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CN110461416B - 用于治疗癌症的环状二核苷酸化合物 - Google Patents

用于治疗癌症的环状二核苷酸化合物 Download PDF

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CN110461416B
CN110461416B CN201880021349.XA CN201880021349A CN110461416B CN 110461416 B CN110461416 B CN 110461416B CN 201880021349 A CN201880021349 A CN 201880021349A CN 110461416 B CN110461416 B CN 110461416B
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方家范
远藤笃史
崔亨旭
郝鸣鸿
鲍幸峰
黄冠群
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Abstract

本文提供可用于治疗癌症的化合物。

Description

用于治疗癌症的环状二核苷酸化合物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年2月17日提交的美国临时专利申请号62/460,562、于2017年3月30日提交的美国临时专利申请号62/479,169、于2017年8月29日提交的美国临时专利申请号62/551,645、于2017年8月29日提交的美国临时专利申请号62/551,647以及于2017年8月29日提交的美国临时专利申请号62/551,668的权益。这些申请全部如同完全重写一样以引用方式并入本文。
背景技术
STING(干扰素基因刺激物)是细胞溶质中对dsDNA的先天反应中的信号传导分子。已在多种人癌症中报道STING缺失。另外，还已经在黑色素瘤(Xia T等，“黑色素瘤中的STING信号传导的反复性丢失与对病毒性溶瘤的易感性相关(Recurrent Loss of STINGSignaling in Melanoma Correlates with Susceptibility to Viral Oncolysis)”，Cancer Res.2016)和结肠癌(Xia T等，“结直肠癌中STING信号的失调限制DNA损伤反应且与肿瘤发生相关(Deregulation of STING Signaling in Colorectal CarcinomaConstrains DNA Damage Responses and Correlates With Tumorigenesis)”CellRep.2016；14:282-97)中报道人癌症中STING信号传导的失调。有趣的是，在那些研究中，基因组分析结果显示STING的损失表达不是由于基因缺失或突变，而是通过表观遗传改变(Xia,Cancer Res.2016；Xia,Cell Rep.2016)。从小鼠模型研究获得的证据也支持STING的癌症保护活性。STING敲除小鼠已显示有缺陷的肿瘤控制(Woo SR等，“STING依赖性细胞溶质DNA传感介导免疫原性肿瘤的先天免疫识别(STING-dependent cytosolic DNAsensingmediates innate immune recognition of immunogenic tumors)”Immunity 2014；41:830-42)。
另外，STING在保护个体发生中的作用已在几个小鼠自发模型中得到证实，包括神经胶质瘤(Ohkuri T等，“STING针对神经胶质瘤发生的保护作用：STING激动剂在抗神经胶质瘤免疫疗法中的合理用途”Oncoimmunology.2015；4:e999523)和结肠癌(Zhu Q等，“最前沿：STING通过控制肠道炎症的量级来介导针对结直肠肿瘤发生的保护(Cutting edge:STING mediates protection against colorectal tumorigenesis by governing themagnitude of intestinal inflammation)”，J.Immunol.2014；193:4779-82)。这种抗肿瘤作用可归因于其抵抗NF-kB和STAT3过度活化的能力(Okihuri 2015)。STING途径的活化还在临床前小鼠肿瘤模型中显示有效活性(Woo 2014；Chandra D等，“STING配体c-di-GMP改善针对转移性乳腺癌的癌症疫苗接种(STING ligand c-di-GMP improves cancervaccination against metastatic breast cancer)”Cancer Immunol Res.2014；2:901-10；Corrales L等，“在肿瘤微环境中直接活化STING导致有效和系统性的肿瘤消退和免疫(Direct Activation of STING in the Tumor Microenvironment Leads to Potent andSystemic Tumor Regression and Immunity)”Cell Rep.2015；11:1018-30；Curran E等，“STING途径活化刺激对急性髓性白血病的有效免疫(STING Pathway ActivationStimulates Potent Immunity against Acute Myeloid Leukemia)”Cell Rep.2016；15:2357-66；Tang CH等，“激动剂介导的STING活化诱导恶性B细胞的凋亡(Agonist-MediatedActivation of STING Induces Apoptosis in Malignant B Cells)”Cancer Res.2016；76:2137-52)。这种抗肿瘤活性可能归因于肿瘤血管系统的破坏以及随后适应性免疫应答的诱导(Corrales L，等，“癌症和免疫界面处的宿主STING途径(The host STING pathwayat the interface of cancer and immunity)”J.Clin.Invest.2016；126:2404-11)。因此，通过激动剂直接刺激肿瘤微环境中的STING可代表用于治疗多种癌症类型的新型方法。
发明内容
实施方案可提供式(I)化合物或其药学上可接受的盐：
(其中P1是左下磷且P2是右上磷，如上所绘示)，其具有如下表1中所示的取代基和立体化学结构。指示单键或双键。
当磷原子具有四个不同的取代基时，该磷原子将是立体中心。SpSp/RpRp/SpRp/RpSp是指如所示的磷立体化学结构。
表1
实施方案可进一步提供式(II)化合物或其药学上可接受的盐：
其具有如下表2中所示的取代基和立体化学结构。当磷原子具有四个不同的取代基时，该磷原子将是立体中心。
表2
实施方案可提供式(III)化合物：
或其药学上可接受的盐，其中
R1a选自由-H、-OH和-F组成的组；
R1b选自由-H、-OH和-F组成的组，其中R1a和R1b中的至少一个为-H；
R4a选自由-H、-OH和-F组成的组；
R4b选自由-H、-OH和-F组成的组，其中R4a和R4b中的至少一个为-H；
P1和P2各自独立地具有S或R立体化学构型；
Z是-O-或-NH-；
X1a和X2a相同或不同并且独立地选自＝O或＝S；
X1b和X2b相同或不同并且独立地选自-OR5和-SR5；
其中R5选自由-H、C1-6烷基、-C(O)C1-6烷基和-CH2OC(O)OC1-6烷基组成的组；
式(III)中的L1长度为四个、五个或六个碳，并且是
其中指示单键、双键或三键，并且其中(i)L1中出现0次或1次的指示三键，或(ii)L1中出现0次、1次或2次的指示双键，其中关于每个双键的几何结构为顺式或反式；并且(iii)其中当L1中出现1次的指示三键时，L1中出现0次的指示双键；并且(iv)其中，当L1中出现2次的表示双键时，那些双键为相邻键或交替键；
其中X10、X11、X12、X13、X14和X15独立地选自键、-CH2-或-CH-，其中所述-CH2-或-CH-未被取代或被(i)-OH、(ii)-F、(iii)-Cl、(iv)-NH2或(v)-D取代，并且当X10或X15为键时，该键不是双键或三键；
并且其中包括X10、X11、X12、X13、X14和X15的组中任两个相邻的成员可任选地与另外的原子形成C3环烷基或C3杂环烷基，所述C3杂环烷基包含N或O原子；
其中B1和B2独立地选自：
其中B1和B2上的点q和r处的键附接于式(III)上的点q和r处。
在L1包含三键或超过一个双键的一些实施方案中，L1可以是例如
实施方案还可提供式(III)化合物：
或其药学上可接受的盐，其中
R1a选自由-H和-F组成的组；
R1b选自由-H和-F组成的组，其中R1a和R1b可以不都是-F；
R4a选自由-H和-F组成的组；
R4b选自由-H和-F组成的组，其中R4a和R4b可以不都是-F；
P1和P2各自独立地具有S或R立体化学构型；
X1a和X2a相同或不同并且独立地选自＝O或＝S；
X1b和X2b相同或不同并且独立地选自-OR5和-SR5；
其中R5选自由-H、C1-6烷基和-C(O)C1-6烷基组成的组；
式(III)中的L1长度是四个或五个碳，并且是
其中指示单键或双键，并且其中(i)L1中出现0次或1次的指示双键，其中关于所述双键的几何结构为顺式或反式；
其中X10和X14独立地选自键、-CH-或-CH2-，并且其中，当X10或X14是键时，该键不为双键；
其中B1和B2独立地选自：
其中B1和B2上的点q和r处的键附接于式(III)上的点q和r处。
实施方案可提供式(IV)化合物：
或其药学上可接受的盐，其中
R1a选自由-H、-OH和-F组成的组；
R1b选自由-H、-OH和-F组成的组，其中R1a和R1b中的至少一个为-H；
R4a选自由-H、-OH和-F组成的组；
R4b选自由-H、-OH和-F组成的组，其中R4a和R4b中的至少一个为-H；
P1和P2各自独立地具有S或R立体化学构型；
X1a和X2a相同或不同并且独立地选自＝O或＝S；
X1b和X2b相同或不同并且独立地选自-OR5和-SR5；
其中R5选自由-H、C1-6烷基、-C(O)C1-6烷基和-CH2OC(O)OC1-6烷基组成的组；
式(IV)中的L1长度是四个、五个或六个碳，并且是
其中指示单键、双键或三键，并且其中(i)L1中出现0次或1次的指示三键，或(ii)L1中出现0次、1次或2次的指示双键，其中关于每个双键的几何结构为顺式或反式；并且(iii)其中当L1中出现1次的指示三键时，L1中出现0次的指示双键；并且(iv)其中，当L1中出现2次的表示双键时，那些双键为相邻键或交替键；
其中X10、X11、X12、X13、X14和X15独立地选自键、-CH2-或-CH-，其中所述-CH2-或-CH-未被取代或被(i)-OH、(ii)-F、(iii)-Cl、(iv)-NH2或(v)-D取代，并且当X10或X15为键时，该键不是双键或三键；
并且其中包括X10、X11、X12、X13、X14和X15的组中任两个相邻的成员可任选地与另外的原子形成C3环烷基或C3杂环烷基，所述C3杂环烷基包含N或O原子；
其中B1和B2独立地选自：
其中B1和B2上的点q和r处的键附接于式(IV)上的点q和r处。
实施方案还可提供式(IV)化合物：
或其药学上可接受的盐，其中
R1a选自由-H和-F组成的组；
R1b选自由-H和-F组成的组，其中R1a和R1b可以不都是-F；
R4a选自由-H和-F组成的组；
R4b选自由-H和-F组成的组，其中R4a和R4b可以不都是-F；
P1和P2各自独立地具有S或R立体化学构型；
X1a和X2a相同或不同并且独立地选自＝O或＝S；
X1b和X2b相同或不同并且独立地选自-OR5和-SR5；
其中R5选自由-H、C1-6烷基和-C(O)C1-6烷基组成的组；
式(IV)中的L1长度是四个或五个碳，并且是
其中指示单键或双键，并且其中(i)L1中出现0次或1次的指示双键，其中关于所述双键的几何结构为顺式或反式；
其中X10和X14独立地选自键、-CH-或-CH2-，并且其中，当X10或X14是键时，该键不为双键；
其中B1和B2独立地选自：
其中B1和B2上的点q和r处的键附接于式(IV)上的点q和r处。
实施方案可提供式(V)化合物：
或其药学上可接受的盐，其中
R1a选自由-H、-OH和-F组成的组；
R1b选自由-H、-OH和-F组成的组，其中R1a和R1b中的至少一个为-H；
R4a选自由-H、-OH和-F组成的组；
R4b选自由-H、-OH和-F组成的组，并且其中R4a和R4b中的至少一个为-H；
P1和P2各自独立地具有S或R立体化学构型；
X1a和X2a相同或不同并且独立地选自＝O或＝S；
X1b和X2b相同或不同并且独立地选自-OR5和-SR5；
其中R5选自由-H、C1-6烷基、-C(O)C1-6烷基和-CH2OC(O)OC1-6烷基组成的组；
式(V)中的L1长度是四个、五个或六个碳，并且是
其中指示单键、双键或三键，并且其中(i)L1中出现0次或1次的指示三键，或(ii)L1中出现0次、1次或2次的指示双键，其中关于每个双键的几何结构为顺式或反式；并且(iii)其中当L1中出现1次的指示三键时，L1中出现0次的指示双键；并且(iv)其中，当L1中出现2次的表示双键时，那些双键为相邻键或交替键；
其中X10、X11、X12、X13、X14和X15独立地选自键、-CH2-或-CH-，其中所述-CH2-或-CH-未被取代或被(i)-OH、(ii)-F、(iii)-Cl、(iv)-NH2或(v)-D取代，并且当X10或X15为键时，该键不是双键或三键；
并且其中包括X10、X11、X12、X13、X14和X15的组中任两个相邻的成员可任选地与另外的原子形成C3环烷基或C3杂环烷基，所述C3杂环烷基包含N或O原子；
其中B1和B2独立地选自：
其中B1和B2上的点q和r处的键附接于式(V)上的点q和r处。
实施方案还可提供式(V)化合物：
或其药学上可接受的盐，其中
R1a选自由-H和-F组成的组；
R1b选自由-H和-F组成的组，其中R1a和R1b可以不都是-F；
R4a选自由-H和-F组成的组；
R4b选自由-H和-F组成的组，其中R4a和R4b可以不都是-F；
P1和P2各自独立地具有S或R立体化学构型；
X1a和X2a相同或不同并且独立地选自＝O或＝S；
X1b和X2b相同或不同并且独立地选自-OR5和-SR5；
其中R5选自由-H、C1-6烷基和-C(O)C1-6烷基组成的组；
式(V)中的L1长度是四个或五个碳，并且是
其中指示单键或双键，并且其中(i)L1中出现0次或1次的指示双键，其中关于所述双键的几何结构为顺式或反式；
其中X10和X14独立地选自键、-CH-或-CH2-，并且其中，当X10或X14是键时，该键不为双键；
其中B1和B2独立地选自：
其中B1和B2上的点q和r处的键附接于式(V)上的点q和r处。
在如上式中所报告的化合物和/或盐的一些实施方案中，(i)P1和P2的立体化学构型均为R，P1的立体化学构型为R且P2为S，或P1的立体化学构型为S且P2为R；(ii)在L1中出现一次的指示双键，其中关于双键的几何结构为反式；并且(iii)Z为-O-。
如上式中所报告的化合物和/或盐的其他实施方案可在本文的其他方面发现。例如，一些实施方案提供化合物或药学上可接受的盐，其中R1a和R4a各自为-F。在一些实施方案中，R1b和R4b各自为–F。在一些实施方案中，B1和B2各自为在一些实施方案中，X1a和X2a均为＝O，并且X1b和X2b均为–SH。在一些实施方案中，L1是
在一些实施方案中，接头是四个碳长。在一些实施方案中，接头是五个碳长。
一些实施方案提供选自由以下组成的组的化合物：
或其药学上可接受的盐。
实施方案可提供具有以下中的一种或多种的化合物或药学上可接受的盐：(i)表达STING HAQ遗传变体的细胞报告子测定中低于100微摩尔的EC50值；(ii)表达人STING AQ变体的报告细胞中低于100微摩尔的EC50值；(iii)表达人STING WT变体的报告细胞中低于100微摩尔的EC50值；和(iv)表达人STING REF变体的报告细胞中低于100微摩尔的EC50值。一个实施方案提供具有以下结构的化合物：
或其药学上可接受的盐。
另外的实施方案可提供本文所报告的化合物的药学上可接受的盐，其中所述盐是二铵盐。另外的实施方案可提供本文报告为三乙胺(TEA)盐的化合物。另外的实施方案可提供包含如本文所报告的化合物或盐和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
实施方案可提供治疗癌症的方法，其包括向患者施用如本文所报告的化合物、药学上可接受的盐或药物组合物。
如本文所报告的化合物或其药学上可接受的盐用于制备用于治疗癌症的药物组合物的用途。
实施方案可提供本文所报告的化合物、药学上可接受的盐或药物组合物在治疗癌症中的用途。
实施方案可提供治疗癌症的方法，其包括鉴别患有通过本文所报告的化合物、药学上可接受的盐或药物组合物可治疗的癌症的个体；和向所述个体施用药学有效量的所述化合物、药学上可接受的盐或药物组合物，所述癌症已被鉴别为通过所述化合物、药学上可接受的盐或药物组合物能治疗的。
在一些实施方案中，通过在患者中存在REF STING变体等位基因，将个体鉴别为患有通过本文所报告的化合物、药学上可接受的盐或药物组合物可治疗的癌症。
一些实施方案提供治疗具有REF STING等位基因的患者的癌症的方法，其包括向所述患者施用如本文所报告的化合物、药学上可接受的盐或药物组合物。
一些实施方案提供治疗具有WT STING等位基因的患者的癌症的方法，其包括向所述患者施用如本文所报告的化合物、药学上可接受的盐或药物组合物。
一些实施方案提供治疗具有AQ STING等位基因的患者的癌症的方法，其包括向所述患者施用如本文所报告的化合物、药学上可接受的盐或药物组合物。
一些实施方案提供治疗具有HAQ STING等位基因的患者的癌症的方法，其包括向所述患者施用如本文所报告的化合物、药学上可接受的盐或药物组合物。
在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：淋巴瘤、黑色素瘤、结直肠癌、乳腺癌、急性髓性白血病、结肠癌、肝癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌和神经胶质瘤。在一些实施方案中，癌症是转移性的。
在本文所呈现的各式化合物的一些实施方案中，L1中的一个键是双键。在另外的实施方案中，该双键具有反式几何结构。在另外的实施方案中，L1是饱和的。在某些实施方案中，L1包含五个碳原子。在其他实施方案中，L1包含4个碳原子。
实施方案可进一步提供如本文所报告的化合物的混合物，包括这些化合物的立体异构体的混合物。例如，可提供化合物11和化合物12的混合物，或者可提供化合物2和化合物4的混合物。当然，这些不是限制性示例，且其他混合物也是可能的。
具体实施方案示于下表3中。
表3
在上表中，化合物8、11和12用相同的结构式绘制且涉及三种单独的立体异构体。然而，申请人指出化合物8的磷手性不一定与标记为“立体异构体1”的其他化合物(例如化合物21)的磷手性相同。其他立体异构体也是如此。
实施方案可涉及C4-C6接头，所述接头可在任一端共价结合到形成环状二核苷酸的一部分的嘌呤或嘧啶碱基。在一个实施方案中，接头是在任一端结合到嘌呤碱基的丁烯、戊烯或己烯接头。在另一实施方案中，接头是在任一端结合到嘌呤碱基的丁烯接头；在另一实施方案中，接头是具有位于中心的两个碳之间的双键的反式丁烯接头。
以下编号的实施方案说明这些C4-C6接头的用途：
1.一种式(x)化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
A1和A2是糖部分并且可相同或不同；
B3和B4是可相同或不同且分别与A1和A2形成核苷酸的嘌呤或嘧啶碱基；
L是烷基接头；
X19和X20相同或不同且选自由–O–、-CH–、-NH–和–S–组成的组，其中–CH-和–NH-可被取代或未被取代。
2.编号实施方案1的化合物或药学上可接受的盐，其中X19和X20的-CH-和-NH-可被C1-6烷基取代。
3.编号实施方案1的化合物或药学上可接受的盐，其中L是丁烯、戊烯或己烷。
4.编号实施方案3的化合物或药学上可接受的盐，其中L是在其中心具有双键的反式丁烯接头。
编号实施方案的化合物或药学上可接受的盐可例如用于治疗癌症。A1、A2、B3和B4可进一步被例如羟基、卤素或甲氧基取代。式(X)中的每个磷可例如被-SH、-OH、＝O或＝S取代，直到其化合价已被满足为止。
可受益于本发明的接头的环状二核苷酸类似物的示例包括但不限于在以下文献中所鉴别的那些：US 2014/0205653 A1；US 2014/0329889 A1；US 2014/0341976 A1；US2015/0056224 A1；US 2016/0362441 A1；US 2017/0158724 A1；US 2017/044206 A1；US 5,547,941；US 7,569,555 B2；US 7,592,326 B2；US 7,709,458B2；US 9,549,944B2；WO2009/133560 A1；WO 2015/074145 A1；WO 2015/077354 A1；WO 2015/185565 A1；WO 2016/100261 A1；WO 2016/120305 A1；WO 2016/145102 A1；WO 2017/027645 A1；WO 2017/027646 A1；WO 2017/075477 A1；WO 2017/093933 A1；WO 2017/123657 A1；WO 2017/175156 A1；EP 1740,192 B1；CN 102199183 A；Corrales,L.等，“在肿瘤微环境中直接活化STING导致有效和系统性的肿瘤消退和免疫”Cell Reports,11:1018-1030(2015)；和Lioux,T.等，“活化干扰素基因的刺激物(STING)新型环腺苷-肌苷一磷酸(cAIMP)类似物的设计、合成和生物学评价(Design,Synthesis,and Biological Evaluation of NovelCyclic Adenosine-Inosine Monophosphate(cAIMP)Analogs That Activate Stimulatorof Interferon Genes(STING))”J.Med.Chem.,59:10253-10267(2016)。所有那些文件，包括其中的化合物，都以引用方式并入本文中；如果那些文件中任一个的任何组成部分与本说明书中的任何内容相矛盾或在其他方面与本说明书中的任何内容不一致，则以本说明书为准。
在一些实施方案中，如本文所报告的化合物作为游离酸提供。在一些实施方案中，所述化合物作为NH4盐或作为三乙胺(TEA)盐提供。
实施方案可提供治疗有此需要的患者的癌症的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的本文所报告的化合物或其药学上可接受的盐，如上所述。
在一些实施方案中，将所述化合物作为游离酸施用。在一些实施方案中，将所述化合物作为二铵盐(NH4)施用。涵盖包含式I、式II、式III、式IV、式V、表3的化合物或其药学上可接受的盐、以及药学上可接受的赋形剂的药物组合物。实施方案可提供根据式I的化合物或其药学上可接受的盐，其中n为1；关于双键的几何结构为反式；X1和X2各自为SH；P1处的立体化学结构是S；且P2处的立体化学结构是R。
实施方案可提供治疗患者的癌症的方法，其包括向所述患者施用如本文所报告的化合物或其药学上可接受的盐、或药物组合物。如本文所报告治疗的癌症可以是转移性癌症。它们可选自例如淋巴瘤、黑色素瘤、结直肠癌、乳腺癌、急性髓性白血病、结肠癌、肝癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌和神经胶质瘤。还涵盖化合物、盐和药物组合物用于治疗癌症和/或制备用于治疗癌症的药物的用途。
实施方案可提供治疗癌症的方法，其包括鉴别患有通过如本文所报告的化合物、药学上可接受的盐或药物组合物可治疗的癌症的个体，和向所述个体施用化合物、药学上可接受的盐或药物组合物，所述患者已被鉴别为通过所述化合物、药学上可接受的盐或药物组合物可治疗。在一些实施方案中，通过在患者中存在人REF STING变体等位基因，将个体鉴别为患有通过如本文所报告的化合物、药学上可接受的盐或药物组合物可治疗的癌症。
实施方案可提供治疗具有REF STING等位基因的患者的癌症的方法，其包括向所述患者施用如本文所报告的化合物或其药学上可接受的盐、或药物组合物。
实施方案可提供治疗具有WT STING等位基因的患者的癌症的方法，其包括向所述患者施用如本文所报告的化合物或其药学上可接受的盐、或药物组合物。
实施方案可提供治疗具有AQ STING等位基因的患者的癌症的方法，其包括向所述患者施用如本文所报告的化合物或其药学上可接受的盐、或药物组合物。
实施方案可提供治疗具有HAQ STING等位基因的患者的癌症的方法，其包括向所述患者施用如本文所报告的化合物或其药学上可接受的盐、或药物组合物。
附图简单说明
图1显示化合物1a和化合物2a的合成。
图2A和图2B显示化合物1和化合物1a的替代合成。该替代合成还示于图2C到图2E中。
图3显示化合物1的1H NMR谱图。
图4A、图4B和图4C分别显示化合物1的不对称晶体、来自不对称晶体的第一分子和来自不对称晶体的第二分子的X射线晶体学结果(ORTEP图)。
图4D显示化合物2的晶体的X射线晶体学结果(ORTEP图)。
图5A和5B显示用于化合物18、19和20的合成途径。
图6显示WT STING(pLenti-WT人STING-Puro)的表达载体图谱。
图7和图8伴随实施例108并显示化合物1a在CT26双重肿瘤模型中的治愈活性。
图9伴随实施例109并显示经治疗肿瘤的肿瘤体积图和存活曲线。
图10伴随实施例110并显示经治疗肿瘤的肿瘤体积图和存活曲线。
图11显示与化合物1复合的人WT STING的X射线晶体结构的图片。
图12显示与化合物1复合的人REF STING C-末端结构域。
图13显示化合物38和化合物39的合成实施例。
具体实施方式
本文提供可用于治疗癌症的化合物。所述化合物可活化干扰素基因刺激物(STING)。
在一些实施方案中，所述化合物作为游离酸提供。在一些实施方案中，所述化合物作为例如NH4盐或TEA盐提供。所提到的后跟“a”的化合物编号指示给定化合物的二铵盐。例如，“化合物1a”是指化合物1的二铵盐。
实施方案可提供治疗有此需要的患者的癌症的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的式I、式II、式III、式IV或式V的化合物或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，将所述化合物作为游离酸施用。在一些实施方案中，将所述化合物作为例如二铵盐(NH4)施用。还可提供用于治疗癌症的药物组合物，包括本文所报告的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的赋形剂。
如本文所报告的实施方案可用于治疗癌症或制备可用于治疗癌症的药物。“癌症”可包括但不限于结肠癌、肝癌、黑色素瘤、结直肠癌、乳腺癌、急性髓性白血病和神经胶质瘤。
本领域技术人员将认识到，当结合到磷原子(P1、P2)的取代基具有单键和双键两者时，它们可能易于发生互变异构。例如，化合物可在平衡时发生互变异构。一个示例显示如下：
此类互变异构体应被认为是在权利要求的范围内。给定化合物的任一互变异构体的结构表示将代表相同的化合物。
在一些实施方案中，选自由本文所报告的化合物组成的组的化合物作为游离酸或其药学上可接受的盐提供。在一些实施方案中，选自由本文所报告的化合物组成的组的化合物作为NH4盐提供，所述盐可以是二铵盐。
如本文所用的“C1-6烷基”或“C1-C6”烷基意在包括C1、C2、C3、C4、C5或C6直链(线性)饱和脂族烃基和C3、C4、C5或C6支链饱和脂族烃基。例如，C1-6烷基意在包括C1、C2、C3、C4、C5和C6烷基。烷基的示例包括具有1到6个碳原子的部分，例如但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、仲戊基或正己基。类似地，“C1-3烷基”或“C1-C3烷基”意在包括C1、C2或C3直链(线性)饱和脂族烃基和C3支链饱和脂族烃基。
如本文所用的术语“C3-6环烷基”或“C3-C6环烷基”是指具有3到6个碳原子(例如，C3-C6)的饱和或不饱和非芳族烃环。环烷基的示例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环戊烯基和环己烯基。术语“C5-6环烷基”或“C5-C6环烷基”是指具有5或6个碳原子(例如，C5-C6)的饱和或不饱和的非芳族烃环。
除非另有说明，否则术语“C5-6杂环烷基”或“C5-C6杂环烷基”是指具有一个或多个杂原子(例如O、N或S)的饱和或不饱和的非芳族5-6元单环。除非另有说明，否则术语“C4-6杂环烷基”或“C4-C6杂环烷基”是指具有一个或多个杂原子(例如O、N或S)的饱和或不饱和的非芳族4-6元单环。杂环烷基的示例包括但不限于哌啶基、哌嗪基、吡咯烷基、二烷基、四氢呋喃基、异吲哚啉基、二氢吲哚基、咪唑烷基、吡唑烷基、唑烷基、异唑烷基、三唑烷基、环氧乙烷基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、1,2,3,6-四氢吡啶基、四氢吡喃基、四氢噻吩基、二氢吡喃基、吡喃基、吗啉基、1,4-二氮杂环庚烷基、1,4-氧杂环庚烷基等。
杂环烷基的另外示例包括但不限于吖啶基、吖辛因基(azocinyl)、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并硫代呋喃基(benzothiofuranyl)、苯并噻吩基、苯并唑基、苯并唑啉基、苯并噻唑基、苯并三唑基、苯并四唑基、苯并异唑基、苯并异噻唑基、苯并咪唑啉基、咔唑基、4aH-咔唑基、咔啉基、色满基、色烯基、噌啉基、十氢喹啉基、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、二氢呋喃并[2,3-b]四氢呋喃、呋喃基、呋咱基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、1H-吲唑基、吲哚烯基(indolenyl)、二氢吲哚基、吲嗪基、吲哚基、3H-吲哚基、靛红酰基(isatinoyl)、异苯并呋喃基、异色满基、异吲唑基、异吲哚啉基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异唑基、亚甲二氧基苯基、吗啉基、萘啶基、八氢异喹啉基、二唑基、1,2,3-二唑基、1,2,4-二唑基、1,2,5-二唑基、1,3,4-二唑基、1,2,4-二唑5(4H)-酮、唑烷基、唑基、羟吲哚基、嘧啶基、菲啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、酚黄素基(phenoxathinyl)、吩嗪基、酞嗪基、哌嗪基、哌啶基、哌啶酮基、4-哌啶酮基、胡椒基、蝶啶基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并唑基、吡啶并咪唑基、吡啶并噻唑基、吡啶基(pyridinyl,pyridyl)、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、2H-吡咯基、吡咯基、喹唑啉基、喹嗪基、喹喔啉基、奎宁环基、四氢呋喃基、四氢异喹啉基、四氢喹啉基、四唑基、6H-1,2,5-噻二嗪基、1,2,3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、噻蒽基、噻唑基、噻吩基(thienyl)、噻吩并噻唑基(thienothiazolyl)、噻吩并唑基(thienooxazolyl)、噻吩并咪唑基(thienoimidazolyl)、噻吩基(thiophenyl)、三嗪基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、1,2,5-三唑基、1,3,4-三唑基和呫吨基。
如本文所用的术语“C5-6芳基”或“C5-C6芳基”是指在环结构中不含任何杂原子的具有5到6个碳原子(例如，C5-C6)的芳族烃环。
除非另有说明，否则术语“C3-6杂芳基”或“C3-C6杂芳基”是指具有一个或多个杂原子(例如O、N或S)的芳族3-6元单环，只是杂芳基环将包含不超过一个氧原子或一个硫原子。
术语“C2-6烯基”包括具有2个、3个、4个、5个或6个碳且含有至少一个双键的不饱和脂族基团。例如，术语“C2-6烯基”包括直链烯基(例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基)和支链烯基。在某些实施方案中，直链或支链烯基在其主链中具有6个或更少的碳原子(例如，对于直链为C2-C6，对于支链为C3-C6)。术语“C2-6烯基”包括含有2至6个碳原子的烯基。
术语“C2-6炔基”包括具有2个、3个、4个、5个或6个碳原子但含有至少一个三键的不饱和脂族基团。例如，“炔基”包括直链炔基(例如，乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基)和支链炔基。在某些实施方案中，直链或支链炔基在其主链中具有6个或更少的碳原子(例如，对于直链为C2-C6，对于支链为C3-C6)。术语“C2-6炔基”包括含有2至6个碳原子的炔基。
治疗方法
实施方案可提供治疗有此需要的患者的癌症的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的本文所报告的化合物或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，施用的化合物作为游离酸或其药学上可接受的盐提供。在一些实施方案中，施用的化合物作为NH4盐、游离酸或其药学上可接受的盐提供。在一些实施方案中，所述化合物作为NH4盐提供。
术语“任选取代的”是指具有指定取代基的部分，所述取代基取代在该部分中带有氢的一个或多个原子上的一个或多个氢原子。
命名或描述的化学品意在包含在本化合物中存在的原子的所有天然存在的同位素。同位素包括具有相同原子序数但具有不同质量数的那些原子。作为一般的示例并且不具有限制性，1H氢的同位素包括氚和氘，并且12C碳的同位素包括13C和14C。
剂量
用于治疗癌症的最佳剂量可使用已知方法针对各个体根据经验确定，并且将取决于多种因素，包括药剂的活性；个体的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；施用的时间和途径；以及个体正在服用的其他药物。可使用本领域熟知的常规测试和程序建立最佳剂量。上述化合物的施用可通过任何适合的途径进行。
如本文所用的“药学上可接受的盐”是指本公开中化合物的酸加成盐或碱加成盐。药学上可接受的盐是保持母体化合物的活性且对其所施用的受试者和其所施用的情形不赋予任何过度有害或不期望的作用的任何盐。药学上可接受的盐包括但不限于无机酸和羧酸两者的金属络合物以及盐。药学上可接受的盐还包括金属盐，例如铝盐、钙盐、铁盐、镁盐、锰盐和络合盐。另外，药学上可接受的盐包括但不限于酸式盐，例如乙酸盐、天门冬氨酸盐、烷基磺酸盐、芳基磺酸盐、乙酰氧乙酸(axetil)盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢(bicarbonic)盐、硫酸氢(bisulfuric)盐、酒石酸氢(bitartaric)盐、丁酸盐、依地酸钙(calcium edetate)盐、樟脑磺酸(camsylic)盐、碳酸盐、氯苯甲酸盐、柠檬酸盐、依地酸(edisylic)盐、乙二磺酸(edisylic)盐、依托酸(estolic)盐、乙磺酰基酸(esyl)盐、乙磺酸(esylic)盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸(gluceptic)盐、葡萄糖酸盐、谷氨酸盐、乙醇酸盐、羟乙酰基阿散酸(glycolylarsanilic)盐、环己磺酸(hexamic)盐、己基间苯二酚酸(hexylresorcinoic)盐、海巴酸(hydrabamic)盐、氢溴酸盐、氢氯酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、羟萘甲酸盐、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、粘康酸盐、萘磺酸(napsylic)盐、硝酸盐、草酸盐、对硝基甲磺酸盐、巴莫酸(pamoic)盐、泛酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、邻苯二甲酸盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、氨基磺酸盐、对氨基苯磺酸(sulfanlic)盐、磺酸盐、硫酸盐、鞣酸盐、酒石酸盐、茶氯酸(teoclic)盐、甲苯磺酸盐等。还可制备钠盐和钾盐。
实施方案可以是二铵盐。药学上可接受的盐可衍生自氨基酸，包括但不限于半胱氨酸。用于生产作为盐的化合物的方法是本领域技术人员已知的(参见例如Stahl等，药用盐手册：性质、选择和用途(Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties，Selection，and Use)，Wiley-VCH；Verlag Helvetica Chimica Acta,Zurich,2002；Berge等，J.Pharm.Sci.66:1,1977)。
治疗剂的“有效量”是与在受试者或患者中未治疗的癌症相比足以提供可观察到的治疗益处的量。
如本文所报告的活性剂可与药学上可接受的载体组合以提供其药物制剂。载体和制剂的具体选择将取决于组合物所意在进行的具体施用途径。
如本文所用的“药学上可接受的载体”是指不破坏用其配制的化合物的药理学活性的无毒的载体、佐剂或媒介物。可用于本发明组合物中的药学上可接受的载体、佐剂或媒介物可包括但不限于山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶态二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙二醇和羊毛脂。
本发明的组合物可适于胃肠外、口服、吸入喷雾、局部、直肠、鼻、颊、阴道或植入的储库施用等。在一些实施方案中，制剂包含来自天然或非天然来源的成分。在一些实施方案中，制剂或载体可以无菌形式提供。无菌载体的非限制性示例包括无内毒素的水或无热原的水。
如本文所用的术语“胃肠外”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。在特定的实施方案中，所述化合物经静脉内、口服、皮下或通过肌内施用来施用。本发明的组合物的无菌可注射形式可以是水性或油性悬浮液。这些悬浮液可根据本领域已知的技术使用适合的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。无菌可注射制剂还可以是无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液。可采用的可接受的媒介物和溶剂包括水、林格氏溶液(Ringer'ssolution)和等渗氯化钠溶液。另外，常规地采用无菌的固定油作为溶剂或悬浮介质。
为此目的，可采用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸和它们的甘油酯衍生物可用于制备注射剂，所述注射剂为药学上可接受的天然油，例如橄榄油或蓖麻油，尤其是它们的聚氧乙烯化形式。这些油溶液或悬浮液还可含有长链醇稀释剂或分散剂，例如羧甲基纤维素或类似分散剂，所述类似分散剂通常用于配制药学上可接受的剂型，包括乳液和悬浮液。通常用于制造药学上可接受的固体、液体或其他剂型的其他常用表面活性剂(例如Tweens、Spans和其他乳化剂)也可用于配制目的。
对于口服施用，可以可接受的口服剂型提供化合物或盐，包括但不限于胶囊、片剂、含水悬浮液或溶液。在用于口服使用的片剂的情况下，通常使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。还可添加润滑剂，例如硬脂酸镁。对于胶囊形式的口服施用，有用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当口服使用需要含水悬浮液时，可将活性成分与乳化剂和悬浮剂组合。如果期望，还可添加某些甜味剂、调味剂或着色剂。另外，还可添加防腐剂。药学上可接受的防腐剂的适合示例包括但不限于各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如溶剂，例如乙醇、丙二醇、苯甲醇、氯丁醇、季铵盐和对羟基苯甲酸酯(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯等)。
“立即释放”意指包括常规释放，其中药物在施用后立即开始释放。如本文所用的术语“立即释放”包括允许药物溶解于胃肠内容物中而无意延迟或延长药物的溶解或吸收的剂型。目的在于使药物在施用后快速释放，例如在溶解测试中，在溶解开始后大约30分钟内可能释放至少80％的药物。
“持续释放”或“延长释放”包括选择时程和/或位置的药物释放特征以实现常规剂型(例如溶液或立即释放剂型)不提供的治疗或便利目的的剂型。
术语“稳定状态”意指已达到给定活性剂的血浆水平，并且通过随后的活性剂剂量将其维持在等于或高于给定活性剂的最小有效治疗水平且低于给定活性剂的最小毒性血浆水平的水平。
如本文所用的术语“单一制剂”是指经配制以向患者递送有效量的两种治疗剂的单一载体或媒介物。单一媒介物被设计成用于递送有效量的每种药剂以及任何药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，媒介物是片剂、胶囊、丸剂或贴剂。
术语“单位剂量”在本文中用于意指以一种剂型向所治疗的患者一起同时施用两种药剂。在一些实施方案中，单位剂量是单一制剂。在某些实施方案中，单位剂量包含一种或多种媒介物，使得每种媒介物包含有效量的药剂连同药学上可接受的载体和赋形剂。在一些实施方案中，单位剂量是同时向患者施用的一个或多个片剂、胶囊、丸剂或贴剂。
如本文所用的术语“剂量范围”是指指定药剂量的可接受变化的上限和下限。通常，可向正在接受治疗的患者施用指定范围内任何量的剂量的药剂。
术语“治疗”在本文中用于指减轻、减少或缓解受试者的疾病的至少一种症状。例如，关于癌症，术语“治疗”可意指阻遏、延迟疾病发作(即，疾病或疾病症状的临床表现之前的时期)和/或降低疾病症状发展或恶化的风险。术语“保护”在本文中用于意指预防、延迟或治疗(或在适当时全部)受试者的疾病症状的发展或持续或恶化。
术语“受试者”或“患者”意在包括能够罹患或患有癌症的动物。受试者或患者的示例包括哺乳动物，例如人、狗、母牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因非人动物。在某些实施方案中，受试者是人，例如罹患癌症、处于罹患癌症的风险之下或潜在能够罹患癌症的人。
术语“约”或“大约”通常意指在给定值或范围的20％内，更优选在10％内且最优选仍在5％内。或者，尤其是在生物系统中，术语“约”意指大约在给定值的一个对数(即，一个数量级)内，优选在两倍内。
除非本文另外指明或者上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其在下文权利要求书的上下文中)所用术语“一(a和an)”和“所述”以及类似指示物应当理解为涵盖单数与复数二者。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应当理解为开放性术语(即，意指“包括但不限于”)。除非本文另外指明，否则本文叙述的值的范围仅仅意在作为个别地表示此范围内的每一单独值的简化方法，并且每一单独值都被并入本说明书中，就如同其在本文中被个别地叙述一样。
可使用本文所公开的一种或多种化合物治疗的示例性细胞增殖性病症包括但不限于体内组织和器官中的癌症、初癌或癌前病况以及转移性病变。细胞增殖性病症可包括增生、化生和发育不良。
本文所公开的化合物或其药学上可接受的盐可用于治疗或预防细胞增殖性病症，或用于治疗或预防相对于整体群体来说具有增加的发生癌症风险的受试者的癌症，或用于鉴别用于此类目的的适合候选者。
药物制剂和施用途径
本文提供包含用于治疗癌症的化合物或其药学上可接受的盐的药物制剂。药物制剂可另外包含载体或赋形剂、稳定剂、调味剂和/或着色剂。
可使用本领域技术人员已知的各种施用途径来施用化合物或其药学上可接受的盐。施用途径包括口服施用。在某些实施方案中，包含化合物或其药学上可接受的盐的药物制剂可以液体、糖浆、片剂、胶囊、粉末、喷剂(sprinkle)、咀嚼片(chewtab)或可溶解片剂(dissolvable disk)的形式口服。或者，本发明的药物制剂可经静脉内或经透施用。另外的施用途径是本领域技术人员已知的(参见例如Remington的药物科学(PharmaceuticalSciences)，Gennaro A.R.编辑，第20版，Mack Publishing公司，Easton，Pa.)。
在一些实施方案中，将化合物或药学上可接受的盐配制为糊剂、胶冻剂或悬浮液。例如，药物以药物颗粒、微囊化颗粒或药物-聚合物颗粒的形式溶解、包埋或悬浮在凝胶状溶液或半固体中。口服胶冻制剂的优点在于较容易将药物施予难以吞咽片剂、胶囊或丸剂的患者。在某些实施方案中，将化合物充分混合并悬浮在适当的介质中以形成糊剂或凝胶。可任选地混合另外的试剂以在口服施用期间提供风味。用覆盆子调味的花生酱或藻酸盐和甜味剂是许多适合的掩味剂的示例。在各种实施方案中，糊剂或胶冻剂还可与本领域已知用于局部施用的适合粘合剂或赋形剂配制。
制备片剂、胶囊或丸剂形式的持续释放制剂的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，通过用聚合物、优选水不溶性聚合物包覆药物的活性成分来制备持续释放制剂。例如，在制药领域中用作持续释放包衣剂、肠溶包衣剂或胃包衣剂的水不溶性聚合物。水不溶性聚合物可包括例如乙基纤维素、纯化虫胶、白虫胶、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物RS、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、乙酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素、羧甲基乙基纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素、甲基丙烯酸共聚物L、甲基丙烯酸共聚物LD、甲基丙烯酸共聚物S、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物E或聚乙烯基缩醛二乙基氨基乙酸酯。
水不溶性聚合物的类型、取代度和分子量可取决于活性成分在水或醇中的溶解度、期望的持续释放水平等。水不溶性聚合物可单独或组合使用。可进一步掺入氢化油、硬脂酸或鲸蜡醇作为包衣助剂，和中链甘油三酯、三醋精、柠檬酸三乙酯或鲸蜡醇作为增塑剂。
在一些实施方案中，持续释放制剂是基质型片剂或颗粒。活性成分可涂覆有最多达3种不同类型的聚合物。这三种不同类型的聚合物可包括：1)水不溶性聚合物，例如乙基纤维素；2)不依赖于pH的胶凝聚合物，例如羟丙基甲基纤维素；3)pH依赖性胶凝聚合物，例如藻酸钠。这三种不同类型的聚合物可一起用于减弱药物的释放速率。
剂型：释放性质
持续释放制剂可实现一定程度的持续作用。然而，活性成分的暴露和/或生物利用度可基于多种因素而变化，例如吸收窗、用于制剂中的载体或赋形剂、制剂的递送方式和/或或活性成分通过患者胃肠道的通行时间。
疗法可含有至少一个用于执行持续释放功能的持续释放部分和一个用于执行立即释放功能的立即释放部分。在某些实施方案中，当治疗呈单一剂型时，它可以呈由构成持续释放部分的缓释颗粒和构成立即释放部分的速释颗粒的混合物形成的片剂形式、通过用持续释放颗粒和立即释放颗粒填充胶囊而获得的胶囊制剂、或其中在构成持续释放部分的内核上形成构成立即释放部分的外层的压制包衣片剂。然而，对上述实施方案没有限制。
此外，对组合物或立即释放部分或持续释放部分中药物的包含状态没有特别限制；化合物可均匀地分散于组合物、立即释放部分或持续释放部分中，或可仅包含在组合物、立即释放部分或持续释放部分的一部分中，或可被包含而使得存在浓度梯度。
根据本发明的组合物中的持续释放部分可含有至少一种用于控制药物释放的非pH依赖性聚合物质或pH依赖性聚合物质。
本文所用的非pH依赖性聚合物质可包括电荷状态在通常在胃肠道中发现的pH条件、尤其是pH 1到pH 8下几乎不变化的聚合物质。这意指例如不具有电荷状态取决于pH而变化的官能团(例如诸如氨基的碱性官能团或诸如羧酸基团的酸性官能团)的聚合物质。注意，非pH依赖性聚合物质可被包含以赋予根据本发明的组合物持续释放功能，但也可被包含用于另一目的。此外，用于本发明中的非pH依赖性聚合物质可以是水不溶性的，或者可在水中溶胀或溶解于水中以形成凝胶。
水不溶性非pH依赖性聚合物质的示例包括但不限于纤维素醚、纤维素酯和甲基丙烯酸-丙烯酸共聚物(商品名Eudragit，由Rohm GmbH&Co KG,Darmstadt,Germany制造)。示例包括但不限于纤维素烷基醚，例如乙基纤维素(商品名Ethocel，由Dow Chemical公司，USA制造)、乙基甲基纤维素、乙基丙基纤维素或异丙基纤维素和丁基纤维素，纤维素芳烷基醚，例如苄基纤维素，纤维素氰基烷基醚，例如氰乙基纤维素，纤维素有机酸酯，例如乙酸丁酸纤维素、乙酸纤维素、丙酸纤维素或丁酸纤维素和乙酸丙酸纤维素，丙烯酸乙酯-甲基丙烯酸甲酯共聚物(商品名Eudragit NE，由Rohm GmbH&Co.KG，Darmstadt，Germany制造)和甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物RS(商品名Eudragit RL、Eudragit RS)。对于用于本发明中的水不溶性聚合物的平均粒径没有特别限制，但通常该平均粒径越低，性能越好，平均粒径优选0.1到100μm，更优选1到50μm，特别优选3到15μm，最优选5到15μm。此外，水溶性或水溶胀性非pH依赖性聚合物质的示例包括但不限于聚环氧乙烷(商品名Polyox，由Dow Chemical公司制造，分子量100,000到7,000,000)、低取代的羟丙基纤维素(商品名L-HPC，由Shin-Etsu Chemical,Japan制造)、羟丙基纤维素(商品名HPC，由Nippon Soda有限公司，Japan制造)、羟丙基甲基纤维素(商品名Metolose 60SH、65SH、90SH，由Shin-Etsu Chemical,Japan制造)和甲基纤维素(商品名Metolose SM，由Shin-Etsu Chemical,Japan制造)。
在一些实施方案中，组合物中可含有单一的非pH依赖性聚合物质，或可含有多种非pH依赖性聚合物质。如果用于本文所报告的实施方案中，则非pH依赖性聚合物质可以是水不溶性聚合物质，更优选乙基纤维素、丙烯酸乙酯-甲基丙烯酸甲酯共聚物(商品名Eudragit NE)或甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物RS(商品名Eudragit RL，Eudragit RS)。特别优选乙基纤维素和甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物RS中的至少一种。最优选乙基纤维素。对组合物中所含非pH依赖性聚合物的量没有特别限制；该量可根据诸如控制持续药物释放的目的适当调整。
可用于本文所报告的实施方案中的pH依赖性聚合物质可以是电荷状态在通常在胃肠道中发现的pH条件、尤其是pH 1到pH 8下变化的聚合物质。这意指例如具有电荷状态取决于pH而变化的官能团(例如诸如氨基的碱性官能团或诸如羧酸基团的酸性官能团)的聚合物质。pH依赖性聚合物质的pH依赖性官能团优选酸性官能团，pH依赖性聚合物质最优选具有羧酸基团。
用于本发明中的pH依赖性聚合物质可以是水不溶性的，或者可在水中溶胀或溶解于水中以形成凝胶。用于本发明中的pH依赖性聚合物质的示例包括但不限于肠溶聚合物质。肠溶聚合物质的示例包括但不限于甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物(EudragitL100、Eudragit S100，由Rohm GmbH&Co.KG,Darmstadt,Germany制造)、甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物(Eudragit L100-55、Eudragit L30D-55，由Rohm GmbH&Co.KG,Darmstadt,Germany制造)、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素(HP-55，HP-50，由Shin-Etsu Chemical,Japan制造)、乙酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素(AQOAT，由Shin-Etsu Chemical,Japan制造)、羧甲基乙基纤维素(CMEC，由Freund公司，日本制造)和邻苯二甲酸乙酸纤维素。
在水中溶胀或溶解于水中以形成凝胶的pH依赖性聚合物质的示例包括但不限于海藻酸、果胶、羧基乙烯基聚合物和羧甲基纤维素。在本发明中，组合物中可含有单一的pH依赖性聚合物质，或者可含有多种pH依赖性聚合物质。用于本发明中的pH依赖性聚合物质优选肠溶聚合物质，更优选甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物、甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素或乙酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素，特别优选甲基丙烯酸酸-丙烯酸乙酯共聚物。
当在根据本发明的组合物的制造过程中使用pH依赖性聚合物质时，可原样使用pH依赖性聚合物质已预先分散于溶剂中的粉末型或颗粒型、或悬浮型的市售产品，或者此类市售产品可分散在水或有机溶剂中使用。pH依赖性聚合物质的粒径越低，性能越好，pH依赖性聚合物质优选粉末类型。在甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物的情况下，示例是EudragitL100-55。对于用于本发明中的pH依赖性聚合物质的平均粒径没有特别限制，但平均粒径优选0.05到100μm，更优选0.05到70μm，最优选0.05到50μm。此外，对于pH依赖性聚合物质的量没有特别限制，例如，在肠溶聚合物质的情况下，基于100重量份的组合物，该量通常为0.1至90重量份，优选1至70重量份，更优选5至60重量份，特别优选10至50重量份。
根据本文所报告的实施方案的疗法可进一步含有各种添加剂中的任一种，例如各种药理学上可接受的载体中的任一种，例如稀释剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂，以及必要时，防腐剂、着色剂、甜味剂、增塑剂、薄膜包衣剂等。稀释剂的示例包括但不限于乳糖、甘露醇、磷酸氢钙、淀粉、预胶凝淀粉、结晶纤维素、轻质硅酸酐、合成硅酸铝、偏硅酸铝镁(magnesium aluminate metasilicate)等。润滑剂的示例包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石、硬脂富马酸钠等。粘合剂的示例包括但不限于羟丙基纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。崩解剂的示例包括但不限于羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙，交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、低取代的羟丙基纤维素等。防腐剂的示例包括但不限于对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯甲醇、苯乙醇、脱氢乙酸、山梨酸等。着色剂的优选示例包括但不限于水不溶性色淀颜料、天然色素(例如，β-胡萝卜素、叶绿素、红色氧化铁)、黄色氧化铁、红色氧化铁、黑色氧化铁等。甜味剂的优选示例包括但不限于糖精钠、甘草酸二钾(dipotassium glycyrrhizate)、阿斯巴甜(aspartame)、甜菊等。增塑剂的示例包括但不限于甘油脂肪酸酯、柠檬酸三乙酯、丙二醇、聚乙二醇等。薄膜包衣剂的示例包括但不限于羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素等。
制造方法
为了制造如本文所报告的实施方案，可使用单一的常规方法或常规方法的组合。例如，当制造作为缓释部分或速释部分的含药颗粒时，造粒是主要操作，但这可与其他操作例如混合、干燥、筛分和分级组合。作为造粒方法，可使用例如将粘合剂和溶剂添加至粉末并进行造粒的湿式造粒法、压缩粉末并进行造粒的干式造粒法、添加加热熔化的粘合剂并进行加热和造粒的熔融造粒法等。
此外，根据造粒方法，可使用诸如以下的操作方法：使用行星式混合器、螺杆混合器等的混合造粒方法，使用亨舍尔混合器(Henschel mixer)、超级混合器(Super mixer)等的高速混合造粒方法，使用圆筒造粒机、旋转造粒机、螺杆挤出造粒机、粒料磨机型造粒机(pellet mill type granulator)等的挤出造粒方法，湿式高剪切造粒方法，流化床造粒方法，压缩造粒方法，粉碎造粒方法或喷雾造粒方法。在造粒后，使用干燥器、流化床等进行干燥，可进行破碎和筛分，以获得供使用的颗粒或细颗粒。此外，在制备根据本发明的组合物时可使用造粒溶剂。对于这种造粒溶剂没有特别限制，所述造粒溶剂可以是水或各种有机溶剂中的任一种，例如水，低级醇，例如甲醇或乙醇，酮，例如丙酮或甲基乙基酮，二氯甲烷，或其混合物。
对于实施方案中所含的持续释放颗粒，将至少一种药物以及选自非pH依赖性聚合物质和pH依赖性聚合物质中的至少一种混合在一起，根据需要添加稀释剂和粘合剂，并进行造粒出来获得颗粒状物质。使用盘式干燥器、流化床干燥器等干燥所获得的颗粒状物质，并使用磨机或振荡器进行筛分，由此可获得持续释放颗粒。或者，作为本发明中制造持续释放颗粒的方法，可添加至少一种药物、选自非pH依赖性聚合物质和pH依赖性聚合物质中的至少一种，以及根据需要添加稀释剂和粘合剂，使用干燥压实机，例如辊式压实机或块料压片机(slug tabletting machine)，并在混合的同时进行压缩模制，然后通过破碎到适合的尺寸进行造粒。使用此类造粒机制备的颗粒物质可原样用作根据本发明的颗粒或细颗粒，或者可使用动力磨机(power mill)、辊式造粒机、转子速磨机(rotor speed mill)等进一步破碎，并筛分以获得持续释放颗粒。注意，立即释放颗粒还可如同持续释放颗粒那样制造。
可使用单一常规方法或常规方法的组合将压缩模制产品制造为含药物的持续释放部分或立即释放部分，或本文所报告的组合物。例如，使用至少一种药物、选自非pH依赖性聚合物质和pH依赖性聚合物质中的至少一种、诸如甘露醇或乳糖的稀释剂、诸如聚乙烯基吡咯烷酮或结晶纤维素的粘合剂、诸如羧甲基纤维素钠(carmellose sodium)或交联聚维酮(crospovidone)的崩解剂和诸如硬脂酸镁或滑石的润滑剂，并使用普通方法进行压片，从而可获得压缩模制产品。在这种情况下，压片是制造压缩模制产品的方法中的主要操作，但这可与诸如混合、干燥、糖包衣形成和包衣的其他操作组合。
用于压片的方法的示例包括但不限于直接压缩模制，其中将至少一种药物和药理学上可接受的添加剂混合在一起，然后使用压片机将该混合物直接压缩模制成片剂；和干式颗粒压缩或湿式颗粒压缩，其中在根据需要添加润滑剂或崩解剂后对根据本发明的持续释放颗粒或立即释放颗粒进行压缩模制。对用于压缩模制中的压片机没有特别限制；例如，可使用单冲压片机、旋转压片机或压制包衣压片机。
根据本文的实施方案的含药物的持续释放颗粒或立即释放颗粒或压缩模制产品可以颗粒或片剂的形式用作组合物，但还可进行进一步加工以制造组合物。例如，压缩模制产品或颗粒可使用薄膜基底材料(例如乙基纤维素、酪蛋白、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基丙烯酸共聚物L、邻苯二甲酸乙酸纤维素、虫胶等)赋予薄膜包衣，或者使用含有蔗糖、糖醇、阿拉伯胶粉末(gum arabic powder)、滑石等的糖包衣液赋予糖包衣，从而生产薄膜包衣片剂或糖包衣片剂。该包衣技术中的一种溶剂可以是纯化水，但还可使用有机溶剂，例如醇、酮、醚或氯化烃或其混合物。例如，乙醇、丙酮、二氯甲烷等可用作有机溶剂。此外，作为包衣装置，可使用通常用于制造药物的包衣技术中的装置，示例包括通过喷雾包衣液等进行包衣的喷雾包衣装置和用于层积(layering)的转子流化床造粒机。
在制造胶囊制剂的情况下，胶囊制剂可通过使用自动胶囊填充机将如上文的持续释放颗粒或立即释放颗粒、或微型片剂(mini-tablet)填充到硬明胶胶囊或HPMC胶囊中来制造。或者，在用于经管施用的制剂或在服用时与水等混合使用的干糖浆的情况下，如上文的持续释放颗粒或立即释放颗粒可与增稠剂或分散剂混合，以分散这些颗粒，然后将所述混合物制成颗粒或片剂。此外，液体或胶冻剂可使用水和选自以下的物质制得：分散剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、pH调节剂、甜味剂、调味剂、香料等。然而，关于其他制造方法，对上述内容没有限制。
为了可以更全面地理解本文所述的实施方案，陈述以下实施例。应当理解的是，这些实施例仅用于说明目的，而不应解释为限制性的。
实施例
在整个实施例中可使用以下缩写。
All：烯丙基
BOP：(苯并三唑-1-基氧基)三(二甲氨基)六氟磷酸
DMT：4,4′-二甲氧三苯甲基
(DMTO-：
Bz：苯甲酰基
ib：异丁酰基
许尼希氏碱(Hunig's Base)：i-Pr2NEt(二异丙基乙胺)
AllylOH：烯丙醇
OAll：-OCH2CHCH2
ACN：乙腈
All：-CH2CHCH2
2-NitroBnBr：2-硝基苄基溴
Bz：苯甲酰基
ib：异丁酰基
i-Pr：异丙基
CE：氰乙基
DEAD：偶氮二羧酸二乙酯
DIAD：偶氮二羧酸二丙酯
DCM：二氯甲烷
DDTT：N,N-二甲基-N'-(3-硫代-3H-1,2,4-二噻唑-5-基)甲脒
DMOCP：2-氯-5,5-二甲基-1,3,2-二氧磷杂环己烷(dioxaphosphinane)-2-氧化物
TBS：叔丁基二甲基甲硅烷基
3H-苯并[c][1,2]二硫醇-3-酮：
实施例1--化合物1a的合成
可在图1中获得该合成的完整方案。
步骤A
在环境温度下向(2R,3R,4R,5R)-5-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟代四氢呋喃-3-基(2-氰乙基)二异丙基亚磷酰胺(化合物100)(磷非对映异构体的混合物；80.0g,91.332mmol,1eq，ChemGenes公司目录编号ANP-9151)、烯丙醇(9.63ml,142mmol,1.55eq)和三苯基膦(38.3g,146mmol,1.60eq)于THF(1.1L)中的混合物中添加DEAD(于甲苯中的40wt％溶液；54.2ml,137mmol,1.5eq)。在环境温度下持续搅拌并通过LC/MS监测反应。在完成(19h)后，将混合物在真空中(35℃)浓缩，并通过硅胶柱色谱(800g×2个柱，于用0.5％三乙胺缓冲的正庚烷中的40％到60％ EtOAc)纯化所得混合物，得到呈白色泡沫的化合物101(84.2g，定量产率，磷非对映异构体的混合物)。
1H NMR(磷非对映异构体的3:2混合物，400MHz,CDCl3)δ1.14-1.21(m,12H)2.40(t,J＝6.2Hz,1.2H)2.59(t,J＝6.2Hz,0.8H)3.27(d,J＝8.6Hz,1H)3.52-3.66(m,5H)3.78(s2.4H)3.79(s 3.6H)4.28-4.34(m,1H)4.84-4.96(m,0.4H)4.99(d,J＝5.5Hz,2H)4.95–5.10(m,0.6H)5.05(d,J＝10.9Hz,1H)5.22(br d,J＝17.6Hz,1H)5.64(br d,J＝53.2Hz,0.6H)5.70(br d,J＝51.6Hz,0.4H)5.96–6.75(m,1H)6.20(d,J＝16.0Hz,0.6H)6.24(d,J＝17.2Hz,0.4H)6.74-6.79(m,4H)7.02–7.06(m,2H)7.17-7.24(m,8H)7.32-7.34(m,2H)7.41-7.44(m,2H)8.11(s,1H)8.52(s,0.4H)8.54(s,0.6H)。
步骤B
向化合物101(3.00g,3.28mmol,1eq)于乙腈(30ml)中的溶液中添加水(0.118ml,6.55mmol,2.0eq)和三氟乙酸吡啶盐(0.759g,3.93mmol,1.2eq)。在环境温度下搅拌1分钟后，添加叔丁胺(14.5g,21.0ml,0.20mol,60eq)。在完全裂解氰乙基(通过LC/MS监测)后，将反应混合物在真空中浓缩并与乙腈共沸两次。在环境温度下将粗制混合物溶解于DCM(45.0ml)中并用水(0.118ml,6.55mmol,2.0eq)和NaHSO4-SiO2(1.18g,6.55mmol,2eq)处理。在完全裂解DMT基团(通过LC/MS监测，大约1小时)后，将反应混合物过滤并用DCM/MeOH(9/1,20ml)冲洗两次。将合并的滤液在真空中浓缩，并用正庚烷/甲苯的1:1混合物(约30ml)处理。通过倾析去除顶层。用正庚烷/甲苯(1/1,30ml)再次重复相同的操作，并将底层与乙腈共沸两次，得到化合物102(假定理论产率100％)。所述产物未经进一步纯化即用于下一步骤中。
步骤C
向化合物102(1.56g,3.27mmol,1eq)和化合物101(3.00g,3.28mmol,1eq)于乙腈(30ml)中的混合物中添加三氟乙酸吡啶盐(与吡啶共沸干燥；0.760g,3.94mmol,1.25eq)。在5分钟后，添加DDTT(0.840g，4.09mmol，1.30eq，ChemGenes公司目录编号RN-1588)，且在完全硫化(通过LC/MS监测)后，在真空中浓缩反应混合物。将残余物溶解于DCM(30ml)中，并用水(0.57ml,32mmol,10eq)和于DCM(30ml)中的6％二氯乙酸(1.56ml,18.9mmol,6.0eq)处理。在20分钟后，用吡啶(20ml)淬灭反应，并在真空中浓缩。将残余物与吡啶共沸，得到化合物103(3.22g，假定理论产率100％)。所述产物未经进一步纯化即用于下一步骤中。
步骤D
在环境温度下向化合物103(3.22g,3.15mmol,1eq)于吡啶(100ml)中的溶液中添加DMOCP(1.45g,7.88mmol,2.50eq)。在完成大环化(通过LC/MS监测)后，添加水(1.7ml,94.5mmol，×10倍，相对于DMOCP)，之后添加3H-苯并[c][1,2]二硫醇-3-酮(0.795g,4.73mmol,1.5eq)。在完全硫化(约40分钟)后，将反应混合物在真空中部分浓缩到大约15ml并倒入饱和NaHCO3水溶液(50ml)和水(30ml)的混合物中。在环境温度下搅拌10min后，用EtOAc/MTBE的1:1混合物(60ml×3次)萃取混合物。将有机层合并，用盐水(25ml)洗涤，经Mg2SO4干燥并在真空中浓缩。通过硅胶柱色谱(于DCM中的0-20％ MeOH)纯化残余物，得到呈棕色油的化合物104(3.31g，3.20mmol，假定理论产率100％)。所述产物未经进一步纯化即用于下一步骤中。
步骤E
向化合物104(3.31g,3.20mmol,1eq)于乙腈(66.2ml)中的溶液中添加2-硝基苄基溴(2.42g,11.2mmol,3.50eq)和三乙胺(1.78ml,12.8mmol,4.00eq)。在完成反应(通过LC/MS监测，在环境温度下大约20小时)后，将反应混合物在真空中浓缩并通过硅胶柱色谱(60％乙酸乙酯/正庚烷到100％乙酸乙酯)纯化，得到0.568g呈磷非对映异构体混合物的产物。非对映异构体的制备型HPLC分离得到化合物105(SR异构体；0.225g，0.180mmol，来自化合物101的5.6％总产率)和化合物106(RR异构体；0.187g，0.149mmol，来自化合物1的4.7％总产率)。
化合物105(SpRp)1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝8.63(s,1H),δ＝8.61(s,1H),8.04–8.00(m,2H),7.99(s,1H),7.90(s,1H),7.65-7.44(m,8H),7.40-7.31(m,4H),7.25-7.21(m,4H),6.15-5.89(m,5H),5.61(dd,J＝52.0,5.1Hz,1H),5.55(ddd,J＝51.2,4.7,2.7Hz,1H)5.51-5.42(m,1H),5.31-5.22(m,2H),5.11(dd,J＝3.9,9.8Hz,2H),5.04-4.95(m,4H),4.55-4.37(m,7H),4.29-4.12(m,3H)
化合物106(RpRp)1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝8.65(s,2H),8.06(dd,J＝1.4,8.0Hz,2H),7.98(s,2H),7.57-7.52(m,6H),7.47-7.32(m,6H),7.25-7.21(m,4H),6.15(d,J＝18.7Hz,2H),6.09-5.99(m,2H),5.82-5.76(m,2H),5.60(dd,J＝51.8,4.9Hz,2H),5.27(dd,J＝1.2,17.2Hz,2H),5.12(dd,J＝1.0,10.4Hz,2H),5.06-4.96(m,4H),4.55-4.40(m,4H),4.36-4.24(m,4H),4.21-4.02(m,2H)
制备型HPLC条件：
步骤F
向化合物105(519mg,0.414mmol,1eq)于甲苯(519ml)中的加热(90℃)溶液中添加Hoveyda-Grubbs催化剂TM第2代((1,3-双-(2,4,6))-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基)二氯(邻异丙氧基苯基亚甲基)钌；可以目录编号569755获得；CAS301224-40-8；91mg,0.15mmol,0.35eq)和醌(0.102ml,1.243)mmol,3.0eq)。将混合物加热到回流并通过LC/MS监测反应进程。在3h后，添加另外的催化剂(91mg,0.15mmol,0.35eq)并且再继续反应3小时。在冷却下来后，将混合物在环境温度下用DMSO(0.59ml,8.3mmol,20eq)处理15小时，在真空中浓缩并通过硅胶柱色谱(SiO2 25g，于正庚烷中的66％乙酸乙酯到100％乙酸乙酯)纯化，得到呈棕色干泡沫的化合物107(200mg，0.163mmol，39％产率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝8.19(s,1H),8.12(dd,J＝7.8Hz,1.9Hz,1H),8.10(s,1H),8.02(d,J＝8.2Hz,1H),7.89(s,1H),7.63(br d,J＝7.0Hz,1H),7.53-7.41(m,10H),7.35-7.30(m,2H),7.25-7.20(m,4H),6.23(d,J＝17.6Hz,1H),6.14(d,J＝18.8Hz,1H),5.86-5.75(m,1H),5.75(dt,J＝15.3,5.0Hz,1H),5.67(dt,J＝15.3,4.7Hz,1H),5.60(dd,J＝52.0,3.9Hz.1H),5.48(dd,J＝50.4,3.9Hz.1H)5.50–5.39(m,1H),4.91-4.64(m,4H),4.57-4.25(m,9H),4.15(d,J＝7.03Hz,1H),4.11(d,J＝7.03Hz,1H)。
步骤G
向化合物107(88mg,0.072mmol,1eq)于1,4-二烷(1.76ml)中的溶液中添加苯硫酚(0.88mL,8.55mmol,119eq)和三乙胺(0.88mL,6.31mmol,88eq)。在环境温度下搅拌所得混合物。在反应完成(通过LC/MS监测，13小时)后，添加甲醇(5.28ml)和28％氢氧化铵(3.52ml)，并将所得混合物加热到50℃。在完成反应(通过LC/MS监测，5小时)后，将混合物冷却到环境温度并过滤所得微棕色浆料并且用水(15ml)冲洗。再次过滤滤液以去除另外的固体。用甲苯和庚烷的1:1混合物(30ml)将最终滤液萃取两次。将水层在真空中浓缩，然后再悬浮于水(6mL)中。滤出所得固体，并对滤液进行制备型HPLC，得到呈白色固体的化合物1二铵盐(也被称为化合物1a)(39mg，0.050mmol，70％产率)。
化合物1a(SpRp，反式)1H NMR(400MHz,CD3OD)δ＝9.05(s,1H),8.33(s,1H),8.25(s,1H),8.12(s,1H),6.34(br s,2H),5.88(br s,2H),5.66(br d,J＝51.6Hz,1H),5.59(brd,J＝52.2Hz,1H)5.01(br s,2H),4.68-4.34(m,6H),4.07-3.82(m,2H),3.79-3.55(m,2H)；31P NMR(162MHz,CD3OD)δ＝55.48(s,1P),55.16(s,1P)。
化合物1a制备型HPLC条件：
仪器 Agilent 1200/1260AS/FC
HPLC柱 Waters XBridge C18,10×100mm，编号1413
流动速率 3.0ml/min
柱温 35℃
移动相 A：于水中的0.1％NH4OH，B：于乙腈中的0.1％NH4OH
梯度(B％) 0→50
运行时间 20min
注射体积 50μl(4mg/ml，于水中)
检测 UV 260nm
保留时间 6.5min
实施例1.1--化合物1a的替代合成
化合物1a的替代合成途径陈述于图2A和图2B中以及图2C中并且报告于下文。
阶段1
将化合物129(570g,1.53mol,1wt,1vol,1eq)溶解于吡啶(2.85L,35.2mol,4.89wt,5.0vol,23eq)中。将混合物冷却到2.6℃并用4,4'-二甲氧基三苯甲基氯(DMTCl；543g,1.60mol,0.953wt,1.05eq)处理。将混合物在0到5℃下搅拌2h，然后温热到环境温度。通过LC/MS监测反应，并在搅拌过夜后确认完全转化。将反应混合物冷却到低于5℃，并通过用MeOH(124ml,3.05mol,0.172wt,0.217vol,2.0eq)处理15分钟来淬灭。将混合物在真空下与甲苯(2.00L,3.04wt,3.51vol)共蒸发，然后用EtOAc(2.850L,4.5wt,5.0vol)和正庚烷(2.85L，3.42wt，5.0vol)的混合物稀释。用饱和NaHCO3(9wt％于水中的溶液；2.0L，3.5vol)洗涤有机层。添加另外的EtOAc(2.85L,4.5wt,5.0vol)以完全溶解粗制产物。在搅拌5分钟后，分离两层。用水(2.0L,3.5wt,3.5vol)洗涤有机层。固体开始从有机层中缓慢沉淀出来。分离水层。然后将有机层浓缩到大约1vol。用正庚烷(2.00L,2.40wt,3.51vol)和甲苯(0.50L,0.76wt,0.88vol)的混合物浆化粗制产物。在搅拌15分钟后，通过真空过滤收集浅黄色固体。依序用以下物质冲洗滤饼：(1)正庚烷(0.60L,0.72wt,1.05vol)和甲苯(0.30L,0.46wt,0.53vol)的混合物，以及然后(2)正庚烷(3.00L,3.6wt,5.26vol)。将固体在不加热的情况下干燥30分钟，然后转移到托盘中，用于在真空烘箱中在50℃下干燥过夜，得到呈浅黄色固体的化合物130(996.7g，1.47mol，1.75wt，97％产率)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.99(s,1H),8.76(s,1H),8.21(s,1H),8.04-8.00(m,2H),7.64-7.59(m,1H),7.57-7.50(m,2H),7.41-7.36(m,2H),7.32-7.15(m,7H),6.83-6.76(m,4H),6.31(dd,J＝2.5,17.0Hz,1H),5.68(ddd,J＝2.3,4.7,52.7Hz,1H),4.88-4.77(m,1H),4.26-4.21(m,1H),3.77(s,6H),3.57(dd,J＝3.1,10.9Hz,1H),3.43(dd,J＝4.1,10.7Hz,1H),2.60(br s,1H)
阶段1’
将化合物129(430g,1.15mol,1wt,1vol,1eq)和咪唑(118g,1.73mol,0.274wt,1.50eq)溶解于DMF(1.72L,3.78wt,4.0vol)中，并将所得混合物冷却到5℃。添加TBS-Cl(191g,1.27mol,0.444wt,1.10eq)。将混合物在0到11℃下搅拌2h，使其缓慢升温到环境温度(通过LCMS监测进程)。添加TBS-Cl后6h反应完成，仍然在环境温度下再搅拌20h。将混合物冷却到2℃并用甲醇(93ml,74g,2.3mol,0.17wt,0.22wt,2.0eq)处理10分钟。将反应混合物用MTBE(1.72L,1.23kg,2.96wt,4.0vol)和EtOAc(1.72L,1.55kg,3.60wt,4.0vol)的混合物稀释，之后用饱和NH4Cl(28wt％于水中的溶液；2.15L，5.0vol)稀释。固体开始缓慢从溶液中脱出。使混合物温热到24℃并向其(内部温度＝22℃)中添加水(1.08L,1.08kg,2.5wt,2.5vol)。更多的固体开始从混合物中沉淀出来。向混合物中添加另外的水(1.08L,1.08kg,2.5wt,2.5vol)和MTBE(1.40L,1.04kg,2.4wt,3.3vol)。通过真空过滤收集灰白色固体。将反应器用水(320ml,0.74vol)冲洗，然后用MTBE(1.80L,1.33kg,3.10wt,4.19vol)冲洗，以将任何残留的固体转移到过滤器中。依序用以下物质冲洗滤饼：(1)水(1.80L,1.80kg,4.2wt,4.2vol)。(2)水(1.80L，1.80kg,4.2wt，4.2vol)、(3)MTBE(0.90L，0.67kg,1.5wt，2.1vol)和正庚烷(0.90L,0.62kg,1.4wt,2.1vol)的混合物、(4)MTBE(0.90L,0.67kg,1.5wt,2.1vol)和正庚烷(0.90L,0.62kg,1.4wt,2.1vol)的混合物。将回收的固体在40℃下在真空下干燥2天，得到呈白色固体的化合物133(483g，0.991mol，1.12wt，86％产率)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.97(s,1H),8.82(s,1H),8.36(s,1H),8.04-8.00(m,2H),7.64-7.58(m,1H),7.56-7.51(m,2H),6.40(dd,J＝2.3,16.0Hz,1H),5.45(ddd,J＝2.7,4.3,53.1Hz,1H),4.75-4.66(m,1H),4.22-4.17(m,1H),4.07(dd,J＝2.3,11.7Hz,1H),3.91(dd,J＝2.7,11.7Hz,1H),2.38(dd,J＝2.7,7.0Hz,1H),0.92(s,9H),0.11(s,3H),0.11(s,3H)。
阶段2
将化合物130(993g,1.47mol,1wt,1vol,1eq)和咪唑(150g,2.20mol,0.151wt,1.5eq)溶解于DMF(3.48L,3.28kg,3.3wt,3.5vol)中并将混合物冷却到5℃。添加TBS-Cl(244g,1.62mol,0.245wt,1.10eq)。将反应在0到5℃下搅拌2h，使其缓慢升温到环境温度并通过LCMS监测。在17h后，添加另外的咪唑(100g,1.47mol,0.10wt,1.0eq)和TBS-Cl(111g,735mmol,0.112wt,0.50eq)并在环境温度下持续搅拌2h且在35℃下搅拌2h。将所得混合物冷却到13.6℃并用MeOH(119ml,2.94mol,2eq)处理10分钟。在单独的反应器中添加冰(5kg,5wt)和饱和NH4Cl(28wt％于水中的溶液；5.0L，5vol)。将反应混合物添加到冰/NH4Cl混合物中。灰白色固体立即开始从溶液中沉淀出来。向混合物中添加另外2kg冰(2kg,2wt)和水(3.0L,3vol)。用水(0.50L,0.5vol)冲洗反应烧瓶，并将冲洗液添加到混合物中。将正庚烷(2.00L,2vol)添加到混合物中，并继续搅拌10分钟。通过真空过滤收集灰白色固体。用以下物质冲洗滤饼：(1)水(4.0L,4.0vol)、(2)水(4.0L,4.0vol)、(3)正庚烷(4.0L,4.0vol)、(4)正庚烷(4.0L,4.0vol)。将回收的固体在45℃下在真空下干燥4天，得到呈灰白色固体的化合物131(1.095kg，1.39mol，1.10wt，94％产率)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝9.09(s,1H),8.78(s,1H),8.28(s,1H),8.02(d,J＝7.4Hz,2H),7.63-7.59(m,1H),7.55-7.50(m,2H),7.37(d,J＝7.1Hz,2H),7.29-7.17(m,7H),6.79(d,J＝7.9Hz,4H),6.29(dd,J＝2.9,16.2Hz,1H),5.60(ddd,J＝2.7,3.9,53.1Hz,1H),4.78(ddd,J＝4.7,6.4,15.8Hz,1H),4.26-4.22(m,1H),3.77(s,6H),3.58(dd,J＝3.1,10.9Hz,1H),3.26(dd,J＝3.7,10.7Hz,1H),0.85(s,9H),0.10(s,3H),0.02(s,3H)
阶段3
将化合物131(1000g,1.27mol,1wt,1vol,1eq)和反式-2-丁烯-1,4-二醇(通过1H-NMR确认的烯烃几何结构；335g,3.80mol,0.335wt,3.0eq)与THF(3.0L,3.0vol)共沸两次。将残余物溶解于THF(10L,10vol)和甲苯(15L,15vol)的混合物中。添加三苯基膦(432g,1.65mol,0.432wt,1.3eq)，然后将反应混合物冷却到-5℃。经20分钟缓慢添加DIAD(0.320L,1.65mol,333g,0.333wt,0.320vol,1.3eq)，同时保持低于5℃的内部温度。将反应在0-5℃下搅拌1h并通过LCMS监测。去除冰浴，并将混合物温热到rt。在搅拌过夜(17h)后，添加三苯基膦(83g,0.32mol,0.083wt,0.25eq)和DIAD(62ml,0.32mol,64g,0.064wt,0.062vol,0.25eq)。在rt下再过1h后，将反应混合物用MTBE(10L,10vol)稀释，用半饱和NaCl(18wt％于水中的溶液；2×4L)洗涤两次并在真空中浓缩成稠油。将混合物再溶解于MTBE(4.00L,4vol)和正庚烷(0.50L,0.5vol)的混合物中，然后冷却到0℃。向溶液中添加三苯基氧化膦籽晶。固体缓慢开始从溶液中沉淀出来并将其搅拌过夜。通过真空过滤收集白色固体，并用MTBE(2L,2vol)冲洗以分离540g三苯基氧化膦。将滤液浓缩并通过Biotage150L KP-Sil(SiO2 5kg；用于Hep/etOAc中的1％ TEA预处理；洗脱液：庚烷/EtOAc(48L具有1％ TEA的33％ EtOAc、24L具有1％ TEA的50％ EtOAc、24L具有1％ TEA的66％EtOAc)→具有1％ TEA的100％ EtOAc)纯化。通过TLC(2:1EtOAc/正庚烷)监测柱。合并清洁产物级分并在真空下浓缩，得到呈浅白色泡沫固体的化合物132(634g，含有14wt％DIAD衍生副产物，净545g，0.63mol，50％调节产率)。将混合物级分合并且在真空下浓缩，得到浅黄色泡沫固体(750g)，通过Biotage 150M HP-Sphere(2.5kg SiO2；用Hep/EtOAc中的1％ TEA预处理；加载甲苯洗脱液的样品：Hep/EtOAc/1％ TEA(12L具有1％ TEA的50％ EtOAc、16L具有1％TEA的66％ EtOAc)→具有1％ TEA的EtOAc)对其进行再纯化。通过TLC(2/1/0.03EtOAc/正庚烷/TEA)监测柱。合并清洁产物级分并在真空下浓缩，得到呈浅白色泡沫状固体的另外化合物132(206g，0.24mol，18％产率)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.58(s,1H),8.10(s,1H),7.43-7.37(m,2H),7.32-7.28(m,2H),7.24-7.15(m,8H),7.03-6.98(m,2H),6.78-6.73(m,4H),6.18(dd,J＝2.7,17.2Hz,1H),5.88(td,J＝5.5,15.6Hz,1H),5.77(td,J＝5.1,15.6Hz,1H),5.60(ddd,J＝2.7,4.3,53.1Hz,1H),5.03-4.96(m,2H),4.91(ddd,J＝4.5,6.6,16.6Hz,1H),4.18-4.14(m,1H),3.88-3.82(m,2H),3.78(s,6H),3.52(dd,J＝2.7,10.9Hz,1H),3.14(dd,J＝3.5,10.9Hz,1H),0.85(s,9H),0.10(s,3H),0.01(s,3H)。
阶段4
将化合物132(800g,0.930mol,1wt,1vol,1eq)和化合物133(522g,1.07mol,0.652wt,1.15eq)与THF(2×3L,2×3.8vol)共沸干燥并在rt下再溶解于THF(9.60L,8.45kg,12.0vol)中。添加三苯基膦(317g,1.21mol,0.396wt,1.30eq)，并将混合物冷却到低于-5℃。在低于7℃的内部温度下添加DIAD(226ml,1.16mol,235g,0.294wt,0.283vol,1.25eq)。使反应缓慢温热到rt。通过LCMS监测反应。在21h后，将反应混合物在真空中浓缩成稠油，与正庚烷(2.00,1.37kg,1.71wt,2.50vol)共沸，然后再溶解于MTBE(2.40L,1.78kg,2.2wt,3.0vol)和正庚烷(800ml,547g,0.68wt,1.0vol)的混合物中。将溶液用三苯基氧化膦接种并冷却到5℃，用正庚烷(400ml,274g,0.34wt,0.50vol)稀释，并在5℃下搅拌30分钟。通过真空过滤收集白色固体沉淀物，并用MTBE和正庚烷的2:1(v/v)混合物(1.8L)冲洗，得到三苯基氧化膦(455g)。将滤液在真空下浓缩并通过Biotage 150L KP-Sil(SiO25kg；用1％ TEA预处理；通过溶解于甲苯洗脱液中加载的样品：9:1庚烷/EtOAc(16L)和15TEA，3.6:1(46L)，2:1(20L)和1％ TEA，1:1(30L)和1％ TEA，以及100％ EtOAc(16L)和1％ TEA)纯化。将合并的清洁产物级分在真空下浓缩，得到呈灰白色固体泡沫的化合物134(662.2g)。合并混合物级分并在真空下浓缩(480g)。通过真空过滤去除在加载到Biotage150L上之前用甲苯(300ml)稀释形成的白色不溶性固体。通过Biotage 150M HP-Sphere(SiO2 2.5kg(用1％ TEA预处理)；用甲苯加载样品；洗脱液：2:1庚烷/EtOAc(26L)w/1％TEA、1:1(25L)w/1％ TEA、1:4(34L)w/1％ TEA)纯化可溶于甲苯中的材料。通过TLC(1:1庚烷/EtOAc)监测柱。将合并的清洁产物级分在真空下浓缩，得到呈灰白色固体泡沫的另外化合物134(165.5g，总计662.2+165.5g＝827.7g，930mmol，1.03wt，67％产率)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.47(s,1H),8.39(s,1H),8.20(s,1H),8.01(s,1H),7.38-7.31(m,5H),7.27-7.19(m,6H),7.14-7.06(m,3H),6.93-6.87(m,2H),6.76(d,J＝8.6Hz,4H),6.26(dd,J＝2.0,16.0Hz,1H),6.15(dd,J＝2.7,17.2Hz,1H),5.86(dd,J＝4.7,15.2Hz,1H),5.80(dd,J＝4.7,15.2Hz,1H),5.51(ddd,J＝2.7,4.3,52.8Hz,1H),5.31(ddd,J＝2.0,4.3,52.8Hz,1H),4.87(d,J＝4.7Hz,2H),4.85-4.81(m,1H),4.79(d,J＝4.3Hz,2H),4.71-4.59(m,1H),4.20-4.13(m,2H),4.06(dd,J＝2.7,11.3Hz,1H),3.90(dd,J＝2.7,11.7Hz,1H),3.77(s,6H),3.52(dd,J＝3.1,10.9Hz,1H),3.18(dd,J＝3.9,10.9Hz,1H),0.92(s,9H),0.84(s,9H),0.10(s,3H),0.09(s,6H),0.07(s,3H)
阶段5-6
向化合物134(410.7g,309mmol,1wt,1vol,1eq)于吡啶(1.23L,1.21kg,15.2mol,2.9wt,3.0vol,49eq)中的溶液中添加亚磷酸二苯酯(90ml,109g,0.46mol,0.26wt,0.22vol,1.5eq)。在rt下搅拌反应并通过LCMS监测。在2h(80％转化)后，添加另外的亚磷酸二苯酯(29.9ml,36.2g,155mmol,0.088wt,0.073vol,0.50eq)。再过1h后，添加额外的亚磷酸二苯酯(6.0ml,7.2g,31mmol,0.018wt,0.015vol,0.10eq)，并且再继续反应0.5h(98％转化)。将反应混合物添加到饱和NaHCO3(9wt％于水中的溶液；2.1L，5vol)和水(1.0L ml，2.5vol)的混合物中，同时保持4.7到12℃的内部温度。用少量EtOAc冲洗反应器。在rt下持续搅拌30分钟并通过LCMS监测反应(100％转化)。用EtOAc和MTBE(2×8.2L,2×20vol)的1:1混合物将反应混合物萃取两次。将合并的有机层用水(4.1L,10vol)洗涤，在真空中浓缩并与甲苯(3×4.1L，3×10vol；连续进料)共沸用于去除吡啶，得到化合物135(残留0.55eq吡啶)。
阶段6-在环境温度下将粗制化合物135溶解于二氯甲烷(3.08L，4.07kg，9.9wt，7.5vol)中。添加水(55.7ml,0.136vol,10eq)，之后添加二氯乙酸(77ml,120g,0.93mol,0.29wt,0.19vol,3.0eq)于DCM(3.08L,7.5vol)中的溶液，同时保持低于25℃的内部温度。(变成橙色溶液)。在30min后，添加三乙基硅烷(Et3SiH；494ml,359g,3.09mol,0.875wt,1.20vol,10.0eq)(T-内部从18.2℃变为17℃)并继续搅拌20min。添加三乙胺(431ml,313g,3.09mol,0.762wt,1.05vol,10.0eq)(内部温度从17.8℃变为22℃)。将混合物浓缩到1.55kg(3.8wt)，再溶解于EtOAc(6.2L,5.5kg,14wt,15vol)中，依序用以下物质洗涤：(1)水(1.0L,2.5vol)和饱和NaHCO3(9wt％于水中的溶液，0.82L，2.0vol)。将粗制产物EtOAc溶液在-20℃下储存过夜(0.82L，2.0vol)；且在第二天，将溶液在25℃下在真空中浓缩。将由此获得的粗制混合物(654g)与以下研磨：(1)正庚烷(3.01L,7.5vol)，(2)正庚烷(2.46L,6.0vol)和甲苯(0.82L，2.0vol)的混合物。倾析出溶液部分(上清液)，并将残留在底部的固体溶解于乙腈(4.1L,10vol)中。将混合物在25℃下在真空中浓缩，并与乙腈共沸两次，得到化合物136。产物未经纯化即用于后续阶段(假定理论产率100％)。
阶段7
阶段7a在rt下将化合物136(337g,309mmol,1wt,1vol,1eq)溶解于无水吡啶(13.5L,13.2kg,39wt,40vol)中。添加三乙胺(129ml,927mmol,94g,0.28wt,0.38vol,3.0eq)，之后添加2-氯-5,5-二甲基-1,3,2-二氧磷杂环己烷-2-氧化物(DMOCP；103g，556mmol,0.31wt,1.80eq)。将所得混合物在环境温度下搅拌30分钟并通过LCMS(100％转化)监测以产生化合物137。
阶段7b将TEA(129ml,927mmol,94g,0.28wt,0.38vol,3.0eq)、水(100ml,5.56mol,0.30wt,0.30wt,18eq)和硫(34.7g,1.08mol,0.10wt,3.5eq)添加到化合物137的上述混合物中。在90分钟(100％转化)后，添加NaHCO3(9wt％于水中的溶液；3.37L，10vol)，同时保持低于30℃(16.6℃到27℃)的内部温度。过滤所得混合物以去除盐。将滤液在真空中浓缩混合物，用MTBE(5.1L,15vol)稀释，并用NaCl(30wt％于水中的溶液；2×1.35L，2×4vol)洗涤两次。滤出不溶性固体，并将滤液在真空中浓缩且与甲苯(4.0L,12vol)共沸。通过过滤去除所得固体，并将粗制混合物溶解于甲苯中，并且通过Biotage 150L KP-Sil(SiO2 5kg；用Hep/EtOAc/TEA(1.5/1.5/0.03CV)预处理；用以下物质洗脱：EtOAc/TEA(3/0.03CV)、EtOAc/MeOH/TEA(4/0.2/0.04CV)、EtOAC/MeOH/TEA(2/0.2/0.02CV))纯化。通过TLC(EtOAC/MeOH/TEA＝9/1/0.1)监测柱。合并含有Sp异构体的级分并在真空下浓缩，得到呈浅粉红色泡沫固体的化合物138(Sp异构体；154g，128mmol，0.46wt，41.3％产率)。合并含有Rp异构体的级分并在真空下浓缩，得到呈浅粉红色泡沫固体的化合物240(Rp异构体；64g，53mmol，0.19wt，17％产率)。
化合物138(Sp异构体)：
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.51(s,1H),8.50(s,1H),8.22(s,1H),8.14(s,1H),7.49–7.44(m,2H),7.38-7.27(m,4H),7.25-7.21(m,2H),7.14(t,J＝7.1Hz,2H),6.44(dd,J＝2.5,13.9Hz,1H),6.18(d,J＝15.2Hz,1H),5.78(td,J＝6.3,15.6Hz,1H),5.69(td,J＝4.7,15.6Hz,1H),5.56(dd,J＝3.9,50.8Hz,1H),5.20-5.06(m,1H),4.95-4.79(m,4H),4.69(dd,J＝4.3,16.0Hz,1H),4.54-4.38(m,3H),4.35(d,J＝5.5Hz,1H),4.32-4.29(m,1H),4.05(dd,J＝1.6,11.7Hz,1H),3.91(dd,J＝3.1,11.7Hz,1H),3.14-3.06(m,6H),1.30(t,J＝7.4Hz,9H),0.91(s,9H),0.90(s,9H),0.12(s,3H),0.08(s,3H),0.06(s,3H),0.05(s,3H)
化合物240(Rp异构体)：
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.54(s,1H),8.38(s,1H),8.33(s,1H),8.01(s,1H),7.39-7.09(m,10H),6.39(dd,J＝2.3,14.1Hz,1H),6.13(d,J＝17.2Hz,1H),5.72(d,J＝3.1Hz,2H),5.68(dd,J＝4.3,51.2Hz,1H),5.43-5.29(m,1H),5.10-4.96(m,3H),4.90-4.83(m,2H),4.78-4.72(m,1H),4.52(ddd,J＝3.9,6.6,17.2Hz,1H),4.44–4.35(m,2H),4.31-4.26(m,1H),4.20–4.12(m,2H),3.87(dd,J＝3.5,11.7Hz,1H),3.79-3.77(m,1H),3.15-3.09(m,6H),1.33(t,J＝7.4Hz,9H),0.94(s,9H),0.89(s,9H),0.13(s,3H),0.12(s,3H),0.10(s,3H),0.09(s,3H)
阶段8
将化合物138(221g,183mmol,1wt,1vol,1eq)溶解于吡啶(530ml,6.56mol,519g,2.3wt,2.4vol)和TEA(2.65L,19.0mol，1.93kg,8.7wt,12vol,104eq)的混合物中。添加三乙胺三氢氟化物(264ml，1.62mol，262g，1.2wt，1.2vol，8.9eq作为络合物，27eq HF)，并在RT下搅拌混合物，同时通过LCMS监测转化。在3h(97％转化)后，添加甲氧基三甲基硅烷(TMSOMe；1.40L,10.2mol,1.06kg,4.8wt,6.3vol,55eq)并继续搅拌30分钟。粘性固体涂覆反应器。倾析出溶液部分(上清液)。将固体用甲苯(2×2.2L，2×10vol；倾析出上清液)研磨两次。将残留在反应器中的粗制固体溶解于二氯甲烷(2.2L,10vol)中并用NH4Cl(28wt％于水中的溶液；2.2L，10vol)洗涤。用二氯甲烷(2.2L,10vol)反萃取水层。将合并的有机层用NaCl(36wt％于水中的溶液；1.1L，5vol)和水(1.1L,5vol)的混合物洗涤，然后在真空下浓缩，得到呈棕褐色干泡沫的化合物139(152g，155mmol，0.70wt，85％产率)。粗制产物未经纯化即用于下一步骤。
阶段9
将化合物139(150g,153mmol,1wt,1vol,1eq)与乙腈(4L,27vol)共沸，然后在rt下再溶解于乙腈(1.05L,0.83kg,5.5wt,7.0vol)中。在rt下添加2-硝基苄基溴(44.4g,205mmol,0.30wt,1.34eq)，并通过LCMS监测反应。在23h(100％转化)后，添加EtOAc(1.50L,10vol)、NH4Cl(28wt％于水中的溶液；300ml，2vol)和水(300ml,2vol)(pH＝6)并将所得混合物在25℃下在真空下部分浓缩到1.11kg的重量。添加EtOAc(2.25L,15vol)并将混合物搅拌5分钟。分离两层。用乙酸乙酯(750ml,5vol)萃取水层。将合并的有机层依序用以下物质洗涤：(1)NaCl(36wt％于水中的溶液；300ml，2vol)和水(300ml,2vol)的混合物以及(2)水(600ml,4vol)。然后将有机层在真空下浓缩并与正庚烷(1.50L,10vol)共沸。将MTBE(0.95L,6.3vol)添加到粗制固体中，并在40℃下加热混合物。将混合物用EtOAc(300ml,2vol)稀释，并缓慢冷却到0℃。使致密固体沉降，并通过过滤器玻璃料管(filter frittube)泵出上清液。用MTBE(2×300ml，2×2vol；每次通过滤器玻璃料管泵出的上清液)将固体冲洗两次，并在40℃下在真空下干燥过夜，得到呈浅黄色固体的化合物140(156g)。将滤液在真空下浓缩，获得棕色油(17.8g)，将其通过Biotage Snap-Ultra 340g(洗脱液：于EtOAc中的0％到5％MeOH)纯化，得到呈浅黄色固体的另外化合物140(5.8g)。总计156g+5.8g＝161.8g(净152mmol，95％纯，99％产率)
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.46(s,1H),8.15(s,1H),8.10(s,1H),8.09-8.06(m,1H),7.89(s,1H),7.54-7.51(m,1H),7.49-7.45(m,4H),7.37-7.28(m,3H),7.24-7.19(m,3H),7.16-7.11(m,2H),6.22(d,J＝16.8Hz,1H),6.14(dd,J＝2.7,17.2Hz,1H),5.83-5.61(m,3H),5.60-5.48(m,1H),5.07(dd,J＝3.5,51.6Hz,1H),5.06-4.96(m,1H),4.79(dd,J＝4.9,15.8Hz,1H),4.69(d,J＝5.9Hz,2H),4.67-4.56(m,1H),4.48-4.40(m,3H),4.37–4.30(m,1H),4.27(d,J＝5.9Hz,2H),4.19-4.13(m,1H),3.93-3.85(m,1H),3.85–3.78(m,1H)
阶段10-11
阶段10将化合物140(95％纯，净73.2g，72.3mmol，1wt，1vol，1eq)和2-氰乙基N,N,N',N'-四异丙基亚磷酰二胺(25.3ml,79.5mmol,0.33wt,0.35vol,1.10eq)与无水乙腈(3×2L)共沸三次，再溶解于二氯甲烷(0.73L,10vol)中并冷却到0-5℃。添加四唑二异丙基铵(6.19g,36.1mmol,0.085wt,0.50eq)。将所得反应混合物在0℃下搅拌10h，经2h升温到10℃且保持10h，并且经2h升温到rt。通过LCMS和TLC(EtOAc，含0.5％ TEA)监测反应。在18h后，添加无水乙腈(0.73L,10vol)，并将混合物在-20℃下储存3天。
阶段11a将来自阶段10的混合物温热到环境温度并通过滴液漏斗逐份(每30分钟100mL，经过9h)添加到三氟乙酸吡啶盐(预先与吡啶共沸两次；41.9g,217mmol，0.57wt,3.0eq)和乙腈(5.85L,80vol)的混合物中。通过LCMS监测反应。在13h后，经4h添加2-氰乙基N,N,N',N'-四异丙基亚磷酰二胺(5.8mL,18mmol,0.25eq)的于乙腈(24mL)中的溶液。基于残留化合物140(约30％，基于LCMS)确定额外试剂的量。6h后观察到更多的二醇转化。
阶段11b添加((二甲基氨基亚甲基)氨基)-3H-1,2,4-二噻唑啉-3-硫酮(DDTT；20.8g,101mmol,0.28wt,1.4eq)并继续搅拌1h。将反应混合物部分浓缩到约800mL，并用MTBE(1.46L,20vol)、NaHCO3(9wt％于水中的溶液；1.1L，15vol)和水(0.37L,5vol)稀释。pH＝8。分离各层，并用MTBE(1.46L,20vol)和EtOAc(1.10L,15vol)的混合物萃取水层。将合并的有机层用30％NaCl水溶液(2×0.73L,2×10vol)洗涤两次，在35℃下在真空下浓缩并与甲苯(1.46L,20vol)共沸。LCMS和TLC(EtOAc)表明化合物143(SpRp，期望的):化合物241(SpSp)＝5:1
通过Biotage 150M KP-Sil(SiO2 2.5kg；洗脱液：EtOAc/Hep：2:1(4CV)、3:1(2.5CV)、4:1(2.5CV)、100％ EA(3CV)，于EA 4CV中的5-10％ MeOH)纯化粗制产物，得到化合物143(36g，31.5mmol，44％产率)。
化合物143(SpRp)：1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.59(s,1H),8.10(s,1H),8.03-7.99(m,1H),7.91(s,1H),7.56-7.53(m,2H),7.49-7.40(m,5H),7.35-7.28(m,2H),7.24-7.16(m,4H),6.92(s,1H),6.29(d,J＝14.9Hz,1H),6.08(d,J＝20.7Hz,1H),5.97-5.83(m,1H),5.76(td,J＝4.7,15.6Hz,1H),5.61-5.51(m,2H),5.40(d,J＝4.3Hz,1H),5.29-5.17(m,1H),4.91(dd,J＝7.4,14.9Hz,1H),4.86-4.75(m,3H),4.63(dd,J＝3.7,9.2Hz,1H),4.58-4.43(m,5H),4.34-4.19(m,4H),2.79(td,J＝5.9,16.8Hz,1H),2.66(td,J＝6.3,16.8Hz,1H)。
化合物241(SpSp)1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.11(s,1H),8.03(d,J＝8.2Hz,1H),7.94(s,1H),7.90(s,1H),7.61(s,1H),7.56-7.40(m,7H),7.33-7.28(m,2H),7.23-7.17(m,4H),6.22(d,J＝17.6Hz,1H),6.15(d,J＝18.8Hz,1H),5.85(dd,J＝3.5,51.2Hz,1H),5.75-5.45(m,5H),4.95-4.23(m,14H),2.82(t,J＝6.1Hz,2H)。
阶段12
将化合物143(71.6g,62.6mmol,1wt,1vol,1eq)溶解于1,4-二烷(0.43L,6vol)中。添加苯硫酚(215ml,2.09mol,230g,3.2wt,3vol,>30eq)，之后添加三乙胺(215ml,1.54mol,156g,2.2wt,3vol)。观察到一些放热(内部温度增加约7℃)，因此，使用水/冰浴冷却并控制低于27℃的内部温度。通过LCMS监测反应。在2h后，添加MeOH(0.57L,8vol)和NH4OH(28wt％；15mol,0.57L,8vol,>200eq)。将所得混合物在50℃下加热5h，冷却到rt并搅拌过夜。在14h后，添加水(0.72L,10vol)(未观察到固体)，并用正庚烷和甲苯(3×0.86L,3×12vol)的1:1(v/v)混合物将混合物萃取三次，之后用甲苯(0.57L,8vol)萃取。将水层在40-50℃下在真空中浓缩，并用水(1.07L,15vol)稀释。将所得浆料在rt下保持过夜。滤出所得固体，用水(0.36L,5vol)冲洗。滤液仍然是混浊的，并通过硅藻土和Kuno过滤器过滤。混浊仍然存在。经1h添加HCl(1.0M于水中的溶液；132ml，132mmol，2.1eq)并检查pH(pH<2)。在rt下持续搅拌1h并过滤混合物。将滤饼用水(8×0.20L)冲洗，在真空烘箱中在35℃下干燥2天且在不加热的情况下干燥1天，得到呈浅橙色固体的化合物1(44.88g，60.1mmol，0.63wt，96％产率)。
阶段13
向游离酸化合物1(22.42g,30.03mmol,1wt,1vol,1eq)中添加氨(2.0M于MeOH中的溶液；220ml,440mmol,10vol,15eq)。添加EtOH(55ml,2.5vol)，并将所得溶液通过Kuno过滤器(0.45微米；PTFE)过滤，用MeOH和EtOH的1:1(v/v)(90mL,4vol)混合物冲洗。将滤液在30℃下在真空中浓缩，获得灰白色固体，将其在rt下干燥过夜，用刮刀(易于破碎)研磨并在rt下在真空中进一步干燥。然后将分离的固体悬浮于甲苯(250ml)中并在rt下搅拌30分钟。然后通过真空过滤收集固体并用甲苯(2×50ml)冲洗两次。然后将固体在真空烘箱中在真空下干燥，得到22.4g化合物1a(化合物1的二铵盐)。
再结晶：将化合物1a(22.14g,28.36mmol,1wt,1vol,1eq)溶解于水(664ml,30vol)和氢氧化铵(28wt％；2.5ml,18mmol,0.63eq)(pH＝9-10)的混合物中并用甲苯(3×300ml,3×14vol)萃取三次，用EtOAc(3×200ml,3×9vol)萃取三次，且用甲苯(3×300ml,3×14vol)萃取三次。经3.5小时的时段用HCl(1.0M于水中的溶液；90ml,90mmol,3.2eq)(pH≤2)处理所得水层。将混合物搅拌30分钟，然后通过真空过滤收集固体沉淀物。将滤饼用水(3×200ml,3×9vol)洗涤三次并真空干燥过夜。将氨(于MeOH中的2.0M溶液；250ml，500mmol，17.6eq)和乙醇(100ml)添加到固体中，并将所得混合物在真空中浓缩直到出现晶体(约100ml)，此时停止浓缩并将混合物搅拌20min。添加乙醇(45mL)，并将混合物部分浓缩(去除45mL)。将相同的操作再重复两次，然后将混合物冷却到0℃并搅拌3.5h。通过真空过滤收集白色固体，并用冷乙醇(20ml)洗涤，之后用乙酸乙酯(2×50mL)洗涤。将白色固体在rt下在真空下干燥3天，得到呈白色固体的化合物1a(16.6g，21.3mmol，0.75wt，75％产率)。将滤液在真空下浓缩且在rt下在真空下干燥3天，得到呈灰白色固体的化合物1a(4.16g，5.3mmol，18％产率)。
实施例1.2-化合物1的1H NMR分析
化合物1a的1H NMR谱图示于图3中。所得光谱是：
1H-NMR谱(400MHz,DMSO-d6,δH 2.49ppm,80℃)
δ(ppm)：3.05-3.13(4H,m),3.70(1H,dd,J＝13,5Hz),3.78(1H，dd,J＝12,4Hz),4.21-4.24(2H,m),4.28(1H,m),4.38(1H,m),4.53-4.68(2H,m),5.22(1H,m),5.76(2H,s),5.78(1H,m),6.26(1H,m),6.29(1H,m),8.13(1H,s),8.14(1H,s),8.36(1H,brs),8.59(1H,brs)。
实施例1.3–化合物1的X射线分析
将约2mg化合物1溶解于600μL水中。将120μL该溶液置于另一玻璃小瓶中，然后将该小瓶在具有3mL MeCN的固定容器中在室温下储存1周。这是H2O/MeCN蒸气扩散方法的样品制备。
将在结晶溶液中发现的无色块状单晶(0.1×0.1×0.1mm)分散于液体Parabar10312中并安装在Dual-Thickness MicroMountsTM(MiTeGen)上。使用多层镜面单色Cu-Kα辐射，利用ω轴线振荡法在XtaLAB PRO P200MM007HF(Rigaku)上在-160℃下收集衍射数据。
图4A显示不对称单元中化合物1分子连同大量无序水分子的ORTEP图。图4B显示来自图4A的一种化合物1分子的晶体结构。图4C显示图4A中所示化合物1的另一分子的晶体结构。
以0.1354的最终R因子解析化合物1的晶体结构。Flack参数接近为零(0.083(17))，表明化合物1的绝对构型为(R，S)。晶体结构分析还表明许多水分子存在于化合物1的大通道中，这表明水分子能够容易地从通道中滑出。分析还确认不对称单元的两个结晶学上独立的分子的构象几乎相同。
X射线分析的其他参数如下所示：
实施例2–化合物2的合成
通过实施例1步骤F和实施例1步骤G单独地处理从实施例1步骤E获得的化合物106(化合物105的RpRp异构体)，得到化合物2a(化合物1a的RR异构体)：
化合物108(RpRp)1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝8.12(dd,J＝8.2,0.8Hz，2H),7.99(s，2H),7.96(s，2H)，7.65-7.48(m,10H)，7.38-7.33(m,2H),7.26–7.24(m,4H),6.22(d，J＝17.6Hz,2H),5.95-5.84(m,2H),5.71(dd,J＝50.8,3.9Hz,2H)5.73-5.71(m,2H),,4.88-4.77(m，4H)，4.59-4.38(m,8H),4.19(m,2H)。
化合物2a(RpRp，反式)1H NMR(400MHz,CD3OD)δ＝8.70(s,1H),8.49(s,1H),8.23(s,1H),8.09(s,1H),6.34(br s,2H),5.83(br s,2H),5.73-5.53(m,2H),5.38-5.01(m,2H),4.76–4.32(m,6H),3.95(br s,2H),3.69-3.64(m,2H)；31P NMR(162MHz,CD3OD)δ＝55.57(s,1P),55.32(s,1P)。
实施例2.1-化合物2的X射线分析
称量化合物2(0.5mg)并将其溶解于乙腈/28％氨溶液中。然后，将该溶液储存在室温下，松散地固定盖子。2周后出现棒状晶体。
将在结晶溶液中发现的无色块状单晶(0.1×0.1×0.5mm)分散于液体Parabar10312中并安装在Dual-Thickness MicroMountsTM(MiTeGen)上。使用多层镜面单色Cu-Kα辐射，利用ω轴线振荡法在XtaLAB PRO P200MM007HF(Rigaku)上在-160℃下收集衍射数据。
图4D显示化合物2分子的ORTEP图。
该X射线分析的其他参数如下所示：
实施例3-化合物3的合成
通过实施例1步骤F和实施例1步骤G单独地处理从实施例1步骤E获得的化合物109(化合物105的SpSp异构体)，得到化合物3a(化合物1a的SS异构体)：
化合物109(化合物105的SpSp异构体)：1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.52(s,2H),7.99(d,J＝8.2Hz,2H),7.91(s,2H),7.63-7.40(m,10H),7.35-7.28(m,2H),7.23-7.16(m,4H),6.10-5.93(m,4H),5.92-5.75(m,2H),5.62-5.50(m,2H),5.26-5.16(m,2H),5.09-5.03(m,2H),4.98-4.91(m,4H),4.61-4.25(m,10H)
化合物3a(SpSp，反式)：1H NMR(400MHz,CD3OD)δ＝8.97(br s,1H),8.84(br s,1H),8.21(br s,2H),6.31(br s,2H),6.08(br d,J＝53.5Hz,1H),5.89(br s,2H),5.63(brd,J＝52.4Hz,1H),5.13-4.96(m,2H),4.72-4.32(m,6H),4.01(br d,J＝9.8Hz,2H),3.67(br s,2H)。
实施例4--化合物4a的合成
通过实施例1步骤G单独地处理从实施例2步骤F获得的通过硅胶色谱分离为唯一的顺式异构体的化合物107，得到化合物4a。
化合物107：1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.13(s,2H),8.12-8.08(m,2H),7.91(s,2H),7.65-7.55(m,4H),7.54-7.45(m,6H),7.33-7.27(m,2H),7.23-7.16(m,4H),6.14(d,J＝17.6Hz,2H),5.88(dd,J＝3.9,50.8Hz,2H),5.76-5.61(m,4H),5.21-4.99(m,4H),4.60-4.46(m,4H),4.45-4.37(m,2H),4.30-4.13(m,4H),3.49(d,J＝5.1Hz,2H)
化合物4a(RpRp，1a的顺式，化合物4a)：1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ＝8.48(br s,2H),8.02(br s,2H),6.29(d,J＝14.8Hz,2H),5.99(br s,2H),5.43(d,J＝51.2Hz,2H),5.03-4.88(m,2H),4.43(br d,J＝11.7Hz,2H),4.32(br d,J＝9.4Hz,2H),4.27-4.17(m,2H),4.21-4.02(m,2H),3.97(br dd,J＝6.1,12.3Hz,2H)。
实施例5--化合物5的合成
通过实施例1步骤G单独地处理从实施例1步骤F获到的顺式异构体，得到化合物5a。
化合物111(化合物107的顺式异构体)：1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.48(s,1H),8.15-8.09(m,1H),8.03(d,J＝8.2Hz,1H),7.94(s,1H),7.75(s,1H),7.65-7.06(m,11H),6.07(d,J＝17.2Hz,1H),5.98(d,J＝20.3Hz,1H),5.97-5.79(m,1H),5.84(dd,J＝3.5,51.2Hz,1H),5.54-5.47(m,1H),5.50(dd,J＝3.9,52.0Hz,1H),5.38-5.21(m,2H),5.18-5.02(m,2H),5.02-4.95(m,1H),4.78-4.69(m,1H),4.60-4.16(m,10H)
化合物5a(SpRp，1a的顺式)：1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ＝8.88(br s,1H),8.51(brs,1H),8.16(s,1H),8.05(s,1H),6.38(d,J＝15.6Hz,1H),6.33(d,J＝14.1Hz,1H),6.14-6.09(m,2H),6.01(d,J＝49.2Hz,1H),5.42(d,J＝49.6Hz,1H),5.02-4.87(m,2H),4.76-3.92(m,8H),3.75-3.56(m,2H)
实施例6--化合物6a(SpRp)的合成
在环境温度下向化合物1a(1.5mg,2.0μmol)于MeOH/H2O(0.6/0.5ml)中的溶液中添加炭载氢氧化钯(20wt.％，以干重计，2mg)。用氢气(气球)处理所得混合物，同时通过LCMS监测反应。在完全消耗起始材料后，将混合物过滤并用甲醇冲洗直到所有产物清出。在真空中浓缩滤液，并将残余物溶解于水(1ml)中。RHPLC纯化提供化合物6a(0.9mg)。
LCMS(MS m/z 749.2[M+H]+)
实施例7--化合物9的合成
向107(3.7mg,3.02μmol)于EtOH(1.5mL)中的溶液中添加氢氧化铵(1mL)。将所得混合物在50℃下加热8h并冷却到环境温度。在降低的压力下去除溶剂。用2mL水处理残余物，并滤出所得固体。对滤液进行制备型HPLC，得到化合物9a(2.5mg)。
化合物9a：1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ＝8.67(br s,1H),8.50(br s,1H),8.25(brs,1H),8.12(br s,1H),6.47-6.28(m,2H),5.92-5.79(m,2H),5.74(d,J＝50.8Hz,1H),5.32(d,J＝52.4Hz,1H),5.16-4.95(m,2H),4.71-4.25(m,6H),4.17-3.97(m,2H),3.83-3.61(m,2H)。
LCMS：MS m/z 715.2[M+H]+。
实施例8--用于化合物8a、11a和12a的合成途径
以化合物112和化合物102作为起始材料，通过与实施例1中所述相同的反应次序制备化合物8、11和12。
用于级分A和B的制备型HPLC条件
化合物8a：级分A进行实施例1的步骤G，得到通过HPLC分离的两种异构体。化合物8a是较快运行的异构体(保留时间：4.1min)，且化合物37a(保留时间：4.5min)是较慢运行的异构体。
1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ＝9.01(s,1H),8.61(s,1H),8.22(s,1H),8.20(s,1H),6.34(d,J＝10.2Hz,1H),6.31(d,J＝10.9Hz,1H),5.92(dd,J＝2.7,51.2Hz,1H),5.85-5.71(m,2H),5.37(d,J＝51.6Hz,1H),4.81-4.56(m,6H),4.52(br d,J＝12.1Hz,1H),4.42(brd,J＝9.4Hz,3H),4.05(dd,J＝4.1,11.9Hz,1H),3.95(br dd,J＝4.3,12.1Hz,1H),3.94-3.84(m,1H),3.62(br dd,J＝4.9,15.4Hz,1H),2.71-2.58(m,1H),2.46-2.33(m,1H)
31P NMR(162MHz，甲醇-d4)δ＝55.36(s,1P),55.18(s,1P)
LCMS：MS m/z 761.2[M+H]+
化合物37a：1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ＝8.95(s,1H),8.40(s,1H),8.18(s,1H),8.15(br s,1H),6.34(d,J＝5.5Hz,1H),6.31(d,J＝6.6Hz,1H),5.96-5.68(m,3H),5.40(dd,J＝2.7,51.6Hz,1H),4.85(s,3H),4.58(br d,J＝12.1Hz,1H),4.49(br d,J＝12.1Hz,1H),4.43-4.33(m,3H),4.29(dd,J＝8.6,14.1Hz,1H),4.05(dd,J＝4.5,11.9Hz,1H),3.95(dd,J＝4.9,12.3Hz,1H),3.94-3.86(m,1H),2.67-2.55(m,1H),2.52-2.40(m,1H)。
化合物8a/37a的制备型HPLC条件：
级分B经过实施例1的步骤G处理，得到两种异构体,其通过下述制备型HPLC分离。化合物11a是较快运行的异构体(保留时间：11.2min)，且化合物12a是较慢运行的异构体(保留时间：12.1min)
化合物11a：1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ＝8.63(br s,2H),8.18(br s,1H),8.17(brs,1H),6.34(d,J＝13.3Hz,1H),6.32(d,J＝12.9Hz,1H),5.86-5.65(m,2H),5.48(d,J＝48.5Hz,1H),5.35(d,J＝43.8Hz,1H),4.84-4.53(m,6H),4.47-4.36(m,2H),4.05-3.91(m,2H),3.96-3.85(m,1H),3.70-3.54(m,1H),2.66-2.54(m,1H),2.43-2.30(m,1H)
化合物12a：1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ＝8.56(br s,1H),8.41(s,1H),8.17(s,1H),7.95(br s,1H),6.35(d,J＝14.8Hz,1H),6.31(d,J＝15.2Hz,1H),5.82-5.65(m,2H),5.50(d,J＝51.2Hz,1H),5.36(d,J＝53.9Hz,1H),4.74-4.33(m,8H),4.26-4.16(m,1H),4.07-3.93(m,3H),2.64-2.44(m,2H)。
化合物11a/12a的制备型HPLC条件：
实施例9--用于化合物13和14的合成途径
以化合物114和化合物115作为起始材料，通过与实施例1中所述相同的反应次序加上TBS脱保护步骤制备化合物13和14。
化合物116：1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝9.36(s,1H),9.18(s,1H),8.77(s,1H),8.76(s,2H),8.07(br dd,J＝1.8,7.6Hz,3H),8.05-8.00(m,2H),7.99(s,1H),7.87-7.82(m,1H),7.70-7.65(m,1H),7.63-7.55(m,3H),7.55-7.41(m,6H),7.39-7.35(m,1H),7.30-7.26(m,1H),6.37(d,J＝8.6Hz,1H),5.89(d,J＝4.7Hz,1H),5.36-5.27(m,2H),5.15(ddd,J＝3.7,8.4,11.7Hz,1H),4.64-4.43(m,4H),4.43-4.38(m,1H),4.37-4.30(m,1H),4.23-4.13(m,2H),4.11-3.98(m,2H),3.97-3.86(m,1H),0.97(s,9H),0.83(s,9H),0.25(s,3H),0.18(s,3H),0.16(s,3H),-0.13(s，3H)。
化合物13a：1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ＝8.78(br s,1H),8.47(br s,1H),8.21(brs,1H),8.08(br s,1H),6.44-6.21(m,1H),6.19-6.03(m,1H),6.01-5.78(m,2H),5.38–4.95(m,2H),4.67-4.45(m,5H),4.45-4.35(m,1H),4.34-4.29(m,1H),4.25(br d,J＝11.3Hz,1H),4.18-3.89(m,2H),3.88-3.54(m,2H)。
31P NMR(162MHz，甲醇-d4)δ＝56.89(br s,1P),56.37(br s,1P)
化合物117(化合物116的Rp1Rp2异构体)：1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝9.36(br s,1H),9.11(br s,1H)，8.98(s,1H),8.87(s,1H),8.78(s,1H),8.14-7.96(m，6H),7.72-7.27(m,13H),6.44(d，J＝8.6Hz,1H)，5.84(d,J＝6.6Hz，1H),5.59-5.50(m,1H)，5.48-5.44(m,1H),5.33-5.24(m，1H),4.75-3.85(m,11H),0.90(s,9H),0.79(s，9H),0.20(s,3H)，0.11(s,3H),0.07(s，3H)，-0.21(s,3H)
化合物14a(化合物13a的Rp1Rp2异构体)
LCMS：MS m/z 743.17[M+H]+
实施例10--用于化合物15和16的合成途径
向化合物A(2.63g,2.46mmol)于MeCN(26.3ml)中的溶液中添加叔丁胺(13.15ml,124.1mmol)。在环境温度下搅拌1h后，将反应混合物在真空中浓缩并与MeCN共沸。将残余物溶解于MeCN(52.6ml)中，并用1-(溴甲基)-2-硝基苯(1.064g,4.925mmol)和三乙胺(0.755ml,5.42mmol)处理。在完成反应(通过LC/MS监测)后，将反应混合物在真空中浓缩并通过硅胶柱色谱(66％乙酸乙酯/正庚烷到100％乙酸乙酯)纯化，得到0.226g化合物118。将分离的产物溶解于DMF(5mL)中，并添加烯丙基溴(0.046ml,0.528mmol)和碳酸钾(0.073g,0.528mmol)。在环境温度下搅拌所得混合物，同时通过LCMS监测进程。在19h后，添加MTBE/EtOAc(12/12mL)的1/1混合物、饱和NH4Cl水溶液(15ml)和水(10mL)。分离出有机层，用盐水(5mL)洗涤两次，经MgSO4干燥并在真空中浓缩。通过硅胶柱色谱(50％乙酸乙酯/正庚烷到100％乙酸乙酯)纯化残余物，得到37mg双烯丙基化产物。将分离的产物(37mg,0.027mmol)溶解于甲苯(55mL)中并加热到适度回流(120-125℃油浴)。添加Hoveyda-Grubbs催化剂第2代((1,3-双-(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基)二氯(邻异丙氧基苯基亚甲基)钌；可以目录编号569755获得；CAS 301224-40-8；8.5mg，0.014mmol)和醌(5.9mg,0.054mmol)于甲苯(10mL)中的溶液。将混合物加热到回流并通过LC/MS监测反应进程。在完全消耗起始材料后，将混合物冷却到环境温度并用DMSO(0.059ml,0.81mmol)处理15小时。将所得混合物在真空中浓缩，并通过硅胶柱色谱(SiO2 10g，于正庚烷中的66％乙酸乙酯到100％乙酸乙酯)纯化，得到化合物119(2.2mg)。
化合物119：1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.49(s,1H),8.12(d,J＝7.8Hz,1H),8.05-8.02(m,1H),8.02(s,1H),7.82(s,1H),7.70-7.10(m,17H),6.27(d,J＝16.8Hz,1H),6.15-6.05(m，1H),5.97(d,J＝8.2Hz，1H),5.94-5.72(m,3H)，4.94(br s,2H)，4.86-4.69(m,2H)，4.67-4.60(m,1H)，4.60-4.44(m,4H),4.39-4.33(m,1H),4.31-4.10(m,6H),0.96(s,9H),0.25(s,3H),0.19(s,3H)
化合物119进行实施例1中的步骤G，之后用TEA 3HF进行TBS脱保护，得到化合物15a。
化合物15a：1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ＝8.76(br s,1H),8.44(br s,1H),8.24(brs,1H),8.07(br s,1H),6.45-6.19(m,2H),6.12-5.75(m,2H),5.54(br d,J＝51.6Hz,1H),5.67-5.06(m,2H),4.66-4.37(m,3H),4.47-4.37(m,1H),4.36-4.22(m,2H),4.17-3.94(m,2H),3.94-3.80(m,1H)3.80-3.59(m,2H)
通过与化合物15中所述相同的次序从化合物B(化合物A的RR异构体)获得化合物16。
化合物120(化合物119的Rp1Rp2异构体)：1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.89(s,1H),8.10(d,J＝8.2Hz,1H),8.01(d,J＝8.2Hz,1H),7.85-7.74(m,4H),7.69-7.61(m,2H),7.58(s,1H),7.55-7.48(m,1H),7.45-7.30(m,6H),7.22-7.15(m,1H),7.13-7.04(m,3H),6.76-6.68(m,1H),6.31-6.22(m,1H),6.22(d,J＝16.0Hz,1H),6.12-5.99(m,2H),5.94(d,J＝8.2Hz,1H),5.92-5.81(m，1H),5.67(dd，J＝3.5,51.2Hz,1H),5.08-4.93(m,2H),4.87-4.77(m，1H),4.60-4.22(m,8H)，4.21-4.16(m,1H),4.11-4.02(m,1H),3.94(br d，J＝11.7Hz,1H),3.66(dd,J＝4.7，11.3Hz，1H),0.90(s，9H)，0.09(s,3H),0.08(s,3H)
化合物16a:1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ＝8.54(br s,1H),8.24(br s,1H),8.17(brs,1H),8.08(br s,1H),6.44-6.23(m,2H),6.07-5.68(m,2H),5.43(d,J＝50.4Hz,1H),5.31-5.05(m,2H),4.69-4.26(m,6H),4.19-3.90(m,2H),3.90-3.57(m,3H)
实施例11--化合物腺嘌呤/鸟嘌呤(A/G)类似物--化合物21、化合物22和化合物23的合成途径
以化合物121和化合物101作为起始材料，通过与实施例1中所述相同的反应次序制备腺嘌呤/鸟嘌呤类似物。
用于分离化合物C、D和E的制备型HPLC条件
化合物D：1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.60(s,1H),8.27(s,1H),8.04-8.01(m,1H),8.01(s,1H),7.99-7.95(m,1H)，7.80(s,1H)，7.63-7.51(m,5H),7.46-7.41(m,1H),7.39-7.30(m,3H),7.25-7.20(m,2H),6.96-6.84(m,1H),6.19-5.99(m,4H),5.67(dd,J＝4.3,52.3Hz,1H),5.47(dd,J＝1.4,17.4Hz,1H),5.36-5.24(m,4H),5.14-5.09(m,1H),5.08(d,J＝5.5Hz,2H),5.04-4.98(m,2H),4.51-4.30(m，10H)，4.21-4.13(m，1H)，2.83-2.67(m，1H)，1.16(d，J＝7.0Hz，3H)，1.14(d，J＝6.6Hz，3H)
化合物D进行实施例1的步骤F和G，得到化合物22。
化合物22：LCMS：MS m/z 763.07[M+H]+
化合物C：1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝9.08(s，1H)，8.60(s，1H)，8.07-8.02(m,2H),8.02(s,1H),7.80(s,1H),7.55 -7.30(m,9H),7.24-7.19(m,2H)，6.58-6.45(m,1H),6.23-5.97(m,4H)，5.97-5.86(m,1H),5.63-5.57(m,1H),5.54-5.47(m,1H),5.48-5.44(m,1H),5.35-5.30(m,1H),5.29-5.22(m,1H),5.18-5.13(m,2H),5.11-5.07(m,1H),5.02-4.97(m,2H),4.51-4.22(m,9H),4.14-4.07(m,1H),2.99-2.85(m,1H),1.20(d,J＝6.6Hz,3H),1.17(d,J＝7.0Hz,3H)
化合物C进行实施例1中的步骤F和G，得到化合物21
化合物21：LCMS：MS m/z 763.13[M+H]+
化合物E：1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.99(s,1H),8.57(s,1H),8.02-7.94(m,2H),7.93(s,1H),7.82(s,1H),7.68-7.63(m,1H),7.60-7.55(m,1H),7.54-7.49(m,2H),7.45-7.31(m,5H),7.25-7.21(m,2H),6.22-5.94(m,6H),5.56(br dd,J＝5.1,51.5Hz,1H),5.54-5.46(m,1H),5.34-5.29(m,1H),5.29-5.22(m,2H),5.16-5.08(m,3H),5.02-4.96(m,2H),4.62-4.54(m,1H),4.52-4.26(m,9H),2.93-2.81(m,1H),1.21(d,J＝2.3Hz,3H),1.20(d,J＝2.0Hz,3H)
化合物E进行实施例1中的步骤F和G，得到化合物23
化合物23：LCMS：MS m/z 763.18[M+H]+
实施例12--化合物24的合成
利用化合物F，通过与实施例1中所述相同的反应次序制备化合物24a。
化合物24：1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ＝8.95(br s,1H)，8.29(br s，1H),8.23(brs,1H),8.08(br s,1H),6.31(br d,J＝12.9Hz,2H),6.23-6.07(m,1H),6.04-5.84(m，2H),5.71(br d,J＝50.8Hz,1H),5.27-4.32(m,7H),4.27-4.16(m，1H),4.12(dd,J＝5.7,11.9Hz,1H),4.07-3.98(m,1H),3.78-3.62(m,2H),1.40(d，J＝7.0Hz，3H)
实施例13-化合物18、化合物19和化合物20的合成
用于该合成的途径示于图3中。
在20℃下向9-((2R,3R,4R,5R)-3-氟-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-醇(100mg，.37)和许尼希氏碱(0.129ml,0.74mmol)于DMF(1ml)中的溶液中添加BOP(327mg,.74mmol)。将混合物在20℃下搅拌过夜。UPLC-MS指示反应完成。在高真空旋转蒸发仪上去除溶剂。将残余物溶解于DCM中，并使用Biotage(24g Si-凝胶柱，于庚烷中的EtOAc＝0％到100％，10vol，100％，10vol)纯化，得到105mg BOP加合物，产率为73％。
1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 3.74-3.84(m,1H)3.92-4.00(m，1H)4.12-4.19(m，1H)4.62-4.74(m，1H)5.37-5.57(m，1H)6.41-6.52(m,1H)7.47-7.55(m，1H)7.57-7.64(m,2H)8.03-8.14(m,1H)8.36-8.46(m,1H)8.86(s,1H)
在20℃下向(2R，3R,4R,5R)-5-(6-((1H-苯并[d][[1，2，3]三唑-1-基)氧基)-9H-嘌呤-9基)-4-氟-2-(羟甲基)四氢呋喃-3-醇(135mg，0.349mmol)于烯丙醇(3ml)中溶液中添加碳酸铯(500mg，1.535mmol)。将混合物在20℃下搅拌1h。UPLC-MS指示反应完成。用饱和NaHCO3/盐水处理反应，并用EtOAc/Hept萃取。将有机层经Na2SO4干燥并过滤。在旋转蒸发器上去除滤液中的溶剂和挥发性有机物。使用Biotage(12g Si-凝胶柱，于庚烷中的EtOAc＝0％到100％，10vol，100％，10vol)纯化残余物，得到100mg期望的烯丙基加合物，产率为92％。
1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 8.56(s,1H)8.47(s,1H)6.29-6.41(m,1H)6.06-6.21(m,1H)5.33-5.53(m,2H)5.22-5.31(m，1H)5.02-5.14(m,2H)4.56-4.71(m,1H)4.10-4.18(m,1H)3.88-3.96(m,1H)3.70-3.79(m,1H)
在20℃下向二异丙基亚磷酰胺(150mg,0.164mmol)和(2R,3R,4R,5R)-5-(6-(烯丙氧基)-9H-嘌呤-9-基)-4-氟-2-(羟甲基)四氢呋喃-3-醇(76mg,0.246mmol)于乙腈(1069μl,20.47mmol)中的溶液中添加分子筛(3A，150mg)。将混合物在20℃下搅拌1h，然后在RT下添加1H-咪唑-4,5-二腈(38.7mg，0.328mmol)。将混合物在RT下搅拌1h。UPLC-MS指示反应完成。添加(E)-N,N-二甲基-N'-(3-硫代-3H-1,2,4-二噻唑-5-基)甲脒(37.0mg,0.18mmol)。UPLC-MS指示硫化在30min内完成。用饱和NaHCO3/盐水处理反应，并用EtOAc/Hept萃取。将有机层经Na2SO4干燥并过滤。在旋转蒸发器上去除滤液中的溶剂和挥发性有机物。使用Biotage(25g Si-凝胶柱，于庚烷中的EtOAc＝0％到100％，15vol，100％，10vol)纯化残余物。
1H NMR(500MHz，甲醇-d4，两种非对映异构体～1:1)δppm 8.62-8.63(m,1H)8.57-8.58(m，1H)8.48-8.50(m,1H)8.44-8.46(m,1H)8.40-8.41(m,1H)8.38-8.39(m,1H)8.33-8.35(m,1H)8.25-8.27(m,1H)7.22-7.33(m，11H)7.11-7.20(m,17H)7.05-7.11(m,4H)6.83-6.92(m,6H)6.65-6.77(m,11H)6.28-6.41(m,5H)6.23-6.28(m，2H)6.10-6.22(m，5H)6.00-6.10(m，4H)5.89-6.00(m，5H)5.52-5.57(m，2H)5.45-5.52(m,3H)5.41-5.45(m，1H)5.24-5.34(m，4H)5.13-5.17(m，3H)5.07-5.12(m，5H)4.93-4.98(m,4H)4.88-4.93(m，5H)4.73-4.82(m，3H)4.50-4.59(m，2H)4.36-4.48(m,4H)4.27-4.36(m,5H)4.16-4.27(m,5H)3.83-4.04(m,5H)3.73-3.78(m，13H)3.64-3.73(m,4H)3.52-3.58(m，1H)3.45-3.51(m,2H)3.35-3.41(m，2H)3.16-3.23(m,2H)3.08-3.15(m,2H)2.84-2.93(m,2H)2.79-2.83(m,2H)2.70-2.77(m,2H)2.61-2.69(m,3H)
在20℃下向O-((2R,3R,4R,5R)-5-(6-(N-烯丙基苯甲酰氨基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟代四氢呋喃-3-基)O-(((2R,3R,4R,5R)-5-(6-(烯丙氧基)-9H-嘌呤-9-基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-(2-氰乙基)硫代磷酸酯(120mg,0.104mmol)于乙腈(4171μl,79.852mmol)中的溶液中添加分子筛(3A,1wt)。将混合物在20℃搅拌1h，然后添加三吡咯烷基膦(71.6μl,0.311mmol)。然后以2min的间隔分7份添加于ACN(253μl,0.114mmol)中的0.45M四唑。TLC(EtOAc/Hept＝2:1，RfSM＝0.7，RfProd＝0.0到0.6)未完成。添加2×磷酸化试剂和四唑。将反应混合物在RT下搅拌10min。UPLC-MS和TLC均未表明剩下任何SM。将反应混合物转移到装有乙腈(20.8ml)、水(104μl,5.776mmol)和三氟乙酸吡啶盐(421mg,2.178mmol)的烧瓶中。将混合物搅拌10min。UPLC-MS表明形成了期望产物。将反应混合物与EtOAc混合并用HCl[0.1N]/盐水洗涤，然后用饱和NaHCO3/盐水洗涤以防止DMT脱保护。用EtOAc(1×)反萃取水层。将合并的有机层经Na2SO4干燥，然后过滤。在旋转蒸发仪上去除滤液中的溶剂和挥发物，得到粗制产物，其未经进一步纯化即用于下一步骤。
在20℃下将粗制的膦酸氢盐中间体溶解于DCM(2635μl,40.946mmol)和水(29.5μl,1.638mmol)中，然后添加于DCM(2635μl,40.946mmol)中的二氯乙酸(135μl,1.638mmol)。将混合物在20℃下搅拌5min。UPLC-MS指示反应完成。用吡啶(510μl,6.308mmol)中和反应。在旋转蒸发仪上去除挥发物，然后在高真空旋转蒸发仪上去除挥发物。在用于环化之前，将残余物再与吡啶共沸一次。
在RT下将DMT脱保护的粗制膦酸氢盐(80mg,0.087mmol)溶解于吡啶(1831μl,22.639mmol)中，然后添加2-氯-5,5-二甲基-1,3,2-二氧磷杂环己烷2-氧化物(48.2mg,0.261mmol)。将混合物在RT下搅拌10min。UPLC在2.1min时未显示SM峰。通过添加水(47.1μl,2.612mmol)，之后立即添加3H-苯并[c][1,2]二硫醇-3-酮(21.97mg,0.131mmol)来淬灭反应。在10min后，UPLC显示无起始材料剩下。将反应在RT下搅拌1h。在UPLC-MS上未发现变化。将反应混合物用EtOAc稀释，并用饱和NaHCO3和盐水洗涤。经Na2SO4干燥有机层，然后过滤。将溶剂蒸发后的残余物溶解于MeOH中，然后添加NH3-H2O。将混合物搅拌5min，然后在旋转蒸发仪和高真空旋转蒸发仪上去除所有溶剂和挥发物。
在20℃下将CDN中间体溶解于乙腈(1484μl,28.417mmol)和1,4-二烷(496μl,5.797mmol)中，然后添加TEA(39.6μl,0.284mmol)和1-(溴甲基)-2-硝基苯(49.1mg,0.227mmol)。将混合物在20℃下搅拌16hr。UPLC-MS指示反应未完成。TLC(EtOAc)和HPLC均未表明剩下任何邻硝基苄基溴。添加1-(溴甲基)-2-硝基苯(49.1mg,0.227mmol)和TEA(39.6μl,0.284mmol)。将反应搅拌5hr。用饱和NaHCO3/盐水处理反应，并用EtOAc/Hept萃取。将有机层经Na2SO4干燥并过滤。在旋转蒸发器上去除滤液中的溶剂和挥发性有机物。使用Biotage(12g Si-凝胶柱，于庚烷中的EtOAc＝0％到100％，15vol，100％，10vol，于EtOAc中的10％ MeOH，6vol)纯化残余物。合并含有期望产物的级分。溶剂蒸发得到期望产物。使用制备型TLC(EtOAc)分离最高极性的异构体，得到最终产物化合物18。使用制备型TLC(EtOAc/DCM＝1:1，运行3次)分离其他两种异构体。将较高极性的异构体转化为化合物19，且将较低极性的异构体转化为化合物20。
来自第一次p-TLC(EtOAc)的最高极性产物，命名为化合物128-1：1HNMR(500MHz，氯仿-d)δppm 8.62(s,1H)8.55(s,1H)8.00-8.07(m,2H)7.99(s,1H)7.96(s,1H)7.56-7.64(m,2H)7.48-7.56(m,3H)7.42-7.48(m,1H)7.34-7.42(m,2H)7.29-7.34(m,1H)7.18-7.25(m,2H)6.09-6.21(m,3H)5.98-6.09(m,2H)5.63-5.75(m,1H)5.52-5.63(m,1H)5.42-5.51(m,2H)5.32(dd,J＝10.27，0.98Hz,1H)5.27(dd,J＝17.12，1.47Hz，1H)5.13(d,J＝5.87Hz,2H)5.09-5.12(m,1H)4.95-5.05(m,2H)4.36-4.54(m,7H)4.23-4.31(m,2H)4.15-4.21(m,1H)
来自第二次p-TLC的较高极性产物，命名为化合物128-2(EtOAc/DCM＝1:1，3X)1HNMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 8.75(s，1H)8.59(s，1H)8.43(s，1H)8.39(s，1H)8.01-8.07(m，2H)7.38-7.56(m，7H)7.27-7.35(m,1H)7.15-7.26(m，3H)6.45(d，J＝19.91Hz,1H)6.38(d,J＝19.52Hz,1H)5.95-6.26(m,4H)5.83(dd,J＝51.54,4.69Hz,1H)5.73(dd,J＝51.54,4.69Hz,1H)5.46-5.57(m,1H)5.28-5.36(m,1H)5.19-5.28(m,1H)5.16(dt,J＝5.56,1.51Hz,2H)5.03-5.10(m,1H)4.95(br d,J＝5.50Hz,2H)4.41-4.62(m,4H)4.28-4.40(m,2H)4.12-4.27(m,4H)
来自第二次p-TLC的较低极性产物，命名为化合物128-3(EtOAc/DCM＝1:1,3×)1HNMR(400MHz,氯仿-d)δppm 8.53(s,1H)8.36(s,1H)7.95-8.02(m,2H)7.95(s,1H)7.89(s,1H)7.53-7.61(m,2H)7.44-7.53(m,4H)7.36-7.44(m,2H)7.25-7.31(m,1H)7.12-7.20(m,2H)5.91-6.18(m,4H)5.85-5.91(m,1H)5.72-5.79(m,1H)5.61-5.72(m,1H)5.47-5.57(m,1H)5.40-5.47(m,1H)5.25-5.32(m,1H)5.15-5.23(m,1H)4.99-5.14(m,3H)4.92(d,J＝5.47Hz,2H)4.52-4.60(m,2H)4.37-4.52(m,4H)4.35(d,J＝3.13Hz,1H)4.30(d,J＝5.47Hz,1H)4.25(d,J＝2.74Hz,1H)4.20(d,J＝4.69Hz,1H)
向2-硝基苄基保护的CDN(10mg,8.696μmol)于甲苯(20ml,187.761mmol)中的回流溶液中添加Hoveyda-Grubbs催化剂第2代((1,3-双-(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基)二氯(邻异丙氧基苯基亚甲基)钌；可以产品目录编号569755获得；CAS 301224-40-8；2.73mg，4.348μmol)和苯醌(2.350mg,0.022mmol)于甲苯(2ml)中的溶液。将所得溶液回流4hr(油浴温度120-125℃)。TLC(EtOAc,Rfsm＝0.8,RfProd＝0.3)和UPLC-MS指示反应未完成。添加1ml Ru催化剂溶液。将反应再回流2hr。还剩下很多未反应的SM。再添加1ml Ru催化剂溶液。将反应再回流2hr。在反相HPLC上未检测到SM。将反应混合物冷却到RT并用DMSO(0.019ml,0.261mmol)淬灭。溶剂蒸发获得粗制产物，将其在Si-凝胶柱(10g Si-凝胶柱，50％到100％的洗脱液，15vol，100％，10vol)上纯化。将含有具有期望MS的产物的级分合并并旋转蒸发。在制备型TLC(EtOAc)上再一次纯化残余物。
在20℃下向1,4-二烷(0.5ml,5.845mmol)中的pTLC纯化的桥锁(bridge-locked)CDN(2.5mg,2.228μmol)(反式异构体)中添加苯硫酚(0.25ml,2.428mmol)和TEA(0.25ml，1.794)。将混合物在RT下搅拌3h。UPLC指示转化完成。
添加甲醇(1.5ml)，之后添加于H2O(1.0ml)中的29％ NH3。将所得混合物在50℃下加热6h并冷却到RT。
将反应混合物的悬浮液过滤并用水(25mL)冲洗。用水冲洗后在滤液中形成沉淀。再次过滤滤液以去除一些固体。
用tol/Hep(3×，1/1，各25ml)的混合物萃取所得滤液。将水层在真空中浓缩，然后溶解于水(6mL)中。将沉淀物再过滤一次。UPLC表明形成了期望产物。使用相同的方法用反相HPLC纯化产物以纯化其他基于锁定(based locked)的CDN类似物。
对于化合物18，LCMS：MS m/z 748.11[M+H]+746.15[M-H]-
对于化合物19，LCMS：MS m/z 748.06[M+H]+746.17[M-H]-
对于化合物20，LCMS：MS m/z 748.09[M+H]+746.21[M-H]-
实施例13--化合物26的合成
化合物151
在0℃下向化合物150(0.70g,2.256mmol)于吡啶(10.5ml)中的溶液中添加4,4'-二甲氧基三苯甲基氯(0.803g,2.369mmol)。将所得溶液搅拌过夜，同时温热到环境温度。在完成(通过LCMS监测)后，添加饱和NH4Cl溶液(10ml)和MTBE(20mL)。分离各层，并用MTBE/EtOAc(3/1，12mL)萃取水层。将合并的有机层用30％ NaCl水溶液(5ml)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并在真空中浓缩。通过硅胶柱色谱(SiO2 25g，于正庚烷中的50％到70％EtOAc)纯化粗制产物，得到0.942g化合物151。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.47(s,1H),8.11(s,1H),7.43-7.35(m，2H)，7.30-7.26(m,4H),7.25-7.17(m,3H),6.82-6.75(m,4H),6.28(dd,J＝2.3,17.6Hz,1H),6.22-6.10(m,1H),5.63(ddd,J＝2.7,4.7,53.1Hz,1H),5.47(qd,J＝1.4,17.3Hz,1H),5.31(dd,J＝1.2，10.6Hz,1H),5.13(t,J＝1.4Hz,1H),5.12(t,J＝1.2Hz,1H)，4.89-4.76(m,1H),4.21(td，J＝3.2,6.8Hz,1H),3.78(s,6H),3.55(dd,J＝2.7,10.9Hz,1H)，3.44(dd,J＝4.3,10.9Hz,1H),2.29-2.21(m,1H)。
化合物152
在环境温度下向化合物151(0.942g,1.538mmol)于DMF(7.5mL)中的溶液中添加3-((双(二异丙基氨基)膦基)氧基)丙腈(0.927g,3.075mmol)、0.45M 1,2,3,4-四唑(2.8mL,1.2mmol)和1-甲基咪唑(30μl,0.38mmol)。将所得溶液在环境温度下搅拌4h。在完成(通过LCMS监测)后，添加TEA(0.50ml,3.6mmol)、DMF(11.3mL)和水(1.9mL)。用正庚烷(每次3mL)将所得混合物萃取三次。将DMF层用水(4ml)稀释，并用甲苯/正庚烷(1/1,10mL)的混合物萃取。将合并的有机层用30％ NaCl水溶液(每次3mL)洗涤两次，经MgSO4干燥，过滤并在真空中浓缩。通过硅胶柱色谱(SiO2 50g，于具有1％TEA的正庚烷中的33％到40％ EtOAc)纯化残余物，得到1.115g呈白色泡沫状固体的化合物152(3:2非对映异构体混合物)。
化合物153
将化合物152(1.115g,1.372mmol)和化合物158(0.650g,2.095mmol)的混合物与MeCN(每次20mL)共沸两次。向所得残余物中添加MeCN(20.0ml)和1H-咪唑-4,5-二腈(0.243g,2.058mmol)。在完成反应(通过LCMS监测)后，用(E)-N,N-二甲基-N'-(3-硫代-3H-1,2,4-二噻唑-5-基)甲脒(0.422g,2.058mmol)处理反应混合物。在完全硫化后，添加饱和NaHCO3溶液(20mL)和MTBE(30mL)。分离各层，并用MTBE/EtOAc(15/15mL)的混合物萃取水层。将合并的有机层用30％ NaCl水溶液(10ml)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并在真空中浓缩。通过硅胶柱色谱(SiO2 50g，于具有1％ TEA的正庚烷中的33％到100％ EtOAc)纯化残余物，得到0.88g化合物153。
LC/MS(ESI)m/z 1076.48[M+Na]+。
化合物154
在环境温度下，向化合物153(0.880g,0.835mmol)于吡啶(8.8ml)中的溶液中添加亚磷酸二苯酯(0.323ml,1.67mmol)。将反应混合物搅拌1h并通过LCMS监测。在完成后，将混合物添加到饱和NaHCO3水溶液(13.2ml)和水(4.4ml)的混合物中，同时保持低于30℃的内部温度，用EtOAc(8.8ml)冲洗。在环境温度下搅拌所得混合物并通过LCMS监测水解。在完成后，用EtOAc/MTBE(1/1,26mL)的混合物将混合物萃取两次。将合并的有机层用30％ NaCl水溶液(3ml)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并在真空中浓缩。将残余物与甲苯(每次7mL)共沸两次。在环境温度下将粗制产物溶解于二氯甲烷(6.6ml)中，并用水(0.15ml,8.35mmol)和于二氯甲烷(6.6ml)中的6％二氯乙酸(0.41ml,5.0mmol)处理。在完成DMT脱保护(通过LCMS监测)后，添加三乙基硅烷(2.7ml,17mmol)。在搅拌10min后，将所得混合物用吡啶(4.4ml)和TEA(1ml)处理并在真空中浓缩。将残余物与正庚烷(每次8.8ml)研磨三次，并与MeCN共沸两次。粗制产物(化合物154)未经进一步纯化即用于下一步骤中。
LC/MS(ESI)m/z 814.29[M-H]-。
化合物155
在环境温度下向化合物154(0.681g,0.835mmol)于吡啶(68ml)中的溶液中添加2-氯-5,5-二甲基-1,3,2-二氧磷杂环己烷(dioxaphophorinane)-2-氧化物(0.462g,2.505mmol)。将所得溶液在环境温度下搅拌1h，并通过LCMS监测。在完成后，添加水(0.45ml,25mmol)(10eq DMOCP)和硫(0.134g,4.175mmol)。在完全硫化(通过LCMS监测)后，将反应混合物用饱和NaHCO3水溶液(13.6ml)处理并在真空中浓缩。用EtOAc(27ml)和水(13.6ml)处理残余物。分离各层，并用EtOAc/MTBE(1/1,27mL)的混合物萃取水层。将合并的有机层用30％ NaCl水溶液(13.6ml)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并在真空中浓缩。通过硅胶柱色谱(SiO2 25g，于EtOAc中的0％到10％MeOH)纯化残余物，得到0.693g(理论产量)的化合物155。
LC/MS(ESI)m/z 830.23[M+H]+。
化合物156
在环境温度下向化合物155(0.693g,0.835mmol)于乙腈(14ml)中的溶液中添加叔丁胺(14ml,131mmol)。将所得溶液搅拌10min并通过LCMS监测。在完成后，将反应混合物在真空中浓缩并与MeCN共沸两次。向残余物中添加乙腈(14ml)和2-硝基苄基溴(0.541g,2.51mmol)。在搅拌过夜后，将反应混合物在真空中浓缩，并通过硅胶柱色谱(SiO2 100g，于正庚烷中的75％到100％ EtOAc和于EtOAc中的0％到10％ MeOH)纯化，得到0.103g化合物156。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.59(s,2H),8.05(br d,J＝8.2Hz,2H),8.03(s,2H),7.58(d,J＝7.4Hz,2H),7.48(t,J＝7.4Hz,2H),7.45-7.37(m,2H),6.20(br d,J＝18.8Hz,2H),6.21-6.08(m,2H),5.98-5.83(m,2H),5.69(dd,J＝4.7,52.0Hz,1H),5.47(br d,J＝17.2Hz,2H),5.31(br d,J＝10.6Hz,2H),5.14(br d,J＝5.5Hz,4H),4.54-4.46(m,2H),4.45-4.40(m,2H),4.37-4.26(m,4H),4.21-4.11(m,2H)。
基于合成方法、NMR数据(对称)和HPLC保留时间(最慢洗脱异构体)，申请人相信化合物156具有RR磷立体化学结构。该立体化学归属(assignment)将通过X射线晶体学加以确认。
化合物157
在回流下向化合物156(0.103g,0.098mmol)于甲苯(103ml)中的溶液中添加Hoveyda-Grubbs催化剂第2代((1,3-双-(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基)二氯(邻异丙氧基苯基亚甲基)钌；可以目录号569755获得；CAS 301224-40-8；31mg，0.049mmol)和醌(32mg,0.295mmol)于甲苯(10mL)中的溶液。将混合物在回流下搅拌2h，并添加另外的催化剂(16mg,0.025mmol)。在完成后，将反应混合物冷却到环境温度并用DMSO(0.14ml,2.0mmol)处理过夜。将所得混合物在真空中浓缩，并通过硅胶柱色谱(SiO210g，于EtOAc中的0％到10％甲醇)纯化，得到期望产物，通过预TLC(EtOAc)将其进一步纯化，得到3.6mg化合物157。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.11(dd,J＝1.2,8.2Hz,2H),8.09(s,2H),7.68(s,2H),7.67-7.58(m,4H),7.52-7.48(m,2H),6.26(d,J＝17.6Hz,2H),6.02-5.97(m,2H),5.97-5.88(m,2H),5.68(dd,J＝3.9,50.8Hz,2H),5.15(br d,J＝10.9Hz,2H),4.99(br d,J＝10.9Hz,2H),4.56-4.44(m,8H),4.25(br t,J＝6.1Hz,2H)。
化合物26
向化合物157(3.6mg,3.5μmol)中添加1,4-二烷(0.11mL)、苯硫酚(0.045mL,0.44mmol)和TEA(0.054mL,0.39mmol)。在环境温度下搅拌所得混合物，同时通过LCMS监测反应。在完全转化后，添加水(0.5mL)。用正庚烷/甲苯(1/1，每次0.4mL)的混合物将所得混合物萃取三次，然后用甲苯(0.3mL)萃取。将水层在真空中浓缩并用水(0.5mL)处理。滤出所得固体，用水(0.5mL)冲洗。冷冻干燥合并的滤液，得到2.0mg呈白色泡沫固体的双-TEA盐化合物26。
1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ＝8.67(s,2H),8.18(s,2H),6.41(d,J＝14.8Hz,2H),6.07-6.01(m,2H),5.56(dd,J＝3.1,51.2Hz,2H),5.48-5.41(m,2H),5.08(br d,J＝12.1Hz,2H),4.99-4.88(m,2H),4.52(br d,J＝12.5Hz,2H),4.40(br d,J＝9.8Hz,2H),3.98(dd,J＝5.7,12.3Hz,2H),3.14(q,J＝7.4Hz,12H),1.27(t,J＝7.4Hz,18H)。
实施例15--化合物27的合成
从化合物159制备化合物27，化合物159是图2B中所示化合物1的途径的阶段11b中的副产物。
向化合物159(2.0g,1.75mmol)于甲醇(24ml)中的溶液中添加28％氢氧化铵(12ml)。将所得混合物在50℃下搅拌5h并冷却到环境温度。在完成(通过LCMS监测)后，将反应混合物冷却到环境温度，用水(20ml)处理，并用甲苯/EtOAc(1/1，每次24mL)的混合物萃取三次。将水层用1.0M盐酸(3.5ml,3.5mmol)酸化，在环境温度下搅拌30min且在0℃下搅拌30min。过滤所得浆料，用水(20mL)冲洗。将滤饼在真空烘箱中于35℃下干燥过夜并用28％NH4OH(2ml)和MeOH(20mL)的混合物溶解。将所得溶液在真空中浓缩，用EtOH(4ml)处理，制得浆料。通过过滤收集所得固体并在真空中干燥。获得70mg呈白色固体的化合物27。
1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ＝9.03(br s,1H),8.31(br s,1H),8.26(br s,1H),8.13(br s,1H),6.43-6.24(m,2H),5.97-5.83(m,2H),5.71(br d,J＝51.6Hz,1H),5.64(brd,J＝50.0Hz,1H),5.12-4.99(m,1H),4.96-4.90(m,1H),4.68-4.32(m,6H),4.14-3.97(m,2H),3.77-3.62(m,2H)。
实施例16--化合物28的合成
使用与化合物27相同的方法，从化合物160制备化合物28，化合物160是图2B中所示化合物1的途径的阶段11中的产物。
1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ＝8.70(br s,1H),8.49(br s,1H),8.24(br s,1H),8.10(br s,1H),6.52–6.26(m,2H),5.94-5.78(m,2H),5.69(br d,J＝54.7Hz,1H),5.48-5.26(m,1H),5.14(br d,J＝53.1Hz,2H),5.06-4.94(m,1H),4.74-4.19(m,4H),4.10-3.93(m,2H),3.76-3.58(m,2H)
实施例17--化合物29的合成
化合物162
将化合物161(5.0g,6.329mmol)和丁-2-炔-1,4-二醇(1.907g,22.153mmol)与THF共沸两次。将残余物溶解于THF(50.0ml)和甲苯(75ml)中。添加三苯基膦(2.158g,8.228mmol)，并将所得溶液冷却到低于5℃。逐滴添加DIAD(1.60ml,8.23mmol)，同时保持低于10℃的内部温度。在0-5℃下搅拌所得溶液，同时通过LCMS监测进程。在完成后，在真空中浓缩反应混合物以去除大部分THF。将残余物用MTBE(50.0ml)稀释，并用30％NaCl水溶液(每次40.0ml)洗涤两次且用水(每次25ml)洗涤两次。将有机溶液在真空中浓缩，并通过硅胶柱色谱(SiO2 100g，于用1％ TEA缓冲的正庚烷中的50％到70％ EtOAc)纯化，得到4.671g化合物162。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.61(s,1H),8.14(s,1H),7.43(d,J＝7.2Hz,2H),7.33-7.27(m,3H),7.24-7.18(m,8H),7.05-7.01(m,2H),6.76(d,J＝8.6Hz,4H),6.20(dd,J＝2.7,17.2Hz,1H),5.59(td,J＝3.1,53.1Hz,1H),5.19(br d,J＝2.3Hz,2H),4.93-4.83(m,1H),4.18-4.15(m,1H),4.01(br d,J＝6.3Hz,2H),3.78(s,6H),3.53(dd,J＝2.7,10.9Hz,1H),3.17(dd,J＝3.7,11.1Hz,1H),0.85(s,9H),0.10(s,3H),0.02(s,3H)。
化合物164
将化合物162(4.671g,5.444mmol)、化合物163(3.32g,6.805mmol)和三苯基膦(1.856g,7.077mmol)溶解于THF(56.1ml)中，并冷却至低于5℃。向所得溶液中添加DIAD(1.3ml,6.8mmol))，同时保持低于10℃的内部温度。在完全消耗化合物162(通过LCMS监测)后，将反应混合物在真空中浓缩并通过硅胶柱色谱(SiO2 340g，于用1％ TEA缓冲的正庚烷中的55％到70％ EtOAc)纯化，得到3.879g呈白色泡沫固体的化合物164。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.51(s,1H),8.45(s,1H),8.20(s,1H),8.05(s,1H),7.41(d,J＝7.1Hz,2H),7.36-7.32(m,4H),7.28-7.13(m,8H),6.98(t,J＝7.8Hz,2H),6.79-6.74(m,4H),6.29(dd,J＝2.0,16.4Hz,1H),6.19(dd,J＝2.7,17.2Hz,1H),5.53(ddd,J＝2.7,4.7,53.1Hz,1H),5.33(ddd,J＝2.0,3.9,53.1Hz,1H),5.23-5.21(m,1H),5.05-5.01(m,2H),4.99-4.94(m,2H),4.81(ddd,J＝4.3,6.7,16.7Hz,1H),4.71-4.60(m,1H),4.21-4.14(m,2H),4.08-4.03(m,1H),3.89(dd,J＝3.1,11.7Hz,1H),3.77(s,6H),0.91(s,9H),0.84(s,9H),0.09(s,3H),0.08(s,6H),0.00(s,3H)。
化合物165
在环境温度下向化合物164(1.5g,1.13mmol)于吡啶(12.0ml)中的溶液中添加亚磷酸二苯酯(0.35ml,1.8mmol)。在环境温度下搅拌所得溶液，同时通过LCMS监测。在完成后，将反应混合物添加到饱和NaHCO3水溶液(22.5ml)和水(7.5ml)的混合物中，同时保持低于30℃的内部温度。在水解完成后(通过LCMS监测)，用EtOAc/MTBE(30.0/30.0ml)的混合物将所得混合物萃取两次。将合并的有机层用30％ NaCl水溶液(15.0ml)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并在真空中浓缩。将残余物与甲苯共沸三次，并在环境温度下溶解于二氯甲烷(11ml)、水(0.20ml,11mmol)和于二氯甲烷(11ml)中的6％二氯乙酸(0.57ml,6.9mmol)中。在完全去除DMT基团(通过LCMS监测)后，添加三乙基硅烷(1.8ml,11mmol)。在搅拌10min后，添加TEA(1.6ml,11mmol))，并在真空中浓缩所得混合物。将残余物溶解于EtOAc(22.5ml)中，用水(3.8ml)和饱和NaHCO3水溶液(8％)(3.0ml)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并在真空中浓缩。用正庚烷(33.8ml)以及正庚烷(9.0ml)和甲苯(3.0ml)的混合物将粗制产物研磨两次。倾析出上清液，并将残留在底部的固体溶解于乙腈中。将所得溶液在真空中浓缩并与乙腈共沸两次。粗制产物化合物165未经纯化即用于下一阶段(假定理论产率100％)。
LC/MS(ESI)m/z 1089.74[M+H]+。
化合物166
在环境温度下向化合物165(1.231g,1.13mmol)于吡啶(100mL)中的溶液中添加TEA(0.47ml,3.4mmol)和DMOCP(0.375mg,2.03mml)。在环境温度下搅拌所得溶液，同时通过LCMS监测。在完成后，添加水(0.41mL,22.6mmol)，然后添加硫(0.181g,5.651mmol)。在完全硫化(通过LCMS监测)后，添加饱和NaHCO3水溶液(8％)(24.6ml)和水(10mL)。将所得混合物在真空中浓缩到约50mL，且每次用MTBE/EtOAc(31/31ml)的混合物萃取两次。将合并的有机层用30％ NaCl水溶液(25ml)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，在真空中浓缩，并通过硅胶柱色谱(SiO2 100g，用1％ TEA缓冲的乙酸乙酯中的0％到10％甲醇)纯化，得到化合物166(0.484g)。
LC/MS(ESI)m/z 1103.65[M+H]+。
化合物167
在环境温度下向化合物166(0.484g,.402mmol)于吡啶(1.2ml)和TEA(5.8ml)中的溶液中添加Et3N 3HF(0.581ml,3.563mmol)。在环境温度下搅拌所得混合物，同时通过LCMS监测。在完全转化后，添加甲氧基三甲基硅烷(3.9ml,28mmol)。在环境温度下搅拌20min后，倾析上清液。向残余物中添加甲苯(5mL)，且在搅拌10min后，倾析甲苯层。将相同的操作再重复一次。将所得粗制产物溶解于二氯甲烷(10mL)中，用饱和NH4Cl水溶液(27wt％)(5ml)和30％ NaCl水溶液(2.4ml)洗涤，并经MgSO4干燥。将所得有机层过滤，之后浓缩，得到0.386g浅棕色固体，将其与MeCN共沸两次。在环境温度下将所得粗制产物溶解于MeCN(4.6ml)中并用2-硝基苄基溴(0.103g,0.475mmol)处理。在烷基化完成(通过LCMS监测)后，将反应混合物在真空中浓缩，并通过硅胶柱色谱(SiO2 25g，于EtOAc中的0％到5％ MeOH)纯化，得到0.251g呈白色固体的化合物167。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.42(br s,1H),8.31(br s,1H),8.22(br s,1H),8.10-8.04(m,1H),7.93(s,1H),7.53-7.37(m,8H),7.32-7.27(m,3H),7.24-7.16(m,2H),6.18(br d,J＝16.8Hz,1H),6.26-6.14(m,1H),5.56(d,J＝53.1Hz,1H),5.48-5.37(m,1H),5.31(br s,1H),5.15(br d,J＝17.6Hz,1H),4.92(d,J＝17.6Hz,1H),4.82(d,J＝17.2Hz,1H),4.88-4.77(m,1H),4.76-4.66(m,1H),4.58-4.33(m,3H),4.29(br d,J＝5.9Hz,1H),4.21(br s,1H),4.13-4.06(m,1H),3.93-3.79(m,2H)。
化合物168
将化合物167(0.224g,0.222mmol)和3-(双(二异丙基氨基)膦氧基)丙腈(0.081ml,0.255mmol)溶解于MeCN(5mL)中并浓缩。将相同的操作再重复两次。将所得混合物溶解于二氯甲烷(2.2ml)中，冷却到0℃，并用四唑二异丙基铵(diisopropylammoniumtetrazolide)(0.019g,0.111mmol)处理。将反应混合物达到环境温度过夜并用MeCN(2.2mL)稀释。通过注射泵经10h将所得溶液添加到三氟乙酸吡啶盐(0.129g，0.665mmol)于MeCN(18ml)中的溶液中。在再搅拌1h后，经4h添加于MeCN(1mL)中的3-(双(二异丙基氨基)膦氧基)丙腈(0.04mL,0.12mmol)。添加(E)-N,N-二甲基-N'-(3-硫代-3H-1,2,4-二噻唑-5-基)甲脒(0.064g,0.311mmol)。在完全硫化(通过LCMS监测)后，在真空中浓缩反应混合物，并用MTBE(4.5ml)吸入所得残余物。用饱和NaHCO3水溶液(8％)(4ml)和水(2ml)洗涤所得有机溶液。用MTBE/EtOAc(4/4mL)的混合物反萃取合并的水层。将合并的有机层用30％NaCl水溶液(每次2mL)洗涤两次，经MgSO4干燥，过滤，在真空中浓缩。通过硅胶柱色谱(SiO2 25g，于正庚烷中的50％到100％ EtOAc)纯化残余物，得到64mg化合物168。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.57(s,1H),8.18(s,1H),8.06-8.01(m,1H),7.91(s,1H),7.62-7.56(m,2H),7.55-7.50(m,2H),7.49-7.43(m,3H),7.42-7.34(m，2H),7.30-7.18(m,5H)，6.33(d,J＝15.2Hz,1H)，6.10(d,J＝20.7Hz,1H)，5.95-5.77(m,1H),5.54(dd,J＝4.3,52.8Hz,1H),5.46(dd，J＝3.9，50.8Hz,1H),5.32-5.18(m，1H),5.10(d,J＝17.6Hz,1H),4.89(d,J＝17.6Hz,1H),4.85-4.81(m,2H),4.78(br d,J＝12.1Hz,1H)，4.64(br dd,J＝4.1,9.2Hz,1H),4.55(dd,J＝2.7,12.1Hz,1H),4.52-4.44(m,3H),4.38-4.20(m，4H)，2.75(td,J＝6.3，17.6Hz,1H),2.58(td,J＝5.9,17.2Hz,1H)。
化合物29
向化合物168(40mg,0.035mmol)于1,4-二烷(0.5mL)的溶液中添加苯硫酚(0.24ml,2.3mmol)和TEA(0.24ml,1.7mmol)。在环境温度下搅拌所得混合物，同时通过LCMS监测反应。在完成后，添加甲醇(0.64ml)和28％氢氧化铵(0.64ml)。将所得混合物加热到50℃，搅拌5h并冷却到环境温度。在完成脱保护(通过LCMS监测)后，将所得混合物用水(0.80ml)处理，并用正庚烷/甲苯(1/1，每次0.5mL)的混合物萃取三次，然后用甲苯(0.3ml)萃取。在40-50℃下将水层在真空中浓缩并用水(1mL)处理。滤出所得固体，用水(0.3ml)冲洗。用1.0M HCl(0.07ml,0.07mmol)处理合并的滤液。过滤所得浆料并用水(1mL)冲洗。用氨(1.0ml,2.0mmol)于MeOH中的2.0M溶液溶解滤饼。将所得溶液在真空中浓缩到0.5mL并用EtOH(0.5ml)处理。将相同的操作再重复两次。向所得溶液中逐滴添加EtOAc(0.9mL)。发生沉淀。通过过滤收集所得固体，将其用EtOAc/EtOH的4/1混合物(0.4mL)冲洗，并在环境温度下在真空中干燥过夜。获得12mg化合物29。
1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ＝8.88(br s,1H),8.50(br s,1H),8.20(br s,1H),8.12(br s,1H),6.42-6.17(m,2H),5.84-5.54(m,1H),5.52(d,J＝51.6Hz,1H),5.06-4.78(m,2H),4.77-4.55(m,3H),4.49(br d,J＝10.2Hz,1H),4.42(br s,2H),4.09-3.77(m,4H)。
实施例18--化合物25的合成
化合物170
在回流下向Hoveyda-Grubbs催化剂第2代(0.996g,1.585mmol)于二氯甲烷(40.0ml)中的溶液中添加丙-2-烯-d5-1-醇(10.0g,158mmol)。在1h后，添加另外的1mol％Hoveyda-Grubbs催化剂第2代(0.996g,1.585mmol)。将所得溶液在回流下搅拌过夜，冷却到环境温度，并在真空中浓缩。通过硅胶柱色谱(SiO2 340g，于EtOAc中的0％到10％ MeOH)纯化残余物，得到4.2g呈棕色油的化合物170。
13C NMR(101MHz，甲醇-d4)δ＝130.87(t,J＝23.8Hz，2C),62.22(五重峰，J＝21.9Hz，2C)。
化合物171
使用化合物170作为起始材料，通过与图2A和图2B中的化合物1的合成途径中所述相同的反应次序(阶段1到11)制备化合物171。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.59(s,1H),8.10(s,1H),8.02-7.96(m,1H),7.93(s,1H),7.58-7.50(m,2H),7.48-7.37(m,5H),7.34-7.27(m,2H),7.24-7.14(m,4H),6.90(s,1H),6.28(d,J＝14.8Hz,1H),6.14-6.03(m,1H),5.97-5.81(m,1H),5.49(dd,J＝4.7,52.3Hz,2H),5.43(dd,J＝3.9,50.8Hz,1H),5.30-5.15(m,1H),4.75(br d，J＝12.1Hz，1H)，4.61(br dd,J＝4.3,9.4Hz，1H),4.53(dd,J＝2.9,11.9Hz,1H),4.47-4.41(m,3H),4.32-4.18(m,4H),2.79(td,J＝7.0,17.2Hz,1H),2.66(td,J＝6.3,16.8Hz,1H)
化合物25
使用化合物171作为起始材料，通过与图2A和图2B中所述相同的反应次序(阶段12-13)制备化合物25。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ＝9.03(br s,1H),8.30(br s,1H),8.24(br s,1H),8.10(br s,1H),6.44-6.13(m,2H),0.00(d,J＝52.4Hz,1H),0.00(d,J＝51.2Hz,1H),4.71-4.32(m,6H),4.09-3.98(m,1H),3.97-3.87(m,1H)。
实施例19--化合物31(RpRp或SpSp)的合成
化合物173
将(E)-丁-2-烯-1,4-二醇(0.10g,1.135mmol)和化合物172(2.52g,2.55mmol)的混合物与THF共沸两次，并溶解于THF(5.0ml)和甲苯(7.5ml)中。向所得溶液中添加三苯基膦(0.714g,2.724mmol)。将所得溶液冷却到低于5℃，并用DIAD(0.53ml,2.72mmol)处理，同时保持低于10℃的内部温度。将所得反应混合物搅拌过夜，同时温热到环境温度。在完成反应(通过LCMS监测)后，将反应混合物在真空中浓缩并通过硅胶柱色谱(SiO2 50g，用正庚烷/EtOAc(1/1)中的1％ TEA预处理，于正庚烷中的50％到66％ EtOAc)纯化，得到2.46g呈白色泡沫固体的化合物173。该材料未经进一步纯化即用于下一步骤中。
化合物174
在环境温度下向化合物173(2.387g,1.177mmol)于乙腈(28.6ml)中的溶液中添加水(0.085ml,4.7mmol)、三氟乙酸吡啶盐(0.500g,2.589mmol)。在1min后，添加2-氨基-2-甲基丙烷(19.1ml,182mmol)。在环境温度下搅拌所得混合物，同时通过LCMS监测反应。在完成后，将反应混合物在真空中浓缩并与MeCN共沸。将残余物溶解于二氯甲烷(24mL)中，并用水(0.42ml)和于二氯甲烷(24ml)中的6％二氯乙酸(1.2ml,14mmol)处理。在完成DMT脱保护(通过LCMS监测)后，用吡啶(12ml)淬灭反应，并将反应混合物在真空中浓缩。用正庚烷/甲苯(15/15ml)的混合物处理所得残余物，并倾析顶层。将相同的操作再重复一次。将残留的残余物在真空中干燥，得到化合物174，其未经进一步纯化即用于下一步骤中。
LC/MS(ESI)m/z 1151.64[M+H]+。
化合物175
在环境温度下向化合物174(1.355g,1.177mmol)于吡啶(271ml)中的溶液中添加TEA(0.98ml,7.1mmol)和2-氯-5,5-二甲基-1,3,2-二氧磷杂环己烷2-氧化物(0.869g,4.708mmol)。在环境温度下搅拌所得溶液直到所有起始材料起始材料均被消耗(通过LCMS监测)。在完成反应后，添加水(0.85ml,47mmol)(10eq DMOCP)，然后添加硫(0.377g,11.77mmol)。在环境温度下搅拌所得混合物，同时通过LCMS监测反应。在完全硫化后，将反应混合物用饱和NaHCO3水溶液(27ml)和水(10mL)处理并在真空中浓缩。向所得残余物中添加MTBE/EtOAc(34/34ml)的混合物、饱和NaHCO3水溶液(27ml)和水(20mL)。分离各层，并用EtOAc/MTBE(34/34mL)的混合物萃取水层。将合并的有机层用30％ NaCl水溶液(7ml)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并在真空中浓缩。通过硅胶柱色谱(SiO2 50g，于具有1％ TEA的EtOAc中的0％到20％ MeOH)纯化残余物，得到56mg化合物175(基于NMR对称；RpRp或SpSp异构体)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝9.09(s,2H),8.46(s,2H),7.56-7.05(m,10H),6.37(d,J＝8.2Hz,2H),6.28-6.22(m,2H),5.29(ddd,J＝4.7,7.8,11.7Hz,2H),5.00(br d,J＝13.7Hz,2H),4.84(d,J＝4.3Hz,2H),4.76(br d,J＝13.3Hz,2H),4.31(br s,2H),4.28-4.20(m,2H),4.16-4.08(m,2H),3.00-2.77(m,12H),1.12-0.99(m,18H),0.96(s,18H),0.34(s,6H),0.25(s,6H)。
化合物31
向化合物175(56mg,0.0405mmol)于甲醇(1.1mL)中的溶液中添加28％氢氧化铵(0.22mL)。将所得混合物在50℃下搅拌5h，冷却到环境温度，在真空中浓缩，并与MeCN共沸两次。向所得残余物中添加吡啶(0.22mL)、TEA(0.11mL)和TEA 3HF(0.11ml,0.69mmol)。将所得混合物在50℃下搅拌5h，冷却到环境温度，用甲氧基三甲基硅烷(0.90mL,6.50mmol)处理30min。将所得混合物在真空中浓缩，并溶于水(5mL)中。用甲苯(每次5mL)将所得水溶液萃取三次并在真空中浓缩。将粗制产物溶解于1mL水中，通过注射器式过滤器过滤并用1NHCl酸化以使pH<3。将所得混合物在冷藏器(refreezer)(5℃)中保持2天，并通过过滤收集所得固体。将固体溶解于MeOH中的2M NH3(1.5ml)中且在真空中浓缩，得到2.8mg呈NH3和TEA盐的混合物的化合物31。将产物溶解于EtOH(1mL)中，用0.1ml TEA处理，浓缩到0.5mL，并在冷冻器(-20℃)中保持过夜。去除上清液，并将残留的固体在真空中进一步干燥，得到0.8mg双TEA盐化合物31(通过NMR确定为对称；RpRp或SpSp异构体)。
1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ＝8.26-7.83(m,4H),6.37(br s,2H),5.89(br s,2H),5.36-5.07(m,2H),4.95(br d,J＝3.5Hz,2H),4.58(br dd,J＝6.3,10.6Hz,2H),4.43(brs,2H),4.12-4.00(m,4H),3.89-3.70(m,2H),3.19(q,J＝7.2Hz,12H),1.30(t,J＝7.4Hz,18H)
实施例20--化合物32的合成
化合物178
向化合物177(2.0g,2.532mmol)和(+)-2,3-O-异亚丙基-L-苏糖醇(化合物176)(1.232g,7.595mmol)于THF(20.0ml)和甲苯(30.0ml)中的溶液中添加三苯基膦(0.930g,3.544mmol)。将所得溶液冷却到低于5℃，并用DIAD(0.64ml,3.3mmol)处理。将反应混合物温热到环境温度。在环境温度下搅拌8h后，添加另外的DIAD(0.64mL)和PPh3(0.93g)。在环境温度下搅拌过夜后，将反应混合物在40℃下搅拌2天，并在真空中浓缩。通过硅胶柱色谱(用于正庚烷/EtOAc(1/1)中的1％ TEA预处理的SiO2 100g，于正庚烷中的50％到70％EtOAc)纯化残余物，得到0.524g呈白色泡沫固体的化合物178。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.62(s,1H),8.09(s,1H),7.40-7.09(m,12H),7.01-6.92(m,2H),6.80-6.73(m,4H),6.16(dd,J＝2.7,16.8Hz,1H),5.49(ddd,J＝3.1,4.3,53.1Hz,1H),4.85-4.75(m,2H),4.63(dd,J＝3.9,14.8Hz,1H),4.30-4.19(m,2H),4.18-4.12(m,1H),3.94(tt,J＝3.5,8.2Hz,1H),3.84(td,J＝5.5,12.1Hz,1H),3.78(s,6H),3.53(dd,J＝2.7,10.9Hz,1H),3.17(dd,J＝3.5,10.9Hz,1H),2.94(br t,J＝5.5Hz,1H),0.89(s,6H),0.83(s,9H),0.08(s,3H),-0.01(s,3H)
化合物180
向化合物178(0.409g,0.84mmol)于THF(6mL)中的溶液中添加三苯基膦(0.191g,0.728mmol)和DIAD(0.142ml,0.728mmol)。在环境温度下搅拌40h后，将反应混合物在真空中浓缩并通过柱色谱(SiO2 50g，用正庚烷/EtOAc(1/1)中的1％ TEA预处理，于正庚烷中的50％到66％ EtOAc)纯化，得到0.533g化合物180。
LC/MS：LRMS(ESI)m/z 1403.86[M+H]+。
化合物181
使用化合物180作为起始材料，通过与图2A和图2B中所述相同的反应次序(阶段5-11)制备化合物181。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.72(s,1H),8.14-8.06(m,1H),7.93(s,1H),7.69(s,1H),7.62-7.53(m,6H),7.53-7.45(m,1H),7.43-7.33(m,2H),7.30-7.24(m,3H),7.19-7.12(m,2H),6.11(d,J＝16.8Hz,1H),6.05(d,J＝19.5Hz,1H),5.89(dd,J＝3.5,52.3Hz,1H),5.57-5.46(m,1H),5.41(dd,J＝3.5,53.1Hz,1H),5.18-5.04(m,1H),4.83(dd,J＝4.7,14.4Hz,1H),4.78-4.73(m,1H),4.70(br d,J＝12.1Hz,1H),4.64-4.48(m,4H),4.46-4.35(m,4H),4.33-4.27(m,2H),4.16-4.06(m,2H),4.05-3.96(m,1H),2.55(t,J＝6.1Hz,2H),1.26(s,6H)。
化合物182
向化合物181(3.2mg,2.629μmol)于二氯甲烷(0.5ml)中的溶液中添加叔丁胺(0.5ml,4.7mmol)。在搅拌30min后，将反应溶液在真空中浓缩并与MeCN共沸两次。将残余物溶解于乙腈(1ml)中并用1-(溴甲基)-2-硝基苯(1.7mg,7.9μmol)处理。在完全烷基化(通过LCMS监测)后，将反应混合物用氮气吹扫浓缩。通过硅胶柱色谱(SiO2 4g，于正庚烷中的80％到100％EtOAc)纯化残余物，得到2mg化合物182。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.12(dd,J＝1.4,8.0Hz,1H),8.03-8.00(m,1H),8.00(s,1H),7.93(s,1H),7.70(s,1H),7.70-7.29(m,13H),7.21(dt,J＝2.7,7.6Hz,4H),6.07(d,J＝19.9Hz,1H),5.94(d,J＝21.1Hz,1H),5.91-5.77(m,1H),5.81(dd,J＝4.3,51.5Hz,1H),5.62-5.49(m,1H),5.54(dd,J＝3.1,52.7Hz,2H),4.83(q,J＝5.9Hz,1H),4.72-4.63(m,2H),4.61-4.28(m,13H),1.42(s,3H),1.28(s,3H)。
化合物32
向化合物182(2.0mg,1.5μmol)中添加乙酸(0.8ml)和水(0.2ml)。将所得混合物在环境温度下搅拌14h且在45-50℃下搅拌24h，在真空中浓缩，并与甲苯共沸两次。向残余物中添加1,4-二烷(0.12mL)、苯硫酚(60μl)，然后添加TEA(60μl)。在环境温度下搅拌所得混合物，同时通过LCMS监测反应。在完成后，添加甲醇(160μl)和28％氢氧化铵(160μl)。在50℃下搅拌所得混合物直到脱苄基化完成(通过LCMS监测)。在完成后，添加水(0.3ml)。滤出所得固体，用水(0.2mL)冲洗。将滤液用甲苯(每次0.5mL)中萃取两次，并且在40-50℃下在真空中浓缩。用水(0.5mL)处理残余物并滤出所得固体，用水(0.1mL)冲洗。在下述条件下HPLC纯化合并的水层，得到1.5mg化合物32。
LC/MS：LRMS(ESI)m/z 781.23[M+H]+。
用于化合物32的制备型HPLC条件：
实施例21--化合物33和化合物34的合成
化合物193
在0℃下向9-((2R,3R,4R,5R)-3-氟-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1,9-二氢-6H-嘌呤-6-酮、化合物183(5.00g,18.5mmol)于吡啶(75ml)中的溶液中添加AC2O(7.0ml,74mmol)和DMAP(0.565g,4.626mmol)。将所得混合物温热到环境温度并搅拌，同时通过LCMS监测反应。在完成后，将反应混合物在真空中浓缩并用EtOAc(200mL)和水(50ml)处理。发生沉淀。通过过滤收集所得固体并用MTBE冲洗。在40℃下在真空中干燥过夜，得到5.81g呈白色固体的化合物193。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝12.53(br s,1H),8.33(s,1H),8.15(d,J＝4.3Hz,1H),6.37(dd,J＝2.7,19.1Hz,1H),5.86(ddd,J＝2.7,5.1,51.6Hz,1H),5.62(ddd,J＝5.5,7.0,16.0Hz,1H),4.49-4.38(m,2H),4.26(dd,J＝4.7,12.1Hz,1H),2.19(s,3H),2.04(s,3H)。
化合物184
在0℃下向化合物193于二氯甲烷(40.0ml)中的溶液中缓慢添加DMF(1.3ml,16.9mmol)和亚硫酰氯(1.28ml,17.5mmol)。将所得混合物加热到回流并搅拌直到所有起始材料消耗(通过LCMS监测)。在完成后，将反应混合物冷却到环境温度并用饱和NaHCO3水溶液(40mL)处理。分离各层，并用二氯甲烷(每次30mL)将水层萃取两次。将合并的有机层经MgSO4干燥，过滤并在真空中浓缩，得到2.81g呈浅棕色油的化合物184。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.79(s,1H),8.30(s,1H),6.29(dd,J＝2.0,18.0Hz,1H),5.79(ddd,J＝1.6,4.7,51.6Hz,1H),5.53(ddd,J＝5.1,7.6,17.8Hz,1H),4.58-4.48(m,2H),4.33(dd,J＝3.9,12.5Hz,1H),2.20(s,3H),2.07(s,3H)。
化合物194
在环境温度下向化合物184(0.22g,0.59mmol)于THF(7.7ml)和NMP(0.77ml)的混合物中的溶液中添加于THF中的乙酰丙酮铁(III)(0.021g,0.059mmol)和0.5M 3-丁烯基溴化镁(1.77ml,0.885mmol)。在完成反应(通过LCMS监测)后，添加MTBE(10mL)和0.1N HCl(10mL)。将所得混合物在环境温度下搅拌10min。分离各层，并用EtOAc/MTBE(1/1,10mL)的混合物萃取水层。将合并的有机层用30％ NaCl水溶液(5mL)洗涤，经MgSO4干燥并在真空中浓缩。粗制产物未经进一步纯化即用于下一步骤中。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.90(s,1H),8.16(s,1H),6.26(dd,J＝2.0,18.4Hz,1H),5.98-5.85(m,1H),5.90–5.73(m,1H),5.63(ddd,J＝4.9,7.5,17.7Hz,1H),5.12-5.05(m,1H),4.98(dd,J＝1.6,10.2Hz,1H),4.54-4.50(m,2H),4.31(dd,J＝5.1,12.9Hz,1H),3.30(t,J＝7.4Hz,2H),2.70-2.64(m,2H),2.19(s,3H),2.05(s,3H)。
化合物185
在环境温度下将粗制产物化合物194(0.232g，理论上0.590mmol)溶解于甲醇(1.5ml)中并用于MeOH中的2.0M氨(1.5ml,3.0mmol)处理。在完全脱乙酰后，将反应混合物在真空中浓缩，并通过硅胶柱色谱(SiO2 10g，于EtOAc中的0％到5％ MeOH)纯化，得到0.17g化合物185。
LCMS：MS(ESI)m/z 309.20[M+H]+
化合物195
在0℃下向化合物185(1.22g,2.928mmol)于吡啶(9.0ml)中的溶液中添加4,4'-(氯(苯基)亚甲基)双(甲氧基苯)(1.042g,3.075mmol)。使反应混合物温热到环境温度，同时通过LCMS监测反应。在完成后，添加MTBE(18mL)和饱和NaHCO3水溶液(9.0ml)。在搅拌10min后，分离各层，并用MTBE(18.0ml)萃取水层。将合并的有机层用30％ NaCl水溶液(10ml)洗涤，过滤并在真空中浓缩。通过硅胶柱色谱(SiO2 50g，于具有1％ TEA的庚烷中的50％到100％乙酸乙酯)纯化，得到1.53g呈橙色固体的化合物195。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.86-8.78(m,1H),8.21(s,1H),7.40-7.36(m,2H),7.31-7.18(m,7H),6.79(d,J＝8.6Hz,4H),6.29(dd,J＝2.3,17.2Hz,1H),5.92(tdd,J＝6.4,10.4,17.0Hz,1H),5.70(ddd,J＝2.7,4.7,52.8Hz,1H),5.09(dd,J＝1.6,17.2Hz,1H),4.97(dd,J＝1.6,10.2Hz,1H),4.90-4.77(m,1H),4.26-4.19(m,1H),3.78(s,6H),3.56(dd,J＝3.1,10.9Hz,1H),3.43(dd,J＝4.3,10.9Hz,1H),3.33-3.28(m,2H),2.70-2.64(m,2H),2.20(dd,J＝2.5,7.2Hz,1H)。
化合物186
在环境温度下向化合物195(1.530g,2.505mmol)于二氯甲烷(23ml)中的溶液中添加3-(双(二异丙基氨基)膦氧基)丙腈(1.20ml,3.76mmol)和四唑二异丙基铵(0.493g,2.881mmol)。在环境温度下搅拌反应混合物，同时通过LCMS监测进程。在完成后，将反应混合物在真空中浓缩，并通过硅胶柱色谱(SiO2 50g，于具有1％ TEA的正庚烷中的40％到66％ EtOAc)纯化，得到1.80g呈浅橙色泡沫固体的化合物186。
化合物196和197
将化合物186(1.8g,2.22mmol)和化合物185(1.110g,2.664mmol)溶解于乙腈(21.6ml)中并在真空中浓缩。将相同的操作再重复一次。在环境温度下将所得混合物溶解于乙腈(21.6ml)中并用三氟乙酸吡啶(0.514g,2.664mmol)处理。在完成反应(通过LCMS监测)后，添加((二甲基氨基-亚甲基)氨基)-3H-1,2,4-二噻唑啉-3-硫酮(0.911g,4.439mmol)并在环境温度下搅拌所得混合物。在完全硫化(通过LCMS监测)后，添加饱和NaHCO3水溶液(30ml)并用MTBE(每次30mL)将所得混合物萃取三次。将合并的有机层用30％NaCl水溶液(20ml)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并在真空中浓缩。通过硅胶柱色谱(SiO2 100g，于具有1％ TEA的EtOAc中的0％到10％ MeOH)纯化，得到0.481g化合物196和1.315g化合物197。
化合物196：LCMS：MS(ESI)m/z 1073.25[M+Na]+
化合物197：LCMS：MS(ESI)m/z 995.23[M-H]-
化合物188
在环境温度下向TEA盐化合物197(1.315g,1.197mmol)于MeCN(20ml)中的溶液中添加2-硝基苄基溴(0.388g,1.796mmol)。在环境温度下搅拌所得溶液，同时通过LCMS监测反应。在完成后，将反应混合物在真空中浓缩，并通过硅胶柱色谱(SiO2 100g，于EtOAC中的0％到5％ MeOH)纯化，得到0.90g化合物188。
LCMS：MS(ESI)m/z 1154.29[M+Na]+
化合物198
在轻度回流(内部温度为110-112℃)下向化合物188(1.35g,1.192mmol)于甲苯(540ml)中的溶液中添加Hoveyda-Grubbs催化剂第2代(0.187g,0.298mmol)和醌(0.322g,2.981mmol)于甲苯(20mL)中的溶液。在110-112℃下搅拌所得溶液，同时通过LCMS监测反应。在4h后，添加另外的催化剂(0.10g,0.16mmol)并继续在回流下搅拌。在完成后，将反应混合物冷却到环境温度并用DMSO(2.54ml,35.8mmol)处理。在搅拌3h后，将反应混合物在真空中浓缩，并通过硅胶柱色谱(SiO2 50g，于EtOAC中的0％到15％MeOH)纯化，得到化合物198和化合物199的混合物。将混合物溶解于二氯甲烷(2mL)中，并用水(0.021ml,1.2mmol)和于二氯甲烷(2mL)中的6％二氯乙酸(0.098ml,1.2mmol)处理。在10min后，用吡啶(1ml)淬灭反应，并在真空中浓缩。将残余物溶解于二氯甲烷(50mL)中并用30％ NaCl水溶液(每次15mL)洗涤两次并经MgSO4干燥。通过硅胶柱色谱(SiO2 50g，于DCM中的5％到10％ MeOH)纯化粗制产物，得到0.25g化合物198。
化合物199：LCMS：MS(ESI)m/z 1104.31[M+H]+
化合物198：LCMS：MS(ESI)m/z 802.16[M+H]+
化合物190
将化合物198(0.233g,0.291mmol)和3-(双(二异丙基氨基)膦氧基)丙腈(0.111ml,0.349mmol)溶解于MeCN(10mL)中并在真空中浓缩。将相同的操作再重复两次。将所得混合物溶解于二氯甲烷(2.3ml)中，冷却到0-5℃，并用四唑二异丙基铵(0.025g,0.145mmol)处理。将反应混合物温热到环境温度过夜，然后用乙腈(2.3ml)稀释。通过注射泵经7h将所得溶液添加到三氟乙酸吡啶盐(0.168g,0.872mmol)于MeCN(18.6ml)中的溶液中。然后经2小时添加3-(双(二异丙基氨基)膦氧基)丙腈(40mg,0.133mmol)于MeCN(2mL)中的溶液。在搅拌1h后，添加(E)-N,N-二甲基-N'-(3-硫代-3H-1,2,4-二噻唑-5-基)甲脒(0.119g,0.581mmol)并搅拌反应溶液直到硫化完成(通过LCMS监测)。在完成后，将混合物在真空中浓缩，溶解于MTBE(5ml)中，并用饱和NaHCO3水溶液(3.50ml)和水(1.2ml)处理。分离各层，并用MTBE/EtOAc(5/3mL)的混合物萃取水层。将合并的有机层用30％NaCl水溶液(2.3ml)洗涤两次，经MgSO4干燥，过滤并在真空中浓缩。通过硅胶柱色谱(SiO2 25g，于EtOAc中的0％到20％ MeOH)纯化粗制产物，得到119mg化合物190(58mg较快洗脱的异构体和61mg较慢洗脱的异构体)。
化合物191(SpRp异构体)
向化合物190的较快洗脱异构体(58mg,0.062mmol)于二氯甲烷(1.8mL)中的溶液中添加叔丁胺(1.2ml,11mmol)。在环境温度下搅拌所得溶液直到所有起始材料起始材料均被消耗(通过LCMS监测)。在完成后，将反应混合物在真空中浓缩，与乙腈共沸两次，并溶解于乙腈(1.7ml)中。向所得溶液中添加1-(溴甲基)-2-硝基苯(40.3mg,0.187mmol)。在环境温度下搅拌反应混合物，同时通过LCMS监测反应。在完全烷基化后，将反应混合物在真空中浓缩，并通过硅胶柱色谱(SiO2 10g，于EtOAC中的0％到5％MeOH)纯化，得到19mg化合物191(SpRp异构体)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.42(s,1H),8.27(s,1H),8.13(dd,J＝1.2,8.2Hz,1H),8.05(s,1H),7.98(d,J＝7.8Hz,1H),7.69-7.67(m,1H),7.61-7.34(m,5H),6.33(d,J＝17.2Hz,1H),6.19(d,J＝19.9Hz,1H),6.09-5.93(m,1H),5.82-5.66(m,2H),5.67(dd,J＝3.5,50.8Hz,1H),5.35-5.32(m,2H),4.62-4.29(m,11H),3.35-3.28(m,1H),3.18-3.14(m,2H),3.01-2.91(m,1H),2.84-2.78(m,1H),2.60-2.49(m,3H)。
化合物192(RpRp异构体)
通过与化合物191中所述相同的反应次序处理化合物190的较慢洗脱的异构体(60mg)，得到14mg化合物192和7mg化合物191。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.18(s,2H),8.10(s,2H),8.10(dd,J＝1.0,8.0Hz,2H),7.66-7.57(m,4H),7.53-7.46(m,2H),6.31(d,J＝17.6Hz,2H),6.19-6.05(m,2H),5.84(dd,J＝4.3,50.8Hz,2H),5.39-5.30(m,2H),4.58-4.46(m,6H),4.45-4.39(m,2H),4.19(ddd,J＝3.1,6.3,10.2Hz,2H),3.32(td,J＝3.5,15.6Hz,2H),3.06(td,J＝6.3,15.2Hz,2H),2.67-2.57(m,4H)。
基于合成方法、NMR数据(对称)、HPLC保留时间(最慢洗脱异构体)和衍生自化合物192的化合物34的生物活性，申请人相信化合物192具有RR磷立体化学结构。该立体化学归属将通过X射线晶体学加以确认
化合物33
向化合物192(26mg,0.026mmol)于1,4-二烷(0.52ml)中的溶液中添加苯硫酚(0.26ml,2.5mmol)，然后添加TEA(0.26ml,1.9mmol)。在环境温度下搅拌所得混合物直到脱保护完成(通过LCMS监测)。在完成后，添加水(2mL)。用甲苯(每次2mL)将所得混合物萃取三次。在40-50℃下将水层在真空中浓缩并溶解于水(2mL)中。用EtOAc/MTBE的混合物将所得混合物萃取四次(1/1，每次mL)。在真空中浓缩水层，得到化合物33的双-TEA盐。
1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ＝9.06(s,1H),8.73(s,1H),8.56(s,1H),8.47(s,1H),6.43(d,J＝14.4Hz,1H),6.38(d,J＝15.2Hz,1H),6.27(dd,J＝3.5,51.1Hz,1H),5.63(dd,J＝2.7,51.5Hz,1H),5.30-5.14(m,2H),5.06-4.91(m,2H),4.58(br d,J＝12.5Hz,1H),4.52-4.39(m,3H),4.07(dd,J＝4.7,11.7Hz,1H),3.98(dd,J＝5.1,12.5Hz,1H),3.43-3.34(m,2H),3.22(q,J＝7.2Hz,12H),2.98-2.86(m,2H),2.79-2.45(m,4H),1.32(t,J＝7.4Hz,18H)
化合物34
使用化合物192作为起始材料，通过与化合物33中所述相同的反应次序制备化合物34。
1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ＝8.77(s,2H),8.49(s,2H),6.39(d,J＝15.2Hz,2H),5.71(dd,J＝3.1,51.2Hz,2H),5.24-5.13(m,2H),5.02(dtd,J＝3.1,9.0,25.4Hz,2H),4.54(br d,J＝12.1Hz,2H),4.42(br d,J＝9.8Hz,2H),3.99(dd,J＝5.9,12.1Hz,2H),3.20(q,J＝7.3Hz,12H),2.90(ddd,J＝3.5,10.2,14.1Hz,2H),2.81-2.70(m,2H),2.55-2.43(m,2H),1.30(t,J＝7.4Hz,18H)。
实施例22--化合物35和化合物36的合成
化合物201
向化合物200的二钠盐(0.10g,0.126mmol)中添加2-硝基苄基溴(0.068g,0.316mmol)和MeCN(2.0ml)。在环境温度下搅拌所得混合物，同时通过LCMS监测反应。在完成后，将反应混合物在真空中浓缩，并通过硅胶柱色谱(SiO2 10g，于DCM中的0％到5％MeOH)纯化，得到115mg化合物201。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.13(dd,J＝0.8,8.2Hz,1H),8.06(s,1H),8.03(dd,J＝1.0,8.0Hz,1H),7.80(br s,1H),7.75(s,1H),7.70-7.65(m,1H),7.62-7.54(m,2H),7.53-7.47(m,2H),7.45-7.39(m,1H),7.34-7.27(m,1H),6.23(br d,J＝16.8Hz,1H),6.14(br d,J＝18.8Hz,1H),5.95(br s,2H),5.77(td,J＝5.1,15.2Hz,2H),5.71(td,J＝5.1,15.6Hz,1H),5.63-5.55(m,1H),5.47(br d,J＝11.7Hz,1H),4.58-4.27(m,11H),4.18-4.10(m,1H),4.05-3.71(m,2H)
化合物202
向化合物201(77mg,0.076mmol)于2,2,2-三氟乙醇(2ml)中的溶液中一次性添加O-(2,4-二硝基苯基)羟胺(36.5mg,0.183mmol)和双[铑(α,α,α′,α′-四甲基-1,3-苯二丙酸)](5.74mg,0.015mmol)。将混合物在环境温度下搅拌过夜，用DCM(10mL)稀释，并用饱和NaHCO3水溶液(10mL)处理。分离各层，并用DCM(每次10mL)将水层萃取两次。将合并的有机层经MgSO4干燥，并通过硅胶柱色谱(SiO2 10g，于EtOAc中的0％到15％ MeOH)纯化，得到3.3mg化合物202。
LCMS：MS m/z 1032.07[M+H]+
化合物35和化合物36
向化合物202(3.3mg,3.2μmol)于1,4-二烷(0.40ml)中的溶液中添加苯硫酚(0.2ml,1.9mmol)和TEA(0.2ml,1.4mmol)。在环境温度下搅拌所得混合物，同时通过LCMS监测反应。在完成后，将反应混合物用水(2mL)处理并用甲苯(每次2mL)萃取三次。在40-50℃下将水层在真空中浓缩并溶解于水(1.5mL)中。滤出所得固体，用水(0.5mL)冲洗。在下述条件下HPLC分离合并的滤液，得到化合物35(保留时间：8.4min)和化合物36(保留时间：8.9min)
化合物35
LCMS：MS m/z 762.08[M+H]+
化合物36
LCMS：MS m/z 762.22[M+H]+
化合物35/化合物36的制备型HPLC条件：
实施例-23--化合物38和化合物39的合成
图13显示化合物38和化合物39的合成实施例。
步骤1
在0℃下向化合物203(5.82g,9.314mmol)和烯丙醇(0.95ml,14mmol)于THF(50mL)中的溶液中添加DIAD(2.4ml,11.6mmol)和三苯基膦(2.93g，11.2mmol)于甲苯(25ml)中的溶液，同时保持低于10℃的内部温度。将所得溶液温热到环境温度并搅拌，同时通过LCMS监测反应。在完成(5h)后，将混合物在真空中浓缩并通过硅胶柱色谱(100g，于正庚烷中的20％到60％ EtOAc)纯化，得到4.56g呈粉红色油的化合物204。
化合物204：1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.55(s,1H),8.24(s,1H),7.46(d,J＝8.2Hz,2H),7.31-7.23(m,1H),7.20-7.10(m,2H),6.02(d,J＝5.1Hz,1H),6.07-5.95(m,1H),5.21(dd,J＝1.6,17.2Hz,1H),5.05(dd,J＝1.4,10.4Hz,1H),5.00(d,J＝5.5Hz,2H),4.82(t,J＝4.9Hz,1H),4.22-4.16(m,1H),4.05-4.00(m,2H),3.82(dd,J＝2.5,11.5Hz,1H),0.95(s,9H),0.81(s,9H),0.14(s,3H),0.13(s,3H),0.00(s,3H),-0.23(s,3H)。
步骤2
向化合物204(4.56g,6.858mmol)中添加乙酸(80ml)和水(20ml)。将所得混合物在环境温度下搅拌过夜，并在35℃下搅拌1天。将所得混合物在真空中浓缩，并通过硅胶柱色谱(SiO2，50g，于正庚烷中的33％到60％EtOAc)纯化，得到3.22g呈白色泡沫固体的化合物205。
化合物205：1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.56(s,1H),7.88(s,1H),7.51-7.47(m,2H),7.32-7.27(m,1H),7.20-7.16(m,2H),6.06-5.95(m,1H),5.72(d,J＝7.8Hz,1H),5.26(dd,J＝5.5,7.8Hz,1H),5.20(dd,J＝1.6,17.2Hz,1H),5.06(dd,J＝1.6,10.2Hz,1H),5.03-4.98(m,2H),4.23(d,J＝5.5Hz,1H),4.14(s,1H),3.92(dd,J＝1.6,12.9Hz,1H),3.68(br d,J＝12.9Hz,1H),0.75(s,9H),-0.14(s,3H),-0.62(s,3H)。
步骤3
在环境温度下向化合物205(3.22g,5.847mmol)于THF(120mL)中的溶液中添加水(30ml)和三苯基膦(2.454g,9.355mmol)。在环境温度下搅拌所得混合物，同时通过LCMS监测反应。在完成后(18h)，将反应混合物在真空中浓缩并与MeCN共沸三次。通过硅胶柱色谱(SiO2(NH)55g，于正庚烷中的20％到100％ EtOAc)纯化残余物，得到4.82g化合物206(假定纯度63％)。所述产物未经进一步纯化即用于下一步骤中。
化合物206：1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.56(s,1H),7.92(s,1H),7.54(qd,J＝1.6,7.6Hz,2H),7.31-7.27(m,1H),7.19-7.15(m,2H),6.07-5.94(m,1H),5.84(d,J＝6.6Hz,1H),5.50(br d,J＝10.6Hz,1H),5.20(dd,J＝1.6,17.2Hz,1H),5.05(dd,J＝1.4,10.4Hz,1H),5.02-4.98(m,2H),4.95-4.91(m,1H),4.16-4.08(m,2H),3.96(dd,J＝1.6,12.9Hz,1H),3.73(dd,J＝2.0,5.5Hz,1H),3.73-3.67(m,1H),0.78(s,9H),-0.20(s,3H),-0.46(s,3H)。
步骤4
在环境温度下向化合物206(4.82g，63％纯度，5.72mmol)于吡啶(39.0ml)中的溶液中添加TEA(1.3ml,8.6mmol)和三苯甲基-Cl(1.753g,6.289mmol)。在完成反应(通过LC/MS监测)后，添加饱和NaHCO3溶液(60mL)。用MTBE/EtOAc(1/1，每次70mL)的混合物将所得混合物萃取三次。将合并的有机层用30％ NaCl水溶液(30mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并在真空中浓缩。通过硅胶柱色谱(SiO2 50g，用于EtOAc/正庚烷中的1％ TEA预处理，于具有1％TEA的正庚烷中的20％到100％ EtOAc)纯化残余物，得到1.484g呈白色固体的化合物207。
化合物207：1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.49(s,1H),8.10(s,1H),7.50-7.46(m,8H),7.31-7.22(m,7H),7.20-7.14(m,5H),6.11(d,J＝6.3Hz,1H),6.07-5.94(m,1H),5.20(dd,J＝1.2,17.2Hz,1H),5.06(dd,J＝1.4,10.4Hz,1H),5.03-4.98(m,2H),4.84(dd,J＝3.1,10.6Hz,1H),4.52(t,J＝5.7Hz,1H),3.78(d,J＝1.6Hz,1H),3.64-3.57(m,1H),3.26-3.16(m,3H),0.77(s,9H),-0.18(s,3H),-0.63(s,3H)。
步骤5
在环境温度下向化合物207(0.50g,0.652mmol)于MeCN(6mL)中的溶液中添加3-((双(二异丙基氨基)膦基)氧基)丙腈(0.393g,1.304mmol)和三氟乙酸吡啶(0.113g,0.587mmol)。在环境温度下搅拌所得溶液，同时通过LCMS监测。在完成(1h)后，将所得溶液用硫化氢气体(鼓泡)处理1min，之后用三氟乙酸吡啶(0.252g,1.304mmol)处理。在环境温度下搅拌所得溶液，同时通过LCMS监测。在完成(1h)后，用MTBE(60mL)稀释所得混合物。将所得溶液用水(每次15mL)洗涤两次并用30％ NaCl水溶液(15ml)洗涤，且经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。通过硅胶柱色谱(SiO2 25g，于正庚烷中的25％到40％ EtOAc)纯化残余物，得到0.411g呈白色泡沫固体的化合物208(1:1P非对映异构体混合物)。
化合物208(1:1P非对映异构体混合物)1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.49(s,1H),8.49(s,1H),8.11(s,1H),8.06(s,1H),7.54-7.47(m,4H),7.46-7.38(m,14H),7.32-7.27(m,2H),7.23-7.04(m,20H),6.11-5.99(m,2H),5.98(d,J＝2.0Hz,1H),5.91(d,J＝1.6Hz,1H),5.27(dd,J＝1.6,6.3Hz,1H),5.23(dd,J＝1.6,6.3Hz,1H),5.12(dd,J＝1.6,6.3Hz,1H),5.09(dd,J＝1.2,6.3Hz,1H),5.02(br d,J＝5.5Hz,4H),4.57-4.45(m,2H),4.43-4.34(m,1H),4.32-4.04(m,8H),3.23-3.19(m,1H),3.10(br s,2H),3.06-2.99(m,1H),2.96–2.89(m,2H),2.73(dt,J＝1.4,6.4Hz,2H),2.65(t,J＝6.3Hz,2H),0.85(s,9H),0.83(s,9H),0.01(s,3H),-0.09(s,6H),-0.11(s,3H)。
步骤6
在环境温度下向化合物208(0.411g,.457mmol)和化合物206(0.293g,0.502mmol)于乙腈(5ml)中的溶液中添加DIEA(0.16ml,0.91mmol)和CCl4(0.18ml，1.8mmol)。在环境温度下搅拌反应混合物，同时通过LCMS监测。在完成(1h)后，将所得混合物在真空中浓缩，并通过硅胶柱色谱(SiO2 25g，于正庚烷中的33％到100％ EtOAc)纯化，得到0.461g呈白色泡沫固体的化合物210(1:1P非对映异构体混合物)。
化合物210：1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.52(s,1H),8.51(s,1H),8.49(s,1H),8.49(s,1H),8.24(s,1H),8.19(s,1H),8.13(s,1H),8.01(s,1H),7.55-7.37(m,20H),7.33-6.99(m,30H),6.09-5.97(m,4H),5.96(d,J＝2.7Hz,1H),5.87(d,J＝1.2Hz,1H),5.82(d,J＝4.7Hz,1H),5.80(d,J＝3.9Hz,1H),5.28-5.17(m,4H),5.11-5.04(m,4H),5.03-4.96(m,8H),4.75(t,J＝5.1Hz,1H),4.70(t,J＝4.5Hz,1H),4.46-4.33(m,3H),4.31-4.18(m,5H),4.12-3.96(m,8H),3.89(br d,J＝11.7Hz,1H),3.78-3.67(m,3H),3.57(dd,J＝2.9,4.1Hz,1H),3.56-3.44(m,2H),3.08-3.01(m,2H),2.99-2.93(m,1H),2.91(d,J＝8.6Hz,1H),2.77-2.73(m,1H),2.72-2.53(m,4H),0.84(s,9H),0.84(s,9H),0.84(s,9H),0.82(s,9H),0.00(s,3H),-0.05(s,6H),-0.08(s,3H),-0.12(s,3H),-0.15(s,3H),-0.18(s,3H),-0.18(s,3H)。
步骤7
在环境温度下向化合物210(0.461g,0.324mmol)于MeCN(5.5ml)中的溶液中添加3-((双(二异丙基氨基)膦基)氧基)丙腈(0.195g,0.648mmol)和三氟乙酸吡啶(0.050g,0.259mmol)。在环境温度下搅拌所得溶液，同时通过LCMS监测。在完成(40min)后，将所得溶液用硫化氢气体鼓泡1min，然后用三氟乙酸吡啶(0.138g,0.713mmol)处理。在完成(通过LCMS监测)后，将所得溶液用MTBE(30mL)稀释，用水(每次10mL)洗涤两次且用30％NaCl水溶液(10ml)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。通过硅胶柱色谱(SiO2 25g，于正庚烷中的33％到60％ EtOAc)纯化残余物，得到0.329g呈白色泡沫固体的化合物211。
化合物211：LC/MS(ESI)m/z 1555.48，[M+H]+。
步骤8
在环境温度下向化合物211(0.329g,0.211mmol)于二氯甲烷(7.2ml)中的溶液中添加水(0.032ml,1.8mmol)和二氯乙酸(0.29ml,3.6mmol)。在环境温度下搅拌所得混合物，同时通过LCMS监测。在完成(30min)后，反应混合物为饱和NaHCO3溶液(25mL)。用DCM(每次30mL)将所得混合物萃取两次。将合并的有机层用30％ NaCl水溶液(20mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并在真空中浓缩。粗制产物化合物212(0.278g理论产量)未经进一步纯化即用于下一步骤中。
化合物212：LC/MS(ESI)m/z 1313.40[M+H]+。
步骤9
在环境温度下向化合物212(0.278g,0.212mmol)于MeCN(55.6ml)中的溶液中添加三乙胺(1.0ml,7.2mmol)和CCl4(1.0ml,10mmol)。在环境温度下搅拌所得溶液，同时通过LCMS监测。在完成(30min)后，将反应混合物在真空中浓缩到约20mL并用MTBE(30mL)稀释。将所得混合物用水(10ml)洗涤，且用30％ NaCl水溶液(每次10mL)洗涤两次，经MgSO4干燥，过滤并在真空中浓缩。通过硅胶柱色谱(SiO2 25g，于正庚烷中的20％到75％EtOAc)纯化残余物，得到71mg化合物213(SpRp异构体)、43mg化合物214(RpRp或SpSp异构体，TLC(SiO2)上的较高rf)和24mg化合物215(RpRp或SpSp异构体，TLC(SiO2)上的较低rf)。
化合物213(SpRp异构体)1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.58(s,1H),8.44(s,1H),8.42(s,1H),8.12(s,1H),7.46(dd,J＝7.2,15.4Hz,4H),7.36-7.27(m,2H),7.18(q,J＝7.6Hz,4H),6.09(s,1H),5.98(s,1H),6.06-5.95(m,2H),5.25(d,J＝11.3Hz,1H),5.21(dd,J＝1.4,10.4Hz,1H),5.12-5.03(m,3H),5.00-4.92(m,3H),4.87(d,J＝4.7Hz,1H),4.60(brd,J＝11.7Hz,1H),4.55(d,J＝3.9Hz,1H),4.44(br d,J＝11.3Hz,1H),4.39-4.32(m,2H),4.26-4.08(m,8H),3.75(dd,J＝11.3,16.0Hz,1H),3.49(dd,J＝8.2,10.6Hz,1H),2.82-2.72(m,3H),2.61(td,J＝5.9,17.2Hz,1H),0.99(s,9H),0.96(s,9H),0.32(s,3H),0.23(s,6H),0.22(s,3H)。
化合物214(RpRp或SpSp异构体，TLC(SiO2)异构体上的较高rf)：1HNMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.60(s,2H),8.18(s,2H),7.50(d,J＝7.0Hz,4H),7.37-7.31(m,2H),7.25-7.21(m,4H),6.05-5.93(m,4H),5.22(dd,J＝1.6,17.2Hz,2H),5.09(dd,J＝1.0,10.4Hz,2H),5.00-4.83(m,6H),4.61(dd,J＝1.2,11.7Hz,2H),4.25(dq,J＝4.3,10.8Hz,2H),4.09(brdd,J＝3.7,10.4Hz,2H),4.04(td,J＝5.5,10.9Hz,2H),3.99-3.88(m,4H),3.70(dd,J＝11.9,15.0Hz,2H),2.71(td,J＝5.5,17.1Hz,2H),2.49-2.37(m,2H),0.98(s,18H),0.25(s,6H),0.24(s,6H)。
化合物215(RpRp或SpSp异构体，TLC(SiO2)异构体上的较低rf)：1HNMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.54(s,2H),8.06(s,2H),7.47-7.44(m,4H),7.32-7.27(m,2H),7.20-7.15(m,4H),6.06-5.95(m,2H),5.92(d,J＝3.5Hz,2H),5.22(dd,J＝1.2,17.2Hz,2H),5.07(dd,J＝1.4,10.4Hz,2H),5.04-4.94(m,6H),4.62-4.52(m,2H),4.46-4.40(m,2H),4.40-4.22(m,8H),3.81(dd,J＝6.6,12.1Hz,2H),2.89-2.71(m,4H),0.88(s,18H),0.08(s,6H),-0.07(s,6H)。
步骤10
在回流下向化合物213(71mg,0.054mmol)于甲苯(28.4ml)中的溶液中添加Hoveyda-Grubbs催化剂第2代(17.0mg,0.027mmol)和对苯醌(11.70mg,0.108mmol)于甲苯(8mL)中的溶液。将混合物加热到回流并通过LC/MS监测反应进程。在3h后，添加于甲苯(2.5mL)中的另外的催化剂(8.5mg,0.0135mmol)，并且再继续反应2.5小时。在冷却下来后，将混合物在真空中浓缩，并通过硅胶柱色谱(SiO2 10g，于正庚烷中的33％到66％乙酸乙酯)纯化，得到17mg呈棕色干泡沫的化合物216(反式/顺式＝5/1)。
化合物216：1H NMR(仅反式异构体，400MHz，氯仿-d)δ＝8.37(s,1H),8.34(s,1H),8.24(s,1H),8.20(s,1H),7.41(d,J＝7.1Hz,2H),7.36-7.27(m,3H),7.24-7.13(m,5H),5.97(d,J＝5.9Hz,2H),5.75(td,J＝5.5,15.2Hz,1H),5.69(td,J＝5.5,15.6Hz,1H),5.07(d,J＝3.9Hz,1H),5.03(dd,J＝5.1,15.2Hz,1H),4.94(t,J＝5.5Hz,2H),4.85(dd,J＝5.1,15.2Hz,1H),4.74(d,J＝3.9Hz,1H),4.67(br d,J＝12.1Hz,1H),4.45(br d,J＝10.2Hz,1H),4.42-4.34(m,2H),4.28-4.19(m,2H),4.19-4.06(m,4H),3.96-3.84(m,1H),3.82-3.68(m,1H),3.56(br dd,J＝12.1,14.5Hz,1H),3.33(dd,J＝9.0,10.9Hz,1H),2.83-2.78(m,2H),2.72(td,J＝5.6,16.6Hz,1H),2.39(td,J＝6.3,17.2Hz,1H),1.00(s,18H),0.42(s,3H),0.40(s,3H),0.34(s,3H),0.30(s,3H)。
化合物217
通过步骤10单独地处理从步骤9获得的化合物214，得到化合物217(反式/顺式异构体的5/1混合物)。
1H NMR(仅反式异构体，400MHz，氯仿-d)δ＝8.47(s,2H),8.14(s,2H),7.43-7.38(m,4H),7.36–7.29(m,2H),7.22(t,J＝7.0Hz,4H),5.83(s,2H),5.77(t,J＝3.3Hz,2H),5.17(d,J＝3.5Hz,2H),5.11-5.04(m,2H),4.70(br dd,J＝3.5,16.4Hz,2H),4.62(br d,J＝12.1Hz,2H),4.16-4.08(m,6H),3.93(br dd,J＝3.7,11.9Hz,2H),3.74-3.64(m,2H),3.49(t,J＝12.9Hz,2H),2.42(td,J＝5.9,18.4Hz,2H),2.13(ddd,J＝5.5,7.8,16.8Hz,2H),1.00(s,18H),0.40(s,6H),0.34(s,6H)。
化合物218
通过步骤10单独地处理从步骤9获得的化合物215，得到化合物218。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.14(s,2H),8.12(s,2H),7.49-7.43(m,2H),7.36-7.27(m,4H),7.19-7.12(m,4H),5.96(s,2H),5.67-5.54(m,2H),4.95-4.82(m,4H),4.69(d,J＝4.3Hz,2H),4.60-4.09(m,12H),3.63(dd,J＝8.8,16.2Hz,2H),2.93(td,J＝5.9,17.2Hz,2H),2.82-2.72(m,2H),0.99(s,18H),0.30(s,6H),0.27(s,6H)。
步骤11
在环境温度下向化合物216(反式/顺式＝5/1，17mg，0.013mmol)中添加甲胺溶液(2ml)(33％于EtOH中)的溶液。在环境温度下搅拌所得溶液，同时通过LCMS监测。在完成(1h后)，在真空中浓缩反应混合物。向残余物中添加吡啶(0.9ml)、TEA(0.45ml)和三乙胺三氢氟化物(0.36ml,2.2mmol)。将所得混合物在50-60℃搅拌下4h并冷却到环境温度。在完成TBS脱保护(通过LCMS监测)后，将反应混合物用甲氧基三甲基硅烷(1.5ml,12mmol)处理并搅拌1h。添加水(3mL)并且用甲苯(每次3ml)将所得混合物萃取两次且用EtOAc(每次2mL)萃取两次。通过注射器式过滤器过滤水层，并对滤液进行制备型HPLC，得到5.3mg化合物38和1.1mg化合物220。
化合物38(SpRp，反式)：1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ＝9.27(br s,1H),8.47(br s,1H),8.21(br s,1H),8.09(br s,1H),6.19-5.96(m,2H),5.94-5.71(m,2H),5.13-4.68(m,2H),4.55-4.39(m,2H),4.38-4.23(m,1H),4.20-3.91(m,5H),3.75-3.50(m,4H)。
化合物220(SpRp，顺式)：1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ＝9.08(s,1H),8.72(br s,1H),8.55(s,1H),8.24(s,1H),8.18(s,1H),6.22-6.14(m,2H),6.10(d,J＝1.6Hz,2H),5.01(d,J＝3.9Hz,1H),4.41(br d,J＝9.8Hz,1H),4.34-4.25(m,3H),4.24-4.18(m,1H),4.15(dd,J＝6.1,11.5Hz,1H),4.08-3.99(m,4H),3.71-3.57(m,3H)。
化合物39和化合物222
通过步骤11单独地处理化合物217，得到化合物39和化合物222。
化合物39(反式异构体)：1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ＝8.83(br s,1H),8.43(br s,1H),8.17(br s,1H),8.11(br s,1H),6.17-5.95(m,2H),5.93-5.63(m,2H),5.10-4.78(m,2H),4.69-4.53(m,1H),4.52-4.35(m,2H),4.12-3.92(m,5H),3.76-3.44(m,4H)。
化合物222(顺式异构体)：1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ＝8.71(br s,2H),8.18(s,2H),6.17-6.06(m,4H),4.37(br d,J＝9.8Hz,2H),4.33(d,J＝3.9Hz,2H),4.27(br dd,J＝7.0,13.7Hz,2H),4.06(dd,J＝7.0,11.3Hz,2H),4.19-4.03(m,2H),4.01(br d,J＝9.8Hz,2H),3.74(ddd,J＝3.9,6.4,10.5Hz,2H)。
化合物40
通过步骤11单独处理化合物218，得到化合物40：1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ＝9.34–8.88(m,2H),8.73(br s,1H),8.34-8.02(m,2H),6.20-5.96(m,2H),5.89(br s,2H),5.25-4.95(m,2H),4.76-4.64(m,1H),4.47-4.22(m,2H),4.20-4.07(m,2H),4.07-3.93(m,2H),3.82-3.55(m,3H),3.54-3.38(m,2H)
实施例24-化合物30的合成
在环境温度下将化合物2(1.1mg,1.4μmol)添加到碳酸碘甲基异丙基酯(13.75mg,0.056mmol)于丙酮/水(0.4/0.10ml)中的溶液中。在环境温度下在黑暗中搅拌所得混合物，同时通过LCMS监测反应。在完成(2h)后，将反应混合物用水(0.4ml)稀释，并用正庚烷(每次0.5mL)萃取三次。在水层中纯化粗制产物，提供0.5mg化合物30。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝7.92(s,2H),7.72(br s,2H),6.22(d,J＝17.2Hz,2H),6.19-6.03(m,2H),5.98(br t,J＝6.3Hz,2H),5.82-5.77(m,2H),5.68(dd,J＝2.3,51.6Hz,1H),5.54(dd,J＝10.9,13.7Hz,2H),5.48(dd,J＝10.9,12.9Hz,2H),4.94(五重峰，J＝6.2Hz,2H),4.71-4.63(m,2H),4.63-4.56(m,2H),4.50-4.43(m,2H),4.22-4.12(m,2H),4.05-3.90(m,2H),1.33(d,J＝4.3Hz,6H),1.32(d,J＝4.3Hz,6H)。
实施例103-HAQ STING激动剂活性报告子测定
将THP1-DualTM细胞(InvivoGen，目录编号thpd-nfis)用于EC50确定。THP1 DualTM细胞已被供应商Invivogen(Insight 201402-1)表征为携带HAQ STING基因型。使细胞在制造商推荐的条件下生长并维持。按照制造商手册中所述的干扰素调控因子(IRF)途径诱导进行EC50确定。简单地说，将细胞接种并用不同浓度的化合物处理20hr，同时在37℃、5％CO2下培育。使细胞再悬浮，并添加QUANTI-LuCTM溶液(目录编号：rep-qlc1)。通过发光计(Envision,Perkin Elmer)测量所得光发射。绘制获得的信号并用GraphPad Prism7软件计算EC50。
EC50值报告于下表4-8中。EC50值可来自单次测定或多次测定的平均值。在每个表之前是用于查阅该表的结构。
表4
*指示在实验浓度范围内活性不可测量。
“N/E”指示“未评价。”
使用表4中每种化合物的铵盐形式测量人STING EC50(μM)。
表5
*指示在实验浓度范围内活性不可测量。
**化合物7是化合物11和化合物12的1:1混合物。
“N/E”指示“未获得。”“N.D.”指示“未确定。”
使用表5中所列的每种化合物的铵盐形式测量人STING EC50(μM)。
表6
*指示在实验浓度范围内活性不可测量。
“N/E”指示“未评价。”“N.D.”指示“未确定”。
除了化合物26、化合物31、化合物33和化合物34(所有这些都作为双-TEA盐进行测试)之外，使用表6中所列的每种化合物的铵盐形式测量人STING EC50(μM)。
表7
*指示在实验浓度范围内活性不可测量。
使用表7中每种化合物的铵盐形式测量人STING EC50(μM)。
表8
*指示在实验浓度范围内活性不可测量。
使用表8中每种化合物的铵盐形式测量人STING EC50(μM)。
实施例104-STING变体特异性报告子测定
人STING有4种主要变体，包括WT、HAQ、REF和AQ变体。例如，REF-STING(也被称为R232H)在约14％的人群中发生。与野生型等位基因相比，R232H对细菌和后生动物环状二核苷酸的反应降低。Yi G等“人STING的单核苷酸多态性可影响对环状二核苷酸的先天免疫应答(Single nucleotide polymorphisms of human STING can affect innate immuneresponse to cyclic dinucleotides)”PLoS One 2013；8:e77846报道了这4种主要变体以及其他罕见变体的细节。通过使用THP1-DualTM KO-STING细胞(InvivoGen，目录编号thpd-kostg)和三种STING变体蛋白质表达载体建立STING变体特异性报告细胞系。WT STING的表达载体图谱示于图6中。对于其他两种表达载体，在该载体中使用不同的STING变体序列，其中WT STING被适当的核苷酸序列取代。
制备用于WT-STING、REF-STING和AQ-STING的STING变体表达载体并将其稳定转染到THP1-DualTM KO-STING细胞中以准备分别用于WT-STING、REF-STING和AQ-STING的STING变体特异性报告子测定。如上文实施例103中针对HAQ STING激动剂活性报告子测定所述确定EC50值。结果示于下表9中。用于这些STING变体的DNA序列示于SEQ ID NO:1(WT人STING的核苷酸序列)、SEQ ID NO:2(REF人STING的核苷酸序列)和SEQ ID NO:3(AQ人Sting的核苷酸序列)中。
WT人STING：
REF人STING：
AQ人STING：
实施例105-小鼠STING激动剂活性报告子测定
将RAW-LuciaTM ISG细胞(InvivoGen，目录编号rawl-isg)用于小鼠STING激动剂报告子测定。如上文实施例103中在HAQ STING激动剂活性报告子测定中所述确定EC50值。结果示于下表9中。
实施例106--差示扫描荧光分析法(DSF)测定
采用DSF测定来测量化合物和重组STING蛋白质之间的物理相互作用。将截短的重组STING蛋白质(a.a.155-341)(SEQ ID NO:4)在大肠杆菌中表达并分离用于如下文所述的测定。在384孔板中制备测定基质到最终体积为每孔10μL，其由1μM重组STING蛋白质(aa155-341)(SEQ ID NO:4)、100mM PBS pH 7.4(补充有100mM KCl)、5×SYPRO橙色染料和50μM化合物(最终DMSO浓度0-1％)组成。使用25℃到95℃的温度梯度(以0.05℃/min的速率)以及激发滤光片和发射滤光片(分别于470和586nm下)，在QuantStudio 12K Flex实时PCR系统上进行测定。根据由Applied 蛋白质热迁移软件(Protein ThermalShift software)(算法版本1.3)赋值的荧光导数曲线，计算未结合和配体结合的重组STING蛋白质的热熔(Tm)和热熔差(dTm D)。
通常，认为ΔTm值大于0的化合物与测试的蛋白质具有物理相互作用，且ΔTm的值与化合物结合亲和力正相关。此处，化合物1a显示17.6的ΔTm(表9)，表明与STING蛋白质的物理相互作用。
表9化合物1a的体外表征
实施例107-离体人PBMC刺激测定
使用10.0mL BD真空采血管(Vacutainer)肝素钠管(目录编号367874)收集来自5个健康供体的人血液。使用SIGMA ACCUSPIN 50ml管(目录编号A2055)和sigma ACCUSPINSystem-HISTOPAQUE-1077(目录编号A7054)，使用制造商提供的方案完成外周血单核细胞(PBMC)分离。收获PBMC层并如Sigma所建议的用1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。对PBMC计数并将其最终以1×10e6/ml悬浮于补充有10％胎牛血清(FBS)(Gibco目录编号20140.79)的RPMI(corning目录编号10-041-CV)中。将1ml细胞(1×10e6)转移到Falcon 5mL圆底聚丙烯试管(目录编号352063)中，并在5％ CO2培育箱中在37℃下用不同浓度(0、0.1、1、10μM)刺激24小时。
在培育24小时后，将管以1400rpm离心5分钟并收获上清液。将上清液储存在-80℃下用于随后的IFNβ测量。使用人IFN-β基础试剂盒(Meso Scale Diagnostics目录编号K151ADA)和由制造商提供的方案完成IFNβ测量。通过在MESO SECTOR Imager 2400上读取测定板并使用MSD Discovery Workbench 4.0程序完成IFN-β估计。在24小时后，分析IFNβ蛋白质。结果显示，化合物1a可以剂量依赖性方式诱导原代人PBMC IFNβ蛋白质的产生。
表10中显示的结果反映了使用五个不同供体进行的测量的平均值。
表10离体人PBMC刺激测定
对于IFNβmRNA定量，使用RNeasy小型试剂盒(Qiagen,Germany)根据制造商的方案分离总RNA。通过qPCR测定来定量IFNβmRNA。简单地说，使用SuperScript VILO MasterMix(Life Technologies,USA)将总RNA(400ng到1000ng)以60μl反应体积转化为cDNA。随后使用Applied Biosystems TaqMan表达测定，使用用于IFNB1(Hs01077958_s1)和GAPDH(Hs99999905_m1)的RNA特异性引物扩增获得的cDNA(10ng)。利用TaqMan Fast AdvancedMaster Mix(Life Technologies,USA)在Applied Biosystems Quantstudio 12K Flex实时PCR系统上进行qPCR分析，其中在50℃下进行初始2min步骤，之后是95℃2s，以及40个循环的95℃1s和60℃20s。在使用2-ΔΔCT方法针对参考基因GAPDH在归一化后计算相对基因表达。使用Applied Biosystems Quantstudio 12K Flex软件v1.2.2完成计算。相对于媒介物处理样品的IFNβmRNA倍数变化汇总于表11中。结果显示化合物1a可以剂量和时间依赖的方式诱导原代PBMC中的IFNβmRNA。表11显示从五个不同供体计算的平均值。
表11--离体人PBMC 3hr和24hr刺激测定(mRNA)
实施例108--化合物1a对CT26双重肿瘤模型的抗癌作用
在CT26双重肿瘤模型中测试化合物1a的抗癌活性，该模型是小鼠结肠癌模型。对5-6周龄Balb/cJ雌性小鼠(Jackson Labs,Bar Harbor,Maine)在每只动物的两侧皮下植入CT26肿瘤细胞，每侧105个细胞。对于研究A，在肿瘤植入后5天，当平均肿瘤达到大约100mm3时，开始治疗(1.25mg/kg、2.5mg/kg和5mg/kg)。对于研究B，在肿瘤植入后8天，当平均肿瘤达到大约120mm3时，开始治疗(0.6mg/kg和10mg/kg)。治疗方案描述于表12和表13中。
表12用于研究A的给药方案
*I.T.是肿瘤内。
表13用于研究B的给药方案
*I.T.是肿瘤内。
研究中的所有小鼠都有两个皮下CT26肿瘤。“治疗的肿瘤”指示有直接施用化合物的肿瘤，而“未治疗的肿瘤”指示没有直接施用化合物的肿瘤。在整个实验中追踪肿瘤体积。在治疗开始后每周测量肿瘤体积两次。通过用于长椭球体的体积的公式(L×W2)/2从卡尺测量值计算肿瘤负荷，其中L和W是各自的正交长度和宽度测量值(mm)。
化合物1a在CT26双重肿瘤模型中显示有效且治愈的活性(图7和图8)。对于治疗的肿瘤，即使在研究中测试的最低剂量下也检测到20％的治愈率(图8，0.6mg/kg剂量)。同时，最高剂量(10mg/kg)在研究结束时治愈了100％的该肿瘤动物。对于未治疗的肿瘤，剂量依赖性抗肿瘤作用也是明显的。最高剂量组(10mg/kg)显示80％的治愈效果；所有较低剂量也显示出肿瘤生长抑制活性。因此，观察到化合物1a的0.6mg/kg到10mg/kg的治疗窗，基于未注射的远端肿瘤部位的效果，不仅局部地而且全身地看到抗肿瘤活性。总之，这些结果表明化合物1a的局部施用可诱导局部和全身(远位)抗癌活性。
实施例109--化合物1a对CT26肝转移模型的抗癌作用
在CT26肝转移模型中测试化合物1a的抗癌活性。对麻醉的5-6周龄BALB/cJ雌性小鼠(Jackson Labs,Bar Harbor,Maine)在脾内植入表达荧光素酶的CT26肿瘤细胞(每只小鼠5×105个细胞)。随后的十分钟等待期允许肿瘤细胞循环进入动物的肝脏中。然后取出脾脏并缝合动物并且使其恢复。在3天后，再次植入CT26肿瘤细胞(每只小鼠105个细胞)，这次是在右前肢区域下方皮下(sc)进行，以使得能够形成用于化合物施用的肿瘤块。在脾内注射后9天，将化合物(10mg/kg)经肿瘤内一次性施用到sc肿瘤中。
化合物的局部抗癌作用是通过其对sc肿瘤的作用来测量的，而化合物的远位作用是通过基于每个小鼠肝脏中生长的肿瘤块的有害作用，治疗小鼠与媒介物治疗对照小鼠相比的总体存活率来评估的。化合物1a显示对局部sc肿瘤的有效活性以及在10只治疗动物中的9只中的治愈性全身活性(图9)。这些结果表明化合物1a的局部施用可诱导局部和全身(远位)抗癌活性，包括深层病变，例如肝脏中。
实施例110--化合物1a对GL261脑原位模型的抗癌作用
在GL261脑原位模型中测试化合物1a的抗癌活性。GL261是鼠神经胶质瘤细胞系。将表达荧光素酶的GL261小鼠神经胶质瘤细胞(2×104个细胞/小鼠)颅内植入5-6周龄B6白化雌性小鼠(Jackson Labs,Bar Harbor,Maine)中。在3到4天后，将GL261细胞在右前肢区域下方皮下植入(106个细胞/小鼠)，以允许形成用于化合物施用的肿瘤块。在颅内肿瘤细胞植入后10天，将化合物(10mg/kg)经肿瘤内一次性施用到sc肿瘤中。化合物的局部抗癌作用是通过其对sc肿瘤的作用来测量的，而化合物的远位作用是通过基于每个小鼠脑中生长的肿瘤块的有害作用，治疗小鼠与媒介物治疗对照小鼠相比的总体存活率来评估的。化合物1a显示对局部sc肿瘤的有效活性并且显示在8只治疗动物中的5只中的治愈性全身活性(图10)。这些结果表明化合物1a的局部施用可诱导局部和全身(远位)抗癌活性，包括深层病变，例如脑中。
实施例111-确认与WT STING复合的X射线结构
为了进一步理解我们的新化合物的靶标结合机制，确定与化合物复合的WT STING的X射线晶体结构。
A.WT STING C-末端结构域(残基155-341)的表达和纯化
将编码人WT STING蛋白质从氨基酸155到341(SEQ ID NO:4)的DNA序列克隆到pET21b载体中，在N-末端具有His-TEV-Sumo标签(SEQ ID NO:5)。pET21b的序列已保存在addgene中且可在这里获得：addgene.org/vector-database/2550/；该序列以引用方式并入本文。
用该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)codon plus细胞，并且用0.1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导重组蛋白质的表达。通过Ni-NTA亲合色谱从细胞溶解产物的可溶性级分纯化蛋白质。通过sumo蛋白酶去除His-TEV-Sumo标签，并使用第二Ni-NTA亲和柱将其与无标记的WT STING 155-341分离。通过阴离子交换和尺寸排阻色谱进一步纯化蛋白质，并将其以35mg/ml的浓度储存在含有20mM Tris·HCl pH 7.5和150mM NaCl的缓冲液中。
B.与化合物1复合的WT STING C-末端结构域的结晶和结构确定
为了使WT STING 155-341与化合物1共结晶，使用储存缓冲液(20mM Tris·HClpH 7.5和150mM NaCl)将WT STING蛋白质稀释到10mg/ml并与化合物1(于DMSO中的100mM母液)以摩尔比1:5混合。将混合物在4℃下培育4小时，并以13,000rpm离心20min，然后结晶。使用悬滴蒸气扩散法在18℃下设置结晶筛托盘(screen tray)。通过将1μL WTSTING/化合物1溶液与等体积的含有100mM HEPES pH 7.5、200mM CaCl2和15％(wt/vol)PEG 8000的孔溶液混合来生长晶体。当晶体在液氮中快速冷冻时，20％(wt/vol)PEG 400用作冷冻保护试剂。使用Pilatus检测器以SSRF BL19U1束线收集衍射数据集，并在CCP4软件套件中用HKL3000和程序SCALEPACK2MTZ处理。
通过使用程序PHASER的分子置换(最大似然分子置换(Maximum LikelihoodMolecular Replacement))，以PDB ID 4F9E作为初始搜索模型，确定结合至化合物1的WTSTING 155-341的结构。在用模型相计算的Fo-Fc差值图中确认WT STING的二聚体界面之间化合物1的存在。使用Coot程序手动构建并完成该模型，并且使用CCP4软件套件中的Refmac5程序进行了精修。在空间群P212121中以的分辨率报告最终的精修结构，其晶胞测量为a＝33.820，b＝78.110，C＝132.212，α＝90.00，β＝90.00，γ＝90.00。在二聚体界面处结合至一个化合物1分子的每个不对称单元中鉴别出两拷贝的WT STING 155-341。
C.在X射线晶体结构中观察到的化合物1与WT STING的相互作用
图11显示与化合物1复合的人WT STING的X射线晶体结构的图片。我们检查了与化合物1复合的人WT STING的X射线晶体结构，所述化合物1从化合物1a的样品中共结晶。所述化合物在由WT STING蛋白质的二聚体形成的界面袋(interface pocket)处结合。所述化合物的腺嘌呤碱基的两个面分别与Tyr240和Arg238的胍基形成π-π堆积相互作用。反式烯烃接头与Arg 238侧链的脂族部分形成范德华(van der Waals)相互作用。化合物的核糖基团的C2’位置处的氟取代基嵌套在由Thr263、Pro264和Tyr163限定的疏水孔中。所述化合物的带负电荷的硫代磷酸酯基团分别与Arg238形成盐桥，并且与Ser162和Thr267形成H-键相互作用。另外，硫代磷酸酯基团还与Arg 232的胍基形成静电相互作用。WT STING的由残基226到243组成的LID环区域包裹两个碱基和反式烯烃接头。
实施例112-与化合物1复合的REF STING的X射线晶体结构的确定。
A.REF STING C-末端结构域(残基155-341，SEQ ID NO:6)的表达和纯化
将编码人REF STING蛋白质从氨基酸155到341(SEQ ID NO:6)的DNA序列克隆到pET21b载体中，在其N-末端跟随His-TEV-Sumo标签(SEQ ID NO:7)。pET21b的序列已保存在addgene中且可在这里获得：addgene.org/vector-database/2550/；该序列以引用方式并入本文。
用该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)codon plus细胞，并且用0.1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导重组蛋白质的表达。通过Ni-NTA亲合色谱从细胞溶解产物的可溶性级分纯化蛋白质。通过sumo蛋白酶去除His-TEV-Sumo标签，并使用第二Ni-NTA亲和柱将其与无标记的REF STING_155-341分离。通过阴离子交换和尺寸排阻色谱进一步纯化蛋白质，并将其以24mg/ml的浓度储存在含有20mM Tris·HCl pH 7.5和150mM NaCl的缓冲液中。
B.与化合物1复合的REF STING C-末端结构域的结晶和结构确定
为了使REF STING_155-341与化合物1共结晶，使用储存缓冲液(20mM Tris·HClpH 7.5和150mM NaCl)将REF STING蛋白质稀释到10mg/ml并与化合物1(于DMSO中的100mM母液)以摩尔比1:5混合。将混合物在4℃下培育4小时，并以13,000rpm离心20min，然后结晶。使用悬滴蒸气扩散法在18℃下设置结晶筛托盘。通过将1μL REF STING/化合物1溶液与等体积的含有100mM HEPES pH 7.5、200mM CaCl2和15％(wt/vol)PEG 8000的孔溶液混合来生长晶体。当晶体在液氮中快速冷冻时，20％(wt/vol)PEG 400用作冷冻保护试剂。使用Pilatus检测器以SSRF BL18U1束线收集衍射数据集，并在CCP4软件套件中用HKL3000和程序SCALEPACK2MTZ处理。该结构示于图12中。
通过使用程序PHASER的分子置换(最大似然分子置换)，使用先前确定的WT STING155-341结构(如上文所述)作为初始搜索模型，确定结合至化合物1的REF STING_155-341的结构。在用模型相计算的Fo-Fc差值图中确认REF STING的二聚体界面之间化合物1的存在。使用Coot程序手动构建并完成该模型，并且使用CCP4软件套件中的Refmac5程序进行了精修。在空间群P212121中以的分辨率报告最终的精修结构，其晶胞测量为a＝33.733，b＝77.831，c＝131.689，α＝90.00，β＝90.00，γ＝90.00。在二聚体界面处结合至一个化合物1分子的每个不对称单元中鉴别出两拷贝的REF STING 155-341。
C.在X射线晶体结构中观察到的化合物1与REF STING的相互作用
图12显示与化合物1复合的人REF STING的X射线晶体结构，所述化合物1从化合物1a的样品中共结晶。所述化合物在由STING蛋白质的二聚体形成的界面袋处结合。所述化合物的腺嘌呤碱基的两个面分别与Tyr240和Arg238的胍基形成π-π堆积相互作用。反式烯烃接头与Arg238侧链的脂族部分形成范德华相互作用，而Arg238侧链的胍部分与来自外侧的His232侧链的咪唑基形成π-π堆积相互作用。烯烃接头与Arg238和His232的侧链的相互作用对接触。化合物的核糖基团的C2’位置处的氟取代基嵌套在由Thr263、Pro264和Tyr163限定的疏水孔中。所述化合物的带负电荷的硫代磷酸酯基团分别与Arg238形成盐桥，并且与Ser162和Thr267形成H-键相互作用。REF STING的由残基226到243组成的LID环区域包裹两个碱基和反式烯烃接头。
实施例113-比较
在头对头比较中，使用本公开的化合物1a、天然STING配体(2'3'cGAMP)和如Corrales等，“在肿瘤微环境中直接活化STING导致有效和系统性的肿瘤消退和免疫(Direct Activation of STING in the Tumor Microenvironment Leads to Potent andSystemic Tumor Regression and Immunity)”，Cell Reports(2015)11:1018-1030(其以引用方式并入本文)中所报道声称的STING激动剂ML RR-S2 CDA计算WT STING、HAQ STING、AQ STING和REF STING的人STING测定的EC50值。如上述实施例中所述进行测定。注意，表14中报告的测定值限于在头对头比较中进行的测定，并且可能并不反映如表5或其他地方所报告的经更大量的试验确定的平均值。应进一步注意，“2'3'cGAMP”与如Cell Reports出版物中所报道的“ML cGAMP”相同。
表14
表14还报告了如通过等温滴定量热法(ITC)测量的人WT STING与三种测试化合物中的每一种的结合的解离结合常数(Kd)。ITC是测量与分子间相互作用相关的热力学性质的微量热滴定技术。基于这些测试，化合物1a似乎与测试化合物的WT STING形成最强的键。
材料
通过在大肠杆菌中表达编码人WT STING的包含氨基酸139-379的胞质结构域的构建体，产生重组人野生型STING(aa,139-379,H232R)蛋白质。
试剂
用于本研究中的试剂来源显示如下：
蛋白质缓冲液制备
在-60℃下将STING蛋白质以90μL和100μL等分试样，分别以3.0mg/mL和20mg/mL的浓度储存在含有5％甘油的PBS(pH 7.5)中。在分析当天，将蛋白质的等分试样解冻，稀释到400μl并使用AmiconMltra离心过滤器单元(10k MW截止值，0.5mL)(利用Eppendorf微量离心机进行至少4次10min 14000×g离心)经缓冲液交换到PBS中，然后最终用1×PBS稀释到20μM到30μM(实验依赖性)。使用Nanodrop 2000分光光度计和22140(M-1cm-1)的蛋白质消光系数确定蛋白质浓度。
样品制备
通过1.5mL微量离心管供应化合物1a、2'3'cGAMP和ML RR-S2CDA的200μL 1mM母液。在每次实验之前，将样品稀释到200μM到500μM的浓度(取决于实验)。
方法
在装配有ITC清洁附件(TA Instruments编号601800.901)的Affinity ITC单元(TAInstruments编号609003.901)上进行测定。将含有20μM到30μMSTING蛋白质的大约400μL的STING蛋白质溶液移液到185μL允许一定可接受的过载的量热计池(calorimeter cell)中。参比池含有等量的Milli-Q水。在25℃下用100μM到300μM化合物的20×2.5μL注射物进行培育。控制软件是ITC Run 3.3.0.0版(TA Instruments)，用于获得由代表每次注射的加热速率(heat rate)的多个原始热峰(μcal/sec)组成的温谱图。分析软件Nano Analyze3.70版(TA Instruments)用于基线校正，校正空白或样品稀释热(饱和时)以及对加热速率峰值求积分，从而产生绘制的“Q”值。将所得等温线用独立模型拟合以推导热力学参数。
推导并报告Kd值和n值(曲线拐点处的摩尔比)。蛋白质和配体的浓度的最佳条件来源于初步实验。
结果
确定测试化合物与重组人野生型STING(aa,139-379,H232R)结合的加热速率温谱图和其所得等温线。每种化合物与STING的结合是吸热的(如通过负加热速率所示)，以及放热(正方向)稀释热(在化合物已达到蛋白质的饱和度后观察到的)。已显示2',3'cGAMP对各种STING变体产生类似的吸热响应。化合物1a提供0.04μM的最低Kd，之后是Kd为0.07μM的2'3'cGAMP，然后是Kd为0.40μM的ML RR-S2 CDA。所有化合物均提供接近0.5的n值，表明STING蛋白质作为二聚体存在并且每2mol STING结合1mol化合物。
实施例114-潜在代谢物的鉴别
将化合物1a在CD-1小鼠、Sprague Dawley大鼠、小猎犬(Beagledog)、食蟹猴和人的肝细胞中培育，以评价主要代谢物的形成。
材料
冷藏保存的混合肝细胞购自ThermoFisher Scientific(Waltham,MA)、Xenotech、LLC(Kansas City,KS)和In Vitro ADMET Laboratories(Columbia,MD)，且适当的培养基购自In Vitro ADMET Laboratories(Columbia,MD)和Life Technologies(Carlsbad,CA)。分别从Corning Life Sciences(Tewksbury,MA)和Nexcelom Bioscience(Lawrence,MA)获得AOPI染色溶液和磷酸盐缓冲液。用于分析中的所有化学品、试剂和溶剂均为分析级或HPLC级。
实验设计和程序
肝细胞培育
称量化合物1a并将其溶解于含有0.12％甲酸PBS的HPLC-水中以制得1020mmol/L。然后将溶液单个地稀释2.5倍到4mmol/L，然后用含有0.1％人血清白蛋白和2mmol/L L-谷氨酰胺的Williams'E培养基进一步稀释21000倍，以制备浓度为20μmol/L的工作母液。
在培育之前，将冷藏保存的肝细胞在37℃的水浴中解冻。将一管冷藏保存的肝细胞添加到从In Vitro ADMET Laboratories(Columbia,MD)获得的冷藏保存的肝细胞恢复培养基(UCRM)的每个50-mL锥形管中。在室温4℃下将细胞在具有GH 3.8转子的Beckman离心机(Brea,CA)中以740rpm旋转10分钟。去除上清液，并将细胞再悬浮于平铺培养基中用于计数。在将细胞再悬浮于平铺培养基中后，转移20μL再悬浮液并与20μL的AOPI染色溶液混合。轻轻混合溶液，并使用Cellometer(Nexcelom,Lawrence,MA)对细胞计数。在计数后，然后将细胞以1或2百万个活细胞/mL再悬浮于含有2mmol/L L-谷氨酰胺(pH 7.4)的Williams'E培养基中。
将肝细胞悬浮液(50μL/孔)添加到48孔板中。添加50微升含有化合物1a(20μmol/L)的工作母液以开始反应。将板置于组织培养物培育箱(5％CO2/95％空气湿润气氛和37℃)中，并在5、30、60、120、180和240min，用200μL由100％甲醇/乙腈(1/1,v/v)与2010ng/mL呋塞米(furosemide)和0.2μmol/L(R)-普萘洛尔(propranolol)组成的停止溶液终止反应。将混合物离心并过滤，并且收集上清液用于分析。冷藏保存的肝细胞的最终浓度为1×106个细胞/mL。化合物1a的最终培育浓度为10μmol/L。
用于代谢物鉴别的LC-MS/MS条件
LC-MS/MS系统由Shimadzu HPLC和AB-SCIEX TripleTOF 5600混合四极以及TOF质谱仪(Framingham,MA)构成。Shimadzu HPLC(Kyoto,Japan)由通信总线模块(CBM-20A)、附接有换架器(Rack Changer II)的自动进样器(SIL-30AC)、两个泵(LC-30AD)和柱温箱(column oven)(CTO-30A)组成。使用AB-SCIEX APCI(负校准溶液和正校准溶液两者)(Framingham,MA)校准质谱仪。在负和正两种扫描模式下分析从用肝细胞培育获得的样品。基本分析方法和仪器条件汇总如下。光谱仪设置的修改取决于分析物的必要性。
LC-MS/MS条件：
活性数据的数据分析
使用AB-Sciex Analyst TF(1.5.1版；Framingham，MA)获得质谱数据。使用AB-Sciex PeakView(2.2.0.1版；Framingham，MA)获得色谱图和光谱。提取离子色谱图的相对峰面积的比较基于每种目标分析物的预期精确质荷比(m/z)的±0.0002Da。
结果
从用肝细胞培育中未检测到代谢物。在所呈现的分析条件下，化合物1a显示大约7.8分钟的保留时间。在负扫描模式下，化合物1a显示去质子化的分子离子m/z 745(C24H25F2N10O8P2S2 ˉ)和双重去质子化的分子离子m/z372(C24H24F2N10O8P2S2 2ˉ)。观察到主要MS/MS产物离子m/z 533(C19H19FN10O4PSˉ)和m/z 186(C9H8N5 ˉ)。在正扫描模式下，化合物1a显示质子化的分子离子m/z 747(C24H27F2N10O8P2S2 +)和主要MS/MS产物离子m/z651(C24H26F2N10O6PS+)、m/z 252(C10H11FN5O2 +)和m/z 188(C9H10N5 +)。MS和MS/MS数据确认了化合物1a的结构。
化合物1a在用小鼠、大鼠、狗、猴和人的肝细胞培育中稳定。在该研究中未鉴别化合物1a的明显代谢物。在从用肝细胞培育获得的样品中，只有化合物1a本身可通过串联质谱(MS/MS)的碎片检测和确认。
本公开中引用的所有文献均以引用方式并入本文，但如果任何并入的文件与本书面说明书相矛盾，则应以本书面说明书为准。本领域技术人员将认识到，可对本文所提供的材料进行各种改变和修改，并且该材料在本公开的范围和精神内。
序列表
SEQ ID NO:1(WT人STING)：
SEQ ID NO:2(REF人STING)：
SEQ ID NO:3(AQ人STING)：
SEQ ID NO:4(WT STING残基155-341)：
SEQ ID NO:5(His-TEV-Sumo-WT STING 155-341)
SEQ ID NO:6(REF STING残基155-341)：
SEQ ID NO:7(His-TEV-Sumo-REF STING 155-341)
SEQUENCE LISTING
<110> 卫材 R&D 管理有限公司
金大式
方家范
远藤笃史
崔亨旭
郝鸣鸿
鲍幸峰
黄冠群
<120> 用于治疗癌症的环状二核苷酸化合物
<130> 0080171-000371
<150> 62/460562
<151> 2017-02-17
<150> 62/479169
<151> 2017-03-30
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<150> 62/551647
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<151> 2017-08-29
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
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gcagccttgg ttctgctgag tgcctgcctg gtgacccttt gggggctagg agagccacca 120
gagcacactc tccggtacct ggtgctccac ctagcctccc tgcagctggg actgctgtta 180
aacggggtct gcagcctggc tgaggagctg cgccacatcc actccaggta ccggggcagc 240
tactggagga ctgtgcgggc ctgcctgggc tgccccctcc gccgtggggc cctgttgctg 300
ctgtccatct atttctacta ctccctccca aatgcggtcg gcccgccctt cacttggatg 360
cttgccctcc tgggcctctc gcaggcactg aacatcctcc tgggcctcaa gggcctggcc 420
ccagctgaga tctctgcagt gtgtgaaaaa gggaatttca acgtggccca tgggctggca 480
tggtcatatt acatcggata tctgcggctg atcctgccag agctccaggc ccggattcga 540
acttacaatc agcattacaa caacctgcta cggggtgcag tgagccagcg gctgtatatt 600
ctcctcccat tggactgtgg ggtgcctgat aacctgagta tggctgaccc caacattcgc 660
ttcctggata aactgcccca gcagaccggt gaccgggctg gcatcaagga tcgggtttac 720
agcaacagca tctatgagct tctggagaac gggcagcggg cgggcacctg tgtcctggag 780
tacgccaccc ccttgcagac tttgtttgcc atgtcacaat acagtcaagc tggctttagc 840
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gttactgtgg gcagcttgaa gacctcagcg gtgcccagta cctccacgat gtcccaagag 1080
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<211> 1140
<212> DNA
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<210> 4
<211> 187
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Val Ala His Gly Leu Ala Trp Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu
1 5 10 15
Ile Leu Pro Glu Leu Gln Ala Arg Ile Arg Thr Tyr Asn Gln His Tyr
20 25 30
Asn Asn Leu Leu Arg Gly Ala Val Ser Gln Arg Leu Tyr Ile Leu Leu
35 40 45
Pro Leu Asp Cys Gly Val Pro Asp Asn Leu Ser Met Ala Asp Pro Asn
50 55 60
Ile Arg Phe Leu Asp Lys Leu Pro Gln Gln Thr Gly Asp Arg Ala Gly
65 70 75 80
Ile Lys Asp Arg Val Tyr Ser Asn Ser Ile Tyr Glu Leu Leu Glu Asn
85 90 95
Gly Gln Arg Ala Gly Thr Cys Val Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln
100 105 110
Thr Leu Phe Ala Met Ser Gln Tyr Ser Gln Ala Gly Phe Ser Arg Glu
115 120 125
Asp Arg Leu Glu Gln Ala Lys Leu Phe Cys Arg Thr Leu Glu Asp Ile
130 135 140
Leu Ala Asp Ala Pro Glu Ser Gln Asn Asn Cys Arg Leu Ile Ala Tyr
145 150 155 160
Gln Glu Pro Ala Asp Asp Ser Ser Phe Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu
165 170 175
Arg His Leu Arg Gln Glu Glu Lys Glu Glu Val
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<210> 5
<211> 311
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> His-TEV-Sumo-WT STING构建体
<400> 5
Met His His His His His His Ser Ser Gly Val Asp Leu Gly Thr Glu
1 5 10 15
Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Asn Ala Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln
20 25 30
Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile
35 40 45
Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys
50 55 60
Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln
65 70 75 80
Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile
85 90 95
Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile
100 105 110
Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Gly Gly Ser Val Ala His Gly
115 120 125
Leu Ala Trp Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Glu
130 135 140
Leu Gln Ala Arg Ile Arg Thr Tyr Asn Gln His Tyr Asn Asn Leu Leu
145 150 155 160
Arg Gly Ala Val Ser Gln Arg Leu Tyr Ile Leu Leu Pro Leu Asp Cys
165 170 175
Gly Val Pro Asp Asn Leu Ser Met Ala Asp Pro Asn Ile Arg Phe Leu
180 185 190
Asp Lys Leu Pro Gln Gln Thr Gly Asp Arg Ala Gly Ile Lys Asp Arg
195 200 205
Val Tyr Ser Asn Ser Ile Tyr Glu Leu Leu Glu Asn Gly Gln Arg Ala
210 215 220
Gly Thr Cys Val Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala
225 230 235 240
Met Ser Gln Tyr Ser Gln Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu
245 250 255
Gln Ala Lys Leu Phe Cys Arg Thr Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asp Ala
260 265 270
Pro Glu Ser Gln Asn Asn Cys Arg Leu Ile Ala Tyr Gln Glu Pro Ala
275 280 285
Asp Asp Ser Ser Phe Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Leu Arg
290 295 300
Gln Glu Glu Lys Glu Glu Val
305 310
<210> 6
<211> 187
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Val Ala His Gly Leu Ala Trp Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu
1 5 10 15
Ile Leu Pro Glu Leu Gln Ala Arg Ile Arg Thr Tyr Asn Gln His Tyr
20 25 30
Asn Asn Leu Leu Arg Gly Ala Val Ser Gln Arg Leu Tyr Ile Leu Leu
35 40 45
Pro Leu Asp Cys Gly Val Pro Asp Asn Leu Ser Met Ala Asp Pro Asn
50 55 60
Ile Arg Phe Leu Asp Lys Leu Pro Gln Gln Thr Gly Asp His Ala Gly
65 70 75 80
Ile Lys Asp Arg Val Tyr Ser Asn Ser Ile Tyr Glu Leu Leu Glu Asn
85 90 95
Gly Gln Arg Ala Gly Thr Cys Val Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln
100 105 110
Thr Leu Phe Ala Met Ser Gln Tyr Ser Gln Ala Gly Phe Ser Arg Glu
115 120 125
Asp Arg Leu Glu Gln Ala Lys Leu Phe Cys Arg Thr Leu Glu Asp Ile
130 135 140
Leu Ala Asp Ala Pro Glu Ser Gln Asn Asn Cys Arg Leu Ile Ala Tyr
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Gln Glu Pro Ala Asp Asp Ser Ser Phe Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu
165 170 175
Arg His Leu Arg Gln Glu Glu Lys Glu Glu Val
180 185
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<212> PRT
<213> 人工序列
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65 70 75 80
Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile
85 90 95
Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile
100 105 110
Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Gly Gly Ser Val Ala His Gly
115 120 125
Leu Ala Trp Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Glu
130 135 140
Leu Gln Ala Arg Ile Arg Thr Tyr Asn Gln His Tyr Asn Asn Leu Leu
145 150 155 160
Arg Gly Ala Val Ser Gln Arg Leu Tyr Ile Leu Leu Pro Leu Asp Cys
165 170 175
Gly Val Pro Asp Asn Leu Ser Met Ala Asp Pro Asn Ile Arg Phe Leu
180 185 190
Asp Lys Leu Pro Gln Gln Thr Gly Asp His Ala Gly Ile Lys Asp Arg
195 200 205
Val Tyr Ser Asn Ser Ile Tyr Glu Leu Leu Glu Asn Gly Gln Arg Ala
210 215 220
Gly Thr Cys Val Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala
225 230 235 240
Met Ser Gln Tyr Ser Gln Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu
245 250 255
Gln Ala Lys Leu Phe Cys Arg Thr Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asp Ala
260 265 270
Pro Glu Ser Gln Asn Asn Cys Arg Leu Ile Ala Tyr Gln Glu Pro Ala
275 280 285
Asp Asp Ser Ser Phe Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Leu Arg
290 295 300
Gln Glu Glu Lys Glu Glu Val
305 310

Claims (27)

1.一种式(III)化合物：
或其药学上可接受的盐，其中
R1a选自由-OH和-F组成的组；
R1b为-H；
R4a选自由-OH和-F组成的组；
R4b为-H；
P1和P2各自独立地具有S或R立体化学构型；
Z是-O-或-NH-；
X1a和X2a相同或不同并且独立地选自＝O或＝S；
X1b和X2b相同或不同并且独立地选自-OR5和-SR5；
其中R5选自由-H和-CH2OC(O)OC1-6烷基组成的组；
式(III)中的L1的长度是四个、五个或六个碳，并且是
其中指示单键、双键或三键，并且其中(i)L1中出现0次或1次的指示三键，或(ii)L1中出现0次、1次或2次的指示双键，其中关于每个双键的几何结构为顺式或反式；并且(iii)其中当L1中出现1次的指示三键时，L1中出现0次的指示双键；并且(iv)其中，当L1中出现2次的表示双键时，那些双键为交替键；
其中X10、X11、X12、X13、X14和X15独立地选自键、-CH2-或-CH-，其中所述-CH2-或-CH-未被取代或被(i)-OH、(ii)-NH2或(iii)-D取代，并且当X10或X15为键时，该键不是双键或三键；
并且其中包括X10、X11、X12、X13、X14和X15的组中任两个相邻的成员可任选地与另外的原子形成C3杂环烷基，所述C3杂环烷基包含N原子；
其中B1和B2独立地选自：
其中B1和B2上的点q和r处的键附接于式(III)上的点q和r处。
2.根据权利要求1所述的化合物或药学上可接受的盐，其中：
R1a为-F；
R1b是-H；
R4a是-F；
R4b是-H；
P1和P2各自独立地具有S或R立体化学构型；
X1a和X2a相同或不同并且独立地选自＝O或＝S；
X1b和X2b相同或不同并且独立地选自-OR5和-SR5；
其中R5选自由-H和-CH2OC(O)OC1-6烷基组成的组；
式(III)中的L1的长度是四个或五个碳，并且是
其中指示单键或双键，并且其中L1中出现0次或1次的指示双键，其中关于所述双键的几何结构为顺式或反式；
其中X10和X14独立地选自键、-CH-或-CH2-，并且其中，当X10或X14是键时，该键不为双键；
其中B1和B2独立地选自：
其中B1和B2上的点q和r处的键附接于式(III)上的点q和r处。
3.根据权利要求1所述的化合物或药学上可接受的盐，其中
(i)P1和P2的立体化学构型均为R，P1的立体化学构型为R且P2为S，或P1的立体化学构型为S且P2为R；
(ii)L1中出现一次的指示双键，其中关于所述双键的几何结构为反式；并且
(iii)Z是–O–。
4.根据权利要求1所述的化合物或药学上可接受的盐，其中R1a和R4a各自为–F。
5.根据权利要求1所述的化合物或药学上可接受的盐，其中B1和B2各自为
6.根据权利要求1所述的化合物或药学上可接受的盐，其中X1a和X2a均为＝O，并且其中X1b和X2b均为–SH。
7.根据权利要求1所述的化合物或药学上可接受的盐，其中L1为
8.根据权利要求1所述的化合物或药学上可接受的盐，其中L1的长度是五个碳。
9.根据权利要求1所述的化合物或药学上可接受的盐，其中L1的长度是四个碳。
10.一种化合物或其药学上可接受的盐，其选自由以下组成的组：
或其药学上可接受的盐。
11.根据权利要求10所述的化合物或其药学上可接受的盐，其选自由以下组成的组：
或其药学上可接受的盐。
12.一种化合物或药学上可接受的盐，其中所述化合物是：
或其药学上可接受的盐。
13.一种化合物或药学上可接受的盐，其中所述化合物是：
或其药学上可接受的盐。
14.一种化合物或药学上可接受的盐，其中所述化合物是：
或其药学上可接受的盐。
15.一种化合物或药学上可接受的盐，其中所述化合物是：
或其药学上可接受的盐。
16.一种化合物或药学上可接受的盐，其中所述化合物是：
或其药学上可接受的盐。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的药学上可接受的盐，其中所述盐是二铵盐。
18.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-16中任一项所述的化合物、或其药学上可接受的盐和药学上可接受的赋形剂。
19.根据权利要求1-16中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐在制备一种用于治疗癌症的药物中的用途。
20.根据权利要求1-16中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐在制备用于治疗癌症的药物组合物中的用途。
21.根据权利要求19所述的用途，其中所述癌症存在于具有REF STING变体等位基因的患者中。
22.根据权利要求19所述的用途，其中所述癌症存在于具有WT STING等位基因的患者中。
23.根据权利要求19所述的用途，其中所述癌症存在于具有AQ STING等位基因的患者中。
24.根据权利要求19所述的用途，其中所述癌症存在于具有HAQ STING等位基因的患者中。
25.根据权利要求19所述的用途，其中所述癌症选自由以下组成的组：淋巴瘤、黑色素瘤、结直肠癌、乳腺癌、急性髓性白血病、肝癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌和神经胶质瘤。
26.根据权利要求25所述的用途，其中所述结直肠癌是结肠癌。
27.根据权利要求19所述的用途，其中所述癌症是转移性的。
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