.0000 1毫克/升
氯化钠 5000-10000毫克/升
氟化钠 0.001-0.01毫克/升
硝普钠 1-10毫克/升
磷酸氢二钠 100-1000毫克/升
亚硒酸钠 0.01-0.05毫克/升
精胺 0.1-1毫克/升
氯化亚锡 0.00005-0.0005毫克/升
牛磺酸 10-50毫克/升
硫辛酸 0.08-0.4毫克/升
硫胺素 0.1-0.8毫克/升
苏氨酸 8-18毫克/升
胸腺嘧啶 0.2-1.5毫克/升
氯化钛 0.0005-0.004毫克/升
生育素 0.05-4毫克/升
色氨酸 1-10毫克/升
吐温80 0.05-3毫克/升
酪氨酸 25-45毫克/升
缬氨酸 70-120毫克/升
维生素B12 2-15毫克/升
硫酸锌 0.6-5毫克/升。
2.如权利要求1所述的肝癌鼠源单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述的填充床式生物反应器高密度杂交瘤细胞连续培养法的工艺条件是，温度为30～40℃，转速为300-480RPM，pH为6.8～7.25，PO2为0.5-1.95巴，PCO2为0.5-1.95巴，PN2为0.5-1.95巴，空气流量为0.1-2/小时、压力为2-5巴。
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