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CN1867665A - 不含运铁蛋白的低铁培养基中的骨髓瘤细胞培养 - Google Patents

不含运铁蛋白的低铁培养基中的骨髓瘤细胞培养 Download PDF

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Abstract

本发明涉及在培养基中培养哺乳动物细胞的方法，所述培养基不含运铁蛋白并且不含亲脂性或合成的含氮螯合剂。本发明也提供这种培养基的用途，和通过在培养基中培养能产生产物的哺乳动物细胞从而提供哺乳动物产物的方法。

Description

不含运铁蛋白的低铁培养基中的骨髓瘤细胞培养
发明领域
本发明涉及在含铁但不含运铁蛋白或亲脂性或合成的含氮螯合剂的培养基中生长某些哺乳动物细胞的方法。
背景技术
细胞培养基必须提供使细胞在一种可控的人造的体外环境中维持并生长的必要营养物。细胞培养基的特性很大程度上取决于被培养的细胞类型而较少程度上取决于培养的方法。
哺乳动物细胞的生长绝对需要铁，在体外，铁是由细胞培养基提供的。Bertheussen(Cytotechnology 11：219-231，1993)提出向细胞培养基中添加简单铁盐不能有效的向哺乳动物细胞提供铁，主要是因为铁的快速氧化和沉淀降低了细胞对铁的利用率。
此外，游离态的铁具有很高的氧化势能，会导致细胞培养基中的成分氧化。经证明，这有利于使铁形成复合物从而降低或消除这种氧化势能。
在体内，铁通过铁结合蛋白运铁蛋白而呈递到哺乳动物细胞。运铁蛋白可以通过结合铁并与细胞表面的运铁蛋白受体相互作用来起作用。然后运铁蛋白-铁复合物通过胞吞作用进入细胞。一旦进入细胞以后，运铁蛋白-铁复合物就发生解离，释放出来的铁又与铁运输蛋白(铁蛋白)复合。运铁蛋白再次循环。Thorstensen和Romslo，Biochem.J.，271：1-10(1990)对这种体内的转铁机制进行过很好的综述。运铁蛋白的这种介导铁转运进细胞的能力已经被应用于细胞培养，即向细胞培养基中简单的加入运铁蛋白和铁盐。
然而，通常用于细胞培养基的运铁蛋白是动物来源的，而近年来在细胞培养方法中除去动物来源的蛋白的调节压力(regulatory pressure)已经增加。使用动物来源的蛋白无疑存在引入污染物和外来的病原体的危险，例如克雅病(Creutzfeld-Jakob disease(CJD))或是海绵状脑病(疯牛病)。因此，寻找并应用替代运铁蛋白的其他铁运输物取得了不同程度的成功。其他替代的铁运输物的种类和使用浓度通常取决于所培养的哺乳动物细胞类型。
Kovar和Franek(Biotechnology Letters 9：259-264(1987))证明了多种可溶性的铁化合物(ferric compound)例如柠檬酸铁可以代替运铁蛋白用于杂交瘤细胞系的培养。Kovar和Franek实验了5μM(1.25mg/L)到5mM(1225mg/L)的浓度范围的柠檬酸铁支持两种杂交瘤细胞系生长的能力。虽然以前的现有技术提到较低浓度的铁化合物适用于几种不同细胞系的培养基(特别是人的白血病或上皮来源的细胞系)，但是Kovar和Franek报道如果使用柠檬酸铁要与运铁蛋白同样地来支持杂交瘤细胞生长，需要柠檬酸铁浓度为500μM(122.5mg/L)。Kovar和Franek发现含有500μM柠檬酸铁的培养基适合于培养其他的杂交瘤细胞系并且同样适合于培养几种类型的骨髓瘤细胞。
Eto等(Agric.Biol.Chem.55(3)：863-865(1991))报道了与Kovar和Franek相似的发现。这些研究者实验了10mg/L到600mg/L的浓度范围的柠檬酸铁对杂交瘤细胞系的生长刺激作用。他们报道说在进一步的研究中可以用300mg/L浓度的柠檬酸铁。在含有300mg/L的柠檬酸铁的培养基中加入浓度10μM的乙醇胺(脂质前体)可以达到和使用运铁蛋白同样的生长效果。
在一个相似的研究中，Toyoda和Inouye(Agric.Biol.Chem.55(6)：1631-1633(1991))试验了三种杂交瘤细胞系在含有0到500μM的浓度范围的柠檬酸铁的培养基中的生长。他们报道，对于被试三种杂交瘤细胞系中的两种，50μM(12.5mg/L)的柠檬酸铁是最佳的。这个结果和Eto等人，以及Kovar和Franek的发现相反，虽然浓度500μM对于第三种细胞系是最佳的。
但是，值得注意的是Kovar和Franek，Toyoda和Inouye，Eto等人的研究都是在静置培养中进行的。WO 94/02592报道说虽然10mg/L的柠檬酸铁铵(FAC)能够支持杂交瘤在静置培养中生长，但是对于搅拌型悬浮培养则不能。因此，显然在搅拌型悬浮培养和在静止培养中生长的杂交瘤细胞最佳利用铁的能力是不同的。
WO 93/00423描述了一种培养基添加剂，它额外包含可溶性铁盐和碱金属或碱土金属的柠檬酸盐的铁螯合物，这是对于不含蛋白的细胞培养基的不含血清的合适铁源。该申请的实施例主要是针对如BHK和CHO细胞等哺乳动物细胞的生长。虽然实施例5证明了杂交瘤细胞的生长，但是值得注意的是所用到的SP2/0细胞实际上是一种非分泌型的小鼠/小鼠杂交瘤细胞。整个培养条件指明是静置悬浮培养。
Kovar和Franek声称他们的含有500μM柠檬酸铁的培养基适合于搅拌型悬浮培养，但却没有提供支持该主张的证据。然而，Qi等(Cytotechnology21：95-109(1996))报道，Kovar和Franek所描述的含有500μM(122.5mg/L)柠檬酸铁的培养基适合于在搅拌型悬浮培养物中培养三种杂交瘤细胞系。但是Qi等发现为了使用含有这些高浓度的柠檬酸铁(500μM)的培养基，必须使得在这种培养基上细胞戒断(wean)；对于一种细胞系这个戒断过程会拖得非常的长。Qi等指出在这种情况下细胞经历了很艰难的适应过程，并且可以通过使用更高效的呈递铁的化合物例如金精三羧酸(aurin tricarboxlic acid)替代柠檬酸铁来改进培养基的配方。
与Kovar和Franek(1987)引用的现有技术相一致，一些研究者报道已经发现某些种类的哺乳动物细胞在使用较低浓度的铁化合物的培养中是稳定的。
Ramos等在WO92/05246中报道，在上皮细胞株和特别在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系的培养中，可以用10-100mg/L的柠檬酸铁(提供约0.6-16mg/L的铁)来替代运铁蛋白。但是这项专利申请清楚地指出这种培养基不适合于培养骨髓瘤细胞系。Keen等在US 5,633,162中报道，在培养CHO细胞时，可以用浓度0.25-5mg/L的柠檬酸铁、硫酸亚铁、和柠檬酸铁铵(FAC)(相当于0.04到0.8mg/L的铁)来替代运铁蛋白。
WO 98/08934限定了一种替代培养基，其中所有的动物蛋白，即运铁蛋白和胰岛素都被替代了。运铁蛋白被与含氮螯合化合物螯合的硫酸亚铁替代，所述硫酸亚铁的浓度按照铁是在0.28到11mg/L之间，其中1.1mg/L为最优的。适合的所述含氮螯合化合物包括：乙二胺四乙酸(EDTA)，乙二醇-双(β-氨基乙醚)-N，N，N’，N’四乙酸(EGTA)，甲磺酰排铁剂(desferoxaminemesylate)，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)和反式-1，2-二胺环己烷-N，N，N’，N’四乙酸(CDTA)。其中EDTA是最优选的。柠檬酸铁也以FeCl3-柠檬酸钠的形式使用，但是需要比硫酸亚铁·7H2O-EDTA螯化物更高的浓度。
这项申请认为不含运铁蛋白的培养基适合用于生长哺乳动物细胞，特别是上皮或是成纤维细胞。已经提供了CHO和人胚胎肾细胞系293的生长实例。
Neumannoca等(In vitro Cell Dev.Biol.，31：625-632(1995))同样实验了一定范围的细胞种类在含有呈低浓度1.25mg/L的柠檬酸铁形式的铁(约0.2mg/L铁)的培养基中的长期培养。在实验的19种细胞系中，只有5种能够在这种低铁培养基中长期生长。这5种细胞系是Jurkat、J111、和THP-1(人白血病细胞系)、HeLa(人的上皮细胞系)和XC(大鼠肉瘤)。虽然在被试的那些中包括杂交瘤和骨髓瘤细胞系，但发现它们均不能在低铁的培养基中生长。
根据上面的讨论，较低浓度的铁化合物适合用于某些类型细胞的培养基(特别是那些上皮和人白血病来源的细胞)。但是，本领域通常认同，为了在用不含运铁蛋白的培养基的搅拌型悬浮培养中培养杂交瘤细胞，需要高浓度的(例如在122.5mg/L范围)的铁化合物。
但是现有技术也表明高浓度的铁是不利的。Bertheusse在Cytotechnology 11：219-231(1993)中指出不宜使用高浓度的铁，例如Kovar和Franek建议的500μM的柠檬酸铁，因为这种高浓度会导致培养基中氢氧化铁的快速沉淀。新形成的氢氧化铁能够有效地吸收其他金属和各种有机分子，从而使得这种含高浓度铁的培养基的组成和稳定性受到严重影响。
考虑到将铁传送到所培养的某些哺乳动物细胞(具体到杂交瘤细胞)中遇到的困难，发展出了螯合铁(例如螯合到亲脂性化合物)的概念。
铁的螯合物通常是杂环化合物，其通过共轭键将金属铁与螯合剂中至少两个非金属离子连接，这些螯合剂的分类有很多标准，例如通过它们的来源(合成的或生物产生的分子)，它们与溶剂如水的相互作用(疏水或亲水)，或者它们的化学计量相互作用(二齿的或六齿的)。
亲脂性螯合剂是具有以下两种独特特性的化合物：(1)所述化合物是疏水性的并且通常是芳香族的，因此表现出在有机溶剂(例如酒精)中具有溶解性，但在水中具有有限的溶解性；(2)所述化合物也通常具有负电荷区域，从而能够通过与带有正电荷的铁离子的静电相互作用与铁“结合”。在细胞培养中，人们认为这样的化合物会被吸引到细胞富含脂质的细胞膜上，由此将“结合”的铁运输到或者有可能穿过细胞膜，从而利于给细胞供铁(US5,045,468)。所述亲脂性螯合剂相对于伴随的铁盐通常是加入过量的。
使用亲脂性螯合剂的最早报道之一是由Brock和Stevensen发表的，他们使用吡哆醛异烟肼(pyridoxal isonicotinoyl hydrazone，PIH)联合次氮基三乙酸铁酯(ferric nitrilotriacetate)(Immunology Letters 15：23-25，(1987))。他们发现，为了培养小鼠淋巴细胞系，PIH和次氮基三乙酸铁酯以2∶1的比例和40μM(基于PIH)的浓度，可以替代运铁蛋白。
Darfler(US 5,045,468/in Vitro Cell.Dev.Biol.26：769-778，1990)报道了适合于杂交瘤细胞系培养的不含蛋白的培养基。该作者发现通过使用有机铁化合物能够替代运铁蛋白，硝普酸钠(SNP)和EDTA的浓度分别是5.7和5.5mg/L。作者把这种培养基取名为“ABC培养基”。
Bertheussen(US 5045467/Cytotechnology 11：219-231(1993))报道细胞培养基中的运铁蛋白可以被金精三羧酸(亲脂性铁螯合剂)和3μM铁离子(以FeCl3形式加入)替代。Bertheussen用多种细胞类型开发了这种培养基，发现这种培养基特别适用于快速生长的杂交瘤细胞系的培养。
WO 94/02592提出环庚三烯酚酮(tropolone)在搅拌型悬浮培养时能用于替代运铁蛋白向细胞呈递铁的功能。其作者指出环庚三烯酚酮相对于伴随加入的铁应该过量。铁可以铁离子或者亚铁离子的形式通过多种铁化合物，最优选FAC呈递。用杂交瘤细胞系来说明环庚三烯酚酮和FAC的最优浓度分别是5μM和0.2mg/L。这种培养基也适合NSO骨髓瘤细胞的生长。用不含运铁蛋白和环庚三烯酚酮但是含有FAC的培养基进行杂交瘤细胞和骨髓瘤细胞的实验，这仅仅是作为实验对照。据发现单独的FAC，在0.1至10mg/L时，不能够支持杂交瘤细胞在搅拌型悬浮培养中的生长。单独的FAC在浓度0.2mg/L时不能够支持NSO骨髓瘤细胞系的生长。单独的FAC的其它浓度没有用骨髓瘤细胞进行测试过：前提是作者假定NSO和杂交瘤细胞系的行为相似，并且不期望其它FAC浓度能够支持细胞生长。
Keen(Cytotechnology 17：193-202，1995)报道开发出了用于培养大鼠骨髓瘤和大鼠杂交瘤细胞的不含蛋白的培养基。这种称为W38的培养基是基于DMEM、RPMI和Darfler开发的ABC培养基的1∶1∶1的混合物。因而这种培养基含有作为亲脂性铁源的SNP和作为含氮螯合剂的EDTA。然而，SNP和EDTA为在ABC培养基中发现的浓度的1/3，Keen认为通过向培养基中加入柠檬酸铁提高铁的浓度是有利的。只要能够提供所需的胆固醇，W38培养基同样适用于培养胆固醇营养缺陷型的骨髓瘤细胞系NS0(Keen和Steward，Cytotechnology 17：203-211，1995)。
Epstein等人最近的WO 01/16294专利申请指出在很多情况下，简单的铁载体如柠檬酸盐不能为所培养的细胞提供足够的铁利用度或摄入。这项专利同时报道说一定范围的亲脂性铁螯合化合物能够用于多种细胞类型并且得到了不同程度的成功。然而，只有用与FeCl3和2-羟基吡啶-N-氧化物螯合的山梨醇才能达到至少和运铁蛋白一样好的效果。
使用亲脂性化合物螯合铁并向不含运铁蛋白的杂交瘤和骨髓瘤细胞类型培养物呈递铁已经成为现有技术。然而，细胞培养基中含有亲脂性螯合剂存在一些缺点。亲脂性螯合剂通常是有毒的，例如SNP被划分为高毒性物质，其对于大鼠的LD50＜1mg/kg。在用于工业化生产生物治疗性产品的细胞系中，这对于生产的操作者和最终产品都有影响。事实上，可能必须开发和确认可证明最终的纯化生物治疗性产品不含任何污染性的亲脂性螯合剂的试验方法。另外，螯合剂和铁化合物的两成份系统会使任何具体方法中的铁浓度优化变得复杂。
总之，现有技术表明：
1.在不存在运铁蛋白的情况下，杂交瘤和骨髓瘤细胞能够在高铁浓度(122.5mg/L柠檬酸铁)下生长(Kovar & Franek)。
2.高铁浓度(例如122.5mg/L柠檬酸铁)导致沉淀，这将会破坏培养基(Bertheussen)。
3.在不存在运铁蛋白或者亲脂性螯合剂时，杂交瘤细胞不能在搅拌型培养中生长并且骨髓瘤细胞根本不能在低铁浓度(分别为0.1-10mg/L和0.2mg/L)下生长(WO 94/02592)。
4.要使得杂交瘤细胞和骨髓瘤细胞在低铁浓度的搅拌型培养中生长，培养基需要亲脂性螯合剂(WO 94/02592)。
5.低铁浓度能够用于某些哺乳动物细胞的生长，但是只能使用含氮螯合剂例如EDTA(WO 98/08934)。
在细胞培养领域，某些细胞类型具有相似的营养属性。应该注意到骨髓瘤细胞和杂交瘤细胞共同具有显著属性，并且这种属性是其他的细胞并不通常所具有的，例如谷氨酰胺营养缺陷型(Bebbington等，Biotechnology10：169-175，1992)。杂交瘤细胞和骨髓瘤细胞在很多方面反应相类似，这在某种程度上并不令人吃惊，因为杂交瘤细胞系是由骨髓瘤细胞和产生抗体的B淋巴细胞融合产生的(Kohler和Milstein，Nature 256：495-497，1975)。
如上所述，现有技术表明在不含运铁蛋白或亲脂性或含氮螯合剂时，杂交瘤细胞和骨髓瘤细胞利用在培养基中由简单的铁载体(例如柠檬酸盐)存在的铁的能力是不同于诸如CHO细胞的相应能力的。现有技术总体上教导杂交瘤细胞和骨髓瘤细胞在不含运铁蛋白的培养基中利用铁的能力相同。
如前所述，从文献中可以明显看出，在开发用于生长杂交瘤细胞种类(尤其是处于静置培养)的不含运铁蛋白的培养基上花费了时间和精力。由于在本领域内隐含的假设是骨髓瘤细胞和杂交瘤细胞在这方面具有相同的需求，尚未用骨髓瘤细胞作同样的实验。
这些年来，杂交瘤细胞和骨髓瘤细胞培养技术明显从使用可溶性铁化合物形式的铁来替代运铁蛋白，转向使用低铁浓度、及在培养基中包含亲脂性或者是含氮螯合剂的好处。当然，在用于生长目的为经改造细胞来产生产品的细胞的培养基中使用所述螯合剂，同样需要进一步处理所述产品来确保没有螯合剂的污染。由于必须开发特定的试验方法来证明“有毒的”铁螯合剂没污染纯的产品，在培养基中包括所述螯合剂不仅延长了证明产品是纯的所花的时间，也增加了生产费用。
因此，明显仍需要向培养的某些细胞以提供足够铁的浓度来提供简单形式的铁，来继续细胞生长，但是不会造成上面讨论的沉淀损害。另一个好处是得到不含运铁蛋白和亲脂性或含氮螯合剂的培养基。其目的是要获得在不含运铁蛋白和亲脂性或含氮螯合剂的培养基中，与含有运铁蛋白的培养基中同样的细胞培养。
发明概述
为了满足提供支持某些细胞生长的不含运铁蛋白的培养基需求，本发明在其它方法之外还提供了在含铁但缺乏运铁蛋白、或亲脂性或合成的含氮螯合剂的培养基中、搅拌型悬浮培养(agitated suspension culture)中培养骨髓瘤细胞的方法。与现有技术的公开相反，本发明惊讶地发现骨髓瘤细胞对铁的需求与杂交瘤细胞不同，骨髓瘤细胞的意外结果显示骨髓瘤细胞在比杂交瘤细胞所需浓度最多低100倍的培养基中的铁浓度中连续生长。本发明方法的另一个优势体现在，在低铁浓度的培养基中培养细胞得到了更高滴度的骨髓瘤细胞产物。
附图简述
图1：图1a显示了骨髓瘤细胞在不同浓度的柠檬酸铁铵中、在搅拌型悬浮培养条件生长的能力；图1b显示了在不同浓度的柠檬酸铁铵中生长的骨髓瘤细胞系所产生的抗体量；图1c显示了重复此实验的生长数据。
图2：图2a显示了骨髓瘤细胞系在不同浓度的柠檬酸铁中、在搅拌型悬浮培养条件的生长；图2b显示了如此生长的细胞系的细胞计数和抗体滴度。
图3：图3a显示了杂交瘤细胞系在不同浓度的柠檬酸铁铵中、在搅拌型悬浮培养条件的生长；图3b显示了细胞计数；图3c显示了如此生长的细胞系的生长的数学导出的比较。
图4：图4a显示了骨髓瘤细胞系在不含富集血清(rich-serum free)和运铁蛋白的培养基中、于不同浓度的柠檬酸铁铵中在搅拌型悬浮培养条件下的生长。
图5：图示了柠檬酸铁铵为在搅拌型悬浮发酵生长条件下的骨髓瘤细胞系的生长提供所有需要的铁的能力。
图6：图示了柠檬酸铁铵为在不含蛋白的培养基和不含血清的培养基中的骨髓瘤细胞系在搅拌型悬浮发酵条件下的生长提供所有需要的铁的能力。
图7：图示了骨髓瘤细胞系以柠檬酸铁铵作为唯一铁源来生长的能力不是因为用GS选择体系来转染。
图8A：图示了在小试规模(bench scale)发酵中、在补充了柠檬酸铁铵的不含蛋白培养基中的另一种骨髓瘤细胞系的生长。
图8B：图示了在100L中试规模分批(fed-batch)的发酵中、骨髓瘤细胞系在补充柠檬酸铁铵的不含蛋白培养基中的生长。
图9：图示了另一种骨髓瘤细胞系在补充柠檬酸铁铵的不含蛋白培养基中小试规模发酵培养的生长。
图10：图示了在100L中试规模分批的发酵中、另一种骨髓瘤细胞系在补充柠檬酸铁铵的不含蛋白培养基中的生长。
在图8A、8B、9和10中，和其他图中一样，X轴定义了以天为单位的时间，Y轴定义了活细胞数(×105细胞/mL)。
发明内容
与上述一致，本发明第一方面提供了在体外培养骨髓瘤细胞系的方法。其包含：
(a)将骨髓瘤细胞系接种于培养基中，所述培养基能够支持上述骨髓瘤细胞系的生长并且含有培养基中的浓度从约0.03mg/L到约3.2mg/L的铁，其中所述培养基不含运铁蛋白、亲脂性螯合剂、合成的含氮螯合剂或亲脂性合成的含氮螯合剂；和
(b)在恰当的条件下用搅拌型悬浮培养来生长所接种的培养基。
在此方面的具体实施方案中，本发明提供了在体外培养骨髓瘤细胞系的方法，其包含：
(a)将骨髓瘤细胞系接种于培养基中，所述培养基能够支持上述骨髓瘤细胞系的生长并且含有培养基中的浓度从约0.2mg/L到约20mg/L的柠檬酸铁铵，其中所述培养基不含运铁蛋白、亲脂性螯合剂、合成的含氮螯合剂或亲脂性合成的含氮螯合剂；和
(b)在恰当的条件下用搅拌型悬浮培养来生长所接种的培养基。
另一方面，本发明提供了获得哺乳动物细胞产物的方法，其包含将能够产生所述产物的骨髓瘤细胞在能够支持所述骨髓瘤细胞系生长的培养基中培养，所述培养基含有培养基中的浓度从约0.03mg/L到约3.2mg/L的铁，其中所述培养基不含运铁蛋白、亲脂性螯合剂、合成的含氮螯合剂或亲脂性合成的含氮螯合剂；和回收所述哺乳动物细胞产物。
再一方面，本发明提供了支持骨髓瘤细胞系体外生长的培养基的用途，其中所述培养基含有培养基中的浓度从约0.03mg/L到约3.2mg/L的铁，其中所述培养基不含运铁蛋白、亲脂性螯合剂、合成的含氮螯合剂或亲脂性合成的含氮螯合剂。
在本发明这些方面的具体实施方案中，培养基含有培养基中的浓度从约0.2mg/L到约20mg/L的柠檬酸铁铵。
在本发明中，培养基可以支持骨髓瘤细胞系的生长。“支持生长”指的是所述细胞经多次传代培养的连续生长，在每次传代即从一次传代培养到下一次传代培养，细胞数变为至少双倍并优选三倍。传代培养的数目对本发明不是必需的，它取决于例如所进行的实验长度或是产生的产物。本发明中，通常优选所述细胞经至少两次传代培养，并优选至少三代传代培养显示连续生长。
也称为淋巴样细胞的骨髓瘤细胞是癌性的淋巴细胞，它在正常的培养条件通常是永生的。骨髓瘤细胞种类是有用的，因为它是制备产生单克隆抗体的杂交瘤的非常好的融合伙伴(partner)。近几年来，骨髓瘤细胞类型作为重组基因技术中的宿主细胞的重要性变得很突出。使用谷氨酰胺合酶选择性标记物时尢其是这样，该标记物与NS0骨髓瘤宿主一起使用来制备稳定高产的重组细胞系(Barnes等，Cytotechnology 32：109-123，2000)。
在本发明中，预期在所述培养基中可以使用任何骨髓瘤细胞系。通常优选所述骨髓瘤细胞系是小鼠来源的，并且如果如此的话，更优选所述骨髓瘤是NS0细胞系或P3系列的细胞系，最优选是NSO细胞系(如ECACC85110503)。其他小鼠骨髓瘤包括MOPC系列、MPC-11、J558L、K6H6/B5、和45.6.TG1.7。本发明方法也可用于培养大鼠的和人的骨髓瘤细胞种类。本发明方法适用的大鼠骨髓瘤细胞系包括Y0和Y，合适的人骨髓瘤细胞系包括HTK、RPMI 8226和U266B1。
当骨髓瘤细胞系是NSO细胞时，优选的细胞株用谷氨酰胺合酶表达体系转染。
本发明中所说的细胞培养基不含运铁蛋白、亲脂性螯合剂、合成的含氮螯合剂或亲脂性合成的含氮螯合剂。亲脂性螯合剂可被定义为为了本发明目的的螯合剂，该螯合剂具有如下两种区别性特征：(1)它们是疏水的，即难溶或不溶于水或细胞培养基，通常是芳香族的；(2)它们有荷负电的区域，该区域可以通过与荷正电的铁离子的静电相互作用而“结合”铁。亲脂性螯合剂的例子有环庚三烯酚酮(tropolone)和硝普酸钠(sodiumnitroprusside)。为本发明目的，合成的含氮螯合剂被定义为在其结构中含有至少一个氮原子的结合铁的化合物。这类化合物可以是疏水的或是亲水的。这方面术语“合成的”指的是这种含氮螯合物不是天然存在的，即正常时不能在自然界中找到。由人工合成的天然存在的含氮螯合物不包括在此定义内，但在本发明的方法和用途中并不排除。这种合成的含氮螯合物包括但不限于化合物如乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid)(EDTA)、乙二醇-双(β-氨基乙醚)N，N，N’，N’四乙酸(ethyleneglycol-bis(β-aminoethylether))(EGTA)、甲磺酰排铁剂(desferoxamine mesylate)、二亚乙基三胺五乙酸(diethylenetriamine pentaacetic acid)(DTPA)和反式-1，2-二胺环己烷-N，N，N’，N’四乙酸(trans-1，2-diaminocyclohexane-N，N，N’，N’-tetraaceticacid)(CDTA)。也排除在本发明的方法和用途之外的是可以是亲脂性并且是合成的含氮螯合物的化合物。
培养基的确切组成在本发明中并不重要，只要该培养基不含运铁蛋白、亲脂性螯合剂、合成的含氮螯合剂或亲脂性合成的含氮螯合剂，但是含有上述提到的浓度的铁，并且该培养基能够支持之前限定的骨髓瘤细胞系的生长就行。
通常所述细胞培养基含有氨基酸、维生素、有机的和无机的盐类和糖类的来源。基于本领域现有信息，能够提供这些生长必要要件的化合物通常都能获得，并且将它们掺入细胞生长的培养基也是本领域技术人员可以实现的。
通常优选所述细胞培养基以已知的能支持哺乳动物细胞连续生长的基础培养基或它们的衍生物为基础。这种基础培养基通常能得到。可被补充来提供本发明培养基的合适的基础培养基的例子包括Dulbecco改进的Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagles Medium，DMEM)、Hams F12培养基、Iscove改进的Dulbecco培养基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)和Roswell Park Memorial Institute(RPMI)。
本发明中的培养基可以不含血清、不含蛋白、不含动物来源或化学限定的组分。
一种选择是，所述细胞培养基可以通过将连续生长所需的具体组分组合从首要元素(first principles)来制备。
当在制备针对具体细胞种类或细胞系的培养基时，通常可以按照具体细胞种类/系的需要来改良或补充基础培养基。补充物的选择是本领域技术人员已知技术，并不构成本发明的必要方面。通常这种补充物可以包括脂类(例如胆固醇和脂肪酸)、脂质前体(例如乙醇胺)、生长促进剂或调节剂(例如胰岛素)、微量元素(例如硒)、聚合物(例如，Pluronic F-68)和对于谷氨酰胺依赖性细胞的谷氨酰胺。
可加入铁源来向培养基提供上面提到的浓度的铁从而使其适合用于本发明的培养基的一个例子，是基于Qi等在Cytotechnology 21：95-109(1996)中描述的CDSS的细胞培养基。这种培养基，称为改进的CDSS，是基于DMEM/F12(1∶1)(Gibco BRL.1x liquid cat.no.21331)以及如下添加物：GS补充物(JRH cat.no.58672)40ml/L；Clevelands微量元素I(Cellgro 99-175)0.5ml/L；Clevelands微量元素II(Cellgro 99-176)1ml/L；硫酸锌2μM；亚硒酸钠50nM；乙醇胺20μM；Pluronic F681g/L；碳酸氢钠1.3g/L和2M盐酸3.6ml/L。对于无法进行谷氨酰胺非依赖性生长的细胞系，所述培养基含有6mM谷氨酰胺；对于NSO细胞系，所述培养基含有2ml/L的胆固醇脂浓缩物(Gibco cat.no.00-0061)。
本发明的细胞培养基含有培养基中的浓度从约0.03mg/L到约3.2mg/L的铁。在优选的具体实施方案中，培养基中的铁源是可溶性铁化合物。所用的可溶性铁化合物的量应当足够向培养基提供在该浓度的铁，只要培养基中的铁的量在这个范围内就应当足够支持所述细胞的生长。培养基中可溶性铁化合物的精确浓度可以根据使用的具体可溶性铁化合物、所用的细胞系和/或存在的其它培养基组分而改变。合适的浓度可以通过直接的方式来确定，例如通过进行根据常规操作的小规模试验，如具体细胞系对于具体培养基中可溶性铁化合物的剂量反应。
在本发明中，培养基中的铁的浓度(优选用可溶性铁化合物来提供)从约0.03mg/L到约3.2mg/L，优选从约0.03mg/L到约2.4mg/L，更优选从约0.064mg/L到约1.6mg/L，最优选从约0.16mg/L到约0.32mg/L。
在本发明优选的具体实施方案中，培养基中的铁源是可溶性铁化合物。适合的可溶性铁化合物可溶于水或细胞培养基，但是在有机溶剂中显示出有限的溶解度。这种化合物对于本领域技术人员是通常可得的，确定其溶解度是直接的。
本发明也包括任何可选的铁源的用途，只要所述铁源能向细胞提供足够的铁来使其在运铁蛋白或亲脂性或合成的含氮螯合物缺无时能连续生长。
提供铁从而用于本发明的合适的可溶性铁化合物包括铁盐，亚铁盐或它们的简单螯合物。需要注意的是这里所用的“简单螯合物”不包括上面讨论过的亲脂性或合成的含氮螯合物。术语“简单螯合”是相对于现有技术各个方面中的术语“简单铁载体”以比较的方式在本文中使用的。
可以是用于本发明方法和用途中的培养基中的铁源的铁盐、或亚铁盐或它们的简单螯合物的例子包括：硫酸亚铁、柠檬酸亚铁、柠檬酸铁、和铁铵离子化合物。优选用于本发明的是铁铵离子化合物。具体的本发明所用的铁铵离子化合物包括柠檬酸铁铵、草酸铁铵、延胡索酸铁铵、苹果酸铁铵、琥珀酸铁铵。本发明中最优选使用柠檬酸铁铵。
虽然本发明的培养基可以含有不只是一种铁源，例如合适的含铁化合物的混合物，当铁源是可溶性铁化合物时，通常优选在培养基中只存在一种这样的化合物。
在本发明的优选具体实施方案中，所述可溶性铁化合物是柠檬酸铁铵。通常在此具体实施方案中并为了给培养基提供范围在约0.03mg/L到约3.2mg/L的铁，将使用浓度从约0.2mg/L到约20mg/L，优选从约0.2mg/L到约15mg/L，更优选从约0.4mg/L到约10mg/L并最优选从约1mg/L到约2mg/L的柠檬酸铁铵。
在本发明的优选具体实施方案中，所述培养基包含铁铵离子化合物。本发明结果证明这些铁铵离子化合物，具体是柠檬酸铁铵，比例如柠檬酸铁更有效地为细胞使用。具体地，如果使用柠檬酸铁，它必须以在相当的培养基中的铁铵离子化合物的浓度的10倍来存在。本发明的图1和2图示了这一点，从所述的图可以明显可见经至少3次传代的连续细胞生长，柠檬酸铁必须以至少10mg/L的浓度存在，而柠檬酸铁铵在0.2mg/L的浓度提供了相同水平的生长。也值得注意抗体滴度在较低的离子浓度是最好的。
本发明的培养基可以通过用标准操作地将各种组分适当混合来制备。所述培养基也可以制备成不同的形式如液体形式或是在使用前重建的干粉状培养基。本发明的培养基在合适的条件下保存时是稳定的。
因此，本发明也提供了制备可以支持骨髓瘤细胞系的体外生长的细胞培养基的方法，所述培养基含有培养基中的浓度从约0.03mg/L到约3.2mg/L的铁，其中所述培养基不含运铁蛋白、亲脂性螯合剂、合成的含氮螯合剂或亲脂性合成的含氮螯合剂，该培养基包含其各自组分的混合物。
本发明的细胞培养基适用于许多培养条件。所以，所述培养基可维持骨髓瘤细胞系在单层培养和悬浮培养，具体是搅拌型悬浮培养中的生长。搅拌型悬浮培养可以被定义为培养基中的细胞的均质悬液是借助于搅拌力的细胞培养。使用搅拌力的手段在本领域公知的，并且包括例如机械的搅拌机(stired impeller)和/或生物反应器培养物中的喷气，和将细胞培养瓶保持在往复式摇床(reciprocal shaking platform)上。本发明的培养基特别适合搅拌型悬浮培养中的细胞培养，也就是使用已知的培养技术用合适的搅拌型培养容器，例如搅拌釜(stirred tank)或气升式发酵罐的悬浮培养。
因此，本发明同时也提供了培养基，它能支持骨髓瘤细胞系的搅拌型悬浮培养的生长，培养基含有培养基中浓度为大约0.03mg/L到3.2mg/L的铁，而培养基不含运铁蛋白、亲脂性螯合剂、合成的含氮螯合剂或亲脂性含氮螯合剂。
现有技术教导指出骨髓瘤和杂交瘤细胞类型对于培养基中的铁具有相同的需求。我们的结果显示并非如此。图3显示了杂交瘤细胞系在含有柠檬酸铁铵的培养基中的生长。从此图中可以看出，杂交瘤细胞的生长和本领域的预测是一致的，也就是说，在柠檬酸铁铵浓度高(50mg/L和100mg/L)而不是这一可溶性铁化合物浓度较低(低于10mg/L)时，细胞生长很好。和图1(显示了骨髓瘤细胞在相当浓度的可溶性铁化合物的培养基中的生长)相比较，显然，杂交瘤细胞比长势相当的骨髓瘤细胞在培养基中需要高大约100倍的铁。
本发明的另一个优点在于当细胞在低铁培养基中培养，即当所述细胞系按照本发明的方法进行培养时，骨髓瘤细胞产物的滴度提高。下面的实施例证明在培养基中的铁浓度低时，例如在0.03mg/L到3.2mg/L之间，优选在0.16mg/L到0.32mg/L之间，骨髓瘤细胞产物的滴度出乎意料的较高。
可由本发明得到的细胞产物包括由所培养的哺乳动物细胞产生的任何产物。通常的产物包括，例如多肽和蛋白，例如免疫球蛋白如单克隆抗体和重组抗体及其片段、激素如促红细胞生成素和生长激素例如人生长激素、淋巴因子如干扰素、白介素如白介素2、4、5和6，和工业用和治疗用的酶，如组织纤溶酶原激活物。利用基因重组技术对骨髓瘤细胞进行操作以使所述细胞产出所述细胞产物的方法是本领域广泛应用并通常可得的。
为了得到细胞产物，能够产生所述产物的骨髓瘤细胞是在本发明的培养基中生长的。生长条件取决于，例如所使用的细胞系和所产生的产物，但是根据本领域现有知识很容易确定。
为此，本发明也提供了含培养基中浓度从约0.03mg/L到约3.2mg/L的铁的培养基的用途，其中制备哺乳动物细胞产物的所述培养基不含运铁蛋白、亲脂性螯合剂、合成的含氮螯合剂或亲脂性合成的含氮螯合剂。
分离骨髓瘤细胞和/或培养基产生的细胞产物的方法是公知的并且是本领域的常规操作。
这里提到的所有的文献都全文引入作为参考。应理解本发明是结合上述具体实施方案来描述的，前面的描述和下面的实施例只是为了说明本发明而没有对本发明的范围作任何限定。另一方面，本发明包括在本发明的范围内对本领域技术人员是显而易见的优点和改进。
实施例
实施例1：0.2mg/L柠檬酸铁铵(FAC)能够支持GS-NS0细胞系的连续生长
方法
将用谷氨酰胺合酶(GS)表达体系(欧洲专利说明书2560550)表达人lgG抗体的重组GS-NS0小鼠骨髓瘤细胞系(细胞系A)预先在完全不含血清、含铁螯合源的培养基(GSF培养基)中传代培养，然后离心并在不含螯合剂的培养基中重悬。将在此培养基中重悬的细胞接种于实验培养瓶中，接种浓度为2×105细胞/ml。
此实验通过使用250ml的有通风盖(vented cap)的锥形瓶(Erlenmeyerflask)(工作容量在20到50ml之间)、在5％二氧化碳/95％空气和湿度75％的条件、在36.5℃和125rpm于往复式摇床上温育来进行。
在含有改进的CDSS培养基的各个培养瓶中分别补充FAC贮存液使得培养瓶含有最终浓度为0.2、0.4、1、2、10、50和100mg/L的FAC。FAC的贮存液用水配制到浓度为0.5mg/L(对于含有0.2-2mg/L FAC的培养瓶)和25mg/L(对于含有10-100mg/L FAC的培养瓶)。贮存液在加入培养瓶之前需要过滤除菌。
将包含了补充了1mg/L人运铁蛋白和0.1mg/L FAC的改进CDSS培养基的培养瓶作为阳性对照。将包含了不含任何运铁蛋白或FAC的改进的CDSS培养基的培养瓶作为阴性对照。所有的培养瓶都补充了2ml/L胆固醇脂质浓缩物(Gibco)作为胆固醇来源。胆固醇脂质浓缩物是胆固醇和脂肪酸与环糊精复合而成的乳状液。
将培养瓶传代培养三次以便使来自接种物的螯合的/贮存的铁所产生的影响最小化。每隔3天通过用新鲜的培养基稀释到2×105细胞/ml来传代培养培养瓶。在第三次传代培养时，让培养瓶按照完全生长循环直到生存能力变得很低(这通常被叫做过度生长)。使用Innovatis Cedex细胞计数器进行细胞计数。对照着相应的lgG标准物，用夹心ELISA法测定抗体滴度。
结果
图1a说明在实验的FAC浓度范围内，在传代培养和最终过度生长中的细胞浓度。此图清楚地表明了阴性对照培养物在第一次传代培养后就不能增殖。含有0.2mg/L FAC的培养物在第一次分裂后可以增殖，但是不能继续生长。这些培养物在初始接种之后能够生长的事实可能是由于需要通过细胞分裂来消耗的细胞铁储备造成的。
图1a也清楚地表明0.4mg/L或以上的浓度能够支持经多次传代培养和过度生长培养的连续的细胞生长。图1c表明在此实验的重复实验中，0.2mg/L的FAC浓度能够支持连续的细胞生长。
图1b表明了来自第一次重复实验(the first of the duplicates)的过度生长培养物的细胞计数和抗体产生数据。此图根据最大活细胞数和生长曲线下的面积表明，用1mg/L或者更高的FAC浓度可得到与含有运铁蛋白的对照相当的生长。这表明在达到阈值水平(1mg/L)以后，在FAC浓度的一个大范围内的生长是差不多相当的。但是，在10mg/L的FAC浓度，可以观察到少量的铁锈色沉淀。在50和100mg/L时，能够观察到量更多的此种沉淀。就像Bertheussen所提醒的一样，这种沉淀被推测为氢氧化铁(Cytotechnology11：219-231，1993)。
图1b也表明了用夹心ELISA法测定的抗体滴度。与含有运铁蛋白的对照相比较，含有FAC的培养物能产生至少相等的，并且在大多数情况显著更多的抗体。在含FAC的培养物中获得的抗体滴度也表现出与FAC浓度的反比关系，例如含有0.4mg/L FAC的培养物比含有100mg/L FAC的培养物多产生超过30％的抗体。
实施例2：柠檬酸铁(FC)需要浓度比支持GS-NS0细胞系连续生长的FAC高出一个数量级
方法
实施例2的方法和实施例1相同，不同点在于螯合铁的来源。在本实施例中，使用柠檬酸铁(FC)来替代FAC。
在冷水中FC只能缓慢地溶解。为配制FC的贮存液，必须将FC溶解于保持在80℃的水中并搅拌长达2小时。配制贮存液的浓度为0.5mg/L(对于含有0.2-2mg/L FAC的培养瓶)和10mg/L(含有10-100mg/L FAC的培养瓶)。
结果
图2a说明在实验的FC浓度范围内，在传代培养和最终过度生长中的细胞浓度。此图表明阴性对照培养物和含有0.2mg/L FC的培养物不能在第一次传代培养后繁殖。含有0.4、1和2mg/L FC的培养物不能在第二次传代培养后繁殖。因此，对于所实验的浓度，需要FC的浓度为10mg/或者更高来支持经多次传代培养和在过度生长培养时的连续的细胞生长。
图2b显示了过度生长培养物的细胞计数和抗体产生数据。此图根据最大活细胞数和生长曲线下的面积表明，10mg/L或者更高的FC浓度可得到与含有运铁蛋白的对照相当的生长。对于FC，在含有10mg/L或更多的FC的培养基中能观察到铁锈色沉淀。
图2b也显示了用夹心ELISA法测定的抗体滴度。与含有运铁蛋白的对照相比，含FC的培养物能产生至少相等的，并在FC为10mg/L时显著更多的抗体。和用FAC的观察结果类似，最低浓度的FC产生最高的滴度。
此结果表明，为了支持与用运铁蛋白观察到的生长相当的细胞生长，需要FC的浓度比FAC高10倍。
实施例3：为得到在搅拌型悬浮培养中的连续细胞生长，杂交瘤细胞系需要高于GS-NS0细胞系超过两个数量级的FAC浓度
方法
实施例3的方法除了以下的内容以外和实施例1是一样的：
产生抗Myc抗体的小鼠杂交瘤细胞系(9E10)预先在补充了1mg/L人运铁蛋白和6mM谷氨酰胺的改进的CDSS中传代培养，然后以1×105细胞/ml的接种密度接种于实验培养瓶中。
此实验通过使用250ml的有密封盖的锥形瓶、在36.5℃和125rpm于往复式摇床上温育来进行。所述培养瓶一开始并且每隔两天充入5％二氧化碳/95％空气。
由于此杂交瘤细胞系不需要胆固醇，所以培养瓶中没有补充胆固醇脂质浓缩物。
每隔三天通过用新鲜培养基稀释到1×105细胞/ml来传代培养培养瓶内容物。第三次传代培养时，让培养瓶内容物过度生长。使用台盼兰排斥法来进行细胞计数。
结果
图3a显示在所实验的FAC浓度范围内，在传代培养和最终过度生长中的细胞浓度。此图显示阴性对照培养物和含有0.2和0.4mg/L FAC的培养物在第一次传代培养后不能增殖。含有1、2和10mg/L FAC的培养物在第二次传代培养后不能增殖。因此，对于所实验的浓度，需要FAC浓度为50mg/L或者更高来支持生长。
图3b显示了过度生长培养物的细胞计数。此图根据活细胞数最大值显示，需要100mg/L FAC来得到与含有运铁蛋白的对照相当的生长。但是，如果以生长曲线下面积的积分(通过接近直角梯形面积的总和来计算，或是累计细胞小时(cumulative cell hours，CCH)来考虑生长，50mg/L FAC可以得到和含运铁蛋白的对照相当的生长。柱状图清楚地显示了最大的CCH(图3c)。正如以前所观察到的，在含有50mg/L和100mg/L FAC的培养物中能观察到铁锈色的沉淀。
此结果显示对于搅拌型悬浮培养中的连续细胞生长，杂交瘤细胞系需要的FAC浓度比GS-NS0细胞高100倍以上。
实施例4：FAC是用在能支持细胞生长并产生高水平抗体滴度的丰富培养基中的有效铁源
实施例4进一步显示了FAC作为铁源的效用。在这个实施例中，FAC被用作称为GSF的完全不含血清的培养基(含牛血清白蛋白[BSA]作为唯一没有定义的组分)中的唯一铁源，本实施例使用了第二种产生抗体的重组GS-BS0细胞系(田胞系B)。
方法
将细胞预先培养在完全不含血清的培养基中，该培养基含有10μM环庚三烯酚酮(亲脂性的铁螯合剂[参考WO94/02592])和0.4mg/L FAC作为铁源，离心所述细胞并且重悬于不含环庚三烯酚酮和铁的GSF不含血清培养基中。用在此培养基中重悬的细胞接种实验培养瓶，接种密度为2×105细胞/ml。
此实验通过使用250ml的有密闭盖的锥形瓶(工作容量50ml)、在36.5℃和125rpm于往复式摇床上温育来进行。给培养瓶一开始并且每隔两天充入5％CO2/95％至气。
用1mg/ml的FAC贮存液向含有GSF(不含环庚三烯酚酮和铁)培养基的各个培养瓶补充至培养瓶含有的FAC终浓度为0.2、0.4、0.8、1.2、1.6和2mg/L。将所述贮存液在加入培养瓶之前过滤除菌。用含有补充了5μM环庚三烯酚酮和0.4mg/L FAC(之前显示与运铁蛋白相当)的培养基的培养瓶作为阳性对照。
所有的培养瓶都补充1ml/L的1000倍浓缩的胆固醇和脂肪酸补充物(CLOC)。
每隔五天通过用新鲜的培养基稀释到2×105细胞/ml来传代培养培养瓶。第二次传代培养时，让培养瓶过度生长至饱和。用台盼兰排斥法进行细胞计数。对比相应标准品，用分析型蛋白A高效液相层析(hplc)来作抗体滴度分析。
结果
图4显示了在实验的FAC浓度范围内，传代培养和最终过度生长时的细胞浓度。此图显示含有0.8mg/L及更高浓度的FAC的培养基能够支持与用阳性对照培养物观察的生长相当的生长。图4也显示了过度生长培养时的抗体产生。数据显示0.8mg/L及更高的FAC能支持至少和对照相当的抗体产生。抗体产生的趋势也和实施例1和2的结果非常类似。
此结果显示FAC用在能够支持细胞生长并产生高水平抗体滴度的丰富培养基中是有效的。
实施例5：含FAC作为铁源的培养基可以在一个缩小规模的生产体系中支持生长并产生抗体。
方法
细胞系B的发酵用含有5μM环庚三烯酚酮和0.4mg/L FAC(对照)、或含有1.0mg/L FAC的GSF不含血清培养基来进行。在7L(工作容量4.5L)的Applikon发酵罐中进行所述发酵，该发酵罐配有半球形的底部并用船用搅拌机(marine impeller)以150rpm搅拌。在36.5℃，pH 7.1进行所述发酵，并通空气/氧气使得溶解氧张力(dissolved oxygen tension)保持在15％。
这些发酵的接种物由与发酵所用的相同的培养基中细胞的传代培养来提供。
结果
图5显示在搅拌型通气的发酵容器中，使用补充了5μM环庚三烯酚酮/0.4mg/L FAC(对照)或1mg/L FAC的培养基会观察到相似的细胞生长和产生特性。
此结果证明了在一个缩小规模的生产体系中FAC作为铁源的有效性。
实施例6：FAC在不含蛋白的培养基中可以支持生长至高细胞密度并产生高滴度。
方法
用细胞系A的搅拌型通气分批发酵物(参考实施例1)，作GSF不含血清培养基(含有蛋白(BSA))和不含蛋白的GSF培养基的对比，这两种培养基中均含有1mg/ml FAC。向不含蛋白的发酵物补充2ml/L的胆固醇脂质浓缩物(参考实施例1)，向不含血清的发酵物补充1ml/L的CLOC补充物(参考实施例4)。发酵条件如实施例5所描述。这些发酵的接种物由与发酵所用的相同的培养基中细胞的传代培养来提供。
结果
图6显示了两种发酵中的生长和抗体产生。此图清楚地显示了FAC可以在这两种培养基中支持良好生长和抗体产生。
此结果说明了FAC在含蛋白(即不含血清)和不含蛋白的培养基中支持生长至高细胞密度和产生高滴度的能力。
实施例7：FAC在不含蛋白的培养基中能够支持生长至高细胞密度和产生高滴度
下面的例子说明了FAC可以用作实施例6的不含蛋白的培养基中的唯一铁源，并且这种补充了FAC的培养基针对一系列的GS-NSO细胞系在生产规模上可以支持生长至高细胞密度和产生高滴度。
方法
三种表达不同抗体的GS-NSO细胞系(细胞系C，D和E)在从液氮贮藏中复苏后直接转到实施例6的不含蛋白含FAC的培养基中。经过几次在不含蛋白含FAC的培养基中的传代培养后，这些培养物被用于接种小试(4.5L)或中试规模的分批发酵。这些分批发酵中使用的培养基和补料(feed)被最优化来提供高抗体滴度。
细胞系C在4.5和100L的规模中生长，细胞系D在4.5L的规模中生长，细胞系E在100L的规模中生长。
结果
图8显示了细胞系C在4.5L发酵中的生长和抗体产生。图8B显示了细胞系C在100L发酵中的生长和抗体产生。图9和10分别显示了细胞系D在4.5L和细胞系E在100L发酵中的生长和抗体产生。
这些图清楚显示了不含蛋白的FAC培养基支持宽范围的细胞系在生产规模的良好生长和抗体产生率。
这些结果证明了FAC在不含化学限定的蛋白和动物组分的培养基中支持宽范围的细胞系生长并产生抗体的能力。这对于抗体在人治疗用途中的应用很重要，因为它会消除引入来自于动物来源的化合物的外来感染因子的风险。
实施例8：使用FAC作为唯一的铁源时，NS0的生长能力不是因为被GS选择体系转染。
用表达人抗体并用G418选择体系选出的重组NS0小鼠骨髓瘤细胞系来评价FAC支持用GS选择体系替代物转染的NS0细胞生长的能力。
方法
在含有1mg/L运铁蛋白、0.1mg/L FAC和6mM谷氨酰胺的GSF不含血清培养基中培养的细胞，通过用含有1mg/L FAC、或1mg/L运铁蛋白和0.1mg/L FAC的新鲜的GSF不含血清培养基稀释到2×105来进行传代培养。5天以后，将培养瓶传代培养然后使其进入完全生长循环。所述实验通过用有密闭盖的摇瓶在往复式摇床上于36.5℃和125rpm温育来进行。所述培养瓶一开始并且每隔2天充入5％二氧化碳/95％空气。
结果
在两种培养基中观察到相当的生长，这表明FAC可以支持用替代选择体系转染的NS0细胞生长。
此结果显示使用FAC作为唯一铁源时，NS0的生长能力不是因为被GS选择体系转染。
实施例9：改进的CDSS培养基的制备
改进的CDSS培养基的制备如下：
对于1L的DMEM/F12(1∶1)(Gibco BRL.1x liquid cat.no.21331)，用磁力搅拌器来搅拌，下面的组分按照以下的顺序加入，小心保证每一种组分都在下一种组分加入前完全溶解。
○1g的Pluronic F-68(Sigma P-1300)
○50nM无水亚硒酸钠(Sigma S-5261)(来自25μM贮存液)
○2μM七水硫酸锌(Sigma Z-0251)(来自2mM贮存液)
○0.5ml Clevelands微量元素I(Cellgro 99-175)
○1ml Clevelands微量元素II(Cellgro 99-176)
○20μM乙醇胺(Sigma E-0135)
○40ml GS补充物(JRHBiosciences 58672)
○1.3g碳酸氢钠(BDH 102475W)
○3.6ml 2M盐酸(BDH 190675T)
仅对于谷氨酰胺依赖性的细胞系：
○0.88g谷氨酰胺(Sigma G-5763)
对于仅含运铁蛋白的对照培养基：
○0.1mg柠檬酸铁铵(BDH 271634K)(来自1M贮存液)
○1mg人运铁蛋白(Serologicals Proteins 82-349)
使所述培养基混合然后用0.2μm的膜过滤。
在培养基制备中(即伴随其他组分)或在所述培养基已经配制后，将可溶性的铁化合物如柠檬酸铁铵加入来自贮存液的上述培养基。

Claims (50)

1.体外培养骨髓瘤细胞系的方法，包含：
(a)将骨髓瘤细胞系接种于培养基中，所述的培养基能够支持所述的骨髓瘤细胞系生长并且含有培养基中的浓度从约0.03mg/L到约3.2mg/L的铁，其中所述的培养基不含有运铁蛋白、亲脂性螯合剂、合成的含氮螯合剂或亲脂性合成的含氮螯合剂；和
(b)在恰当的条件下并使用搅拌型悬浮培养来使所述接种的培养基生长。
2.权利要求1的方法，其中培养基中的铁浓度从约0.03mg/L到约2.4mg/L。
3.权利要求1的方法，其中培养基中的铁浓度从约0.064mg/L到约1.6mg/L。
4.权利要求1的方法，其中培养基中的铁浓度从约0.16mg/L到约0.32mg/L。
5.权利要求1的方法，其中所述铁的来源是可溶性铁化合物。
6.权利要求5的方法，其中所述可溶性铁化合物选自亚铁盐或铁盐或它们的简单螯合物。
7.权利要求6的方法，其中所述可溶性铁化合物选自硫酸亚铁、柠檬酸亚铁、柠檬酸铁或铁铵离子化合物。
8.权利要求7的方法，其中所述铁铵离子化合物选自柠檬酸铁铵、草酸铁铵、延胡索酸铁铵、苹果酸铁铵或琥珀酸铁铵。
9.权利要求7的方法，其中所述铁铵离子化合物是柠檬酸铁铵。
10.体外培养骨髓瘤细胞系的方法，包含：
(a)将骨髓瘤细胞系接种于培养基中，所述的培养基能够支持所述骨髓瘤细胞系的生长并且含有培养基中的浓度从约0.2mg/L到约20mg/L的柠檬酸铁铵，其中所述的培养基不含有运铁蛋白、亲脂性螯合剂、合成的含氮螯合剂或亲脂性合成的含氮螯合剂；和
(b)在恰当的条件下并使用搅拌型悬浮培养来使所述接种的培养基生长。
11.权利要求10的方法，其中所述柠檬酸铁铵在培养基中存在的浓度从约0.2mg/L到约15mg/L。
12.权利要求10的方法，其中所述柠檬酸铁铵在培养基中存在的浓度从约0.4mg/L到约10mg/L。
13.权利要求10的方法，其中所述柠檬酸铁铵在培养基中存在的浓度从约1mg/L到约2mg/L。
14.权利要求1或10的方法，其中所述培养基不含血清、不含蛋白、不含动物来源的或化学限定的组分。
15.权利要求1或10的方法，其中所述骨髓瘤细胞系选自NSO系列，P3系列，MOPC系列，MPC-11，J558L，K6H6/B5，45.6.TG1.7，Y0，Y3 HTK，RPMI8226或U266B1。
16.权利要求1或10的方法，其中所述骨髓瘤细胞系是NSO细胞系。
17.培养基用于支持骨髓瘤细胞系在搅拌型悬浮培养条件的体外生长的用途，其中所述培养基含有培养基中的浓度从约0.03mg/L到约3.2mg/L的铁，其中所述培养基不含运铁蛋白、亲脂性螯合剂、合成的含氮螯合剂或亲脂性合成的含氮螯合剂。
18.权利要求17的用途，其中培养基中的铁浓度从约0.03mg/L到约2.4mg/L。
19.权利要求17的用途，其中培养基中的铁浓度从约0.064mg/L到约1.6mg/L。
20.权利要求17的用途，其中培养基中的铁浓度从约0.16mg/L到约0.32mg/L。
21.权利要求17的用途，其中所述铁的来源是可溶性铁化合物。
22.权利要求21的用途，其中所述可溶性铁化合物选自亚铁盐或铁盐或它们的简单螯合物。
23.权利要求21所述的用途，其中所述可溶性铁化合物选自硫酸亚铁、柠檬酸亚铁、柠檬酸铁、或铁铵离子化合物。
24.权利要求21所述的用途，其中所述铁铵离子化合物选自柠檬酸铁铵、草酸铁铵、延胡索酸铁铵、苹果酸铁铵或琥珀酸铁铵。
25.权利要求24所述的用途，其中所述铁铵离子化合物是柠檬酸铁铵。
26.培养基用于支持骨髓瘤细胞系在搅拌型悬浮培养条件下的体外生长的用途，其中所述培养基含有培养基中的浓度从约0.2mg/L到约20mg/L的柠檬酸铁铵，其中所述的培养基不含运铁蛋白、亲脂性螯合剂、合成的含氮螯合剂或亲脂性合成的含氮螯合剂。
27.权利要求26的用途，其中所述柠檬酸铁铵在培养基中存在的浓度从约0.2mg/L到约15mg/L。
28.权利要求26的用途，其中所述柠檬酸铁铵在培养基中存在的浓度从约0.4mg/L到约10mg/L。
29.权利要求26的用途，其中所述柠檬酸铁铵在培养基中存在的浓度从约1mg/L到约2mg/L。
30.权利要求17或26的用途，其中所述培养基不含血清、不含蛋白、不含动物来源的或化学限定的组分。
31.权利要求17或26的用途，其中所述骨髓瘤细胞系选自NSO系列，P3系列，MOPC系列，MPC-11，J558L，K6H6/B5，45.6.TG1.7，Y0，Y3 HTK，RPMI8226或U266B1。
32.权利要求17或26的用途，其中所述骨髓瘤细胞系是NSO细胞系。
33.得到哺乳动物细胞产物的方法，其包含在搅拌型悬浮培养和能够支持所述骨髓瘤细胞系生长的培养基中培养能生产所述产物的骨髓瘤细胞，所述培养基含有培养基中的浓度从约0.03mg/L到约3.2mg/L的铁，其中所述的培养基不含运铁蛋白、亲脂性螯合剂、合成的含氮螯合剂或亲脂性合成的含氮螯合剂；和回收所述的哺乳动物细胞产物。
34.权利要求33的方法，其中所述培养基中的铁的浓度从约0.03mg/L到约2.4mg/L。
35.权利要求33的方法，其中所述培养基中的铁的浓度从约0.064mg/L到约1.6mg/L。
36.权利要求33的方法，其中所述培养基中的铁的浓度从约0.16mg/L到约0.32mg/L。
37.权利要求33的方法，其中所述铁的来源是可溶性铁化合物。
38.权利要求37的方法，其中所述可溶性铁化合物选自亚铁盐或铁盐或它们的简单螯合物。
39.权利要求37的方法，其中所述可溶性铁化合物选自硫酸亚铁、柠檬酸亚铁、柠檬酸铁、或铁铵离子化合物。
40.权利要求39的方法，其中所述铁铵离子化合物选自柠檬酸铁铵、草酸铁铵、延胡索酸铁铵、苹果酸铁铵或琥珀酸铁铵。
41.权利要求40的方法，其中所述铁铵离子化合物是柠檬酸铁铵。
42.得到哺乳动物细胞产物的方法，其包含在搅拌型悬浮培养和能够支持所述骨髓瘤细胞系的生长的培养基中培养能产生所述产物的骨髓瘤细胞，所述培养基含有培养基中的浓度从约0.2mg/L到约20mg/L的柠檬酸铁铵，其中所述培养基不含运铁蛋白、亲脂性螯合剂、合成的含氮螯合剂或亲脂性合成的含氮螯合剂；和回收所述哺乳动物细胞产物。
43.权利要求42的方法，其中所述柠檬酸铁铵在培养基中存在的浓度从约0.2mg/L到约15mg/L。
44.权利要求42的方法，其中所述柠檬酸铁铵在培养基中存在的浓度从约0.4mg/L到约10mg/L。
45.权利要求42的方法，其中所述柠檬酸铁铵在培养基中存在的浓度从约1mg/L到约2mg/L。
46.权利要求33或42的方法，其中所述培养基不含血清、不含蛋白、不含动物来源的或化学限定的组分。
47.权利要求33或42的方法，其中所述骨髓瘤细胞系选自NSO系列，P3系列，MOPC系列，MPC-11，J558L，K6H6/B5，45.6.TG1.7，Y0，Y3 HTK，RPMI8226或U266B1。
48.权利要求33或42的方法，其中所述骨髓瘤细胞系是NSO细胞系。
49.权利要求33或42的方法，其中所述细胞产物选自多肽、蛋白、激素、淋巴因子、白介素、或工业上和治疗上有用的酶。
50.权利要求49的方法，其中所述细胞产物是抗体或其片段。
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