CN1238498C - 动物细胞无血清悬浮培养工艺过程控制参数的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种动物细胞无血清悬浮培养生产重组蛋白治疗药物的工艺过程控制参数方法，该工艺采用流加浓缩的能源物质和氨基酸，结合灌流基础培养基的方法。过程控制参数主要针对特定细胞生长代谢需求，设定谷氨酰胺、葡萄糖、氨、乳酸的上/下限浓度指标，控制流加浓缩的谷氨酰胺、葡萄糖和氨基酸等营养物的速率，结合灌流无血清基础培养基降低代谢产物浓度的方法；采用氧气摄入率即时监测反应细胞生长状态；用计算机程控补料系统精确控制流加速率；该工艺特别适宜杂交瘤细胞的大规模培养生产治疗用抗体，具有稳定性好、可控性强、过程控制指标明确、可操作性强、批次间结果差异小，等特点。

Description

动物细胞无血清悬浮培养工艺过程控制参数的方法

                               技术领域

本发明属于生物工程技术领域的细胞工程技术，主要涉及动物细胞(杂交瘤、CHO、SP2/0、NSO等工程细胞)大规模培养，及生产重组蛋白治疗药物的工艺，具体涉及动物细胞无血清悬浮培养工艺过程控制参数的方法。

                               背景技术

动物细胞大规模培养已成为生物制药领域最重要的关键技术之一，并以其研究的深入和进展推动生物技术产业的迅速发展。目前工业化生产动物细胞表达重组蛋白治疗药物的主要方法是通过搅拌式细胞发酵罐，中空纤维或固定床式等生物反应器培养系统，在体外大规模高密度培养杂交瘤细胞、工程细胞(CHO、SP2/0、NSO)、昆虫细胞和微生物等，再通过相关的纯化手段浓缩纯化制备重组蛋白产品。

根据申请人所进行的资料检索，检索到和本发明相关的有以下参考文献：

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动物细胞培养无论是贴壁细胞还是悬浮细胞，就操作方式而言，主要分为分批式(batch)，流加式(fed-batch)和灌流式(perfusion)三种操作方式。当前被FDA批准的生物技术产品以及公开发表的生产工艺占有主流优势的是搅拌式生物反应器悬浮培养，工艺设计是流加或灌流培养。在工业化生产，悬浮培养工艺参数的放大原理和过程控制，比较其它培养系统较易理解和掌握，因此在规模化动物细胞培养生产中多选择悬浮细胞培养工艺^[1]。首先重组治疗药物，主要是重组蛋白或抗体，对产品应用最有代表性的需求是生产产量与质量，其生产形式至少70％是采用搅拌式生物反应器悬浮培养形式，50％以上采用无血清培养。

适用于悬浮培养的生产细胞有：杂交瘤、鼠骨髓瘤(SP2/0，NSO)，对适于贴壁培养的细胞(CHO，BHK，)可进行细胞生长形式的驯化。

悬浮培养方法的主要优点有：可连续收集部分细胞进行传代培养；传代时无需胰酶消化分散，免遭酶类、EDTA及机械损害；细胞收率高，并可在线连续直接监测细胞密度。对于大规模培养而言其操作简便，培养条件均一，传质和传氧较好，容易放大培养规模(3升至15000升)。主要缺点是由于细胞悬浮游离生长，生产中细胞培养体积较大，设备资金投入大，相对细胞密度较低。悬浮培养不适于包括二倍体细胞在内的正常组织细胞培养。悬浮培养过程依据使用培养模式的不同分为批式再灌注培养、流加补料培养和灌流培养三种。自1996年至2000年美国FDA批准的70％的重组治疗药物如重组蛋白或抗体均是用搅拌罐反应器悬浮培养生产^[2]。

无血清培养基和无血清培养成为当今细胞培养领域的一大趋势。采用无血清培养可降低生产成本，简化分离纯化步骤，避免病毒污染造成的危害。然而现有各种商业化的无血清培养基，对表达不同蛋白的细胞株适应性各不相同，缺乏广泛的通用性，应用时需针对每个细胞的生长代谢特性进行优化^[3]。

流加培养工艺是当前动物细胞培养工艺中占有主流优势的培养工艺，也是近年来动物细胞大规模培养研究的热点^[4]。在规模化的蛋白质生产中选择使用流加工艺(Fed-batch)的公司有，如美国的Genentech，IDEC，MedImmune，Merck等。此工艺具有操作简单、产率高、容易放大(10000升以上)等优点。流加培养工艺中的关键技术是基础培养基和流加浓缩营养培养基的设计。1996年谢良志博士运用化学计量法(Xie LZ)，根据动物细胞生长的需求，设计定量添加浓缩的培养液，控制葡萄糖、谷氨酰氨的浓度维持在一个低水平，以改变细胞代谢方式^[5]。在杂交瘤细胞流加培养周期超过550小时，比较一般流加工艺特异性乳酸生成率减少了4倍，特异性氨生成率减少了十倍，细胞密度5×10⁷/ml，峰值的活细胞密度大于1.5×10⁷/ml，抗体累积浓度为2.4g/L^[6]。

连续灌流培养工艺(perfusion)也是近年来用于动物细胞培养生产蛋白较为推崇的一种操作方式。连续灌流培养过程是将活细胞截留在反应器内，新鲜培养基连续不断的循环，有利于反应器中活细胞密度的提高，同时又可降低有害副产物的积累^[7]。此工艺对生产一些稳定性不好的产品则比较合适，具有反应体积小，回收体积大的特点，但操作较繁杂、产品浓度低、培养液利用效率低，应用连续灌流工艺的公司有Genzyme，GeneticInstitute，Bayer公司等。

流加工艺和连续灌流工艺的技术本身没有专利保护，但在某一特有技术上的有专利保护。如Takazawa等人^[8]，在1995年“蛋白分泌细胞的流加培养方法”(美国专利No.5,443,968)中，用流加培养人293细胞诱导产生基因表达蛋白的生产工艺，培养基是无血清培养基，权利要求主要是流加培养基的营养成分糖和钙离子，糖的浓度1-7g/L，钙离子的浓度是0.3-4.0Mm；另外，主要保护工艺中开始流加的时间、剩余浓度的范围等。Birch等人^[9]，在1997年“动物细胞培养”(美国专利No.5,672,502)专利中主要授权保护，动物细胞流加培养的主要营养组成包括一种或多种能源物质，葡萄糖浓度在1-10g/L，谷氨酰胺浓度在0.5-3g/；一种或多种必需和非必需氨基酸，另外还有复合维生素B等成分，细胞由对数生长期进入衰退期，细胞生产表达产品。Brown等人的“培养动物细胞的方法”(美国专利No.5,786,215)主要描述动物细胞培养的无气泡供气与氧气可通过膜的培养系统^[10]。Andersen等人2003年有关“细胞培养工艺”专利(美国专利No.6,610,516)，主要保护在无血清条件下培养表达核酸编码糖蛋白的CHO细胞，细胞在生长期培养温度在37℃，当细胞转入产物表达期，控制较低的培养温度在30℃-35℃，并加入0-2mM的丁酸盐，其工艺可增加糖蛋白表达糖基化位点的百分比，其糖基化形式没有改变^[11]。

由于动物细胞体外培养的复杂性，尤其在规模培养中如何确保细胞高密度生长，确保产品质量，以及培养工艺批次间的一致性是当前动物细胞生产重组蛋白的最为关注的问题^[12]。Mark A.Schenerman在人源化抗体(Synagis)放大生产过程中，用三个评价工艺参数(最大反应体积的群体倍增时间；低糖培养条件；回收后稳定时间)对工艺放大过程进行了相似性比较研究，以确认工艺放大与产品质量的一致性。结果显示在生物反应器逐级放大过程的早期，抗体表达存在着不同的糖基化形式；培养环境和条件的变化对细胞系的稳定性和抗体结构、活性滴度都没有影响^[13]。

对于搅拌的剪切损害可通过反应器的优化被减少，另外在培养液中添加剪切保护剂，Pluronic F68是使用最为广泛、研究最多的保护性多聚体，它可在细胞与气泡的接触面形成保护层，以减少动力学表面的张力。

但由于哺乳动物细胞体外培养的复杂性，常会出现细胞维持时间短、密度及活性低等问题，限制了细胞产品产量、质量的提高和生产成本的降低。

目前世界众多的研究领域将研究热点集中于动物细胞代谢调控、反应器操作模式和控制策略上，以实现细胞培养时间延长、细胞密度提高和细胞比生产率的提高。

动物细胞培养工艺中的营养成分主要分为三大类：

1)葡萄糖是细胞的供能物质和主要的碳源物质，然而当其浓度较高是会产生大量的代谢产物乳酸，因而需要进行其浓度控制，以足够维持细胞生长而不至于产生大量的副产物的浓度为佳；

2)谷氨酰胺是细胞的供能物质和主要的氮源物质，然而当其浓度较高是会产生大量的代谢产物氨，因而也需要进行其浓度控制，以足够维持细胞生长而不至于产生大量的副产物的浓度为佳；

3)氨基酸、维生素及其他。主要包括营养必需氨基酸、营养非必需氨基酸、一些特殊的氨基酸如羟脯氨酸、羧基谷氨酸和磷酸丝氨酸；此外还包括其他营养成分如胆碱、生长刺激因子。

动物细胞培养工艺中影响细胞生长代谢和产物量的关键参数：

1.营养物质的耗尽

动物细胞的生长需要数十种不同的营养物质，这些营养物质的消耗速率会随着细胞浓度的增加而增加，当细胞达到一定密度时，培养液中某些关键的营养物质将可能耗尽或降到很低的水平，此时将影响细胞的新陈代谢，造成细胞死亡。

2.有毒废物的积累

(1)乳酸(Lactate)

动物细胞在生长过程中会产生三种主要的新陈代谢副产物：乳酸，氨和二氧化碳。乳酸主要来自葡萄糖代谢，但也有部分来自其他氨基酸的代谢，如谷酰胺(glutamine)等。乳酸的产生会使培养液的pH值降低，另外由于一个葡萄糖分子可变成二个乳酸分子，而导致培养液中的渗透压(osmolarity)增高。乳酸积累本身也会对细胞的新陈代谢产生影响。

(2)氨

在细胞培养中，氨的主要来源是氨基酸的代谢，其中最主要的是谷酰胺(glutamine)。有研究表明，有高达80％的氨来自于谷酰胺的代谢，其中来自谷酰胺的酰基，30％来自谷酰胺的氨基(Nissim等1987)。在细胞培养中，氨产量和谷酰胺消耗量的摩尔比通常在0.5-1.5之间，氨的积累不仅能抑制细胞的生长速率，导致细胞死亡，并且对蛋白产物的糖基化形式产生影响。氨的积累通常是动物细胞培养工艺中影响细胞密度和产量的主要因素之一。

(3)二氧化碳

细胞培养中一个通常不被人们重视的副产物是二氧化碳，它是能量代谢中的副产物。二氧化碳极易溶于水，与水分子反应后形成碳酸，碳酸首先离解成一个氢离子和碳酸根，从而使培养液的pH值降低。当HCO₃ ^-的浓度达到一定值时，细胞的新陈代谢和生长会受到严重的影响。

                                    发明内容

针对上述现有技术存在的缺陷或不足，本发明的目的在于，提供一种动物细胞无血清悬浮培养工艺过程参数控制的方法，该方法在动物细胞培养工艺中采用流加和灌流相结合，根据动物细胞生长代谢的特点，流加浓缩的一种或多种能源物质和营养成分，结合灌流基础培养基，降低有害毒附产物。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是，一种动物细胞无血清悬浮培养工艺过程控制参数的方法，动物细胞包括杂交瘤或CHO或SP2/0或NSO工程细胞，这些细胞分泌表达重组蛋白治疗药物；培养工艺采用流加浓缩的能源物质和氨基酸，结合灌流基础培养基，降低有害毒附产物；其特征在于，包括以下步骤：

1)用机械搅拌式生物反应器无血清悬浮培养杂交瘤细胞，起始接种细胞密度为1×10⁵～3×10⁵细胞/ml；培养环境维持在温度36℃-37℃、pH值为6.5-7.4、搅拌速度40-80转/分、溶氧浓度即空气饱和度40％～80％；

2)培养过程参数主要采用针对特定细胞生长代谢需求，设定谷氨酰胺、葡萄糖、氨、乳酸的上/下限浓度指标，控制流加浓缩营养物中谷氨酰胺、葡萄糖和氨基酸的速率；

过程控制的参数包括：

a.无血清培养基起始谷氨酰胺的浓度为2.0～3.5mM；

b.无血清培养基起始葡萄糖的浓度为1.0～1.5g/L；

c.培养过程中，谷氨酰胺的最低下限为0.1～0.3mM；

d.培养过程中，葡萄糖的最低下限为0.25～0.5g/L；

e.培养过程中，氨离子的最高上限为2～4mM；

f.培养过程中，乳酸的最高上限为15～25mM；

g.培养过程中，通过氧气摄入率的变化，即时监测反应细胞生长状态；

a.培养过程细胞的氧气摄入率在qOUR＝0.10×10^-12-0.15×10^-12mol/细胞/h表示细胞生长状态良好，流加浓缩组分的速率、灌流速率以及培养环境适宜；

b.培养过程细胞的氧气摄入率在qOUR≤0.07×10^-12mol/细胞/h，表示细胞生长状态受到抑制；需改变流加速率或灌流速率，或调整培养环境如溶氧浓度、pH、搅拌速度、温度；

i.当培养液中谷氨酰胺、葡萄糖浓度低于下限时，开始流加浓缩营养物；当培养液中氨和乳酸的浓度高于上限时，开始灌流无血清基础培养基，灌流速率为0.3-1.0day^-1；

3)结合灌流无血清基础培养基；通过氧气摄入率(qOUR)的变化即时监测细胞生长状态；培养过程细胞由对数生长期进入平稳期并维持较长时间，其产物浓度逐渐升高，当细胞群体生长处于衰退期且产物浓度不再持续增加时停止培养。

本发明的其它一些特点是，所述流加浓缩营养物为葡萄糖10-20g/L、谷氨酰胺20-40mM，氨基酸为营养必需氨基酸和营养非必需氨基酸；包括颉氨酸0.4-1.0g/L、蛋氨酸0.4-1.0g/L、异亮氨酸0.5-1.5g/L、亮氨酸1.0-2.0g/L，组氨酸0.5-2.0g/L，脯氨酸0.04-0.1g/L，苯丙氨酸0.05-1.5g/L，精氨酸0.1-0.5g/L，半胱氨酸0.04-1.0g/L，络氨酸0.04-1.0g/L，流加速率为0.04-0.12day^-1。

所述控制流加营养物的速率采用计算机程控补料系统。

所述配制流加浓缩营养物用基础培养基为无血清培养基。

所述培养反应器中流加浓缩营养物后，细胞密度比接种细胞密度增长5倍以上，达到5×10⁵细胞/ml～3×10⁶细胞/ml。培养反应器中灌流无血清培养基，细胞密度达到1.5×10⁶～3×10⁷细胞/ml。

本发明特别适宜杂交瘤细胞培养生产单克隆抗体，具有稳定性好、可控性强、过程控制指标明确、可操作性强、批次间结果差异小，等特点。

本发明首次应用了控制过程参数的方法，设定谷氨酰胺、葡萄糖、氨、乳酸的上/下限浓度指标，以此标准控制流加浓缩的谷氨酰胺、葡萄糖和氨基酸的速率，结合灌流无血清基础培养基以降低毒附产物的积累。

                                附图说明

图1是杂交瘤细胞无血清悬浮培养工艺流程图；

图2是细胞增殖活性与抗体分泌量图；

图3是无血清悬浮培养工艺中氨基酸的变化图；

图4是在一般无血清悬浮灌流培养中氨基酸的代谢情况示意图；

图5是无血清悬浮培养工艺与一般无血清悬浮灌流工艺比较抗体分泌量示意图；

图6是无血清悬浮培养工艺中氨与细胞生长的关系示意图；

图7是文艺血清悬浮培养工艺中乳酸与细胞生长的关系示意图；

图8是细胞活性与细胞氧气摄入率及比氧气摄入率的关系示意图；

图9是HAb181(1)增殖活性与抗体分泌量图；

图10是HAb181(2)增殖活性与抗体分泌量图；

图11是HAb181(3)增殖活性与抗体分泌量图。

                              具体实施方式

以下结合附图和发明人给出的具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。

依照本发明的技术方案，申请人采用杂交瘤细胞HAb18，该细胞是经新鲜人肝癌组织细胞免疫的BALB/c小鼠，取其免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，获得HAb18杂交瘤细胞，该细胞系能稳定高效表达抗人肝癌相关抗原的单克隆抗体(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心保藏，保藏号：CGMCC No 0426)。

用机械搅拌式生物反应器，大规模高密度悬浮培养杂交瘤细胞；用扩张柱床技术一步回收纯化大规模细胞培养液中的单克隆抗体，对初步分离纯化的单克隆抗体IgG进行酶切处理，得到的F(ab’)₂片段抗体，再用Phenyl-sepharose HP疏水柱精纯后冻干，制成Hab18F(ab’)₂肝癌片段抗体半成品；由Hab18F(ab’)₂半成品、NBS氧化剂、PBS缓冲液和人血清白蛋白BSA组成试剂盒；临用前标记上碘[¹³¹I]放射性核素，制成¹³¹I-HAb18F(ab’)₂肝癌片段抗体注射液(其工艺流程参见图1)。

本发明的工艺用机械搅拌式生物反应器无血清高密度悬浮培养杂交瘤细胞。工艺过程主要分以下几步：

1.种子细胞株复苏，首先用T-Flask培养，逐渐适应无血清培养7-14天；

2.接种1L悬浮搅拌培养瓶，悬浮搅拌驯化培养10-20天后；

3.接种细胞罐无血清悬浮培养，培养过程参照质量控制标准，根据需要细胞生长代谢的需要，流加浓缩的营养物结合灌流基础培养基，使细胞持续增长，达到高细胞密度和高产物量；

4.工艺放大接种30L细胞反应罐；

5.用扩张柱床Streamline技术一步回收纯化培养液中的单克隆抗体。

一、生物反应器

(1)1升悬浮搅拌培养瓶-Superspinner(B.Braun Biotech德国)，磁力搅拌无气泡供气系统，用于杂交瘤细胞悬浮培养种子细胞的制备。

(2)5升细胞发酵罐(B.Braun Biotech德国)，无气泡供气系统，Spinfilter B5，10um细胞连续旋转过滤器，温度、pH、搅拌、溶氧PID全自动控制，四气混合控制供气系统，溶氧双参数关联，程序设定控制补料、回收液流速。用于杂交瘤细胞连续悬浮培养。

(3)30升细胞发酵罐BIOSTATC 20(B.Braun Biotech德国)，冷热循环蒸气控温系统，四气混合控制供气系统，蒸气灭菌系统，压力测定系统，分散顶部通气系统，温度、pH、搅拌、溶氧PID全自动控制，溶氧双参数关联，程序设定控制补料、回收液流速。用于杂交瘤细胞连续悬浮培养的放大。

二、培养用液的配制

(1)基础培养基：杂交瘤细胞无血清培养基HyQ-CCM1，不含葡萄糖和谷氨酰胺(HyClone公司，Cat No：SH30058.03)；

(2)浓缩培养基：称取葡萄糖10g/L、谷氨酰胺20mM，亮氨酸0.5-1.0g，蛋氨酸0.2-0.4g，异亮氨酸0.3-0.6g，颉氨酸0.2-0.6g，组氨酸0.5-1.0g/L，脯氨酸0.04-0.06g/L，苯丙氨酸0.04-0.08g/L，半胱氨酸0.03-0.06g/L；

三、细胞的复苏与传代：

(1)从生产细胞库取出HAb18杂交瘤细胞(细胞株经检定合格)，置37℃水浴中迅速溶化，移入37℃预热的CCM1无血清培养液中，1000rpm离心8分钟，弃上清，细胞沉淀加入含1％胎牛血清的CCM1无血清培养液，置5％二氧化碳，37℃孵箱培养，观察细胞生长状态；

(2)2-3天后更换含0.5％胎牛血清的CCM1无血清培养液扩增培养；

(3)逐渐过度到完全无血清的CCM1培养基培养3-5天后，扩大置1L搅拌瓶培养；

四、杂交瘤细胞大规模培养

1.悬浮搅拌瓶培养

(1)HAb18杂交瘤细胞无血清培养方瓶培养；

(2)细胞生长在对数生长期，计数细胞密度在1×10⁵-4×10⁵细胞/ml，活性率大于90％，接种1L的悬浮培养搅拌瓶(Superspinner)无血清培养；

(3)1L的悬浮培养搅拌瓶，放置37℃、5％CO₂孵箱磁力搅拌培养，50rpm，无气泡供气连续培养，每天半量换液；

2.细胞发酵罐培养

(一)培养方法

(1)按规程完成生物反应器的安装、校准和灭菌消毒，放置反应器于操作台，连接搅拌电机、pH电极导线、溶氧电极导线、测温探头、硷液瓶、收液瓶、补加培养液瓶、取样管和细胞接种管等，检查无误后，开机；

(2)将罐内的无离子水吸出，加入CCM1无血清培养基约3L，将温度、搅拌速度、pH、溶氧等各项参数按具体要求设置，开机运行24-48小时，观察有无异常情况；

(3)接种细胞，罐内细胞密度为2×10⁵-5×10⁵细胞/ml，活性大于90％，体积3-5L。细胞接种时边接种边搅拌，使细胞均匀混合，当细胞密度生长≥1×10⁵细胞/ml，流加浓缩的培养基。

特别值得注意的是，接种细胞密度和细胞活性对后期培养非常重要；

(4)反应条件：温度37℃，pH7.2～7.4，溶氧40～60％，搅拌速度35～60rpm；

(5)气体系统：采用无气泡供气系统，或微气泡供气系统，空气、氧气、氮气和二氧化碳四气比例、积分、微分(PID：Proportion-Integral-Differential)控制系统；

(6)细胞截流装置：采用细胞截留搅拌装置，细胞截留网孔径10-40微米；该装置可用内置型或外置型，在大于30L的细胞罐可用外置型；

(7)每12小时取样测定死活细胞数、葡萄糖浓度、谷酰胺浓度；每24小时测定乳酸和氨的浓度和抗体浓度，

(8)根据细胞生长、代谢的各种参数变化，调整其灌流进出量、流加浓缩液的量、搅拌速度和溶氧等参数。

(二)结果

1.细胞的增殖活性与抗体分泌量

由图2可知，杂交瘤细胞在无血清悬浮培养工艺中，细胞能够在较长时间保持旺盛的增殖趋势，在培养第五天活细胞密度已达到1×10⁷细胞/ml，活性大于80；抗体分泌量在175-260mg/ml之间。

2.无血清悬浮培养工艺中氨基酸的变化情况

A.由图3可知，在无血清悬浮培养工艺中，根据细胞生长代谢情况流加浓缩的氨基酸和营养物，几种代表性的氨基酸代谢处于较平稳趋势。

B.由图4可知，在一般的无血清悬浮灌流培养工艺中，培养液中氨基酸的代谢非常快，特别是一些必需氨基酸成整体下降趋势，不能满足杂交瘤细胞生长和抗体合成的需要。

C.由图5可知，流加浓缩营养液结合灌流的方法，与一般的无血清悬浮灌流培养比较，杂交瘤细胞生长和抗体分泌情况有很大不同，抗体产量可提高4-5倍。

3.无血清悬浮培养工艺中细胞增殖活性与代谢产物-氨和乳酸生成浓度的关系

由图6、7可以看出，在无血清悬浮培养工艺中，根据细胞生长代谢情况灌流基础培养基，可有效降低副产物浓度，氨离子的浓度一直维持在2mmol/ml以下，乳酸浓度维持在7mmol/ml以下，总细胞数成持续增长趋势，活性率大于70％。

4.细胞活性与培养过程的氧气摄入率(OUR)及比氧气摄入率(qOUR)有较好的相关性。

由图8可以看出，OUR与活细胞密度呈现出非常好的相关关系，可准确地反映出细胞的生长状态。

经计算，HAb18(1)qOUR平均值为0.0939±0.036×10^-12mol/细胞/h，与批次间的值基本一致，如HAb18(2)qOUR＝0.103±0.028×10^-12mol/细胞/h，HAb18(3)qOUR＝0.0975±0.048×10^-12mol/细胞/h。说明此参数已可以作为常数写入数学控制模型加以应用。

5.无血清悬浮培养工艺有明确的质量控制标准，可操作性强，批次间的差异小。

从图9、图10、图11的三批次结果可以看出，用同样的方法，批次间细胞的增殖活性与抗体分泌的趋势非常相似。

Claims (5)

1.一种动物细胞无血清悬浮培养工艺过程控制参数的方法，动物细胞包括杂交瘤或CHO或SP2/0或NSO工程细胞，这些细胞分泌表达重组蛋白治疗药物；培养工艺控制流加浓缩的谷氨酰胺、葡萄糖和氨基酸等营养物的速率，结合灌流无血清基础培养基，降低有害毒附产物的浓度；其特征在于，包括以下步骤：

1)用机械搅拌式生物反应器无血清悬浮培养动物细胞，起始接种细胞密度为1×10⁵～3×10⁵细胞/ml；培养环境维持在温度36℃-37℃，pH值为6.5-7.4，搅拌速度40-80转/分、溶氧浓度40％～80％；

2)培养过程中的参数主要针对特定细胞生长代谢需求，设定谷氨酰胺、葡萄糖、氨、乳酸的上/下限浓度指标，控制流加浓缩的谷氨酰胺、葡萄糖和氨基酸等营养物的速率；

过程控制的参数包括：

a.无血清培养基起始谷氨酰胺的浓度为2.0～3.5mM；

b.无血清培养基起始葡萄糖的浓度为1.0～1.5g/L；

c.培养过程中，谷氨酰胺的最低下限为0.1～0.3mM；

d.培养过程中，葡萄糖的最低下限为0.25～0.5g/L；

e.培养过程中，氨离子的最高上限为2～4mM；

f.培养过程中，乳酸的最高上限为15～25mM；

g.培养过程中，通过氧气摄入率的变化，即时监测反应细胞生长状态；

h.培养过程细胞的氧气摄入率在0.10×10^-12～0.15×10^-12mol/细胞/h；当该值小于0.07×10^-12mol/细胞/h，需改变流加速率或灌流速率，或调整培养环境；

i.当培养液中谷氨酰胺、葡萄糖浓度低于下限时，开始流加浓缩营养物；当培养液中氨和乳酸的浓度高于上限时，开始灌流无血清基础培养基，灌流速率为0.3-1.0day¹；

3)培养过程细胞由对数生长期进入平稳期并维持较长时间，其产物浓度逐渐升高，当细胞群体生长处于衰退期且产物浓度不再持续增加时停止培养。

2.如权利要求1所述的动物细胞无血清悬浮培养工艺过程控制参数的方法，其特征在于，所述流加浓缩营养物为葡萄糖10-20g/L、谷氨酰胺20-40mM，氨基酸为必需氨基酸和非必需氨基酸；包括颉氨酸0.4-1.0g/L、蛋氨酸0.4-1.0g/L、异亮氨酸0.5-1.5g/L、亮氨酸1.0-2.0g/L，组氨酸0.5-2.0g/L，脯氨酸0.04-0.1g/L，苯丙氨酸0.05-1.5g/L，精氨酸0.1-0.5g/L，半胱氨酸0.04-1.0g/L，络氨酸0.04-1.0g/L，流加速率为0.04-0.12day^-1。

3.如利要求1所述的动物细胞无血清悬浮培养工艺过程控制参数的方法，其特征在于，所述控制流加营养物的速率采用计算机程控补料系统。

4.如利要求1所述的动物细胞无血清悬浮培养工艺过程控制参数的方法，其特征在于，所述配制流加浓缩营养物用基础培养基和灌流用基础培养基均为无血清培养基。

5.如利要求1所述的动物细胞无血清悬浮培养工艺过程控制参数的方法，其特征在于，所述培养反应器中流加浓缩营养物后，细胞密度比接种细胞密度增长5倍以上，达到5×10⁵细胞/ml～3×10⁶细胞/ml；培养反应器中结合灌流无血清培养基后，细胞密度可达到1.5×10⁶～3×10⁷细胞/ml。

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